SANTOS 2007 Sharline

TESE DE DOUTORADO
ESTUDO DA PRODUO DE PECTINASES

POR FERMENTAO EM ESTADO
SLIDO UTILIZANDO PEDNCULO DE
CAJU COMO SUBSTRATO

Sharline Florentino de Melo Santos

Orientadora: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo
Co-Orientador: Prof. Dr. Flvio Luiz Honorato da Silva

Natal / RN
Dezembro / 2007
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Tecnologia
Departamento de Engenharia Qumica
Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica

Sharline Florentino de Melo Santos

ESTUDO DA PRODUO DE PECTINASES POR
FERMENTAO EM ESTADO SLIDO
UTILIZANDO PEDNCULO DE CAJU COMO
SUBSTRATO.

Tese apresentada ao Programa
de Ps-Graduao em
Engenharia Qumica da
Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como parte
dos requisitos necessrios para a
obteno do grau de Doutor.

Natal / RN
Dezembro / 2007.

Diviso de Servios Tcnicos
Catalogao da Publicao na Fonte. UFRN
Biblioteca Central Zila Mamede

Santos, Sharline Florentino de Melo.
Estudo da produo de pectinase por fermentao em estado
slido utilizando pednculo de caju como substrato / Sharline
Florentino de Melo Santos. Natal, RN, 2007.
151 f.

Orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo.
Co-orientador: Flvio Luiz Honorato da Silva.

Tese (Doutorado) Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Tecnologia. Programa de Ps-Graduao em Engenharia
Qumica.

1. Processo biotecnolgico Tese. 2. Fermentao estado slido
Caju Pednculo Tese. 3. Pectinases Tese. 4.
Poligalacturonase. 5. Aspergilus niger. I. Macedo, Gorete Ribeiro de.
II. Silva, Flvio Luiz Honorato da. III. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. IV. Ttulo.

RN/UF/BCZM CDU 663.15(043.2)

ii

SANTOS, Sharline Florentino de Melo - Estudo da produo de pectinases por fermentao em
estado slido utilizando pednculo de caju como substrato. Tese de Doutorado, UFRN, Programa
de Ps-graduao em Engenharia Qumica. rea de concentrao: Alimentos e Biotecnologia,
Natal/RN Brasil.

Orientadora: Prof
a
Dr
a
Gorete Ribeiro de Macedo
Co-orientador: Prof
o
Dr
o
Flvio Luiz Honorato da Silva

RESUMO - As enzimas pectinolticas ou pectinases formam um grupo heterogneo de enzimas
que hidrolisam as substncias pcticas, so usadas na extrao de suco de fruta e sua clarificao,
tratamento de fibra txtil e extrao de leo vegetal. O objetivo deste trabalho foi o estudo da
produo de pectinases (cintica fermentativa) atravs da fermentao em estado slido, usando
como substrato o pednculo de caju seco e como agente da fermentao o microrganismo
Aspergillus niger CCT 0916. Utilizando a metodologia do planejamento experimental fatorial e
anlise de superfcie de resposta estudou-se a influncia da umidade inicial do meio, suplementao
do meio com fonte de nitrognio e fonte de fsforo. Como fonte de nitrognio foi utilizado o
sulfato de amnia e como fonte de fsforo o fosfato de potssio monobsico. Estudou-se, tambm,
a melhor condio de extrao da enzima produzida do meio de fermentao. Neste caso, foram
estudadas as variveis: razo volume de solvente/gramas de meio fermentado e tempo de contato
entre as fases, utilizando-se dois sistemas de extrao com e sem agitao. Como meio de cultivo
foram utilizados dois resduos do pednculo de caju: resduo sem lavar e resduo lavado. Estes
resduos diferem devido ao tratamento dado antes da secagem. O sem lavar foi obtido secando o
resduo aps a extrao do suco, enquanto que o lavado, foi obtido lavando-se com gua, cinco
vezes, aps a extrao do suco, na proporo 1 kg de bagao para 2 litros de gua. A caracterizao
fsico-qumica dos resduos mostrou composies diferentes, principalmente em relao aos teores
de acares redutores e pectina. Durante o cultivo foram analisados, em intervalos de
aproximadamente 12 horas, umidade do meio, pH, teor de protena, acares redutores, atividade
da poligalacturonase (PG) e o percentual de reduo de viscosidade. Para o resduo sem lavar o
pico de atividade foi com 40% de umidade e 1% de nitrognio, sem adio de fsforo, com 30
horas de cultivo sendo 16 U/g de atividade de PG e 82% de reduo de viscosidade. As equaes
empricas obtidas fornecem valores bem prximos aos experimentais nas mesmas condies de
processo, 15,55 U/g de PG e 79,57% de reduo de viscosidade para o resduo sem lavar. Assim
como para o resduo sem lavar, para o resduo lavado os picos de produo da enzima ocorreram
para as mesmas condies de processo: umidade de 40%, nitrognio de 1%, sem adio de fsforo,
com 22 horas de cultivo. Nesta condio, obteve-se atividade da poligalacturonase de 9,84 U/g e
percentual de reduo de viscosidade de 81,36%. Estes valores esto bem prximos aos valores
experimentais que foram de 10,1 U/g de PG e 81%, respectivamente. Na extrao da PG o sistema
que apresentou os melhores resultados de atividade foi o operado com agitao e a melhor
condio de extrao foi com o tempo de contato solvente com o meio de fermentao de 100
minutos e a razo volume de solvente com o meio fermentado 5 (mL/g).

Palavras-chave: Processo biotecnolgico, fermentao estado slido, pednculo de caju,
pectinases, poligalacturonase, Aspergillus niger.

Banca Examinadora:
Presidente: Prof
a
. Dr
a
. Gorete Ribeiro de Macedo (UFRN)
Membros: Prof. Dr. Flvio Luiz Honorato da Silva (UFCG)
Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos (UFRN)
Prof. Dr. Maurcio Pereira de Sales (UFRN)
Prof. Dr. Gustavo Adolfo Saavedra Pinto (EMBRAPA/CE)
Prof
a
. Dr
a
. Sueli Rodrigues (UFC)
iii

ABSTRACT

Pectinases production by solid-state fermentation using cashew apple as
substrate

Pectinolytic enzymes, or simply pectinases, are complex enzymes that degrade pectic
polymers. They have many uses, such as fruit juice extraction and purification, textile fiber
treatment and vegetal oil extraction. The aim of this work was to study the kinetics of
pectinases production by solid-state fermentation, using dry cashew apple residue as
substrate and the microorganism Aspergillus niger CCT 0916. The influence of the initial
medium moisture and medium supplementation with a source of nitrogen and phosphorus
was evaluated using the factorial experimental planning and response surface
methodology. Ammonia sulphate and potassium phosphate were used as nitrogen and
phosphorus source, respectively. The variables time of contact (T) and ratio volume
solvent/fermented medium (RZ), in systems with and without agitation, were evaluated in
order to study the best extraction condition of the produced enzyme. Washed and
unwashed cashew apple residues were tested as the growth medium. The unwashed residue
was obtained by drying the residue after the extraction of the juice, while the washed
residue was obtained by water washing 5 times using the proportion of 1 kg pulp/2 liters of
water. Samples were taken every 12 hours for moisture content, pH, protein, reducing
sugars, polygalacturonase activity (PG) and viscosity reduction. The physical-chemical
composition of the residues had different sugar and pectin levels. For the unwashed
residue, the peak activity was reached with 40% of initial moisture content, 1% of nitrogen
supplementation without phosphorus addition after 30 hours of process. These conditions
led to 16 U/g of PG activity and 82% of viscosity reduction. The calculated models
reached similar values to the experimental ones in the same process conditions: 15.55 U/g
of PG and 79.57% of viscosity reduction. Similarly, the greatest enzyme production for
washed residue was reached with 40% initial moisture content, 1% nitrogen
supplementation without phosphorus addition after 22 hours of cultivation. In this
condition it was obtained polygalacturonase activity of 9.84 U/g and viscosity reduction of
81.36%. These values are close to experimental values that were of 10.1 U/g and 81%,
respectively. The conditions that led to the best PG activity results was the agitated one and
the best extraction condition was obtained with 100 minutes of solvent/medium contact
and RZ of 5 (mL/g).

Keywords: Process, solid-state fermentation, cashew apple, pectinases, polygalacturonase,
Aspergillus niger.

iv

As minhas filhas Catarina e Ceclia
Dedico

v

SUMRIO

RESUMO................................................................................................................... ii
ABSTRACT............................................................................................................... iii
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... viii
LISTA DE TABELAS.............................................................................................. xi
NOMENCLATURA................................................................................................. xiii
1. Introduo Geral .................................................................................................. 1
2. Aspectos Tericos ................................................................................................. 5
2.1 Fermentao em estado slido..................................................................... 6
2.1.1 Breve histrico da FES....................................................................... 8
2.1.2 Fatores que influenciam o processo ................................................... 9
2.2 Biorreatores para FES ................................................................................. 19
2.2.1 Biorreatores em escala de laboratrio................................................. 20
2.2.2 Biorreatores em escala piloto e industrial........................................... 26
2.3 Microrganismos usados em FES.................................................................. 29
2.3.1. Aspergillus............................................................................................ 30
2.3.2. Estimativa da biomassa......................................................................... 33
2.4 Substratos..................................................................................................... 35
2.4.1. Caju....................................................................................................... 37
2.5 Enzimas microbianas................................................................................... 40
2.6 Substncias pcticas..................................................................................... 42
vi

2.7 Enzimas pectinolticas................................................................................. 44
2.7.1 Aplicaes das pectinases................................................................... 46
3. Estado da Arte....................................................................................................... 49
3.1 - Produo de pectinase por FES ................................................................... 50
3.2 Microrganismos usados na produo de pectinase ..................................... 55
4. Metodologia Experimental................................................................................... 58
4.1 Preparo do resduo....................................................................................... 59
4.1.1 - Caracterizao dos resduos................................................................ 60
4.1.1.1 - Granulometria.......................................................................... 60
4.1.1.2 - Densidade aparente................................................................... 61
4.1.1.3 - pH............................................................................................. 61
4.1.1.4 Umidade .................................................................................. 61
4.1.1.5 - Cinzas...................................................................................... 61
4.1.1.6 - Teor de slidos solveis (Brix)............................................... 62
4.1.1.7 - Teor de acares redutores (AR).............................................. 62
4.1.1.8 - Protena bruta............................................................................ 63
4.1.1.9 Pectinas.................................................................................... 66
4.1.2 Relao entre umidade e Aa dos resduos frente adio de gua .... 67
4.2 Microrganismo ............................................................................................ 68
4.3 Meio de cultura e manuteno do fungo ..................................................... 68
4.4 Obteno da suspenso de esporos ............................................................. 69
vii

4.5 Estudo das condies de fermentao na sntese de pectinases .................. 70
4.6 - Processo fermentativo .................................................................................. 71
4.7 Extrao da enzima ..................................................................................... 71
4.8 - Atividade da poligalacturonase .................................................................... 72
4.9 Percentual de reduo de viscosidade ......................................................... 73
4.10 - Influncia das condies de extrao da enzima........................................ 73
5. Resultados e Discusso ......................................................................................... 75
5.1 Caracterizao dos resduos secos .............................................................. 76
5.1.2 - Relao umidade e Aa dos resduos frente adio de gua .............. 78
5.2 Variveis de processo estudadas.................................................................. 80
5.2.1 - Pednculo de caju sem lavar ............................................................... 81
5.2.1.1 Avaliao do comportamento do processo atravs da
metodologia de superfcie de resposta para o resduo sem lavar ........... 89
5.2.2 Pednculo de caju lavado ................................................................... 96
5.2.2.1 Avaliao do comportamento do processo atravs da
metodologia de superfcie de resposta para o resduo lavado ................ 102
5.2.3 Avaliao do processo atravs da metodologia de superfcie de
resposta usando os picos de produo de enzima .......................................... 110
5.3 Estudo das condies de extrao da PG .................................................... 114
6.Concluso .............................................................................................................. 118
Referncias bibliogrficas........................................................................................ 121

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Tpico reator de coluna em escala de laboratrio................................... 21
Figura 2.2. Fotografia e esquema de um reator estril em escala de laboratrio....... 22
Figura 2.3. Sistema para a conduo das fermentaes em estado slido utilizando
T. aurantiacus.......................................................................................... 23
Figura 2.4. Biorreator de tambor giratrio................................................................. 24
Figura 2.5. Biorreator de tambor perfurado............................................................... 25
Figura 2.6. Fotografia de um misturador de paleta horizontal................................... 25
Figura 2.7. Diagrama esquemtico de uma sala tpica de koji operando em escala
industrial com biorreator de bandeja.......................................................................... 27
Figura 2.8. Esquema geral do reator de leito empacotado com agitao intermitente
e aerao forada......................................................................................................... 28
Figura 2.9. Morfologia representativa de espcies do gnero Aspergillus.................. 31
Figura 2.10. Estrutura da parede celular vegetal, contendo as molculas de pectina 43
Figura 2.11. Pontos de ataque das pectinases na molcula de pectina....................... 45
Figura 4.1. Resduo do pednculo de caju................................................................. 59
Figura 4.2. Resduo seco do pednculo de caju lavado............................................. 60
Figura 5.1. Distribuio granulomtrica dos resduos do pednculo de caju seco.... 78
Figura 5.2. Relao da Aa (A) e umidade (B) para diferentes volumes de gua
destilada adicionados aos resduos............................................................................. 79
Figura 5.3. Relao linear entre % de Umidade e Volume de gua destilada
adicionada aos resduos.............................................................................................. 80
ix

Figura 5.4. Ensaio 1, 40% de umidade, 0% de N e 0% de P..................................... 81
Figura 5.7. Ensaio 4, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.................................. 85
Figura 5.10. Ensaio 5, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P................................. 87
Figura 5.11. Ensaio 7, 40% de umidade, 1% de N e 0,6% de P................................ 87
Figura 5.12. Ponto central, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P...................... 88
Figura 5.13. Ponto central, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P...................... 88
Figura 5.14. Diagrama de Pareto para atividade da PG (resduo sem lavar)............. 92
Figura 5.15. Diagrama de Pareto para o percentual de reduo de viscosidade........ 93
Figura 5.16. Influncia da adio das fontes de N e P na atividade da PG para 30
horas de fermentao, fixando-se a umidade em 40% (nvel -1)............................... 94
Figura 5.17. Influncia da adio das fontes de N e P no percentual de reduo de
viscosidade para umidade inicial de 40% (nvel -1) com 30 horas de fermentao.. 95
Figura 5.18. Ensaio 1, 40% de umidade, 0% de N e 0% de P................................... 97
Figura 5.23. Ensaio 4, 60% de umidade, 1% de N, 0% de P..................................... 100
x

Figura 5.25. Ensaio 8, 60% de umidade, 1% de N e 0,6% de P................................. 101
Figura 5.26. Ensaios 9,10 e 11, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P............... 102
Figura 5.27. Diagrama de Pareto para atividade da poligalacturonase com 22 horas
de fermentao (resduo lavado)................................................................................ 105
Figura 5.28. Influncia da adio de nitrognio e fsforo na atividade da
poligalacturonase para umidade fixa em 40%............................................................ 107
Figura 5.29. Diagrama de Pareto para percentual de reduo de viscosidade com 22
horas de fermentao (resduo lavado)....................................................................... 108
Figura 5.30. Influncia da adio das fontes de nitrognio e fsforo com umidade
fixa em 40%............................................................................................................... 109
Figura 5.31. Atividade da poligalacturonase variando N e P para umidade fixa em
40% (resduo sem lavar)............................................................................................. 111
Figura 5.32. Efeito da adio de sulfato de amnia e fsforo no % de reduo de
viscosidade, para umidade fixa em 40%.................................................................... 112
Figura 5.33. Percentual de reduo de viscosidade variando N e P com 40% de
umidade, resduo lavado............................................................................................. 114
Figura 5.34. Efeito das condies de extrao na atividade poligalacturonsica
(PG) nos sistemas com e sem agitao...................................................................... 116
Figura 5.35. Efeito da razo solvente meio fermentado na extrao da
poligalacturonase nos sistemas com e sem agitao.................................................. 117
Figura 5.36. Efeito do tempo de contato solvente meio fermentado na extrao da
poligalacturonase nos sistemas com e sem agitao.................................................. 117

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1. Classificao e principais caractersticas do Aspergilluas niger............. 32
Tabela 2.2. Composio qumica mdia do caju vermelho........................................ 39
Tabela 3.1. Ocorrncia de enzimas pcticas em alguns microrganismos.................. 56
Tabela 4.1. Curva de calibrao para anlise de protena.......................................... 65
Tabela 4.2. Composio do meio bsico.................................................................. 68
Tabela 4.3. Matriz do planejamento fatorial 2
3
+ 3 repeties no ponto central...... 70
Tabela 4.4. Matriz do planejamento experimental fatorial 2
2
com trs repeties no
ponto central e pontos axiais................................................................................. 74
Tabela 5.1. Caracterizao dos resduos do pednculo de caju seco......................... 76
Tabela 5.2. Resultado experimental em termos de atividade poligalacturonsica
para o resduo do pednculo de caju sem lavar.......................................................... 89
Tabela 5.3. Resultado experimental em termos do percentual de reduo de
viscosidade para o resduo do pednculo de caju sem lavar...................................... 90
Tabela 5.4. Modelo de primeira ordem obtido para a atividade poligalacturonsica
(PG) por hora de fermentao para o resduo do pednculo de caju sem lavar......... 90
Tabela 5.5. Modelo de primeira ordem obtido para percentual de reduo de
viscosidade (RV) por hora de fermentao para o resduo do pednculo de caju
sem lavar................................................................................................................... 91
Tabela 5.6. Anlise de varincia para atividade da poligalacturonase com 30 horas
de fermentao (resduo sem lavar)........................................................................... 92
Tabela 5.7. Anlise de varincia para percentual de reduo de viscosidade com 30
horas de fermentao (resduo sem lavar)............................................................. 93

xii

Tabela 5.8. Resultado experimental em termos de atividade poligalacturonsica
para o resduo do pednculo de caju lavado..............................................................
103
Tabela 5.9. Resultado experimental em termos do percentual de reduo de
viscosidade para o resduo do pednculo de caju lavado........................................... 103
Tabela 5.10. Modelo linear obtido para a atividade poligalacturonsica (PG) por
hora de fermentao para o resduo de pednculo de caju lavado............................. 104
Tabela 5.11. Modelo linear obtido para percentual de reduo de viscosidade (RV)
por hora de fermentao para o resduo de pednculo de caju lavado....................... 104
Tabela 5.12. Anlise de varincia para atividade da poligalacturonase com 22 horas
de fermentao (resduo lavado)....................................................................... 106
Tabela 5.13. Anlise de varincia para percentual de reduo de viscosidade com
22 horas de fermentao (resduo lavado).................................................................. 108
Tabela 5.14. Anlise de varincia para atividade da poligalacturonase, pednculo
de caju sem lavar........................................................................................................ 110
Tabela 5.15. Anlise de varincia para percentual de reduo de viscosidade,
pednculo de caju sem lavar...................................................................................... 111
Tabela 5.16. Anlise de varincia para atividade da poligalacturonase do resduo
lavado......................................................................................................................... 113
Tabela 5.17. Anlise de varincia para percentual de reduo de viscosidade para o
resduo lavado......................................................................................................... 113
Tabela 5.18. Variao da atividade poligalacturonsica em funo das condies de
extrao................................................................................................................. 115

xiii

NOMENCLATURA

Brix Percentual de slidos solveis
Aa Atividade de gua
ABNT Associao Brasileira de Normas Tcnicas
abs Absorbncia
ACC Amndoa da castanha de caju
AR Acares redutores
ATP Adenosina trifosfato
C/N Carbono / nitrognio
CCT Centro de cincias e tecnologia
DNS cido 3,5 dinitro-saliclico
EMPARN Empresa de pesquisa agropecuria do Rio Grande do Norte
F Parmetro estatstico
FBB Fundao Banco do Brasil
FES Fermentao em estado slido
FS Fermentao submersa
FSS Fermentao semi-slida
GL Graus de liberdade
gms Gramas de meio slido
h Hora
LCC Resina lquida custica da castanha de caju
min Minutos
MQ Mdia quadrtica
N Nitrognio
P Fsforo
xiv

p/v Peso por volume
Pa presso de vapor de gua do substrato
PA Pureza analtica
Pa
0
presso de vapor da gua pura
PG Poligalacturonase
PGL poligalacturonato liase
PMG Polimetilgalacturonase
PMGL polimetilgalacturnato liase
Prot. Protena
R
2
Coeficiente de determinao
rpm Rotaes por minuto
RV Percentual de reduo de viscosidade
RZ Razo volume de solvente por gramas de meio fermentado
SQ Soma quadrtica
T Tempo
U/g Unidade de atividade por grama de meio
U Umidade
U.I. Unidades internacionais
UR% Umidade relativa de equilbrio
UV Ultravioleta
v/v Volume por volume

Captulo 1
Introduo Geral
Cap t ul o 1 I nt roduo Geral

Sharline Florentino de Melo Santos, dezembro, 2007.

2
1. Introduo Geral

O captulo 1 apresenta os aspectos gerais sobre os temas abordados na tese, como
definio do processo de fermentao em estado slido e sua utilizao na produo de
enzimas, o que so pectinases e suas principais aplicaes. Apresenta tambm os objetivos
deste trabalho.

A economia brasileira uma das mais importantes economias do mundo baseadas na
agricultura, produzindo e exportando caf, acar de cana, soja, mandioca, frutas, entre
outros. Entretanto, a grande produo desses produtos agrcolas gera uma grande quantidade
de resduos. Nos ltimos anos houve um aumento na tentativa de tornar mais eficientes
utilizao desses resduos, cuja disposio no meio ambiente causa srios problemas de
poluio (Soccol & Vandenberghe, 2003).
Umas das aplicaes em potencial desses resduos pode ser sua utilizao como fonte de
carbono em bioprocessos para obteno de produtos de maior valor agregado, como enzimas,
lcoois, protenas, cidos orgnicos, aminocidos, metablicos secundrios biologicamente
ativos e compostos de aroma (Uenojo & Pastore, 2007). Processos biotecnolgicos,
especialmente a tcnica de fermentao em estado slido, vem contribuindo enormemente
para tal utilizao (Soccol & Vandenberghe, 2003).
O termo fermentao em estado slido (FES), ou fermentao semi-slida, ou
fermentao em meio semi-slido aplica-se aos processos onde h crescimento de
microrganismos sobre ou dentro de partculas em matriz slida, onde a quantidade de lquido
apresenta um nvel de atividade de gua que possa garantir o crescimento e metabolismo dos
microrganismos, mas no exceda mxima capacidade de ligao da gua com a matriz
slida (Pinto et al. 2006).
A fermentao em estado slido apresenta diversas vantagens em relao fermentao
submersa principalmente quando os agentes de transformao so fungos filamentosos. Uma
delas que as condies de cultivo so mais parecidas com o habitat natural dos fungos
filamentosos, com isto os fungos esto mais adaptados para crescer e excretar maior
quantidade de enzimas (Pandey, 2003). A concentrao dos produtos aps extrao maior
que os obtidos no processo de fermentao submersa e gera menos resduo lquido. Este
processo desperta maior interesse econmico em regies com abundncia em biomassa e


3
resduos agroindustrial, que representa material barato e abundante (Castilho, Alves,
Medronho, 2000).
A produo de pednculos de caju no Brasil estimada em torno de 1,8 milho de
toneladas/ano concentrando-se basicamente na regio Nordeste e com aproveitamento
industrial de apenas 15 % do total

(Kiss, 2005). A quantidade desperdiada apresenta elevada
concentrao de nutrientes que tm potencial de uso para converso por microrganismos, na
obteno de produtos de alto valor agregado como enzimas.
As enzimas pectinoltica ou pectinases formam um grupo heterogneo de enzimas que
hidrolisam as substncias pcticas (Jayani, Saxena, Gupta, 2005). Podem ser produzidas, em
diferentes combinaes, por plantas e por microrganismos como fungos, leveduras e bactrias

(Silva et al., 2005). As pectinases microbianas respondem por 25% das vendas de enzimas
para alimentos (Jayani, Saxena, Gupta, 2005) e so muito utilizadas nas indstrias de sucos de
frutas para reduzir viscosidade, melhorar e aumentar a eficincia de filtrao e de clarificao;
no tratamento preliminar da uva em indstrias vincola; para melhorar a extrao de leos
vegetais e no tratamento e degomagem de fibras naturais para indstria txtil e de papel
(Uenojo & Pastore, 2007).
A poligalacturonase a enzima com funo hidroltica principal. Para maioria dos usos
industrial, as poligalacturonases produzidas por fungos provam ser til pela alta atividade e
atividade tima em faixa de pH baixa servindo para grande parte das aplicaes em processos
com frutas e vegetais (Zheng & Shetty, 2000).
Um grande nmero de microrganismos produz enzimas pectinolticas. Fungos so
geralmente usados como fonte das preparaes comerciais. Aspergillus e Rhizopus so
espcies freqentemente usadas pela alta atividade pectinoltica exibida dos membros gerados
(Fawole & Odunfa, 2003).
A produo de pectinases por microrganismos influenciada pelas condies de cultivo,
em particular pelo meio de cultura, tipo e concentrao da fonte de carbono, pH e temperatura
do cultivo alm de outros fatores (Bravo et al., 2000). Um aspecto importante na fermentao
em estado slido a recuperao adequada dos metablitos produzidos. A eficincia de
extrao um fator crtico que determina a viabilidade econmica da FES para produo de
enzima. Temperatura e tipo de solvente so conhecidos como importantes parmetros na
extrao de solutos de slidos. Adicionalmente, ao lidar com enzimas, necessrio levar em
conta a estabilidade trmica da enzima, que funo do tempo de exposio (Castilho, Alves,


4
Medronho, 2000).
Devido a estes fatores, o objetivo deste trabalho foi o estudo da produo de pectinases
(cintica fermentativa) atravs da fermentao em estado slido, usando como substrato o
pednculo de caju seco e como agente da fermentao o microrganismo Aspergillus niger
CCT 0916. Utilizando a metodologia do planejamento experimental fatorial e anlise de
superfcie de resposta estudou-se a influncia da umidade inicial do meio, suplementao do
meio com fonte de nitrognio e fonte de fsforo. Tambm visou estudar a melhor condio de
extrao da enzima produzida do meio de fermentao. Neste caso, foram estudadas as
variveis: razo volume de solvente/gramas de meio fermentado e tempo de contato entre as
fases, utilizando dois sistemas de extrao com e sem agitao.

Captulo 2
Aspectos Tericos
Captulo 2
Aspectos Tericos
Cap t ul o 2 Aspect os Teri cos


6
2. Aspectos Tericos

Este captulo apresenta a fundamentao terica sobre os assuntos abordados na tese.
O processo de fermentao em estado slido, os fatores que influenciam o processo, os
biorreatores utilizados e caractersticas dos microrganismos e substratos empregados, bem
como as caractersticas das enzimas pectinolticas e seu emprego industrial.

2.1 - Fermentao em estado slido
A fermentao em estado slido (FES), ou fermentao semi-slido (FSS), conforme
definida por Pandey (2002), um processo fermentativo que ocorre na ausncia ou prximo
da ausncia de gua livre, usando um slido natural como substrato ou suporte inerte.
Segundo Durand, Boise, Blachre (1988), a fermentao em estado slido definida
como um sistema com matriz de partculas slidas, uma fase lquida ligada a elas e uma fase
gasosa entre as mesmas. Este processo envolve o crescimento de microrganismos em
materiais slidos nos quais no h lquido livre. O teor de gua presente no meio est na
forma complexada ou absorvida na matriz slida (Correia, 2004).
Outras definies mais detalhadas descrevem a FES como uma tcnica de crescimento
de microrganismos sobre e no interior de partculas porosas midas (suporte ou matriz slida)
na qual o contedo de lquido contido na matriz slida deve ser mantido em valores de
atividade de gua que assegure o conveniente crescimento e metabolismo celular, mas que
no exceda a capacidade mxima de reteno de gua na matriz. A matriz slida pode ser
classificada em duas categorias: 1) as partculas so, ao mesmo tempo, suporte e substrato
(materiais orgnicos e lignocelulsicos); 2) a matriz slida apenas um suporte e deve ser
acrescida de nutrientes (Palma, 2003).
Na FES, o meio de cultura composto de substratos slidos, com um determinado teor
de umidade. Assim, a gua torna-se um fator limitante do processo, o que no ocorre na
fermentao lquida (submersa), onde h abundncia da fase aquosa (Andrade, 1999). O teor
de umidade do substrato deve variar entre 12% at cerca de 80%. Abaixo do limite mnimo,
os microrganismos no se desenvolvem. O limite superior fixado em funo da capacidade
de absoro de gua pelo material empregado.
As fermentaes submersas (FS) incluem uma variedade grande de processos
microbianos onde a biomassa completamente rodeada pelo meio de cultivo lquido. Ramana
Murthy, Karanth, Raghava Rao (1993) descreveram que a diferena entre os dois


7
bioprocessos refere-se a utilizao, na FES, do substrato slido mido, o qual insolvel em
gua e no se encontra suspenso no lquido, ao contrrio da FS, onde se utilizam substratos
slidos dissolvidos ou submersos no lquido. Gervais & Molin (2003) relataram que a
principal diferena entre a FS e FES est na capacidade de mistura dos sistemas. As FS so
reaes de mistura perfeita onde, em teoria, cada parte do reator contm, ao mesmo tempo, a
mesma quantidade de microrganismos, nutrientes e metablitos. No entanto, nos cultivos em
meio slido, encontram-se sistemas com alta viscosidade, sendo que, para se chegar a
homogeneidade, seria necessria excessiva agitao, o que levaria a ruptura celular. Assim, os
autores concluem que os sistemas de cultivo em meio slido caracterizam-se por serem meios
heterogneos, em termos de populao microbiana e concentrao de soluto (Palma, 2003).
tarefa difcil generalizar vantagens relacionadas aos processos submersos, ou em
estado slido, sabendo-se que cada microrganismo pode melhor se adequar a um ou outro
processo, bem como produzir complexos enzimticos diferentes. Abaixo so citadas algumas
caractersticas da FES quando comparada fermentao submersa.
* Menores riscos de contaminao, devido baixa umidade do meio.
* Simplicidade no preparo do meio de fermentao, pois se necessita normalmente apenas
do ingrediente principal e de gua para umedecer.
* Possibilidade de emprego de resduos abundantes e de custo reduzido como matria-
prima, especialmente em pases como o Brasil.
* Menor necessidade de espao.
* O crescimento celular ocorre em condies mais prximas aos dos habitats naturais.
* O meio apresenta alta heterogeneidade e os substratos no esto completamente acessveis
ao microrganismo.
* Maiores rendimentos e concentrao mais alta do produto desejado.
* Baixo consumo de gua.
O processo em estado slido apresenta algumas limitaes, que devem ser consideradas.
Neste contexto, destaca-se a dificuldade de remoo do calor gerado pelo metabolismo
microbiano. Alm disto, a heterogeneidade da mistura na FES dificulta o controle do
crescimento celular e de parmetros como temperatura, pH, agitao, aerao e concentrao
de nutrientes e produtos, o que torna complicado controlar e automatizar o processo (Palma,
2003).
Pandey, Soccol, Leon (2001) acreditam que a tecnologia de FES no deve ser encarada
como uma tcnica que substitui a fermentao submersa. Na verdade, cada uma destas


8
tcnicas possui suas potencialidades e particularidades. No entanto, existe o consenso da
necessidade de investigao contnua dos fatores relacionados FES para permitir que o
pleno potencial desta tecnologia seja utilizado.
A maior diferena conhecida entre FES e FS esporulao de fungo. muito fcil de
obter esporos de fungo por FES. Cultura de superfcie slida o habitat natural dos fungos, o
que torna mais fcil de conservar e controlar o ciclo morfolgico deles por FES, que por FS.
Uma aplicao prtica deste fato o uso de FES como um procedimento apropriado de
produzir esporos para vrios tipos de aplicaes industriais. Por exemplo, produo de
inculo de Penicillium roquefortii para queijos azuis e Camembert, produo de Beauveria
bassiana para uso como biopesticida e a produo de inculo fresco para comear um novo
processo de FES ou FS.

2.1.1 - Breve histrico da FES
A fermentao em meio semi-slido vem sendo utilizada desde a antiguidade. O uso do
molho de soja na China reportado desde 3000 a.C e no Japo e sudoeste da sia desde 1000
a.C (Arajo, 2004).
A produo de cido glucnico, cido ctrico e enzimas comearam a serem
desenvolvidas entre as dcadas de 1920 a 1940. Entre 1940 e 1950 o desenvolvimento de
processos de cultivo semi-slido aconteceu muito rapidamente.
A partir de 1940, os pases ocidentais direcionaram seus esforos para o
desenvolvimento e aprimoramento dos processos de FS, dando pouca ou nenhuma
importncia FES. Depois da 2
a
Guerra Mundial, os processos de FS tornaram-se muito
conhecidos, impulsionados pelo sucesso na fabricao de penicilina, tornando-se modelos
tecnolgicos para a produo de qualquer composto por fermentao. Assim, o progresso no
desenvolvimento da tecnologia de FS levou a uma estagnao de FES nos pases ocidentais.
Alguns trabalhos isolados, fazendo uso da FES, foram realizados entre 1950 e 1960,
objetivando a transformao de esterides por culturas de fungos e, entre 1960 e 1970, para a
produo de micotoxinas. No entanto, foi o enriquecimento protico de raes animais a
principal atividade que motivou a utilizao da FES nos pases Ocidentais aps 1940, pois
tratava-se de um processo que permitia a utilizao de resduos agroindustriais, agregando
valor a um material de baixo custo e, em alguns casos, minimizando a poluio causada por
estes resduos (Pandey, 2003). Este aspecto, caracterstico da FES, de interesse global e,


9
devido a isto, h um contnuo aumento do nmero de estudos relativos a este processo, que
teve um grande avano na ltima dcada.
Zheng & Shetty (1999) consideram que a partir da dcada de 80, os avanos
relacionados aos processos em meio slido incluem a diversificao no emprego de novos
microrganismos, melhorias do desempenho dos biorreatores, utilizao de novos subprodutos
e a descoberta de novos produtos.
Embora a FES tenha sido desenvolvida para a manufatura de produtos tradicionais,
como alimentos e bebidas fermentadas, sua aplicao, atualmente, tem se estendido s
indstrias farmacuticas e bioqumicas, destacando-se alguns produtos e processos como
enzimas, cidos orgnicos, etanol, biogs, antibiticos, surfactantes, toxinas, agentes de
biorremediao, cogumelos comestveis, polissacardeos microbianos, biopesticidas,
enriquecimento protico de alimentos fermentados, pr-digesto de raes animais, e
variaes dos tradicionais alimentos fermentados. De uma forma geral, a aplicao comercial
dos processos de FES podem ser divididos em dois tipos: 1) aplicaes scio-econmicas
como compostagem de resduos, ensilagem e aproveitamento de resduos agroindustrias; 2)
aplicaes lucrativas, economicamente, como produo de enzimas, cidos orgnicos e
alimentos fermentados (Palma, 2003).
Alguns processos de FES, para obteno de insumos de valor industrial, j se encontram
em nveis de grande escala como a produo de cido ctrico, que est sendo feita,
comercialmente, na Tailndia e na Indonsia, utilizando-se recursos naturais como substratos.
Recentemente, o Alltechs European Bioscience Center iniciou a produo, em larga escala,
no Mxico, da enzima fitase, tambm utilizando processo de FES (Palma, 2003).

2.1.2 - Fatores que influenciam o processo
As condies ambientais como temperatura, pH, atividade de gua, nvel de oxignio e
concentrao de nutrientes e produtos afetam significativamente o crescimento celular e a
formao de produto. Na FS o controle das condies ambientais relativamente simples
devido homogeneidade da suspenso de clulas microbianas e a soluo de nutrientes e
produtos na fase lquida. O baixo contedo de umidade na FES possibilita um pequeno
volume de reator por massa de substrato usado quando comparado com a FS e, tambm,
simplifica a separao do produto. No entanto, existem srios problemas com respeito
mistura, troca de calor, transferncia de oxignio, controle de umidade, formao de


10
gradientes de pH, nutrientes e produtos como conseqncia da heterogeneidade do sistema
(Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).
Segundo Gutierrez Rojas et al. (1998) todos os processos de fermentao em estado
slido, necessitam das seguintes etapas: seleo cuidadosa da matria-prima ou substrato,
escolha de um microrganismo especfico, controle dos parmetros da fermentao
propriamente dita, separao em alguns casos e a purificao dos produtos.
Segundo Del Bianchi, Moraes, Capalbo (2001) e Pandey (2002) o controle de
determinadas variveis se faz necessrio para a obteno de produtos com caractersticas
constantes e uniformes.

Umidade e atividade de gua (Aa)
O nvel de umidade do substrato um dos fatores que mais influenciam o processo e
varia de acordo com a natureza do substrato, tipo de produto final e necessidade do
microrganismo. Um nvel de umidade muito alto resulta em diminuio da porosidade, baixa
difuso de oxignio, aumento no risco de contaminao, reduo no volume de gs e reduo
de troca gasosa. Baixos nveis de umidade levam a um crescimento baixo em relao ao timo
e baixo grau de substrato realmente utilizado (Losane et al., 1985).
A umidade nos processos de FES geralmente varia entre 30 e 85%. A umidade tima
para o cultivo do microrganismo em FES dependente da capacidade do substrato em reter
gua. Por exemplo, o nvel de umidade timo para o cultivo de Aspergillus niger em arroz
de 40%, entretanto, para polpa de caf de 80%. Isto ilustra a insegurana de usar a umidade
como parmetro do crescimento do microrganismo. O requerimento de gua pelo
microrganismo deve ser definido em termos de atividade de gua (Aa) do meio em lugar da
umidade do substrato slido (Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).
A atividade de gua do meio (Aa) definida de acordo com a Equao 1. A umidade
revela a concentrao de gua existente em determinado material, sendo expresso
normalmente em termos percentuais. Por sua vez, a atividade de gua determina a quantidade
de gua livre do meio, prontamente utilizvel pelo microrganismo, influenciando o
crescimento microbiano, processos bioqumicos e enzimticos. A atividade de gua exerce
papel de maior importncia para a atividade fisiolgica microbiana do que aquele exercido
pelo teor de umidade do meio (Correia, 2004).



11
0
Pa
Pa
100
% UR
Aa = = (1)

Onde:
UR% = umidade relativa de equilbrio
Pa = presso de vapor de gua do substrato
Pa
0
= presso de vapor da gua pura

A relao entre a umidade e a atividade de gua extensivamente estudada por
cientistas de alimentos e so publicados estudos com as isotermas de adsoro em alimentos.
Apesar destas isotermas serem construdas para substratos usados em processos de FES,
muitas isotermas retratam relaes com Aa abaixo de 0,9 e 25% de umidade, condies
geralmente no usadas em FES. So limitados os dados sobre a relao entre Aa e a umidade
na faixa usada em FES (30-85%), em geral esta relao no linear havendo grande variao
de umidade nesta faixa para pequenas variaes de Aa. Alm disto, histerese observada em
grande nmero de isotermas de soro determinadas experimentalmente em que gua
adicionada ao substrato (adsoro) diferentemente de quando a gua removida (dessoro)
Na fermentao em estado slido, o microrganismo possui um limite de gua para suas
atividades metablicas e seu crescimento. A atividade de gua tima para fungos por volta
de 0,7; para leveduras 0,8 e para bactrias 0,9. Uma pequena flutuao nestes valores timos
causa um grande distrbio no crescimento e metabolismo dos microrganismos (Andrade,
1999).
Para cada espcie de microrganismo utilizado, existe um valor timo de umidade do
substrato para o crescimento celular, que pode no coincidir com o melhor valor para a
expresso do produto que se pretende obter no processo, como por exemplo, enzimas. Esta
constatao foi feita por Narahara et al. (1982) que estudaram o efeito da umidade do
substrato sobre a atividade de proteases e amilases produzidas por Aspergillues oryzae. Os
autores observaram que as atividades especficas diminuram nos cultivos realizados com o
substrato mais mido, condio que, no entanto, foi favorvel ao crescimento celular. Os
autores concluem que h um valor de umidade timo para a produo de enzimas em
substratos slidos o qual, no necessariamente coincide com o valor correspondente para a
obteno da mxima concentrao celular. Assim, o controle da umidade do sistema pode


12
aumentar as produtividades enzimticas nas FESs. Han, Gallagher, Wilfred (1987)
confirmam esta concluso mostrando, em seu trabalho que, a mnima umidade necessria para
o crescimento de Aspergillus ficuum no a mesma para produo de fitase, no cultivo em
estado slido, a partir de gros de cereais e sementes de leguminosas. Os autores obtiveram
que, para a produo da enzima, a umidade necessria esteve entre 25 e 35%, enquanto para o
crescimento celular os valores deveriam estar acima de 50%. Neste estudo, o nvel da
atividade de fitase foi sensivelmente reduzido quando o contedo de umidade do substrato
excedeu os 40%, alm de se observar que a faixa tima de umidade para a produo da
enzima (20 a 35%) foi muito mais estreita do que para o crescimento celular (maior que 50%).
A explicao para estes resultados, segundo os autores, pode estar no fato de que, baixas
umidades do substrato resultam em cultivos com extensa fase lag, havendo tempo suficiente
para se alcanar valores mximos de produo enzimtica (Palma, 2003).
Castilho (1997) considerando a produo de poligalacturonase por Aspergillus niger em
funo da produtividade atingida nos diferentes tempos de fermentao, com umidade
variando de 25 a 70%, concluiu que as maiores produtividades ocorreram em torno de 22
horas, com teores iniciais de umidade iguais a 40% e 55%.
Em substratos slidos, a proporo de gua ligada e no-ligada varia de acordo com a
temperatura e sendo a atividade de gua considerada como medida da gua disponvel, esta
decresce com o aumento da temperatura (Andrade, 1999).
De acordo com Correia (2004), o preparo e a seleo do substrato devem levar em conta
os nveis de atividade de gua e umidade ideais. A adio de gua ou soluo de nutrientes ao
meio pode ser utilizada de forma a alcanar os nveis ideais para o desenvolvimento do
cultivo.

Temperatura e transferncia de calor
Os processos fermentativos caracterizam-se por serem exotrmicos. Durante a FES
grandes quantidades de calor so liberadas, sendo estas diretamente proporcionais atividade
metablica do microrganismo. Em fungos filamentosos, a temperatura influencia diretamente
a germinao dos esporos, crescimento e formao de produtos. Praticamente em todas as
FES, a temperatura um fator crtico, devido ao acmulo do calor metablico gerado, pois,
alm da dificuldade de mistura do meio slido, a maioria dos substratos utilizados possui
baixa condutividade trmica, o que pode gerar gradientes de temperatura no biorreator (Pinto,
2003).


13
No incio da fermentao, tanto a temperatura como a concentrao de oxignio, so os
mesmos em qualquer ponto do leito. No entanto, com o progresso da fermentao, o oxignio
se difunde, permitindo que as reaes metablicas aconteam, fato que, por sua vez, libera
calor, o qual no facilmente dissipado devido baixa condutividade trmica do substrato e a
dificuldades na conduo atravs do leito da fermentao. Sendo assim, so formados
gradientes de temperatura e de concentrao de oxignio, que podem se tornar excessivos
dependendo dos parmetros de controle do sistema. Nesse caso podem ser formadas zonas de
alta temperatura e baixa concentrao de oxignio, que afetam negativamente a produtividade
em termos de formao de biomassa e metablitos desejveis (Palma, 2003).
Um dos pontos limitantes no controle da transferncia de calor na FES que as tcnicas
e conceitos usados para esta finalidade nas fermentaes submersas no so facilmente
adaptados para as fermentaes conduzidas em meio slido. Para remoo do calor gerado
durante a FES, o mtodo do resfriamento evaporativo, injetando-se ar parcialmente saturado,
baixa temperatura um dos mais promissores (Palma, 2003).
Vrias estratgia para remoo do calor podem ser adotadas:
o Aerao forada com ar mido remove calor por conduo
o Aerao forada com ar seco remove calor por evaporao
o Resfriamento da superfcie externa do biorreator, com jaqueta de gua
o Circulando gua resfriada atravs de um trocador de calor interno
o Colocar o biorreator em uma sala com temperatura controlada ou em
um banho com gua (pequena escala)
Estes mtodos podem ser usados de forma combinada. Remover calor por evaporao
o mtodo mais eficiente e pode remover 80% do calor gerado. No entanto, a perda de
umidade nesta escala representa um srio problema na FES onde o contedo de umidade j
baixo. Neste caso, o resfriamento por evaporao pode ser acompanhado por reposio de
umidade.
Del Bianchi, Moraes, Capalbo (2001) apresentam a taxa de produo de protenas por
Aspergillus niger em relao temperatura empregada no processo. Observaram que a
temperatura de 40C apresentou menor tempo na fase lag, mas 35C obteve maiores valores
de produo de protena. Para a temperatura equivalente a 45C houve uma perda sensvel na
eficincia do processo.
Rizzato, Alegre, Gomes (2005) estudaram as variaes de temperatura, a influncia da
densidade aparente do leito semi-slido na produo de poligalacturonase por Penicillium


14
italicum IZ1587, utilizando bagao de laranja em reatores de coluna encamisados e
perceberam ao longo do processo que a temperatura no centro do reator se elevou de 28C
para 31,9C com densidade de 430g/L e 36,2C no leito com densidade aparente de 760g/L. O
crescimento celular foi menor nos meios com maior densidade aparente levando a uma menor
atividade enzimtica.
Ghildyal et al. (1981) estudaram a produo em larga escala de enzimas pectinolticas
por FES em farelo de trigo por Aspergillus carbanerius CFTRI1048, em um fermentador de
bandeja comercial, com capacidade para 96 bandejas e controle de umidade, temperatura e
circulao de ar, perceberam que quando o controle de temperatura no foi empregado, a
temperatura do meio aumentou desde 25C at 45,2C devido gerao de calor durante a
fermentao, resultando em diminuio de cerca de 12% na produo da enzima.

pH
Embora o pH seja um fator relevante para a otimizao dos processos em estado slido
o controle e monitoramento deste parmetro, durante as FESs, no fcil de ser realizado
(Pandey, 2003).
Alguns eletrodos tm sido utilizados para medidas do pH diretamente da superfcie do
substrato slido, mas a medida na suspenso aquosa ou no extrato, preparado a partir da
amostra slida, o procedimento mais comum. Entretanto, a forma da gua nos substratos
slidos constitui um obstculo para a medida do pH. Na maioria dos casos mede-se o pH aps
colocar, em suspenso, uma parte da amostra slida em 3 a 4 partes de gua. Este mtodo
permite medir o pH global, todavia no totalmente representativo dos valores de pH nos
micro ambientes, localizados no filme aquoso, onde se passam, na realidade, as reaes
bioqumicas. Sendo assim, a determinao exata do pH, em substratos slidos feita, com
preciso, somente no incio e no final do processo fermentativo (Palma, 2003).
Como tentativa de amenizar o efeito de uma variao brusca do pH, utilizam-se
substratos com boa capacidade tamponante ou a adio de solues-tampo durante a etapa de
umidificao do substrato (Del Bianchi, Moraes, Capalbo, 2001).
O pH uma varivel importante em qualquer processo biolgico, havendo valores de
pH mnimo, timo e mximo para o desenvolvimento de cada microrganismo. Geralmente os
fungos preferem pH baixo (4,5 5,0) e as bactrias pH prximos neutralidade (6,5 7,0). O
pH do meio afeta o metabolismo dos microrganismos por alterar seu conjunto enzimtico
(Perazzo Neto, 1999).


15
O pH de um cultivo varia devido s reaes que ocorrem durante as atividades
metablicas do microrganismo. Quando cidos orgnicos so secretados, como cidos actico
ou lctico, causam o decrscimo do pH. Entretanto, o consumo destes cidos quando presente
no meio causa o aumento do pH. A utilizao de fonte de nitrognio causa variao de pH.
Com sais de amnia o pH geralmente decresce durante o crescimento celular, devido a
formao do on hidrognio durante o consumo da amnia. Quando nitrato serve de fonte de
nitrognio o pH tende a subir (Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).

Inculo
Arajo (2004) ressalta a necessidade de se otimizar a concentrao de inculo para as
fermentaes em substratos slidos, afirmando que uma concentrao baixa de inculo pode
favorecer o desenvolvimento de contaminantes e formar pouca biomassa. Por sua vez, um
inculo com elevada concentrao de esporos pode exaurir o meio para a formao de
biomassa, reduzindo a quantidade do produto que se deseja obter. Caso se deseje a produo
de biomassa recomendado o emprego de inculo elevado para evitar contaminantes, porm
deve-se ter o cuidado para no se elevar muito o custo de produo com a preparao do
inculo.
Terzi et al. (2003) estudaram a influncia da concentrao de inculo do A. niger
3T5B8 e da umidade do meio de fermentao sobre a produo de poligalacturonase em
colunas aeradas, variando a relao soluo/substrato em 0,06 e 0,08 L para cada 100 g de
meio e a concentrao do inoculo em 10
5
e 10
7
condios/g de farelo, concluram que, a
relao de 0,06 e a concentrao de condios de 10
7
foram as condies mais favorveis para
a sntese de PG com produo mxima de 33,08U/mL em 64 horas de fermentao.

Requerimentos nutricionais
Os meios fermentativos devem conter todos os elementos imprescindveis sntese de
material celular e formao de produto, alm de serem economicamente viveis. Quando o
produto desejado biomassa, a definio do meio deve permitir velocidades de crescimento
elevadas. Por outro lado, quando o interesse recai num metablito celular, como enzimas, a
situao mais complexa, haja vista que a constituio do meio se associa, sempre, ao
comportamento de produo desta substncia em relao ao crescimento celular. Se a
formao de produto estiver associada ao crescimento, o meio deve satisfazer tanto as
necessidades para a multiplicao celular quanto para a gerao do metablito. No caso em


16
que o produto formado, sobretudo, numa fase ps-exponencial, o meio deve ser desenhado
de forma a controlar a composio nutritiva e os fatores ambientais, a fim de que a durao do
perodo de formao do produto seja controlada (Correia, 2004).
Os microrganismos necessitam de carbono, nitrognio, minerais, gua, eventualmente
fatores de crescimento e, caso seja aerbio, oxignio, para formar biomassa e impulsionar
reaes de biossntese e manuteno celular. Os substratos ricos em carboidratos so os
melhores e as mais baratas fontes de carbono, uma vez que podem ser adquiridos a baixo
custo como resduo da indstria alimentcia ou atividades agrcolas.
Normalmente os carboidratos so as principais fontes de carbono acessveis aos fungos,
so metabolizados proporcionando energia, atuando tambm como precursores na sntese do
material celular. Outras fontes de carbono utilizadas pelos fungos incluem lcool e
hidrocarboneto.
Ao lado da fonte de carbono, outros nutrientes utilizados na composio do meio podem
ser muito importantes para o desempenho do processo (Macedo, 1998).
Pandey et al.(1994) cita que o nitrognio corresponde, em mdia, a 8-14% do peso seco
de uma bactria ou fungo e que uma grande variedade de compostos nitrogenados orgnicos e
inorgnicos utilizada para suprir as necessidades desse elemento durante a biossntese. A
amnia representa a forma inorgnica de nitrognio mais assimilvel pelos microrganismos.
Quanto ao fsforo, este utilizado nas reaes biossintticas e tambm pode ser
polimerizado para manter o nvel de fosfato celular e promover o crescimento da clula. O
fosfato inorgnico a fonte de fsforo necessria ao metabolismo de microrganismos, este
hidrolisado por fosfatases. Numa clula fngica cerca de 0,4 a 4,5% da massa seca
corresponde ao fsforo, embora o requerimento para cada microrganismo possa ser varivel.
A concentrao tima de fosfatos depende de fatores tais como fontes de carbono, nitrognio
e O
2
(Macedo, 1998).
Hennis (1996) estudou o efeito da concentrao de sais nutrientes, para obteno de
pectinases em bagao de laranja usando Penicillium italicum e concluiu que as concentraes
que proporcionam os maiores nveis de produo de pectinases foram: 1,20g de NH
4
NO
3
,
0,08 de KH
2
PO
4
e 0,12 MgSO
4
.7H
2
O por 20 gramas de bagao de laranja. Triplicando estas
concentraes o crescimento do fungo foi quase imperceptvel, indicando que houve inibio.

Aerao e transferncia de oxignio
Correia (2004) citou que a aerao cumpre funes bsicas, a saber:


17
a) Manter condies aerbicas;
b) Eliminar o dixido de carbono formado;
c) Regular a temperatura do substrato;
d) Ajustar o nvel de umidade.
Os sistemas de FES tm carter heterogneo e a transferncia de oxignio limitada por
um filme lquido na superfcie do substrato. Como no existe gua livre no meio, a rea
interfacial e a presso parcial de oxignio tornam-se fatores cruciais. A transferncia de
oxignio acontece, fundamentalmente, em duas instncias: transferncia interpartculas e
transferncia intrapartculas.
A maioria dos cultivos semi-slidos permite o livre acesso do oxignio atmosfrico ao
substrato, j que o oxignio capaz de se difundir, com rapidez, pelo filme lquido superficial
formado nas partculas do substrato.
Del Bianchi, Moraes, Capalbo (2001) relataram que h diferentes maneiras para se obter
uma movimentao do ar por entre o substrato, permitindo assim uma melhor transferncia de
oxignio, quer seja pela utilizao do material poroso medianamente granulado ou fibroso,
pelo uso de pequena espessura da camada de substrato, pela utilizao de bandejas perfuradas
ou reatores com fundo de tela de arame, pela agitao do substrato ou ainda pela introduo
de ar forado estril dentro do reator.
A passagem de ar atravs do leito permite elevadas taxas de crescimento e
produtividade, mas, pode levar ao desenvolvimento do fenmeno de secagem que faz com
que a transferncia de nutrientes e metablitos sejam lentas ou nulas, que a presso osmtica
do meio aumente e se acelere o processo de esporulao. Para controlar ou minimizar este
problema, o ar deve ser saturado em vapor de gua ou prximo da saturao.
A taxa de aerao tima nos processos de FES determinada pela natureza do
microrganismo usado, do requerimento particular de oxignio para o crescimento e sntese de
produtos, da quantidade de calor metablico gerado, do grau de CO
2
e outros metablitos
volteis que devem ser eliminados, da espessura e densidade aparente do meio e da umidade

Agitao
Melhoria na troca de gs pode ser alcanado pela mistura do substrato. A mistura ajuda
a manter a biomassa homognea, quanto a distribuio de gua, nutrientes e inculo, facilita a
remoo de calor e a aerao. Entretanto, o acesso ao oxignio melhor na mistura peridica


18
que na mistura constante. Porm, devido fragmentao mecnica do miclio, pode interferir
na formao dos esporos e no desenvolvimento natural do microrganismo, podendo causar
tambm a compactao do meio e a danificao das hifas (Correia, 2004).
O processo de FES pode ser dividido em trs grupos de acordo com o regime de mistura
usado: esttico, periodicamente agitado e agitao contnua. A agitao facilita a manuteno
de condies homogneas no biorreator, especificamente com respeito temperatura e
aerao. Facilita tambm a distribuio uniforme de qualquer aditivo que pode ser adicionado
durante o processo. Pode ser de vital importncia quando nutrientes so periodicamente
adicionados ou quando gua adicionada para o controle da umidade ou se tampes, cidos
ou alcalinos so adicionados para o controle de pH. Dependendo das propriedades do
substrato, a agitao previne ou facilita a aglomerao dos slidos.
A falta de agitao influencia profundamente quantidade de substrato que pode ser
usado. Na FES esttica tm-se observado que o gradiente de temperatura pode subir 3C por
centmetro. Se a aerao forada no for usada na FES esttica, o oxignio no espao entre as
partculas pode cair ao nvel limite e a concentrao de dixido de carbono subir a nvel
inibitrio.
Na FES periodicamente agitada, a agitao serve para preencher os espaos entre
partculas com ar fresco. A freqncia de mistura requerida depende da frao de vazios do
substrato. A frao de vazios depende das propriedades do substrato como tamanho e forma
das partculas. Tambm depende da umidade, o excesso de umidade pode deslocar o ar. A
freqncia de mistura tambm governada pela necessidade de resfriar o substrato, que
conseqncia da taxa de crescimento que est associada produo de calor metablico.
Entretanto, a mistura do substrato slido tambm pode causar danos fermentao,
incluindo efeito adverso na porosidade do substrato, rompimento da fixao do
microrganismo ao substrato e causar danos ao miclio do fungo devido, s foras causadas
pela abraso entre as partculas. Fungos filamentosos so particularmente susceptveis a estas
foras. Hifas areas so esmagadas sobre a superfcie do substrato, resultando em inibio da
esporulao.
A agitao estimula o crescimento inicial ao ponto em que o calor metablico liberado
no pode ser removido facilmente, conduzindo ao superaquecimento do substrato. O balano
entre as vantagens e desvantagens dos efeitos de mistura diferente para diferentes sistemas
substrato-microrganismo-reator na FES. Em todo caso, a agitao s deve ser provida se for
necessria e a agitao peridica normalmente suficiente.


19
2.2 Biorreatores para FES
Nos processos de fermentao, o biorreator deve criar um ambiente adequado para o
crescimento e atividade dos microrganismos. Para isto, o biorreator deve ser projetado de
forma a impedir a entrada de substncias estranhas ao ambiente, bem como permitir o estreito
contato entre o meio e o microrganismo, ao longo de todo o cultivo (Pandey, Soccol, Leon,
2001).
De maneira geral, o biorreator ideal deve ter vrias caractersticas:
* O material de construo deve ser no txico e capaz de suportar alta presso, geralmente
vapor pressurizado para esterilizao.
* No deve ser afetado pela corroso qumica.
* Possuir sistema para aerao/agitao bem como permitir a retirada de amostras
peridicas, sem comprometer o processo.
* Um mecanismo de resfriamento para controlar a energia gerada pelo metabolismo na
forma de calor.
* Ser capaz de operar sob condies asspticas, embora alguns dos processos, exemplo
compostagem, podem ser tratados como no-estril (inculo natural).
Embora haja numerosos projetos para fermentadores industriais usando fermentao
submersa, houve um desenvolvimento limitado para processos usando fermentao semi-
slida (Pandey, Soccol, Leon, 2001).
Os reatores, a serem utilizados nos processos de FES, devem ser projetados levando-se
em considerao, no apenas os aspectos gerais de operao, mas tambm as particularidades
inerentes a este tipo de processo. A variedade de materiais que podem ser utilizados como
suportes ao crescimento e suas caractersticas como composio, tamanho, resistncia
mecnica, porosidade e capacidade de reteno de gua, somados ao fato da baixa umidade do
substrato que conferem problemas de transferncia de calor ao sistema, devem ser levados em
considerao no projeto e nas estratgias de controle de um reator que vai operar em um
cultivo em estado slido. A morfologia do fungo, no que diz respeito presena de hifas
septadas ou no (o que confere maior ou menor resistncia mecnica eventual agitao do
meio), e a necessidade, ou no, da esterilidade no processo so outros fatores que influenciam
o projeto dos biorreatores para FES (Durand, 2003).
Muitos parmetros do processo no podem ser acompanhados on-line, devem ser
retiradas amostras periodicamente para anlise off-line. Em sistemas no agitados os
parmetros do processo certamente variaro dento do biorreator, assim, quase impossvel


20
obter uma amostra representativa. Ento, devem ser constitudos vrios pontos de amostragem
que permitem retirar amostra de vrios locais. A mesma considerao se aplica ao
posicionamento de sondas on-line como termopares e, eventualmente, eletrodos de pH.
Muitos problemas referentes conduo do processo em estado slido podem ser
minimizados, ou at mesmo solucionados, pela escolha correta do reator. Durand (2003) fez
uma simples classificao destes biorreatores separando-os em: a) reatores em escala de
laboratrio, que permitem a utilizao de poucas gramas ou, at mesmo, poucos quilos de
matria slida seca; b) reatores em escala piloto ou escala industrial, nos quais podem ser
utilizados muitos quilos e, at, toneladas de material. Para o primeiro caso, segundo o autor,
existe uma grande diversidade de configuraes, mais ou menos sofisticadas, sendo mais
comumente utilizados os reatores de bandeja, de leito fixo ou de coluna e de tambor rotativo,
e suas variveis, o que confirmado nos trabalhos de Pandey (1991) e Ramana Murthy,
Karanth, Raghava Rao (1993).

2.2.1 - Biorreatores em escala de laboratrio
Para estudos de laboratrio tem se usado geralmente frascos, placas de Petri e jarras ou
colunas de vidro. Erlenmeyer de boca larga oferece facilidade de manipulao e empregado
comumente para processo de FES sem qualquer agitao e aerao (Pandey, Soccol, Leon,
2001). Fceis de usar em grandes quantidades, eles so bem adaptados particularmente para a
escolha do substrato ou microrganismos nos primeiros passos de uma pesquisa e programa de
desenvolvimento.
Um das unidades em escala de laboratrio interessante o equipamento desenvolvido e
patenteado por uma equipe da ORSTOM entre 1975 e 1980. composto de pequenas colunas
(dimetro de 4 cm, comprimento 20 cm) cheio com um meio previamente inoculado e
colocado em um banho de gua termoregulado (Figura 2.1). Ar saturado com gua atravessa
cada coluna. Este equipamento extensamente usado por pesquisadores e oferece a
possibilidade para aerar o cultivo e tambm analisar a respirao de microrganismo
conectando as colunas a um cromatgrafo a gs com um classificador automatizado que
analisa cada coluna. Este equipamento conveniente para estudos preliminares, otimizao da
composio do meio e a medida da produo de CO
2
.



21

Figura 2.1. Tpico reator de coluna em escala de laboratrio. Vrias colunas, detalhada na
parte direita da figura, ficam situadas em um banho de gua para controle de temperatura.
Fonte: Durand (2003).

A quantidade pequena de meio (poucos gramas) usado e a geometria da coluna de vidro
so satisfatrias para manter a temperatura nos reatores (a remoo de calor pela parede
suficiente). O projeto deste reator, porm, no permite retirar amostra durante fermentao e
assim necessrio sacrificar uma coluna inteira para cada anlise durante o processo. Este
equipamento, com suas vantagens (aerao forada, barato, relativamente fcil de usar), pode
constituir um primeiro passo na pesquisa (Durand, 2003).
Uma gerao nova de reatores pequenos foi desenvolvida por um grupo da INRA na
Frana alguns anos depois. Como mostrado na Figura 2.2, este reator tem volume de
funcionamento de cerca de 1 litro.
Comparado ao primeiro modelo, as mudanas principais foram a introduo de uma
sonda de umidade relativa, um circuito de resfriamento no circuito de ar e uma cobertura de
aquecimento para o recipiente. Estas mudanas melhoraram o controle do contedo de gua
durante o processo. Como para as colunas de ORSTOM, os reatores esto cheios com um
meio previamente inoculado em um ambiente estril. Cada reator automaticamente
controlado por computador. Alm disso, amostras podem ser retiradas abrindo a cobertura na


22
presena de chama sem problema de contaminao. Neste tipo de reator, a temperatura e a
umidade do meio podem ser monitoradas por meio do sensor da temperatura, umidade
relativa e taxa de fluxo de ar que atravessa a camada de substrato. Perfis diferentes para a
temperatura do ar que entra e taxa de fluxo podem ser elaboradas e geradas informaes teis
na ampliao de escala (Durand, 2003).

Figura 2.2. Fotografia e esquema de um reator estril em escala de laboratrio. (1) Tampa
aquecedora, (2) sonda da temperatura do meio, (3) tela de ao inoxidvel, (4) medidor de
temperatura do ar de entrada, (5) sonda de umidade relativa, (6) resistncia de aquecimento,
(7) sonda de temperatura da gua, (8) medidor do fluxo mssico, (9) medidor de nvel, (10)
isolamento trmico.
Fonte: Durand (2003)

A vantagem dos biorreatores de leito fixo que so relativamente simples e permitem
um melhor controle que os de bandeja. Consequentemente, tm sido relatados muitos estudos
com biorreatores de leito fixo. As desvantagens associadas com os biorreatores de leito fixo
incluem dificuldades para esvaziar o biorreator ao final do processo, no uniformidade no
crescimento celular e baixa remoo de calor em grande escala (Doelle, Mitchell, Rolz, 1992).


23
Santos, Ender, Palma, (2005) avaliaram alguns parmetros do processo de produo de
xilanase por Thermoascus aurantiacus em reator de coluna. Os ajustes feitos no sistema de
produo incluem a montagem de um novo sistema de umidificao no qual foram acoplados
trocadores de calor para aquecer o ar que entra no reator de coluna. Foram necessrios trs
trocadores de calor (trocador de tubo-carcaa, serpentina de cobre e coluna de bolhas,
identificados como 1, 2 e 3, respectivamente da Figura 2.3.

Figura 2.3. Sistema para a conduo das fermentaes em estado slido utilizando T.
aurantiacus.
Fonte: Santos, Ender, Palma, (2005).

Esta srie de trocadores permitiu aumentar o tempo de residncia do ar no sistema de
aquecimento e umidificao. A montagem experimental da unidade de aquecimento e
umidificao do ar foram feitas acoplando-se um trocador de calor com configurao tipo
tubo-carcaa a uma serpentina de cobre (aproximadamente 2m) e um outro feito com duas
colunas de bolhas, objetivando aquecer e umidificar o ar, conforme ilustrado na Figura 2.3. O
ar passa primeiro pelo trocador de tubo-carcaa, em seguida, passa pela serpentina, que est
imersa no banho termosttico. Ento, borbulhado em duas colunas de gua, com
temperatura controlada, montadas em srie. Estas colunas de bolhas tm as mesmas
dimenses do biorreator. Aps estas etapas, o ar aquecido e umidificado segue para a terceira
coluna (identificao 4 da Figura 2.3) na qual executado o processo de fermentao.


24
Os reatores de coluna foram construdos de vidro encamisado, tendo como dimenses
altura de 50 cm e dimetro de 6 cm, correspondendo a um volume de 1,4 litros, equivalendo a
utilizao de 500 g de substrato mido. Esta modificao permitiu manter a umidade do meio
durante 10 dias temperatura de 45
o
C nos cultivos. A partir destes ajustes foi possvel
observar um melhor crescimento celular no reator e, conseqentemente, maior produtividade
da enzima em estudo. Foi obtido produo mxima de xilanase de 6260 U/gms no cultivo de
T. aurantiacus.
Outro conceito foi desenvolvido baseado na agitao contnua do meio slido. Os
biorreatores podem ser de tambor giratrio (Figura 2.4), ou tambor perfurado (Figura 2.5) ou
um misturador de paleta horizontal (Figura 2.6). Com ou sem uma jaqueta de gua, este tipo
de reator requer mistura constante para aumentar o contato entre a parede do reator e o meio
slido e tambm para prover oxignio ao microrganismo.

Figura 2.4. Biorreator de tambor giratrio. (1) entrada de ar, (2) junta giratria, (3) acoplador,
(4) nozzles de ar, (5) linha de ar, (6) rolos, (7) tambor giratrio, (8) meio slido,
(9) aro.

Para biorreatores de tambor giratrio, com um cilindro horizontal, a mistura provida
pelo movimento de desmoronamento do meio slido.
A aglomerao de partculas de substrato durante o crescimento do miclio pode levar
ao aumento da dificuldade de regular a temperatura do meio slido. Alm disso, a
transferncia de oxignio dentro destas bolas de meio, aglomeradas pelas hifas do fungo e
tambm muito freqentemente pela viscosidade do substrato usado, pode ser muito baixa ou
nula. Alm disto, de um ponto de vista de engenharia, uma jaqueta de gua no movimento do
biorreator causa problemas na ampliao de escala (Durand, 2003).


25

Figura 2.5. Biorreator de tambor perfurado.

Um misturador contnuo de paleta horizontal (Figura 2.6) foi desenvolvido por um
grupo holands na Universidade de Wageningen. Este fermentador assptico foi usado para
diferentes propsitos e promove o controle simultneo de temperatura e umidade. Embora o
transporte de calor pela parede do biorreator seja melhor, este dispositivo fica ineficiente para
volume maior.

Figura 2.6. Fotografia de um misturador de paleta horizontal. Esquema de um biorreator de
mistura horizontal. (1) entrada de ar, (2) temperatura sonda, (3) jaqueta de gua, (4) paletas,
(5) sada de ar, (6) motor de agitao, (7) reator, (8) meio slido, (9) haste de agitao.


26
Geralmente, uma agitao contnua, at mesmo suave, modifica a estrutura do meio
slido a uma textura pastosa. Dependendo da natureza das partculas, grnulos de barro como
suporte, por exemplo, esta agitao tambm pode ser abrasiva e assim prejudicial para o
miclio especialmente se a hifa no for septada.

2.2.2 - Biorreatores em escala piloto e industrial
O nmero de tipos de reator usados em escala piloto e industrial menor devido a
importantes razes como:
* A utilizao de grande quantidade de substrato gera dificuldade na remoo de calor,
a compactao do meio e a formao de caminhos preferenciais. Todos estes fatores
afetam a transferncia de calor e massa.
* Devido a fragilidade do microrganismo mistura h formao de gradientes de
temperatura e oxignio causando prejuzos as atividades metablicas dos
microrganismos.
* De acordo com a natureza do substrato pode haver necessidade de preparo como
adio de gua, nutriente e esterilizao, bem como procedimentos apropriados para
a inoculao sem haver contaminao do meio.
* Controle de problemas como a facilidade de encher, esvaziar e limpar o reator.
O problema de transferncia de calor e massa identifica uma aerao insuficiente. Este
problema pode ser resolvido usando as estratgias seguintes: (i) o ar circula ao redor da
camada de substrato ou (ii) passa por ela. Dentro da segunda estratgia, trs possibilidades
esto disponveis: no mistura, com mistura intermitente ou de mistura contnua.

Biorreator de Bandeja (sem mistura)
So os mais simples biorreatores usados em FES. As bandejas podem ser construdas
usando: madeira, metal (ferro ou alumnio) ou plstico. Se for de ferro deve ser de ao
inoxidvel ou deve ser pintado para evitar corroso. O fundo da bandeja deve ser perfurado de
modo a sustentar o substrato e permitir a aerao. A Figura 2.7 apresenta a operao de um
tpico biorreator de bandeja.



27

Figura 2.7 Diagrama esquemtico de uma sala tpica de koji operando em escala industrial
com biorreator de bandeja. 1. sala de koji; 2. vlvula de gua; 3. tubo germicida UV; 4, 8, 13.
soprador de ar; 5, 11. filtros de ar; 6. sada de ar; 7. humidificador; 9. aquecedor; 10
recirculao de ar; 12. entrada de ar; 14. bandejas; 15. suporte de bandejas.
Fonte: Durand (2003).

Usualmente as bandejas so organizadas umas sobre as outras com espaamento
adequado entre elas, a camada de meio slido de no mximo 15 cm. So colocadas em uma
cmara onde o ambiente criado para manter a temperatura e umidade durante a fermentao.
A temperatura geralmente controlada pela circulao de ar. A fermentao do koji
tradicionalmente feita em biorreatores de bandeja desde que comeou a ser produzido em
escala comercial. Muitas modificaes na estrutura tm sido propostas e usadas de modo a
melhorar a eficincia do processo e melhorar a manipulao. Biorreatores de bandeja tm sido
usadas no estudo em escala de laboratrio, de planta piloto e em escala industrial (Pandey,
Soccol, Leon, 2001).
Entretanto, requerem uma rea operacional grande e trabalho intensivo. Este modelo
no permite a manipulao mecnica. O substrato esterilizado separado. Por estas razes
no de uso atrativo.

Biorreator de mistura intermitente com circulao de ar forado
Em geral, estes biorreatores podem ser descritos como de leito empacotado onde ar
passa atravs do leito. Um dispositivo de agitao usado para misturar o leito
periodicamente e ao mesmo tempo, gua borrifada se necessrio.


28
Similar ao reator estril usado no processo de malte da cevada, foi construdo um
equipamento para o processo de fabricao de molho de soja. Um compartimento contm os
slidos estticos no biorreator que geralmente retangular com vrios metros de
comprimento. O substrato preparado e inoculado em uma malha de arame e ar condicionado
forado atravs do leito. Um agitador rolante mistura periodicamente o meio slido. Embora
este tipo de reator seja muito simples e bsico, extensamente usado por muitos fabricantes
asiticos de molho de soja.
Um grupo da INRA em Dijon (Frana) desenvolveu um processo no estril com
estratgia baseada neste princpio (Figura 2.8).

Figura 2.8. Esquema geral do reator de leito empacotado com agitao intermitente e
aerao forada. (Te, URe e FAe) respectivamente a temperatura, umidade relativa, e taxa de
fluxo do ar na entrada, (Ts, URs e FAs), respectivamente,a temperatura, umidade relativa e
taxa de fluxo de ar na sada, (Tm) temperatura do meio slido, (Am) quantidade de gua do
meio slido, (Mg) massa total do meio slido, (A) agitao, (E) spray de gua.

A temperatura (Tm) e a umidade (Am) do meio so mantidos por um regulador de
temperatura e pela umidade relativa e taxa de fluxo do ar de entrada. Tambm necessrio
borrifar gua (E) e agitar periodicamente. O volume de gua borrifado calculado de medidas
on-line da massa total do meio (Mg) e estimativa das perdas de massa devido respirao
(CO
2
).


29
2.3 Microrganismos usados em FES
Bactrias, leveduras e fungos filamentosos podem crescer em substratos slidos.
Contudo, so os fungos filamentosos os microrganismos mais adaptveis a este tipo de
processo. Os fungos so capazes de crescer em baixos valores de atividade de gua e altas
presses osmticas. O prprio modo de crescimento dos fungos gera uma vantagem sobre os
microrganismos unicelulares. A combinao de prolongamento da regio apical e a gerao
de novas hifas permitem aos fungos uma rpida colonizao dos substratos slidos, alm de
uma melhor utilizao dos nutrientes disponveis. De forma coordenada ao crescimento, os
metablicos excretados pelo microrganismo permitem a penetrao das hifas nas partculas
slidas, o que aumenta o contato e a disponibilidade dos substratos macromoleculares, bem
como a assimilao e metabolizao dos nutrientes (Pinto, 2003).
Como exemplos, podem ser citados o uso de culturas de Rhizopus, Trichoderma,
Penicillium ou Aspergillus para obteno de enriquecimento protico e produo de enzimas,
Mucor ou Rhizopus na produo de renina microbiana, Penicillium para a produo de
penicilina e Fusarium ou Giberella para obteno de cido giberlico. Tambm pode ser
citada a utilizao das bactrias Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus e Streptococcus
thermophilus para produo de cido ltico (Del Bianchi, Moraes, Capalbo, 2001).
A escolha do microrganismo adequado importante no sucesso da produo desejada.
A amilase pode ser produzida por 28 tipos diferentes de culturas microbianas. O Aspergillus
niger, por exemplo, tem a capacidade de produzir 19 tipos diferentes de enzimas, dependendo
da induo e/ou do substrato.
A reproduo dos fungos filamentos pode acontecer pelos esporos, que so germinados,
formando estruturas filamentosas chamadas hifas, cujo crescimento limitado na sua poro
terminal. importante ressaltar que, um mesmo miclio, formado pelo conjunto das hifas,
apresenta diferentes estgios fisiolgicos, uma vez que as hifas prximas extremidade, que
apresentam crescimento, so mais jovens que as demais, localizadas no interior do miclio,
onde no se detecta crescimento. Como as hifas de extremidade so proporcionalmente muito
menores em relao frao interna do miclio, pode-se dizer que a proporo de biomassa
nova em relao massa total diminui com o avano da cultura (Palma, 2003).
Na FES o crescimento acontece pela extenso das pontas das hifas sobre a superfcie
slida, sendo a direo e a velocidade do crescimento determinadas pela disponibilidade dos
nutrientes, bem como pelas caractersticas do substrato (Losane et al., 1985). As hifas
crescem ao longo da superfcie da partcula slida mida utilizando o filme lquido como


30
fonte de umidade e nutrientes e os poros do substrato como espao para o crescimento em
busca de novos nutrientes.
Palma (2003) cita em seu trabalho uma representao do crescimento dos fungos
filamentosos em FES, no qual so apresentados dois tipos de hifas, assim denominadas: 1)
hifas areas; 2) hifas penetrativas. As hifas areas aparecem sobre a interface ar-lquido e as
hifas penetrativas esto em contato direto com o substrato. As hifas penetrativas podem
desempenhar um importante papel na disponibilidade do substrato pois, na maioria das vezes,
estes so polmeros insolveis em gua que precisam ser degradados em fraes
monomricas, solveis em gua, para serem, ento, consumidos pelos fungos. Portanto, esta
degradao enzimtica do substrato, pela frao penetrativa das hifas, um fator determinante
para o processo, pois, a partir da, os fragmentos difundem-se at a superfcie das partculas,
sendo transformados, pela ao de outras enzimas, em compostos metabolizveis.
As hifas areas parecem ser responsveis pelo consumo do oxignio, uma vez que esta
frao do miclio no tem contato direto com o substrato. A adeso dos fungos filamentosos
s partculas do substrato, durante o crescimento uma importante propriedade destes
microrganismos uma vez que favorece a absoro dos nutrientes. No entanto, esta forte
ligao a uma matriz slida implica na impossibilidade de separao entre o miclio e o
substrato e, consequentemente, na determinao, de forma direta, da biomassa formada
(Palma, 2003).

2.3.1. Aspergillus
Trata-se do gnero mais comum dos fungos filamentosos, alm de ser um dos mais bem
estudados. As espcies que compe este gnero tm ampla distribuio mundial estando
presente na superfcie, no ar e na gua, tanto em organismos vegetais bem como em animais,
alm de estarem associadas com a deteriorao de materiais vegetais e alimentos,
principalmente em regies de clima tropical e sub-tropical. Muitas das espcies de Aspergillus
so utilizadas para a obteno de enzimas, na biossntese qumica e na transformao de
compostos. H espcies patognicas para o homem, para os animais e h aquelas que durante
seu metabolismo produzem txicos. A taxonomia atual reconhece 150 espcies do gnero
Aspergillus, entretanto somente 30 destas so bem definidas e atualmente facilmente
distinguveis (Rosa, Campos, Baroni, 2002).
As colnias geralmente tm crescimento rpido e exuberante, inicialmente so brancas,
amarelas, passando para marrom ou para o negro. A colnia composta por miclio areo


31
com conidiforos eretos, densamente distribudos sobre a superfcie do meio e farta produo
de condeos.
As estruturas morfolgicas so caractersticas importantes para a sua classificao. As
espcies pertencentes a este grupo produzem tipicamente o aspergillum ou cabea
aspergillar, que consiste de uma haste (estipede) asseptado que termina em uma vescula,
sobre a qual nascem s clulas conidiognicas (filides e mtulas). As filides produzem os
condeos com diferentes pigmentaes e ornamentaes. Uma cabea aspergillar simples
(uniseriada) formada por uma vescula, total ou parcialmente coberta por uma srie de
clulas alongadas (filides) que geram os condeos. Quando se diz que a cabea aspergillar
bisseriada, porque, antes da camada de filides, esta apresenta uma camada de clulas que as
geraram, chamadas de mtulas. A anatomia da cabea aspergillar, forma da estrutura
anamrfica que caracteriza o gnero esta apresentada na Figura 2.9. A estrutura inteira,
incluindo a cabea aspergillar, a haste (ou estipede) e a clula p, chamada de conidiforo.

Figura 2.9. Morfologia representativa de espcies do gnero Aspergillus. Fonte: Rosa et al.
(2002)

Os conidiforos so formados por uma estpede originada em uma clula p (clula
podal), no ramificada, e termina em uma vescula. A parede da estpede pode ser lisa ou
rugosa.


32
As filides so diretamente inseridas sobre a vescula (monoseriados) ou a partir das
mtulas que esto inseridas diretamente a partir da vescula (bisseriados). As estruturas
conidiognicas (mtulas ou filides) podem estar distribudas sobre toda a superfcie da
vescula ou somente no extremo dela.
Os condeos so formados a partir das filides e se dispem em cadeias curtas
compactas colunares ou de forma radiada. Estes so unicelulares, lisos ou rugossos, hialinos
ou pigmentados.
O conjunto de estruturas reprodutivas, isto , estpede, vescula, mtulas, filides e
cadeias de condeos, recebem o nome de Cabea Aspergillar.
A classificao e principais caractersticas do Aspergillus niger so apresentadas na
Tabela 2.1.

Tabela 2.1. Classificao e principais caractersticas do Aspergilluas niger.
CLASSIFICAO PRINCIPAIS CARACTERSTICAS
Reino Fungi
Diviso Eumycota Tipicamente micelial, algumas vezes
unicelular.
Subdiviso Deuteromycotina Talo micelial e septado ou unicelular;
reproduo sexual ausente, mas a parasexual
pode ocorrer.
Classe Hyphomycetes Formas miceliais estreis ou produzindo
condios em hifas separadas ou agregadas na
ausncia de conidiomata.
Ordem Moniliales Miclio hialino, contendo conidiforos livres,
que se projetam do miclio de forma irregular.
Famlia Moniliaceae Os conidiforos so solitrios livres, que se
projetam do miclio de forma irregular.
Gnero Asperillus Miclio septado. Conidiforo erecto com
terminais globosos dos quais emergem filides
com condios arredondados unicelulares e de
colorao negra, esverdeada ou amarela.
Espcie niger Condios globulosos de aspecto rugoso, com
equinulaes verdadeiras, colorao negra,
medindo em torno de 4 a 5 m de dimetro.
Fonte: Couri (1993)

O Aspergillus niger se caracteriza por colnia de 4-5 cm de dimetro, quando
desenvolvida em agr Czapek a 25
o
C por 7 dias. Consiste de uma base compacta branca ou
amarela, com uma densa camada de conidiforos marrom escuro ou preta. A cabea tem


33
forma radiada, preta, e composta de cadeias de condeos que tendem a se dividir com a idade.
Os conidiforos so formados por estpede liso hialino, tambm de colorao marrom,
vesculas globulares com 50-100 m de dimetro, fialides ou mtula com 7,0-9,5 m x 3-4
m, mtulas hialina ou marrom, muitas vezes septada com 15-25 x 4,5-6,0 m, condia
globular com 3,5-5 m de dimetro, marrom, ornamentadas com verrugas, lombadas e cume.
Tem como importante metablito txico naphtho-T-pyrones, malformins (Samson et al.,
1995).

2.3.2. Estimativa da biomassa
Em todo bioprocesso, a biomassa constitui um parmetro fundamental na caracterizao
do crescimento celular. Os bioprocessos podem ser divididos em dois tipos, o primeiro tipo
aponta a produo de biomassa, enquanto o segundo tipo envolve produo de metablitos
(primrio ou secundrio). No primeiro caso, a medida de biomassa muito importante,
porque o objetivo principal do processo submerso ou de fermentao em estado slido. Na
produo de metablitos estes podem ser proporcionais quantidade de biomassa. Ento, para
aperfeioar a produo de metablitos, especialmente um metablito secundrio, necessrio
aperfeioar o crescimento celular.
Em FES, existem trs fases, uma matriz slida (orgnico, mineral ou sinttico), uma
fase lquida, ligada a matriz, e uma fase gasosa. O microrganismo est presente a todas estas
fases. Ento, diferente da fermentao submersa, a determinao direta da biomassa em FES
difcil, devido a problemas de separao do microrganismo da fase insolvel. No obstante,
em alguns casos que envolvem esporos e microrganismos unicelulares (bactrias e leveduras),
esta separao possvel. Porm, quando o crescimento de fungos estiver na forma de
miclio, impossvel, porque as hifas do fungo penetram dentro da matriz slida, ligando o
miclio fase slida (Durand et al. 1993).
Devido a este fato so utilizados mtodos indiretos para estimao da biomassa. Os
mtodos indiretos podem ser classificados em:
* Baseados nos constituintes celulares como glicosamina, ergosterol, cidos nuclicos
e protenas;
* Baseados na atividade biolgica como ATP e consumo de oxignio e/ou produo
de CO
2
;

* Baseados no consumo de algum componente do meio (nutrientes).


34
O mtodo de dosagem do contedo de glicosamina tem por princpio a quantificao de
um constituinte majoritrio da parede celular dos fungos, a quitina, um polmero linear
insolvel, constitudo por ligaes -1,4 de acetilglicosamina. O mtodo de dosagem do
monmero baseia-se na despolimerizao da molcula de quitina, seguida pelo ensaio, por
espectrofotometria, da quantidade de glicosamina liberada (Palma, 2003).
Em seu trabalho experimental Degranges et al. (1991) avaliaram o teor de biomassa
pela anlise da glicosamina como constituinte celular. A anlise foi efetuada em duas etapas:
hidrlise e extrao. O principal problema, neste procedimento, segundo os autores, a
reprodutibilidade e a quantificao da glicosamina. Os dados mostraram que a glicosamina
apresenta comportamento constante, mas a anlise deste constituinte sofre influncia do meio
de cultivo. Assim, os autores afirmam que a glicosamina um bom indicador do
desenvolvimento da biomassa devendo ser usada, no entanto, para estudos que visem otimizar
a concentrao de nutrientes nos meios.
O consumo de oxignio, durante o metabolismo dos fungos aerbios, est associado ao
crescimento celular e tem sido utilizado para a estimativa de biomassa em FES. A medida do
oxignio simples, rpida e pode ser feita diretamente no sistema fermentativo, utilizando-se
um analisador de oxignio paramagntico ou um cromatgrafo gasoso. Entretanto, para a
estimativa da biomassa, a partir destes dados, necessrio que se estabelea uma correlao
matemtica entre o consumo do oxignio e a formao de biomassa. Alguns modelos foram
propostos por Sato et al. (1983), Soccol et al. (1994) e Goudar & Ellis (2001). Os mtodos
baseados na composio dos constituintes celulares dos fungos so utilizados para determinar
a correlao nos modelos e, dentre estes, a medida de glicosamina a mais utilizada. Os
trabalhos de Nagel et al. (2000) e Rosenblitt et al. (2000) relatam dados positivos acerca desta
associao na construo dos modelos.
Sargantanis et al. (1993) estimaram o valor da biomassa atravs da determinao de
protena; assumiram que 1,0 grama de clulas de Rhizopus oligosporus continha 0,2758g de
protena.
Embora muitos mtodos de estimativa de biomassa indireta existam para FES, nenhum
idealmente usado para todas as situaes, porque praticamente todos os componentes da
biomassa variam de acordo com a fase de crescimento, a natureza do meio e a relao de C/N
para um mesmo meio. Porm, em alguns casos, como o enriquecimento de protena de um
subproduto, importante saber a quantidade de protena produzida, e, assim, a estimativa de
biomassa no sentido restrito, no de interesse. Da mesma maneira, a otimizao da produo


35
de uma enzima que relacionada ao crescimento do microrganismo pode ser realizada sem a
medida de biomassa (Durand, 2003).

2.4 - Substratos
Compostos naturais e sintticos podem ser usados como substrato do cultivo semi-
slido. Normalmente so substncias insolveis em gua, nos quais a gua absorvida
aproveitada pelo microrganismo para crescimento e atividade metablica. Exemplos destas
matrias so resduos de frutas, farelo de soja e materiais porosos como argila.
Materiais sintticos como o poliestireno, podem ser usados como suporte inerte, mas,
atualmente, os resduos agroindustriais so os substratos mais pesquisados. Em geral so
baratos e abundantes. Alm do mais, tm estrutura polimrica e composio rica em amido,
lignocelulose e pectina. Estes materiais orgnicos, em sua maioria insolvel em gua, so
fontes de carbono e nitrognio, atuando como suporte para o crescimento de microrganismos.
Normalmente so materiais particulados, e a gua presente no meio encontra-se complexada
na matriz slida, onde pode ser aproveitada pela cultura microbiana. Bactrias e leveduras
crescem na superfcie, enquanto que a estrutura miceliar de fungos filamentosos penetra nas
partculas do substrato (Correia, 2004).
Atualmente os esforos concentram-se no emprego de subprodutos agroindustriais
como substrato, buscando obter produtos de alto valor comercial e baixo custo de produo.
Os grupos de pesquisa existente ao redor do mundo tiram proveito de substratos naturalmente
abundantes em sua regio. Vrios resduos agroindustriais podem ser utilizados como
substrato, como o bagao de laranja, farelo de trigo e de arroz, farelo de soja, polpa de maa,
polpa de caf, quirela do milho, bagao de cana, bagao de abacaxi, pednculo de caju etc.
Na FES o substrato slido no apenas fornece os nutrientes para os microrganismos,
mas tambm serve de suporte para o crescimento destes (Pandey, 2002). Aqueles materiais
que fornecem todos os nutrientes necessrios ao crescimento celular so considerados
substratos ideais. Entretanto, em muitos casos, alguns nutrientes encontram-se em
concentraes abaixo da mnima, sendo necessria suplementao do meio.
Pode-se incorporar solues de nutrientes ao substrato slido, visando adequ-lo melhor
s condies nutricionais do microrganismo para a fermentao desejada. Como no caso de
enriquecimento protico, quando so utilizadas fontes de nitrognio tais como amnia, uria
ou solues sintticas como o sulfato de amnia. As pectinases comerciais so enzimas


36
indutveis e substratos com altos teores de pectina, como polpa de beterraba, casca de ctricos
e polpa de ma estimulam a produo destas enzimas.
Del Bianchi, Moraes, Capalbo (2001) afirmam que o substrato necessita de um pr-
tratamento para se adequar s condies necessrias ao crescimento e metabolismos dos
microrganismos. Recomendam os seguintes processos para facilitar a atuao dos
microrganismos sobre o meio:
1- Esmagamento, quebra, moagem e peneiramento visando adequar o meio a
granulometria mais adequada ao processo;
2 - Suplementao de nutrientes e correo de pH, para suprir a falta de algum
nutriente ou adequar as melhores condies de crescimento microbiano;
3 - Hidrlise cida ou alcalina de material celulsico, visando facilitar a atuao
enzimtica;
4 - Embebio, para regular o teor de umidade inicial do processo;
5- Vaporizao ou aquecimento, visando a gelatinizao ou expanso de substrato;
6 - Adio de agente seqestrante, com o objetivo de retirar ons metlicos do meio,
que podem diminuir o rendimento do processo;
7 - Processo de esterilizao, que visa diminuio ou eliminao de possveis
contaminaes.
A esterilizao do substrato pelo calor, alm de ser dispendioso pelo alto consumo de
energia, pode causar modificaes nas caractersticas do substrato, tais como textura ou
qualidade nutricional. Alguns autores mostram que, a partir da adio de uma quantidade
grande de inculo que visa evitar ou abrandar o problema de contaminaes, a esterilizao
do meio no necessria.
O substrato deve ter algumas caractersticas que possibilitem o maior rendimento do
processo. A principal peculiaridade o alto grau de acessibilidade do microrganismo a todo o
meio e, para tanto, de suas caractersticas mais importantes destacam-se a porosidade, o
tamanho e o formato das partculas (Del Bianchi, Moraes, Capalbo, 2001).
A maior parte dos substratos de origem agroindustrial, variando entre gros, razes,
resduos ou subprodutos. Alguns substratos demandam pr-tratamento mas, em geral, sofrem
apenas corte ou moagem, o que gera material formado por partculas de tamanho diverso.
Partculas de tamanho reduzido oferecem maior rea superficial ao ataque dos
microrganismos, mas ao mesmo tempo, tendem a compactar-se facilmente. Neste caso, a
respirao e aerao do sistema so dificultadas. Partculas maiores, por sua vez, promovem


37
maior espao interpartculas, embora possuam rea superficial menor, segundo Pandey,
Soccol, Leon (2001).
Quanto porosidade, a principal qualidade desta caracterstica a capacidade de
absoro de gua, que facilita o transporte de enzimas e metablitos por entre o meio e os
microrganismos.
Echevarria, Rodrigues Leon, Espinosa (1991) realizaram um estudo sobre o
enriquecimento protico de cana-de-acar, atravs do microrganismo Aspergillus niger, onde
o substrato utilizado era composto de partculas de 1,4 mm, proporcionando um bom
rendimento do produto fermentado. O que leva-se a acreditar que cada processo apresenta um
tamanho de partcula ideal, dependendo do tipo de substrato e biorreator utilizado.

2.4.1. Caju
O cajueiro (Anacardium occidentale L.) uma planta perene, nativa do Brasil. Sua
explorao econmica atividade relativamente nova, dos anos 1950 e 1960. A quase
totalidade (94%) da produo est concentrada no Nordeste brasileiro.
Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE), a produo
nacional de castanha de caju em junho de 2007 foi superior a 250 mil toneladas. Os estados
com maior produo so: Cear, com 136,7 mil toneladas, Piau, com 64,1 mil toneladas, o
Rio Grande do Norte, com 49,7 mil toneladas e a Bahia, com 6,6 mil toneladas (Assessoria de
Comunicao FBB, 2007).
Estudos da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) mostram que cada
quilo de castanha corresponde a 9 quilos de polpa. Assim, a estimativa da produo da polpa,
em 2007, de 2,3 milhes de toneladas. Calcula-se que utilizado apenas de 15% a 20% da
polpa na fabricao de doces, sucos, vinho ou consumo in natura, sendo que 80%
desperdiado, ou seja, 1,9 milhes de toneladas so resduos, tratados como lixo.
O caju um fruto de especial interesse botnico, sendo conhecido pela sua castanha de
alta qualidade. O fruto do cajueiro, a castanha, definido como um aqunio reniforme
pendente do pednculo floral, hipertrofiado, carnoso e suculento, denominado comumente de
caju. A castanha constituda basicamente de trs partes: a casca, a pelcula e a amndoa. A
proporo entre estes trs componentes de 65,4% de casca, 2,5% pelcula e 32,1% de
amndoa (Faria, 1994).


38
A mdia da massa do pednculo situa-se na faixa de 70 a 90 gramas, com comprimento
em torno de 6 a 10 cm. A boa aceitabilidade e o consumo de caju in natura esto relacionados
a dois aspectos principais: adstringncia e colorao da casca (Faria, 1994).
Internamente o Brasil consome pednculos do fruto, amndoa da castanha e o lquido
da castanha. O Brasil exporta quase a totalidade da sua produo do lquido da castanha (LCC
resina lquida custica) e amndoa da castanha (ACC).
So conhecidas cerca de vinte variedades de caju, classificadas segundo a consistncia
da polpa, o formato, o paladar e a cor da fruta (amarela, vermelha ou roxo-amarelada,
dependendo da variedade).
Vrias pesquisas foram desenvolvidas para a obteno de gentipos de cajueiro que
permitissem no s o aumento de produtividade, como tambm a melhoria da qualidade da
castanha para a indstria e o aproveitamento do pednculo. Desse modo, a recuperao no
campo vem sendo feita com o uso de clones, cultivados dentro das normas tcnicas de
produo (Pereira et al., 2005).
Entretanto, o pednculo tambm importante pois constitui proveitosa fonte alimentcia
no Nordeste do Brasil, na forma in natura ou processada. O mercado consumidor para
pednculo in natura crescente e exigente em frutos que apresentem alta resistncia ao
manuseio, formato piriforme e frutos de colorao laranja e vermelha (Moura et al., 2001).
At muito recentemente, os pednculos eram vendidos exclusivamente em feiras locais,
porm hoje alcanam supermercados em outras partes do Pas, podendo ser mantidos em boas
condies por at quinze dias aps a colheita, devido ao desenvolvimento de tcnicas
adequadas de manuseio e conservao ps-colheita (Moura et al., 2001).
O valor nutritivo do pednculo de caju revela-se sob a forma de vitaminas e sais minerais.
A Tabela 2.2 apresenta a composio mdia do pednculo.
O contedo de vitamina C do pednculo superior ao da goiaba, do mamo, do limo e
do tomate, que apresentam, respectivamente, 175 a 236, 75 a 91, 48 a 57, 32 a 38 e 26 a
30mg.100g
-1
, o que o coloca como grande fornecedor desta vitamina. Alm desta, destaca-se
ainda a vitamina A e sais minerais como clcio, ferro e fsforo (Simes et al., 2001).
A composio fsico-qumica do pednculo varia largamente em funo da variedade,
do estado de maturao, do tamanho, da durao da colheita e de variaes ambientais
regionais, entre outros fatores.



39
Tabela 2.2. Composio qumica mdia do caju vermelho
Discriminao Pednculo de caju
Umidade (%) 86,07
Brix 10,98
Acares totais (%) 8,38
Acares redutores (%) 8,00
Protenas (Nx6,25)(%) 0,74
Extrato etreo (%) 0,39
Amido 1,33
Tanino (%) 0,40
c. Total (% c. Mlico) 0,34
c. Ascbico (mg/100g) 204,00
pH 4,48
Carotenides 0,22
Vitamina A (U.I.) 11,32
Cinzas (%) 0,38
Clcio (mg/100g) 14,70
Ferro (mg/100g) 0,35
Fsforo (mg/100g) 32,55
Fonte: Faria (1994).

Sob o ponto de vista social, a cajucultura ainda se caracteriza como uma das principais
atividades da populao rural. Em quase sua totalidade ela cultivada por pequenos
produtores. Deste modo, a produo acontece na poca da seca, justamente no perodo de
entressafra das demais espcies cultivadas na regio.
Esta peculiaridade demonstra a relevncia da cultura para a manuteno da mo-de-obra
e a fixao do homem no campo. No decorrer do ano, a atividade emprega cerca de 40 mil
pessoas no campo e 15 mil na indstria.
A ocupao de mo-de-obra temporria nos trabalhos de colheita que ocorre no perodo
de setembro a dezembro chega a 200 mil pessoas. Estratificando estes nmeros entre os
principais Estados produtores, v-se que no Cear so gerados 30.000 empregos diretos e
100.000 indiretos. No Piau a atividade proporciona 28.300 trabalhadores rurais permanentes
e 56.700 temporrios (Moura, 2007).


40
Com uma rea plantada em torno de 120 mil hectares, o Rio Grande do Norte o
terceiro produtor nacional de castanhas de caju, representando divisas superiores a 20 milhes
de dlares e oferta de 159 mil empregos diretos e indiretos. Objetivando aumentar a
produtividade da cultura e melhorar a qualidade de castanhas e aproveitamento de pednculos
de caju, de forma a tornar a atividade mais competitiva, a EMPARN vem desenvolvendo
atividades de pesquisas nas reas de fertilidade dos solos, melhoramento gentico, manejo
cultural, propagao vegetativa e aproveitamento do resduo da indstria de sucos na
alimentao animal. O resduo da indstria de suco, depois de enriquecido, pode ser usado
como ingrediente de raes, representando at 45% da formulao de concentrado para
ruminantes e at 30% para aves caipiras.
Na tentativa de minimizar os desperdcios da produo e industrializao do pednculo
de caju, o Laboratrio de Engenharia Bioqumica, CCT/UAEQ/UFCG, vem desenvolvendo
pesquisas com a finalidade de valoriz-lo, utilizando o suco para a produo de fermentado,
vinagre e aguardente e aumentar o valor agregado do bagao do pednculo, atravs do seu
enriquecimento protico por leveduras. Com o acrscimo de microrganismos, esse resduo
pode aumentar seu valor nutricional em protenas, vitaminas, fosfato e clcio, importantes
fatores de crescimento para os animais, podendo posteriormente ser utilizado como fonte
alternativa de alto potencial protico, em rao animal, tornando-se uma boa estratgia para
solucionar alguns dos problemas relacionados s limitaes e desperdcios de alimentos,
principalmente na regio Semi-rida do Nordeste (Campos et al., 2005).

2.5 Enzimas microbianas
Enzimas so catalisadores orgnicos efetivos, responsveis por milhares de reaes
bioqumicas coordenadas, envolvidas nos processos biolgicos dos sistemas vivos. So
macromolculas pertencentes classe das protenas globulares (Couri, 1993).
Uma das caractersticas notveis das enzimas quando comparadas com catalisadores
qumicos so a especificidade pelo substrato e a especificidade em promover somente uma
reao bioqumica com seu substrato, em condies brandas de reao e menores problemas
ambientais e toxicolgicos.
As enzimas so divididas em seis grandes classes, baseadas no tipo de reao que elas
catalisam. As seis classes representativas das enzimas industriais so: oxiredutases,
transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases.


41
A produo e uso de enzimas tem se tornado uma rea de grande interesse da indstria
biotecnolgica. As enzimas tm sido usadas pelo homem por vrios sculos, mesmo antes do
conhecimento de sua natureza. A fabricao de queijo usando estmago de bezerro como um
catalisador foi provavelmente o primeiro exemplo, sendo seu uso to antigo que a data de seu
descobrimento desconhecida.
As enzimas so componentes de todos os tipos de clulas, animal, vegetal e microbiana.
Os organismos superiores foram os primeiros utilizados como fontes de enzimas. O efeito do
amaciamento da carne por mamo (papana) levou a um expressivo cultivo da planta com
propsito de produzir a enzima papana da famlia das proteases. Outras enzimas so extradas
de rgos animais, como, tripsina e quimotripsina do pncreas de porco. Essas fontes
apresentam algumas desvantagens tais como: o tecido utilizado na extrao da enzima pode
sofrer limitaes de suprimento quando a demanda aumenta, requer cultivos de grandes reas
e esto sujeitas a intempries (Couri, 1993).
Reconhecidamente, as clulas microbianas so importantes produtoras de enzimas,
oferecendo uma srie de vantagens: a produo pode ser aumentada facilmente, apresenta
natureza diversa permitindo a produo de vrias enzimas, so relativamente fceis de serem
cultivadas em ambiente controlado e so altamente sensveis alteraes genticas, o que
permite obteno de linhagens melhoradas quanto a produo e qualidade da enzima. O
processo fermentativo permite tambm a produo de enzimas com consistente produtividade
e menor custo.
O desenvolvimento do processo de produo de enzimas, em escala industrial, de
qualidade satisfatria e custos que permitam sua comercializao, requer um trabalho
laborioso, caro e interdisciplinar. Faz-se necessrio o conhecimento tcnico-econmico da
relao entre linhagem, o meio de produo, o processo de fermentao, os mtodos de
recuperao e a demanda de mercado.
O mercado mundial de enzimas apresenta valor comercial de US$ 2 bilhes de dlares
anuais e vem crescendo a cada ano com taxas de 8 a 10%. Deste total, o Brasil participa com
5% do mercado atravs de importaes, que segundo dados de 2005 do Ministrio do
Desenvolvimento chegaram a US$ 100 milhes de dlares. A indstria de alimentos a que
mais tem se beneficiado como uso das enzimas, sendo utilizadas em 15% dos processos
industriais. Alm disso, este setor est em crescente expanso faturando aproximadamente R$
1 trilho em 2005, o quer representa um crescimento de 9,2% em relao a 2004. Desse total,
a indstria de sucos naturais teve uma produo de 111 milhes de litro entre janeiro e maro


42
de 2007 representando um crescimento de 12,6% em relao ao mesmo perodo de 2006.
Considerando que 25% do mercado mundial de enzimas correspondem s enzimas pectinases,
percebe-se uma grande oportunidade de negcio (Aquino, 2007).
As enzimas pectinolticas consumidas pela indstria brasileira so importadas por
alguns laboratrios tais como: Miles, Novo Nordisk, Biocon e Novozymes. O consumo
interno ainda pequeno, porm, o mercado potencial muito grande considerando que o
Brasil um dos maiores produtores de suco de laranja do mundo e significante produtor de
vinhos.

2.6 Substncias pcticas
Substncias pcticas so macromolculas glicosdicas de alto peso molecular que
formam o maior componente da lamela mdia das paredes primrias de clulas de vegetais
superiores. Quimicamente so um complexo coloidal de polissacardeos cidos, composto de
resduos de cido galacturnico unidos por ligaes - 1,4, parcialmente esterificados por
grupos metil e parcial ou completamente neutralizadas por uma ou mais bases (ons sdio,
potssio ou amnio) (Uenojo & Pastore, 2007).
Baseado nos tipos de modificaes da cadeia principal, as substncias pcticas so
classificadas em (Martins, 2006):
A- protopectina: o termo usado para descrever as substncias pcticas insolveis em
gua, das quais se originam as substncias pcticas solveis.
B- cido pctico: so os cidos poligalacturnicos cujos grupos carboxlicos no
apresentam esterificados com grupos metila.
C- cido pectnico: so os cidos poligalacturnicos que contm quantidades variveis
de grupos metoxlicos. Estes compostos apresentam a propriedade de formar gel na presena
de acares e ctions divalentes.
D- pectina: o nome genrico de misturas pcticas que contm cido pectnico como
maior componente.
As substncias pcticas so os maiores componentes da lamela mdia e parede celular
primria das clulas vegetais, estando interligadas a outros polissacardeos estruturais, como a
celulose e a hemicelulose (Figura 2.10).



43

Figura 2.10. Estrutura da parede celular vegetal, contendo as molculas de pectina.
Fonte: Martins (2006)

Alm da funo adesiva que exercem nas paredes celulares das plantas superiores, estas
tambm so responsveis pelas diferenas de textura das frutas e dos vegetais durante o seu
crescimento, amadurecimento e armazenamento. A pectina tem sido indicada ainda como
importante fator de interao entre plantas e seus patgenos (Martins, 2006).
As substncias pcticas so usadas na indstria de alimentos como agentes geleificantes
e como fibras nutricionais. Por outro lado, podem representar um problema nas vrias etapas
do processamento de frutas e vegetais, visto que seu arraste, aps o rompimento da parede
celular, pode causar turbidez em sucos ou incrustaes em tubulaes e reatores industriais.
O grau de esterificao, o grau de polimerizao, a proporo de acares neutros, o
peso molecular, so os principais fatores de heterogeneidade entre as substncias pcticas de
diferentes origens. Isso torna improvvel a existncia de pectinas idnticas.
A pectlise, ao das enzimas pectinolticas, um fenmeno associado com vrios
processos biolgicos da planta, tais como alongamento, crescimento celular e maturao do
fruto. A microbiana tem um importante papel na patogenicidade da planta, simbiose,
decomposio de depsitos da planta, fermentao de resduos da agricultura e da indstria de
alimentos, processos de macerao de vegetais e clarificao de sucos (Couri, 1993).



44
2.7 Enzimas pectinolticas
As enzimas pectinolticas, ou pectinases so as responsveis pela degradao das
substncias pcticas, sendo produzidas somente por vegetais e microrganismos. Elas esto
envolvidas nos processos fisiolgicos dos vegetais e so empregadas em nvel industrial
destacando-se por serem as enzimas mais utilizadas pelas indstrias de processamento de
frutas (Hennies, 1996).
A classificao destas enzimas baseada nos modos de ataque molcula dos
polmeros pcticos. So descritos trs grupos de enzimas: as protopectinases, as esterases
(pectinesterases) e as despolimerases (hidrolases e liases) (Martins, 2006).
Protopectinases: so enzimas que degradam a protopectina insolvel gerando a pectina
polimerizada altamente solvel.
Esterases: catalisam a desesterificao da pectina por remoo do grupo metoxil das
substncias pcticas, formando cido pctico. A pectina de baixa metoxilao liberada pode
ser hidrolisada pela poligalacturonase. As pectinesterases (PE) so produzidas por fungos,
bactrias, leveduras e plantas superiores e esto presentes em praticamente todos os
preparados comerciais.
Despolimerases: catalisam a quebra das ligaes glicosdicas (14) entre os
monmeros do cido D galacturnico da cadeia de galacturonana. Essas enzimas atuam em
pectinas por mecanismos de hidrlise (poligalacturonase), catalisando a quebra da ligao
glicosdica pela introduo de gua, ou por transeliminao (liases), quebrando a ligao
glicosdica por reao de transeliminao do H, formando dupla ligao entre os carbonos 4 e
5 do cido galacturnico.
As enzimas despolimerizantes so classificadas de acordo com a clivagem hidroltica
(hidrolases) ou transeliminativa (liases) das ligaes glicosdicas; mecanismos endo-
(randmica) ou exo- (a partir do final da molcula) de ao e preferncia por cido pctico ou
pectina como substrato. Envolvem as hidrolases (catalisam a hidrlise de ligaes -1,4) e as
liases (catalisam -eliminao) (Uenojo, 2003). Os pontos de ataque das enzimas pcticas na
molcula de pectina esto representados na Figura 2.11.



45

Figura 2.11. Pontos de ataque das pectinases na molcula de pectina.
Fonte: Martins (2006)

Hidrolases - As hidrolases incluem as polimetilgalacturonases e as poligalacturonases, podem
apresentar ao endo- (hidrlise randmica) ou exo- (hidrlise seqencial).
A polimetilgalacturonase (PMG) presumivelmente hidrolisa ligaes -1,4 de
polimetilgalacturonatos. Apesar de ser citada em algumas literaturas, sua existncia
questionada por alguns autores.
A poligalacturonase (PG) hidrolisa -1,4 ligaes glicosdicas entre dois resduos do
cido pctico. As poligalacturonases fngicas so teis pela alta atividade enzimtica e possui
pH timo de atividade na regio levemente cida e temperatura tima entre 30 e 50C (Zheng
& Shetty, 2000; Uenejo & Pastore, 2007).
Liases - As liases, tambm chamadas transeliminases, rompem ligaes glicosdicas
resultando em galacturondeos com uma ligao insaturada entre os carbonos 4 e 5 do final
no redutor do cido galacturnico formado. Podem apresentar ao endo- (hidrlise
randmica) ou exo- (hidrlise seqencial).
A pectina liase (polimetilgalacturnato liase, PML) quebra as ligaes por
transeliminao do hidrognio dos carbonos das posies 4 e 5 da poro aglicona do
substrato (pectina).
A pectato liase (poligalacturonato liase, PL) catalisa a clivagem de ligaes -1,4 de
cido pctico e requerem Ca
2+
para atividade (Uenojo, 2003).


46
Os preparados enzimticos que se encontram no mercado so um complexo enzimtico
contendo todas as enzimas do grupo pectinoltico alm de celulase, hemicelulase, ou seja,
possuem diversos tipos de atividade (Couri, 1993).
A sntese destas enzimas sofre influncia dos componentes do meio de cultivo,
particularmente da fonte de carbono, presena de indutores (pectina e derivados) e das
condies de cultivo, como pH, temperatura, aerao, agitao e tempo de incubao. Com
relao s estratgias para o processo de produo, a fermentao em estado slido
geralmente preferida por permitir a produo de enzimas brutas mais concentradas e,
conseqentemente, com menores custos de extrao e purificao (Uenojo & Pastore, 2007).

2.7.1 Aplicaes das pectinases
As pectinases foram s primeiras enzimas a serem utilizadas comercialmente, tendo sido
introduzida na dcada de 30 na produo familiar de sucos de frutas. So aplicadas
industrialmente na extrao e clarificao de sucos de frutas, na macerao de vegetais e
frutas e na extrao de leos essenciais.
Uenojo & Pastore (2007) relataram algumas aplicaes industriais importantes de
pectinases bem como suas vantagens citadas a seguir:

Indstrias de sucos de frutas
As substncias pcticas so responsveis pela consistncia, turbidez e aparncia dos
sucos das frutas, e sua presena causa um aumento considervel na viscosidade do suco,
dificultando a filtrao e a concentrao. A adio de enzimas pectinolticas nos purs de
frutas e vegetais resulta na degradao da pectina e outros componentes de alto peso
molecular, diminuindo a viscosidade e aumentando o rendimento dos sucos ocasionando uma
aparncia cristalina no produto final e reduzindo em at 50% o tempo de filtrao.
A combinao de pectinases, celulases e hemicelulases, chamadas coletivamente de
enzimas de macerao, usada na extrao e clarificao de sucos de frutas e vegetais. O
tratamento enzimtico conduz a uma extensa degradao da lamela mdia e da pectina das
paredes celulares por ao de poligalacturonase, pectina metil esterase e pectina liase. O efeito
sinergstico da combinao de pectinases e celulases um processo crucial no tratamento
enzimtico da polpa para uma quase completa liquefao das frutas e dos vegetais. A hidrlise
enzimtica das paredes celulares aumenta o rendimento de extrao, a polpa resultante tem
baixa viscosidade e a quantidade de resduos da polpa reduzida. O uso de enzimas de


47
macerao aumenta o rendimento da extrao e melhora o processamento, sem aumento de
custos. Essas enzimas so utilizadas aps o corte da matria-prima, para macerar a polpa at a
liquefao parcial ou total da fruta, diminuindo o tempo de processamento e melhorando a
extrao dos componentes da fruta. Aps a extrao, pectinases so adicionadas para
clarificao e diminuio de viscosidade para facilitar a filtrao e concentrao.

Recuperao de leos essenciais
Os leos essenciais esto localizados especialmente no albedo de frutas ctricas e
contm hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos), compostos oxigenados (aldedos, steres,
lcoois, cetonas e fenis) e resduos no volteis (ceras, flavonides e cidos graxos). Aps a
extrao do suco, as partculas de albedo e a emulso leo-gua so separadas. Esta emulso
passada em um ciclone e, a seguir, centrifugada para produzir uma emulso rica em leo, que
concentrada. A aplicao de pectinases hidrolisa os complexos de pectina-protena,
liberando o leo, aumentando o rendimento, diminuindo o tempo de processo e melhorando a
qualidade do produto final.

Indstrias de vinhos
Pectinases, em conjunto com -glucanases e hemicelulases, tm sido utilizadas na
produo de vinho. As vantagens do uso das trs enzimas so: melhor macerao da casca e
aumento da extrao de pigmentos, facilita a clarificao e a filtrao do mosto e aumenta a
qualidade e a estabilidade do vinho. A adio de pectinases durante o esmagamento das uvas
ou no mosto de vinho melhora a extrao do suco, reduz o tempo de clarificao e aumenta o
contedo de terpenos no vinho. Preparaes comerciais de pectinases com alta atividade de
pectina liase e baixa atividade de pectina metil esterase so preferidas por minimizarem a
liberao de metanol dos cidos poligalacturnicos metilados durante a produo de vinho.

Extrao de leos vegetais
leos de canola, coco, semente de girassol, palma e oliva so tradicionalmente
produzidos por extrao com solventes orgnicos, mais comumente o hexano. A degradao
da parede celular por enzimas pectinolticas permite seu uso para extrao de leo vegetal em
processo aquoso, pela liquefao dos componentes estruturais das paredes celulares das
sementes que contm leo. Preparaes comerciais enzimticas contendo pectinases, celulases
e hemicelulases comearam a ser utilizadas para extrao de leo de oliva, sendo adicionadas


48
durante a prensagem das azeitonas para melhorar o processo de extrao. O uso de enzimas de
macerao aumenta a quantidade de agentes anti-oxidantes e de vitamina E em leo de oliva
extravirgem, reduz a induo ao rano, aumenta a extrao, melhora o fracionamento na
centrifugao e produz leo com baixo teor de umidade.

Indstria txtil
Enzimas pectinolticas podem ser usadas nas indstrias txteis para degradar a camada
de pectina que recobre as fibras de celulose, liberando-as para posterior processamento, no
tratamento do resduo lquido e na degomagem das fibras naturais. Pectinases alcalinas so
utilizadas para macerao das fibras vegetais, como linho, cnhamo e juta, na biopreparao
de algodo e no polimento enzimtico de tecidos mistos de juta e algodo. Em algodo cru, a
remoo da pectina, cera e agentes de goma com a utilizao de pectinases em conjunto com
amilases, lipases e hemicelulases em condies adequadas, substitui o uso da soda custica e
gera produtos de alta qualidade, para posterior tingimento e processo de tecelagem com
menor consumo de energia.

Indstria de papel e celulose
Durante a fabricao de papel, pectinases podem despolimerizar substncias pcticas e,
subseqentemente, diminuir a demanda catinica das solues pcticas e do filtrado
resultantes do branqueamento com perxido, solucionar problemas de reteno no
branqueamento mecnico da celulose e no tratamento dos efluentes dos moinhos de papel.

Rao animal
Pectinases so utilizadas em conjunto com outras enzimas para reduzir a viscosidade da
rao animal, a fim de aumentar a absoro e a liberao de nutrientes atravs da hidrlise das
fibras no biodegradveis e dos nutrientes bloqueados pelas fibras.

Captulo 3
Estado da Arte
Cap t ul o 3 Est ado da Art e


50
3. Estado da Arte

O captulo trs discorre sobre estudos de produo de enzimas, em especial pectinase,
por fermentao em estado slido, quais os avanos em termos de meios, condies de cultivo
e os principais microrganismos utilizados.

3.1 - Produo de pectinase por FES
A fermentao em estado slido (FES), associada a diferentes organismos, sempre
representou um importante instrumento para a obteno de produtos de interesse econmico.
Este processo tem-se mostrado muito promissor no desenvolvimento de vrios bioprocessos,
como na biorremediao e biodegradao de compostos txicos, desintoxificao de resduos
e subprodutos agroindustriais, biotransformao de resduos de colheitas para enriquecimento
nutricional e na obteno de produtos de alto valor agregado, como metablitos secundrios
(antibiticos, alcalides, fatores de crescimento vegetal, etc), cidos orgnicos, biopesticidas,
biocombustveis, compostos aromticos e enzimas (Martins, 2006).
Nos ltimos anos, houve uma crescente tendncia em se utilizar o processo de
fermentao em estado slido para obteno de enzimas, considerando a maior produo,
menor represso catablica e, ainda, esse processo geralmente permite a obteno de
protenas com maior termoestabilidade e tolerncia ao pH (Martins, 2006).
Sols-Pereira et al. (1993) compararam a produo de pectinases por Aspergillus niger
em FS e FES utilizando diferentes fontes de carbono, avaliando o efeito da adio de glicose,
sacarose e cido galacturnico sobre a produo da enzima. As atividades das enzimas endo-
poligalacturonase e exo -poligalacturonase em FS foram inferiores quelas obtidas em FES.
Alm disso, altas concentraes de glicose estimularam a produo das enzimas em FES,
enquanto que em FS levaram represso catablica.
Zheng & Shetty (2000) mostraram que a produo de pectinases por FES, a partir de
resduos das indstrias que processam frutas, levou a obteno de enzimas com caractersticas
de resistncia a valores de pH ideais para aplicao industrial. Os autores ressaltaram que, o
pH naturalmente cido dos substratos, levou a este resultado. A enzima se mostrou estvel a
temperaturas at 50C sendo completamente inativada a 85C por 20 minutos e a pH na faixa
de 3,0 a 6,5.


51
A seleo do substrato para os processos de FES depende de vrios fatores,
principalmente aqueles relacionados ao seu custo e eficincia. Neste contexto, a utilizao de
subprodutos agroindustriais torna-se um atrativo para este processo. A aplicao destes
materiais em bioprocessos tornou-se importante sob o ponto de vista ambiental, reduzindo
problemas relacionados ao seu manejo inadequado e conseqentes danos ambientais. Alm
disso, seu baixo custo e grande disponibilidade fazem dos mesmos excelentes matrias-primas
alternativos para vrios processos industriais (Silva et al., 2005). Para a seleo do substrato
duas consideraes so importantes. A primeira que este deve ter boa disponibilidade e
agregar valor ao produto de interesse. A outra que o mesmo deve proporcionar uma boa
produo do produto desejado (Pandey, 2002). Nos estudos de produo de pectinases,
inmeros subprodutos agrcolas e agroindustriais tm sido testados como substratos
alternativos.
A seleo do substrato para produo de pectinase foi centrada basicamente na
utilizao de resduos tropicais da colheita e agroindstria. Os mais estudados foram: farelo
de trigo, farelo de arroz, resduos de ma, bagao de laranja e bagao de cana-de-acar.
Fatores como as fontes de carbono e nitrognio e suas concentraes sempre foram de
interesse da indstria biotecnolgica, sempre com o interesse de baixar o custo do meio.
Estima-se que 30% a 40% do custo da produo industrial de enzimas devido ao meio
(Ustok, Tari, Gogus, 2006).
A sntese de enzimas pectinolticas fortemente influenciada pelo substrato,
especialmente as fontes de carbono e nitrognio, presena de pectina e temperatura (Linde et
al., 2007). Fontana, Salvador, Silveira (2005) relataram que a pectina pode ser usada pelo A.
niger como substrato para crescimento alm de indutor na produo da poligalacturonase.
Estes resultados so suportados com Maldonado & Strasser Saad (1998) que verificaram o
crescimento miceliar e produo de pectinase por A. niger usando exclusivamente pectina
como fonte de carbono.
A falta de atividade pectinoltica em culturas com glicose como nica fonte de carbono
reflete a natureza de induo das enzimas pcticas pelo fungo Aspergillus niger. Entretanto,
quando diferentes concentraes de glicose so adicionadas ao meio contendo pectina, a
produo de enzimas pcticas inibida em altas concentraes enquanto que baixas
concentraes de glicose estimulam a produo de enzimas (Fawole & Odunfa, 2003).
Fawole & Odunfa (2003) estudaram alguns efeitos da produo de pectinase por
Aspergillus niger. Com relao fonte de nitrognio observaram que o sulfato de amnia e o


52
nitrato de amnia so boas fontes de nitrognio enquanto usando glicina e triptofano no
houve atividade da poligalacturonase nem da polimetilgalacturonase. A maior produo de
enzimas pcticas ocorreu usando o sistema de fermentao em estado slido, substrato
contendo pectina, suplementado com sulfato de amnia em fermentador estacionrio a 40C e
pH 5, por 5 dias.
Patil & Dayanand (2006) testaram como fontes de nitrognio o sulfato de amnia e o
nitrato de amnia nas concentraes de 0,1-0,5% na produo de pectinase por Aspergillus
niger usando girassol como substrato, observaram que as duas fontes aumentam a produo
de enzimas, sendo o maior valor obtido com 0,3% de uma das fontes, a atividade foi um
pouco maior quando o sulfato de amnia foi usado.
As observaes de Hours, Voget, Ertola (1998) sugerem que baixos nveis de sulfato de
amnia (0,16%) e fosfato de potssio (0,1%) adicionados ao meio no influenciam no
rendimento em enzimas.
Ustok, Tari, Gogus (2006) estudaram a produo da poligalacturonase por Aspergillus
sojae ATCC 20235 em milho esmagado e observaram que a maior produo foi com valores
de inculo de 2x10
7
com tempo de fermentao de 5-6 dias sendo de 29,1 U/g de PG.
Silva et al. (2002) estudaram a produo de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG)
por cepa de Penicillium viridicatum Rfc3 em FES usando bagao de laranja, tegumento de
milho, farelo de trigo e casca de manga e banana como fontes de carbono. Quando os resduos
foram utilizados isoladamente, o valor mximo de atividade de PG (30 U/g) foi observado em
farelo de trigo, enquanto o valor mximo de PL (2000 U/g) foi obtido em bagao de laranja.
Misturas de casca de banana ou de manga com bagao de cana-de-acar (1:1) resultaram em
aumento na produo tanto de PL quanto de PG, quando comparado com os experimentos nos
quais esses materiais foram usados isoladamente. A mistura de bagao de laranja e farelo de
trigo elevou a produo de PG e PL para 55U/g e 3540 U/g, respectivamente. A adio de
material fibroso, como bagao de cana, aumentou os espaos entre as partculas,
possibilitando elevao na aerao e difuso de nutrientes e enzimas.
Couri et al. (2000) testaram casca de banana, casca de manga, farelo de mandioca e
farelo de trigo como substratos na produo de enzimas hidrolticas pelo Aspergillus niger
3T5B8. O uso de farelo de trigo as 42 horas de fermentao apresentou os melhores
resultados com 30,75 U/mL (76,9 U/g) da poligalacturonase, 30,62 U/mL de xilanase e 5,27
U/mL de protease. Com casca de manga obtiveram 4,20 U/mL (10,5 U/g) de PG em 72 horas
de processo com adio de 0,3% de celobiose. A casca de manga agiu como inibidor na


53
sntese de protease, o que bom, pois a presena de protease aumenta a instabilidade da
mistura enzimtica.
Malvessi & Silveira (2004) estudaram a influencia do pH inicial do meio (2 a 7) na
produo de PG por Aspergillus oryzae por FS. Observaram que o pH do meio influencia
fortemente a produo da poligalacturonase. A mxima atividade ocorreu quando o pH inicial
do meio foi de 4. O pH timo de desenvolvimento dos fungos Aspergillus 4 enquanto a
maior atividade da PG ocorre em pH 3. Para valores de pH entre 2-3 o crescimento do fungo
menor e a atividade de PG tambm menor, para valores de pH inicial de 4-6; favorece o
crescimento do fungo nas primeiras 24 horas resultando em elevados valores de atividade da
PG. O pH 7 favorece a ao das proteases, com capacidade para degradar as pectinases do
meio.
Martin et al. (2004) usaram os fungos Moniliella sp SB9 e Penicillium sp EGC5 na
produo da poligalacturonase (PG) e pectina liase (PL) usando substrato composto de bagao
de laranja, bagao de cana e farelo de trigo (1:1:1), a maior produo foi obtida entre o
terceiro e quarto dia de processo, com a mxima atividade de PG 26 U/g e PL 19400 U/g com
seis dias usando Moniliella sp SB9.
Linde et al. (2007) estudaram a produo de poliglacturonase por FES testando os
microrganismos A. niger e A. oryzae, substrato farelo de trigo e farelo de arroz
desengordurado e como fonte de nitrognio sulfato de amnia e uria e tambm a utilizao
de pectina. Concluram que o microrganismo e a pectina influenciam o processo, sendo a
maior produo obtida usando-se A. niger e pectina. Apesar do meio e fonte de nitrognio no
serem estatisticamente significativas para o processo os maiores valores de atividade da
enzima foram obtidos com farelo de arroz desengordurado e com o sulfato de amnia como
fonte de nitrognio.
Conforme Botella et al. (2006) o bagao de uva uma fonte promissora de enzima
hidrolticas por Aspergillus awamori. O tamanho da partcula do substrato no tem efeito na
produo da enzima, enquanto a adio de uma fonte extra de carbono, glicose, e o teor de
umidade influenciam extremamente a produo das enzimas.
A produtividade da FES, conforme Nigam & Singh (1994), afetada significativamente
pelo nvel de umidade do meio. Gonzlez et al. (1988) mostrou que em FES, entre todas as
condies de cultura o nvel de umidade inicial um dos mais crticos. Ramana Murthy,
Karanth, Raghava Rao (1993) explicam que o contedo inicial de umidade impacta em dois
fatores afetando o crescimento celular e formao de produto. Primeiro, determina a atividade


54
de gua (Aa) do meio, ou seja, a disponibilidade de gua no substrato. Segundo, o inchao
causado no substrato facilita a penetrao do miclio para utilizao de efetiva do substrato.
Raimbault & Alazard (1980) estudaram a influncia de diferentes nveis de umidade
iniciais no crescimento de Aspergillus niger. Os melhores resultados foram obtidos para
meios com contedos de umidade que variam de 50% a 55%. Eles mostraram o efeito
negativo dos contedos de umidade mais altos no crescimento, devido reduo na
porosidade do meio e difuso de oxignio no material slido.
Castilho, Medronho, Alves (2000) observaram reduo na formao de enzima por
Aspergillus niger com alto nvel de umidade (70%), mas tambm baixos nveis de umidade
25% resultam em pouca produo de pectinase. Conforme Acua-Arguelles et al. (1994), em
meios com baixa disponibilidade de gua os fungos sofrem modificaes na membrana
celular, conduzindo a limitaes de transporte e afetando o metabolismo microbiano.
Berovic & Ostroversnik (1997) usando o Aspergillus niger para fermentar uma mistura
de bagao de ma, farinha de soja, farelo de trigo e farelo de milho, relatam que o alto
contedo de umidade, 50-73% reduz a produo de enzimas, no promove o crescimento do
fungo e aumenta a possibilidade de contaminaes bacterianas, principalmente na coleta de
amostra, apresentando contaminaes por Bacillus subtilis. Com umidade baixa, entre 12-
23% o crescimento da biomassa e a penetrao do miclio so reduzidos, consequentemente
diminuindo a produo de enzimas e prolongando o tempo de processo. Observaram tambm
que aps 70 horas de processo h um decrscimo da atividade enzimtica, devendo ser
associada ao consumo de algum componente essencial ou a produo de inibidor.
Patil & Dayanand (2006) citam que geralmente o perodo de fermentao para sntese
de pectinase fngica varia entre 48-72 horas.
Hours, Voget, Ertola (1998) obtiveram 1062 U/g de pectinase usando resduo de ma
com uma fonte adequada de nitrognio orgnico e o Aspergillus foetidus. Bladino et al.
(2002) obtiveram 25 U/g de atividade da poligalacturonase usando trigo e Aspergillus
awamori. Galiotou-Panaytou & Kapantai (1993) obtiveram 14,5 U/mL da poligalacturonase
por Aspergillus niger em meio suplementado com pectina ctrica. Patil & Dayanand (2006)
obtiveram 45,9 U/g de poligalacturonase usando girassol, suplementado com glicose e sulfato
de amnia por Aspergillus niger. Segundo Ustok, Tari, Gogus (2006) a comparao direta dos
valores de atividade enzimtica no prudente, pois nem todas as condies so idnticas,
podendo ser usada como uma avaliao grosseira da produo de enzimas.



55
3.2 Microrganismos usados na produo de pectinase
A composio dos complexos pectinolticos de origem microbiana varia de acordo com
a espcie do microrganismo produtor e, dessa forma, a seleo de isolados capazes de
sintetizar enzimas com propriedades adequadas a cada processo fundamental para a
utilizao industrial das mesmas. Bactrias, leveduras e fungos filamentosos so de grande
interesse na produo de enzimas em virtude das inmeras vantagens apresentadas por estes
organismos, tais como: o crescimento rpido, no requerem amplos espaos para o seu
crescimento; so capazes de degradar variados substratos, inclusive resduos e subprodutos
agroindustriais (Martins, 2006).
As preparaes de pectinases mais comumente utilizadas so de origem fngica,
principalmente de Aspergillus e Penicillium (Pandey, Soccol, Mitchell, 2000; Guammadi &
Panda, 2003). No entanto, o estudo de outros microrganismos produtores fundamental para
a obteno de enzimas com caractersticas distintas, adequadas a materiais e processos
industriais especficos.
Segundo Fogarty & Ward (1972), a produo de pectinases em larga escala feita
basicamente por fungos, particularmente do gnero Aspergillus. Dentre estes, linhagens de
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus wentii e Aspergillus flavus so algumas das
mais adequadas. As caractersticas das enzimas obtidas a partir destas fontes as tornam ideais
para o processamento de frutas, sendo esta sua principal aplicao. Os preparados enzimticos
comerciais de origem fngica normalmente contm uma mistura de enzimas pectinolticas. A
Tabela 3.1 mostra a ocorrncia das enzimas pcticas em alguns microrganismos.
A seleo do microrganismo capaz de produzir a enzima em nveis adequados o
primeiro passo para a produo de qualquer produto microbiano comercial. Esta seleo
normalmente resultado da investigao da capacidade de centenas de espcies e linhagens
em produzir a enzima desejada. A linhagem selecionada pode sofrer ainda melhoramento
gentico para atingir nveis de produo mais elevados. A cultura pura do microrganismo
mantida sob condies rigidamente controladas, atravs de cultura em gar inclinado e
armazenamento como cultura liofilizada. Exames detalhados da cultura so realizados
periodicamente para assegurar que ela est livre de contaminantes, garantindo assim a
uniformidade da produo da enzima (Couri, 1993).



56
Tabela 3.1. Ocorrncia de enzimas pcticas em alguns microrganismos
MICRORGANISMO PE PG PL PMG PL
Aspergillus niger + + + +
Aspergillus sojae +
Aspergillus saito +
Bacillus sp +
Bacillus subtilis +
Bacillus polymixa +
Bacillus pumilus +
Bacillus sphaericus +
Bacillus stearothermophilus +
Cercocpora arachidicola +
Cephalosporium sp +
Clostridium multifermentans + +
Clostridium aurantibutyricum + +
Clostridium felsineum + +
Cytophaga johnsonii +
Cytophaga deprimata +
Cytophaga albogilva +
Erwinia aroideae + + +
Erwinia carotovora + +
Fusarium culmorum +
Fusarium oxysporum +
Fusarium solani + +
Penicillium expansum +
Penicillium italicum +
Penicillium digitatum + + +
Penicillium chrysogenum + +
Pseudomonas sp +
Pseudomonas fluorescens +
Pseudomonas marginalis + + +
Rhizoctania fragariae +
Rhizoctania solani + +
Rhizopus arrhizus +
Streptomyces nitrosporeus +
Trichoderma koningii +
Trichoderma pseudokoningii +
Xanthomonas sp + +
Xanthomonas campestris + +
Xanthomonas cyanopsidis +
PE: pectina esterase, PG: poligalacturonase, PL: poligalacturonato liase, PMG:
polimetilgalacturonase, PL: polimetilgalacturonato liase. Fonte: Uenojo & Pastore (2007).



57
Couri & Farias (1987) isolaram 49 linhagens de fungos filamentosos de fontes naturais
e selecionaram uma de A. niger van Tieghem, da pimenta do reino, para produo de enzimas
pectinolticas por fermentao semi-slida.
Maldonado et al. (1986) isolaram uma linhagem de Aspergillus sp de limo podre e
verificaram a produo de pectinases usando como fonte de carbono, casca de limo pr-
tratada e pectina como padro. A produo de PE foi maior com casca de limo enquanto que
a de PG no foi alterada.
Castilho (1997) citou que o estudo da manipulao gentica de microrganismos, para
seleo de linhagens mutantes que sejam mais produtivas e que no estejam sujeitas
represso catablica ou que sintetizem grandes quantidades de enzimas sem a necessidade de
uma substncia indutora, pode ser de grande interesse para a produo comercial. Um
exemplo de xito em pesquisas nesta rea foi obtido por Couri & Farias (1995). Os autores
utilizaram tcnicas de manipulao gentica com etilmetanosulfonato (EMS) e radiao UV
para obteno de linhagens mutantes de A. niger com elevada capacidade de sintetizar
pectinases em FES. A linhagem mutante selecionada, A. niger 3T5B8, produziu atividade
pectinoltica 282% e atividade poligacturonsica 56% superior linhagem selvagem.

Captulo 4
Metodologia
Experimental
Cap t ul o 4 Met odol ogi a Experi ment al


59
4. Metodologia Experimental

O captulo quatro apresenta os materiais utilizados no presente trabalho, bem como os
mtodos empregados. Neste captulo descrevem-se a obteno dos resduos utilizados nos
ensaios de fermentao em estado slido para obteno de pectinase e sua caracterizao
fsico-qumica. O microrganismo empregado no processo, o modo de preservao e cultivo.
Apresenta tambm a matriz do planejamento experimental em que se basearam os
experimentos, com o objetivo de identificar as melhores condies do processo em termos de
umidade inicial, adio de fonte de nitrognio e adio de fonte de fsforo ao meio, para
produo da poligalacturonase. Detalhes do processo fermentativo e as anlises realizadas
durante os experimentos. Por fim, apresenta matriz do planejamento experimental realizado
para identificar as melhores condies de extrao da poligalacturonase.

4.1 Preparo do resduo
Como meio de cultivo no processo de fermentao em estado slido para obteno de
pectinase, foram utilizados dois resduos do pednculo de caju: o resduo do pednculo de
caju no lavado e resduo do pednculo de caju lavado.
O resduo do pednculo de caju sem lavar foi obtido a partir do pednculo de caju
adquirido no comrcio da cidade de Campina Grande-PB. Os frutos estavam maduros e
apresentavam colorao vermelha.
Os cajus foram lavados em gua corrente, e depois separou-se os pednculos da
castanha. O pednculo limpo foi triturado e peneirado para separao do suco. O bagao
mido foi disposto em bandejas de alumnio cobertas com polietileno e levados a estufa com
circulao de ar a temperatura de 60C por um perodo de 30 horas em camadas de
aproximadamente 0,5 cm, para chegar-se ao resduo seco do pednculo. A Figura 4.1 mostra
o aspecto do resduo do pednculo de caju seco.

Figura 4.1. Resduo do pednculo de caju.


60
O resduo do pednculo de caju lavado foi fornecido pela Embrapa Agroindstria
Tropical, com sede em Fortaleza-CE. O bagao de pednculo de caju foi cedido por uma
indstria de suco de fruta de Fortaleza. Ao chegar Embrapa o bagao foi lavado com gua
cinco vezes, na proporo 1 kg de bagao para 2 litros de gua, e seco em estufa com
circulao de ar a 50C por 24 horas. A Figura 4.2 apresenta o resduo seco do pednculo de
caju lavado.
Os resduos secos obtidos foram triturados em moinho e armazenados em recipientes
fechados temperatura ambiente.

Figura 4.2. Resduo seco do pednculo de caju lavado.

4.1.1 - Caracterizao dos resduos
A caracterizao fsico-qumica dos resduos quanto granulometria, densidade
aparente, pH, umidade, cinzas, slidos solveis, acares redutores, protena e pectina, foi
realizada conforme procedimentos descritos a seguir.

4.1.1.1 - Granulometria
Pesou-se 100 gramas (balana analtica) de cada resduo que foram transferidos,
separadamente, para o agitador de peneiras Contengo-Pavitest durante dez minutos, em jogo
constitudo por quatro peneiras, seguindo as recomendaes da Associao Brasileira de
Normas Tcnicas (ABNT): 20 mesh (0,84 mm), 24 mesh (0,71mm), 35 mesh (0,45mm) e 48
mesh (0,297mm). O material retido em cada peneira foi pesado e os resultados expressos
percentualmente em relao ao peso do material original (Correia, 2004).



61
4.1.1.2 - Densidade aparente
Para determinao da densidade aparente pesou-se 100 gramas dos resduos que foram
colocados em proveta para determinar o volume ocupado, sem haver compactao (Correia,
2004). A densidade aparente expressa conforme Equao (2).

( )
( ) mL ocupado volume
g massa
aparente Densidade = (2)

4.1.1.3 - pH
Preparou-se uma suspenso com 10mL de gua destilada e 1,0 g da amostra slida.
Aps homogeneizao a suspenso foi deixada em repouso por um perodo de 30 minutos,
depois o pH foi mensurado em potencimetro digital, previamente calibrado com as solues
padres (Instituto Adolfo Lutz, 1985).

4.1.1.4 - Umidade
Para anlise de umidade pesou-se de 3 a 5 gramas da amostra em cadinho de alumnio
previamente seco e tarado. Os cadinhos foram colocados em estufa a 105C por 24 horas
(Correia, 2004).

( ) 100
amostra da inicial peso
) amostra da final peso inicial peso (
% Umidade
= (3)

4.1.1.5 - Cinzas
Cadinhos de porcelana vazios foram depositados em mufla e deixados a 550C, durante
15 minutos. Depois foram deixados em dessecador at atingir a temperatura ambiente e
pesados vazios e com cinco gramas da amostra. Logo aps pesagem os cadinhos foram
levados mufla durante cinco horas, a 550C, at obter cinza clara. Foram ento deixados no
dessecador at a temperatura ambiente e novamente pesada (Instituto Adolfo Lutz, 1985).

( ) 100
amostra da inicial peso
amostra da final peso
% Cinzas = (4)



62
4.1.1.6 - Teor de slidos solveis (Brix)
A concentrao de slidos solveis medida em Brix uma medida relacionada com a
quantidade de acares presentes na amostra. Foram adicionados 9 mL de gua destilada a 1g
do resduo e, aps homogeneizao, deixou-se a suspenso em repouso por 30 minutos, com
agitao intermitente. Aps este perodo a suspenso foi filtrada com algodo realizada a
leitura em refratmetro, o resultado foi multiplicado por dez, devido diluio, afim de
determinar o teor de slidos solveis do resduo (Instituto Adolfo Lutz, 1985).

4.1.1.7 - Teor de acares redutores (AR)
Para a determinao dos acares redutores utilizou-se uma modificao do mtodo do
DNS, originalmente proposto por Miller (1959), de acordo com protocolo da Embrapa
Agroindstria Tropical. O mtodo do DNS (cido 3,5-dinitro saliclico) baseia-se na reduo
deste a cido 3-amino-5-nitrosaliclico, concomitantemente com a oxidao do grupo aldedo
do acar a grupo carboxlico. Aps aquecimento, a soluo torna-se avermelhada, sendo lida
no espectrofotmetro a 540 nm.
Soluo reagente:
Preparo de 100 mL de NaOH 2 normal: em becker de 250 mL foram pesados 8g de NaOH PA
e dissolvido com 50 mL de gua destilada em banho com gua fria. A soluo foi transferida
para balo volumtrico de 100 mL e aferida com gua destilada.
Preparo de 500 mL de DNS: foram pesados 5g de DNS (cido 3,5 dinitro-saliclico) e
adicionados 100 mL de NaOH 2 normal, em becker de 250mL. Em um becker de 500 mL
foram pesados 150 g de tartarato duplo de sdio e potssio e dissolvidos em 250 mL de gua
destilada. A soluo foi levada para aquecimento at dissolver completamente e a ela foi
adicionado soluo de DNS sob aquecimento at dissolver completamente. Deixou-se
esfriar, e aferiu-se em balo de 500 mL com gua destilada. A soluo foi armazenada em
frasco escuro sob condies mnimas de luz.
Curva padro: Na construo da curva padro foram pesados 100 mg (0,1 g) de glicose e
dissolvido em 100 mL de gua destilada em balo volumtrico. Aps agitao vigorosa para
homogeneizar, transferiu-se 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 mL da soluo-me para tubos de ensaio e
o volume foi completado para 10 mL com gua destilada. Os tubos foram homogeneizados e
de cada tubo transferiu-se 1 mL para tubos com 1 mL de DNS (em duplicata). Os tubos foram
aquecidos a 100C por cinco minutos, tendo-se o cuidado de no colocar os tubos antes de
aquecimento vigoroso do banho e ento resfriados em banho com gua a temperatura


63
ambiente por trs minutos. A cada tubo foram adicionados 8 mL de gua destilada, aps
homogeneizado, a absorbncia foi lida a 540 nm. Com os valores de absorbncia, foi
construda a curva de absorbncia versus concentrao.
Anlise das amostras: Inicialmente foi determinada a quantidade inicial de amostra que
resultasse em leitura dentro da faixa da curva padro. As diluies necessrias foram usadas
no clculo para determinao do teor de acar da amostra desconhecida. Depois de dissolver
determinada quantidade de amostra em um volume definido de gua, transferiu-se 1mL para
tubos de ensaio contendo 1mL de soluo DNS. A seguir, os tubos foram levados para banho
de gua fervente por exatos 5 minutos. Aps este intervalo, os tubos foram retirados do banho
de gua quente e colocados em banho de gua fria por trs minutos, at completo
resfriamento. Em cada tubo foi adicionado 8 mL de gua destilada e feita leitura
imediatamente a 540 nm. A curva padro foi usada para transformar a leitura de absorbncia
em miligramas de acares redutores por mililitro de soluo. Efetuaram-se os clculos para
expressar os resultados em miligramas de acares redutores por grama de amostra inicial
(mg AR/g amostra).

4.1.1.8 - Protena bruta
Inicialmente para anlise de protena testou-se o mtodo do Biureto. Durante a etapa de
extrao das protenas do resduo slido, usando 0,5 g da amostra, 1 mL de hidrxido de sdio
0,5 normal e 10 mL de gua destilada em banho de gua fervente por 5 minutos, a soluo
obtida ficava muito escura. Devido a isto as leituras de absorbncia eram muito elevadas
levando a resultados de protena inconsistentes. Assim mtodos em que a extrao da protena
feita usando soluo de hidrxido de sdio como, mtodo do Biureto e Lowry, foram
descartados.
Desta forma, adotou-se o mtodo usado para anlise de protena do Laboratrio de
Solos e Nutrio de Plantas da Embrapa Algodo, localizada em Campina Grande PB, nele
as protenas so digeridas pelo mtodo do Kjeldahl e o nitrognio formado quantificado
usando o Reativo de Nessler.
No mtodo de Kjeldahl determina-se o nitrognio protico propriamente dito e outros
compostos nitrogenados no proticos, tais como: aminas, amidas, lecitinas, nitrilas e
aminocidos. Neste caso, o resultado dado como protena bruta. O termo protena bruta


64
envolve um grande grupo de substncias com estruturas semelhantes, porm com funes
biolgicas diferentes.
Sendo o contedo de nitrognio das diferentes protenas aproximadamente 16%,
introduz-se o fator emprico 6,25 para transformar o nmero de gramas de nitrognio
encontrado em nmero de gramas de protena (Instituto Adolfo Lutz, 1985).
Pelo mtodo Kjeldahl as protenas e outros compostos nitrogenados so decompostos
na presena de cido sulfrico concentrado, a quente, com produo de sulfato de amnio. O
sulfato de potssio ou de sdio adicionado, a fim de aumentar o ponto de ebulio do cido
sulfrico, apressando a digesto. O sulfato de amnia resultante, neste caso, foi quantificado
usando o Reagente de Nessler, conforme descrito a seguir.
Preparo do Reativo de Nessler
Pesava-se 45,5 g de HgI em um becker (1) de 500 mL adicionava-se 200 mL de gua
destilada e misturava-se bem.
Pesava-se 34,9 g de KI e dissolvia-se em um pouco de gua destilada. Adicionava-se ao
becker com soluo de HgI e misturava-se para dissolver bem.
Pesava-se 112 g de KOH e dissolvia-se em aproximadamente 200 mL de gua destilada, em
banho com gua fria. Aps completa dissoluo esperava-se esfriar e adicionava-se ao becker
(1) com agitao constante para no queimar.
O contedo do becker era transferido para balo volumtrico de 1000 mL e aferindo-se o
balo com gua destilada.
Transferia-se a soluo para um becker e agitava-se, com agitador magntico por 4 horas.
Aps este perodo, se houvesse necessidade a soluo era filtrada e guardada em frasco
escuro.
Digesto sulfrica
Pesava-se 0,1 g da amostra em tubo de ensaio grande.
Colocava-se 50 mg de sulfato de sdio.
7 a 10 gotas de sulfato de cobre a 5% (0,5 mL).
5 mL de cido sulfrico.
Fazia-se uma prova em branco.
Fazia-se uma pr-digesto (12 horas) a frio.
Aquecia-se em bloco digestor a temperatura de 350 C, aumentando gradativamente a
temperatura do bloco: 50C por uma hora, 100C por uma hora, 150C aps 30 minutos e
assim sucessivamente at 350C.


65
Retirava-se do bloco digestor quando toda matria orgnica estava destruda (ficava uma cor
clara esverdeada).
Deixava-se esfriar.
Transferia-se o material para um balo volumtrico de 100 mL, lavando bem o tubo de ensaio.
Fazia-se o aferimento do balo quando estava frio. extrato (1)
Preparo da curva padro
A curva padro foi feita utilizando uma soluo 10 ppm de cloreto de amnia, como ppm
corresponde a mg/L preparava-se uma soluo usando 1g de NH
4
Cl e dissolvia-se em balo
volumtrico de 1000 mL, obtendo-se assim uma soluo de 1000 ppm.
Da soluo anterior, tomava-se 1 mL e transferia-se para balo volumtrico de 100 mL,
obtendo uma soluo 10 ppm.
Numerava-se 6 bales volumtricos de 50 mL e adicionava-se um pouco de gua destilada.
Seguia-se os valores da Tabela 4.1 para fazer a curva padro.

Tabela 4.1. Curva de calibrao para anlise de protena
Concentrao de
N (ppm)
NH
4
Cl 10 ppm
(mL)
NaOH 10%
(mL)
Silicato de Sdio
20% (mL)
Reagente de
Nessler (mL)
0 0 1 1 2
0,2 1 1 1 2
0,4 2 1 1 2
0,6 3 1 1 2
0,8 4 1 1 2
1,0 5 1 1 2

Completava-se o volume de cada balo para 50 mL com gua destilada.
Deixava-se em repouso por 30 minutos.
Fazia-se leitura no espectrofotmetro a 410 nm.
Preparo das amostras:
Colocava-se 1 mL do extrato(1) em um balo volumtrico de 50 mL.
Adicionava-se um pouco de gua destilada.
Adicionava-se 1 mL de hidrxido de sdio a 10%.
Adicionava-se 1 mL de silicato de sdio a 20 %.
Adicionava-se 2 mL do Reativo de Nessler.


66
Completava-se o volume para 50 mL.
Deixava-se em repouso por 30 minutos.
Fazia-se leitura em espectrofotmetro com o comprimento de onda de 410nm.
Com auxlio da curva padro obtinha-se o teor de protena bruta, pela Equao 5.

% Protena = ABS(amostra-branco)*valor da curva*5*6,25 (5)

4.1.1.9 - Pectinas
Certo nmero de substncias relacionadas ao cido pctico (C
17
H
24
O
16
) recebe esta
designao. Pectinas so componentes de muitas frutas; na presena de acares e cidos,
apresentam a tendncia a formar um gel, de onde a sua grande importncia nos produtos de
frutas. Os mtodos de determinao de pectinas se baseiam na sua extrao por gua quente
seguida por precipitao com lcool e, aps purificao, pesagem na forma de pectato de
clcio ou cido livre.
Inicialmente foram preparadas as seguintes solues:
cido actico 1 normal: Dilua-se 30 mL de cido actico glacial para 500mL com gua
destilada.
Cloreto de clcio 1 normal: Dissolvia-se 27,5g de cloreto de clcio anidro em 500mL de gua
destilada.
Nitrato de prata a 1%: Dissolvia-se 1g de nitrato de prata em 100mL de gua destilada.
cido clordrico 0,05 normal: Dilua-se 4,5 mL de cido clordrico para 1000mL com gua
destilada.
Pesava-se 20 g da amostra em um becker de 1000 mL, adicionando-se 400mL de
soluo de HCl 0,05 normal e leva-se para aquecimento por duas horas a 80-90C,
recolocando-se a gua destilada perdida por evaporao. Aps este perodo a suspenso era
resfriada at a temperatura ambiente e ento transferida para uma proveta de 500mL
completando-se o volume com gua destilada. Filtrava-se com auxlio de algodo.
Do extrato filtrado media-se em proveta 200mL e transferia-se para um becker de 1000mL,
acrescentando-se 250mL de gua destilada. A soluo era ento neutralizada com NaOH 1
normal, usando papel indicador de pH. Aps neutralizao, adicionava-se 10mL de NaOH 1
normal em excesso, com agitao constante. Em seguida era deixada em repouso por uma
noite. No dia seguinte adicionava-se 50mL de cido actico 1 normal e aps 5 minutos
acrescentava-se 25mL de soluo de cloreto de clcio 1 normal com agitao. A soluo era


67
levada ebulio por 2 minutos e deixada em repouso por 3 horas. Aps esse perodo era
filtrada atravs de papel de filtro preparado antecipadamente (molhava-se o papel de filtro
com gua destilada, secava-se em estufa a 105C por 2 horas, resfriava-se em dessecador e
pesava-se). O precipitado era lavado com gua destilada quase fervendo, at que ficasse livre
de cloretos, para isto fazia-se o teste usando nitrato de prata no filtrado. O papel de filtro
contendo o pectado de clcio era seco na estufa a 105C at peso constante Rangana (1979). A
pectina era expressa em %de pectato de clcio atravs da expresso:

amostra da peso filtrado do mL
100 500 clcio de pectato do peso
clcio de Pectato %

= (6)

4.1.2 Relao entre umidade e atividade de gua dos resduos frente adio de gua
O preparo e a seleo do substrato devem levar em conta os nveis de atividade de gua
e umidade ideais. A adio de gua ou soluo de nutrientes ao meio pode ser utilizada de
forma a alcanar os nveis ideais para o desenvolvimento do processo de fermentao.
Para os dois resduos utilizados foram analisadas as atividades de gua na temperatura
do processo (30C) e a umidade relativa de equilbrio.
Para a determinao da atividade de gua do substrato foram pesadas amostras com 10g
do resduo seco com a adio de diferentes quantidades de gua, de modo a simular as
condies de incubao. As amostras foram armazenadas em recipientes fechados por um
perodo de 2 horas, e ento analisadas diretamente em equipamento Thermoconstanter
Novasina. As amostras foram colocadas em cubetas apropriadas e inseridas no aparelho.
Transcorrido o tempo necessrio para equilbrio das mesmas era feita leitura direta da
atividade de gua. Aps leitura de atividade de gua as amostras foram levadas estufa para
determinao da umidade relativa de equilbrio.
Com os valores das atividades de gua e umidade relativa de equilbrio foram
construdas curvas que relacionam os valores de atividade de gua e umidade ao volume de
gua adicionada ao resduo, com o objetivo de avaliar a quantidade de gua a ser adicionada
ao substrato, inicialmente, assim como definir o comportamento do resduo frente adio de
gua.



68
4.2 - Microrganismo
O microrganismo empregado foi o Aspergillus niger CCT 0916, selecionado por ser
uma linhagem produtora de pectinases por FES, cedido pela Embrapa Agroindstria Tropical,
com sede em Fortaleza-CE. Os esporos da linhagem foram preservados em tubos de ensaio
com tampas rosqueadas contento solo estril e estocados a -18 C.

4.3 Meio de cultura e manuteno do fungo
Os microrganismos foram ativados em duas etapas de transferncia conforme
procedimento adotado por Couri (1993), usando um meio bsico conforme Tabela 4.2. Neste
meio a pectina a nica fonte de carbono induzindo o crescimento de organismos produtores
de pectinases.
O meio foi preparado dissolvendo a pectina em gua destilada sob agitao vigorosa.
Em seguida, os outros componentes foram adicionados, e o volume do balo aferido. O meio
foi ento levado fervura para cozimento do agar e depois distribudo em tubos de ensaio
(18x180 mm), nos quais foram adicionados 20 mL do meio e tampados com rolhas de
algodo envolvidos em gaze. O meio foi esterilizado por 20 minutos a 0,5 atm e, ainda
quente, inclinados.
Os esporos foram transferidos dos tubos com solo para o meio e incubados por cinco
dias em estufa a 30C, constituindo o primeiro repique. O segundo repique foi obtido de
modo semelhante ao primeiro, partindo dos esporos de primeiro repique.

Tabela 4.2. Composio do meio bsico

COMPONENTES
(grau p.a.)
CONCENTRAO
(g/L)
Pectina ctrica 10,00
NaNO
3
3,00
KH
2
PO
4
1,00
MgSO
4
0,50
KCl 0,50
FeSO
4
7H
2
O 0,01
Agar-Agar 20,00
gua destilada q.s.p.
Fonte: Couri (1993)



69
Os esporos de segundo repique foram utilizados para obteno de grande quantidade de
esporos no meio de sabugo de milho. Cada repique pode ser mantido sob refrigerao por um
perodo de quatro meses. Segundo este procedimento cada tubo de ensaio contendo o
microrganismo no solo s era usado 4 ou 5 vezes, e descartado. Deste modo se assegura que a
linhagem no sofreu mutao, sendo a mesma linhagem usada em todos os experimentos.
O meio de sabugo foi preparado de acordo com protocolo da Embrapa Agroindstria de
Alimentos, no qual primeiro prepara-se as seguintes solues:
Soluo A: pesa-se 20 g de fosfato de potssio monobsico e dissolve-se em gua
destilada, transfere-se para balo volumtrico de 100 mL e afere-se.
Soluo B: Pesa-se 3,96g de sulfato de zinco e dissolve-se em um pouco de gua
destilada. Adiciona-se 4,60g de sulfato de ferro, 0,01g de sulfato de mangans e 0,5mL de
cido sulfrico (95-97%). Aps completa dissoluo avoluma-se a 100 mL com gua
destilada.
Soluo umidificante: pesa-se 2,8g de peptona e dissolve-se em um pouco de gua
destilada, transfere-se para balo volumtrico de 50 mL. Adiciona-se 0,19 mL da soluo A e
0,025 mL da soluo B, avoluma-se e homogeneza-se.
Para cada Erlenmeyer de 125 mL foram pesados 4,6 g de sabugo de milho seco e modo
e adicionado 6 mL da soluo umidificante. O frasco foi tampado com tampo de algodo
envolvido com gaze, homogeneizado e esterilizado em autoclave por 1 hora a 1 atm.
Para inoculao do meio de sabugo de milho foram transferidos 10 mL de uma soluo
0,3% (v/v) de Tween 80 para tubos com os microrganismos de segundo repique. Com auxlio
de uma ala de platina os microrganismos foram suspensos e transferiu-se 1 mL para cada
frasco com o sabugo. Os frascos foram agitados e incubados em estufa a 30C por um perodo
de 5 dias. Aps este perodo os frascos foram armazenados sob refrigerao e utilizados como
inculo nos ensaios de fermentao.

4.4 Obteno da suspenso de esporos
Nos frascos de sabugo com esporos foram adicionados 40 mL de soluo 0,3% v/v de
Tween. Aps agitao vigorosa os esporos foram transferidos para Erlenmeyer com auxlio de
gaze estril. A quantificao da suspenso assim obtida foi feita atravs de contagem dos
esporos em Cmara de Neubauer espelhada. O volume de suspenso de esporos adicionado ao
meio de fermentao foi ajustado de modo a ter-se uma concentrao de 10
7
esporos por
grama de substrato slido.


70
4.5 Estudo das condies de fermentao na sntese de pectinases
Com o objetivo de verificar a influncia das variveis: umidade inicial, suplementao
com uma fonte de nitrognio e suplementao com uma fonte de fsforo na produo da
poligalacturonase foi elaborado uma planejamento experimental fatorial 2
3
, sendo ento trs
fatores e dois nveis para cada fator com trs repeties no ponto central, como mostra a
Tabela 4.3.
Como variveis de resposta (dependentes) foram avaliadas a atividade da
poligalacturonase e o percentual de reduo de viscosidade.
Os nveis das variveis independentes utilizadas em ordem crescente (-1, 0, +1) foram
40%, 50% e 60% para umidade inicial, 0%; 0,5% e 1,0% para nitrognio e 0%, 0,3% e 0,6%
para o fsforo, todos calculados em base mida. Como fonte de nitrognio foi utilizado o
sulfato de amnia e como fonte de fsforo o fosfato de potssio monobsico. Quando as
fontes de nitrognio e fsforo eram adicionadas ao meio, estas aps serem pesadas eram
diludas no volume de gua a ser adicionada ao meio.

Tabela 4.3. Matriz do planejamento fatorial 2
3
+ 3 repeties no ponto central

Experimento Umidade(%) N (%) P (%)
1 -1(40) -1(0) -1(0)
2 +1(60) -1(0) -1(0)
3 - 1(40) +1(1) -1(0)
4 +1(60) +1(1) -1(0)
5 -1(40) -1(0) +1(0,6)
6 +1(60) -1(0) +1(0,6)
7 -1(40) +1(1) +1(0,6)
8 +1(60) +1(1) +1(0,6)
9 0 (50) 0 (0,5) 0 (0,3)
10 0 (50) 0 (0,5) 0 (0,3)
11 0 (50) 0 (0,5) 0 (0,3)



71
4.6 - Processo fermentativo
As fermentaes foram realizadas em Erlenmeyer de 250 mL contendo 20 gramas do
meio mido. Para garantir a uniformidade das amostragens o meio foi preparado, de acordo
com a matriz do planejamento, em becker de polipropileno, adicionando-se lentamente gua
destilada ao resduo de caju e homogeneizando-se. Aps homogeneizao o meio foi
distribudo nos Erlenmeyer, que foram tampados com tampo de algodo envolvido com gaze
e levados a autoclave; 0,5 atm por 5 minutos.
A umidade inicial do meio foi ajustada atravs da Equao (7) para o resduo do
pednculo de caju sem lavar e Equao (8) para o resduo do pednculo de caju lavado, que
d o volume de gua a ser adicionado ao meio, tendo por base 10 gramas de resduo seco e
apresentando um coeficiente de correlao de 0,96 ambas. Estas equaes foram obtidas a
partir do estudo da atividade de gua e umidade relativa de equilbrio frente adio de gua
ao resduo detalhado no item 4.1.2.

Volume gua adicionado - sem lavar (mL) = 0,3779 x (umidade desejada) 10,388 (7)
Volume gua adicionado lavado (mL) = 0,3528 x (umidade desejada) 8,1578 (8)

Ao meio de fermentao frio foram inoculados 10
7
esporos/grama de meio e incubados
a 30C em estufa, sendo ento processo esttico. As amostras foram retiradas em perodos de
tempo regular durante o processo para realizao das anlises de pH, umidade, acares
redutores (AR) e protena, segundo metodologias descritas nos itens: 4.1.1.3, 4.1.1.4, 4.1.1.8 e
4.1.1.8, respectivamente. A extrao do complexo enzimtico tambm era realizada e nela
media-se a atividade da poligalacturonase e percentual de reduo de viscosidade. Para cada
amostragem um Erlenmeyer era retirado da estufa, estando todos nas mesmas condies
iniciais do processo.

4.7 Extrao da enzima
A extrao do complexo enzimtico foi realizada adicionando-se 2,5 mL/grama de
meio fermentado de tampo acetato 200mM (pH 4,5) em temperatura ambiente (30C). Aps
adio do tampo as amostras foram homogeneizadas com auxlio de basto de vidro e
deixadas por 1 hora em banho-maria com controle automtico de temperatura a 30C, depois
foram filtradas, usando papel de filtro qualitativo e funil de vidro. O filtrado foi estocado em
tubos de polietileno com tampa e armazenados a temperatura de -18C.


72
4.8 - Atividade da poligalacturonase
A atividade da poligalacturonase do extrato enzimtico foi baseada no aumento dos
grupos redutores formados por ao da enzima. Em tubos de ensaio contendo 4mL de soluo
de cido poligalacturnico 0,25% (p/v) preparada em tampo acetato 200mM (pH 4,5),
previamente aclimatado a 35C, adicionou-se 0,25mL de extrato enzimtico, prosseguindo a
reao enzimtica por 30 minutos a 35C. Terminada a reao, transferiu-se 0,25mL da
mistura reacional para tubos de ensaio contendo 1mL do reagente de DNS, aps
homogeneizao adicionava-se 0,75mL de gua destilada e seguia-se o procedimento para
anlise dos grupos redutores descrita no item 4.1.1.8.
Os ensaios foram feitos em duplicatas, nos ensaios em branco (tambm em duplicata),
a enzima foi adicionada ao cido poligalacturnico e imediatamente transferida para os tubos
contendo o DNS. A curva padro foi feita com soluo de cido galacturnico na faixa de 0 a
1 mg/mL.
Uma unidade de atividade corresponde quantidade de enzima que libera 1 mol de
cido galacturnico por minuto de reao, nas condies de reao. Assim, o clculo da
atividade feito de acordo com a Equao 9. Os resultados foram expressos em unidades de
atividade por grama de meio fermentado (U/g).

( )
30 16 , 212
5 , 2 4 17 f Abs Abs
ATIV
branco amostra

=
(9)
Onde:
ATIV Atividade da poligalacturonase (U/g)
Abs
amostra
Absorbncia da amostra
Abs
branco
Absorbncia do branco
f Fator de converso da curva padro de cido galacturnico (mg/L)
17 Diluio da enzima no meio reacional
4 Diluio dos grupos redutores no reagente DNS
212,16 Peso molecular do cido galacturnico (g/mol)
30 Tempo de reao (min.)
2,5 Razo solvente/meio usado na extrao (mL/g)



73

4.9 Percentual de reduo de viscosidade
A atividade do complexo pectinoltico foi tambm dosada atravs do mtodo
viscosimtrico, conforme procedimento adotado por Castilho (1997), sendo expressa na forma
de % de reduo de viscosidade.
Em tubos de ensaio contendo 10 mL de pectina ctrica 1% (p/v) preparada em tampo
acetato de sdio 200 mM (pH 4,5) adicionou-se 1 mL do extrato enzimtico prosseguindo a
reao por 10 minutos a 35C. Completado este tempo, ainda mesma temperatura, a
viscosidade da mistura reacional foi medida usando viscosmetro de bola da marca Schott,
modelo 52013.
Foram realizados ensaios em branco, nos quais 1 mL de tampo acetato 200 mM (pH
4,5) foi adicionado soluo de pectina, ao invs do extrato enzimtico. Todas as anlises
foram realizadas em duplicata. Com os valores da viscosidade do ensaio em branco e daquele
com extrato enzimtico, calculava-se a reduo percentual de viscosidade devida ao
enzimtica.

4.10 - Influncia das condies de extrao da enzima
Para verificar a influncia das condies de extrao foram realizados experimentos em
que se variou o tempo de contato do meio fermentado com o tampo e a razo volume de
tampo/gramas de meio fermentado, de acordo com a matriz do planejamento experimental
mostrada na Tabela 4.4. Nestas condies foram testados dois sistemas um agitado e outro
sem agitao. A agitao foi feita colocando-se o Erlenmeyer em mesa agitada com rotao
de 200 rpm.
Neste caso, usou-se o meio fermentado nas seguintes condies: resduo do pednculo
de caju lavado, umidade inicial de 40% e tempo de fermentao de 16 horas. As fermentaes
foram realizadas em Erlenmeyer de 250 mL contendo 20 gramas do meio. Para garantir a
uniformidade das amostragens ao resduo do pednculo de caju lavado foi adicionada gua
destilada, de modo a atingir a umidade de 40%, conforme Equao (8), em becker de
polipropileno. Aps homogeneizao o meio foi distribudo nos Erlenmeyer e autoclavados a
0,5 atm por 5 minutos. Depois de frio o meio foi inoculado com os esporos do Aspergillus na
concentrao de 10
7
esporos por grama de meio.


74
Transcorrida s dezesseis horas de fermentao o extrato enzimtico foi extrado
conforme matriz do planejamento, filtrado e congelado para posterior anlise da atividade
enzimtica.
A atividade da poligalacturonase foi quantificada de acordo com o item 4.8.

Tabela 4.4. Matriz do planejamento experimental fatorial 2
2
com trs repeties no ponto
central e pontos axiais.

Experimentos
Tempo de
contato (min)
Razo volume tampo/
massa de meio(mL/g)
1 -1 (30) -1 (2,5)
2 +1 (90) -1 (2,5)
3 -1 (30) +1 (7,5)
4 +1 (90) +1 (7,5)
5 0 (60) 0 (5)
6 0 (60) 0 (5)
7 0 (60) 0 (5)
8 + (100) 0 (5)
9 - (20) 0 (5)
10 0 (60) + (8,5)
11 0 (60) - (1,5)

Captulo 5
Resultados e
Discusso
Cap t ul o 5 Resul t ados e Di scusso


76
5. Resultados e Discusso

O captulo cinco apresenta os resultados obtidos nos experimentos e a discusso sobre
os mesmos. Primeiro so apresentados os resultados da caracterizao fsico-qumica do
resduo do pednculo de caju, seguidos dos relativos influncia da umidade inicial do meio
e presena do sulfato de amnia e fosfato de potssio monobsico no meio, sobre a produo
de pectinases em processo de fermentao em estado slido. No final do captulo
apresentado um estudo sobre as condies de extrao da poligalacturonase.

5.1 Caracterizao dos resduos secos
A caracterizao dos resduos secos do pednculo de caju sem lavar e lavado, utilizados
como meio na produo de pectinases por fermentao em estado slido esto apresentadas na
Tabela 5.1, os dados esto em base mida. Como se observa, os resduos apresentam variao
na sua composio de acordo com o tratamento dado antes da secagem.

Tabela 5.1. Caracterizao dos resduos seco do pednculo de caju

Parmetros Analisados Unidade Sem Lavar Lavado
Umidade % 7,70 1,57 10,20 0,53
Cinzas % 2,05 0,02 0,86 0,02
Protena % 6,83 0,40 12,94 1,42
Slidos solveis Brix 46,40 3,5 0,00 0,00
AR % 35,45 0,73 0,21 0,01
Pectinas % 7,31 0,20 13,41 0,49
pH - 4,15 0,01 4,51 0,01
Densidade aparente g/mL 0,6 0,05 0,56 0,00

A produo de pectinase por Aspergillus niger induzida pela presena de pectina no
meio de cultura. Assim, a caracterizao dos resduos secos do pednculo de caju visa
conhecer a composio dos resduos com respeito ao contedo de nutrientes, que so
importantes na sntese da enzima como percentual de pectina, acares redutores e protena,
bem como os parmetros que afetam o processo como pH e a densidade aparente.
Os valores de pH esto de acordo com os determinados por Campos (2003) para o
pednculo fresco, (4,5). O pH uma varivel importante em qualquer processo biolgico,
havendo valores de pH mnimo, timo e mximo para o desenvolvimento de cada
microrganismo. Geralmente os fungos tem como condio favorvel de desenvolvimento pH


77
baixo (4,5 5,0) e as bactrias pH prximos neutralidade (6,5 7,0). Na faixa de pH
encontrada, 4,15 para o resduo do pednculo de caju sem lavar e 4,51 para o lavado,
associado ao baixo teor de umidade, os resduos foram armazenados em temperatura ambiente
sem problemas de contaminao.
Para o processo de fermentao em estado slido o pH do meio um parmetro
importante mais de difcil controle. A padronizao do pH do substrato pode se dar durante a
sua preparao. H componentes com capacidade tamponante, os quais podem ser
adicionados ao meio de modo a evitar flutuaes drsticas de pH. A adio pode ser efetuada
desde que a substncia no exera nenhum papel deletrio sobre a atividade biolgica
(Pandey, Soccol, Leon, 2001). Os valores de pH observados nos resduos so considerados
ideais como relatado por Malvessi & Silveira (2004) na produo da poligalacturonase. Eles
estudaram meios com pH inicial variando 2 a 7 e observaram mxima atividade da enzima
com pH inicial do meio de 4, usando o Aspergillus oryzae.
A maior parte das pectinases comerciais so enzimas indutveis e substratos com alto
teor de pectina estimulam a produo da enzima. Os resduos aqui estudados apresentam alto
teor de pectina sendo de 7% para o resduo do pednculo de caju sem lavar e de 13% para o
lavado.
Com relao ao teor protico, os valores encontrados foram de 6,83 para o resduo do
pednculo de caju sem lavar e de 12,94 para o resduo do pednculo de caju lavado. Assim
como o percentual de pectina para protena percebe-se um aumento dos valores percentuais
sendo no resduo lavado superior ao resduo sem lavar, isto se deve ao fato de como durante
as lavagens houve arraste dos componentes solveis, proporcionalmente houve aumento dos
componentes insolveis em gua.
Apresentam valores de slidos solveis tambm diferentes sendo para o resduo sem
lavar de 46,4Brix e zero para o lavado; estes valores esto de acordo com os valores de
acares redutores, pois para o resduo do pednculo de caju sem lavar foi de 35,5% e de
0,21% para o lavado. Esta diferena est associada ao fato que as lavagens feitas no resduo
do pednculo de caju retiraram praticamente todos os acares solveis.
A densidade aparente (0,6 g/mL) revela que os resduos tendem a no se compactarem
completamente, fator propcio ao desenvolvimento de microrganismo, visto que os espaos
vazios criados pelo resduo geram espaos suficientes para a circulao de ar. O que muito
positivo, tendo em vista que o material ser utilizado como substrato para o processo de
fermentao em estado slido.


78
A estrutura do substrato, sobretudo, tamanho e porosidade, determinam a rea
superficial acessvel ao microorganismo e enzima (Correia, 2004). Partculas de tamanho
reduzido oferecem maior rea superficial ao ataque microbiano, mas ao mesmo tempo, tende
a compactar-se facilmente. Neste caso, a respirao e aerao do sistema so dificultadas.
Partculas maiores, por sua vez, promovem maior espao interpartculas, embora possua rea
superficial menor. Para reduzir e uniformizar as partculas, aps secagem os resduos foram
modos.
Como pode ser observado na Figura 5.1 os resduos secos apresentam granulometria
cerca de 70% de partculas com Tyler de 20-35 o que corresponde a dimenses entre 0,42-
0,84mm. Correia (2004) estudando o enriquecimento protico do bagao de abacaxi trabalhou
com partculas de tamanho maior que 0,42 mm. Hennies (1996) trabalhando com bagao de
laranja para produo de pectinases usou partculas com tamanho igual ou inferior a 0,71 mm.

0
10
20
30
40
50
20 (0,840 mm) 24 (0,710 mm) 35 (0,425 mm) 48 (0,297 mm) Fundo (<0,297
mm)
Tyler
%

p
e
s
o

r
e
t
i
d
o
Sem Lavar
Lavado

Figura 5.1. Distribuio granulomtrica dos resduos do pednculo de caju seco.

5.1.2 - Relao umidade e Aa dos resduos frente adio de gua
O nvel de umidade do substrato um dos fatores que mais influenciam o processo e
varia de acordo com a natureza do substrato, tipo de produto que se deseja sintetizar e
necessidade do microrganismo. Nveis de umidade muito altos resultam numa diminuio da
porosidade, baixa difuso de oxignio, aumento no risco de contaminao, reduo no volume
de gs e reduo de troca gasosa. Por outro lado, baixos nveis de umidade levam a um


79
crescimento baixo em relao ao timo, baixo grau de utilizao do substrato e um
crescimento na tenso da gua.
A atividade de gua est relacionada quantidade de gua disponvel para o
desenvolvimento do microrganismo (gua livre). O teor de gua do meio (umidade) revela a
concentrao de gua existente em determinado material, sendo expresso normalmente em
termos percentuais. A Figura 5.2 apresenta os valores de atividade de gua e umidade
correspondente ao valor de gua adicionada aos resduos secos do pednculo de caju.
Como pode ser visto pela Figura 5.2 B a relao entre o volume de gua adicionado e a
umidade no linear para os valores estudados, que vo de 10-70% de umidade. Com o
objetivo de obter uma equao linear entre o volume de gua a ser adicionado no resduo para
obter uma umidade inicial definida, foram construdas curvas para os valores de umidade
entre 30-70%, Figura 5.3.

0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 2 4 6 8 10 12 14
A
a
Vol. gua adicionado (mL/10 g)
lavado
sem lavar
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 2 4 6 8 10 12 14
U
m
i
d
a
d
e
(
%
)
Vol. gua adicionado (mL/10 g)
lavado
sem lavar

Figura 5.2. Relao da Aa (A) e umidade (B) para diferentes volumes de gua destilada
adicionados aos resduos.

A Figura 5.3 apresenta as equaes para o clculo do volume de gua a ser adicionado a
cada resduo. Os modelos lineares apresentam coeficientes de correlao de 0,96. Com o
auxlio destas curvas foi possvel ajustar o valor de umidade inicial do meio para os dois
resduos, pela adio de um volume definido de gua.

A B


80
y = 0,377x - 10,38
R = 0,963
y = 0,352x - 8,157
R = 0,964
0
4
8
12
16
20
20 30 40 50 60 70
V
o
l
.

g
u
a

a
d
i
c
i
o
n
a
d
o

(
m
L
/
1
0
g
)

Umidade (%)
Sem lavar
Lavado

Figura 5.3. Relao linear entre % de Umidade e Volume de gua destilada adicionada aos
resduos.

A literatura cita diversos teores iniciais de umidade para a produo de pectinases por
Aspergillus niger em fermentao semi-slida. Couri & Farias (1995) empregaram um meio a
base de farelo de milho e soja, contendo 37,5% de umidade. Castilho (1997) usando farelo de
trigo e soja realizou testes para teores iniciais de umidade de 25%, 40%, 55% e 70%; com Aa
correspondente a 0,90; 0,95; 0,98 e 0,99; respectivamente, verificou que teores entre 40 e 55%
so os mais propcios sntese de pectinases pelo fungo. Antier et al (1993), para selecionar
linhagens mutantes de A. niger para produo de pectinases por fermentao semi-slida,
utilizaram meios com Aa = 0,96. Assim, no presente trabalho, a umidade inicial do meio
variou de 40%, 50% e 60% o que representa valores de atividade de gua no resduo sem
lavar de 0,90; 0,92 e 0,94 e para o resduo lavado de 0,95; 0,96 e 0,97, respectivamente.

5.2 Variveis de processo estudadas
As variveis de processo estudadas foram: umidade inicial do meio, suplementao com
uma fonte de nitrognio (sulfato de amnia) e suplementao com uma fonte de fsforo
(fosfato de potssio monobsico), para os resduos do pednculo de caju sem lavar e o resduo


81
do pednculo de caju lavado, de acordo com a matriz do planejamento mostrado na Tabela
4.3 (Captulo 4).
Durante o processo fementativo (72 horas) foram analisadas, em intervalos de
aproximadamente 12 horas, a umidade do meio, o pH, acares redutores, a atividade da
poligalacturonase e o percentual de reduo de viscosidade. Os resultados para cada resduo
estudado, esto mostrados a seguir.

5.2.1 - Pednculo de caju sem lavar
O primeiro ensaio teve como condies iniciais umidade de 40%, e no houve adio de
fontes de nitrognio (N) e fsforo (P). A Figura 5.4 mostra a variao dos parmetros
analisados ao longo de 72 horas de fermentao. A umidade se mantm praticamente
constante durante o processo. O pH inicial 4,01 e cai lentamente durante o processo, s 47
horas de processo o pH 2,89 mantendo-se nesta faixa ate s 72 horas de fermentao.

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 8 23 32 47 56 72
Tempo (h)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
,

p
H
,

P
r
o
t
e
n
a

(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%

R
e
d
.

V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
,

A
R

(
%
)

pH
PG
Prot .
U
AR
%RV

Figura 5.4. Ensaio 1, 40% de umidade, 0% de N e 0% de P.

A concentrao de acares redutores no incio do processo de 27%, estes acares
so consumidos de modo mais acentuado at 23 horas do processo, chegando ao valor de
13,9%. Neste instante surge o primeiro pico do percentual de reduo de viscosidade,
indicando a produo de pectinases pelo microrganismo. A atividade da poligalacturonase
ainda zero neste instante, ou seja, h formao de outras enzimas do grupo. No intervalo 23
a 47 horas de cultivo o consumo de acares lento variando de 13,9 para 11,9. possvel


82
que esteja ocorrendo o consumo da pectina como fonte de carbono resultando na produo da
poligalacturonase (PG) a partir de 23 horas de processo.
A maior produo de PG acontece s 47 horas de cultivo atingindo, nas condies
estudadas, 3 U/g. Este valor se mantm at 56 horas do processo, quando h novamente um
maior consumo de acares. Botella et al. (2006) estudando a produo da poligalacturonase
por Aspergillus awamori com bagao de uva observaram, com a adio de 6% de glicose,
aumento de atividade, mas quando utilizou 8% de glicose houve diminuio da atividade
enzimtica. Concluiu que a adio de glicose at certa concentrao exerce efeito positivo na
sntese da enzima, mas quando em excesso tem efeito repressivo.
No incio tem-se uma concentrao de protena de 5,6%, este valor aumenta atingindo
um pico em 23 horas de cultivo (8,6%) coincidindo com o maior pico de percentual de
reduo de viscosidade. Aps este perodo h uma leve queda (6,8%) justamente na fase de
menor consumo de acares. Considerando-se o teor de protena como uma indicao da
concentrao celular, pode-se dizer que a queda de acares decorrente do crescimento
celular, mas quando a concentrao de acares limitante o microrganismo reduz sua
velocidade de crescimento e comea a produo de PG.
Este fato tambm foi citado por Fawole & Odunfa (2003), alta concentrao de glicose
presente no meio satisfaz as exigncias de crescimento do organismo sendo desnecessria ou
mnima a quebra da molcula de pectina, resultando assim em baixa atividade de enzimas
pectinolticas. Porm, a baixas concentraes de glicose, surge a necessidade da quebra da
molcula de pectina de modo que possa ser utilizada levando a alta atividade pectinoltica.
No segundo ensaio adotou-se umidade do meio em 60%, sem adio de fontes de
nitrognio e fsforo. A Figura 5.5 apresenta a cintica do processo para este ensaio.
Nota-se que com 60% de umidade praticamente no houve formao de PG durante o
processo. O maior pico do percentual de reduo de viscosidade ocorreu em 23 horas de
cultivo (25%), em seguida mantendo valores em torno 16% at o fim do processo. Neste
instante a concentrao de acares redutores era de 9%. Fazendo uma associao do
consumo de acares e da produo de protena com o crescimento celular, pode-se observar
uma fase lag durante as primeiras oito horas, onde foi baixo o consumo de acares e o teor
de protena se manteve constante (2,8-2,9%). Entre 8 e 32 horas o crescimento exponencial,
com consumo acelerado de acares e produo de protena. Das 32-47 horas pode-se
observar uma fase estacionria, sem variaes de acares redutores ou protena. Aps 47


83
horas de processo ocorre a fase de declnio, onde o teor de protena cai (10,1-4,5%) e o
percentual de acares redutores se mantm em torno de 1%.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 8 23 32 47 56 71
Tempo (h)
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t
i
v
i
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n
a

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)
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20
30
40
50
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80
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m
i
d
a
d
e

(
%
)
,

%

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e
d
.

V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
,

pH
PG
AR
Prot .
U
%RV


O pH do meio tem leve queda at 32 horas de processo depois comea a subir (2,6-4,6).
Botella et al. (2006) observaram o mesmo fato associando o decrscimo do pH a produo de
cidos orgnicos pelo microrganismo. Quando a concentrao de acares mnima, o pH
aumenta, provavelmente pela assimilao dos cidos orgnicos pelos microrganismos. Neste
momento a umidade tambm se eleva (58,9-70,5%).
O ensaio 3 tem como condio inicial umidade de 40%, com adio de 1% de
nitrognio e sem adio da fonte de fsforo. Difere do ensaio 1 pela adio de 1% de sulfato
de amnia como fonte de nitrognio. A Figura 5.6 mostra a cintica do processo nesta
condio. A umidade do meio se mantm praticamente constante durante as 71 horas de
processo.
A concentrao de acares redutores no incio do cultivo 26%, caindo rapidamente
nas primeiras 7 horas, chegando a 19,1% e depois passa a cair mais lentamente entre 7 e 22
horas de processo (19,1-18,8%). s 22 horas de cultivo observa-se o incio da produo de
pectinases, apresentando 72,2% de reduo de viscosidade com 4,9 U/g de PG. No intervalo
entre 22 a 30 horas quase no h consumo de acares redutores (18,8-18,1%) indicando um
possvel consumo de pectina para a produo de pectinases por induo, sendo o mximo de
atividade observado s 30 horas de processo, 16U/g de PG e 82,3% de reduo de


84
viscosidade. s 46 horas de processo a concentrao de acares redutores caiu bastante,
chegando a 3,7%. Neste instante v-se um aumento da concentrao de protena (10,9-17,2%)
indicando um crescimento celular, mas com queda da atividade enzimtica, ou seja, o
microrganismo consome acares redutores preferencial para crescimento.
O pH do meio cai lentamente at 30 horas de processo (3,93-3,33), atingindo 2,76 s 46
horas de cultivo.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
0 7 22 30 46 55 71
Tempo (h)
A
t
i
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i
d
a
d
e

P
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(
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/
g
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30
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m
i
d
a
d
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d
.

V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
pH
PG
AR
Prot .
%RV
U


Comparando o ensaio 3 com o ensaio 1 pode-se observar que a adio da fonte de
nitrognio traz benefcios para produo de PG passando de 3 U/g com 47 horas de cultivo
para 16 U/g com 30 horas de cultivo. Este fato pode estar associado a um maior equilbrio da
relao C/N do meio onde no experimento 1 apresentava 27% de acares redutores e 6% de
protenas, j no experimento 2 havia 26% de acares redutores e 9% de protena no incio do
processo.
Quando adotou-se 60% de umidade no houve produo significativa de PG o que pode
ser observado nas Figuras 5.7, 5.8 e 5.9 com maiores picos de produo de PG 0,41; 1,15 e
0,54 U/g, representando respectivamente as cinticas dos ensaios 4, 6 e 8.
O ensaio 4 foi conduzido com 60% de umidade inicial, 1% de sulfato de amnia sem
adio da fonte de fsforo. A cintica deste cultivo est apresentada na Figura 5.7. V-se que
o consumo de acares redutores alto at as 22 horas de cultivo (18,6-3,0%), com queda do
pH (3,92-2,76). O percentual de reduo de viscosidade cresce com o tempo, atingindo o pico


85
s 46 horas de cultivo (38%), indicando haver produo de outras enzimas do complexo
pectinoltico.

0
2
4
6
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10
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14
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0 8 22 30 46 56 71
Tempo (h)
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,

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e

(
%
)
pH
PG
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Prot .
U
%RV

Figura 5.7. Ensaio 4, 40% de umidade, 0% de N e 0,6% de P.

O ensaio 6 (Figura 5.8) foi conduzido com umidade inicial de 60%, adio de 0,6% de
fosfato de potssio monobsico e sem adio da fonte de nitrognio. J o ensaio 8 (Figura 5.9)
foi conduzido com mesma umidade mas com adio de 1% de N e 0,6% de P.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 7 21 30 46 54 71
Tempo (h)
A
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,

U
m
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d
a
d
e

(
%
) pH
PG
AR
Prot .
U
%RV




86
Nestes ensaios pode-se verificar o crescimento exuberante do microrganismo com 21
horas de cultivo o que mostra condies ideais de crescimento, pois com alta umidade os
acares se encontram dissolvidos no meio, facilitando o transporte do interior para o exterior
da partcula do slido, assim o microrganismo se desenvolve sem necessidade de utilizao de
outra fonte de carbono, no havendo necessidade de produo de enzimas pectinolticas.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 18 21 32 48 55 71
Tempo (h)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
,

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,

A
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%
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,

P
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n
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)
0
10
20
30
40
50
60
70
%
R
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d
.
V
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s
c
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s
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d
a
d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
PG
AR
U
%RV
Prot .


No ensaio 5 adotou-se umidade inicial do meio de 40%, sem adio da fonte de
nitrognio e com 0,6% de fosfato de potssio monobsico. A Figura 5.10 apresenta a cintica
do processo nestas condies. Observa-se que com 22 horas de processo obtm-se o mximo
de atividade de PG de 11,58 U/g com 70% de reduo de viscosidade.
A adio da fonte de fsforo tambm apresenta benefcios para o processo com 40% de
umidade. Comparando com a condio onde houve adio da fonte de N, apresentada na
Figura 5.3, v-se que o maior pico de PG acontece com 22 horas de cultivo (11,6 U/g)
enquanto que o com adio de N ocorreu s 30 horas (16U/g) de cultivo. Apresentando,
entretanto, a mesma produtividade 0,53 U/g.h.
Comparando os ensaios 5 e 7 observa-se que apresentam cinticas de cultivo
semelhantes, ou seja, quando as duas fontes (N e P) esto presentes no meio, ensaio 7, a
cintica de cultivo e a produo de PG e quase igual ao cultivo onde somente a fonte de
fsforo est presente. Neste caso (ensaio 7) a fermentao aconteceu com umidade inicial de


87
40%, com 1% de N e 0,6% de P. Aqui tambm o maior pico de PG ocorreu com 22 horas de
processo sendo de 11,85 U/g, com percentual de reduo de viscosidade de 71%.
Para os ensaios 3, 5, e 7, todos com umidade de 40%; os maiores picos de percentual de
reduo de viscosidade foram com 30 horas de processo, sendo de 82%, 74% e 73%
respectivamente. Ento, para a atividade do complexo pectinoltico como um todo, a adio
de 1% de nitrognio com 40% de umidade a melhor condio e os picos de percentual de
reduo de viscosidade so atingidos s 30 horas de processo.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
0 8 22 31 48 55 72
Tempo (h)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
,

A
R
(
%
)
,

p
H
,

P
r
o
t
e
n
a

(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%
R
e
d
.
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
PG
AR
Prot .
U
%RV


0
5
10
15
20
25
30
35
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
,

A
R
(
%
)
,

p
H
,

P
r
o
t
e
n
a

(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%
R
e
d
.
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
PG
AR
Prot .
U
%RV




88
Tendo como uma das finalidades verificar a reprodutibilidade dos dados, foram
realizados ensaios em triplicata na condio 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P. As
Figuras 5.12 e 5.13 apresentam as cinticas do processo para estes ensaios. Os parmetros de
processo: umidade, pH, acares redutores e o teor de protena, apresentam desvios pequenos
sendo 1,4; 0,2; 1,1 e 1,0 respectivamente, Figura 5.12.

0
5
10
15
20
25
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
A
R

(
%
)
,

P
r
o
t
e
n
a

(
%
)
,

p
H
0
10
20
30
40
50
60
70
U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
AR
U
Prot.

Figura 5.12. Ponto central, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P.

Para a atividade enzimtica os desvios so apresentados na Figura 5.13. No incio os
dados so bem reproduzidos, apresentando desvio zero, isso ocorre porque ainda no
comeou a produo de enzimas. s 21 horas de processo tem-se a maior produo de
enzima, apresentado um desvio padro grande, mas que se repete nas duas anlises de
enzimas, havendo variao destes desvios para cada hora de fermentao analisada.

0
1
2
3
4
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
%
R
e
d
.

V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
PG
%RV

Figura 5.13. Ponto central, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P.


89
5.2.1.1 Avaliao do comportamento do processo atravs da metodologia de superfcie
de resposta para o resduo sem lavar
Utilizando a ferramenta do planejamento experimental e anlise de superfcie de
resposta para o resduo sem lavar possvel investigar a influncia das variveis em um
processo e a forma de interao entre estas variveis, bem como obter o valor das variveis
que otimizem os resultados.
As Tabelas 5.2 e 5.3 mostram respectivamente os resultados experimentais da atividade
poligalacturonsica e do percentual de reduo de viscosidade quando se faz variar os fatores:
percentual inicial de umidade (U), adio de uma fonte de nitrognio (N) e adio de uma
fonte de fsforo (P). Os resultados esto apresentados para cada istante do processo analisado.

Tabela 5.2. Resultado experimental em termos de atividade poligalacturonsica para o
resduo do pednculo de caju sem lavar

Atividade PG por horas de fermentao (U/g)
Exp. 7 22 30 46 54 70
1 0,0 0,0 1,7 3,0 3,1 2,1
2
0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,5
3
1,7 4,9 16,0 4,7 1,8 0,1
4
0,0 0,4 0,2 0,0 0,0 0,0
5
1,8 11,6 3,2 1,3 3,5 1,8
6
0,0 0,0 0,0 1,2 0,9 0,0
7
0,0 11,9 0,0 1,7 0,0 0,3
8
0,0 0,0 0,5 0,2 0,1 0,3
9
0,0 2,6 1,1 1,3 0,3 0,2
10
0,0 3,7 1,2 0,0 0,3 0,0
11
0,0 3,2 0,9 0,8 0,6 0,3

Com os resultados experimentais obtidos para cada instante de fermentao, a partir do
planejamento fatorial, possvel ajustar os dados para obter um modelo de primeira ordem
que relacione a atividade enzimtica com os parmetros estudados. bom lembrar que os
modelos obtidos so empricos sendo aplicveis apenas na regio estudada. Os modelos
obtidos para a atividade da poligalacturonase (PG) esto apresentados na Tabela 5.4, junto
com os coeficientes de determinao (R
2
) e os valores de F. Os parmetros em negrito so os
estatisticamente significativos ao nvel de 95% de confiana.


90
Tabela 5.3. Resultado experimental em termos do percentual de reduo de viscosidade
para o resduo do pednculo de caju sem lavar
% Reduo viscosidade por horas de fermentao
Exp. 7 22 30 46 54 70
1
0 74 76 61 46 37
2
0 26 21 17 18 18
3
0 72 82 69 43 31
4
11 19 28 38 15 40
5
1 70 74 63 52 38
6
0 23 20 9 6 4
7
0 61 73 59 43 21
8
19 16 15 22 8 54
9
0 46 38 30 19 13
10
0 37 37 27 23 11
11
0 32 37 38 24 36

Tabela 5.4. Modelo de primeira ordem obtido para a atividade poligalacturonsica (PG) por
hora de fermentao para o resduo do pednculo de caju sem lavar
Modelo Atividade da Poligalacturonase R
2
(%) F
PG (7h) = 0,32-0,44U-0,01N+0,01P+0,01UN-0,01UP-0,44NP+0,44UNP 91,7 0,5
PG (22h) = 3,48-3,5U+0,7N+2,28P-0,6UN-2,38UP-0,63NP+0,53UNP 99,5 9,3
PG (30h) = 2,25-2,52U+1,48N-1,77P-1,30UN+1,85UP-2,15NP+2,23UNP 97,3 1,8
PG (46h) = 1,29-1,16U+0,14N-0,41P-0,39UN+0,76UP-0,29NP+0,04UNP 89,9 0,4
PG (54h) = 0,90-0,90U-0,72N-0,07P+0,48UN+0,28UP-0,35NP+0,20UNP 84,3 0,3
PG (70h) = 0,53-0,44U-0,45N-0,03P+0,41UN-0,01UP+0,15NP+0,04UNP 90,9 5,3

O coeficiente de determinao ou explicao R
2
quantifica a qualidade do ajuste, pois
fornece uma medida da proporo da variao explicada pela equao de regresso em
relao variao total das respostas. Varia de 0 a 100% (Rodrigues & Iemma, 2005).
O teste F apresenta a razo entre o F calculado e o F tabelado. Sempre que esta relao
for maior que 1 a regresso estatisticamente significativa havendo relao entre as variveis
independentes e dependentes. Para que uma regresso seja no apenas estatisticamente


91
significativa, mas tambm til para fins preditivos, o valor da razo deve ser no mnimo maior
que quatro (Barros Neto et al., 1996).
Da mesma forma, para o percentual de reduo de viscosidade foram obtidos os
modelos apresentados na Tabela 5.5.

Tabela 5.5. Modelo de primeira ordem obtido para percentual de reduo de viscosidade (RV)
por hora de fermentao para o resduo do pednculo de caju sem lavar
Modelo Percentual de Reduo de Viscosidade R
2
F
RV (7h) = 2,82+3,63U+3,63N+1,13P+3,88UN+0,88UP+0,88NP+1,13UNP 91,7 0,5
RV (22h) = 43,27-24,13U-3,13N-2,63P-0,38UN+1,13UP-0,88NP+0,88UNP 96,0 1,2
RV (30h) = 45,55-27,63U+0,88N-3,13P-0,38UN-0,38UP-2,38NP-0,63UNP 95,7 1,1
RV (46h) = 39,36-20,75U+4,75N-4,00P+3,75UN-2,00UP-2,50NP+0,50UNP 92,7 0,6
RV (54h) = 27,00-17,13U-1,63N-1,63P+1,38UN-3,13UP-0,13NP+1,38UNP 95,5 1,0
RV (70h) = 27,55-1,38U+6,13N-1,13P+11,88UN+1,13UP+2,13NP+4,88UNP 73,1 0,9

De acordo com os dados experimentais os maiores valores de atividade enzimtica
foram obtidos s 30 horas de fermentao. Assim, ser apresentada a seguir a anlise
estatstica detalhada para 30 horas de fermentao.
O modelo obtido para a atividade da poligalacturonase (PG) apresentado pela Equao
(10) e para o percentual de reduo de viscosidade na Equao (11). Os parmetros em
negrito so os estatisticamente significativos ao nvel de 95% de confiana.

PG (30h) = 2,25-2,52U+1,48N-1,77P-1,30UN+1,85UP-2,15NP+2,23UNP (10)

RV (30h) = 45,55-27,63U+0,88N-3,13P-0,38UN-0,38UP-2,38NP-0,63UNP (11)

Neste caso o modelo apresentado na Equao (10) tem 97,3% das variaes obtidas
explicadas pelo modelo e com um valor de F de 1,8; indicando que o modelo
estatisticamente significativo com 95% de confiana.
De acordo com o Diagrama de Pareto apresentado na Figura 5.14, para o modelo de
atividade da poligalacturonase, a maioria dos efeitos so estatisticamente significativos ou


92
esto bem prximos de 95% de confiana, neste caso a retirada de algum parmetro no
melhora a qualidade do ajuste, ento se estudou o modelo com todos os parmetros. A Tabela
5.6 apresenta a anlise de varincia completa.

-2,63986
2,994882
-3,59842
3,750576
-4,36426
4,516413
-5,11995
p=,05
Atividade da poligalacturonase (30 horas)
1by2
(2)N
(3)P
1by3
2by3
1*2*3
(1)U

Figura 5.14. Diagrama de Pareto para atividade da poligalacturonase com 30 horas de
fermentao (resduo sem lavar).

Tabela 5.6. Anlise de varincia para atividade da poligalacturonase com 30 horas de
Fonte variao SQ GL MQ Teste F
Regresso 211,12 7 30,16 15,50
Resduo 5,83 3 1,94
F.ajuste 5,79 1
Erro puro 0,04 2
Total 216,95 10
%R 0,97
F tabelado= 8,89 F5%= 1,75

Para o percentual de reduo de viscosidade o Diagrama de Pareto (Figura 5.15) mostra
que a nica varivel estatisticamente significativa a umidade. Neste caso a retirada de alguns
efeitos de menor valor contribui para um melhor ajuste do modelo.
O modelo com a retirada de algums coeficientes :



93
RV (30h) = 45,55-27,63U+0,88N-3,13P-2,38NP (12)

A Tabela 5.7 apresenta a anlise de varincia para o percentual de reduo de
viscosidade com 30 horas de fermentao. Com o novo ajuste o valor de F passa de 1,1 para
7,26 sendo agora o modelo no s estatisticamente significativo, mas tambm preditivo, sem
haver alteraes no valor de R
2
, que era de 95,7% fica 95,6%.

-,110014
-,110014
-,183357
,2567004
-,696758
-,916787
-8,1044
p=,05
1by3
1by2
1*2*3
(2)N
2by3
(3)P
(1)U

Figura 5.15. Diagrama de Pareto para o percentual de reduo de viscosidade.

Tabela 5.7. Anlise de varincia para percentual de reduo de viscosidade com 30 horas de
Regresso 6234,50 4 1558,62 32,90
Resduo 284,23 6 47,37
F.ajuste 283,56 4
Erro puro 0,67 2
Total 6518,73 10
%R 0,96
F tabelado = 4,53 F5%= 7,26

Como observado nas Figuras 5.14 e 5.15 a umidade o efeito de maior importncia
para o processo, estando com valor negativo, ento, o maior valor de atividade enzimtica
atingido para os menores valores de umidade.
Com base nesta informao as superfcies de resposta foram construdas mantendo-se o
valor de umidade fixa em 40% (menor umidade), variando os valores das fontes de nitrognio


94
e fsforo. A superfcie de resposta a descrio grfica do modelo, o que facilita a
interpretao dos resultados.
A Figura 5.16 apresenta a superfcie construda para a atividade da poligalacturonase.
Nela observa-se que a mxima produo da poligalacturonase, 15,55 U/g, ocorre para valores
de nitrognio de 1% e de fsforo 0%. Este valor est prximo do valor experimental obtido
nas mesmas condies, pois experimentalmente a atividade obtida nestas condies foi de 16
U/g. Como discutido anteriormente a adio das fontes de nitrognio e fsforo trazem
benefcios para o processo. No entanto esta influncia observada quando apenas um dos
componentes adicionada ao meio, sendo o valor de atividade da poligalacturonase maior
quando apenas nitrognio adicionada (16 U/g) do que quando apenas fsforo est presente
(11,6 U/g).

Figura 5.16. Influncia da adio das fontes de nitrognio e fsforo na atividade da
poligalacturonase para 30 horas de fermentao, fixando-se a umidade em 40% (nvel -1).

Para o percentual de reduo de viscosidade, Figura 5.17, nota-se que a adio das
fontes de nitrognio e fsforo tm pouca influncia no processo, mantendo valores de


95
percentual de reduo de viscosidade superior a 70% para quase toda faixa de valores
estudadas, quando se mantm fixa a umidade em 40%.
Assim como para atividade da poligalacturonase, os maiores valores de percentual de
reduo de viscosidade ocorrem para a condio de 40% de umidade, 1% de nitrognio e no
adio da fonte de fsforo, chegando-se a 79,57% de reduo de viscosidade, prximo do
valor obtido experimentalmente nas mesmas condies, 82%.

Figura 5.17. Influncia da adio das fontes de nitrognio e fsforo no percentual de reduo
de viscosidade para umidade inicial de 40% (nvel -1) com 30 horas de fermentao.

De acordo com os resultados obtidos, a concentrao inicial de umidade a varivel de
maior importncia para o processo, estando sempre os maiores valores de atividade
enzimtica associada a baixos valores de umidade, 40%. Este resultado est de acordo com o
encontrado por Botella et al. (2006) que estudou a influncia da umidade inicial na produo
de poligalacturonase usando resduo da indstria de vinho (bagao de uva), variando a
umidade inicial de 45-80%. Concluiu que a atividade enzimtica decresce para valores de
umidade superior a 65%, atribuindo o fato ao decrscimo da porosidade, alteraes na
estrutura da partcula e baixa transferncia de oxignio.


96
A melhor condio de fermentao encontrada foi 40% de umidade, 1% de nitrognio e
sem adio de fonte de fsforo, atingindo assim atividade da poligalacturonase de 15,55 U/g e
79,6% de reduo de viscosidade s 30 horas de cultivo. Este valor de atividade superior aos
citados na literatura para poligalacturonase obtida a partir de resduos de frutas sendo 12 U/g
para bagao de laranja, 5 U/g para casca de manga e 7,5 U/g para casca de banana, utilizando
Penicillium viridicatum RFC3, atividades estas atingidas em 4 dias de fermentao (Silva et
al., 2002).
Zheng & Shetty (2000) encontraram atividade de 29,4 U/g e 20,1 U/g para bagao de
morango e ma, mas usando suplementao com cido poligalacturnico, que aumenta o
custo do processo, e estes valores foram obtidos aps 40 dias de fermentao usando Lentinus
edodes. Ento, em termos de produtividade dentre estes resduos o bagao de caju ainda
apresenta-se como melhor substrato para a produo de pectinases.

5.2.2 Pednculo de caju lavado
Igualmente para o resduo de pednculo de caju sem lavar, para o resduo do pednculo
de caju lavado foram realizados ensaios variando a umidade inicial, a adio de sulfato de
amnia (N) e a adio de fosfato de potssio monobsico (P) ao meio, Tabela 4.3.
O primeiro ensaio foi realizado com 40% de umidade, sem adio das fontes de N e P.
A Figura 5.18 apresenta a cintica do processo nestas condies. No incio o pH do meio de
4,54 e vai caindo lentamente devido aos metablicos formados. O pico de atividade de PG se
d no incio do processo, logo com 8 horas, chegando a 9,34 U/g. O percentual de reduo de
viscosidade tambm se apresenta no inicio do processo, mas, seu maior pico ocorre s 23
horas (81%), indicando a produo de outras enzimas do complexo pectinoltico.
No incio do processo h uma queda no teor de protena at as 23 horas de processo
(11,4-8,6%), depois deste perodo o teor de protena comear a se elevar. Como o teor de
protena uma medida indireta da biomassa pode-se dizer que no incio do processo as
condies de crescimento no so favorveis, pois o resduo no possui acares redutores,
sendo a pectina a fonte de carbono disponvel, tal fato, associado ao baixo teor de umidade,
que dificulta o transporte de nutrientes para as extremidades da partcula; deste modo os
microrganismos so induzidos a produzir a enzima para que a pectina seja hidrolisada
componentes fermentescveis. Aps as 23 horas de cultivo, maior pico de percentual de
reduo de viscosidade, supe-se que a fonte de carbono j est disponvel ao microrganismo


97
e ele a utiliza para seu crescimento. Aps este perodo a umidade do meio que se mantinha
constante comea a cair, tendo-se ao final do processo a umidade em 31%.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 8 23 32 47 56 72
Tempo (h)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
,

p
H
,

P
r
o
t
e
n
a

(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%
R
e
d
.
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
PG
Prot .
U
%RV


No ensaio 2 em que a umidade inicial do meio de 60%, o microrganismo encontra
condies de crescimento favorvel ao desenvolvimento, e se percebe o aumento do teor de
protena logo aps as oito horas de processo.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 8 23 32 47 56 71
Tempo (h)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
,

p
H
,

P
r
o
t
e
n
a

(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
%
R
e
d
.
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
) pH
PG
Prot .
U
%RV




98
O maior pico do percentual de reduo de viscosidade ocorre s 32 horas de cultivo
(36%) sendo um valor bem inferior ao obtido com 40 % de umidade. Ento, quando o
microrganismo encontra condies favorveis ao seu crescimento, este se desenvolve sem a
necessidade de produo de grandes quantidades de enzimas pectinolticas. Em condies
desfavorveis ele obrigado a produzir enzimas para o seu desenvolvimento. Caso tpico de
produo de enzimas por induo do substrato.
Os ensaio 3, 5 e 7 foram realizados com 40% de umidade inicial do meio, sendo o
ensaio 3 com a adio de 1% de N, o ensaio 5 com 0,6% de P e o ensaio 7 com 1% de N e
0,6% de P. As Figuras 5.20, 5.21 e 5.22 mostram a cintica do processo de cada um destes
ensaios respectivamente.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 7 22 30 46 55 71
Tempo (h)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
,

p
H
,

P
r
o
t
e
n
a

(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%
R
e
d
.
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
PG
Prot .
U
%RV


A mxima atividade de PG (10,13 U/g) e percentual de reduo de viscosidade (81%)
no ensaio 3 ocorreu com 22 horas de processo. Comparando o ensaio 1 com o ensaio 3 v-se
que a adio da fonte de nitrognio no alterou o percentual de reduo de viscosidade mas, a
atividade de PG teve um pequeno aumento (9,34-10,13 U/g). Em termos de produtividade
houve uma queda de 1,2 U/g.h no ensaio 1 para 0,5 U/g.h no ensaio 3. Ento, para este
resduo a adio da fonte de nitrognio no interessante, isto pode estar associado ao fato
deste resduo (lavado-12,94%) apresentar o dobro de protena que o contido no resduo sem
lavar (6,83%), no sendo necessria a adio de N.


99
Com 40% de umidade a adio de fsforo tambm no trouxe benefcios ao processo.
Neste caso o maior pico de PG tambm ocorreu s 22 horas de cultivo sendo de 6,64 U/g e
80% de reduo de viscosidade, como mostra a Figura 5.21. A ao dos dois sais no meio
pode ser vista na Figura 5.22. Nela v-se que o maior pico de PG agora com 30 horas de
processo (7,21) com 68% de reduo de viscosidade, sendo esta a condio menos favorvel
produo de enzimas pectinolticas, com baixa umidade.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 8 22 31 48 55 72
Tempo (h)
A
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v
i
d
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P
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U
/
g
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d
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U
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a
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e
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%
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pH
PG
Prot .
U
%RV


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0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
A
t
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v
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d
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d
e

P
G

(
U
/
g
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%
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%
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e
d
.
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a
d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)

pH
PG
Prot .
U
%RV




100
Os ensaios 4, 6 e 8 foram conduzidos com 60% de umidade, sendo o ensaio 4 com
adio de 1% de N, o ensaio 6 com 0,6% de P e o ensaio 8 com a adio de 1% de N e 0,6 de
P. As cinticas do processo esto apresentadas nas Figuras 5.23, 5.24 e 5.25 respectivamente.
Assim como no ensaio 2, nos ensaios 4 e 8 praticamente no h atividade da
poligalacturonase. Ento, assim como para o resduo do pednculo de caju sem lavar, a
umidade de 60% no favorece a produo de enzimas pcticas.

0
2
4
6
8
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0 8 22 30 46 56 71
Tempo (h)
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P
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(
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/
g
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d
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d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
PG
Prot .
U
%RV

Figura 5.23. Ensaio 4, 60% de umidade, 1% de N, 0% de P.

0
2
4
6
8
10
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0 7 21 30 46 54 71
Tempo (h)
A
t
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v
i
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e

P
G

(
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/
g
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,

p
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%
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%
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e
d
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s
c
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s
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d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
PG
Prot .
U
%RV




101
Com 60% de umidade a adio da fonte de fsforo aumentou a produo de PG, que no
ensaio 2, sem fsforo era de 1,17 U/g para 10,41 U/g com 21 horas de processo, ensaio 6.
Estes valores so semelhantes aos obtidos com 40% de umidade e 1% de N, condio
aplicada no ensaio 3.
A interao das fontes de nitrognio e fsforo no meio (Figura 5.25) a condio menos
favorvel produo de enzimas pectinolticas para o resduo lavado, como dito
anteriormente ao se analisar a ao conjunta dos sais com 40% de umidade. A cintica de
produo semelhante ao obtido no ensaio 4 com 60% de umidade e 1% de N.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 18 21 32 48 55 71
Tempo (h)
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G

(
U
/
g
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,

p
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,

P
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n
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%
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20
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d
e
,

U
m
i
d
a
d
e

(
%
)
pH
PG
Prot .
U
%RV


A reprodutibilidade dos dados apresentada na Figura 5.26 que apresenta os resultados
das mdias e desvios padres de trs ensaios realizados com 50%de umidade, 0,5% de sulfato
de amnia e 0,3% de fosfato de potssio monobsico. Os desvios com relao a umidade, pH
e protena so pequenos, 0,1; 4,2 e 1,4 respectivamente, apenas o desvio para umidade s 54
horas de cultivo grande (13,6), o que pode ser justificado pelo toque da amostra nas paredes
midas do Erlenmeyer, no instante da retirada de amostra.
O percentual de reduo de viscosidade e a atividade PG tambm apresentam pequenos
desvios, variando conforme a amostra analisada, sendo em mdia 5,1 e 0,6 respectivamente.



102
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 7 21 30 46 54 70
Tempo (h)
A
t
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d
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P
G

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/
g
)
,

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,

P
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t
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n
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50
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,

U
m
i
d
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e

(
%
)
pH
PG
U
%RV
Prot.

Figura 5.26. Ensaios 9,10 e 11, 50% de umidade, 0,5% de N e 0,3% de P.

5.2.2.1 Avaliao do comportamento do processo atravs da metodologia de superfcie
de resposta para o resduo lavado
Assim como para o resduo do pednculo de caju sem lavar agora ser feita uma
avaliao do processo de produo de pectinase por fermentao em estado slido utilizando a
ferramenta do planejamento experimental e anlise de superfcie de resposta para o resduo do
pednculo de caju lavado.
As Tabelas 5.8 e 5.9 apresentam os resultados experimentais para atividade da
poligalacturonase e percentual de reduo de viscosidade respectivamente para cada instante
de fermentao analisada. Vale lembrar que os experimentos 10 e 11 foram realizados nas
mesmas condies do experimento 9, estando as variveis no ponto central, 50% de umidade,
0,5% de nitrognio e 0,3% de fsforo.
A partir da matriz do planejamento, pode-se analisar a influncia dos parmetros
(variveis independentes): umidade inicial, adio da fonte de nitrognio e adio da fonte de
fsforo no processo. Com os resultados experimentais para cada instante de fermentao,
possvel ajustar os dados para obter um modelo de primeira ordem que relacione a atividade
enzimtica com os parmetros estudados.



103
Tabela 5.8. Resultado experimental em termos de atividade poligalacturonsica para o
resduo do pednculo de caju lavado
Atividade PG por horas de fermentao (U/g)
EXP 7 22 30 46 54 70
1 9,3 6,2 6,2 7,0 3,9 1,8
2
0,0 0,1 1,2 1,2 0,5 0,0
3
3,7 10,1 10,0 4,2 3,6 4,4
4
0,0 0,0 0,0 0,2 0,0 0,5
5
2,9 6,6 6,8 4,0 3,7 2,8
6
0,7 10,4 0,6 2,5 0,6 0,4
7
1,6 0,1 7,2 7,0 6,4 4,8
8
0,2 0,8 0,0 0,0 1,3 0,5
9
0,5 3,2 2,0 2,1 2,6 2,1
10
1,1 3,0 3,5 2,0 3,2 2,0
11
0,9 2,9 1,3 1,3 0,7 0,9

Tabela 5.9. Resultado experimental em termos do percentual de reduo de viscosidade para o
resduo do pednculo de caju lavado

Reduo de viscosidade por horas de
fermentao (%)
EXP
7 22 30 46 54 70
1 53 81 79 70 63 58
2
0 24 32 36 24 25
3
61 81 74 62 68 62
4
32 22 35 50 31 48
5
45 80 77 67 63 58
6
13 82 23 12 9 5
7
21 29 68 61 70 68
8
17 9 39 67 70 49
9
20 51 53 38 41 31
10
19 55 50 50 41 36
11
48 51 46 47 45 42

As Tabelas 5.10 e 5.11 apresentam os modelos codificados para a atividade da
poligalacturonase e percentual de reduo de viscosidade para cada hora de fermentao
analisada. Os valores em negrito correspondem aos efeitos estatisticamente significativos ao


104
nvel de 95% de confiana. Nela tambm possvel observar o valor do coeficiente de
explicao R
2
, que d o percentual da variao explicada pelo modelo e o valor do teste F que
diz se o modelo estatisticamente significativo para F maior que 1 e preditivo para valores de
F maior que 4.

Tabela 5.10. Modelo linear obtido para a atividade poligalacturonsica (PG) por hora de
fermentao para o resduo de pednculo de caju lavado
Modelo Atividade da Poligalacturonase R
2
F
PG(7h)=1,90-2,08U-0,93N-0,96P+0,81UN+1,18UP+0,48NP-0,61UNP 93,4 0,7
2
PG(22h)= 3,94-1,47U-1,54N+0,19P-0,88UN+2,60UP-2,49NP+0,10UNP 97,7 2,0
PG(30h)= 3,52-3,55U+0,30N-0,35P-0,75UN+0,20UP-0,35NP+0,50UNP 92,3 0,6
PG(46h)=2,86-2,29U-0,41N+0,12P-0,46UN+0,16UP+0,53NP-0,91UNP 91,5 0,5
0,5
PG(54h)=2,41-1,90U+0,33N+0,51P-0,28UN-0,15UP+0,52NP-0,22UNP 90,9 0,5
8,4
PG(70h)= 1,93-1,54U+0,66N+0,23P-0,51UN-0,13UP-0,13NP+0,03UNP 99,8 8,5

Tabela 5.11. Modelo linear obtido para percentual de reduo de viscosidade (RV) por hora
de fermentao para o resduo de pednculo de caju lavado
Modelo Percentual de Reduo de Viscosidade R
2
F
RV(7h)= 27,36-14,75U+2,50N-6,25P+6,50UN+5,75UP-7,50NP+0,50UNP 92,8 0,6
RV(22h)= 51,36-16,75U-15,75N-1,00P-3,00UN+12,25UP-15,25NP-2,50UNP 99,8 24,
0
RV(30h)= 52,36-21,13U+0,63N-1,63P+4,13UN+0,38UP+1,13NP+2,13UNP 98,6 3,3
3
RV(46h)= 53,09-11,88U+6,88N-1,38P+10,38UN-0,38UP+5,38NP+4,88UNP 95,7 1,1
RV(54h)=47,73-16,25U+10,00N+3,25P+7,00UN+2,75UP+7,00NP+6,50UNP 97,0 1,5
RV(70h)= 44,00-14,88U+10,13N-1,63P+6,63UN-3,13UP+3,38NP+1,88UNP
3,25
91,6 0,2

Assim como para os modelos obtidos utilizando o resduo do pednculo de caju sem
lavar, os modelos aqui obtidos apresentam bons coeficientes de explicao estando todos
acima de 90%, mas os valores de F mostram que os modelos com todos os parmetros no o
melhor ajuste para maioria dos casos.


105
Pelos modelos obtidos percebe-se que, assim como para o resduo do pednculo de
caju sem lavar, a umidade a varivel que tem maior influncia no processo, e que os
menores valores de umidade correspondem quase sempre aos maiores valores de atividade
encontrados.
Usando os dados experimentais v-se que os maiores valores de atividade da
poligalacturonase e de percentual de reduo de viscosidade foram s 22 horas de
fermentao. A partir desta observao, ser feito o estudo estatstico para obter modelos que
sejam significativos e preditivos e assim identificar e quantificar o efeito das variveis para o
processo. importante lembrar que as equaes aqui apresentadas so empricas e s devem
ser aplicadas dentro da faixa dos valores estudados.
Para 22 horas de fermentao o modelo para atividade da poligalacturonase apresenta
um F de 2,0 que indica um modelo significativo, mas no preditivo. Usando o diagrama de
Pareto mostrado na Figura 5.27 possvel identificar que os efeitos do fsforo e da interao
das trs variveis no so significativos, ento a retirada destes parmetros pode melhorar a
qualidade do modelo.

,2727869
,496275
-2,31047
-3,86832
-4,03922
-6,5436
6,826246
p=,05
Estimativa Efeitos (Valor Absoluto)
1*2*3
(3)P
1*2
(1)U
(2)N
2*3
1*3

Figura 5.27. Diagrama de Pareto para atividade da poligalacturonase com 22 horas de
fermentao (resduo lavado).

Com a retirada destes parmetros os efeitos de umidade e fonte de nitrognio passam a
ser significativos, o novo modelo apresentado na Equao (13).

PG(22h)= 3,94-1,47U-1,54N-0,88UN+2,60UP-2,49NP (13)


106
A Tabela 5.12 apresenta a anlise de varincia para este modelo, percebe-se que o
coeficiente de explicao quase no se alterou passando de 97,7 para 97,4; mas que o valor de
F passou de 2,0 para 7,5; de onde se conclui que o modelo agora significativo e preditivo.

Tabela 5.12. Anlise de varincia para atividade da poligalacturonase com 22 horas de
fermentao (resduo lavado).
Regresso 146,22 5 29,24 38,05
Resduo 3,84 5 0,77
F.ajuste 3,80 3
Erro puro 0,05 2
Total 149,69 10
%R 0,97
F tabelado = 5,05 F5%= 7,50

De acordo com a Figura 5.27, os efeitos de maior significncia estatstica so as
interaes da umidade com a adio da fonte de fsforo e a interao das fontes de nitrognio
e fsforo.
Para interao umidade e fsforo a maior atividade de PG atingida quando ambas
esto em seus nveis mximo ou mnimo. J a interao nitrognio e fsforo mostra que a
mxima atividade de PG atingida quando apenas uma das fontes est presente no meio.
Assim, para umidade de 60% a maior atividade atingida para fsforo de 0,6% (9,98 U/g)
sem adio de nitrognio; ou com 40% de umidade, 1% de nitrognio sem adio de fsforo
(9,84 U/g).
A Figura 5.28 mostra a superfcie de reposta construda com base neste modelo para
umidade fixa em 40%. V-se que o maior valor de atividade da poligalacturonase obtido
com a adio de 1% de sulfato de amnia (9,84 U/g). A atividade da poligalacturonase cai
bastante quando os dois sais esto presentes no meio, sendo esta a condio menos favorvel
produo da poligalacturonase.



107

Figura 5.28. Influncia da adio de nitrognio e fsforo na atividade da poligalacturonase
para umidade fixa em 40%.

Para percentual de reduo de viscosidade, com 22 horas de fermentao, o modelo
com todos os parmetros e no s estatisticamente significativo como tambm altamente
preditivo com um F de 24, Equao 14.

RV(22h)= 51,36-16,75U-15,75N-1,00P-3,00UN+12,25UP-15,25NP-2,50UNP (14)

Pelo diagrama de Pareto, Figura 5.29, a nica varivel que no estatisticamente
significativa a adio da fonte de fsforo. Mais uma vez confirma-se que a umidade do meio
a varivel mais importante para o processo. A anlise de varincia para este modelo est
apresentada na Tabela 5.13.


108
-1,28452
-3,21131
-3,85357
15,73541
-19,589
-20,2312
-21,5158
p=,05
(3)P
1*2*3
1by2
1by3
2by3
(2)N
(1)U

Figura 5.29. Diagrama de Pareto para percentual de reduo de viscosidade com 22
horas de fermentao (resduo lavado).

Tabela 5.13. Anlise de varincia para percentual de reduo de viscosidade com 22 horas de
fermentao
Regresso 7420,00 7 1060 218,63
Resduo 14,55 3 4,85
F.ajuste 3,88 1
Erro puro 10,67 2
Total 7434,55 10
%R 0,998
4

F tabelado = 8,89 24,59

A Figura 5.30 mostra a superfcie construda para percentual de reduo de
viscosidade s 22 horas de fermentao mantendo-se a umidade fixa em 40% e variando a
adio da fonte de nitrognio e da fonte de fsforo. Assim como para a atividade da
poligalacturonase os maiores percentual de reduo de viscosidade so atingidos quando
apenas uma das fontes est presente no meio, sendo a condio mais desfavorvel quando as
duas fontes esto no meio de fermentao.
Os valores das variveis que maximizam a produo de enzimas pcticas para o
resduo do pednculo de caju lavado, com tempo de fermentao de 22 horas so: umidade de
40% (-1), nitrognio de 1% (1) e fsforo de 0% (-1). Com estes valores foi obtido atividade da
poligalacturonase de 9,84 (U/g) e percentual de reduo de viscosidade de 81,36%. Estes


109
valores esto bem prximos aos valores experimentais que foram de 10,1 (U/g) para atividade
da poligalacturonase e de 81% de reduo de viscosidade.

Figura 5.30 Influncia da adio das fontes de nitrognio e fsforo com umidade fixa em
40%.

Para o resduo do pednculo de caju sem lavar a melhor condio de fermentao foi
com umidade de 40%, nitrognio 1% e sem necessidade da adio da fonte de fsforo s 30
horas de processo atingindo-se atividade da poligalacturonase de 15,55 U/g e 79,6% de
reduo de viscosidade.
Os dois resduos apresentam as mesmas condies de mxima produo de enzima,
sendo que em tempos de fermentao diferentes. Por no conter acares redutores, no
resduo lavado, o microrganismo induzido a produzir enzimas nas primeiras horas e
fermentao, por isso o pico de atividade enzimtica se d em tempo de fermentao menor
neste resduo. Apesar de necessitar de um tempo de fermentao mais longo o resduo sem
lavar apresenta maior atividade da poligalacturonase. Em termos de produtividade tambm


110
maior, 0,52 U/g*h para o resduo do pednculo de caju sem lavar e de 0,45 U/g*h para o
resduo do pednculo de caju lavado.

5.2.3 Avaliao do processo atravs da metodologia de superfcie de resposta
usando os picos de produo de enzima
Usando o planejamento experimental tambm possvel fazer uma anlise do processo
fermentativo a partir dos dados de pico de produo da enzima para cada experimento,
diferente do feito anteriormente analisando cada instante de fermentao individualmente.
Assim, analisando os dados das Tabelas 5.2 e 5.3, que apresentam os valores de
atividade da poligalacturonase e percentual de reduo de viscosidade para os experimentos
com o resduo do pednculo de caju sem lavar, possvel fazer um estudo de verificao das
faixas que as variveis de entrada (umidade inicial, adio das fontes de nitrognio e fsforo),
usando o maior pico de atividade de cada experimento (resposta), aplicando a ferramenta do
planejamento experimental e anlise de superfcie de resposta para otimizar o processo, ou
seja, buscar operaes das variveis de entrada que maximizem a produo de
poligalacturonase.
Os modelos de primeira ordem obtidos foram:

PG = 4,97 5,00U + 1,55N 1,75UN - 1,65NP + 1,50UNP (15)
RV = 51,73 20,25U + 6,25N + 5UN + 3,00UNP (16)

As Tabelas 5.14 e 5.15 apresentam a anlise de varincia para a atividade da
poligalacturonase e percentual de reduo de viscosidade respectivamente para os modelos
obtidos. Observa-se que os valores de F indicam que os modelos so estatisticamente
significativos com 95% de confiana.

Tabela 5.14. Anlise de varincia para atividade da poligalacturonase, pednculo de caju sem
lavar
Regresso 283,80 5 56,76 14,73
Resduo 19,20 5 3,84
Total 303,0 10
%R 0,94
F tabelado = 5,05 F5%= 2,93


111
Tabela 5.15. Anlise de varincia para percentual de reduo de viscosidade, pednculo de
caju sem lavar
Fonte variao SQ GL MQ
Teste
F
Regresso 3865,00 4 966,25 8,82
Resduo 657,18 6 109,53
Total 4522,18 10
%R 0,85
F tab. 4,53 F5%= 1,93

Pelos modelos, verifica-se que a varivel de maior importncia para o processo a
umidade, como dito anteriormente, estando os maiores valores de atividade associada a
valores de umidade de 40%. A adio da fonte de nitrognio tem seu efeito mais expressivo
para a atividade da poligalacturonase. As Figuras 5.31 e 5.32 apresentam as superfcies de
resposta construdas para valores de umidade fixos em 40%, variando-se as variveis fontes
de nitrognio (N) e fsforo (P).

Figura 5.31. Atividade da poligalacturonase variando N e P para umidade fixa em 40%
(resduo sem lavar).


112
Para otimizar o processo (maximizar a produo de enzima-maior valor de atividade da
poligalacturonase), deve-se fixar a umidade inicial em 40%, adio de 1% em nitrognio e
sem necessidade de adio da fonte de fsforo. Operando-se com estes valores obtm-se
16,42 U/g de atividade da poligalacturonase, valor prximo ao mximo experimental que de
16 U/g. Para o percentual de reduo de viscosidade as variveis estudadas no apresentaram
efeito significativos, o maior valor de atividade nas condies acima de 76,23% de reduo
de viscosidade, valor abaixo do experimental (82%), isto pode ser devido ao baixo valor do
coeficiente de correlao mostrado na Tabela 5.15, de 0,85.

Figura 5.32. Efeito da adio de sulfato de amnia e fsforo no % de reduo de viscosidade,
para umidade fixa em 40%.

Do mesmo modo, para o resduo do pednculo de caju lavado, usando os valores dos
picos de cada experimento apresentados nas Tabelas 5.8 e 5.9 usando a ferramenta do
planejamento experimental, obteve-se as Equaes (17) e (18) para atividade da
poligalacturonase e percentual de reduo de viscosidade, respectivamente.


113
PG = 5,13 2,51U 1,37UN + 1,93UP 1,10NP (17)
RV = 64,45 9,25U + 6,75P + 9,75UP 4,5NP (18)

As Tabelas 5.16 e 5.17 apresentam a anlise de varincia para as equaes de primeira
ordem obtidas. Os valores do coeficiente de correlao so considerados baixos, pois s
explicam 76% das variaes em relao ao valor experimental. O valor de F indica que o
modelo para o percentual de reduo de viscosidade estatisticamente significativo. Para
atividade da poligalacturonase o modelo no estatisticamente significativo, no sendo,
portanto indicado construo da superfcie.

Tabela 5.16. Anlise de varincia para atividade da poligalacturonase do resduo lavado
Regresso 104,77 4 26,20 4,42
Resduo 35,56 6 5,93
Total 140,33 10
%R 0,75
F tabelado = 4,53 F5%= 0,98

Tabela 5.17. Anlise de varincia para percentual de reduo de viscosidade para o resduo
lavado
Regresso 1971,50 4 492,88 4,87
Resduo 607,23 6 101,20
Total 2578,73 10
%R 0,76
F tabelado = 4,53 F5%= 1,08

As Equaes (17) e (18) confirmam que a umidade inicial a varivel de maior
significado para o processo. Para o percentual de reduo de viscosidade usando o resduo do
pednculo de caju sem lavar, a adio das fontes de nitrognio e fsforo juntas a condio
menos favorvel ao processo, como j dito anteriormente. Os maiores valores de percentual
de reduo de viscosidade para este resduo so obtidos quando apenas uma das fontes
adicionada.


114
A Figura 5.33 apresenta a superfcie construda com base neste modelo com a umidade
fixa em 40%. Os maiores valores de atividade so para umidade de 40% com 1% de
nitrognio e sem adio da fonte de fsforo, chegando a valores de 81,2% de reduo de
viscosidade. Este valore prximo do valor experimental de 81%.

Figura 5.33. Percentual de reduo de viscosidade variando N e P com 40% de umidade,
resduo lavado.

5.3 Estudo das condies de extrao da PG
No estudo das condies de extrao da enzima do meio fermentado foi feito um
planejamento experimental 2
2
mais configurao estrela com trs repeties no ponto central.
As variveis de entrada foram: tempo de contato (T) e a razo volume solvente/gramas
de meio fermentado (RZ), testando os sistemas com e sem agitao. Como varivel de
resposta usou-se atividade da poligalacturonase, Tabela 5.18.


115
Os experimentos foram realizados usando o resduo lavado, com 40% de umidade e
com tempo de fermentao de 16 horas.

Tabela 5.18. Variao da atividade poligalacturonsica em funo das condies de extrao
Atividade PG (U/g)
Exp. T (min)
R Z
(mL/g)
Com agitao Sem agitao
1 -1 (30) 7,2 4,3
2 +1 (90)
-1 (2,5)
-1 (2,5) 6,8 5,5
3 -1 (30) +1 (7,5) 5,5 5,3
4 +1 (90) +1 (7,5) 9,1 5,7
5 0 (60) 0 (5) 10,6 9,0
6 0 (60) 0 (5) 13,1 9,4
7 0 (60) 0 (5) 12,0 9,7
8 + (100) 0 (5) 16,1 12,4
9 - (20) 0 (5) 8,2 9,7
10 0 (60) + (8,5) 12,2 11,1
11 0 (60) - (1,5) 6,7 5,3

A anlise estatstica dos dados, pela metodologia do planejamento fatorial, mostrou no
haver diferena significativa das variveis de entrada, nos nveis estudados, sobre o processo
apresentando coeficientes de correlao muito baixos de 0,4 sem agitao e 0,6 com agitao.
Isto impossibilita a construo de modelos empricos e a obteno das superfcies de resposta,
mas no inviabiliza o estudo pontual dos experimentos.
Os experimentos 5, 6 e 7 com valores de 10,6; 13,1 e 12 U/g no sistema com agitao e
9; 9,4 e 9,7 U/g sem agitao, mostram a reprodutibilidade dos dados usando o ponto central.
Apresentam valores de atividade PG com mdia de 11,9 (U/g) e desvio padro de 1,2 no
sistema com agitao e mdia de 9,4 (U/g) e desvio padro de 0,3 no sistema sem agitao
Na Figura 5.34 possvel ver que o sistema que apresentou os melhores resultados de
atividade foi o sistema com agitao. A melhor condio de extrao com o tempo de
contato solvente meio de fermentao de 100 minutos e com a razo volume de solvente meio
fermentado 5 (mL/g), sendo a atividade da poligalacturonase de 16,1 U/g. Comparando a


116
atividade mais alta 16,1 U/g em relao ao resultado mais baixo de atividade 4,3 U/g, no
sistema sem agitao, com 30 minutos de contato, e 2,5 de razo solvente/meio; houve um
ganho em atividade de 4 vezes, mudando-se apenas as condies de extrao.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Experimento
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
com
sem

Figura 5.34. Efeito das condies de extrao na atividade poligalacturonsica (PG) nos
sistemas com e sem agitao.

A Figura 5.35 apresenta o efeito da razo solvente (tampo acetato) massa de meio
fermentado na extrao da poligalacturonase. Mostra que para razes entre 1,5 e 5 o aumento
da razo possibilita uma maior extrao da enzima, mas que na faixa entre 5-8,5 no h
variao significativa, principalmente no sistema com agitao.
A Figura 5.36 mostra o efeito do tempo de contato solvente meio de fermentao na
atividade poligalacturonsica. Nela percebe-se que quanto maior o tempo maior a extrao da
poligalacturonase. Para o sistema sem agitao no h variao significativa para tempos de
contato de 20-60 minutos.
Castilho (1997) estudando a influncia do tempo de contato na extrao da
poligalacturonase em sistema agitado por agitador mecnico, encontrou um perfil parablico
no comportamento dos extratos enzimticos obtidos entre 10 e 50 minutos. O crescimento da
curva de 10-30 minutos indica que o perodo de 10 minutos insuficiente para a total
solubilizao das enzimas presentes no slido fermentado. O decrscimo decorrido aps 30
minutos foi atribudo perda de atividade enzimtica decorrente de fatores como maior
extrao de agentes desnaturantes, aumento da formao de espuma e adsoro de enzima s


117
partculas slidas mais finas. No caso aqui estudado a agitao foi realizada em mesa agitada
no ocorrendo formao de espuma.

0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 6 8 10
Razo solvente/meio fermentdo (mL/g)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
com
sem

Figura 5.35. Efeito da razo solvente meio fermentado na extrao da poligalacturonase nos
sistemas com e sem agitao.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 20 40 60 80 100 120
Tempo de contato (min.)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

P
G

(
U
/
g
)
com
sem

Figura 5.36. Efeito do tempo de contato solvente meio fermentado na extrao da
poligalacturonase nos sistemas com e sem agitao.

Captulo 6
Concluso
Cap t ul o 6 Concl uso


119
6. Concluso

Caracterizao:
* A caracterizao dos resduos secos do pednculo de caju lavado e sem lavar mostrou
que os resduos apresentam nutrientes que podem ser utilizados para sntese de
pectinase, com valores de acares redutores, protena e pectina de 35,5; 6,8 e 7,3
respectivamente, para o resduo sem lavar e 0,2; 13,4 e 12,9 para o resduo lavado.
* O pH dos resduos secos considerado ideal como pH inicial do meio utilizado na
produo de pectinases por Aspergillus niger.
* Com a secagem os resduos ficaram com umidade de 7,7; resduo sem lavar e 10,2;
resduo lavado. Estes valores de umidade associados ao pH dos resduos, por volta de
4,0; permitiram que os resduos fossem armazenados em temperatura ambiente durante
o decorrer dos experimentos.

Para o resduo sem lavar:
* Os maiores valores de atividade da poligalacturonase foram obtidos para umidade
inicial de 40%.
* Em geral, a adio das fontes de nitrognio e fsforo foi favorvel para o processo.
* O pico de atividade foi com 40% de umidade e 1% de nitrognio sem adio de fsforo
s 30 horas de processo, sendo 16 U/g de atividade de PG e 82% de reduo de
viscosidade.
* Os modelos matemticos obtidos fornecem valores bem prximos aos experimentais
nas mesmas condies de processo, 15,55 U/g de PG e 79,57% de reduo de
viscosidade.

Para o resduo lavado:
* A adio das fontes de nitrognio e fsforo favorvel ao processo, sendo o efeito do
nitrognio mais pronunciado com 40% de umidade e o do fsforo com 60% de
umidade.
Cap t ul o 6 Concl uso


120
* Com 60% de umidade e 0,6% de fsforo, sem nitrognio, s 22 horas de processo
obtm-se 10,4U/g de PG e 82% de reduo de viscosidade. O modelo fornece nestas
condies 9,98U/g e 82,36% respectivamente.
* Com 40% de umidade e 1% de nitrognio, sem fsforo, s 22 horas obtm-se 10,1 U/g
de PG e 81% de reduo de viscosidade. Pelo modelo tem-se 9,84 U/g e 81,37%
respectivamente.
* A condio menos favorvel produo de enzimas pectinoltica quando as duas
fontes, de N e P, esto presentes no meio.
* Em termos de produtividade da poligalacturonase o resduo sem lavar apresenta melhor
condio, ou seja, com 40% de umidade e sem adio das fontes de nitrognio e
fsforo, obtendo-se, s 8 horas de processo, 9,34 U/g de PG. Enquanto para o resduo
sem lavar o pico foi de 16 U/g de PG, s 30 horas de processo, com 40% de umidade e
1% de nitrognio, sem adio de fsforo. Ento, obteve-se, para o resduo lavado,
produtividade de 1,2 U/g.h de PG e para o sem lavar 0,52 U/g.h de PG.
* Comparando os dados aqui obtidos com os apresentados na literatura percebe-se que o
bagao do pednculo de caju um substrato promissor na produo da
poligalacturonase.

Condio de extrao da PG:
* Os experimentos para melhor condio de extrao mostram a boa reprodutibilidade
dos dados.
* Para extrao da poligalacturonase o sistema operado com agitao mostrou-se mais
eficiente que o sistema sem agitao, obtendo-se maiores atividades.
* A melhor condio de extrao da PG foi com o tempo de contato, solvente meio de
fermentao, de 100 minutos e com a razo, volume de solvente meio fermentado, 5
(mL/g).

Referncias
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Ref ernci as bi bl i ogrf i cas


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