Quim. Nova, Vol. 30, No.

4, 1001-1005, 2007

Renata Platcheck Raffin, Letcia Marques Colom e Slvia Stanisuaski Guterres* Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga, 2752, 90610-000 Porto Alegre RS, Brasil Adriana Raffin Pohlmann Departamento de Qumica Orgnica, Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, CP 15003, 91501-970 Porto Alegre - RS, Brasil. Recebido em 10/3/06; aceito em 4/8/06; publicado na web em 26/3/07

VALIDATION OF ANALYTICAL METHODOLOGY BY HPLC FOR QUANTIFICATION AND STABILITY EVALUATION OF SODIUM PANTOPRAZOLE. Pantoprazole is a proton pump inhibitor used in the treatment of digestive ulcers, gastro-esophageal reflux disease and in the eradication of Helicobacter pylori. In this work, an analytical method was developed and validated for the quantification of sodium pantoprazole by HPLC. The method was specific, linear, precise and exact. In order to verify the stability of pantoprazole during dissolution assays, pantoprazole solution in phosphate buffer pH 7.4 was kept at room temperature and protected from light for 22 days. Pantoprazole presented less than 5% of degradation in 6 hours and the half live of the degradation was 124 h. Keywords: pantoprazole; validation; stability.

INTRODUO O pantoprazol [5-(difluorometoxi)-2-[[(3,4-dimetoxi-2piridinil)metil]sulfinil]-1H-benzimidazol] um frmaco inibidor da bomba de prtons, atualmente considerado um dos mais importantes para tratamento de uma variedade de doenas relacionadas ao trato gastrintestinal superior1. Este frmaco vem sendo amplamente utilizado no tratamento de lceras gstricas, refluxo gastroesofgico e condies hipersecretrias patolgicas, devido sua capacidade de inibir irreversivelmente a bomba de prtons, diminuindo a secreo gstrica proveniente das clulas parietais do estmago2. Outra indicao o tratamento adjunto a antibiticos para erradicao de Helicobacter pylori3. O mecanismo de ao do pantoprazol, um pr-frmaco, baseia-se na sua ativao no ambiente cido das clulas parietais gstricas, aps sua absoro intestinal e circulao na corrente sangnea. A ativao leva formao de uma sulfonamida catinica cclica (Figura 1), que se liga a uma ou mais subunidades catalticas da bomba de prtons, alterando sua configurao e provocando uma inibio irreversvel do transporte cido. No entanto, para que o

pantoprazol esteja apto para atuar em seu local de ao, a ativao deve ocorrer somente nos canalculos das clulas parietais, sendo necessria sua passagem intacta pelo lmen do estmago2. O sal sdico sesquiidratado a forma mais utilizada do frmaco (C16H14F2N3O4SNa.1,5H2O), sendo solvel em gua, pouco solvel em tampo fosfato pH 7,4 e insolvel em n-hexano1. A degradao do pantoprazol em solues aquosas dependente do pH, sendo que a taxa de degradao aumenta com o abaixamento do pH. Jungnickel1 relatou que, em pH 5, a meia vida de degradao de aproximadamente 2,8 h e em pH 7,8 de 220 h. O pantoprazol tambm apresenta instabilidade frente presena de diversos sais em soluo aquosa, como cloreto de sdio, cido ctrico, citrato trissdico, citrato monossdico, bicarbonato de sdio e carbonato de clcio, em diferentes concentraes e valores de pH, conforme descreveram Ekpe e Jacobsen4. Os autores observaram ainda que as condies de armazenamento mais adequadas para diminuir a degradao do frmaco so pH 10 e 4 C. Em outro estudo, realizado por Detinger e colaboradores5, comprimidos foram triturados e o p suspenso em soluo aquosa de bicarbonato (2 mg/mL de pantoprazol) com o objetivo de

Figura 1. Reaes de ativao do pantoprazol sdico em meio cido e ligao bomba de prtons *e-mail: nanoc@farmacia.ufrgs.br

Nota Tcnica

VALIDAO DE METODOLOGIA ANALTICA POR CROMATOGRAFIA LQUIDA PARA DOSEAMENTO E ESTUDO DA ESTABILIDADE DE PANTOPRAZOL SDICO

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preparar uma forma farmacutica lquida contendo pantoprazol. A suspenso extempornea foi avaliada quanto sua estabilidade por 62 dias sob refrigerao (2 a 8 C). Aps este perodo, mais de 90% da quantidade inicial de pantoprazol manteve-se estvel. A mesma metodologia de preparao da soluo extempornea foi estudada em escala maior por Ferron e colaboradores6. Neste estudo, 34 comprimidos foram triturados e suspensos em 680 mL de soluo de bicarbonato a 4,2% e mantidos em seringas plsticas. A 25 C a suspenso foi estvel por 1 dia (99,1%), a 5 C por 2 semanas (98,6%) e a 20 C por at 3 meses de armazenamento (98,3%). Em outro trabalho7, o p liofilizado comercial de pantoprazol foi reconstitudo com soluo de NaCl a 0,9% com o objetivo de estudar sua estabilidade, visando o uso por via intravenosa. A soluo (4 mg/mL) foi mantida em seringas de polipropileno temperatura ambiente por 96 h. A concentrao final de pantoprazol em soluo foi 96% da concentrao inicial, porm a soluo alterou sua cor para laranja-amarelado. O autor considerou que o grau de degradao no foi significativo, no havendo alterao da concentrao do frmaco nas condies testadas. De forma geral, os estudos mostram que a degradao do pantoprazol aumenta com a presena de sais em soluo e com a diminuio do pH, o que reafirma a necessidade de administr-lo em uma forma gastrorresistente, capaz de permitir absoro exclusivamente entrica. Normalmente, o planejamento de novas formas farmacuticas deve contemplar como etapa inicial o desenvolvimento e validao de metodologia analtica capaz de quantificar o frmaco contido nas formulaes, bem como eventuais produtos de degradao formados, especialmente quando essas metodologias esto ausentes em cdigos oficiais. Apesar do pantoprazol j ser um frmaco bastante usado na teraputica e ter sido aprovado pelo FDA em 2000, sua monografia ainda no est descrita em compndio oficial algum. Para o controle de qualidade de formas farmacuticas, os testes de dissoluo preconizados pelos cdigos oficiais so indispensveis, sendo importantes tambm para orientar o desenvolvimento de novas formulaes. Alm disso, permitem a demonstrao in vitro de caractersticas da formulao, as quais podem estar correlacionadas com seu desempenho in vivo. Em geral, estes testes so conduzidos com velocidade e agitao padronizadas e sob condies sink, mimetizando, tanto quanto possvel, as condies do trato gastrintestinal8. Estes podem ser conduzidos em aparatos, como dissolutores9,10, nos quais as formas farmacuticas so colocadas em recipientes com volume padronizado de meio de dissoluo e mantidas at sua completa dissoluo ou em equipamentos de clulas de fluxo9, onde a amostra submetida a um fluxo de meio de dissoluo at seu esgotamento. Quando se utiliza qualquer uma destas metodologias, o baixo limite de quantificao do mtodo analtico empregado no doseamento do frmaco fundamental para garantir preciso na avaliao dos pontos iniciais e finais da dissoluo. Os ensaios de dissoluo para novas formas farmacuticas de liberao prolongada devem ser realizados em meio capaz de mimetizar as condies intestinais. Desta forma, os ensaios podem ser realizados empregando-se solues tamponadas (pH 7,4) por, no mnimo, 2 h. A estabilidade da substncia no meio deve ser garantida, especialmente no caso das formas farmacuticas que utilizam polmeros de liberao colnica, cuja solubilidade se d em soluo com pH superior a 78,10. No caso de formulaes revestidas e/ou gastrorresistentes contendo pantoprazol, o estudo da sua estabilidade no meio de dissoluo fundamental para se detectar se h ou no degradao do pantoprazol aps sua liberao/dissoluo, o que ocasionaria interpretao errnea do perfil de liberao.

Para a quantificao do pantoprazol em estudos de dissoluo e estabilidade, o limite de quantificao o parmetro mais importante na escolha do mtodo. Entre os mtodos j existentes na literatura para determinao do pantoprazol em formas farmacuticas, um mtodo5 de cromatografia lquida de alta eficincia desenvolvido para determinao da estabilidade de pantoprazol em suspenso oral extempornea utilizou fase mvel em sistema isocrtico, constituda de acetonitrila e fosfato de potssio dibsico 50 mM, com faixa de anlise entre 6 e 24 g/mL. Outro mtodo cromatogrfico semelhante11 para determinao de pantoprazol em comprimidos utilizou fase mvel constituda de acetonitrila (300 mL) e tampo fosfato pH 7,4 (600 mL). Os autores utilizaram coluna octadecilsilano (C18) e trabalharam na faixa de anlise entre 5 e 20 g/mL. Em ambos os mtodos, o limite de quantificao no foi determinado. Um mtodo que empregou coluna octilsilano (C8) e fase mvel isocrtica constituda de 70:30 tampo e acetonitrila, sendo o tampo constitudo por 0,02 M de fosfato de sdio monobsico e 0,03 M de fosfato de sdio dibsico, foi validado. No entanto, os autores descreveram uma concentrao inferior de trabalho alta para o pantoprazol (228 g/mL)12. A especificidade foi avaliada injetando-se uma mistura dos excipientes dos comprimidos comerciais de pantoprazol. Considerando o exposto, este trabalho teve como objetivo desenvolver e validar uma metodologia analtica para doseamento de pantoprazol, atravs de cromatografia lquida de alta eficincia, a fim de obter um limite de quantificao, que permita a aplicao do mtodo em estudos de dissoluo in vitro. O trabalho visou tambm aplicar esta metodologia analtica na quantificao do pantoprazol em breve estudo de estabilidade do frmaco em tampo fosfato pH 7,4, a fim de investigar a presena de produtos de degradao que possam ser formados durante os ensaios de dissoluo. PARTE EXPERIMENTAL Materiais e equipamentos Pantoprazol sdico sesquiidratado (99,84%, Henrifarma, So Paulo, Brasil); acetonitrila grau CLAE; gua purificada atravs de sistema Milli-Q para uso em CLAE; fosfato de potssio monobsico; fosfato de potssio dibsico. Cromatgrafo lquido de alta eficincia Perkin Elmer Srie 200 acoplado a detector UV-VIS. Cromatgrafo lquido de alta eficincia Schimadzu LC-10ADV acoplado a detector de arranjo de diodo (SPD-M10AVP). Metodologia A validao da metodologia analtica foi realizada segundo os critrios propostos pela ICH (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)13 de 1996, USP10 e resoluo da ANVISA RE n 899, de 29/5/200314. Os parmetros avaliados foram: linearidade, preciso intermediria, repetibilidade, exatido, limites de deteco e quantificao e especificidade frente aos produtos de degradao, sendo os ltimos ensaios realizados em cromatgrafo Perkin Elmer Srie 200 com detector UV/VIS. A pureza do pico foi avaliada em cromatgrafo acoplado a detector de arranjo de diodo. Os parmetros cromatogrficos utilizados em ambos os equipamentos encontram-se na Tabela 1. O tampo fosfato pH 7,4, utilizado na fase mvel, foi preparado com 839 mg de fosfato de potssio monobsico e 137 mg de fosfato de potssio dibsico para 1000 mL de soluo. Para avaliao da linearidade, a faixa de concentrao de

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Tabela 1. Parmetros cromatogrficos utilizados para validao da metodologia analtica Parmetro Deteco Fluxo Coluna Fase mvel Volume de injeo Condio UV ( = 290 nm) 1,0 mL/min LiChrospher 100 RP18 (5 m) (Merck) Acetonitrila:tampo fosfato pH 7,4 (35:65 v/v) 20 L

RESULTADOS E DISCUSSO A fase mvel composta de acetonitrila e tampo fosfato pH 7,4 na proporo 35:65 (v/v) foi considerada adequada. O pico referente ao pantoprazol (Figura 2) apresentou-se bem definido e com tempo de anlise reduzido (8 min) em relao ao descrito na literatura para mtodo empregando gradiente de solventes na fase mvel (28 min)15. O cromatograma obtido da amostra aps 168 h em tampo fosfato foi utilizado para verificar a seletividade do mtodo analtico e pode-se verificar a completa separao dos picos do frmaco e dos produtos de degradao (Figura 2).

pantoprazol utilizada nas curvas foi de 0,5 a 20,0 g/mL, sendo a ltima diluio realizada em fase mvel. As amostras foram filtradas atravs de membrana com 0,22 m de poro (Durapore, Millipore ) antes das anlises e injetadas em triplicata no cromatgrafo, registrando-se os valores das reas. Os limites de deteco e quantificao (Equaes 1 e 2) foram calculados matematicamente atravs da relao entre o desvio padro da curva de calibrao e sua inclinao, usando o fator multiplicador sugerido pela norma da ICH13. DP LD = 3,33 B 10DP LQ = B (1)

(2)

onde LD o limite de deteco, LQ o limite de quantificao, DP o desvio padro da reta de calibrao e B o coeficiente angular da reta de calibrao. Para avaliar a repetibilidade, trs concentraes diferentes (6, 9 e 14 g/mL) foram injetadas em triplicata, totalizando nove determinaes, sendo o resultado da anlise expresso em termos de desvio padro relativo (DPR). A preciso intermediria foi avaliada atravs da comparao entre as injees de uma mesma concentrao (9 g/mL) realizadas em trs dias consecutivos, calculando-se posteriormente o DPR dos resultados das determinaes. O teste de recuperao (exatido) foi realizado adicionando-se uma quantidade conhecida de frmaco (2 g/mL) soluo-amostra, resultando nas concentraes de 6, 9 e 14 g/mL. As soluesamostra utilizadas para avaliaes da preciso, da repetibilidade e da exatido foram preparadas a partir de micropartculas contendo pantoprazol. Tais partculas foram preparadas pelo mtodo de evaporao do solvente, aps a emulsificao de uma soluo de acetona contendo pantoprazol e Eudragit S100 com leo mineral contendo monooleato de sorbitano, na proporo 1:1 (m/m) polmero:frmaco. Depois de formadas, as micropartculas foram recolhidas por filtrao e lavadas com cicloexano. Para avaliao da estabilidade e verificao da especificidade do mtodo frente a produtos de degradao, o pantoprazol foi exatamente pesado (25 mg), dissolvido em gua e o volume completado a 25 mL. Uma nova diluio foi realizada em tampo fosfato pH 7,4 obtendo-se uma concentrao de 50 g/mL4. As amostras, mantidas ao abrigo da luz e do calor, foram analisadas por CLAE em um perodo de 1 h at 22 dias, sendo que para anlise, 1 mL da soluo amostra foi dissolvido a 5 mL em fase mvel e filtrada para posterior injeo no cromatgrafo. O perfil de dissoluo das micropartculas foi realizado em equipamento dotado de clula de fluxo com mecanismo para movimento pendular, acoplado bomba peristltica, em banho termostatizado a 37 C. O meio de dissoluo utilizado foi tampo fosfato pH 7,4 com fluxo de 1 mL/min. As coletas foram realizadas at as alquotas estarem abaixo do limite de quantificao do mtodo analtico.

Figura 2. Cromatogramas das amostras de pantoprazol em tampo fosfato aps 1 h (preto) e 168 h (cinza)

O estudo da linearidade do mtodo analtico foi realizado atravs de anlise de varincia, verificando-se regresso linear significativa e desvio da linearidade no significativo (p<0,01) com injeo de concentraes compreendidas entre 0,5 e 20 g/mL, em triplicata. O coeficiente de correlao encontrado para a curva mdia foi de 0,9994 (Tabela 2). Tabela 2. Regresso linear da curva de pantoprazol (ANOVA) Fonte de variao Regresso linear Desvio da linearidade Resduo Graus de Soma dos liberdade quadrados 1 5 56 Varincia F

5,45 x 1012 5,45 x 1012 7398,2* 7,03 x 109 1,41 x 109 1,91 4,12 x 1010 7,36 x 109

Estatstica de regresso e coeficientes Coeficiente de correlao linear Inclinao Intercepto * Valor significativo ( = 0,05) Com os dados provenientes da avaliao da linearidade foram calculados os limites de deteco e quantificao atravs das Equaes 1 e 2, respectivamente. Os valores obtidos foram 0,182 g/ mL para o limite de deteco e 0,553 g/mL para o limite de quantificao. Esse limite de quantificao permite a anlise do frmaco at praticamente sua completa dissoluo. Alguns mtodos15,16 analticos utilizando CLAE para determinao de pantoprazol em plasma obtiveram limites de deteco inferiores (0,05 e 0,025 g/mL), porm utilizavam gradiente de fase mvel. Mtodos que utilizam eluio em gradiente so demorados por necessi0,9994 67936 -10399

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tarem de longos perodos para equilibrar a coluna, maior gasto de solvente e bombas especializadas17. Comparando-se as faixas de anlise e limites de quantificao encontrados na literatura com os utilizados e determinados em nosso estudo, a metodologia aqui descrita reduz em 93% a faixa de anlise, em relao descrita por Badwan e colaboradores12 que passa de 228 a 670 g/mL para 0,5 a 20 g/mL. Essa reduo torna o mtodo vivel para sua aplicao, tanto na quantificao da liberao do frmaco a partir de formas farmacuticas quanto em seus estudos de estabilidade. Os resultados de repetibilidade e preciso intermediria foram expressos em termos de desvio padro relativo (DPR) (Tabela 3). A repetibilidade apresentou DPR de 1,71; 0,59 e 1,10 para as triplicatas das concentraes de 6, 9 e 14 g/mL, respectivamente. A preciso intermediria foi avaliada em trs dias consecutivos, com amostras de mesma concentrao (9 g/mL). Os valores de DPR foram 0,59; 0,54 e 0,27 para cada dia. Para ambos os estudos os valores de desvios padres relativos foram inferiores a 2, demonstrando repetibilidade e preciso intermediria adequadas para o mtodo analtico em questo. No que diz respeito exatido, o mtodo permitiu a recuperao de 95,39 3,77% para a concentrao final de 6 g/mL; 101,13 1,71% para 9 g/mL e 101,38 1,46% para 14 g/mL, o que caracteriza o mtodo como exato, segundo os preceitos da International Conference on Harmonization13. Tabela 3. Valores de desvio padro relativo da avaliao da preciso intermediria e da repetibilidade do mtodo analtico Concentrao (g/mL) 6 9 14 Mdia Dia 1 DPR 1,71 0,59 1,10 1,13 Dia 2 DPR 0,54 Dia 3 DPR 0,27 Mdia

Figura 3. Curva de degradao de pantoprazol em tampo fosfato 7,4. Os pontos indicam os dados experimentais e a linha, a modelagem matemtica (a). As primeiras 6 h de anlise esto representadas em escala diferente (b)

O perfil de liberao do pantoprazol a partir das micropartculas foi determinado por 120 min (Figura 4), tendo demonstrado que neste perodo a totalidade de pantoprazol encapsulado foi liberada a partir das micropartculas.

0,47
Figura 4. Perfil de dissoluo das micropartculas em tampo fosfato pH 7,4

CONCLUSO A anlise dos cromatogramas demonstrou que h completa separao entre os picos do frmaco (6,7 min) e seus produtos de degradao em tampo fosfato (1,6 e 3,2 min), no havendo interferncia dos produtos de degradao na quantificao do pantoprazol (Figura 2). A anlise do pico referente ao frmaco, utilizando o detector de arranjo de diodo, demonstrou 100% de pureza no pico. Atravs do estudo de estabilidade, verificou-se que a concentrao de pantoprazol atinge 90% da concentrao inicial em cerca de 19 h, em tampo fosfato pH 7,4, sendo que aps 22 dias, a concentrao atinge apenas 3,9% da concentrao inicial (Figura 3). Por outro lado, o pantoprazol mantm 100% de sua concentrao at 6 h, tempo normalmente limite para testes de dissoluo10, pois existe a necessidade de mimetizar condies fisiolgicas de trnsito no trato gastrintestinal. A modelagem matemtica da curva de degradao foi realizada empregando o software Micromath Scientist segundo o modelo monoexponencial (Equao 3). C=100 e-kt (3)
Jungnickel, P. W.; Clin. Ther. 2000, 22, 1268. Cheer, S.; Prakash, A.; Faulds, D.; Lamb, H.; Drugs 2003, 63, 101. Poole, P.; Am. J. Health Syst. Pharm. 2001, 58, 999. Ekpe, A.; Jacobsen, T.; Drug. Dev. Ind. Pharm. 1999, 25, 1057. Detinger, P.; Swewnson, C.; Anaizi, N.; Am. J. Health Syst. Pharm. 2002, 59, 953. 6. Ferron, G.; Ku, S.; Abell, M.; Unruh, M.; Getsy, J.; Mayer, P.; Paul, J.; Am. J. Health Syst. Pharm. 2003, 60, 1324. 7. Johnson, C.; Am. J. Health Syst. Pharm. 2005, 62, 2410. 8. Aulton, M. E.; Delineamento de formas farmacuticas, Artmed: Porto Alegre, 2005. 1. 2. 3. 4. 5.

A metodologia analtica proposta para deteco e quantificao de pantoprazol por CLAE mostrou-se sensvel, precisa e linear na faixa de concentrao entre 0,5 e 20 g/mL, sendo adequada para avaliao do frmaco em formas farmacuticas como micropartculas e em solues de tampo fosfato. Alm disso, esse limite de quantificao (0,553 g/mL) torna a metodologia adequada utilizao em ensaios de dissoluo e estabilidade. A estabilidade do frmaco em tampo fosfato pH 7,4 limitada, porm suficiente para a realizao de anlises normalmente conduzidas em estudos biofarmacuticos. AGRADECIMENTOS CNPq/MCT, CAPES e FAPERGS. REFERNCIAS

O valor da constante observada k foi 0,00558 0,00015 h-1. O coeficiente de correlao foi de 0,9997. O tempo de meia-vida de degradao do pantoprazol em tampo fosfato foi de 124 h. Com o objetivo de demonstrar a adequabilidade do mtodo analtico, as micropartculas de pantoprazol empregadas para avaliao de preciso, repetibilidade e exatido foram avaliadas quanto ao perfil de dissoluo in vitro do pantoprazol em equipamento de clulas de fluxo, utilizando como meio tampo fosfato pH 7,4.

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