Bioquimica PDF

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA COORDINACION DEL PROCESO DE ADMISION CURSO PROPEDEUTICO 2009.
INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA BIOQUIMICA
DR. FELIPE DE J. DAVILA ESQUIVEL FEBRERO DEL 2009.
CURSO PROPEDEUTICO 2009
INTRODUCCIN A LA BIOQUMICA 1. Bioqumica: concepto y ramas. 2. Introduccin a la Bioqumica estructural. Bioelementos y Biomolculas 3. Aparicin de la vida en la Tierra: la lgica molecular
1. Bioqumica: concepto y ramas. En un sentido amplio podemos decir que la Bioqumica es la ciencia que estudia la Qumica de los seres vivos. El objetivo ltimo de la Bioqumica es determinar como interactan entre s los conjuntos de molculas inertes que constituyen los organismos vivos a fin de mantener y perpetuar el estado vital de estos. La Bioqumica aparece como ciencia independiente desde aproximadamente los aos 40 del siglo XX, cuando los qumicos orgnicos observaron que numerosas reacciones de molculas orgnicas realizadas en el laboratorio ocurran tambin en la materia viva. Entre las ramas fundamentales de la Bioqumica, que son aquellas donde se recogen y estudian los conceptos bsicos, podemos citar: la Bioqumica estructural, la Bioqumica metablica, la Enzimologa, la Bioenergtica y la Bioqumica de la informacin gentica o Biologa molecular. Otras muchas disciplinas derivadas de la Bioqumica, como la Neuroqumica, la Fotobioqumica, la Bioqumica clnica, la Inmunoqumica, la Tecnologa enzimtica, la Bioqumica de alimentos, la Bioqumica Vegetal, la Bioqumica ambiental, la Ingeniera gentica o la Biotecnologa, tienen gran importancia en la mayor calidad de vida actual y en las acciones relacionadas con la preocupacin por la conservacin ambiental. 2. Bioelementos y biomolculas El primer objetivo en el estudio de la Bioqumica es conocer los elementos qumicos y molculas que forman parte de la materia viva. La rama de la Bioqumica que aglutina el referido conocimiento se denomina Bioqumica estructural. Desde el punto de vista de la Bioqumica estructural podemos afirmar que la vida es consecuencia de las reacciones de los componentes qumicos de un ser vivo. Los componentes de los seres vivos pueden clasificarse como bioelementos y biomolculas.
Bioelementos Inorgnicas (agua, gases, cationes, aniones) Biomolculas Orgnicas Aminocidos.........Protenas Monosacridos.....Polisacridos Nucletidos..........cidos nucleicos Ac. Grasos............Lpidos
La composicin qumica de los seres vivos es muy diferente de la del entorno fsico en el que viven, aunque es precisamente la interaccin con el medio fsico la que condiciona la forma de vida e influye decisivamente en la evolucin de las distintas especies que pueblan el planeta.
Es curioso resear que slo se conoce necesidad biolgica de 27 de los 90 elementos qumicos que aparecen en la naturaleza (Figura 1). Adems, la distribucin de estos elementos qumicos en los organismos vivos no est en la misma proporcin que en la corteza terrestre. Los cuatro elementos ms abundantes de la corteza terrestre son el oxgeno, el silicio, el aluminio y el hierro. En contraste, los cuatro elementos ms abundantes en los seres vivos son el oxgeno, el carbono, el hidrgeno y el nitrgeno, que constituyen alrededor del 99% de la masa de muchas clulas. El resto de elementos (Tabla 1) estn presentes en cantidades muy pequeas (trazas). Parece obvio que los compuestos de los cuatro elementos citados poseen propiedades nicas que permiten el fenmeno de la vida.
Figura 1. Tabla peridica de los elementos qumicos. Tan slo 27 de los 90 elementos de la naturaleza aparecen en la materia viva.
El carbono, el oxgeno, el hidrgeno y el nitrgeno poseen una propiedad comn: son los elementos ms ligeros capaces de formar con facilidad enlaces covalentes mediante la comparticin de pares de electrones. As, para completar sus capas electrnicas externas y formar, de este modo, enlaces covalentes estables, el hidrgeno necesita solamente un electrn, dos el oxgeno, tres el nitrgeno y cuatro el carbono. Los cuatro elementos pueden interaccionar unos con otros para formar un gran nmero de compuestos covalentes diferentes. Adems, tres de ellos (C, N y O) pueden formar enlaces sencillos o dobles, capacidad que les dota de una gran versatilidad para la formacin de gran nmero de estructuras qumicas. Particularmente significativa es la capacidad del carbono para formar enlaces covalentes C-C muy estables (348 kJ.mol-1 ). Cada carbono puede formar enlaces covalente con otros cuatro carbonos, permitiendo la constitucin de esqueletos carbonados lineales o cclicos de gran estabilidad (Figura 2). Adems, el carbono puede establecer enlaces covalentes estables con el oxgeno, hidrgeno, nitrgeno y azufre, lo que permite introducir en las biomolculas un gran nmero de grupos funcionales (alcohol, cetona, aldehdo, carboxilo, amino...), con su particular reactividad qumica, fundamental para las reacciones responsables del fenmeno de la vida. As, de los 7 millones de compuestos qumicos conocidos en la actualidad, casi el 90% son orgnicos.
Tabla 1. Clasificacin de los elementos qumicos presentes en la materia viva. Dependiendo de su mayor o menor presencia, desempean diferentes funciones en la materia viva.
Veamos por qu los dems elementos carecen de estas propiedades. Solamente cinco elementos de la tabla peridica son capaces de establecer tres o ms enlaces covalentes cada uno y formar, por tanto, cadenas de tomos unidos por covalencia: B, C, N, P y Si. El boro tiene menos electrones de valencia (tres) que orbitales de valencia (cuatro), por lo que es deficitario en electrones, lo que hace poco estable el enlace B-B y limita severamente los tipos y estabilidades de los compuestos que puede formar. En el nitrgeno la repulsin que se produce entre los pares de electrones no compartidos de los tomos de N enlazados disminuye la energa de enlace N-N (171 kJ.mol-1) en relacin con la de un enlace C-C (348 kJ.mol-1), de modo que las cadenas alargadas constituidas por tomos de nitrgeno son poco estables.
Figura 2. Enlaces covalentes del carbono. (a) Geometra tetradrica de orbitales del carbono. (b) Enlace simple: rotacin libre. (c) Enlace doble: ms corto y de rotacin limitada.
Por otra parte, al hallarse C y Si en el mismo grupo de la tabla peridica podra suponrseles un comportamiento qumico muy similar. Sin embargo, al ser el radio atmico del Si mucho mayor que el del C, los enlaces Si-Si son ms dbiles (177 kJ.mol-1) que los enlaces C-C, siendo los enlaces mltiples Si-Si raramente estables. Es pues la propia naturaleza electrnica del carbono la que lo hace digno merecedor del papel que juega en los seres vivos. Estos condicionantes qumicos se cumplen independientemente de las coordenadas espacio-temporales dadas. Podemos dudar de la vida en otros planetas, pero hay certeza de la existencia de C, O, N, Fe, Ni, Ba, etc. en el resto del Universo. Luego, si la base qumica existe, se antoja esencial que algo ms posibilita la vida en la Tierra, unas condiciones ambientales de temperatura, radiaciones, atmsfera poco reactiva que permitan la reactividad y estabilidad de las biomolculas esenciales de la vida. Algunos organismos son capaces de vivir en condiciones extremas, lo que junto al mejor conocimiento de la vida y la historia del Universo ha desatado en las ltimas dcadas distintas y novedosas hiptesis sobre el origen de la vida y la posibilidad de su existencia en otros puntos del Universo (Figura 3).
Figura 3. Condiciones ambientales para la vida. Algunos organismos viven en condiciones extremas de pH, temperatura, nutrientes, salinidad o radiaciones.
3. Aparicin de la vida en la Tierra: la lgica molecular Cmo aparecieron las primeras biomolculas y como se originaron a partir de estas los primeros seres vivos?. Hace 15.000 o 20.000 millones de aos surgi el Universo como un cataclismo de calor y partculas subatmicas ricas en energa. En pocos segundos se formaron los elementos ms simples (H, He). Segn el Universo se enfriaba y se expanda, la materia condensada por la influencia de la gravedad form las estrellas (Figura 4). Algunas estrellas crecieron mucho y entonces explotaron como una Supernova, liberando la energa necesaria para fundir los ncleos atmicos ms simples y formar otros elementos ms complejos. Esto ocurri durante miles de millones de aos. Durante este tiempo se form la Tierra y todos los elementos qumicos que encontramos en ella. Se cree que el sistema solar se form hace unos 4.500 millones de aos.
Figura 4. Formacin de ncleos pesados. Segn el Universo se enfriaba y se expanda, la materia condensada por la influencia de la gravedad form las estrellas.
La atmsfera de la Tierra entonces era muy reducida, probablemente contena N2, H2O, CO2, CO, CH4, NH3, SO2 y la temperatura era alta. Cuando las temperaturas bajaron apareci el agua sobre la Tierra. Las fuentes de energa del espacio (rayos, radiaciones electromagnticas) propiciaron que las molculas de esta atmsfera primitiva reducida reaccionaran en presencia de los metales de la corteza terrestre formando, supuestamente, compuestos orgnicos simples. Estas reacciones tendran lugar durante miles de millones de aos.
Esto fue postulado en 1920 por Alexander Oparin y en 1953 Stanley Miler y Harold Urey lo demostraron diseando un aparto para simular las reacciones que habran tenido lugar en la atmsfera primitiva, sometiendo una mezcla a reflujo de H2O, CH4, NH3 e H2 a descargas elctricas durante una semana. La mezcla resultante contena pequeas cantidades de una serie de compuestos orgnicos solubles en agua (aminocidos, cidos orgnicos, urea). Estos compuestos orgnicos simples formaran otros ms complejos como los nucletidos, que seran la base para la vida. Los restos fsiles ms antiguos que se conocen son microorganismos similares a las cianobacterias datados en, aproximadamente, 3.500 millones de aos (Figura 5). Aunque en algn momento debi producirse la evolucin desde las entidades qumicas a las entidades biolgicas ms simples, la pregunta que la Ciencia an no ha sido capaz de responder es cmo se auto-organizaron las biomolculas para configurar las entidades ms simples de vida, con capacidad de autoreplicacin: los microorganismos unicelulares.
Figura 5. Cronologa de la vida en la Tierra. En millones de aos y hasta la actualidad, cronologa de los hitos ms relevantes en el proceso de aparicin y evolucin de la vida en la Tierra.
Los primeros microorganismos debieron ser bacterias termfilas muy simples. Consistiran en una membrana encerrando una serie de molculas polimricas, que tendra al menos un metabolismo simple y un mecanismo hereditario. El metabolismo de los primeros microorganismos sera anaerobio, pues no haba O2. Como tanto los fototrofos como los litotrofos requieren complejos sistemas de membrana, los primeros microorganismos seran organotrofos, que obtienen energa de sustancias orgnicas por fermentacin (Figura 6). Cuando los nutrientes orgnicos empezaran a agotarse surgiran otros tipos de metabolismo ms complejos, fotosntesis anoxignica con donadores de electrones distintos del H2O, por ejemplo el H2S (bacterias prpuras del azufre). El siguiente paso fue la aparicin de dos fotosistemas con el H2O como donador de electrones con la consecuente aparicin del O2 y de la vida aerobia. Despus, la formacin del O3 que protege la Tierra de la radiacin UV hara de ella un lugar habitable.
Figura 6. Clasificacin de los organismos. Clasificacin en funcin de la fuente de energa y de carbono utilizada para sostener el crecimiento y reproduccin.
Paralelamente por mecanismos de mutacin iran apareciendo ciertas innovaciones evolutivas, desarrollo de la pared celular para evitar lisis, aparicin de los citocromos y la creacin de las cadenas electrnicas de transporte. Primitivamente el ARN tena la informacin gentica y la funcin cataltica. Progresivamente la actividad cataltica pas a las protenas y la informacin gentica paso al ADN, que es ms estable y solo se usa para su transcripcin a ARN, que luego se traduce a protenas. Los sistemas antiguos siguieron evolucionando, hasta la aparicin de los eucariotas y posteriormente de los organismos pluricelulares. Actualmente todos los sistemas vivos (a excepcin de los virus) mantienen el sistema de informacin gentica ADN-ARN-protena aunque conviven distintos sistemas metablicos de obtencin de energa. Y todos estn incluidos en algunos de los dos grupos celulares (procariotas, eucariotas). Organismos eucariotas (griego eu, bueno, y kayro, ncleo) Organismos procariotas (griego pro, antes)
Los primeros poseen un ncleo encerrado en una membrana que encapsula su DNA, y los segundos carecen de este orgnulo. Los procariotas, que comprenden los distintos tipos de bacterias y cianobacterias, poseen estructuras relativamente simples y son unicelulares invariablemente. Los eucariotas, que pueden ser unicelulares o multicelulares, son mucho ms complejos.
Los virus no se consideran en ninguna de las dos clasificaciones, de hecho algunos autores no los consideran seres vivos al carecer de sistema reproductor propio, catalogndolos como clulas husped. Procariotas Son los ms numerosos y extendidos sobre la tierra (Figura 7). Presentan metabolismos muy variados y altamente adaptables a diferentes hbitats. A diferencia de los eucariotas, pueden vivir en condiciones extremas, incluso a veces es una condicin necesaria para su pervivencia, tales como altas temperaturas o falta de oxgeno. Tienen un tamao menor de 10m. Pueden ser esfricas (cocos), cilndricas (bacilos), y arrollados helicoidalmente (espirilos). Estructuralmente, tienen membrana celular (plasmtica) y una pared celular gruesa. La membrana puede replegarse y formar estructuras con capas mltiples llamadas mesosomas. El citoplasma posee un nico cromosoma, una molcula de DNA de la que existen varias copias en la clula, que se encuentra formando un cuerpo conocido como nucleoide, as como numerosas especies de RNA, enzimas y ribosomas, millares de partculas donde tiene lugar la sntesis de protena. Muchas bacterias poseen filamentos alargados denominados flagelos, que utilizan en la locomocin
Figura 7.
Clula procariota. Componentes estructurales y localizacin en la clula.
Eucariotas Las clulas eucariticas tienen un tamao variable no superior, generalmente, a 100m (Figura 8). Poseen un ncleo celular diferenciado, protegido por una membrana nuclear, y en general una estructura y funcin mucho ms compleja que los procariotas. Poseedores de membrana plasmtica y, excepto en el caso de las clulas animales de pared celular, contienen la informacin gentica en molculas de DNA que forman los cromosomas. Estos estn constituidos por cromatina, complejo formado por DNA y protena. La cantidad de informacin gentica que portan los eucariotas es inmensa: una clula humana contiene 700 veces ms DNA que la de E. Coli, unas 200 veces la informacin contenida en un libro de Bioqumica de 1.300 pginas, unos 700 mega. Hay gran nmero de eucariotas unicelulares como los protozoos, adems de las clulas de los organismos multicelulares como hongos, plantas y animales.
Figura 8. Distribucin de las biomolculas en una clula eucariota vegetal. Composicin molecular predominante de los diferentes elementos estructurales de la clula.
Las principales diferencias entre clulas procariotas y eucariotas se recogen en la Tabla 2. Obviamente los organismos eucariticos son mucho ms complejos que los procariticos, de hecho, mientras que en E. Coli existen alrededor de 5.000 compuestos distintos (de los que aproximadamente 3.000 son protenas, 1.000 nucleicos, y el resto otras biomolculas) en el hombre se podran considerar mas de 100.000 protenas distintas. Si se supone que existen 1,5 millones de especies distintas (muchas de las cuales aun se desconocen), puede calcularse entre 1010-1012 protenas distintas y unos 1010 cidos nucleicos diferentes (en nuestro Planeta). Paradjicamente, esta gran diversidad (que enriquece nuestro planeta) se reduce, en ltimo trmino, a una gran simplicidad, pues las macromolculas de las clulas no son ms que el resultado de la combinacin de pocas biomolculas sencillas llamadas unidades estructurales o precursores. Por ejemplo, el almidn o la celulosa, estn formados por cadenas largas de un monosacrido, la glucosa; las protenas (1010-1012) se reducen a la combinacin de 20 tipos distinto de aminocidos y los cidos nucleicos a 8 nucletidos. Como puede observarse, tan solo 28 biomolculas dan lugar a esa gran diversidad y adems estn presentes tanto en una bacteria como en nosotros mismos. Analizando la jerarqua de la organizacin celular se llega a la conclusin final de que los organismos se estructuran, realizan sus funciones y se replican gracias a la compleja interaccin de 27 elementos qumicos. Un organismo complejo (el hombre), est formado por una serie de rganos (la piel), que a su vez estn formados por distintos tejidos (la epidermis), formados por clulas (una clula basal), formada por orgnulos (la mitocondria), resultado de una agrupacin supramolecular (la membrana) la cual est formada por macromolculas (una protena), resultado de la interaccin de unas unidades estructurales (los aminocidos), resultado de la interaccin qumica de C, H, N, O y S.
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE QUERETARO FACULTAD DE MEDICINA Tabla 2. Comparacin de algunas propiedades de las clulas procariotas y eucariotas.
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UNIDAD 2 HIDRATOS DE CARBONO 1. Definicin y clasificacin 2. Estructura tridimensional de los monosacridos 3. Reacciones de ciclacin de los monosacridos 4. Reacciones de oxidacin-reduccin 5. Reaccin de formacin de enlaces O-glucosdicos 6. Disacridos 7. Polisacridos 8. Funciones fisiolgicas de los carbohidratos
1. Definicin y clasificacin Los carbohidratos o sacridos (del griego: sakcharn, azcar) son compuestos esenciales de los organismos vivos y son la clase ms abundante de molculas biolgicas. El nombre carbohidratos significa literalmente hidratos de carbono y proviene de su composicin qumica, que para muchos de ellos es (CH2O)n, donde n 3. Es decir, son compuestos en los que n tomos de carbono parecen estar hidratadas con n molculas de agua. En realidad se trata de polihidroxialdehidos y polihidrohicetonas (y algunos derivados de stos), cadenas de carbono que contienen un grupo aldehdo o cetnico y varios grupos hidroxilos (Figura 1).
Figura 1. Estructura qumica bsica de los carbohidratos. Polihidroxi-aldehdo (gliceraldehido, izquierda) y polihidroxicetona (dihidroxi-acetona, derecha).
Las unidades bsicas de los carbohidratos son los monosacridos, no hidrolizables en unidades ms pequeas. La glucosa es el monosacrido ms abundante; tiene 6 tomos de carbono y es el combustible principal para la mayora de los organismos. Los oligosacridos contienen de dos a diez unidades de monosacridos unidas covalentemente. Por su parte, los polisacridos estn constituidos por gran nmero de unidades de monosacridos unidos covalentemente, alcanzando pesos moleculares de hasta 106 dalton (g/mol). Los polisacridos desempean dos funciones biolgicas principales: algunos almacenan energa metablica y otros sirven de elementos estructurales a la clula.
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Los monosacridos se forman en la naturaleza por reduccin del carbono atmosfrico gracias a la "fijacin" del CO2 que realizan los organismos fotosintticos. El ciclo del carbono se completa con la oxidacin de los carbohidratos hasta CO2 realizada por el metabolismo oxidativo de plantas y animales (Figura 2).
Figura 2. Ciclo del carbono en la naturaleza. Procesos de fijacin fotosinttica de CO2 y respiracin oxidativa para liberar CO2.
2. Monosacridos Los monosacridos se clasifican segn la naturaleza qumica de su grupo carbonilo y del nmero de tomos de carbono que poseen. Atendiendo a la naturaleza qumica del grupo funcional carbonlico, si ste es aldehdo el monosacrido recibe el nombre genrico de aldosa, y si es cetnico el monosacrido se le designa como cetosa. Dependiendo del nmero de tomos de carbono de la molcula, los monosacridos se denominan triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, etc. cuando contienen tres, cuatro, cinco, seis, etc. tomos de carbono. Se conocen en la naturaleza monosacridos de hasta 8 tomos de carbono. La combinacin de ambas nomenclaturas anteriores permite denominar con el trmino aldohexosa a un azcar (-osa) de seis tomos de carbono (-hex), cuyo carbono carbonlico es una aldosa (aldo-). Por ejemplo, la glucosa. El gliceraldehido es la aldosa ms simple. Est formado por tres tomos de carbono, el primero contiene el grupo aldehdo, el segundo tiene unido un hidrgeno y un grupo hidroxilo, mientras que el tercero posee dos hidrgenos y un hidroxilo. De los tres carbonos, el segundo (C-2) posee los cuatros sustituyentes distintos y por esta caracterstica recibe el nombre de carbono asimtrico o quiral. Este hecho hace que el gliceraldehido exista en dos estructuras espaciales que se diferencian por cierta propiedad fsica (actividad ptica): una tiene el hidroxilo del C-2 hacia la derecha (D-gliceraldehido) y la otra posee el hidroxilo del C-2 hacia la izquierda (L-gliceradehido).
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Figura 3. Estructura espacial de gliceraldehido. Proyecciones de Fischer y en perspectiva de la molcula de gliceraldehido.
Las molculas que an teniendo la misma composicin qumica tienen diferentes propiedades se denominan ismeros. A ismeros que se diferencian por la disposicin espacial de los grupos sustituyentes de un centro quiral se les conoce con el nombre de ismeros pticos o estereoismeros. Dichos ismeros pticos presentan una propiedad fsica denominada actividad ptica. La actividad ptica es la capacidad que tienen las molculas quirales, en disolucin, de desviar el plano de un haz de luz polarizada. Si lo hacen en el sentido de las manecillas del reloj, se designan con el smbolo (+) y si lo hacen en sentido contrario se designan con (-). As, el enantimero D- del gliceraldehido es (+) y el L- es (-). Esto no quiere decir que todos los monosacridos de la serie D tengan que ser (+). Por un lado est la posicin del grupo hidroxilo (OH) respecto a su carbono quiral, que es un aspecto puramente estructural, y por otro el efecto de la estructura de la molcula sobre el haz de luz polarizada, que es producido por la interaccin de los rayos de luz polarizada con la red cristalina de la molcula en disolucin. Por la configuracin de los sustituyentes de los carbonos quirales no es posible asignar a un carbohidrato actividad ptica (+) (-). Cuando los ismeros pticos son imgenes especulares no superponibles se denominan enantimeros, como es el caso del D y L gliceraldehido (Figura 4). Aquellos ismeros pticos que se diferencian solo en la configuracin de uno de sus carbonos quirales se denominan epmeros. El resto de ismeros pticos que no son enantimeros ni epmeros se denominan diasteremeros.
Figura 4. Enantimero del gliceraldehido. Imgenes especulares no superponibles de la molcula de gliceraldehido.
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Los monosacridos se clasifican en la serie D- o en la serie L- de acuerdo con la configuracin del carbono quiral ms alejado del grupo carbonilo. As, si dicho carbono posee la misma configuracin que el carbono quiral del D-gliceraldehido, pertenece a la serie D-. En la Figura 5 se recogen las aldosas de la serie D-. Como se observa podemos construirlas adicionando unidades de H-C-OH de HO-C-H inmediatamente por debajo del carbono carbonlico. Lgicamente existir otra familia de la serie L- con las imgenes especulares de las aldosas de esta Figura. En total tendremos 2 aldotriosas, 4 aldotetrosas, 8 aldopentosas y 16 aldohexosas.
Figura 5. D-Aldosas. Frmulas de todas las aldosas pertenecientes a la serie D, hasta los monosacridos de 6 tomos de carbono..
En las cetosas el grupo carbonilo ocupa la posicin 2 en la cadena carbonada. La cetosa ms pequea es la dihidroxiacetona:
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Lo primero que salta a la vista es que esta cetosa carece de carbono quiral, luego, a diferencia de las aldosas, slo existe una cetotriosa y carece de actividad ptica. De ella se contina la familia con la Eritrulosa, la cual s posee enantimeros D- y L-, ya que el carbono 3 es quiral (posee 4 sustituyentes distintos). La Figura 6 muestra las cetosas de la serie D-. Existen 1 cetotriosa, 2 cetotetrosas, 4 cetopentosas y 8 cetohexosas. De todas ellas la cetosa ms comn es la D-fructosa, cuyo nombre se le asign antes de conocer su estructura; el resto de cetosas se aislaron o sintetizaron a partir de las aldosas y se las denominan basndose en el nombre de su aldosa de origen. As, la D-fructosa, debera llamarse D-arabinohexulosa, ya que posee el esqueleto base de la D-arabinosa.
Figura 6. D-cetosas. Frmulas de todas las cetosas pertenecientes a la serie D, hasta los monosacridos de 6 tomos de carbono.
3. Reacciones de ciclacin de los monosacridos La presencia de cinco o de seis carbonos en la cadena proporciona a estos compuestos la posibilidad de formar estructuras de anillo muy estables mediante la formacin de un enlace hemiacetal interno, en el caso de las aldosas, o un hemicetal interno si son cetosas.. La formacin de la estructura cclica se produce de la misma manera que los alcoholes reaccionan con los grupos carbonilo de aldehdos o las cetonas.
Figura 7. Formacin de estructuras cclicas de los monosacridos. Se producen por la formacin de hemiacetales y hemicetales, reacciones intramoleculares de un hidroxilo con el grupo carbonilo de la propia aldosa o cetosa, respectivamente.
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El grupo hidroxilo de un monosacrido puede reaccionar con su correspondiente grupo carbonilo (aldo- o ceto-) para dar lugar a hemiacetales o hemicetales cclicos. Este tipo de procesos se puede representar mediante las frmulas de proyeccin de Haworth. Las proyecciones derivadas de aldosas de seis carbonos dan lugar a anillos derivados de pirano y las derivadas de cetosas de seis carbonos originan anillos derivados de furano (Figura 8).
Figura 8. Formacin de estructuras cclicas de los monosacridos. Las aldohexosas generan anillos de pirano y las cetohexosas anillos de furano.
As, por ejemplo, la D-Glucosa se cicla por reaccin del hidroxilo del carbono 5 (C-5) con el grupo carbonilo del aldehdo, dando lugar a un anillo hexagonal de piranosa, por similitud con el anillo de pirano (Figura 9).
Figura 9. Ciclacin de la glucosa. La glucosa se cicla en un anillo de piranosa.
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Un aspecto importante del proceso es que al formarse el correspondiente hemiacetal, el C-1 de la glucosa (que inicialmente era no quiral) se transforma en un carbono quiral (con 4 sustituyentes distintos). Este nuevo carbono quiral recibe el nombre de anomrico (*), y da lugar a dos estructuras denominadas anmeros, uno con el grupo hidroxilo del C-1 por debajo del anillo, anmero, y el otro con el grupo hidroxilo por encima del anillo, anmero . As, por ciclacin de la D-glucosa obtenemos los hemiacetales -D-glucopiranosa y la -D-glucopiranosa.
CHO
CH2OH O
CH2OH O OH
OH HO OH
OH
OH CH2OH
-D-glucopiranosa
D-glucosa
-D-glucopiranosa
De la misma manera la D-fructosa se cicla por reaccin del hidroxilo del carbono 5, con el carbonilo que ocupa la posicin 2, dando lugar, en este caso, a un anillo de furanosa (por similitud con el anillo de furano), con dos anmeros; uno sera la -D-fructofuranosa y el otro la -D-fructofuranosa.
CH2OH
CH2OH O
CH2OH
OH
CH2OH O
OH
OH
OH OH CH2OH
CH2OH
Anillo de furano
-D-fructofuranosa
D-fructosa -D-fructofuranosa.
En general, las hexosas y las pentosas pueden adoptar la forma de pirano o furano dependiendo de la naturaleza del azcar. Es importante indicar que en disolucin acuosa existe un equilibrio entre la forma abierta y los anillos ciclados. De tal manera que la D-glucosa se presentara en equilibrio entre su anmeros y . 4. Reacciones de oxidacin-reduccin La oxidacin de los monosacridos puede producirse de diversas formas, segn el agente oxidante utilizado. As, la oxidacin suave de una aldosa con Cu (II) produce los cidos aldnicos, como en el ejemplo recogido en la Figura 10.
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Figura 10. Oxidacin y reduccin de la glucosa. La glucosa se oxida en condiciones suaves para producir cido glucnico. Su reduccin da lugar al sorbitol (glucitol).
La reduccin de aldosas en atmsfera de hidrgeno produce alditoles (polialcoholes). As, la reduccin de la glucosa conlleva la reduccin del grupo carbonilo de naturaleza aldehdica para rendir un polialcohol conocido como sorbitol. 5. Reaccin de formacin de enlaces O-glucosdicos Una de las reacciones ms importantes de los monosacridos es la reaccin del carbono anomrico (del anillo de piranosa o furanosa) con un alcohol para producir un glucsido. El nuevo enlace que se forma recibe el nombre de enlace glucosdico. As, la -D-glucopiranosa puede reaccionar con el etanol para dar el siguiente glucsido:
CH2OH O OH H2O CH2OH O O CH2CH3
CH3
CH2OH
Que recibe el nombre de -D-metil-glucopiransido (se cambia la terminacin -osa por -sido). La importancia de este proceso radica en que el enlace glucosdico se forma tambin por reaccin del hidroxilo del carbono anomrico de un monosacrido con un grupo hidroxilo de otro monosacrido, dando lugar a un disacrido. Los oligosacridos y los polisacridos son el resultado de la unin de monosacridos mediante este tipo de enlace. En general este tipo de compuestos se conocen con el nombre de O-glucsidos (el oxigeno hace de puente en el enlace). Adems existen otros glucsidos, de gran importancia en la naturaleza: se trata de los N-glucsidos, en los que el C anomrico reacciona con una amina. Tiene gran importancia en la formacin de nuclesidos, entre ellos la adenosina es el ms abundante, que forma parte del trifosfato de adenosina (ATP), y de los cidos ribonucleicos.
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6. Los Disacridos Son dmeros formados por dos molculas de monosacridos, iguales o diferentes, unidas mediante enlace glucosdico. Este enlace puede realizarse de dos formas distintas; tomemos como ejemplo la glucosa.
CH2 OH O 1* O 4 CH2 OH O *
CH2 OH O 1* O
1*
CH2 OH O
Enlace (1,4)
Enlace (1,1)
i) ii) En el primer caso, i), los dos monosacridos estn unidos mediante enlace O-glucosdico del tipo (1-4); como se puede apreciar, el disacrido formado presenta un carbono anomrico (*) libre (en el anillo segundo). En el caso ii) la unin se establece a travs de los carbonos anomricos de ambos monosacridos; en este caso, el enlace glucosdico es del tipo (1-1), bloqueando los dos carbonos anomricos (*). La Figura 11 muestra algunos disacridos abundantes, la sacarosa, la lactosa, la maltosa y la trealosa. Vamos a analizar qumicamente la lactosa y la sacarosa. La lactosa es el -Dgalactopioranosil-(1-4)--D-glucopiranosido, y la sacarosa es el -D-glucopiranosil-(1-2)--Dfructofuranosido. La lactosa posee un enlace glucosdico -(1-4), mientras que en la sacarosa es del tipo (1-2). Este aspecto es muy importante si se analizan sus propiedades qumicas. As, la lactosa al poseer un carbono anomrico libre (el C-1 de la glucosa), en disolucin, puede abrirse y poner de manifiesto la naturaleza reductora de este disacrido. Por su parte la sacarosa, no posee carbono anomrico libre, los dos estn formando parte del enlace glucosdico, ninguno de los anillos puede abrirse y pierde su capacidad reductora. Por esta razn se dice que la lactosa es un azcar reductor y la sacarosa no.
Figura 11.
7. Polisacridos
Disacridos abundantes en la naturaleza. Estructuras de la lactosa, sacarosa, maltosa y trealosa.
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Son polmeros de monosacridos unidos por enlace O-glucosdico. Entre los polmeros naturales, algunos de los ms abundantes y de mayor significativo biolgico son el almidn, el glucgeno y la celulosa. Los tres estn formados por molculas de D-glucosa y slo se diferencian en el tipo de enlace glucosdico, constituyendo estructuras espaciales diferentes.
El almidn
Es la principal reserva de hidratos de carbono que sintetizan las plantas y es tambin la principal fuente de glucosa para la alimentacin de los animales. Est formado por una mezcla de dos polisacridos, la amilosa (en un 20 %) y la amilopectina (en un 80 %). La amilosa es un polmero lineal de D-glucosa con uniones -(1-4) glucosdicas (Figura 12), que le permite adoptar una disposicin tridimensional de tipo helicoidal (Figura 13).
Figura 12. Estructura de la amilosa. Polisacrido formado por monmeros de glucosa en enlaces (1-4).
Figura 13. Estructura tridimensional de la amilosa. El enlace (1-4) produce el curvamiento helicoidal del polmero.
Por su parte, la amilopectina est constituida por restos de D-glucosa unidos por enlace -(1-4), pero presenta tambin ramificaciones cada 24-30 unidades de glucosa, mediante enlaces -(1-6) (Figura 13).
Figura 14. Estructura tridimensional de la amilopectina El enlace (1-6) produce ramificaciones responsables de la estructura abierta de la hlice de almidn.
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El Glucgeno El glucgeno es el polisacrido de reserva de glucosa en los animales y constituye el equivalente al almidn en las clulas vegetales. Se halla presente en todas las clulas, aunque preferentemente se acumula en los msculos esquelticos y especialmente en el hgado (10 % en peso), en cuyas clulas el glucgeno aparece en forma de grandes grnulos. La estructura principal del glucgeno se parece a la amilopectina, posee una cadena lneal con uniones -(1-4) y ramificaciones -(1-6), aunque en este caso aparecen cada 8 12 unidades de glucosa (Figura 15). El glucgeno (al igual que el almidn) se hidroliza con facilidad por la accin de las -amilasas (protenas especializadas en la rotura del enlace -glucosdico).
Figura 15.
Estructura La celulosa del

monosacrido.
glucgeno. El enlace (1-6) produce ramificaciones cada 8-12 restos de
La celulosa, componente estructural primario de las paredes de las clulas vegetales, es un polmero lineal de glucosa unido por enlaces -(1-4) glucosdicos (Figura 16). A diferencia de la amilosa (helicoidal y con uniones ), el enlace impide que la molcula se enrolle, de forma que las cadenas de celulosa pueden adoptan una conformacin plenamente extendida permitiendo que se empaqueten con facilidad mediante puentes de hidrgeno, lo que explica su resistencia y su insolubilidad en agua. A diferencia de los casos anteriores, los vertebrados no poseen enzimas capaces de hidrolizar el enlace -(1-4), slo los herbvoros poseen microorganismos simbiticos con una enzima (celulasa) que permite hidrolizar los enlaces -(1-4) glucosdicos.
Figura 16. Estructura lineal de la celulosa y estabilidad por puentes de hidrgeno entre cadenas paralelas.
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Otro polisacrido de gran abundancia en la naturaleza es la quitina, que es el principal componente estructural de los esqueletos de los invertebrados. La quitina es un polmero constituido por restos N-acetil-D-glucosamina unidos por enlace -(1-4). Se diferencia de la celulosa slo en el sustituyente del C-2, que posee, en lugar de un -OH, una acetamida. De relevancia son tambin otros polisacridos como la heparina, polisacrido heterogneo natural compuesto por D-iduronato2-sulfato unidos por enlace glucosdico (1-4) a N-sulfo-D-glucosamina-6-sulfato (Figura 17). Se utiliza en medicina por su poder anticoagulante. El cido hialurnico es otro heteropolmero constituido por dmeros de cido glucurnico y N-acetilglucosamina (Figura 18). Est presente en los fluidos sinoviales de las articulaciones donde desempea su funcin protectora contra golpes, basada en su valor lubrificante y su alta viscosidad.
Figura 17. Estructura de la unidad dimrica bsica constituyente de la heparina.
Figura 18. Estructura de la unidad dimrica bsica constituyente del cido hialurnico.
8. Funciones fisiolgicas de los carbohidratos Algunos monosacridos como la glucosa y sus derivados, son piezas fundamentales de muchas rutas metablicas esenciales para la obtencin de energa. La glucosa acta en el organismo como combustible energtico de uso rpido, mientras polisacridos o grasas son reservas energticas que deben ser procesadas antes de su utilizacin. Algunos monosacridos y disacridos como la fructosa o la sacarosa son responsables del sabor dulce de muchos frutos, con lo que se hacen ms atractivos a los agentes dispersantes de las semillas. Los oligosacridos, pequeas cadenas polimricas conteniendo entre 2 y 10 monosacridos, aparecen normalmente formando parte de las glicoprotenas que ejercen importantes funciones reguladoras o de reconocimiento celular. Los polisacridos como almidn o glucgeno tienen funciones de reserva energtica en plantas y animales, respectivamente. Otros polisacridos tienen funciones estructurales. Ya hemos citado el caso de la celulosa, principal componente de las paredes celulares vegetales, que supone la mayor parte de la masa de la madera y el algodn en casi pura celulosa; y la quitina, principal componente del exoesqueleto de muchos artrpodos. Tambin tienen gran importancia estructural el heteropolmero de residuos alternados de N-acetilglucosamina y N-acetilmurmico unidos por enlaces 1-4), que constituyen el componente principal de las paredes celulares bacterianas; estos heteropolmeros se unen a protenas formando peptidoglucanos.
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UNIDAD 3 LPIDOS
1. Introduccin y clasificacin 2. cidos grasos 3. Ceras 4. Triacilglicridos 5. Fosfoglicridos 6. Esfigolpidos 7. Lpidos insaponificables
1. Definicin y clasificacin A diferencia de los carbohidratos, que se clasificaban en funcin de los grupos funcionales que posean, los lpidos no pueden clasificarse de esta manera porque no poseen un grupo funcional caracterstico. En este sentido, los lpidos son sustancias de origen biolgico, solubles en disolventes orgnicos (cloroformo, benceno, etc.), y muy poco o nada solubles en agua. Como consecuencia de ello, el trmino lpido abarca a un gran nmero de compuestos orgnicos con estructuras muy diversas; no obstante, poseen algo en comn, la porcin principal de su estructura es de naturaleza hidrocarbonada y sta es la razn de su escasa o nula solubilidad en agua. Los lpidos desempean diversas funciones biolgicas de gran importancia, ya que: Constituyen las principales reservas energticas de los seres vivos Forman parte de las membranas celulares, Regulan la actividad de las clulas y los tejidos As, las grasas, aceites, ciertas vitaminas y hormonas y la mayor parte de los componentes no proteicos de las membranas son lpidos. En este tema, discutiremos las estructuras y propiedades de las clases principales de lpidos. Una forma de clasificar los lpidos es la que se basa en su comportamiento frente a la reaccin de hidrlisis en medio alcalino (SAPONIFICACIN). Los lpidos saponificables son los que se hidrolizan en medio alcalino produciendo cidos grasos, que estn presentes en su estructura; en este grupo se incluyen las ceras, los triacilglicridos, los fosfoglicridos y los esfingolpidos. Los lpidos no saponificables son los que no experimentan esta reaccin (terpenos, esteroides y prostaglandinas, en este ltimo grupo tambin estaran incluidos los cidos grasos).
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2. cidos grasos Se conocen ms de 100 cidos grasos naturales. Se trata de cidos carboxlicos, cuyo grupo funcional (-COOH) est unido a una larga cadena hidrocarbonada normalmente no ramificada (Figura 1).
Figura 1. Estructura qumica de un cido graso saturado.
Se diferencian entre s en la longitud de la cadena y el nmero y las posiciones de los dobles enlaces que puedan tener. Los que no poseen dobles enlaces se denominan cidos grasos saturados (de hidrgeno) y los que poseen uno o ms dobles enlaces se denominan cidos grasos insaturados. Los cidos grasos en estado libre se encuentran en muy bajas cantidades, ya que en su mayora se encuentran formando parte de la estructura de otros lpidos. La Tabla 1 recoge algunos cidos grasos de inters. La mayora de los cidos grasos son compuestos de cadena lineal y numero par de tomos de carbono, comprendido entre 12 y 22. As, el cido palmtico (C16H32O2) y el cido esterico (C18H34O2), son dos cidos grasos saturados bastante abundantes, mientras que el cido oleico (C18H34O2), junto con el linolico (C18H32O2), son los cidos grasos insaturados ms comunes. Obsrvese que todos los cidos grasos insaturados naturales presentan isomeria cis. El ismero cis- posee los dos hidrgenos hacia el mismo lado, mientras que en el ismero trans- se encuentran alternados.
R1 C H C H R2 R1 C C H
Ismero Cis
H R2 Ismero Trans
La presencia de dobles enlaces con isomera cis-, en los cidos grasos insaturados, hace que la cadena hidrocarbonada se doble en el espacio lo cul, a su vez, dificulta su empaquetamiento con otras molculas prximas y asegura que los lpidos que contienen estos cidos grasos tengan bajos puntos de fusin y, por consiguiente, sean fluidos a temperaturas fisiolgicas, lo que facilita, entre otras cosas, su transporte en nuestro organismo. Tabla 1 Principales cidos grasos saturados e insaturados.
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La Figura 2 muestra las diferencias existentes entre las estructuras espaciales de dos cidos grasos, uno saturado y otro insaturado.
Saturado
Insaturado
Figura 2. Estructura tridimensional de dos cidos grasos. Se observa cmo la presencia de la insaturacin de configuracin CIS torsiona la estructura espacial de la molcula, a diferencia de la estructura lineal del cido graso saturado.
3. Ceras Las ceras son lpidos saponificables, formados por la esterificacin de un cido graso y un monoalcohol de cadena larga. O R1 C OH cido graso Monoalcohol + R2 OH
Reaccin de esterificacin
O R1 C O Cera R2
Los alcoholes constituyentes de las ceras tambin tienen un nmero par de tomos de carbono, que oscila entre 16 y 34 (Figura 3). Dos de las ceras ms comunes son la de carnauba, de origen vegetal, que se utiliza como cera para suelos y automviles; y la lanolina (en la que el componente alcohlico es un esteroide) que se utiliza en la fabricacin de cosmticos y cremas. Las ceras son blandas y moldeables en caliente, pero duras en fro. En las plantas se encuentran en la superficie de los tallos y de las hojas protegindolas de la prdida de humedad y de los ataques de los insectos. En los animales tambin actan como cubiertas protectoras y se encuentran en la superficie de las plumas, del pelo y de la piel.
Figura 3. Ejemplo de cera. Esterificacin del cido palmtico (16 tomos de carbono) con un monoalcohol de cadena larga (30 tomos de carbono).
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4. Triacilglicridos Aunque tradicionalmente se ha empleado el nombre de triglicridos, las normas actuales de formulacin recomiendan que este trmino deje de utilizarse y se cambie por el indicado. El nombre de Triacilglicridos (TAGs) describe adecuadamente la estructura de estos compuestos, pues poseen el esqueleto del glicerol unido a (esterificado con) tres cidos grasos (grupos acilos). Se trata, pues, de tristeres formados por tres molculas de cidos grasos y una molcula de glicerol (Figura 4). El punto de fusin de los TAGs viene determinado por la naturaleza de los cidos grasos que lo forman. Los TAGs que son slidos a temperatura ambiente reciben el nombre de grasas (poseen mayor nmero de grupos acilos saturados), mientras que los que son lquidos a esta temperatura reciben el nombre de aceites (poseen mayor nmero de acilos insaturados). La presencia mayor o menor presencia de cidos grasos saturados es responsable de un empaquetamiento ms compacto o ms dbil, dando lugar a grasas o aceites, respectivamente (Figura 5).
Figura 4. Ejemplo de triacilglicrido. Esterificacin de tres cidos grasos con los tres hidroxilos de las molculas de glicerol.
Figura 5. Empaquetamiento de los cidos grasos. Empaquetamiento compacto (saturados) y dbil (insaturados).
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No obstante las grasas y aceites naturales no son puros, sino una mezcla de TAGs. Entre las grasas y aceites ms comunes destaca, como TAG ms puro, el aceite de oliva (84 % de cido olico). La Figura 6 compara de forma sencilla la diferente composicin en cidos grasos de algunas grasas y aceites naturales.
Figura 6. Composicin de cidos grasos en sustancias naturales. Porcentaje de cidos grasos saturados e insaturados en aceite de oliva, mantequilla y carne de vacuno.
Las grasas constituyen una forma eficiente de almacenamiento de energa metablica. Esto se debe a que las grasas estn menos oxidadas (ms hidrogenadas) que los glcidos (glucgeno) de ah que su rendimiento de energa en la oxidacin sea significativamente mayor. Las grasas proporcionan alrededor de seis veces ms energa metablica que un peso igual de glucgeno. El contenido en grasa de las personas normales (21 % en hombres, 26 % en mujeres) les permite sobrevivir en ayuno de dos a tres meses; por el contrario, el suministro corporal de glucgeno, puede cubrir las necesidades metablicas durante menos de un da (ojo con las dietas, posibilidad de nivel cero de glucosa). Adems la apolaridad de las grasas facilita mucho su almacenamiento en forma anhidra (cosa que no ocurre con el glucgeno, que se moviliza ms fcilmente). En los animales, los adipocitos son clulas especializadas en la sntesis y almacenamiento de TAGs, concentrndose en el tejido adiposo (Figura 7).
Figura 7. Micrografa de tejido adiposo. Acumulacin de grasa en los adipocitos.
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Los TAGs experimentan las mismas reacciones que los steres. Una de las reacciones ms importantes es su hidrlisis, que puede ser alcalina (bajo el punto de vista industrial) o enzimtica (por lipasas, en el organismo). La hidrlisis alcalina o saponificacin, es el proceso base para la fabricacin de los jabones (Figura 8), mientras que la hidrlisis enzimtica se produce en la degradacin de las grasas ingeridas como alimentos.
Figura 8. Reaccin de saponificacin.
Figura 9. Micela y emulsin.
Los jabones se obtienen calentando grasas naturales con una disolucin alcalina (de carbonato sdico o hidrxido sdico). Tras la hidrlisis, el jabn (sales sdicas de cidos grasos) se separa del resto mediante precipitacin al aadir sal a la mezcla de reaccin, tras lo cul se lava y purifica. El jabn as obtenido es el de tipo industrial. Estos, al igual que otros lpidos polares, forman micelas (Figura 9) en contacto con el agua. Esta propiedad explica su capacidad limpiadora, pues actan disgregando la mancha de grasa o aceite formando pequeas micelas en las que las partes hidrofbicas (apolares) rodean la grasa y las partes hidroflicas (polares, debido al grupo carboxilato) quedan expuestas hacia el agua. De esta manera, se forma una emulsin (gotas cargadas negativamente) que son arrastradas por el agua en forma de diminutas partculas. Otra reaccin importante de los TAG es la hidrogenacin cataltica de los grupos acilo insaturados existentes en los aceites vegetales. Mediante este proceso los TAGs con grupos acilos insaturados se transforman en TAGs saturados. Esta reaccin se vienen realizando en la industria desde hace muchos aos para la produccin de margarinas de uso culinario, a partir de aceites vegetales abundantes y baratos (como el de soja y el de maz).
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R1 C C
R2
H2, Pt
R1
CH2
CH2
R2
H H Doble enlace insaturado
Doble enlace saturado
5. Fosfoglicridos Los fosfoglicridos (FFGs) son componentes esenciales de las membranas biolgicas. Se trata tambin de steres del glicerol, pero slo poseen dos grupos acilo unidos a los tomos de oxgeno de los carbonos 1 y 2 del glicerol, mientras que el tercer hidroxilo est esterificado con el cido fosfrico, el cul a su vez se encuentra unido a un resto X de distinta naturaleza, resto que da nombre al FFG (Figura 10).
Figura 10. Estructura de fosfoglicridos. Esterificacin de dos cidos grasos y una molcula de cido fosfrico con los tres hidroxilos de las molculas de glicerol.
Los diferentes FFGs difieren en el tamao, forma y carga elctrica de los grupos (X) de la cabeza polar. A su vez, cada tipo de FFG puede existir en muchas especies qumicas distintas que se diferencian en sus grupos acilos (parte apolar). Habitualmente hay un grupo acilo saturado y otro insaturado. Los FFG ms abundantes en las membranas de las clulas de animales y de plantas superiores son la fosfatidil-etanolamina y la fosfatidil-colina, mientras que el fosfatidil-glicerol y el difosfatidil-glicerol son ms frecuentes en membranas bacterianas (Figura 10). Como se puede apreciar en la fosfatidilcolina la cardiolipina, los FFGs poseen una cabeza polar (grupo X) y una cola apolar (cadena hidrocarbonada); este tipo de compuestos reciben el nombre de anfipticos (tambin lo son los cidos grasos). Esta caracterstica estructural posee una gran importancia, pues gracias a ello los FFGs pueden agruparse al interaccionar las partes apolares, dando lugar a estructuras ms complejas como las membranas biolgicas celulares (Figura 11).
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Figura 11. Pared celular y liposoma. Estructura en bicapa lipdica que da lugar a formaciones biolgicas o artificiales (liposomas).
6. Esfingolpidos Los esfingolpidos (EFLs), son lpidos complejos cuyo esqueleto est constituido por la esfingosina o la dihidroesfingosina, en lugar de glicerol. Son tambin componentes importantes de las membranas celulares, debido a su naturaleza anfiptica. Bajo el punto de vista estructural, todos los EFLs contienen tres componentes bsicos: un grupo acilo (procedente de un cido graso), una molcula de esfingosina (o su derivado hidrogenado) y una cabeza polar (Figura 12). La zona polar puede estar formada por un grupo fosfato unido a un resto X (de similar naturaleza que el presente en los fosfoglicridos), dando lugar a los fosfoesfingolpidos, a una molcula de azcar, dando lugar a los glicoesfingolpidos.
Figura 12. Estructura de los esfingolpidos. Esterificacin de la molcula de esfingosina con un cido graso y un grupo polar responsable del carcter anfiptico de la molcula. Principales esfingolpidos.
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Los FELs se encuentran presentes en cantidades importantes en el tejido nervioso y cerebral. En ellos, un grupo hidroxilo del fosfrico est esterificado con colina o etanolamina y se conocen con el nombre general de esfingomielinas, el FEL ms abundante en las vainas membranosas que envuelven y aslan elctricamente los axones de las neuronas (Figura 13). En los glicoesfingolpidos, la cabeza polar la forma un carbohidrato. As, los denominados galactocerebrsidos son los ms abundantes en las membranas de las clulas neuronales del cerebro y tienen un grupo de cabeza polar que es la -D-galactosa.
Figura 13. Estructura de la esfingomielina.
7. Lpidos insaponificables Terpenos Los terpenos, son lpidos insaponificables, formados por dos o ms unidades de isopreno (2-metil1,3-butadieno).
Los terpenos pueden ser molculas lineales o cclicas, y algunos de ellos contienen estructuras de ambos tipos. Las sucesivas unidades de isopreno se hallan enlazadas por lo comn mediante enlaces cabeza-cola, aunque tambin existen enlaces tipo cola-cola. Los terpenos que contienen dos unidades de isopreno, se llaman monoterpenos; los que contienen tres unidades, sesquiterpenos y los que contienen cuatro, seis, y ocho unidades reciben el nombre de diterpenos, triperpenos y tetraterpenos. En los vegetales se han identificado un gran nmero de terpenos, muchos de los cuales poseen olores o sabores caractersticos, y son componentes principales de los aceites esenciales obtenidos de las plantas (limoneno, geraniol, mentol o alcanfor). Por su parte el fitol (diterpeno) es un componente esencial de la clorofila, molcula esencial en la fotosntesis y, por tanto, situada en la base qumica de la vida (Figura 14).
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Figura 14. Estructuras de fitol y clorofilas a y b.
Entre los terpenos superiores ms importantes figuran el escualeno (triterpeno, encontrado en grandes cantidades en los escualos), precursor del colesterol (que es un esteroide) y el -caroteno, que junto a otros carotenos es el responsable del color amarillo-anaranjado asociado a determinadas membranas celulares (zanahoria, tomate, etc) y tambin acta como precursor de la Vitamina A o retinol (Figura 15).
Figura 15. Estructuras de -caroteno, vitamina A (retinol) y cis-retinal. El -caroteno es precursor de la vitamina A. La vitamina A y el retinal estn implicados en el ciclo qumico responsable de la visin. El retinal se produce por oxidacin de la vitamina A
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Esteroides Los esteroides son otro tipo de lpidos no saponificables, que poseen un ncleo comn formado por cuatro anillos condensados, tres de los cuales poseen seis tomos de carbono y el cuarto nicamente cinco. El nombre de dicha estructura comn es ciclopentanoperhidrofenantreno. Aunque los distintos tipos de esteroides se diferencian en la naturaleza y la posicin de los sustituyentes. La mayora de los esteroides se generan (en los seres vivos) a partir de la ciclacin del escualeno (un triterpeno lineal); as, el primer esteroide formado en este proceso es el lanosterol que posteriormente se transforma en otros muchos esteroides de inters. Uno de ellos es el colesterol (Figura 16).
Figura 16. Estructura del colesterol.
El colesterol es el esteroide mejor conocido y ms abundante en el cuerpo humano. Forma parte de las membranas biolgicas y es precursor de cidos biliares, de las hormonas esteroides y de la Vitamina D. Es tambin muy abundante en lipoprotenas del plasma sanguneo, entre ellas la LDL, en las que alrededor del 70 % se encuentra esterificado con cidos grasos de cadena larga (Figura 17). Por desgracia, es tambin conocido por su nivel en la sangre y ciertos tipos de enfermedades cardiacas, como la arterosclerosis. Esta enfermedad se debe a un exceso de LDL (provocado por varias causas) que se deposita en la superficie interna de las arterias, disminuyendo as su dimetro, produciendo un aumento de la presin sangunea y, por tanto, un mayor riesgo a sufrir la formacin de ateromas, causantes en ltimo trmino de los problemas cardiovasculares que determinan los infartos de miocardio. Como se ha indicado antes, el colesterol es tambin el precursor de otros muchos esteroides, algunos de los cuales se muestran en la Figura 18. La vitamina D, cuya ausencia produce el raquitismo (enfermedad en el crecimiento de los huesos), se sintetiza a partir de un derivado del colesterol (7-dehidrocolesterol) mediante una reaccin que requiere irradiacin de la piel por la luz solar. Los cidos biliares son compuestos, sintetizados a partir del colesterol, que a modo de detergente ayudan a la emulsin de los lpidos y a su absorcin intestinal.
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Por su parte, los andrgenos son hormonas sexuales masculinas y los estrgenos hormonas sexuales femeninas, tambin derivados del colesterol.
Figura 17. Estructura de una lipoprotena. Contiene molculas de colesterol libres y esterificadas con cidos grasos.
Figura 18. Algunos esteroides derivados del colesterol.
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Prostaglandinas Las prostaglandinas son lpidos insaponificables que poseen una gran variedad de actividades biolgicas de naturaleza hormonal y reguladora, as median en: La respuesta antiinflamatoria La produccin de dolor y fiebre La regulacin de la presin sangunea La induccin de la coagulacin de la sangre La induccin al parto La regulacin del ciclo sueo/vigilia La prostaglandinas, se encuentran en cantidades muy pequeas en tejidos y fluidos corporales, entre ellos los fluidos menstruales y seminales. Todas las prostaglandinas son derivados hipotticos de la ciclacin de cidos grasos insaturados de 20 carbonos. Las prostaglandinas E2 y E2a pueden utilizarse teraputicamente para provocar el aborto o bien para acelerar el parto. Tambin se investiga sobre ellas para la obtencin de derivados estables, para su utilizacin como anticonceptivos.
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UNIDAD 4 AMINOCIDOS, PPTIDOS Y PROTENAS 1. Estructura y clasificacin de los aminocidos. 2. Propiedades cido-base de los aminocidos y pptidos 3. El enlace peptdico 4. Pptidos: hidrlisis y secuenciacin 5. Clasificacin y funcin biolgica de las protenas 6. Niveles estructurales de las protenas 1. Estructura y clasificacin de los aminocidos. Como su nombre indica los aminocidos son compuestos que poseen un grupo amino (-NH2) y un grupo cido (carboxlico -COOH) en su estructura. Los aminocidos son los precursores de los pptidos y las protenas, y en ellos el grupo amino y el grupo carboxilo, se encuentran unidos al mismo tomo de carbono, conocido como carbono- (-aminocidos). La estructura general de los -aminocidos (a excepcin de la prolina, que es cclica) se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Estructura qumica de un aminocido. Estructura qumica en el plano y estructura espacial. Enantimeros del aminocido alanina.
Como se puede apreciar, el carbono- (a excepcin de la glicina) es un carbono quiral y como tal presenta dos enantimeros (L- y D-). Los 20 -aminocidos presentes en las protenas son de la serie L- y en su representacin de Fischer poseen el grupo amino hacia la izquierda. La diferencia entre los aminocidos viene dada por el resto -R, o cadena lateral, unida al carbono-. Atendiendo a la naturaleza del grupo -R los aas pueden clasificarse en: Neutros o apolares Polares sin carga Polares con carga negativa Polares con carga positiva
La Figura 2 recoge las estructuras de los 20 L--aminocidos a pH fisiolgico.
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Neutros o Apolares. Son 8 los aminocidos que se clasifican como poseedores de cadenas laterales no polares. La alanina, valina, leucina e isoleucina, poseen cadenas laterales de hidrocarburos alifticos. La metionina posee una cadena lateral de ter tilico (C-S-C). La prolina es el nico aminocido cclico, pues el grupo -R se cierra sobre el N del grupo -amino (realmente es un amina secundaria). Por su parte, la fenilalanina y el triptfano contienen grupos aromticos. Polares sin carga. Siete son los -aminocidos cuyo resto -R es polar pero sin carga. La glicina posee la cadena ms simple, un tomo de hidrgeno. La serina y la treonina son portadores de un grupo hidroxilo (-OH). La asparragina y la glutamina, poseen cadenas laterales portadoras de un grupo amida, y por hidrlisis dan lugar, respectivamente, a aspartato y glutamato, dos aminocidos con carga negativa. La tirosina posee un grupo fenlico y la cistena debe su polaridad a la presencia de un grupo tilico (-SH). Polares con carga negativa. Existen dos -aminocidos cuyo resto polar posee carga negativa a pH fisiolgico, debida a la presencia de un grupo carboxilo (-COOH) , el cido glutmico y el cido asprtico. Polares con carga positiva. Tres son los -aminocidos que poseen restos -R cargados positivamente a pH fisiolgico. La lisina posee una cadena lateral de butilamonio, la arginina presenta un grupo -R de guanidina y la histidina es portadora de un grupo -R de imidazolio.
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Figura 2. Estructura qumica de los L-aminocidos.
Esta clasificacin se ha realizado en base al grupo -R, pero es importante indicar que a pH fisiolgico (pH 7,3), el grupo -amino se encuentra cargado positivamente y el grupo -carboxilo lo est negativamente, por esta razn en la Figura 2 estos grupos aparecen siempre cargados. Dentro del conjunto de los aminocidos naturales, existen unos que pueden ser sintetizados por las clulas humanas a partir de otras sustancias, pero tambin hay aminocidos que debemos tomarlos en la dieta, ya que nuestras clulas no pueden sintetizarlos o, cuando menos, no en cantidad suficiente para satisfacer la demanda del organismo; se conocen con el nombre de aminocidos esenciales y son valina, leucina, isoleucina, treonina, metionina, fenilalanina, triptfano y lisina. 2. Propiedades cido-base de los aminocidos y los pptidos El pH del medio en el que se encuentre el aminocido es esencial para determinar sus propiedades cido-base, aspecto importante pues de ello dependen las propiedades qumicas y la funcionalidad biolgica de los pptidos y protenas que forman. Las propiedades cido-base de un aminocido vienen determinadas por los grupos protonables que posea. Un aminocido puede actuar bien como cido o como base (sustancias anfteras), pudiendo tener hasta tres grupos con carcter cido-base: el -amino, el -carboxilo y, en algunos casos, el resto -R. Lo importante es que estos grupos poseen un carcter cido-base dbil, lo que hace que, dependiendo del pH, el correspondiente equilibrio pueda desplazarse en un sentido o en otro (hacia la forma protonada o hacia la desprotonada, Figura 3).
Figura 3: Ionizacin de un L-aminocido.
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En funcin del pH, la proporcin de forma protonada (carga 0) o forma desprotonada (carga -1) variar, respetando siempre la constante de ionizacin del grupo en cuestin si la temperatura se mantiene constante. 3. El enlace peptdico Los aminocidos se encuentran unidos en los pptidos y las protenas mediante un enlace amida (-CO-NH-):
Este enlace se forma por reaccin entre el grupo -COOH de un aminocido y el -amino del siguiente (con prdida de una molcula de agua) y recibe el nombre de enlace peptdico.
Figura 4. Estructura espacial del enlace peptdico. (a) Ilustracin del carcter parcialmente doble del enlace peptdico. (b) Configuracin del plano que conforman el enlace peptdico y los carbonos extremos.
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Entre los aos 1930-1940, Pauling y Corey, mediante el estudio de Rayos X de cristales de aminocidos, dipptidos y triptidos, dilucidaron la estructura tridimensional del enlace peptdico (Figura 4). As, descubrieron que la unin C-N del enlace peptdico era ms corta que en la mayor parte de los dems enlaces C-N y llegaron a la conclusin de que el enlace deba tener algn carcter de doble enlace, por la aparicin de dos formas resonantes:
Luego dedujeron que los 4 tomos que rodeaban al enlace peptdico C-N (O, C, C, H) estaban situados en el mismo plano, de tal manera que el oxgeno del grupo carbonilo y el hidrgeno del N-H estaran en posicin trans. Esta ordenacin es rgida, y es el resultado de la estabilizacin por resonancia de las formas anteriormente citadas. Partiendo de estos dos hechos, puede describirse el armazn de una cadena polipeptdica como constituido por una serie de planos, con posibilidad de giro en los C. De esta forma podemos escribir la estructura de un pptido como una sucesin de planos en la que los grupos -R se van alternando (Figura 5).
Figura 5. Estructura espacial de un pptido. Secuencia ordenada de los planos de enlace peptdico en el espacio. Los grupos R se alternan por encima y debajo del plano general de la molcula.
4. Secuenciacin de un pptido La secuencia de un pptido tiene gran importancia porque entre otras cosas condiciona los siguientes niveles estructurales. La insulina bovina fue la primera protena que se secuenci completamente por Sanger en 1953, lo que le vali el premio Nobel. La determinacin de la secuencia de la insulina fue el resultado del trabajo de muchos cientficos durante 10 aos, desde entonces se han secuenciado miles de protenas.
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La secuencia de un pptido, si conocemos el gen del que proviene, puede secuenciarse indirectamente, secuenciando dicho gen. Pero tambin puede hacerse la secuenciacin qumica directa. La secuenciacin. Entre los distintos mtodos existentes, podemos citar la degradacin de Edman, cuyo fundamento hemos visto en la determinacin del extremo N-terminal. La aplicacin continuada de varios ciclos de la degradacin de Edman me permite la secuenciacin de todo el pptido, siempre que este no tenga ms de 20 o 30 aminocidos. No obstante los actales requerimientos de secuenciacin de gran cantidad de pptidos en poco tiempo, han dado origen al desarrollo de nuevos mtodos de secuenciacin de pptidos, desarrollados principalmente para afrontar proyectos como el del proteoma humano. Entre estos mtodos podemos citar el MALDI MS y el ESI MS, ambos basados en la espectrometra de masas. 5. Clasificacin y funcin biolgica de las protenas Las protenas son cadenas polipptidicas que se diferencian de los oligopptidos en el nmero de aminocidos que contienen, en su carcter funcional y sobre todo en que son el resultado del proceso de traduccin gentica. La conformacin de una protena hace referencia a la disposicin espacial de la misma, aspecto de vital importancia, pues va a estar directamente relacionado con la funcin que desempean. Segn la conformacin las protenas pueden clasificarse en fibrosas y globulares. Las fibrosas poseen las cadenas polipeptdicas ordenadas de modo paralelo a lo largo de un eje. Forman materiales fsicamente resistentes e insolubles en agua, siendo elementos bsicamente estructurales como por ejemplo la -queratina del pelo, la fibroina de la seda o el colgeno de los tendones. Por su parte, las protenas globulares, estn constituidas por una o varias cadenas polipeptdicas plegadas de modo que puedan adoptar una conformacin esfrica o globular, desempeando diferentes funciones de tipo metablico (protenas transportadoras, enzimas, anticuerpos,...). Algunas protenas incluso pueden situarse entre estas dos conformaciones como sera el caso de la miosina de los msculos o el fibringeno de la sangre. 6. Niveles estructurales de las protenas La conformacin que presenta una protena va a depender directamente de los distintos niveles estructurales (hasta cuatro, esquema en Figura 7) que posee, niveles que a continuacin se detallan.
Figura 7. Esquema de los cuatro niveles de estructura de las protenas.
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a) Estructura primaria: hace referencia a la posicin que ocupa cada aminocido en la cadena polipeptdica, es decir nos da idea de la secuencia de la protena. La importancia de este nivel radica en que la posicin que ocupa cada aminocido dentro de la cadena va a condicionar enormemente el resto de los niveles estructurales y en ltimo trmino la funcin que desempea la protena. b) Estructura secundaria: hace referencia a la ordenacin regular y peridica de la cadena polipeptdica en una direccin determinada. Bsicamente, podemos encontrar dos tipos de estructura secundaria, la hlice- y la conformacin-. En la Hlice- (Fig.8) la cadena polipeptdica adopta una conformacin helicoidal. Las estructuras helicoidales se caracterizan por el numero de aminocidos por vuelta (n) (3,6 restos en la Hlice-) y por su paso de rosca (p), o distancia entre vueltas (5,4 para la Hlice). Esta conformacin se estabiliza por puentes de hidrgeno (R-C=O H-N-R) intracatenarios (dentro de la hlice). Adems, los restos -R de los aminocidos se disponen hacia fuera de la hlice evitando las interacciones estricas (por grupos voluminosos) y estabilizando la conformacin. Por otro lado, la hlice- se distorsiona o pierde la conformacin cuando en la secuencia aparece una prolina, nico aminocido ciclado por su grupo -amino.
Figura 8. Esquema de la hlice-
En la conformacin- (Fig.9) la cadena adopta una ordenacin lineal en la que los restos -R, de los aminocidos, se van alternando por encima y por debajo (zig-zag) del plano del enlace peptdico. Esta conformacin se estabiliza con puentes de hidrgeno entre varias cadenas de protenas con conformacin-. El resultado de estas interacciones es la hoja plegada , que puede presentar un plegamiento paralelo, (en el que las cadenas vecinas se desarrollan en la misma direccin), o bien un plegamiento antiparalelo con cadenas vecinas en direcciones opuestas.
Figura 9. Esquema de la hoja plegada-. En conformacin antiparalela (a) y paralela (b)
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Aunque las dos conformaciones (hlice- y hoja plegada- son posibles dentro de una misma protena (como veremos en la estructura terciaria), existen tambin protenas que presentan slo una de las dos. La -queratina es una protena que aparece Fig.10 en todos los vertebrados superiores y es el -queratina del pelo componente principal del pelo, la lana, las uas o los cuernos. El pelo est construido por clulas muertas, cada una de las cuales contiene macrofibrillas empaquetadas que se orientan paralelamente a la fibra del pelo. stas estn formadas por microfifrillas, que es una asociacin de protofibrillas que continen dos cadenas de hlice- que se retuercen en un arrollamiento hacia la izquierda. Las queratinas poseen un alto contenido de Cys (R= -CH2-SH) de tal manera que las interacciones entre las hebras se producen a travs de puentes disulfuro (-S-S-) dando una gran resistencia e insolubilidad al conjunto. Aunque la insolubilidad de las queratinas impide que la mayor parte de los animales la puedan digerir, la polilla, posee una concentracin elevada de mercaptanos, que rompen los puentes disulfuro, en su tracto digestivo, y por lo tanto pueden digerir la lana. Por su parte, la fibrona (Fig.11) de la seda es una agrupacin de -queratinas en conformacin hoja plegada- antiparalela unidas por enlaces de hidrgeno intracatenarios. La fibroina y otras -queratinas son muy ricas en aminocidos poco voluminosos (gly y ala), lo que facilita que las hojas se apilen unas sobre otras, de tal modo que se alternan zonas de contacto entre glicinas y zonas de contacto entre alaninas, interaccionando mediante fuerzas dbiles de van der Waals. Este hecho hace posible que la seda pueda extenderse en fibras fcilmente separables (separando hojas) pero relativamente difciles de romper (implicara romper los enlaces peptdicos).
Figura 11. Hoja plegada- de la fibroina de la seda.
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Por otro lado, existe la posibilidad de transformar la -queratina en -queratina. As, cuando el pelo o la lana se someten a la accin del vapor (calor + humedad) pueden incluso duplicar su longitud. Lo que ocurre es que se rompen los puentes de hidrgeno de la hlice- y las cadenas polipeptdicas adoptan una conformacin-; no obstante los grupos -R de las -queratinas son muy voluminosos, lo que hace que la conformacin- se desestabilice y al poco tiempo adopte de nuevo la conformacin en -hlice con lo que el pelo o la lana recuperan su longitud original. c) Estructura terciaria: hace referencia al modo en que se curvan o pliegan en el espacio los segmentos de hlice- y/o conformacin-, que presenta una cadena polipeptdica de los protenas globulares. La conformacin espacial de las protenas depende lgicamente de su estructura primaria, as las cadenas laterales de los aminocidos en las protenas globulares se hallan distribuidas espacialmente de acuerdo con sus polaridades, de tal forma que: Los restos no polares aparecen, casi siempre, en el interior de la protena, para no entrar en contacto con el disolvente acuoso que la envuelve, creando un ambiente hidrofbico. Los residuos polares con carga se hallan situados, normalmente en la zona externa, interaccionando con el medio acuoso. A veces, se requiere de estos centros en la parte interna de la protena y en estos casos tambin ocurre que estn directamente implicados en alguna funcionalidad de la protena, bien a nivel estructural o bien a nivel cataltico. Los grupos polares sin carga, aparecen distribuidos por la totalidad de la cadena, si bien mayoritariamente, tambin aparecen en las partes externas, en contacto con la disolucin acuosa. Como consecuencia de esta distribucin de restos, las protenas globulares son muy compactas, hay poco espacio en el interior, de modo que el agua difcilmente accede a dicho espacio. Algunas protenas, como le ocurre a la mioglobina (Fig.12) estn constituidas solo por hlices. La estructura terciaria de la mioglobina, se trata de una protena globular que contiene una sola cadena polipeptdica, constituida por ocho segmentos de hlice- . La mioglobina se halla, principalmente, en las clulas de los msculos esquelticos y es especialmente abundante en los mamferos buceadores, en los que no slo acta almacenando oxgeno, sino tambin contribuyendo al aumento de la velocidad de difusin del oxgeno. La protena, adems, contiene un componente no proteico, el grupo hemo que permite la oxigenacin y desoxigenacin de forma reversible.
Fig.12. Estructura de la Mioglobina, donde se aprecia el grupo hemo (en rojo) y los 8 segmentos en hlice-
Mioglobina
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Otras protenas globulares, como la concanavalina A (Fig.13a) (lecitina de soja) mayoritariamente est formada por regiones extensas de hoja plegada-. Por otro lado, tambin nos podemos encontrar con protenas que poseen cantidades significativas de ambos tipos de estructura secundaria, como puede ser la anhidrasa carbnica (Fig.13 b).
Fig.13. Estructura de la concanavalina A (a) y la anhidrasa carbnica (b)
d) Estructura cuaternaria: Muchas protenas globulares son oligomricas, es decir estn formadas por ms de una subunidad polipeptdica. La posicin espacial que ocupa cada una de estas subunidades respecto a las otras queda determinada por la estructura cuaternaria. La estructura cuaternaria de la hemoglobina (Hb) estara formada por cuatro subunidades (iguales dos a dos) cada una con su grupo hemo, necesario para el transporte de oxgeno.
Fig.14 Estructura cuaternaria de la hemoglobina
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En la figura 7 se mostraban los cuatro niveles estructurales presentes en la hemoglobina. As, se puede apreciar como la estructura primaria condiciona el resto de niveles estructurales de la Hb. De hecho, existen varias mutaciones de las molculas de Hb, en las que la secuencia de aminocidos difiere un poco de la secuencia de la Hb normal (conocida como HbA). La mayora de estas mutaciones son inofensivas, pero algunas causan graves enfermedades, como es el caso de la Hb de las clulas falciformes (HbS).
Fig.15a Glbulos rojos con HbA
La diferencia entre la HbA y la HbS (Fig.15a y 15b) radica slo en que en la secuencia una molcula de ac. Glutmico (polar con carga) es sustituida por una Val (apolar). Este pequeo cambio (1 de los 146 aas de las cadenas- ) tiene un profundo efecto sobre el resto de niveles estructurales, pues la apolaridad de la Val (situada en un extremo exterior) interacciona de modo hidrofbico con partes apolares de las subunidades a de otras HbS. Esto hace que las molculas se agreguen y precipiten en las clulas. Como consecuencia, los glbulos rojos (normalmente con forma de disco) adoptan una forma de media luna, obstruyendo los capilares ms delgados, restringiendo el flujo sanguneo y provocando entre otras complicaciones dolores severos y sudoracin.
Fig.15b Glbulos rojos con HbS
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UNIDAD 5 ENZIMAS 1. Introduccin 2. Las enzimas como catalizadores 3. Nomenclatura y clasificacin de enzimas 4. Cofactores enzimticos 5. Modelos de actuacin de las enzimas 6. Cintica enzimtica 7. Inhibicin enzimtica 8. Reacciones multisustrato 9. Regulacin enzimtica 1. Introduccin La vida depende de la existencia de unos catalizadores muy potentes y altamente especficos denominados enzimas. De hecho, todos los pasos de todos los procesos metablicos estn catalizados por enzimas y la capacidad cataltica se considera, junto con la capacidad de autorreplicacin, una de las caractersticas fundamentales de la vida. Con la excepcin de un pequeo grupo de molculas de RNA cataltico (los ribozimas), todas las enzimas conocidas son protenas. El nombre de enzima ("en la levadura") no se emple hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biolgicos intervenan en muchos procesos. As en 1850, Louis Pasteur concluy que la fermentacin de azcar en alcohol por levaduras estaba catalizada por lo que llam fermentos, que l consideraba inseparable de las clulas de levadura vivas. En 1897, Bchner, consigui extraer las enzimas que catalizaban la fermentacin alcohlica de las clulas de levadura, terminando as con la teora vitalista. No obstante hubo que esperar hasta 1926, cuando Sumner consigui purificar y cristalizar por primera vez una enzima, la ureasa, para demostrar su naturaleza proteica. En la actualidad se conocen ms de 2000 enzimas diferentes, muchas de las cuales se han aislado en forma pura. Se utilizan potentes tcnicas de purificacin y secuenciacin, tcnicas de difraccin de rayos X, RMN, etc., para conocer su estructura, y tcnicas de mutagnesis dirigida para conocer ms sobre su funcionalidad y sus mecanismos de actuacin. 2. Las enzimas como catalizadores La funcin principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las reacciones de los seres vivos; como tales catalizadores tienen ciertas caractersticas que vamos a estudiar a continuacin. Todas las reacciones qumicas tienen lugar porque cierta fraccin de la poblacin de molculas reactantes poseen la suficiente energa como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transicin, en el que es muy elevada la probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los productos. Este estado de transicin reside en la cima de la barrera energtica que separa los reactantes de los productos, como muestra la Figura 1. En ella se observa el diagrama de energa para una reaccin qumica, no catalizada y catalizada, donde la energa libre de activacin es la cantidad de energa necesaria para llevar todas las molculas de un mol de sustancia, a una temperatura determinada, al estado de transicin.
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Figura 1.
Evolucin energtica de una reaccin qumica. Se observa la diferencia energtica entre los estados de transicin de las reacciones catalizada y no catalizada.
Existen dos mtodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reaccin qumica. Uno de ellos es la elevacin de la temperatura (ya que provoca un incremento en la velocidad de las molculas); el otro consiste en utilizar un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activndolos, produciendo un estado de transicin de menor energa que en la reaccin no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. La Tabla 1 muestra una comparacin de las energas de activacin para la descomposicin del perxido de hidrgeno, en ausencia o presencia de un catalizador. En ella se puede apreciar cmo el catalizador enzimtico baja an ms la barrera energtica que ha de superarse desde el nivel de reactivos para alcanzar el estado de transicin. Esta es una caracterstica comn de las enzimas. Su alto poder cataltico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cul puede ser absoluta para un nico sustrato o relativa, cuando permite la reaccin de compuestos diferentes pero con una estructura similar.
Tabla 1 Descomposicin enzimtica del agua oxigenada. Comparacin de las energas de activacin para la descomposicin del perxido de hidrgeno, en ausencia o presencia de un catalizador
Reaccin
Catalizador
Temperatura (C)
Energa (Kcal/mol)
Descomposicin de H2O2
Ninguno Fe2+ Catalasa
20 22 22
18 10 1,7
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La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada clula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas combinaciones posibles entre las reacciones qumicas que estos compuestos pueden experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera especfica, aquellas reacciones que son esenciales e indispensables para que la clula viva. Adems de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos caractersticas que diferencian a las enzimas de los catalizadores qumicos, son que las enzimas pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad. 3. Nomenclatura y clasificacin de las enzimas Muchas enzimas han sido designadas aadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molcula sobre la cul ejerce su actividad cataltica. Por ejemplo la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrlisis de la arginina (a urea y ornitina). Otras enzimas han recibido su nombre en funcin del tipo de reaccin que catalizan; as la Gliceraldehdo-3Pdeshidrogenasa cataliza la oxidacin del la Gliceraldehdo-3P. Incluso algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre, sin dar informacin alguna del sustrato o la reaccin que catalizan (tripsina). No obstante existe una clasificacin sistemtica de las enzimas que las divide en 6 grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases: 1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reduccin) 2: Transferasas (transfieren grupos funcionales) 3: Hidrolasas (reacciones de hidrlisis), 4: Liasas (reacciones de adicin a los dobles enlaces) 5: Isomerasas (reacciones de isomerizacin) 6: Ligasas (formacin de enlaces con consumo de ATP). A cada enzima se le asigna un nmero con cuatro componentes. Los tres primeros indican la clase, subclase y sub-subclase, respectivamente, y el ltimo es un nmero de orden. As, por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidacin de etanol a acetaldehdo, y por lo tanto pertenece al grupo 1, se designa como EC 1.1.1.1. La Tabla 2 muestra la clasificacin internacional de las enzimas en los seis grupos antes citados.
Tabla 2 Clasificacin internacional de enzimas.
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4. Cofactores enzimticos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como protena, mientras que otras necesitan, adems, uno o ms componentes no proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metlico o bien una molcula orgnica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la protena (suele ser el in metlico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prosttico, o dbilmente unido, por lo que en realidad acta como un sustrato especfico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molcula orgnica, coenzima). La Tabla 3 muestra una relacin de iones metlicos que actan como cofactores de enzimas. Tabla 3 Iones metlicos como cofactores.
La Tabla 4 muestra algunos de las coenzimas ms habituales en la catlisis enzimtica.
Tabla 4 Algunos coenzimas mayoritarios en catlisis
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El complejo enzima-cofactor catalticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la protena restante, que por s misma es inactiva catalticamente, se designa con el nombre de apoenzima. Holoenzima = Apoenzima + Cofactor
Centro activo Apoenzima Holoenzima Cofactor

En las enzimas el cofactor puede actuar como centro cataltico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima agente estabilizante de la actividad enzimtica (conformacin). Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su estructura, alguna vitamina (sustancias orgnicas que, en cantidades mnimas, son vitales para el funcionamiento de todas las clulas, y deben figurar en la dieta de algunas especies) o molcula derivada de ella. Las coenzimas actan por lo general como transportadores intermedios de tomos especficos o de electrones. 5. Modelos de actuacin de las enzimas Para explicar la actividad cataltica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo general, en dos etapas:
S + E
ES
P + E
En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molcula de sustrato (S), para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta dando lugar al producto (P) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molcula de sustrato. Por lo general, la molcula de enzima es mucho mayor que la del sustrato por lo que slo una pequea parte de la enzima est implicada en la formacin del complejo; esta regin que interacciona con el sustrato y en la que tiene lugar la reaccin, se denomina sitio activo de la enzima. El sitio activo es una regin tridimensional de la enzima con una distribucin de los grupos nica para posibilitar la unin a su sustrato especfico. Dichos grupos del enzima no tienen por qu ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la protena y reciben el nombre de centros catalticos. El modelo ms conocido sobre el mecanismo de reaccin de las enzimas es el de Fischer, quien propuso que la molcula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo hara una llave al encajar en una cerradura, es decir, que tienen una relacin estructural complementaria (Figura 2). No obstante, esta hiptesis tiene ciertas limitaciones: si el centro activo posee una estructura prediseada para el sustrato, en caso de que sea reversible
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el proceso dicho debera estar perfectamente diseado para que tambin encaje el producto de la reaccin. De la misma forma, la teora de la llave-cerradura tampoco explica bien el fenmeno de la inhibicin enzimtica.
Figura 2. Modelos de accin enzimtica. Modelo llave-cerradura de Fischer.
Otra hiptesis ms aceptada actualmente es la del enzima flexible o de ajuste inducido (modelo de Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad geomtricamente rgida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe tener una disposicin espacial, precisa y especfica, de ciertos grupos de la enzima que en presencia del sustrato se adaptan a su estructura cuando interaccionan con l (Figura 3).
Figura 3. Modelos de accin enzimtica. Modelo de ajuste inducido de Koshland.
Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato, mediante un mecanismo de distorsin, se activan los enlaces que hay que romper y se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formacin del producto resultante de la reaccin catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso cataltico. La Figura 4 muestra el caso de una enzima (carboxipeptidasa) que nos sirve para ilustrar el modelo de Koshland, en ella se puede ver como en el sitio activo, en el que se encuentran los centros catalticos (Arg-145, Glu-270, tyr-248) y el cofactor (Zn), posee una conformacin inicial que se modifica al interaccionar con el sustrato y formal el complejo [ES].
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Figura 4. Modelo de ajuste inducido de Koshland. Carboxipeptidasa.
6. Cintica enzimtica. Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, estas muestran (adems del fenmeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo caracterstico que no se observa en los catalizadores no enzimticos, se trata de la saturacin por el sustrato, entendida en trminos de ocupacin de los centros activos de todas las molculas de enzima. Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad cataltica, ralentizando o paralizando la reaccin enzimtica. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimticos. Teniendo en cuenta que las reacciones qumicas en la clula estn catalizadas por enzimas, es fcil intuir el papel de muchos inhibidores enzimticos que actan como frmacos, antibiticos o conservantes; otros pueden ser txicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la sntesis de prostaglandinas, implicadas en la produccin del dolor. Se conocen dos tipos principales de inhibicin: la reversible y a la irreversible. La primera implica una unin no covalente del inhibidor y, por lo tanto, siempre puede revertirse. En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une al enzima de forma covalente y permanente. Inhibicin reversible: los distintos modelos de inhibicin reversible implican todos, la unin no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimtica y en la forma en que afectan a la cintica de la reaccin. Entre ellos estn la inhibicin competitiva, la acompetitiva y la no competitiva. En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la inactiva de manera irreversible. Casi todos los inhibidores irreversibles son sustancias txicas naturales o sintticas. Se trata de sustancias que reaccionan con algn grupo funcional importante para la catlisis, bloquendolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interaccin se produce a travs del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal es el caso del gas Sarn, que inhibe irreversiblemente enzimas implicadas en la transmisin del impulso nervioso y su inhalacin causa parlisis rpida de las funciones vitales.
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8. Reacciones multisustrato En este captulo hemos estudiado reacciones del tipo S-P, un mecanismo relativamente simple con un solo sustrato que podra ajustarse a reacciones catalizadas por algunas enzimas (isomerasas, hidrolasas, algunas liasas) pero es importante tener en cuenta que la gran mayora de las reacciones son multisustrato y suelen dar varios productos. Cuando una enzima une dos o ms sustratos y libera mltiples productos, el orden de los pasos para a ser una caracterstica importante del mecanismo de reaccin. Hay distintos mecanismos que explican este tipo de reacciones, veamos varios casos en los que se utilicen dos sustratos S1 y S2 y se obtengan dos productos P1 y P2. a) Unin ordenada de los sustratos: en este caso un sustrato debe unirse antes de que el segundo sustrato pueda unirse. b) Unin aleatoria de los sustratos: en este caso cualquiera de los dos sustratos puede ser el primero en unirse a la enzima. c) Mecanismo ping-pong: en este caso primero se une un sustrato, se libera el primer producto, y a continuacin se une el segundo sustrato para as liberar el segundo producto. 9. Regulacin enzimtica Una caracterstica que diferencia las enzimas de los catalizadores qumicos convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede ser ms o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulacin: Nivel de sntesis: que haya ms o menos molculas de la enzima (ya lo veremos).
Nivel de actividad: que las molculas de enzima existentes estn ms o menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrnsecos a la enzima, pH, T, [S], [I], o por factores intrnsecos a la propia enzima; en este caso hablamos de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulacin. Estn especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a seales externas. En la clula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos enzimticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que determina la velocidad de toda la ruta. La modulacin de las enzimas reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos: Enzimas alostricas. Funcionan mediante la unin reversible no covalente de compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser una activador (modulacin positiva) o un inhibidor (modulador negativo) y ser el propio sustrato de la reaccin (alosterismo homotrpico) o ser otra sustancia (alsoterismos heterotrpico). Normalmente se trata de enzimas multimricas y normalmente el sito activo y el regulatorio se encuentran en distintas subunidades. Enzimas interconvertibles Por modificacin covalente reversible, como por ejemplo por fosforilacin/defosforilacin o modificacin redox. Mediante protenas reguladoras que se unen a la enzima. Mediante la eliminacin proteoltica de pequeos segmentos peptdicos (esto es irreversible).
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UNIDAD 6 CIDOS NUCLEICOS 1. Composicin de los cidos nucleicos 2. Estructura de los nuclesidos y nucletidos 3. Estructura del ADN y de los ARNs 1. Composicin de los cidos nucleicos Los cidos nucleicos son polinucletidos, es decir, polmeros resultantes de la unin mediante enlace fosfodister de un nmero variable de unidades monomricas bsicas, denominadas nucletidos. Un nucletido est formado por tres componentes. Una pentosa, un compuesto heterocclico nitrogenado (base nitrogenada) que junto con la pentosa forma un nuclesido, y una molcula de cido fosfrico. Los nucletidos tienen papeles muy variados dentro del metabolismo celular. Son la moneda energtica en el metabolismo (ej: ATP), son mensajeros qumicos secundarios en la respuesta celular a los estmulos inducidos por hormonas o agentes externos (ej.: AMPc), constituyen una serie de importantes cofactores enzimticos y, por supuesto, son los constituyentes de los cidos nucleicos: ribonucleicos (ARN) y desoxiribonucleicos (ADN). Pentosas La ribosa o -D-ribofuranosa es la pentosa caracterstica de los ARN (cidos ribonucleicos) y la desoxirribosa o 2`-desoxi--D-ribofuranosa la de los cidos desoxirribonucleicos (ADN) (Figura 1).
HOCH 2 O
OH
HOCH 2 O
OH
Figura 1. Pentosas componentes de los cidos nucleicos.
OH ribose
OH
OH
(no O)
deoxyribose
Bases nitrogenadas pricas y pirimidnicas En la Figura 2 se representan las estructuras y los nombres de los compuestos nitrogenados aislados en la hidrlisis de los cidos nucleicos. Tres de ellos derivan de la pirimidina y son la citosina, uracilo y timina, y los otros dos derivan de la purina y son la adenina y la guanina. Cuando estos compuestos se disuelven en agua originan una disolucin de carcter bsico, por lo que se conocen con el nombre de bases nitrogenadas.
Fig.2 Estructura de las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos. Bases pricas y pirimidnicas
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Los tomos de los anillos de estas cinco bases se numeran de la misma manera que los anillos de pirimidina y purina. Esta numeracin es importante y se har referencia a ella ms adelante. Tanto el ADN como el ARN contienen adenina, guanina y citosina, si bien el uracilo slo est presente en el ARN, mientras que la timina lo est nicamente en el ADN. Es importante destacar el carcter aromtico de las bases nitrogenadas, que hace que los cidos nucleicos absorban en el UV a unos 260 nm. Son estructuras casi planas y tienen la peculiaridad de que pueden presentar diferentes formas tautmeras. Por ejemplo, la citosina puede estar en forma lactmica (normal) y entonces se empareja con la guanina, pero puede tambin adoptar forma lactmica y entonces es ms estable su unin a la adenina, lo que facilita las mutaciones espontneas y por tanto la evolucin. Adems de estas cinco bases mayoritarias los cidos nucleicos pueden contener pequeas proporciones de otras bases, normalmente derivados metilados o hidroximetilados de las bases principales.
2. Estructura de los nuclesidos y nucletidos Nuclesidos Los nuclesidos son los compuestos resultantes de la unin de las pentosas y de una base nitrogenada. Estos compuestos se unen con prdida de una molcula de agua, a travs del tomo de carbono 1' del azcar y el tomo de nitrgeno 1 de la base pirimidnica o el tomo de nitrgeno 9 de la base prica, como se indica en la Figura 3. Obsrvese que el enlace Nglucosdico es siempre .
H 2N H2N N N N HOCH2 O N N N N HOCH2 N
Figura 3. Estructura nuclesidos. de dos
OH
OH
OH
Adenosina
Desoxiadenosina
Los nombres de los nuclesidos indican su estructura. As, si el nuclesido est formado por una ribosa y una base prica, se nombra cambiando la terminacin -ina de la base por -osina (por ejemplo, de la guanina y la ribosa obtenemos la guanosina), mientras que si se trata de una base pirimidnica la terminacin cambia a -idina (de timina y ribosa obtenemos el nuclesido timidina). Por su parte, si el nuclesido se forma con desoxirribosa, delante del nombre obtenido habr que colocar el prefijo desoxi- (de adenina y desoxirribosa se obtiene el nuclesido desoxiadenosina). La Tabla 1 recoge el nombre de todas las combinaciones posibles (si bien la timidina y la desoxiuridina no existen en los cidos nucleicos naturales).
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Tabla 1: Nomenclatura de los nuclesidos.
Bases pricas A G Bases pirimidinicas C U T Citosina Uracilo Timina Adenina Guanina
Nuclesido Adenosina Guanosina
Desoxinuclesido Desoxiadenosina Desoxiguanosina
Citidina Uridina (Timidina)
Desoxicitidina (Desoxiuridina) Desoxitimidina
Nucletidos Los nucletidos son steres fosfricos de los nuclesidos. Todos los nucletidos naturales poseen el grupo fosfato unido al tomo de carbono 5' de la pentosa. En la Figura 4 se indica cmo se une el cido fosfrico con dos nuclesidos diferentes para formar los correspondientes nucletidos, en una reaccin que tambin implica prdida de una molcula de agua.
NH2 N O O
-
O O
P O CH 2 O
-
Figura 4. Estructura nucletido. de un
OH deoxyctyidine monophosphate (dCMP)
Los nucletidos se denominan combinando el nombre del nuclesido del que proceden con la palabra monofosfato. As, el ster fosfrico de adenosina se denomina 5'-monofosfato de adenosina (Tabla 2).
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Tabla 2.: Nomenclatura de los nucletidos monofosfato.
Bases pricas A G Adenina Guanina
Nucletido Monofosfato de adenosina Monofosfato de guanosina
Desoxinuclesido Monofosfato desoxiadenosina Monofosfato desoxiguanosina de de
Bases pirimidinicas C U T Citosina Uracilo Timina Monofosfato de citidina Monofosfato de uridina Monofosfato de desoxitimidina Monofosfato de desoxicitidina
Por otro lado, los ribonuclesidos y desoxirribonuclesidos corrientes aparecen en las clulas no solamente en forma monofosfato, sino que tambin pueden aparecer en forma de 5'-difosfatos (con dos molculas de fosfrico) o bien 5'-trifosfatos (con tres molculas). As los derivados de la adenosina, seran: AMP: 5'-monofosfato de adenosina ADP : 5'-difosfato de adenosina ATP : 5'-trifosfato de adenosina. Los nucletidos trifosfato (NTPs) desempean diversas funciones en las clulas. As, el ATP, es un transportador de fosfato y de pirofosfato en numerosas reacciones enzimticas en las que se requiere aporte energtico (aunque tambin pueden realizar esta funcin el GTP, el UTP y el CTP). Por otro lado, algunos NTPs, pueden actuar como transportadores de restos de azcares (energetizados) en la biosntesis de polisacridos. Por supuesto, la funcin principal de los NTPs, es la de actuar como precursores en la biosntesis enzimtica de los cidos nucleicos. 3. Estructura del ADN y de los ARNs El cido desoxirribonucleico (ADN) est constituido por cadenas de desoxirribonucletidos y el cido ribonucleico (ARN) por cadenas de ribonucletidos (ambas monofosfato). Las uniones entre nucletidos se realizan mediante enlaces fosfodister (Figura 5).
NH 2 N O P OO O P OO O P OO CH 2 O N N NH 2 N OH O CH 2 O N N NH 2 N OH O CH 2 O N N N N N
Figura 5. Enlace fosfodister nucletidos. entre
OH
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Entre el ADN y el ARN, existen tres diferencias claras: El azcar integrante del ARN es la ribosa El ARN contiene uracilo en lugar de timina El ARN est formado por una nica cadena Adems, existen tres tipos diferentes de ARN, cada uno de los cuales desempea una funcin diferente, el mensajero (ARNm), el transferente (ARNr) y el ribosmico (ARNr). Podemos distinguir varios niveles estructurales en los cidos nucleicos. La estructura primaria o secuencia indica el orden en que se encuentran los nucletidos. La ordenacin regular y estable que adopten los nucletidos puede denominarse estructura secundaria, la ms conocida es la estructura de la doble hlice del ADN, descubierta por Watson and Crick en 1953.
Estructura primaria. Secuenciacin de cidos nucleicos Una vez definido si el cido nucleico es un ADN o un ARN, la secuencia de nucletidos o estructura primaria solo vara segn las bases. Por eso un cido nucleico puede representarse por la secuencia de bases, cada base representa al nucletido que la porta.
Figura 6. Secuenciacin de cidos nucleicos. Mtodo de Sanger.
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Secuenciacin automtica. El proyecto genoma humano que acaba de ser completado (Febrero 2001) por la empresa Celera es el ms ambicioso de los proyectos de secuenciacin que ha secuenciado 35000 genes y unos 3000 millones de pares de bases con esta tecnologa. Estructura secundaria de los cidos nucleicos Los diagramas de rayos X realizados a principios de los 50 por Rosalind Franklin y Wilkins, indican que las molculas de ADN son largas cadenas helicoidales con dos periodicidades a lo largo de su eje. Su anlisis qumico pone de manifiesto diversos aspectos. La composicin en bases nitrogenadas es la misma para todas las clulas de una especie. En los ADN, la proporcin molar de adenina es siempre igual a la de timina, y anlogamente la proporcin molar de citosina es equimolar con la de guanina. Por lo tanto el nmero total de bases pricas es igual al de bases pirimidnicas (Regla de Chargaff). Basndose en estos datos, J. Watson y F. Crick propusieron un modelo estructural para el ADN. La principal caracterstica de este modelo es que una molcula de ADN consta de dos cadenas helicoidales de polinucletidos, que a su vez se hallan enrolladas alrededor de un mismo eje, formando una doble hlice dextrgira de cadenas antiparalelas, como muestra la Figura 7. Las unidades de desoxirribosa y los grupos fosfato, que forman el esqueleto de las cadenas polinucleotdicas, constituyen la parte externa de su estructura, mientras que las bases (parte hidrfoba) se sitan de forma perpendicular al esqueleto carbonado y se encuentran situadas en su interior.
Figura 7. Estructura del DNA. Doble hlice y disposicin espacial de los componentes moleculares del DNA.
Las dos cadenas, que forman la doble hlice, estn unidas entre s por puentes de hidrgeno, entre bases especficas de cada cadena. As, la guanina de una cadena est siempre unida a la citosina de la otra (a travs de tres puentes de hidrgeno), y la adenina a la de timina (por dos puentes de hidrgeno), como se muestra en la Figura 8. Esto explicara el que molculas de ADN con mayor % G+C son ms difciles de separar en hebras. Debido a la gran longitud de la molcula de ADN, existen numerosos enlaces por puente de hidrgeno entre las dos cadenas, y
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aunque este enlace es dbil, hacen que en conjunto el ADN sea una molcula muy estable. La disposicin de parte hidrfoba hacia el interior y los fosfatos y ribosas hidrfilos hacia el exterior tambin contribuye a estabilizar la estructura. Las dos cadenas son antiparalelas. Una en el sentido 5` 3`y la otra en el sentido 3` 5`.
Figura 8. Enlaces entre las bases del ADN. Puentes de hidrgeno T-A y G-C.
Las medidas de la doble hlice son muy concretas y pueden estudiarse por difraccin de rayos X. La distancia entre las cadenas es constante e igual a 1.9 nm. Hay 10.5 nucletidos por vuelta y el paso de rosca son 3.4 nm. Se aprecia un surco mayor y uno menor. Este modelo explica bien los procesos de replicacin y transcripcin, y se ha comprobado experimentalmente su validez, la estructura de Watson and Crick del DNA se conoce tambin con el nombre de B-DNA y es la estructura ms estable, pero tambin se han caracterizado otras variantes. Algunas secuencias del ADN adoptan ciertas estructuras inusuales como los palndromes o regiones o simetra rotacional.
Figura 9. Modelos del ADN. Diferentes conformaciones espaciales.
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Por su parte, las molculas de ARN son monocatenarias y con un nivel de estructura inferior al ADN. Qumicamente se caracterizan por una menor estabilidad que el ADN debido al hidroxilo reactivo del C-2 , capaz de esterificar un hidroxilo de la molcula prxima de fosfato y producir la ruptura de la cadena. La menor estabilidad se justifica en base a la funcin del ARN, que es una copia de la informacin contenida en las molculas de ADN, de menor tamao y mayor movilidad y tiene vida limitada dependiendo del requerimiento de su presencia. Las estructuras ms definidas corresponden a los ARN transferentes y los ARN ribosmicos. Los ARNt pueden representarse esquemticamente en forma de hoja de trbol (Figura 10). Comenzando por el extremo 5, los ARNt comparten las siguientes caractersticas: Un grupo fosfato 5 terminal. Un brazo de 7 pares de bases que incluye el nucletido 5 terminal y que contiene emparejamientos de bases que no son del tipo Watson-Crick, como G-U. Esta estructura se conoce como brazo aceptor o brazo del aminocido. Una horquilla de 3 4 bases apareadas que acaba en un lazo de cadena sencilla que contiene frecuentemente la base modificada dihidrouridina (D). La estructura completa recibe el nombre de brazo D. Una horquilla de 5 bases apareadas con un lazo que contiene el anticodn, el triplete de bases que es complementario al codn del ARNm. Esta estructura recibe el nombre de brazo anticodn. Una horquilla de 5 bases apareadas en un lazo monocatenario que contiene por lo general una secuencia T-pseuouridina-C. La estructura se denomina brazo T. Todos los ARNt acaban en la secuencia CCA con un grupo 3-OH libre.
Figura 10. Estructura secundaria de los ARNt.
Los ARNr son las molculas de nucleicos que constituyen la estructura de los ribosomas. Todos los ribosomas contienen dos subunidades (Figura 11). Por razones histricas, los ribosomas intactos y las subunidades se designan por unos nmeros que describen la velocidad a la que sedimentan cuando se centrifugan
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Figura 11. Estructura secundaria de los ARNr.
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UNIDAD 7 REPLICACIN, TRANSCRIPCIN Y TRADUCCIN 1. Herencia y replicacin del ADN 2. Transcripcin y ARN 3. Cdigo gentico y traduccin 1. Herencia y replicacin del ADN El ADN posee la informacin necesaria para transmitir los caracteres de una especie de generacin en generacin y conseguir la supervivencia de la especie. Por lo tanto la molcula de ADN constituye la base qumica de la herencia. La mayora de las molculas de ADN se encuentran en los cromosomas del ncleo de las clulas. El nmero de cromosomas depende de la especie, as por ejemplo, las bacterias poseen un nico cromosoma, mientras que las clulas humanas poseen 46 (23 de cada progenitor). La informacin gentica en forma de ADN se organiza estructuralmente dentro del cromosoma arrollndose alrededor de ciertas protenas (histonas) constituyendo asociaciones ADN-protena denominadas nucleosomas (Figura 1). Las cadenas de ADN de cada especie difieren en longitud y en la secuencia de las bases nitrogenadas, de tal manera que esta secuencia contiene la informacin gentica caracterstica de cada especie. La informacin gentica debe reproducirse exactamente cada vez que la clula se divide. El proceso por el que las molculas de ADN se copian a si mismas en el ncleo de las clulas recibe el nombre de replicacin del ADN. La replicacin pretende a partir de una cadena de ADN obtener dos iguales. Esta replicacin es semiconservativa, cada una de las hebras progenitoras acta como molde para la sntesis de una hebra nueva o hija.
Figura 1. Organizacin estructural del ADN en el cromosoma.
La replicacin se lleva a cabo gracias a la ADN polimerasa III, esta enzima cataliza la unin de los desoxinucletidos trifosfato que son abundantes en el fluido del ncleo celular. Estos
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desoxinucletidos trifosfato se desplazan hacia la parte desenrollada de la molcula de ADN y se colocan por complementariedad enfrente de la base que les corresponde (A=T; C=G) de la cadena que acta como molde, y una vez que estn en el sitio adecuado se unen entre si por accin de la polimerasa III. La adicin de dos unidades nucletidicas consecutivas tiene lugar mediante la unin del grupo hidroxilo del carbono 3`de un nucletido con el grupo fosfato del extremo 5`del siguiente. El mecanismo por el que se produce esta unin es un ataque nucleoflico del grupo 3`-OH de un nucletido al 5`-trifosfato del nucletido adyacente, eliminndose el pirofosfato y formndose un enlace fosfodister. La polimerasa lee la hebra que hace de molde en el sentido 3` 5` y sintetiza la nueva hebra en el sentido 5` 3`. Esta enzima necesita para iniciar la sntesis un pequeo fragmento de nucletidos que denominamos cebador. En la sntesis del cebador interviene un tipo de ARN polimerasa denominado primasa. Durante el proceso de replicacin, una de las cadenas madre se lee bien (en sentido 3` 5`) y, por lo tanto, la nueva cadena se sintetiza de corrido (hebra conductora), pero la otra est dispuesta en sentido contrario al que la polimerasa puede leer (hebra retardada). La solucin a este problema es sintetizar la cadena en pequeos fragmentos en el sentido 5` 3`. Los cebadores son luego eliminados por la accin exonucleasa de la ADN polimerasa tipo I y los nuevos fragmentos resultantes son unidos por la accin de la ligasa, que elimina las mellas que quedan entre fragmentos. La secuencia de pasos implicados la replicacin del ADN puede resumirse como sigue (Figura 2): Apertura de la doble hlice del ADN por accin de las helicasas. Sntesis de los cebadores para que la ADN polimerasa pueda actuar. Las enzimas implicadas denominan primasas. Se inicia la polimerizacin por accin de la ADN polimerasa III Cuando se alcanza el cebador del fragmento sintetizado anteriormente la Polimerasa I sustituye a la Pol III y, haciendo uso simultneo de sus actividades exonucleasa (degradadadora de nucletidos) y polimerasa, va sustituyendo los cebadores por el ADN correspondiente. Las ligasas cierran las mellas que hay entre cada dos fragmentos.
Figura 2. Visin general del proceso de replicacin del ADN.
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2. Transcripcin y ARN Consiste en la copia del ADN a tres formas distintas de ARN con diferentes funciones, ARNr (constituyente de los ribosomas), el ARNt (que transporta los aminocidos a los ribosomas durante el proceso de traduccin) y ARNm (secuencia que se traducir en protenas). Durante la replicacin el cromosoma entero se replica; en la transcripcin normalmente solo unos pocos genes o grupos de genes se transcriben. El proceso empieza cuando una parte de la doble hlice del ADN se desenrolla formado el bucle de transcripcin (unos 17 nucletidos) para servir de molde para la sntesis del ARN, de tal manera que solamente una de las dos cadenas es la que transcribe la informacin al ARN. La cadena de ADN que sirve de molde se denominacadena molde, mientras que la complementaria se llama cadena codificante, idntica en secuencia de bases al ARN transcrito excepto que la timina es sustituida por uracilo. Los ribonucletidos trifosfato existentes en el fluido celular (ATP, GTP, CTP y UTP) se desplazan hacia la parte desenrollada de la doble hlice del ADN y se sitan complementando la cadena (T=A; A=U; C=G). Cuando estos nucletidos se encuentran adecuadamente situados se unen entre si por accin de la enzima ARN-polimerasa (en el sentido 5` 3`). Finalmente, el ARN se separa y el ADN recupera la estructura de doble hlice. El ARNm as formado sufre pocas modificaciones en el caso de los procariotas, pero sufre importantes modificaciones postranscripcionales en el caso de los eucariotas, eliminndose los intrones (secuencias del genoma que no codifican nada), formando as el ARNm maduro que se traducir en protenas. El ADN se utiliza tambin como molde para la sntesis de los otros dos tipos de ARN, el transferente y el ribosmico. Las principales diferencias entre el proceso de trancripcin en procariotas y eucariotas pueden resumirse como sigue: - En procariotas no hay separacin fsica entre transcripcin y traduccin, mientras que en los eucariotas la transcripcin tiene lugar en el ncleo, donde est el ADN, y la traduccin en el citoplasma donde estn los ribosomas. - En procariotas los ARNm son policistrnicos (llevan varios genes) y en eucariotas por lo general son monocistrnicos. - En procariotas hay un solo tipo de ARN polimerasa, mientras que en eucariotas hay al menos 3 tipos de ARN polimeras distintas (una para cada tipo de ARN). - En Procariotas los ARNm sufren pocas modificaciones postranscripcionales, mientras que en eucariotas sufren muchas, entre ellas la eliminacin de intrones. La ARN polimerasa necesita al igual que la ADN polimerasa los cuatro nucletidos trifosfato (ATP, GTP, CTP, UTP), Mg2+ y la cadena patrn de ADN cuya secuencia determinar la del ARN, pero a diferencia de la ADN polimerasa no necesita cebador para iniciar la sntesis de la cadena (Figura 3). La ARN polimerasa al igual que la ADN polimerasa slo lee en el sentido 3` 5` y sintetiza la nueva hebra en el sentido 5` 3`. La primera etapa del proceso de transcripcin es la unin de la ARN polimerasa a la molcula de ADN; esta unin se produce por unas zonas especficas del ADN denominadas promotores, que indican a la enzima que tiene que empezar a transcribir. Tambin la terminacin obedece a ciertas secuencias especficas denominadas secuencias de terminacin.
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Figura 3. Visin general del proceso de transcripcin del ADN.
Los promotores son zonas especficas del ADN donde se une la ARN polimerasa para empezar la transcripcin, y dirigen la transcripcin de los genes adyacentes. Las secuencias de los promotores no son idnticas pero se han encontrado en muchas bacterias ciertas secuencias que son particularmente comunes en ciertas posiciones (secuencia consenso). Se sitan unos 10 y 35 nucletidos a la izquierda de donde se inicia la transcripcin y se llaman secuencia 35 o caja de entrada y secuencia 10 o caja TATA (Figura 4).
Figura 4. Visin de la regin del promotor en el ADN.
Tipos de ARN p ribosmico son bastantes estables, pero el mensajero es extremamente inestable, tiene una vida media de segundos. ARN Ribosmico. Los ribosomas son orgnulos intracelulares donde tiene lugar la sntesis de protenas. Estn formados por tres tipos de ARN y varias protenas diferentes, incluyendo todas las enzimas necesarias para la traduccin. Los ARNr son componentes estructurales de los ribosomas y tambin hay una serie RNA ribosmicos con funciones especiales incluyendo actividad cataltica (ribozimas). ARN Transferente. Los aminocidos se alinean frente al molde de RNAm durante la sntesis de protenas gracias a los tRNA que son capaces de leer los codones del ARNm y colocar el aminocido correspondiente en el polipptido. Estructuralmente tiene forma de trebol.
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ARN Mensajero. Es el nico que puede usarse como molde para la traduccin a protenas. Ni el rRNA ni el t RNA sirven para este fin. Son poco estables, tienen una vida media muy corta, sera antieconmico para la clula tener muchos. 3. Cdigo gentico y traduccin La traduccin se realiza utilizando una secuencia especfica de tres bases del ARNm llamada triplete de bases o codn. Cada aminocido est codificado por, al menos un triplete, que constituyen en cdigo gentico y que se recogen en la Figura 5. Este cdigo es universal (vlido para todas las especies) y degenerado (un aminocido puede estar codificado por varios codones), pero no imperfecto (un codn codifica uno y slo un aminocido). La traduccin del ARNm tiene lugar en los ribosomas y sigue los mismos pasos en procariotas y eucariotas. Cada triplete de nucletidos o codn del ARNm determina un aminocido especfico. Cada molcula de ARNt porta el aminocido correspondiente a un codn. El reconocimiento entre el ARNt y el codn tiene lugar gracias al anticodn. Entre los dos aminocidos consecutivos debe formarse el enlace peptdico, este paso est catalizado por la enzima peptidil transferasa. Luego el ribosoma se transloca, desplazandose a lo largo de la cadena peptdica que se est formando y dejando un sitio vacante para un nuevo ARNt-aminocido. La traduccin contina hasta que aparece un codn de terminacin.
Figura 5. El cdigo gentico.
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En este proceso el reconocimiento del aminocido por su correspondiente RNAt es fundamental. Este reconocimiento se debe a una enzima la aminoacil-ARNt sintetasa que tiene dos sitios especficos, uno presenta afinidad por el aminocido y otro por el ARNt. De forma, que gracias a la especificidad de esta enzima es posible la especificidad de un ARNt por su aminocido.
Figura 6. Visin general del proceso de traduccin del ARNm
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UNIDAD 8 REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA 1. Introduccin regulacin. 2. El opern lactosa 1. Introduccin. La cantidad de protenas que produce un gen activo por unidad de tiempo vara para poder satisfacer las necesidades de la clula. De hecho de todos los genes que posee un organismos solo unos pocos se expresan en un momento dado. El nivel de expresin de los genes variar segn las condiciones ambientales, el nivel de diferenciacin de la clula etc. Dado el alto coste energtico que conlleva la sntesis de protenas parece lgico que este proceso est finamente regulado. Esta regulacin se puede dar a nivel de transcripcin o de traduccin Los sistemas de regulacin difieren entre procariotas y eucariotas, especialmente si las clulas eucariotas pertenecen a organismos pluricelulares que estn organizados en tejidos. En procariotas es usual que varios enzimas de una ruta metablica sencilla sean codificadas por un nico RNAm policistrnico y que por tanto su expresin sea regulada conjuntamente (regulacin coordinada), esto no ocurre en eucariotas donde los RNAm son generalmente monocistrnicos. Existen dos categoras mayoritarias de regulacin, negativa y positiva. En un sistema de regulacin negativa existe un inhibidor o represor celular que evita la transcripcin y para iniciar la transcripcin se necesita un antagonista del inhibidor que generalmente se llama inductor. En un sistema de regulacin positiva una molcula efectora activa un promotor (no se tiene que anular ningn inhibidor). La regulacin positiva y negativa no son excluyentes, muchos sistemas estn regulados tanto positiva como negativamente. Un sistema degradativo puede estar regulado tanto positiva como negativamente. En una ruta biosinttica el producto final normalmente regula negativamente su propia sntesis. 2. Sistema del opern lac.
Un ejemplo claro de regulacin de la expresin gentica en procariotas, es el que ocurre en el opern lac. En E. Coli se requieren dos enzimas para la metabolizacin de la lactosa, la lactosa permeasa, una enzima de membrana que permite el transporte de la lactosa al interior celular y la -Galactosidasa, que cataliza la ruptura del enlace -1,4 entre la galactosa y la glucosa. La lactosa se degrada mediante rutas catablicas para la obtencin de energa, pero si en el medio no hay lactosa estas dos enzimas no son necesarias.
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UNIDAD 9 TCNICAS DE MANIPULACIN GENTICA Introduccin Las enzimas de restriccin. Aislamiento del ADN forneo Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo Mtodos de seleccin Obtencin de genotecas Electroforesis en geles de azarosa PCR (polymerase chain reaction)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
1. Introduccin La ingeniera gentica o clonacin molecular o tecnologa del DNA recombinante son trminos acuados para describir un amplio nmero de tcnicas que tienen por objeto la manipulacin de los genes que componen un organismo que puede ser desde una bacteria hasta una planta o un ser humano. Se considera que los padres de la ingeniera gentica son dos investigadores americanos en cuyos laboratorios se estudiaban durante los aos 70 los plsmidos bacterianos (Stanley Cohen, U. Stanford) y las enzimas de restriccin-modificacin (Herbert Boyer, U Columbia, San Francisco). Estos cientficos colaboraron estrechamente y sentaron las bases del DNA recombinante. La clonacin molecular consiste bsicamente en insertar un segmento de DNA que nos interesa en una molcula con capacidad autnoma de replicacin, que llamamos vector. Este vector artificial se introduce en el organismo hospedador adecuado, lo que se traduce en la sntesis de grandes cantidades del DNA deseado. Cada colonia que proviene de una sola clula se denomina clon. Los principales pasos de la estrategia general de la clonacin son: 1. 2. 3. 4. 5. Aislamiento del DNA forneo que queremos clonar Unin del fragmento al vector o vehculo de clonacin Introduccin del vector con el DNA forneo en la clula hospedadora Seleccin de la clula hospedadora con el DNA forneo Determinar si la informacin gentica se mantiene de forma estable.
Algunos de estos pasos son ms o menos comunes a todos los organismos, otros como la introduccin del vector con el DNA forneo en la clula hospedadora o la seleccin de la clula transformada pueden variar mucho segn el organismo en cuestin. 2. Las enzimas de restriccin. Aislamiento del ADN forneo El aislamiento del DNA forneo puede efectuarse utilizando una de las dos estrategias siguiente: seleccin desde el genoma que lo contiene o sntesis directa a partir de RNA mensajero.
Cortes Aislamiento Sntesis
Endonucleasas de restriccin o restrictasas Fragmentacin mecnica Sntesis de DNA a partir de RNA mensajero Sntesis qumica directa
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Endonucleasas de restriccin Son enzimas capaces de cortar el DNA. Podemos agruparlas en tres tipos: Tipo I y Tipo III. Son enzimas multifuncionales con las actividades de restriccin y modificacin. Necesitan Mg2+ y ATP y S-adenosil-metionina. Reconocen la secuencia de reconocimiento, despus recorren un cierto nmero de bases, unas 1000 en el caso de endonucleasas tipo I y unas 25 en el caso de las tipo III, por lo que rompen el DNA por secuencias ms o menos al azar. Tipo II. Rompen el DNA por la secuencia de reconocimiento por lo que dan lugar a fragmentos de longitud y secuencia definidas. Necesitan Mg2+ pero no ATP. La utilidad prctica de las endonucleasas tipo II es incalculable. Se han aislado miles de enzimas de restriccin tipo II en diferentes especies bacterianas y se emplean como herramientas para cortar el DNA artificialmente. Generalmente reconocen secuencias palindrmicas con entre 4 y 7 pares de bases. Las secuencias palindrmicas son aquellas que se leen igual en sentido 5-3 en ambas cadenas complementarias. En la Figura 1 se muestran algunas endonucleasas de restriccin con sus secuencias de reconocimiento. La Figura 2 muestra algunos palndromes.
Figura 1. : Secuencias de reconocimiento de algunas enzimas de restriccin.
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Figura 2. Palndromes.
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN Todos los vehculos de clonacin tienen como propiedad indispensable que pueden replicarse autnomamente. Adems es necesario que puedan separarse fcilmente del resto del genoma y que contengan regiones no esenciales para su propagacin y estabilidad. Plsmidos. Son replicones de DNA circular que se replican independientemente, aparecen de forma natural en las bacterias pueden tener entre 5.000 y 400.000 pares de base. La organizacin de la informacin gentica en bacterias responde en general a un cromosoma circular y una serie de fragmentos de DNA circular con capacidad autnoma de replicacin denominados plsmidos. Pueden introducirse en las clulas bacterianas por un proceso llamado transformacin. Las propiedades deseables en un plsmido para que sea un buen portador gentico son: Bajo peso molecular, as puede incorporar ms informacin. Control relajado (muchas copias por clula que se replican de forma no asociada al cromosoma). Amplio rango de hospedadores. Fenotipo seleccionable, es decir, que posea marcadores genticos como resistencia a antibiticos. Buen mapa de restriccin.
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Los plsmidos usados en ingeniera gentica son relativamente pequeos, se replican bajo control relajado y llevan genes de resistencia especficos a uno o ms antibiticos. Contienen adems un cierto nmero de sitos de restriccin para endonucleasas en los que el DNA que queremos clonar puede insertarse. Virus. Se emplean para introducir DNA forneo en una clula hospedadora. Cosmidos. Es un artificio de laboratorio, un plsmido que posee el sito cos del fago , un origen de replicacin igual que otros plsmidos, marcadores genticos y puntos nicos de corte para ciertas restrictasas. Vectores YACs (yeast artificial cromosomas). . Los YACs son segmentos lineales de DNA de levaduras que contienen todos los elementos necesarios para la replicacin autnoma en una levadura (origen de replicacin, centrmeros y telmeros). El uso de vectores capaces de incorporar segmentos de DNA mayores se hace necesario cuando vamos a clonar genomas muy grandes, como el genoma humano con un milln de pares de bases. Esto reduce el nmero de clones necesarios para tener una librera genmica completa (Figura 6).
(A)
Figura 6. Csmido (A) y YAC (B).
(B)
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La unin del fragmento de DNA al vector o vehculo de clonacin se produce por la accin de la DNA ligasa. Sella mellas existentes entre nucletidos adyacentes. Cuando se unen fragmentos creados por una endonucleasa de restriccin quedan mellas. La DNA ligasa repara estas mellas. Al producir la unin entre el inserto y el vehculo de clonacin se debe evitar la recirculacin de plsmidos. Para esto se aumenta la concentracin de DNA, favoreciendo las reacciones intermoleculares. La reaccin del plsmido con fosfatasa alcalina elimina los grupos 5`-P e impide tambin la recircularizacin. La Figura 7 muestra esquemticamente el proceso de insercin del fragmento de DNA en el vector.
Figura 7. Esquema de la insercin de un fragmento de DNA en un vector.
4. Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo La introduccin en la clula hospedadora del vector con el fragmento de DNA que se desea clonar difiere dependiendo del tipo de vector utilizado. Los mtodos utilizados se describen a continuacin. Transformacin. Se introduce el DNA plasmdico o desnudo en una clula hospedadora. Esto ocurre normalmente en la naturaleza, pero se favorece con ciertos tratamientos que modifican la permeabilidad de la membrana al DNA como CaCl2 (obtencin de clulas competentes).
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La transformacin con plsmidos de hasta 10Kb es bastante eficiente, ms de 20Kb es casi imposible. Transduccin. El DNA entra por infeccin con un bacterifago. Transfeccin. Introduccin del DNA procedente de un virus sin la cpsida; es menos eficaz. Conjugacin. Paso del DNA de una clula a otra por pili. Fusin de protoplastos. Se elimina la pared celular de dos clulas microbianas, los protoplastos se unen temporalmente, pasa la informacin de uno a otro, luego se separan y se regeneran las paredes celulares. Microinyeccin. Se usa para clulas de mayor tamao, generalmente eucariotas; se requiere un micromanipulador, aparato con microscopio, sistema de TV y micropipeta. Otros. Pistola o bombardeo de partculas se usa principalmente para la trasformacin de vegetales. Hay que tener en cuenta que cualquier combinacin no es posible. Hay ciertas limitaciones, por ejemplo: Los plsmidos con ms de 20Kb difcilmente pueden introducirse por transformacin, por lo que si el inserto es muy grande debe recurrirse a un csmido. Los derivados, de sito cos a sitio cos pueden tener entre 38-53 Kb pues se les elimina hasta 22Kb intiles: lo mximo posible a encapsidar ser la diferencia. La trasfeccin tiene un rendimiento mucho menor. 5. Mtodos de seleccin En el proceso de clonacin, y especficamente durante la introduccin de la asociacin vectorDNA forneo en la clula hospedadora, pueden ocurrir diferentes posibilidades: que entre en la clula hospedadora el DNA forneo recircularizado, el vector slo (ambas situaciones indeseables) o el portador gentico completo (vector+DNA forneo). Debe disponerse de un mtodo sencillo que permita distinguir estas clulas diferentes de forma sencilla. Normalmente, adems del marcador correspondiente los plsmidos llevan genes de resistencia a antibiticos, que permiten una primera seleccin. Resistencia a antibitico Por ejemplo, supongamos un DNA forneo que introducimos en un vector que lleva genes de resistencia a ampicilina. Se prepara un medio de cultivo con ampicilina. Las clulas que no han sido transformadas o han sido transformadas con el inserto solo recircularizado, no crecern (Figura 8). Solo crecern aquellas que tengan el plsmido, pues contendrn as el gen de resistencia al antibitico, aunque todava habr de buscarse un mecanismo que permita distinguir si las clulas tienen el plsmido solo o con el inserto (DNA forneo) correspondiente.
Figura 8.
Resistencia ampicilina
Esquema del mtodo de seleccin de clulas transformadas (I). Resistencia a antibiticos.
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Seleccin gentica.
Inactivacin insercional. Consiste en introducir el DNA forneo en un gen marcador del vector, de forma que este gen se inactive. Insercin gnica positiva. Al DNA forneo le pego un marcador de forma que las colonias con el inserto tienen las caractersticas del marcador. Hibridacin de colonias. Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hibridacin in situ con sondas marcadas radioactivamente o con otros marcajes. Se basa en la interaccin de las bases de dos cadenas de DNA complementarias. Es la misma tcnica que se usa para el southernblot. Tcnicas genticas. Supongamos que quiero clonar el gen que codifica la nitrito reductasa. Utilizo como hospedador una cepa de E.coli mutante que carece de nitrito reductasa. Si clono la nitrito, la cepa tendr la nitrito reductasa podr degradar nitrito. La causa de esto slo puede ser que la mutacin ha revertido o que se ha conseguido introducir el gen de la nitrito reductasa en E. coli. 6. Obtencin de genotecas Si partimos de cDNA o DNA sintetizando qumicamente del gen que nos interesa, conocemos muy bien lo que deseamos clonar. Pero si slo tenemos una cierta funcin gnica, por ejemplo el gen que codifica una protena, y no conocemos la localizacin de dicho gen en el genoma correspondiente, entonces tendremos que obtener una genoteca o banco de genes para realizar una bsqueda del gen de inters. 7. Electroforesis en gel de agarosa Las molculas de cidos nucleicos pueden separase por electroforesis, porque sus movilidades electroforticas al igual que ocurra con las protenas varan de forma inversa a su tamao. Se usa agarosa en vez de poliacrilamida porque los DNAs con varios miles de pb no pueden penetrar por la red de acrilamida. El uso de geles de agarosa nos permite por ejemplo separar los plsmidos del cromosoma bacteriano de mayor tamao. 8. PCR (polymerase chain reaction) La reaccin en cadena de la DNA-polimerasa fue descubierta en 1985 por Kary B. Mullis de la empresa Cetus y le vali el premio Nbel de Qumica en 1993. Permite, partiendo de un pequeo fragmento de DNA, obtener un gran nmero de copias en tan slo unas horas. La PCR se ha convertido en una tcnica indispensable en una gran variedad de aplicaciones. Como mtodo de diagnstico en clnica, en medicina forense para determinar si una muestra de pelo o esperma pertenece o no a un individuo, para mutagnesis dirigida, o en paleontologa molecular. Secuencias de organismos extinguidos cuyo DNA se ha conservado pueden amplificarse, secuenciarse y compararse con especies contemporneas. Tambin se ha conseguido amplificar el DNA de momias egipcias.
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1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
UNIDAD 10 INTRODUCCIN AL METABOLISMO Introduccin al metabolismo Concepto de anabolismo y catabolismo Mtodos de estudio de las rutas metablicas Clasificacin de los organismos atendiendo a su metabolismo Ciclo energtico en las clulas El flujo de C, O, N y energa en la biosfera Regulacin de las rutas metablicas
1.- Introduccin al metabolismo El metabolismo es el conjunto de reacciones qumicas que se dan en un organismo, cada una de ellas est catalizada por un sistema enzimtico y su finalidad es el intercambio de materia y energa entre la clula y el entorno. Las enzimas son claves para que se den los procesos metablicos y para su regulacin. Las finalidades del metabolismo son cuatro: 1. Obtencin de energa qumica de molculas combustibles o de la luz solar absorbida (esto ltimo en organismos fotosintticos). 2. Conversin de principios nutritivos exgenos en precursores de los componentes macromoleculares. 3. Ensamblaje de estos materiales para formar protenas, cidos nucleicos y otros componentes celulares. 4. Formacin y degradacin de las biomolculas necesarias para las funciones especializadas de la clula. El metabolismo intermediario comprende mapas enzimticos aparentemente muy complejos (Figura 1), pero la forma y funcin de las rutas metablicas centrales no resultan de difcil comprensin. Adems, las rutas centrales del metabolismo son muy parecidas en la mayora de las formas de vida. Consideraremos en este captulo la procedencia de los principios nutritivos y de la energa necesaria para la vida celular, las principales rutas por las que se sintetizan y degradan los componentes celulares y la ruta de transferencia de la energa celular.
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Figura 1. Esquema de las rutas metablicas centrales.
2. Rutas anablicas, catablicas y anfiblicas El metabolismo consta de dos grandes bloques de rutas: anabolismo y catabolismo. El catabolismo es la fase degradativa del metabolismo, en el cul molculas complejas y relativamente grandes (glcidos, lpidos y protenas) que provienen bien del entorno o de los propios depsitos celulares de reserva se degradan para producir molculas ms sencillas como cido lctico, cido actico, dixido de carbono, amonaco o urea. El catabolismo va acompaado de la liberacin de la energa qumica inherente a la estructura de las molculas orgnicas nutritivas y a su conservacin en forma de ATP. El anabolismo constituye la fase biosinttica del metabolismo, por la que tiene lugar la biosntesis enzimtica de los componentes moleculares de las clulas, tales como nucleicos, protenas, polisacridos o lpidos, a partir de sus precursores. La biosntesis de estas macromolculas orgnicas, necesita del consumo de energa qumica aportada por el ATP generado durante el catabolismo. La separacin entre catabolismo y anabolismo es puramente formal, fisiolgicamente ambas se desarrollan simultneamente en el tiempo y en el espacio, pero lgicamente se regulan de manera independiente. Los productos intermedios del metabolismo se denominan metabolitos. Cada ruta anablica o catablica est constituida por numerosas etapas enzimticamente catalizadas, a veces hasta 20 de ellas. La razn fundamental de esto es que la naturaleza adapta sus procesos a la moneda energtica; una ruta de 20 etapas requerira, entre gasto y consumo, el movimiento de una cantidad de energa muy superior a la que una molcula de ATP
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puede mover. Estudiando las rutas metablicas puede concluirse que la naturaleza se ha adaptado para producir la transformacin de un precursor en otra molcula producto en tanto pasos como sean necesarios en funcin de los quantum o movimientos de energa libre inherente al grupo fosfato del ATP. Es decir, dicho de manera sencilla, las transformaciones metablicas de un compuesto en otro implicarn un movimiento de energa que sea mltiplo de la moneda energtica, el enlace entre el segundo y tercer fosfato en el ATP. La degradacin enzimtica de cada uno de los elementos nutritivos mayoritarios de las clulas, a saber, polisacridos, lpidos y protenas, tiene lugar por medio de cierto nmero de reacciones enzimticas consecutivas organizadas en tres fases principales (no se incluyen nucleicos al no ser utilizados como fuente de energa por la mayor parte de los organismos). En la Fase I del catabolismo (Figura 2) las grandes molculas nutritivas se degradan, liberando los sillares qumicos sobre las que fueron construidas. As, los polisacridos se degradan rindiendo hexosas o pentosas, los lpidos producen cidos grasos, glicerina y otros componentes, y las protenas se desintegran en sus componentes aminocidos. En la Fase II del catabolismo, todos los productos anteriores se convierten en un nmero menor de intermediarios ms sencillos. As, las hexosas, pentosas y glicerina, se degradan pasando por el cido pirvico, intermediario de tres carbonos, para rendir una especie ms sencilla, de dos carbonos, el grupo acetilo del acetil-CoA. De igual forma, los diversos cidos grasos y aminocidos se escinden para formar acetil-CoA y unos pocos productos finales diferentes. Finalmente, el grupo acetilo del acetil-CoA, as como los productos de la Fase II se canalizan hacia la Fase III, ruta catablica final comn, en la que en ltimo trmino pueden ser oxidados a dixido de carbono y agua. En este sentido, el catabolismo es convergente.
Figura 2. Fases del metabolismo.
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La biosntesis tiene igualmente lugar en tres etapas (Figura 2). En la Fase III se generan molculas precursoras que en la Fase II se convierten en molculas sillares. Estas, a su vez, se ensamblan en la Fase I para constituir macromolculas. Por ejemplo, la biosntesis de protenas comienza en la Fase III con la formacin de ciertos oxocidos, que son los precursores de los aminocidos, por aminacin de los primeros. Finalmente, en la Fase I se ensamblan los aminocidos para constituir las cadenas polipeptdicas. Las rutas biosintticas o anablicas son por tanto divergentes. Las rutas catablicas y anablicas no son inversas, aunque pueden tener algn paso comn. Aunque la existencia de dos conjuntos de rutas metablicas, una para el catabolismo y otra para el anabolismo, pueda parecer un despilfarro, esta ordenacin posee ventajas importantes. La regulacin de ambos tipos de rutas es independiente, puesto que enzimticamente estn controladas por catalizadores enzimticos diferentes, y as mismo pueden estar ocurriendo en localizaciones distintas dentro de clulas eucariotas. Aunque las correspondientes rutas del catabolismo y anabolismo no son idnticas, la Fase III constituye un punto de cita central o de ruta asequible al catabolismo y al anabolismo. Esta ruta central comn, designada a veces como ruta anfiblica, posee una doble funcin; as, la ruta puede utilizarse catablicamente para producir la degradacin completa de pequeas molculas que se derivan de la Fase II del catabolismo, o bien anablicamente para suministrar a las reacciones biosintticas molculas pequeas utilizables como precursores.
3. Mtodos de estudio de las rutas metablicas. Cuando se estudia el metabolismo es necesario conocer los intermediarios metablicos, las enzimas implicadas en la ruta y su regulacin. Hay tres formas clsicas para estudiar el metabolismo: Aislamiento y caracterizacin de las enzimas y los intermediarios implicados en la ruta. Uso de mutantes auxtrofos (mutantes que necesitan la presencia de un nutriente en el medio para sobrevivir). Esto permite determinar el orden en que se suceden los precursores de la ruta. Uso de precursores isotpicamente marcados (istopos son elementos con el mismo nmero atmico pero distinta masa atmico). Por ejemplo, los istopos radiactivos son fcilmente detectables porque son inestables y emiten partculas subatmicas (32P, 14C y 3H). La resonancia magntica nuclear (RMN) detecta istopos especficos por las caractersticas de su spn nuclear (1H, 13C, 31P).
4. Clasificacin de organismos segn su metabolismo Hay muchos tipos de metabolismo, adaptados a los distintos hbitats de la tierra. Podemos clasificar a los organismos segn su metabolismo de acuerdo a los siguientes criterios: a) En funcin del aceptor de electrones de la cadena respiratoria: Aerobios. Tienen como aceptor de e- en la cadena respiratoria el O2 (formando agua). Anaerobios. Tienen como aceptor de e- en la cadena respiratoria nitrato (formando N2), sulfato (formando H2S) CO2 (formando metano). b) En funcin de la fuente de carbono: Auttrofos. Utilizan el CO2 como fuente de carbono (plantas, algas, cianobacterias). Hetertrofos. Utilizan compuestos orgnicos como fuente de carbono.
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c) En funcin de la fuente de energa: Fototrofos o fotoergnicos. Obtienen la energa de la luz (las plantas, algas y cianobacterias). Quimiotrofos o quimioergnicos. Obtienen la energa de las sustancias qumicas. Dentro de estos podemos distinguir: Litotrofos. La energa proviene de la oxidacin de sustancias qumicas inorgnicas. Organotrofos. La energa proviene de sustancias qumicas orgnicas. 5. Ciclo energtico en las clulas Cuando una molcula orgnica relativamente compleja como la glucosa se oxida con oxgeno molecular para formar 6 molculas de dixido de carbono y 6 de agua, sus tomos de carbono experimentan un incremento en el grado de libertad, se separan unos de otros en forma de CO2 y pueden adoptar as muchas posiciones diferentes unos con relacin a otros. Como resultado de esta transformacin, la molcula de glucosa experimenta una prdida de energa libre, es decir, de la forma de energa capaz de realizar trabajo bajo temperatura y presin constantes (que es, a fin de cuentas, energa contenida en los enlaces). Dicha energa perdida es parcialmente capturada por las clulas en forma de energa de enlace (en la molcula de ATP) energa redox (en NADH / FADH2). Las oxidaciones biolgicas son esencialmente combustiones sin llama, a baja temperatura. La energa libre de los combustibles celulares se conserva en forma de energa qumica inherente a los enlaces covalentes de los grupos fosfato terminales del trifosfato de adenosina, ATP, que se produce enzimticamente a partir de difosfato de adenosina (ADP) y de fosfato inorgnico (Pi) mediante reacciones enzimticas de transferencia del grupo fosfato, que estn qumicamente acopladas a etapas de oxidacin especficas del catabolismo. El ATP as formado puede difundirse entonces hacia aquellos lugares de la clula en los que se necesita energa, constituyendo una forma de transporte de la energa libre. Cierta cantidad de la energa qumica transportada por el ATP es transferida, junto con el grupo fosfato terminal del ATP, a ciertas molculas especficas aceptoras, las cuales adquieren un mayor contenido en energa y resultan energetizadas, pudiendo entonces actuar como precursores de biomolculas mayores en cuya sntesis intervienen como donadores de energa. Los electrones son otro vehculo importante para la transferencia de energa qumica procedente de las reacciones que liberan energa del catabolismo a las reacciones biosintticas que precisan de tal energa. En la biosntesis de algunas molculas ricas en hidrgeno, por ejemplo, colesterol y cidos grasos, se necesitan electrones (o tomos de hidrgeno) para la reduccin de los dobles enlaces a enlaces sencillos. Los electrones son enzimticamente transportados desde las oxidaciones liberadoras de electrones del catabolismo hasta los grupos que requieren electrones, tales como los dobles enlaces carbono-carbono o carbono oxgeno. Esto se consigue normalmente mediante coenzimas transportadoras de electrones. El coenzima ms importante es el nicotinamida adenndinucletido fosfato (NADP). Esta coenzima acta por tanto como transportador de electrones (en forma de NADPH) desde las reacciones catablicas hasta las reacciones anablicas que precisan de electrones. 6. Ciclos del carbono, oxgeno, nitrgeno y energa en la biosfera Los organismos vivos son interdependientes en el aspecto nutritivo, debido principalmente a la existencia de ciclos de elementos bsicos en la biosfera como son los del carbono, nitrgeno y oxgeno, gracias a los cuales las clulas fotosintticas y las hetertrofas se alimentan literalmente unas a otras, relacin conocida con el nombre de sintropa.
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Las clulas fotosintticas producen compuestos orgnicos tales como glucosa, a partir del CO2 y del agua, y a expensas de la energa solar. Las clulas hetertrofas utilizan compuestos orgnicos producidos por las clulas fotosintticas, como la glucosa, oxidndolos y produciendo dixido de carbono que puede nuevamente ser utilizado por las clulas fotosintticas. Acompaa al ciclo del carbono el intercambio de oxgeno entre los organismos fotosintticos y hetertrofos (Figura 3). La mayor parte de los organismos fotosintticos producen oxgeno, que es utilizado a su vez por los hetertrofos para oxidar los combustibles.
Figura 3. Ciclo del oxgeno en la biosfera.
Figura 4. Ciclo del nitrgeno en la biosfera.
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El nitrgeno, componente elemental de las protenas, los cidos nucleicos y otras biomolculas importantes, se cicla tambin a travs de los organismos vivos en la biosfera (Figura 4). Aunque el nitrgeno molecular (N2 ) se halla en gran cantidad en la atmsfera, no puede ser utilizado por la mayor parte de las formas vivas. La gran mayora de organismos lo obtienen de una forma combinada, como nitrato, amoniaco o formas ms complejas como aminocidos. Estas formas son muy escasas en aguas superficiales y experimentan un intercambio continuo. La mayor parte de los vegetales obtienen su nitrgeno del suelo en forma de nitrato, al que reducen para formar amonaco, aminocidos y otros productos reducidos. Todos estos productos son elaborados para formar los componentes nitrogenados de la clula, tales como las protenas. Los organismos hetertrofos utilizan a continuacin las protenas de las plantas como elementos nutritivos y devuelven el nitrgeno al suelo en forma de productos finales de excrecin o como productos de la putrefaccin despus de su muerte, generalmente en forma de amonaco. Los microorganismos del suelo, a su vez, oxidan el amoniaco para formar nitrito (bacterias nitrificantes como Nitrosomonas) y nitrato (bacterias nitrificantes como Nitrobacter), que pueden ser utilizados de nuevo por los vegetales. Solamente algunas formas de vida pueden reducir el nitrgeno atmosfrico y utilizarlo as como suministro biolgico de nitrgeno (bacterias fijadoras de nitrgeno como Klebsiella, Rizobium o Azotobacter y cianobacterias). En la biosfera existe un flujo masivo de energa que est muy emparejado con el ciclo del carbono. Los organismos fotosintticos capturan la energa solar, convirtindola en la energa qumica de la glucosa y otros compuestos orgnicos. Los organismos hetertrofos utilizan estos productos como precursores de sus biomolculas estructurales y como combustibles ricos en energa para ejecutar sus actividades que precisan energa. La energa solar es, por lo tanto, la fuente nica de energa para casi todos los organismos, ya sean auttrofos o hetertrofos. Sin embargo, es importante observar que la energa no se cicla en la biosfera, sino que fluye en una sola direccin. El flujo comienza con la energa solar, capturada por las clulas fotosintticas y convertida en la energa qumica de los productos fotosintticos. Estos productos son empleados despus por los hetertrofos para desempear las diversas formas de trabajo celular. En el curso de estos procesos, la energa qumica se degrada hasta formas de energa biolgicamente intiles, tales como el calor, que se disipa hacia el entorno. El flujo energtico en la biosfera es de proporciones enormes. Se emplean anualmente unas 1019 kcal de energa solar para convertir el dixido de carbono en biomasa por medio de los organismos fotosintticos de la biosfera, unas 20 veces ms que toda la energa empleada por todas las mquinas manufacturadas por el hombre sobre la tierra. Todo esto lo consiguen con una eficiencia fotosinttica del 0,3 %. Del 100 % de energa que llega a la tierra, solo un 0,3 % queda fijada por los fotosintticos como energa qumica de enlace, el resto son perdidas.
7. Regulacin de las rutas metablicas La velocidad del catabolismo viene controlada por las necesidades de ATP (energa) de la clula en cada momento, y no por la concentracin de sustratos. Las clulas slo consumen su combustible en la medida que les es necesario para proporcionar la energa requerida para sus actividades en un instante determinado. Anlogamente, la velocidad de biosntesis de los componentes celulares se ajusta a las necesidades inmediatas. Es el principio de la mxima economa el que preside todos los aspectos del metabolismo. La regulacin de cualquier ruta metablica, es decir, los mecanismos que controlan su actividad, puede ocurrir a diversos niveles.
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Primer nivel. La velocidad de reaccin de cada una de las reacciones enzimticas de la ruta depender del pH y de las concentraciones intracelulares de sustratos o productos y del cofactor, que son los elementos primarios para regular la actividad enzimtica y que directamente afecta a la velocidad del proceso catalizado. Segundo nivel. Tal como se estudi en el tema de enzimologa, la actividad puede regularse de forma muy sensible gracias a las enzimas reguladoras. Muchas enzimas son inhibidas por el producto final de la reaccin, mientras que otras son estimuladas por algn metabolito o protena reguladora. Ejemplo de ello son las enzimas alostricas. Tercer nivel. Se realiza a travs del control gentico de la velocidad de sntesis del enzima. Las enzimas que estn siempre en cantidades casi constantes en una determinada clula reciben el nombre de enzimas constitutivas, mientras que aquellas que se sintetizan solamente en respuesta a la presencia de ciertos sustratos se llaman enzimas inducibles. Los genes que especifican la sntesis de estas ltimas enzimas se encuentran generalmente bajo represin, y se desreprimen solamente en presencia de un agente inductor. Una secuencia completa de enzimas puede ser reprimida o inducida como si fuera un grupo, es decir, su sntesis est codificada por un conjunto de genes consecutivos en el ADN, llamado opern, que puede ser reprimido o desreprimido en conjunto. Cuarto nivel. En organismos multicelulares habra que apuntar un ltimo nivel de regulacin, el hormonal, molculas que actan como mensajeros qumicos, trasladndose por la sangre hasta ciertos tejidos, donde activan o inhiben de forma especfica determinadas rutas metablicas.
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UNIDAD 11 METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS 1. 2. 3. 4. 5. Glucolisis Fermentacin Transformacin del piruvato en Acetil-CoA Ciclo de los cidos tricarboxlicos Transporte electrnico y fosforilacin oxidativa
1. Glucolisis La glucolisis consiste en una secuencia de 10 reacciones enzimticas que catalizan la transformacin de una molcula de glucosa a dos de piruvato, con la produccin de dos moles de ATP y dos de NADH por mol de glucosa. Se trata de la ruta metablica mejor conocida, que desempea un papel clave en el metabolismo energtico al proporcionar una parte importante de la energa utilizada por la mayora de los organismos. Sirve en su funcin principal para preparar la glucosa y otros carbohidratos para su posterior degradacin oxidativa. En la Figura 1 se representa una visin general de la va glucoltica y su continuacin hasta la degradacin completa de la glucosa. El piruvato formado por degradacin de la glucosa puede sufrir posteriormente distintas degradaciones, dependiendo de las condiciones y del organismo: a) En condiciones aerobias, el piruvato se transforma en Acetil-CoA, que se oxida aun ms a travs del ciclo de los cidos tricarboxlicos, y posteriormente a travs de la fosforilacion oxidativa, generando CO2 y agua b) En condiciones anaerobias tiene lugar la fermentacin, que es la transformacin del piruvato hasta molculas con un grado medio de oxidacin, permitiendo la regeneracin del NAD+. Dos de las fermentaciones ms importantes son la homolctica, en el msculo, por la que el piruvato es reducido hasta lactato, y la fermentacin alcohlica, en levaduras, por la que se reduce hasta etanol y CO2 .
Figura 1. Visin general de la glucolisis.
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La glucosa, que inicia la va glucoltica en animales, aparece en la sangre directamente de la degradacin de polisacridos complejos o de su sntesis a partir de distintas fuentes de carbohidratos (gluconeognesis) y penetra en la mayor parte de las clulas a travs de un transportador especifico que la traslada hasta el citosol. Las enzimas de la glucolisis estn localizadas en el citosol. La glucolisis convierte la molcula de glucosa en dos de piruvato, en un proceso que utiliza la energa libre liberada para sintetizar ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico (Pi). Este proceso requiere de la existencia de una serie de reacciones de transferencia del grupo fosforilo acopladas qumicamente. As pues, la estrategia qumica de la glucolisis es la siguiente: a) Adicin de grupo fosforilo a la glucosa b) Conversin qumica de grupos intermediarios fosforilados a compuestos con alto potencial de transferencia de grupos fosfato. c) Acoplamiento de la hidrlisis de estos compuestos para la sntesis de ATP. Las 10 reacciones enzimticas constituyentes de la glucolisis se recogen esquemticamente en la Figura 2 y ms detalladamente en los esquemas posteriores. Al inicio de la va se consume ATP para la generacin de grupos fosforilo, pero posteriormente se regenera.
Figura 2. Visin esquemtica de las 10 reacciones de la glucolisis.
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Por tanto, la glucolisis transcurre en dos fases: FASE I. (Reacciones 1-5). Fase preparatoria en que la glucosa es fosforilada y fragmentada, dando lugar a dos molculas de gliceraldehido-3-fosfato. Este proceso consume 2 ATPs. FASE II (Reacciones 6-10). Las dos molculas anteriormente formadas se convierten a dos molculas de piruvato, con la produccin de 4 ATPs y 2 NADH. Por consiguiente, el rendimiento de la glucolisis es de dos ATPs formados por molcula de glucosa y la reaccin global sera: Glucosa + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 4H+
El NAD+ es el principal agente oxidante de la va glucoltica, as que el NADH formado durante el proceso debe ser continuamente reoxidado para mantener el suministro de NAD+. Las reacciones las dos fases de la glucolisis pueden desglosarse en sus 10 reacciones: 1. Consumo del primer ATP Transferencia del grupo fosforilo del ATP a la glucosa para formar glucosa-6-fosfato (G6P) en una reaccin catalizada por la hexoquina.
6 CH OPO 2 2 3 5 4
6 CH2OH
H
4
O H
2
ATP ADP H H
1
O H
2
H
1
H OH
3
OH
OH
Mg2+
H OH
3
OH
OH
OH
glucose
Hexokinase H OH glucose-6-phosphate
2. Isomerizacin Conversin de G6P a fructosa-6-fosfato (F6P) catalizada por la Fosfoglucosa isomerasa. Primero debe abrirse el anillo para que ocurra la isomerizacin, con posterior ciclacin de la fructosa. Para la apertura del anillo se requiere la presencia de un grupo cido, probablemente el resto de butilamonio de una lisina.
6 CH OPO 2 2 3
H
4
O H
2
H
1
6 CH OPO 2 2 3
H OH
3
1 CH2OH
H
4
HO H
OH
OH
3 OH
OH
OH
Phosphoglucose Isomerase glucose-6-phosphate fructose-6-phosphate
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3. Consumo del segundo ATP La fosfofructoquinasa fosforila la F6P para formar fructosa-1,6-bifosfato (FBP). Esta reaccin controla la velocidad de la va glucoltica. Esta reaccin es estimulada alostricamente por AMP e inhibida alostricamente por ATP y citrato.
Phosphofructokinase
6 CH OPO 2 2 3
1CH2OH
6 CH OPO 2 2 3
ATP ADP HO H
2 5
1CH2OPO32
H
4
H
4
HO H
3 OH
Mg2+
3 OH
OH
OH
fructose-6-phosphate
fructose-1,6-bisphosphate
4. Rotura La aldolasa cataliza la rotura de la FBP en dos triosas, el gliceraldehido-3-fosfato (GAP) y la dihidroxacetona fosfato (DHAP).
2
1 CH2OPO3 2C
O H OH OH
2
O
1C
HO 3 C H 4C H
5
Aldolase
CH2OPO32 3
2C
1CH2OH
H 2C OH 2 3 CH2OPO3
6 CH2OPO3
fructose-1,6bisphosphate
dihydroxyacetone phosphate
glyceraldehyde-3phosphate
Triosephosphate Isomerase
5. Isomerizacin Slo uno de los productos de la rotura aldlica, el GAP, continua la va glucoltica. La interconversin entre ste y la DHAP es catalizada por la triosa fosfato isomerasa.
1 CH2OPO3 2C
2
O H OH OH
2
O
1C
HO 3C H 4C H
5
Aldolase
CH2OPO32 3
2C
1CH2OH
H 2C OH 2 3 CH2OPO3
6 CH2OPO3
fructose-1,6bisphosphate
dihydroxyacetone phosphate
glyceraldehyde-3phosphate
Triosephosphate Isomerase
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6. Formacin del primer intermediario de "alta energa" La gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa cataliza la oxidacin y fosforilacin del GAP, por NAD+ y fosfato inorgnico, para producir el 1,3-bifosfoglicerato (BFG).
Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase
H
1C
O C OH
NAD+ + Pi
2
OPO32 + H+ O NADH 1C H
2
OH
2
3 CH2OPO3
3CH2OPO3
glyceraldehyde3-phosphate
1,3-bisphosphoglycerate
7. Primera produccin de ATP Se forma el primer ATP por defosforilacin del 1,3-bisfosfoglicerato, rindiendo adems 3fosfoglicerato (3PG) en una reaccin catalizada por la fosfoglicerato quinasa (PGK).
Phosphoglycerate Kinase
O
1C
OPO32 ADP ATP O

1
O C
H 2C OH 2 3 CH2OPO3
Mg
2+
H 2C OH 2 3 CH2OPO3
1,3-bisphosphoglycerate
3-phosphoglycerate
8. Isomerizacin La fosfoglicerato mutasa cataliza la conversin de 3PG a 2-fosfoglicerato (2PG).
Phosphoglycerate Mutase
O
1
O C
O
1
O C
H 2C OH 2 3 CH2OPO3
H 2C OPO32 3 CH2OH
3-phosphoglycerate
2-phosphoglycerate
9. Formacin del segundo intermediario de "alta energa"
91
La enolasa cataliza la deshidratacin del 2PG a fosfoenolpiruvato (PEP), formando un complejo activo por la presencia del catin magnesio.
Enolase
O
1
O C C
O
1
O C C OPO32 + H2O
OPO32
3 CH2OH
3 CH2
2-phosphoglycerate phosphoenolpyruvate
10. Produccin del segundo ATP La piruvato quinasa cataliza el acoplamiento de la energa libre de la hidrlisis del PEP a la sntesis de ATP para formar piruvato.
Pyruvate Kinase
O
1 2
O C C ADP ATP OPO32
O
1 2
O C C OH
O
1 2
O C C O
3 CH2
3 CH2
3 CH3
phosphoenolpyruvate
enolpyruvate
pyruvate
Entrada de otros azcares en la gluclisis Adems de la glucosa procedente de la degradacin de almidn y glucgeno, hay otras hexosas de importancia, como la fructosa, que procede de la hidrlisis del azcar de mesa y tambin de la fruta, la galactosa, que procede de la hidrlisis del azcar de leche (lactosa), y la manosa, obtenida a partir de la digestin de polisacridos y glucoprotenas. La fructosa es fosforilada en el msculo y convertida directamente a fructosa-6-fosfato, siguiendo despus la va glucoltica gracias a la accin de la hexoquinasa. No obstante, en el hgado la fructosa sigue una ruta ms compleja cuyo resultado final es la produccin de dos unidades de gliceraldehido-3-fosfato que se incorpora a la ruta. La galactosa se transforma en glucosa-6-fosfato, aunque este proceso parece simple las enzimas de la glucolisis no son capaces de reconocer la configuracin de la galactosa, lo que hace que el proceso sea catalizado por 5 enzimas. Una de las enzimas cataliza la trasformacin de la galactosa-1-fosfato a su derivado de uridina fosfato, revelando el papel que pueden jugar los nucleotidil-azcares en el transporte activo de determinado metabolitos. La manosa es fosforilada para rendir manosa-6-fosfato y a continuacin se produce una isomerizacin hasta fructosa-6-fosfato.
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Regulacin de la gluclisis Desde un punto de vista global podemos decir que la gluclisis se inhibe cuando hay mucho ATP. Los puntos clave en la regulacin de la gluclisis son las tres enzimas que catalizan pasos irreversibles: la hexoquinasa, la fosfofructokinasa y la piruvato kinasa.
2. Fermentacin Para la continuacin de la degradacin de glucosa, el NAD+ (en cantidades limitadas en la clula) consumido en la gluclisis debe ser reciclado. En presencia de oxgeno, el NADH pasa a la mitocondria para ser nuevamente oxidado. En condiciones anaerbicas, el NAD+ se recupera por reduccin del piruvato, en lo que constituye una extensin de la va glucoltica. Los procesos fermentativos permiten recuperar el NAD+. La fermentacin homolctica y la fermentacin alcohlica son dos ejemplos que tienen lugar en el msculo y en la levadura, respectivamente. A. Fermentacin homolctica En el msculo, especialmente durante el ejercicio intenso, cuando la demanda de ATP es elevada y se ha consumido el oxgeno, la lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la oxidacin del NADH por el piruvato para dar lactato. Los mamferos poseen hasta 5 isoenzimas de la LDH (todas ellas tetramricas) algunas de ellas estn ms adaptadas para la reaccin directa y otras para la inversa, dependendiendo de factores estructurales referentes a las distintas estructuras terciarias que puede presentar la enzima.
Lactate Dehydrogenase
O C C O O NADH + H+ NAD+ O C HC OH O
CH3
CH3
pyruvate
lactate
La reaccin global de la degradacin anaerbica de glucosa mediante la fermentacin lctica puede esquematizarse como sigue: Glucosa + 2ADP + 2Pi -------------> 2 lactato + 2ATP + 2H+ La mayor parte del lactato, producto final de la glucolisis anaerbica, es exportado de las clulas musculares por la sangre hasta el hgado, donde vuelve a convertirse en glucosa. Al contrario de lo que se cree, la causa de la fatiga muscular y el dolor no es la acumulacin de lactato en el msculo, sino del cido producido durante la glucolisis (los msculos pueden mantener su carga de trabajo en presencia de concentraciones elevadas de lactato si el pH permanece constante). Los cazadores saben del sabor agrio de la carne de un animal que ha corrido hasta agotarse antes de morir. Esto es debido a la acumulacin de cido lctico en los msculos.
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B. Fermentacin alcohlica En levadura, el NAD+ se regenera en condiciones anaerbicas mediante un proceso de gran importancia para la humanidad: la conversin de piruvato a etanol y dixido de carbono. El etanol es el componente activo de vinos y licores, y el CO2 producido en la panificacin es el responsable de la subida del pan.
Pyruvate Decarboxylase
O C C O O CO2 H C CH3 O
Alcohol Dehydrogenase
NADH + H+ NAD+ H H C OH
CH3
CH3
pyruvate
acetaldehyde
ethanol
El etanol se produce a travs de las siguientes reacciones; la primera es la descarboxilacin del piruvato para formar acetaldehido y dixido de carbono, catalizada por la piruvato descarboxilasa (ausente en animales) y que contiene la coenzima pirofosfato de tiamina (TPP) como grupo prosttico. La tiamina, vitamina B1, es esencial al no ser sintetizada ni almacenada en cantidades significativas por la mayora de vertebrados, por lo que debe ser tomada en la dieta. Su deficiencia produce importantes disfunciones, al intervenir el TPP en multitud de procesos de descarboxilacin. Una consecuencia de su falta en el hombre es la enfermedad del beriberi, que puede resultar mortal y se caracteriza por alteraciones neurolgicas, parlisis, atrofia muscular y/o paro cardiaco. El acetaldehido formado por descarboxilacin del piruvato es reducido a etanol por el NADH, en una reaccin catalizada por la alcohol deshidrogenasa (ADH). La transferencia del H del NADH al acetaldehido est favorecida por un cofactor de Zn2+, que estabiliza la carga negativa de un intermediario que se forma en el proceso. El sentido de esta reaccin vara con las concentraciones relativas de acetaldehido y etanol. As, la ADH del hgado de mamferos metaboliza los alcoholes producidos anaerbicamente por la flora intestinal, as como los que provienen de fuentes externas. En ambos tipos de fermentacin el fin ltimo es el mismo: regenerar NAD+ para poder continuar la glucolisis. La diferencia son los productos metablicos generados en funcin de las condiciones que se den. 3. Transformacin del piruvato en Acetil-CoA Los grupos acetilo entran en el ciclo en forma de acetil-CoA. Es este el producto comn de la degradacin de carbohidratos, cidos grasos y aminocidos. El grupo acetilo esta unido al grupo sulfhidrilo del CoA por un enlace tioster. Es interesante tener en cuenta que la hidrlisis del enlace tioster del acetil-CoA libera 31,5 kJ/mol y es, por lo tanto, un enlace rico en energa.
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El acetil-CoA se forma por descarboxilacin oxidativa del piruvato, por la accin del complejo enzimtico piruvato deshidrogenasa (Figura 3). Este proceso, constituye, adems, un punto de regulacin previo al ciclo de Krebs. De hecho, el complejo multienzimtico presenta dos tipos de regulacin. La piruvato dehidrogenasa est regulada por dos mecanismos superpuestos. Por una parte est alostericamente inhibida cuando las proporciones de ATP/ADP y NADH/NAD+ son altas, adems la enzima se inhibe cuando la disponibilidad de combustible para el ciclo, en forma de Acetil-CoA o cidos grasos, es alta. Y se activa cuando las demandas energticas crecen y por tanto el flujo de Acetil-CoA aumenta.
Figura 3. Conversin de piruvato en acetil-CoA.
Pyruvate Dehydrogenase
O H3C C O C O HSCoA H 3C O C S CoA
+ CO2
pyruvate
NAD+ NADH
acetyl-CoA
Por otra parte esta regulada por un mecanismo de modificacin covalente. La piruvato deshidrogenasa fosforilada es inactiva, mientras que la enzima defosforilada es activa. La interconversin entre las formas fosforilada y defosforilada est catalizada por las enzimas piruvato deshidrogenasa kinasa y la piruvato deshidrogenasa fosfatasa. La kinasa es activada por ATP (cuando la concentracin de ATP es alta, mientras que la piruvato deshidrogenasa se inactiva por fosforilacin) (Figura 4).
Enzima - Pi
Inactiva
Figura 4.: Regulacin de la piruvato deshidrogenasa.
Piruvato deshidrogenasa quinasa
+ ATP
Piruvato deshidrogenasa fosfatasa
Enzima
Activa
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4. El ciclo de los cidos tricarboxlicos Este ciclo, conocido tambin como de los cidos tricarboxlicos o ciclo de Krebs, es la va de oxidacin de la mayor parte de carbohidratos, cidos grasos y aminocidos y genera numerosos metabolitos intermediarios de otras rutas metablicas. Es, por lo tanto, un ciclo anfiblico, es decir, opera catablica y anablicamente. Una visin general del ciclo del cido ctrico nos muestra una secuencia de reacciones que, en la mitocondria, oxidan el grupo acetilo del acetil-CoA a dos molculas de dixido de carbono, de forma que se conserva la energa libre producida, utilizndola en la sntesis de ATP. El ciclo fue propuesto por Hans Krebs en 1937. Las ocho enzimas del ciclo catalizan una serie de reacciones que, globalmente, oxidan un grupo acetilo a dos molculas de dixido de carbono, con la generacin de tres molculas de NADH, una de FADH2 y una de GTP. Tal y como se muestra en la Figura 5.
Figura 5. Reacciones del ciclo de los cidos tricarboxlicos.
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1. La citrato sintetasa cataliza la condensacin entre acetil-CoA y oxalacetato para rendir citrato, que da nombre al ciclo. 2. Las dos etapas siguientes conllevan la transformacin del citrato en un ismero ms fcilmente oxidable. Para ello, la aconitasa convierte el citrato en isocitrato mediante una deshidratacin, producindose cis-aconitato unido al enzima, seguida de una hidratacin. As, el grupo hidroxilo del citrato es transferido a un tomo de carbono adyacente. 3. La isocitrato deshidrogenasa oxida el isocitrato a oxalosuccinato, con la reduccin acoplada de NAD+ a NADH. Posteriormente, el oxalosuccinato es descarboxilado, rindiendo -oxoglutarato. Esta es la primera etapa en la que la oxidacin se acopla a la produccin de NADH, y tambin la primera en la que se genera dixido de carbono. 4. El complejo enzimtico -oxoglutarato deshidrogenasa descarboxila oxidativamente el oxoglutarato a succinil-CoA. Esta reaccin conlleva la reduccin de una segunda molcula de NAD+ a NADH y la generacin de una segunda molcula de dixido de carbono. Hasta aqu ya se han producido dos molculas de dixido de carbono, por lo que se ha completado la oxidacin neta del grupo acetilo. Hay que resaltar que no son los tomos del grupo acetilo entrante los que han sido oxidados. 5. La succinil-CoA sintetasa convierte el succinil-CoA en succinato. La energa libre de la reaccin se conserva aqu por la formacin de GTP, a partir de GDP y Pi. 6. Las reacciones restantes suponen la preparacin de otra vuelta del ciclo, y para ello completan la oxidacin de succinato a oxalacetato gracias a la succinato deshidrogenasa, la cul cataliza la oxidacin del enlace sencillo situado en el centro de la molcula de succinato a un doble enlace trans, dando lugar a fumarato con la reduccin simultnea de FAD a FADH2. 7. La fumarasa cataliza despus la hidratacin del doble enlace del fumarato para rendir malato. 8. Finalmente, la enzima malato deshidrogenasa regenera el oxalacetato, oxidando el grupo alcohol secundario del malato a la correspondiente cetona, con la reduccin de una tercera molcula de NAD+ a NADH. Catalticamente, el ciclo funciona como consecuencia de la regeneracin del oxalacetato. Se pueden oxidar un nmero ilimitado de grupos acetilo con la mediacin de una sola molcula de oxalacetato, ya que sta se regenera en el ciclo. El NADH y el FADH2 son productos vitales del ciclo. Su reoxidacin por el oxgeno, a travs de la cadena de transporte electrnico y la fosforilacin oxidativa, completa la degradacin del combustible metablico para la sntesis de ATP. Hay dos aspectos importantes sobre el ciclo de Krebs que deben conocerse: a) la regulacin del ciclo b) la naturaleza anfiblica del ciclo a) Regulacin del ciclo El flujo de carbono desde el piruvato a travs del ciclo del cido ctrico est finamente regulado mediante efectores alostricos y/o modificacin covalente de ciertas enzimas regulatorias.
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Adems de la regulacin a nivel de la piruvato deshidrogenasa, este ciclo est regulado a nivel de la entrada de acetil-CoA en el ciclo (citrato sintasa). Esto es importante pues el Acetil-CoA que se incorpora al ciclo de Krebs no llega slo del piruvato sino tambin del la degradacin de otras molculas como cidos grasos y aminocidos. Adems, tambin juegan un importante papel en la regulacin del ciclo la IDH y la -cetoglutarato deshidrogenasa. Es decir, los tres pasos irreversibles son nuevamente los pasos de control del ciclo. Estas enzimas, en la mayora de los casos, parecen estar controladas de tres maneras simples: a) disponibilidad de sustrato. b) inhibicin por producto. c) inhibicin competitiva por retroalimentacin de los intermediarios que se encuentran ms adelante en el ciclo. Por ejemplo, la citrato sintasa y la IDH se inhiben por ATP, y la cetoglutarato deshidrogenasa se inhibe por sus productos succinil-CoA y NADH. En condiciones normales las velocidades de la gluclisis y del ciclo del cido ctrico estn integradas de forma que slo se metaboliza a piruvato la cantidad de glucosa necesaria para abastecer al ciclo del cido ctrico. La velocidad de la glucolisis se acopla a la del ciclo del cido ctrico no slo a travs de su inhibicin por altos niveles de ATP y NADH, productos del ciclo, sino tambin por la inhibicin por citrato, producto de la primera etapa del ciclo. b) Naturaleza anfiblica del ciclo Es interesante realizar unas breves apreciaciones sobre la doble naturaleza del ciclo de Krebs. Es obvia su naturaleza degradativa, con la consiguiente conservacin de parte de la energa libre, siendo el ciclo un importante sistema para dicha funcin conservativa en la mayora de organismos. Adems, algunos de los intermediarios del ciclo de Krebs intervienen en otras rutas biosintticas, lo que implica que continuamente tienen que ser repuestos en el ciclo del cido ctrico para no desabastecer aquellas de sustrato. Se comentan seguidamente y de forma breve algunas de estas interconexiones metablicas, citando ejemplos de rutas que utilizan intermediarios del ciclo de Krebs: 1. La biosntesis de glucosa que ocurre en el citosol utiliza malato que ha sido transportado a travs de la membrana mitocondrial. 2. La biosntesis de aminocidos utiliza de dos formas los intermediarios del ciclo; el oxoglutarato se usa en la sntesis directa de glutamato mediante una aminacin reductiva; adems dicho compuesto y el oxalacetato se emplean en la sntesis de glutamato y aspartato, respectivamente, mediante reacciones de transaminacin, ambas con alanina, para rendir los correspondientes aminocidos y piruvato. 3. La biosntesis de lpidos (que incluye la de cidos grasos o la de colesterol) son procesos que requieren acetil-CoA. Este se genera en la mitocondria y no puede ser transportado a travs de la membrana mitocondrial interna, luego el acetil-CoA citoslico se genera por degradacin del citrato, que puede atravesar la citada membrana en un transporte mediado por ATP. 5. Transporte electrnico y fosforilacin oxidativa Lavoisier ya haba demostrado que los seres vivos consuman oxgeno y producan dixido de carbono. Pero no fue hasta principios del siglo XX, despus del desarrollo de la enzimologa (en parte gracias a los trabajos de Otto Warburg) cuando se demostr que las oxidaciones biolgicas
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se catalizan mediante enzimas intracelulares. Como hemos visto, la glucosa se oxida a CO2 mediante las reacciones de glucolisis y ciclo de Krebs. Pero, cul es el destino de los electrones que pierde la glucosa en este proceso? La respuesta la discutiremos en este apartado. En los sistemas vivos, estas reacciones de transferencia electrnica ocurren a travs de una va con mltiples etapas, que aprovechan la energa libre producida para formar ATP. Los 12 pares de electrones involucrados en la oxidacin de la glucosa no pasan directamente al oxgeno, sino que se transfieren a los coenzimas NAD+ y FAD, formndose un total de 10 NADH y 2 FADH2 (Figura 6). Los electrones pasan entonces a la cadena de transporte electrnico donde participan (por la reoxidacin mitocondrial del NADH y FADH2) en un proceso de oxidacinreduccin secuencial de determinados centros redox antes de reducir el oxgeno a agua. En este proceso, los protones son expulsados de la mitocondria, y la energa libre almacenada en el gradiente de pH resultante impulsa la sntesis de ATP, a partir de ADP y Pi, a travs de la fosforilacin oxidativa. La reoxidacin de cada NADH da lugar a la sntesis de 3 ATP, y la de un FADH2 a 2 ATP. El total por molcula de glucosa oxidada es pues de 38 ATP, 30 proceden de los 10 NADH, 4 de los 2 FADH2, adems en la glucolisis se producen 2 ATP por mol de glucosa y en el ciclo de Krebs 2 GTP (= 2 ATP) por cada 2 de piruvato que entra en el ciclo. La respiracin celular y la fosforilacin oxidativa tienen lugar en las mitocondrias de los eucariotas, cuya membrana interna es impermeable a la mayora de las pequeas molculas e iones, incluyendo los protones. En los procariotas que carecen de mitocondrias las protenas de la cadena de transporte electrnico de la respiracin se encuentran en la membrana plasmtica,
Figura 6. Poder reductor generado por oxidacin de glucosa.
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La obtencin de ATP a partir de la oxidacin de NADH y FADH2 se realiza mediante la fosforilacin oxidativa. El primer paso es la entrada de los electrones en la cadena respiratoria. La mayora de los electrones provienen de la accin de dehidrogenasas que recogen los electrones de los distintos procesos catablicos y los canalizan hacia los aceptores universales de electrones (NAD+, NADP+, FMN o FAD). Entonces los electrones son transferidos a una serie de transportadores asociados a membrana (Figura 7). Estos transportadores son de naturaleza proteica y tiene grupos prostticos capaces de aceptar/donar electrones. El movimiento de electrones por los transportadores se produce desde potenciales estndar de reduccin bajos a otros ms elevados (Figura 8). En la cadena respiratoria intervienen tres tipos de molculas capaces de transportar electrones. La ubiquinona o coenzima Q (una quinona hidrofbica), los citocromos (proteinas que tienen como grupos prostticos grupos hemo con hierro) y las protenas con agrupaciones sulfo-frricas. El complejo I, tambin llamado NADH: ubiquinona oxidorreductasa transporta los electrones del NADH a la ubiquinona. El complejo II, es la succinato dehidrogenasa, nica enzima del ciclo de Krebs unida a membrana, que pasa los electrones del FADH2 a la ubiquinona. El complejo III, tambin llamado citocromo bc1 o complejo ubiquinona: citocromo c oxidorreductasa, acopla la transferencia de electrones desde la ubiquinona al citocromo c. El complejo IV, tambin llamado citocromo oxidasa, es la ltima etapa de la cadena de transporte electrnico de la respiracin y conduce los electrones desde el citocromo c hasta el ltimo aceptor de los electrones, el oxgeno que se reduce a agua.
Figura 7. Cadena de transporte electrnico. CURSO PROPEDEUTICO 2009

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Figura 8. Cadena de transporte electrnico.
Fosforilacin oxidativa La sntesis de ATP a partir de ADP y Pi en las mitocondrias est catalizada por la ATP sintasa (complejo V), y est impulsada mediante el proceso de transporte electrnico anterior. Para ello, la energa liberada durante el transporte debe conservarse en una forma que pueda ser usada por la ATP-sintasa. Esto se conoce como acoplamiento de energa o transduccin de energa. Para explicar tal acoplamiento, existen distintas hiptesis. La teora ms aceptada es la de Mitchell, que propone que los transportadores de electrones adems de transportar electrones bombean protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana en contra de gradiente, para ser llevado a cabo este proceso endergnico es acoplado a la energa producida por el transporte de electrones a favor de gradiente, de modo que se crea un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana mitocondrial interna. El potencial electroqumico de este gradiente es aprovechado por la ATP sintasa para sintetizar ATP. La ATP sintasa transporta los protones a la matriz mitocondrial a favor de gradiente y acopla este proceso exergnico a al sntesis de ATP De esta forma, el transporte electrnico provoca que los complejos I, III y IV transporten protones a travs de la membrana mitocondrial interna desde la matriz (una regin de baja concentracin de protones y potencial elctrico negativo), al espacio intermembranal (una regin de elevada concentracin de protones y potencial elctrico positivo). La energa libre secuestrada por el gradiente electroqumico resultante impulsa la sntesis de ATP por la accin de la ATP-sintasa. La ATP sintasa translocadora de protones es la estructura ms compleja de la membrana mitocondrial, contiene dos subestructuras principales (F0 y F1 ) cada una con una Funcin determinada, F0 es una protena submembranal insoluble en agua y que contiene un canal para la translocacin de los protones. F1 es una protena perifrica de membrana, soluble en agua, que participa directamente en la sntesis de ATP a partir de ADP y Pi,.( Figura 9.)
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Figura 9. Fosforilacin oxidativa. Teora quimiosmtica y complejo ATP-sintasa.
Otras respiraciones no aerobias En la respiracin aerobia el aceptor final de los electrones es el oxgeno que se reduce a agua. Pero hay organismos que son capaces de respirar sin oxgeno llevando los electrones hasta otros aceptores con el mismo objetivo final, obtener mucho ATP. Hay organismos capaces de respirar: Nitrato, generando nitrgeno (bacterias denitrificantes) Sulfato, generando sulfuro (bacterias sulforeductoras) CO2, generando metano (bacterias metanognicas)
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TEMA 12 METABOLISMO DE LPIDOS 1. 2. 3. 4. Valor energtico de los lpidos Activacin de los cidos grasos y entrada en la mitocondria -oxidacin de los cidos grasos Balance y energtica
1.- Valor energtico de los lpidos Los lpidos, al ser ms reducidos que los carbohidratos, acumulan un mayor contenido energtico que los carbohidratos. Frente a las 4 Kcal/gr de los carbohidratos, los lpidos acumulan unas 9 Kcal /gr. Esta es la razn, junto con su hidrofobicidad y su relativa poca reactividad, que facilita su almacenamiento. Constituyen la mayor reserva energtica de los animales. Los lpidos se degradan por la repeticin consecutiva de cuatro pasos hasta acetil-CoA mediante la ruta metablica conocida como la -oxidacin. El acetil-CoA puede seguir oxidndose mediante el ciclo de Krebs y la respiracin hasta CO2 y agua o puede servir como precursor para otras rutas biosintticas. Los lpidos suponen una media del 40% de los requerimientos energticos de los seres humanos (aunque no se aconseja que este valor sobrepase el 30%), y muchos animales. Las plantas los utilizan como reserva energtica en las semillas, pero no dependen de ellos como fuente energtica. Las clulas pueden obtener los cidos grasos de distintas fuentes: grasas consumidas en la dieta, grasas acumuladas en las clulas como gotas de grasa o grasas sintetizadas en un rgano que son transportadas a otro. Los vertebrados, por ejemplo, usan las tres fuentes: obtienen grasas de la dieta, de los depsitos en las clulas especializadas del tejido adiposo y el hgado convierte el exceso de carbohidratos de la dieta en grasa que se exportan a otros tejidos. Los triacilglieroles son los principales lpidos que actan como reserva energtica. Antes de ser absorbidos, las sales biliares sintetizadas en el hgado y almacenadas en la vescula biliar, los convierten en micelas finamente dispersadas para que sean ms accesibles a la accin de las lipasas, que los degradan a cidos grasos que se degradan por la b-oxidacin y glicerol, que conecta con la ruta glucoltica.
2. Activacin de los cidos grasos y entrada en la mitocondria Las enzimas de la degradacin de los cidos grasos en las clulas animales se encuentran localizadas en la matriz mitocondrial. Los cidos grasos no pueden pasar directamente del citoplasma al interior de la mitocondria, para ello deben sufrir una activacin:
O R C OH + ATP
+
O CoA-SH R C SCoA + AMP + P Pi
Los acil-CoA tiosteres formados no pueden atravesar la membrana interna mitocondrial. Los grupos acilos deben ser transferidos (gracias a la carnitina transfera I) a una molcula de carnitina, que facilita la difusin a travs de la membrana mitocondrial utilizando el transportador acil-carnitina/carnitina que funciona como una lanzadera (Figura 1).
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Figura 1. Activacin de los cidos grasos y entrada en la mitocondria.
Una vez en el interior de la matriz mitocondrial el grupo acilo es transferido nuevamente a una molcula de CoA-SH y se separa de la carnitina, gracias a la carnitina aciltransferasa II. El transporte mediado por carnitina de los cidos grasos es el paso limitante de la oxidacin de cidos grasos. 3. -oxidacin de los cidos grasos La Figura 2 representa la visin general del proceso de degradacin oxidativa de los cidos grasos. Esquemticamente, se muestra la activacin y transporte al interior de la mitocondria de un cido graso y la posterior oxidacin hasta acetil-CoA con la produccin acoplada de energa en forma de poder reductor.
104
En el proceso de oxidacin mitocondrial, el cido graso se escinde en fragmentos de dos tomos de carbono (acetil-CoA) para lo que son necesarios 4 pasos enzimticos sucesivos que se repiten (n/2 1) veces, siendo n el nmero de tomos de carbono del cido graso. Los cuatro pasos son los siguientes (Figura 3):
Figura 3. Pasos enzimticos de la oxidacin de cidos grasos.
a. Deshidrogenacin ligada a FAD, catalizada por la enzima acil-CoA deshidrogenasa. Consiste en introducir un doble enlace entre los carbonos y del cido graso. b. Adicin de agua al doble enlace formado, catalizado por la enoil-CoA hidrolasa. c. Deshidrogenacin ligada a NADH, catalizada por la hidroxiacil-CoA-deshidrogenasa. d. Tiolisis por CoA-SH, catalizada por la -ceto liasa, que introduce un nuevo grupo CoA-SH al primitivo carbono , rindiendo un acetil-CoA con dos tomos de carbono menos y una molcula de Acetil-CoA.
105
Los cidos grasos insaturados y de nmero impar de tomos de C, se degradan por este mismo mecanismo con pequeas modificaciones.
4. Balance y energtica Tomemos como ejemplo para el balance energtico la degradacin de cido palmtico, cido graso saturado que tiene 16 tomo se carbono. La degradacin por -oxidacin rendir:
O CH3 (CH2)14 C CoA
7 CoA-SH
7FADH2 / 7 NADH O 8 CH3 C CoA
Los 8 Acetil-CoA seguirn oxidndose mediante el ciclo de Krebs, por lo que se obtendrn: 24 NADH, 8 FADH2 y 8 GTP. El poder reductor generado en la -oxidacin y en el ciclo de Krebs pasar a la cadena respiratoria y se obtendr: -oxidacin NADH FADH2 GTP 7 7 Ciclo de Krebs 24 8 8 Total 31 15 8 Respiracin 93 ATP 30 ATP 8 ATP 131 ATP
Si descontamos los 2 ATP que se gastan durante la activacin del cido graso (uno equivale a la rotura del enlace P-Pi), podemos concluir que la degradacin total de un molcula de cido palmtico rinde 129 ATP.
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FUENTE: http://www.uhu.es/24003/apuntes.htm RECOPILACION Y EDICION: DR. FELIPE DE JESUS DAVILA ESQUIVEL. FEBRERO DEL 2009.
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INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA BIOQUIMICA

DR. FELIPE DE J. DAVILA ESQUIVEL FEBRERO DEL 2009.

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