PRCTICA No.

3 MTODO DE BURRI, DE TINTA CHINA O TINCIN NEGATIVA Objetivo: De manera prctica el alumno aprender a realizar el mtodo de Burri, para as aplicarlo en el diagnstico de Cryptococosis. Fundamento. El examen microscpico directo proporciona un diagnstico definitivo si se observan elementos fngicos patognomnicos: cpsula de Cryptococcus neoformans, clulas muriformes en cromoblastomicosis, levaduras pequeas intracelulares de Histoplasma capsulatum, quistes tpicos de P. jiroveci, levaduras con brotes de base ancha de Blastomyces dermatitidis, levaduras con gemacin multipolar en rueda de timn de Paracoccidiodes brasiliensis o las esfrulas de Coccidiodes immitis. El examen directo tambin es muy importante para interpretar el crecimiento de hongos oportunistas o contaminantes; p. ej. Visualizacin de elementos fngicos anchos y no septados en muestras de lesiones rpidamente invasoras de las que se puede, o no, aislar un zigomiceto. Generalidades. La Cryptococosis es una micosis sistmica producida por un hongo levaduriforme encapsulado denominado Cryptococcus neoformans, descubierto hace aproximadamente cien aos por Sanfelice, quien aisl originalmente el microorganismo de un jugo de melocotn. Las lesiones cutneas, seas o viscerales pueden presentarse durante la diseminacin de la enfermedad, pero la inclusin del sistema nervioso central con meningitis subaguda o crnica es la forma ms familiar de la micosis. Aunque el hongo tiene una amplia distribucin mundial y se encuentra de manera abundante en la naturaleza, solamente causa enfermedad grave en personas con resistencia inmunolgica muy baja. En la actualidad, la incidencia de la criptococosis es paralela a la presentada por el SIDA. Taxonoma Reino: Fungi Phylum: Basidiomycota Orden: Tremellales Familia: Tremellaceae
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Gnero: Cryptococcus Especies: neoformans var. grubii, neoformans var. neoformans, gattii, albidus, laurentii.

Y aproximadamente, otras 35 especies ms que continuamente se estn reclasificando. Se han registrado casos raros provocados por Cryptococcus albidus, C. laurentii y C. uniguttulatus;

formalmente se reconoce a C. neoformans y C. gattii, como los agentes etiolgicos de la criptococosis en mamferos.

Morfologa Estado anamorfo o mitosprico. La reproduccin asexual representa el estado anamrfico, el cual est caracterizado por la produccin de clulas levaduriformes gemantes (propgulos asexuales), que tpicamente desarrollan una gran cpsula compuesta por polisacridos. El arreglo de los componentes capsulares determina alguno de los cuatro serotipos de la levadura: A, B, C D. Las levaduras son redondas (4-6 m de dimetro) o en ocasiones ovaladas y excepcionalmente formadoras de seudomicelio. Tanto las levaduras madre, como los blastoconidios se caracterizan por la presencia de cpsula. Estado Teleomorfo. El estado sexual del hongo est caracterizado por la produccin de basidiosporas (propgulos sexuales).Filobasidiella neoformans es el teleomorfo de C. neoformans y F. bacillispora, lo es de C. gattii. El gnero Filobasidiella es un basidiomiceto, con dos tipos sexuales: "a" y "alfa" caracterizados por tener el micelio hialino, consistente en hifas dicariticas y un basidio alargado, portando basidiosporas ssiles y en cadena (gemacin baspeta).

Cryptococcus albidus.
Imagen: L. R. Castan, Facultad de Medicina, UNAM.

Cryptococcus neoformans.
Levaduras encapsuladas. Imagen: CDC/Leanor Haley.

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Factores de virulencia Las caractersticas ms estudiadas sobre C. neoformans son la presencia de la cpsula polisacrida y la produccin de melanina. El polisacrido capsular puede: Inhibir la produccin de ciertas linfocinas provocando respuestas tanto celular como humoral muy dbiles, enlazar e inmovilizar parcialmente a los anticuerpos dirigidos contra la pared celular y la cpsula del hongo y adems, enmascarar a los anticuerpos. La presencia de la melanina funciona como un escudo que protege al hongo contra: anticuerpos del hospedero, agentes oxidantes y la anfotericina B. Otros parmetros que pudiesen estar relacionados con la patogenicidad de este hongo son: el tipo sexual, la biosntesis de adenina, produccin de manitol y ureasas y presencia de miristoil-transferasas. Fisiopatogenia Al entrar por las vas respiratorias altas, el hongo coloniza el rbol bronquial, y la evidencia sugiere que la criptococosis inicia como una enfermedad pulmonar con diseminacin a la piel, huesos, vsceras abdominales y particularmente hacia el sistema nervioso central. Generalmente, las lesiones pulmonares sanan espontneamente y son asintomticas. La criptococosis pulmonar benigna, probablemente representa una ligera o mnima exposicin y se llega a identificar por el hallazgo accidental en autopsia de un granuloma subpleural encapsulado. Las lesiones activas son granulomatosas o mixomatosas y pueden estar caracterizadas por masas de clulas de C. neoformansque debido a su crecimiento y cpsula producen desplazamiento mecnico de tejidos del hospedero. Si las lesiones de este tipo penetran la pared de un bronquio, se descarga un gran nmero de clulas fngicas en el esputo. Las lesiones pulmonares de criptococosis no calcifican y es probable que la mayora de ellas sanen sin formar criptococomas y sin dejar evidencia. En la autopsia, las lesiones pulmonares primarias se observan como ndulos de 1 - 7 cm de dimetro, localizados cerca de la superficie pleural, del hilio o en el centro del lbulo. En pulmones con infeccin criptococal progresiva, las lesiones se aprecian como granulomas miliares, pequeos abscesos, o lesiones mucoides grandes y slidas de neumonitis incluyendo uno o ms lbulos. Posteriormente, el hongo se disemina por el torrente sanguneo, va de infeccin habitual al sistema nervioso central y de otros rganos.
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En el sistema nervioso central, los datos clnicos estn asociados con el desarrollo de lesiones granulomatosas en las meninges. En la necropsia, la reaccin menngea se hace notoria en la base del cerebro y la parte dorsal del cerebelo, con membranas espesas y opacas. En el espacio subaracnoideo se presenta, de forma caracterstica, un exudado mucoide adherente semejante a pequeas "burbujas de jabn". Quitando la membrana, en la superficie de la corteza pueden observarse mltiples y finos hoyuelos. Se aprecian focos qusticos con masas de levaduras, predominantemente localizados en la materia gris, los cuales pueden estar en comunicacin con la superficie pero tambin pueden presentarse en el mismo patrn de lesiones granulomatosas, visto en pulmones y sistema nervioso central se da en los tejidos de cualquier rgano afectado. La apariencia mucoide causada por criptococos es consecuencia de las numerosas clulas de C. neoformans y la reaccin celular tenue. Cuando C. neoformans exhibe una reaccin celular marcada, las lesiones no pueden ser distinguidas histopatolgicamente de aquellas de otras enfermedades granulomatosas. Debido a la encapsulacin del hongo, la reaccin de defensa del hospedero es relativamente tarda. Dependiendo del grado de desarrollo capsular, las reacciones celulares (granulomas y ocasionalmente necrosis) generalmente aparecen en infecciones avanzadas. Formas clnicas Pese a la ocurrencia ubicua de Cryptococcus neoformans, no es frecuente que se desarrolle una enfermedad clnicamente importante en el hombre. Las manifestaciones ms severas de la micosis y su frecuencia estn asociadas a una seria deficiencia inmunitaria local o sistmica del paciente. Por consiguiente, la criptococosis es ms frecuente en personas con enfermedades como SIDA, Hodgkin, leucemia, linfosarcoma, diabetes mellitus y en pacientes con terapias prolongadas con esteroides. Criptococosis pulmonar. Generalmente, las lesiones pulmonares se encapsulan y sanan. La criptococosis pulmonar crnica ha sido reportada ocasionalmente. Las manifestaciones clnicas no son especficas; los principales signos y sntomas son: tos y escaso esputo mucoide con o sin hemoptisis, febrcula, malestar general y prdida de peso. Un estado inmunolgico deficiente puede determinar el que las levaduras se diseminen silenciosamente a travs del torrente sanguneo a otros rganos, principalmente hacia sistema nervioso central.

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 Criptococosis del sistema nervioso central (SNC). Las manifestaciones corresponden a una meningitis (el cuadro ms frecuente en inmunodeprimidos), meningoencefalitis o lesiones focales con cefalea intermitente. Aunque el resultado usualmente es insidioso y el curso crnico, el paciente puede desarrollar sbitamente vrtigo, cefalea frontal severa, temporal o postorbital y vmito. El curso agudo y severo puede indicar la presencia de lesiones cerebrales de rpida diseminacin. Los datos clnicos corresponden a los de una lesin intracraneal extensa o meningitis cerebroespinal con fiebre elevada, rigidez de nuca (moderada). Cabe mencionar que el meningismo solo es aparente en un 30% de los sujetos. El paciente puede estar irritable o aptico, incoherente o comatoso. Los reflejos de rtula y taln pueden estar disminudos pero algunos pacientes muestran hiperreflexia. Puede estar presente papiledema importante que requiere de frecuentes drenajes espinales para prevenir un dao ptico irreversible. Pueden ocurrir ambliopa, diplopa, estrabismo, nistagmus, fotofobia, neurorretinitis, hemorragia retinal y atrofia del nervio ptico. La duracin de la criptococosis del SNC vara de pocos meses a 15 - 20 aos, aunque el curso usual es rpido y marcado por una deterioracin progresiva. En la mayora de los casos crnicos, hay perodos de remisin y eventualmente se presenta la recurrencia a la enfermedad progresiva. Las lesiones focales por Cryptococcus se manifiestan hasta en1/5 parte de los pacientes con SIDA. Dan lugar a datos de una masa ocupativa, tales como fiebre, dolor de cabeza, convulsiones, hemiparesia y estado mental alterado. Criptococosis cutnea. Cursa generalmente de forma simultnea con una infeccin sistmica y precedida por una infeccin respiratoria, pero existen casos que han sido diagnosticados sin una lesin pulmonar preexistente. Las lesiones cutneas consisten en infiltraciones drmicas que crecen lentamente con contornos a menudo fijos, ocasionalmente fluctuantes, semejantes al eritema nodoso. Los ndulos cutneos ulcerativos de color rojo-azulado que aparecen posteriormente pueden presentar configuraciones muy variadas y tener aspecto acneiforme, como ppulas y pstulas o abscesos subcutneos con superficies irregulares y granulomatosas con ulceracin, presentando a menudo
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infiltracin e induracin. Las lceras pueden ser solitarias o mltiples, en ocasiones con apariencia de carcinoma o goma. Las lesiones en las mucosas no estn consideradas como sitios primarios de inoculacin, a menos que exista linfoadenopata regional, pero es factible la diseminacin hematgena o extensin de una lesin cutnea. Las lesiones mucosas oronasales son nodulares, granulomatosas o lceras superficiales. Criptococosis sea. Las lesiones ocurren en alrededor del 10% de los casos reportados. Se diseminan lentamente sin proliferacin periosteal, pero frecuentemente hay osteolisis con diseminacin a piel por extensin o seguida de una exploracin quirrgica, con multiplicacin del hongo que contribuye a la secrecin de pus. Criptococosis visceral. Cualquier rgano o tejido del cuerpo es susceptible de invasin. Las Lesiones granulomatosas son habitualmente sintomticas, con parecido histolgico a cncer maligno. Las lesiones del ojo incluyen papiledema, uveitis, retinitis y queratitis. La endocarditis es una manifestacin rara. Diagnstico de laboratorio El lquido cefalorraqudeo es el espcimen en donde con mayor frecuencia se hace el diagnstico de criptococosis; sin embargo otros productos como esputo, pus, orina, material fecal y muestras de tejido tambin pueden ser analizados.

Examen directo en fresco con tinta china o nigrosina. El tamao de C. neoformans/C. gattii (4 20 m de dimetro) permite una fcil observacin con tincin negativa, y ayuda a diferenciar al hongo de los linfocitos con los cuales algunas veces es confundido. Este estudio en fresco solo requiere agregar tinta china al producto patolgico, lo que revela una clara aureola, imagen debida a la cpsula, en torno a las clulas de Cryptococcus. Muy ocasionalmente pueden observarse seudomicelios. Ante un examen directo negativo, es de gran utilidad centrifugar el lquido cefalorraqudeo o la orina, a 3000 rpm/10 min, reservando el sedimento para su examen al microscopio y cultivo. El esputo y el pus, pueden mezclarse con una solucin al 10% de hidrxido de sodio antes del examen. En un espcimen apropiadamente preparado, las clulas del pus y desechos celulares digeridos delinean la cpsula, la cual es resistente al hidrxido. En un fragmento de tejido macerado, sin digestin preliminar, la cpsula es prominente.
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Cultivo. Cryptococcus neoformans es fcil de cultivar en los medios convencionales (Sabouraud dextrosa, malta dextrosa, papa dextrosa), adicionados con cloranfenicol y sin cicloheximida. Los cultivos se mantienen a 30C y a 37C, al menos durante una semana. El cultivo levaduriforme es inicialmente blanco, pero posteriormente se torna beige y marrn-amarillo. Si las levaduras poseen grandes cpsulas, esto se ver reflejado en la presentacin de una morfologa colonial de aspecto brillante, mucoide y escurrente; por el contrario, si el material capsular es escaso, la morfologa macroscpica se traducir en colonias secas y opacas. El medio de Nger (Staib agar), es aconsejable como primocultivo, sobre todo en los casos del aislamiento del hongo a partir de especmenes muy contaminados, como esputo o materia fecal. En este medio, las colonias de C. neoformans crecen de color marrn obscuro, distinguibles de otras levaduras como Candida spp, Trichosporon spp o Rhodotorula spp. Cubreobjetos.

Cryptococcus neoformans.
Cultivo agar dextrosa Sabouraud. Imagen: L. R. Castan, Facultad de Medicina, UNAM.

Asa Derecha: Ureasa (+). bacteriolgica.

Imagen: E. Snchez Paredes, UNAM.

Cryptococcus neoformans.

Material. Tinta china (marca Pelikan) o nigrosina (granular). Portaobjetos.

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Equipo. Microscopio. Tcnica.

Muestra biolgica. Cepa de C. neoformans.

Este mtodo se utiliza especialmente para la observacin en fresco de

Cryptococcus neoformans.
1) Colocar una gota de tinta china sobre el portaobjetos. 2) Agregar una gota de material por investigar, que generalmente es lquido cefalorraqudeo o esputo, mezclar con el asa. 3) Colocar el cubreobjetos evitando la formacin de burbujas. 4) Si el material fuera muy espeso, conviene diluir la tinta china con una gota de agua. 5) Observar a 40x.

Observaciones y resultados

Examen directo con tinta china. Se aprecian la cpsula y gemacin de una de las levaduras. As debi de observarse ms que nada la cpsula de C. neoformans, en la tincin realizada. Pero debido a la cepa proporcionada no se logr dicha observacin, ya que tiene tiempo de encontrarse en el laboratorio y eso influye en el hongo.

Conclusiones. Con esta prctica se aprendi a realizar el mtodo de Burri para identificar cpsula(s) del hongo C. neoformans, ms sin embargo, no se lograron ver en la tincin que se practic a la cepa, porque sta ya estaba pasada de tiempo y eso intervino en nuestros resultados.

Bibliografa
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 Mazuelos

Martn,

Estrella

Valverde

Conde,

Anastasio.

Criptococosis: Diagnstico microbiolgico y sensibilidad in vitro. Control Calidad SEIMC.

estudio

de

la

Extrado de: http://www.seimc.org/control/revisiones/micologia/cripto.pdf http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/micologia/criptoc ocosis.html

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