UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

AGUSTN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA
QUMICA

GUA DE PRCTICA
BIOQUMICA APLICADA
AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Moran Medina

AREQUIPA PER
2013

PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Gua de Prctica con el objeto de hacer llegar al

interesado los alcances actuales de la bioqumica aplicada en el laboratorio.
Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano tienen como base el
desarrollo de la biologa molecular, lo que a su vez ha generado el desarrollo de la
bioqumica como consecuencia natural.
La aplicacin de los nuevos conocimientos de la bioqumica han determinado el
gran impulso que la bioqumica aplicada ha dado a la nueva tecnologa de los bioprocesos.
Todos los avances de la biotecnologa tienen como sustento el conocimiento previo
de la biologa y de la bioqumica aplicada.
La presente Gua de Prcticas brinda a los estudiantes de Ingeniera Qumica las
destrezas bsicas para el empleo de los diferentes instrumentos requeridos para el estudio
prctico de la bioqumica.

Los Autores

NDICE

PROLOGO
NDICE
Pgs.
PRCTICA 1

SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS ................ 3

PRCTICA 2

DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS

PROTENAS .................................................................................................................. 11

PRCTICA 3

DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS ....................... 18

PRCTICA 4

CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DILISIS ...................... 25

PRCTICA 5

DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICRO-KJELDAHL ............................. 29

PRCTICA 6

REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS .............................. 34

PRCTICA 7

METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIN. ............................... 40

PRCTICA. 8

INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE

ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA. .......................... 44

PRCTICA 9

EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES ............................................................. 48

PRACTICA 10 DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA ........................ 53

PRACTICA 11 CINETICA ENZIMATICA EN UREASA .................................................................... 59
PRACTICA 12 EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO ................................................... 66

PRCTICA 1
PRCTICA 1

SEPARACIN EN CAPA FINA

SEPARACIN EN CAPA FINA
DEUNA
UNAMEZCLA
MEZCLADE
DEAMINOCIDOS
AMINOCIDOS
DE

I.

OBJETIVO:
Aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina para la identificacin de aminocidos
presentes en una muestra biolgica.

II. FUNDAMENTO TERICO:

AMINOCIDOS
Los aminocidos son las unidades estructurales de las protenas.
Por lo tanto, si a una determinada protena se le somete a una hidrlisis ya sea cida o
alcalina; ste proceso rendir una mezcla de sus aminocidos constituyentes, los cuales
pueden ser susceptibles de ser analizados o identificados por mtodos cromatogrficos.
Todas las protenas son polmeros y los monmeros que se cambian para
formarlos son los a -aminocidos.

Los diferentes aminocidos se diferencian por sus cadenas laterales.

In vivo el pH fisiolgico es prximo a la neutralidad.
El pKa de los grupos carboxlo y amino de los alfa -aminocidos es
aproximadamente 2 y 10 respectivamente.
Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habr
perdido un protn y el grupo amino habr captado un protn para dar la
forma ZWITTERION.
En los genes, de todos los organismos estn codificados 20 aminocidos
que se incorporan a las protenas.
Todos los aminocidos son enantimeros (L)
Existen otros aminocidos (no proteicos) y tambin hay aminocidos
modificados que se hallan en las protenas.
La variedad de las cadenas laterales (hidroflicas, hidrfobas, cidas, bsicas,
neutras) permite una gran complejidad funcional en las protenas.
CROMATOGRAFA
Mtodo de Separacin
Permite separar, aislar e identificar componentes
relacionados presentes en mezclas complejas.

estrechamente

En estos mtodos se emplea:

- Fase estacionaria

: Slido/lquido

- Fase mvil

: liquido/gas

Los componentes de una mezcla se transportan a travs de una fase

estacionaria por medio de una fase mvil que fluye.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migracin entre
los componentes de la muestra.
Cromatografa en Capa Fina
Tiene 2 partes: Fase mvil y Fase estacionaria.
El soporte o Fase Estacionaria.
Es un slido poroso capaz de retener solvente y slido pueden ser.

El soporte poroso est adherido a la base, est pegado gracias a la presencia de

SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de slica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de la
migracin de muestra o estndares esta marcha ya no es verde sino violeta.
III. PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
Se siembra los estndares y la muestra con un capilar bastante fino.
Tener precaucin de que en el sembrado se intenta tener una mancha entre
1 y 2 mm de dimetro.
La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm
aproximadamente.

Segundo Proceso: Elusin

Una vez sembrada la muestra se procede a la fase mvil con la ayuda de un
solvente de elusin.
Para ello se coloca dentro de una cmara de elusin

El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra.

El solvente comienza a subir por capilaridad.
Las muestras se comportan diferente segn el solvente utilizado y sus
componentes algunos migrarn rpidamente otros no.
Tercer Proceso: Visualizacin o Revelado
El producto puede verse:
Por s mismo porque tiene color.
Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista.
Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna dnde est la mancha dando
coloraciones amarillas profundas.
Usando mtodos qumicos, usando una sustancia qumica como revelado, ( en este
caso ninhidrina en butanol)

Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en funcin de su factor de retardo RF

que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia

patrn en idnticas condiciones.
La razn de estas distancias se designa por Rf
IV. PARTE EXPERIMENTAL:
Sembrado de estndares de aminocidos y muestras
Corrida cromatogrfica. Elusin
Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
Tapar hermticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separacin
cromatogrfica, hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la parte
superior de la placa.
Revelado del cromatograma
-

Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.

Destapar la cmara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa con
ayuda de una secadora de cabello.

Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol sobre la placa. Secar
la placa con una secadora.
7

 Identificacin
Luego proceder a identificar las manchas existentes que debern corresponder a
aminocidos para ello se debern hacer los clculos de los Rfde los estndares y luego
los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reaccin que identifica aminocidos a travs de una coloracin
azul violeta.
V. CUESTIONARIO:
5.1.

Haga un esquema de los resultados observados.

5.2.

Calcular los Rf de los estndares y muestras.

5.3.

Identificar que aminocidos estn presentes en las muestras problemas.

5.5.

Qu es la cromatografa de exclusin molecular y la cromatografa de intercambio

inico y cules son sus aplicaciones.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________

5.6.

Qu mtodos existen para el anlisis de aminocidos de las protenas.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.7.

Indicar tipos de solventes de elusin para la fase mvil tanto para silica y almina.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.8.

Haga el mecanismo de reaccin de la Ninhidrina con los aminocidos.

5.9.

La cromatografa en capa fina separa las sustancias segn su peso molecular.?

Fundamente.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

VI. OBSERVACIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
VII. CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

10

PRCTICA2
PRCTICA 2

DETERMINACIN
DE LAS PROPIEDADES
DETERMINACIN
DE LAS PROPIEDADES
QUMICAS DE LAS
PROTENAS

QUMICAS DE LAS PROTENAS

11

I.

OBJETIVOS:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir y demostrar de manera
cualitativa las propiedades qumicas de las protenas en base a los siguientes aspectos:
Solubilidad de las protenas.
Las propiedades electroqumicas de las protenas.
El efecto cido-bsico en la solubilidad de las protenas.

II. PRERREQUISITOS:
1. Salting In y Salting Out.
2. Agentes precipitantes de protenas.
3. Propiedades fisicoqumicas del agua.
4. Ecuacin de Henderson-Hasselbach.
III. INTRODUCCIN:
Se considera a las protenas como polmeros biolgicos de aminocidos. En las protenas
existen 20 tipos de aminocidos diferentes los cuales estn en un nmero y secuencia
determinados por el cdigo gentico.
Con respecto a su tamao, las protenas van desde un peso molecular de 6000 Dalton
hasta varios millones de Dalton con una considerable variacin de formas y estructuras.
Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la ms
simple la estructura primaria y la ms compleja la estructura cuaternaria cuya
conformacin depende de diferentes fuerzas qumicas de atraccin y repulsin que son
ejercidas sobre la estructura molecular de la protena y por lo tanto son responsables de
su estabilidad.
Por convencin se acepta dividir a las protenas en dos grupos: protenas simples y
conjugadas, las cuales presentan diferencias en sus propiedades qumicas y fsicas. Sin
embargo, para los fines que se persiguen en esta prctica se les mencionara en forma
general.
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena son: La fuerza inica del
medio, el pH. la temperatura y la constante dielctrica del solvente. Cuando hay un
cambio de cualquiera de estos factores, la protena responde con una intensidad
proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una manera
superficial o lo hace tan drsticamente que desnaturaliza a la protena. Por fortuna, en
nuestro organismo, la variacin de tales factores es mnima por lo que son
imperceptibles los cambios en la protena.

12

IV. MATERIAL:
13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm
1 pipeta de 10 ml
5 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 5 ml
1 gradilla
V. METODOLOGA:
En esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en protenas que se
encuentran en el organismo, mediante la modificacin las propiedades de los solventes,
para establecer una relacin con los efectos que se pueden presentar en el organismo.
Fundamento Qumico:
Las protenas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH de la solucin
en la cual se encuentran; cuando se neutralizan, se presenta precipitacin proteica.
La adicin de una sal a una solucin proteica modifica la constante dielctrica del
solvente permitiendo una mayor solubilidad de la protena. Sin embargo, cuando se
aade exceso de una sal, se neutralizan las cargas de la protena y sta tiende a precipitar.
Este mismo efecto ocurre al aadir sales metlicas cargadas electropositivamente. Con la
adicin de un cido o una base a una solucin proteica se alcanza un estado en que hay
el mismo nmero de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la
protena y tiende a precipitar. El pH que determina el nmero igual de cargas de signos
opuestos se denomina punto isoelctrico.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido.
Preparar una solucin de caseinato de sodio, tomando 250 mg de casena, 20 ml de agua
destilada y 5 ml de NaOH 1N. Cuando la solucin sea perfecta, se agregan 5 ml de cido
actico 1 N. Mezclar bien, diluir a 50 ml con agua destilada. Si la solucin no est
suficientemente clara, se puede filtrar.
Preparar los siguientes tuboscomo se indica a continuacin
Tubo pH Agua
destilada
1
8.38
2
7.75
3
8.75
4
8.5
5
8.0
6
7.0
7
5.0
8
1.0
9
7.4
10
5.8

Ac. Actico
0.01N
0.62
1.25
0
0
0
0
0
0
0
0

Ac.
Actico 0.1
0
0
0.25
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
0
0

Ac. Actico
1.0N
0
0
0
0
0
0
0
0
1.6
3.2

Caseinato
de Sodio
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

13

Mezclar bien , esperar 30 minutos y observar los cambios que presente la solubilidad
de la casena en cada tubo. Reportar el punto isoelctrico correspondiente al tubo donde
se presenta la mayor precipitacin.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de Hendersosn-Hasselbach.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido.
Tubo
pH
Solubilidad
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Cul es el punto isoelctrico de la protena ?
____________________________________________________________________
VI. CUESTIONARIO:
6.1.

De qu factores depende la solubilidad de una protena en el agua.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.2.

Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la adicin de un cido

o una base fuerte.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

14

6.3.

Explique cmo afecta un cambio en la constante dielctrica del agua a la

solubilidad de una protena.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.4.

Qu es el Salting in y qu tipo de compuestos pueden promoverlo.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.5.

Qu es el Saltingout y qu tipo de compuestos pueden promoverlo.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.6.

Qu relacin existe entre el punto isoelctrico y la solubilidad de una protena.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.7.

Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en que casos est indicado

utilizarse.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

15

6.8.

Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le permiten interaccionar

y transportar cualquier compuesto incluyendo hidrofbicos a travs de un medio
acuoso.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

VII. OBSERVACIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
______________________________________________________
VIII. CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
16

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
IX. BIBLIOGRAFA
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

17

PRCTICA 3
DETERMINACIN
PRCTICA 3

ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS
DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE
PROTENAS

18

I.

OBJETIVO
Determinar la concentracin de una solucin de protenas mediante la reaccin de
Biuret y el espectrofotmetro.

II.

FUNDAMENTO:
La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin
del Biuret. El reactivo Biuret contiene CuSO4 en solucin alcalina. La reaccin se
basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de
un complejo de coordinacin entre los iones Cu (+2) y los pares de electrones no
compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.

Los compuestos que contienen 2 o ms enlaces peptdicos producen un color

violeta
caracterstico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO4) en solucin
alcalina.
El color se debe al compuesto de coordinacin formado al existir enlaces qumicos
entre los pares de electrones libres del tomo de nitrgeno presente en los enlaces
peptdicos de las cadenas proteicas con el ion cobre.
Los espectros de absorcin de los complejos entre los iones de Cu+2 y las
diferentes protenas son similares pero no idnticas por lo tanto, se puede utilizar
una protena como patrn de calibracin. La curva de calibracin obtenida por
este mtodo, se har utilizando como patrn solucin de extracto de levadura, cuya
concentracin es de 8 mg/ml preparada con agua destilada.
Espectrofotometra. Principios bsicos
La reaccin de biuret es cuantificable, es decir a mayor concentracin de protenas,
mayor intensidad de color violeta, estas reacciones en las que el color formado es
proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimtricas.

19

Midiendo la intensidad de color se podra conocer la concentracin de la sustancia

que lo produce. Para ello se aplican tcnicas fotomtricas, empleando un aparato
llamado colormetro (si mide slo un determinado color) o espectrofotmetro (si
realiza una medida de todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiacin electromagntica, que se propaga de forma
ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas se diferencian unas de otras por
sus longitudes de onda que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones
comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arcoris, de
tal forma que cada color corresponde a una radiacin con una longitud de onda
especfica. El espectrofotmetro dispone de una lmpara que emite luz
monocromtica, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la
muestra coloreada a medir, y de un detector, que medir la cantidad de luz que no
es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizar la
radiacin de longitud de onda a la que absorba ms cantidad de luz ( a la longitud
de onda de mxima absorbancia).
Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fraccin de luz incidente
que es absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin de soluto y al
espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre luz incidente (Io) y la
reflejada (I) dar una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absdorbida por la
muestra. Esto es lo que se denomina Absorbancia (Abs)DensidaOptica (DO)
Laley de Beer-Lambert se formula como:
Abs (DO) =e x C x 1
Siendo e el coeficiente de extincin molar (especfico para cada sustancia a una
longitud de onda y en unas condiciones determinadas (M-1, cm-1), C es la
concentracin de la muestra a medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayora de
los espectrofotmetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor, por lo
que 1 se puede ignorar. As la concentracin desconocida de la sustancia ser:
C = Abs /e

20

III. MATERIALES Y EQUIPO

Espectrofotmetro
Gradilla para tubos de ensayo
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado
Probetas, Pipetas
Materiales: extracto de levadura, reactivo biuret
IV. PROCEDIMIENTO
Realizacin de una curva patrn: Como se desconoce el coeficiente de extincin
molar () de las protenas coloreadas con el reactivo biuret, se proceder a construir
una curva patrn, midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones
conocidas de protena, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solucin
problema y determinar su concentracin grficamente y tambin por regresin lineal.
Para ello se dispone de una solucin de 10 mg/ml de protena (extracto de levadura) a
partir de ella se realizan diluciones conocidas aplicando la frmula:

Ci x Vi = Cf x Vf
Dnde:
Ci = concentracin de la solucin madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solucin madre inicial
Cf= concentracin final de la solucin a preparar
Vf= volumen total final de la solucin a preparar
En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solucin madre (Ci=10 mg/ml) las
soluciones de la tabla.

21

Conc.
Final.Sol.a
preparar
Tubo
Blanco
1
2
3
4
5
6
7
8
Muestra

Volumen Volumen
agua
Rx.Biuret

Volumen Abs.
Final
570nm

Mg/ml

Volumen
Sol.
Madre
inicial
ml

ml

ml

ml

0,0

4,0

0,5

3,5

1,0

3,0

1,5

2,5

2,0

2,0

2,5

1,5

3,0

1,0

3,5

0,5

4,0

0,0

4,0

0,0

Al aadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la absorbancia.

Medicin de la absorbancia en el espectrofotmetro:
a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de mxima absorbancia para la
reaccin del biuret)
b) Poner en la cubeta del espectrofotmetro el contenido del tubo blanco, secarla y
limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotmetro.
c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.
d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia de las soluciones
de los otros tubos, comenzando por el de menor concentracin.
e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo muestra.
f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0), se construye una
recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de abscisas
y las Abs. en las ordenadas.
g) Interpolar la Abs de la protena problema en la grfica y calcular su concentracin.
h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin y
que la relacin es lineal: Y = a + b X
(Y = A + B x Conc.). Utilizando
regresin lineal se obtiene el valor de los coeficientes A y B y se puede despejar
concentracin que en este caso es de la muestra desconocida.

22

V.

5.1

CUESTIONARIO
Cul es la concentracin de protenas de la muestra?

5.2

Se podra determinar la concentracin de cualquier muestra de protenas con

esta curva patrn?

5.3

Los aminocidos y los dipptidos daran positiva la reaccin del Biuret?

5.4

Investigue si existe alguna protena en la que no est presente ninguna

aminocido con anillo bencnico en su cadena lateral, e indique que
consecuencias tendra sobre la determinacin espectrofotomtrica

23

VI.

OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________________________________

VII.

CONCLUSIONES

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________
VIII. BIBLIOGRAFA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

24

PRCTICA 4

PRCTICA4

CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR

DILISIS DE EXTRACTOS
CONCENTRACIN

PROTEICOS POR DILISIS

25

I.

OBJETIVO
Aumentar la concentracin de las protenas en un extracto o solucin que las
contenga.

II. FUNDAMENTO
La dilisis es una tcnica que separa las molculas de acuerdo a su tamao usando
membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las
macromolculas que se deseen separar como las protenas, los poros permiten la
difusin de las molculas de solventes, sales y otras molculas pequeas, pero
bloquean el paso de protenas por su gran tamao.
Se usan membranas de celofn (acetato de celulosa), nitrocelulosa, colodin, u otras de
naturaleza semipermeable.
Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusin por diferencia de
concentracin.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
01 pliego de papel celofn.
1Kg de azcar.
Solucin de extracto proteico al 0.5%.
Pipeta de 10 ml.
Vaso de precipitados.
Piceta.
IV. MTODO
Preparar una bolsa con el papel celofn, de modo que no se presenten fugas al
llenarla con una solucin.
Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solucin de protena al 0.5%.
Comprobar la concentracin de protena con el espectrofotmetro a 280 nm.
Llenar la bolsa de celofn con 50 ml de solucin proteica, usando para tal fin la
pipeta de 10 ml., y sellar luego la bolsa de modo que no presente fugas.
Preparar un tazn con azcar, y colocar all la bolsa de celofn conteniendo la
solucin proteica.
Untar toda la bolsa de celofn, con el azcar, cubrindola por completo.
Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azcar, observando los cambios
ocurridos.
Medir el volumen de lquido que qued en la bolsa de celofn y comparar con el
volumen inicial.
Mediar nuevamente la concentracin de protenas en el espectrofotmetro a 280
nm.

26

V. CUESTIONARIO
Seale las principales tcnicas de separacin de solutos por membrana, y las
principales aplicaciones de cada una de ellas.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________
Investigue la composicin qumica de la membrana utilizada y explicar las
razones de su porosidad.
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______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________
Efecte los clculos de variacin en el volumen y la concentracin de la protena
en solucin.

Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de solventes por osmosis.

______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de solutos por difusin
debida a diferencias de concentracin.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
VI. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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___________________________________________________________________
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___________________________________________________________________
_____________________________________________
VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________
VIII. BIBLIOGRAFA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

28

PRCTICA 5
DETERMINACIN DE PROTENAS POR
PRCTICA 5
MICRO-KJELDAHL
DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICRO-KJELDAHL

29

I.

OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de protenas totales en una muestra
desconocida.

II. FUNDAMENTO
El mtodo de micro-kjeldahl es una simplificacin hecha por HACH en el proceso
Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo anlisis en un tiempo corto y con pequeas
muestras.
Se funda en la transformacin del nitrgeno presente en las protenas a nitrgeno
inorgnico. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por accin del cido sulfrico en presencia de
oxidantes fuertes (perxido de hidrgeno), de esta manera todo el carbono
presente se libera como CO2 y nitrgeno como NH3, luego este se combina con
el exceso de cido sulfrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la accin de un lcali
fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe en una solucin de cido dbil en
presencia de colorante indicador.
3. En la tercera se titula la solucin con un cido fuerte cuantificando el nitrgeno
presente.
Luego se aplica la relacin siguiente:
%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
dnde: ml.N.fc.meq = peso de nitrgeno en la muestra
ml = gasto de cido sulfrico en la titulacin (ml)
N. normalidad del cido
Fc. Factor de correccin del cido
meq.= peso del miliequivalente del nitrgeno
Suponiendo que la muestra solo contiene protenas simples con 16% de N, el
porcentaje de protenas ser:
Protena = 6.25xN
III. PROCEDIMIENTO
El proceso de determinacin se hace en tres etapas:
DIGESTIN.
Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es slido) y colocar en el matraz
de digestin
Agregar 4 ml de cido sulfrico concentrado al matraz
Verificar que el control automtico del digestor este en 440C y que haya
succin en la columna de fraccionamiento.
Digerir la muestra por 4 min despus de haber alcanzado la temperatura
indicada.
30

 Aadir 10 ml de perxido de hidrgeno al 50% a la muestra a travs de un

embudo de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna
incoloro, aadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se aclare.
Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la columna de
fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se
haya enfriado.
Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.
DESTILACIN
El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un baln de destilacin.
Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de cido borrico al 4% (
en volumen) adicionndole indicador azul de metileno y rojo de metilo,
dando una coloracin violeta.
El baln de destilacin que contiene el digesto se aade 13 a 15 ml de
hidrxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc.
Conectar el equipo de destilacin y destilar el digesto durante unos 10 a 20
min (hasta que el vaso receptor tenga una coloracin verdusca y su volumen
sea ms o menos 3 veces del volumen inicial)
TITILACIN.
Preparar una solucin de cido sulfrico 0.1 N y valorizarla.
Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta
IV. CUESTIONARIO
Explique la diferencia entre protenas simples y conjugadas.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
________
Indique ejemplos y estructuras primarias de dos protenas simples y dos protenas
conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el proceso
de determinacin del nitrgeno

31

Efectu los clculos y determine el contenido de protenas en la muestra

Indique que tipo de enlaces de una protena se rompen durante la etapa de digestin

Explique el objetivo de la etapa de destilacin.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
Explique porque la titilacin se hace con cido sulfrico y no con un lcali.
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___________________________________________________________________
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V. OBSERVACIONES
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___________________________________________________________________
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___________________________________________________________________
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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32

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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
VI. CONCLUSIONES
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___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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VII. BIBLIOGRAFA
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___________________________________________________________________
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33

PRCTICA 6
PRCTICA 6

REACCIONES
DE IDENTIFICACIN DE
REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
CARBOHIDRATOS

34

I.

OBJETIVOS:

Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos.

Diferenciar experimentalmente monosacridos, disacridos y polisacridos.
Familiarizarse con la clasificacin de los hidratos de carbono en reductores y no
reductores.
Estudiar las propiedades del almidn.

II. FUNDAMENTO TERICO:

Se denominan carbohidratos o glucsidos los derivados aldehdicoscetnicos, reales o
potenciales de alcoholes polivalentes o sus productos de condensacin segn la
cantidad de glucsidos o azcares sencillos que se obtengan por hidrlisis de los
policarbohidratos.
Se les clasifica como:
Polisacridos (celulosa, almidn)
Trisacridos (rafinosa)
Disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacridos
Los monosacridos por el grupo carbonilco pueden ser aldosas o cetosas por el.
nmero de tomos de oxigeno, pueden ser hexoaas (glucosa, galactona, manosa,
fructosa), pentosa (arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).
Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones carbonilo y oxhidrilo
y, adems, algunas especficas. Todos son ptimamente activos. Por el calor y la accin
de cidos fuertes se deshidratan, dando en algunos casos derivados del furfural.
Los hidratos de carbono ms abundantes de la bisfera estn constituidos por el
almidn y celulosa que son polmeros de glucosa presentes en plantas.
El almidn est distribuido ampliamente en las plantas que lo almacenan en granos y
en tubrculos como reserva alimenticia para el momento de la germinacin. Todos los
tipos de almidn producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de indicador
cualitativo sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidn.
La hidrlisis del almidn catalizada por cidos lo convierte en varias clases de
dextrinas, en maltosa y por ltimo en D (+) glucosa.
El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrlisis puesto que la
coloracin va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular
delcompuesto orgnico.
Los grupos funcionales existentes en el almidn y en la celulosa son los grupos
hidroxilo y acetal. Estos polisacridos tienen diferente configuracin, siendo el
almidn un glucsido y la celulosa un f -glucsido. Tambin difieren en el tamao
teniendo lacelulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del almidn.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Reactivo Molisch

Tubos de ensayo

Reactivo Fehling

Pipetas

Reactivo Tollens

Bao de agua hirviente

Reactivo Seliwanoff

Pinzas
35

 Reactivo Barfoed

Bao hirviente

Sol. glucosa 1%

Vaso de precipitados

Sol. fructuosa 1%

Luna de reloj

Sol. sacarosa 1
Sol. lactosa 1%
Sol. almidn 1%
Sol. sacarosa 5%
Sol. HCl

10%

Sol. NaOH 10%

Sol. yodo - yodurado
IV. PROCEDIMIENTO:
Reacciones genricas de los carbohidratos
Reaccin de Molisch
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una solucin de glucosa
al1%, 1 ml. de solucin de fructuosa o levulosa al 1%, 1 ml. de una solucin de
sacarosa al 1%, 1 ml. de una solucin de lactosa al 1%, 1 ml. de una solucin de
almidn al 1% y en el ltimo 1 ml. de agua (testigo). A cada una agrguele 2 gotas
de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes 2 ml. de
cido sulfrico concentrado.
Observe el color violceo del anillo formado en la interfase entre los dos lquidos.
Anote aquellas soluciones que den positiva la prueba.
Reacciones Especficas
Reacciones de Fehling
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solucin A de Fehling con
0.5 ml. de la solucin B de Fehling, agrgueles 1 ml. de la solucin de los
carbohidratos utilizados en el experimento anterior.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay cambios de color,
formacin de precipitados.
Reaccin de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de Tollens
recientemente preparado, aadir a cada uno 2 ml. de las soluciones de
carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay formacin de espejo de
plata y cuales carbohidratos dan negativa esta reaccin.
Realice una comparacin de estos resultados con los de la prueba de Fehling.
Reaccin de Seliwanoff
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff, luego aada 3 gotas
de solucin de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los tubos a
bao hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color adquirido.
36

 Reaccin de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego aada 1 ml. de
solucin de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a
bao hirviente y observar la formacin de un precipitado de color rojo ladrillo, lo
que indicar la presencia de monosacridos.
Los disacridos tambin precipitan xido cuproso, pero muy lentamente.
Hidrlisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solucin de sacarosa al 5%, llvelos a bao
hirviente y a cada tubo aada volmenes iguales de agua para el primer tubo,
cido clorhdrico al 10% en el segundo tubo, e hidrxido sdico acuoso al 10% en
el tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuacin la reaccin de
una porcin de cada mezcla con la solucin de Fehling. Qu conclusiones
deduce?
Ensayo del Almidn frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solucin de almidn al 1%, aada una gota
de solucin de Iodo - lodurada, observe el color de la solucin. Luego caliente la
solucin coloreada a ebullicin y observe el efecto, observe tambin qu efecto
produce el enfriamiento de la solucin.
Hidrlisis del Almidn
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solucin de almidn al 1%, aada 1
ml de cido dorhdrico concentrado. Hierva la solucin y retire muestras de Y ml.
a intervalos prximos, ensayando su reaccin frente al iodo. Anote el color en los
diferentes ensayos.
Cuando la solucin ya no produzca coloracin con el iodo, neutralcela y ensaye la
reaccin de una muestra frente al Fehling. Formule estructuralmente los
productos finales de la hidrlisis del almidn (un disacrido y un monosacrido).
V. CUESTIONARIO:
5.1. Indique la composicin de los reactivos utilizados en la prctica (R. Molish, R.
Seliwanoff, R Barfoed, R Fehling).

37

5.2. Elabore un diagrama de flujos del proceso de produccin de la glucosa a nivel

industrial.

5.3. A qu se debe la coloracin azul del iodo sobre las muestras de almidn?
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________
5.4. Cmo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrlisis del almidn?
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______________________________________________________________
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VI. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
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VII. CONCLUSIONES
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___________________________________________________________________
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VIII. BIBLIOGRAFA
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39

PRCTICA 7
METABOLISMO
DE CARBOHIDRATOS:
PRCTICA 7
FERMENTACIN.
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIN.

40

I.

OBJETIVOS
1) Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular anaerbica
(fermentacin) en levaduras.
2) Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la respiracin celular.
3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no
competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH e inhibidores en la
interpretacin de sus resultados.

II. ACTIVIDADES
Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede
medir la fermentacin por la produccin de CO2.
III. PROCEDIMIENTOS.
3.1. Complete la siguiente batera de tubos:
Tubos

Suspensin de 1 ml
levadura 7%

1 ml

1 ml

1 ml

Sol. Glucosa

1 ml

1 ml

1 ml

Sol. NaF

1 ml

Agua
2 ml
destilada(43C)

1 ml

Sol.Rojo
Neutro

1 ml

Agitar por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo.

3.2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionndolo girar
rpidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Marcar el
nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elstico los
4 frascos, ponerlos a incubar en un bao de agua a 43C.
3.3. Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solucin en el tubo y mida el
volumen de gas producido con una pipeta con agua.
3.4. Cul es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH.
3.5. Anote y discuta sus resultados.

41

Soluciones:
1.

Solucin de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de agua

destilada a 43C y completar a 100 ml con agua destilada a 43C.

2.

Solucin de glucosa 0,1 M

3.

Solucin de NaF0,1 M

4.

Solucin rojo neutro 0,02 M

Papel pH.
IV. OBSERVACIONES
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___________________________________________________________________
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V. CONCLUSIONES
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___________________________________________________________________
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VI. BIBLIOGRAFA
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43

PRCTICA. 8
INMOBILIZACION
PRCTICA. 8 DE ENZIMAS Y
CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL POR
INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL
POR SACCHAROMYCES
cerevisiae INMOVILIZADA.cerevisiae
SACCHAROMYCES
INMOVILIZADA.

44

I.- OBJETIVOS
1) Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
2) Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
3) Evaluar por refractometra el grado alcohlico del producto de la fermentacin
II.- ACTIVIDADES
Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede
medir la fermentacin por la produccin de CO2 y por la concentracin del producto
formado o por la disminucin de la concentracin del sustrato (en grados Brix)
III.- MATERIALES.
- Material biolgico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas
- Reactivos: Agar-agar, solucin de glucosa 5%
- Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodrmicas de 20cc, esptulas, picetas,
papel toalla.
- Equipos: Balanza, refractmetro, bao mara.
IV.- PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento de materiales:
Solubilizar la levadura comercial de panificacin en 50 ml de agua destilada.
En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada, con calentamiento y
agitacin constante.
Calibrar el bao de mara a 40C, para mantener dentro del agar licuado.
Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en refrigeracin
(aproximadamente 4C), por 30 minutos.
Inmovilizacin de la enzima:
Mezclar 50 ml de la suspensin de levaduras y 50 ml de agar agar licuado y homogenizar.
Tomar con una hipodrmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar caer gota a gota en
la probeta que contiene el aceite vegetal refrigerado.
Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios
suaves.
Secar los pellets en papel toalla.
Obtencin del mosto de uva:
Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.
Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
Tomar una alcuota y leer los grados brix o porcentaje de azcar en el refractmetro.
Obtencin de etanol:
Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de uva, (o 50ml de una
solucin de glucosa al 5%). To0mar una alcuota, considerando la muestra a tiempo cero y
leer los grados brix o porcentaje de azcar en el refractmetro.
Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alcuotas cada 15 minutos. Leer los grados brix en
el refractmetro para cada alcuota.
45

V .- CUESTIONARIO.
1.-Indique la importancia de la inmovilizacin de enzimas y/o clulas.
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_____________________________________________________________________________________

2- Cul es el fundamento de la inmovilizacin de levaduras en agar?.

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_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

3.- Explique las caractersticas coagulantes del agar-agar.

_____________________________________________________________________________________
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_____________________________________________________________________________________

4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las clulas de levadura, si estas
estn atrapadas en la matriz de agar-agar.
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5- Presente al menos un caso detallado de aplicacin de la inmovilizacin de enzimas.

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_____________________________________________________________________________________

6- Qu otros mtodos para la inmovilizacin se utilizan?

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VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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______________________________________________________________________
VI.- CONCLUSIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
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VIII.- BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
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47

PRCTICA 9
PRCTICA 9

EXTRACCIN
DE ENZIMAS
EXTRACCIN
DE ENZIMAS VEGETALES
VEGETALES

48

I.

OBJETIVO.
Extraer la enzima Ureasa de la cscara de frejol y comprobar su actividad cataltica.

II. FUNDAMENTO.
Las enzimas son protenas con accin cataltica.
Las protenas se encuentran en el interior de las clulas en un estatus particular, a pH
fisiolgico, y con estructura nativa estabilizada por diversas mezclas de sustancias.
La extraccin de enzimas debe realizarse de modo que conserven las caractersticas
estructurales y las propiedades funcionales de las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad uresica, debido a la enzima
ureasa presente en la cscara.
La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato rea provoca la hidrlisis de esta con la
consiguiente liberacin de amoniaco y anhdrido carbnico, segn la siguiente
reaccin.
O=C

NH2

+ H2O ----------

2NH3 + CO2

NH2
La actividad uresica se puede comprobar haciendo reaccionar el amoniaco liberado
con el Reactivo de Nessler (K2Hg14). Este reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y
Potasio, que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de color
amarillo-anaranjado (complejo cuya frmula se supone sea HgONH 2I), cuya
intensidad de color puede medirse a longitudes de onda de 405 a 420 nm.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
150 gr. De cubierta de frejol, solucin de rea0.3 M, agua destilada
Buffer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
Espectrofotmetro, Bao Mara, Balanza, Equipo de filtracin, papel filtro,
Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de ensayo de 10 ml. Baln de
500ml. Vaso de precipitados de 500 ml.
IV. PROCEDIMIENTO.
Extraccin de la Enzima.
Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua hervida fra) ,
despus de 24 horas remover la cscara por friccin, y proceder a escurrir el
agua.
Preparar 200 ml. De buffer fosfato de sodio 0.005 M.( PO4HNa2) , y 200ml.
De solucin EDTA 0.001 M. Usando en ambos casos agua destilada fra,
mezclar ambas soluciones, y enfriar a 4C. En un baln de 500 ml.
Pesar 20 gr de cscara de frejol y colocarlo en un vaso de precipitados de 500
ml.
Agregar 90 ml. De buffer fosfato previamente preparado, y licuar cuidando
se mantenga baja la temperatura.
Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De agua destilada.
49

 Centrifugar la suspensin a 14,000 g. Por 10 min. o pasar la solucin por un

filtro rpido y enjuagar el papel filtro con 10 ml. De agua destilada.
Separar el sobrenadante y medir el volumen final del extracto obtenido, llevar
a refrigeracin.
Preparar un cuadro de resultados.
CASCARA BUFFER AGUA EXTRACTO FINAL (ml)

Determinacin de
espectrofotometra.

presencia

de

protenas

en

el

extracto

por

Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de reactivo biuret.

Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1 ml de agua y 4 ml de
reactivo biuret.
Calibrar el espectrofotmetro y leer la absorbancia a 570 nm. Para comprobar la
presencia de protenas.
Anotar la lectura de Absorbancia.
Comprobacin de La actividad enzimtica.
Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro
como tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M y 1.5 ml de
buffer fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de agua, al tubo
blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por 15 min.
Despus de incubar los tubos, adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5
ml a cada tubo. Volumen total 8 ml.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Calibrar el espectrofotmetro a 420 nm.
Medir la absorbancia. La muestra de extracto dar coloracin y un alta
absorbancia por el amoniaco liberado.
V. CUESTIONARIO.
Explique por qu es necesario licuar la cscara durante la extraccin de la enzima
ureasa.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
50

Diga que pruebas se tienen de haber extrado realmente enzimas vegetales.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
Haga los clculos de reactivos para las soluciones que se prepararon.

Explique el papel que juegan en la extraccin el buffer fosfato y la refrigeracin.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
____________
Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extraccin utilizado en laboratorio.

VI. OBSERVACIONES
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
51

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________
VII. CONCLUSIONES
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________
VIII.

BIBLIOGRAFA
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________

52

PRACTICA 10
PRACTICA 10

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA

ENZIMATICA EN UREASA

53

I.

OBJETIVO
Determinar la capacidad cataltica o actividad enzimtica de la enzima ureasa.(enz.
Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)

II. FUNDAMENTO.
La actividad enzimtica (U) es la expresin del poder cataltico de la enzima y se
obtiene midiendo la velocidad de la reaccin que cataliza.
La actividad enzimtica (U) se define como la cantidad de enzima contenida en 1 ml
de solucin que transforma o produce 1 mg de sustrato producto por minuto
medidas en las condiciones optimas de operacin de la enzima.
La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en el
organismo humano. Algunas fuentes comunes son las bacterias, o la cscara de frejol.
La ureasa cataliza la descomposicin de la rea segn la reaccin:
CO

NH2

+ H2O

2NH3 + CO2

NH2
La velocidad de una reaccin enzimtica como la velocidad de cualquier reaccin
puede ser determinada midiendo:
1. la cantidad de sustrato transformado en un determinado tiempo de reaccin
2. la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reaccin catalizada por ureasa se puede hacer el ensayo midiendo la
cantidad de urea en el tiempo, o midiendo cualquiera de los productos (CO2 NH3)
producidos en un tiempo determinado.
Por facilidad se medir la cantidad de amoniaco formado, lo cual se hace por medios
espectrofotomtricos utilizando el reactivo Nessler que es un ioduro doble de
mercurio y potasio que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un
complejo de color anaranjado castao.
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH

HgONH2I + 7KI + 2H2O

La intensidad del color formado ser directamente proporcional a la cantidad de

amoniaco presente en cada tubo y se medir la absorbancia de cada tubo a 420 nm
(filtro morado).
III. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
Materiales.
Preparar 50 ml de solucin de urea 0.3 M.
Preparar 100 ml buffer fosfato 0.05M de pH=7.4, con EDTA 0.001M
Reactivo Nessler.
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH, 7.4 ( a 4C)
100 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M (5x10-4milimoles/ml)
Material de vidrio.
02 fiolas de 50 ml.
54

 02 fiola de 100ml.
08 tubos de ensayo.
01 gradilla para tubos.
01 espectrofotmetro.
bao de hielo.
Incubadora a bao mara.
Determinacin de la curva de calibracin.
Se preparan en los tubos de ensayo soluciones de sulfato de amonio segn la tabla
siguiente:
Patrn Concentracin SO4(NH3)2 ml
de Buffer Nessler Volumen Absorbancia
N
(NH3) mol/ml nmol/ml
SO4(NH3)2 (ml)
(ml )
final ml
420 nm.
Blanco 00

0.0

0.0

7.50

0.5

8.0

5.0

0.01

7.49

0.5

8.0

10

0.02

7.48

0.5

8.0

15

0.03

7.47

0.5

8.0

20

0.04

7.46

0.5

8.0

25

0.05

7.45

0.5

8.0

30

0.06

7.44

0.5

8.0

Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o curva de

calibracin.
Medida de la actividad ureasica.
Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como
tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M y 1.5 ml de buffer
fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solucin de ureasa y 4.8 ml de agua, al tubo
blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por 15 min.
Despus de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubacin e introducir en bao
de hielo para detener la reaccin.
Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo). Volumen total 8
ml, agitar.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Leer la absorbancia a 420 nm.

55

IV. CUESTIONARIO
1.- Efecte los clculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reaccin enzimtica.

3.- Calcule la actividad enzimtica de la solucin de ureasa en nmol de NH3

producido/min.

4.- Explique por qu durante la reaccin debe incubarse a 37C

5.- Realizar los clculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y urea para cada tubo
patrn usados en la construccin de la curva de calibracin.

6.- Encontrar la equivalencia por el clculo del factor de equivalencia y por la

determinacin analtica de la ecuacin de la curva.

56

7.- Diga si la curva de calibracin obtenida obedece a la ley de Beer. Explique por qu.

8.- Explique por qu es necesario contar con un blanco en las determinaciones de

actividad enzimtica.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimtica y actividad especfica.

57

V. OBSERVACIONES

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

58

PRACTICA
PRACTICA
11

11

CINETICA ENZIMATICA EN UREASA

CINETICA
ENZIMATICA EN UREASA

59

I.

OBJETIVO.
Verificar la variacin de la velocidad de las reacciones enzimticas con la
concentracin del sustrato.

II. FUNDAMENTO.
La rea puede descomponerse por accin de la enzima Ureasa, para formarse amoniaco
y bixido de carbono segn la siguiente ecuacin.
NH2
CO

+ H2O

2NH3 +

CO2

NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por espectrofotometra a
= 420 nm, si previamente se le compleja con reactivo Nessler.
Cintica de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimticas varan con la concentracin del
sustrato segn una cintica autosaturante que se describa por la Ec.
DeMichaelis-Menten.
V = Vmax. [S]
Ks + [S]

La representacin grfica de tal ecuacin tiene la forma:

La ecuacin de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo uso de la

Linearizacin de Lineweaver-Burk, en cuyo caso toma la forma.

Donde los parmetros anteriores se relacionan por la ecuacin de una recta.

1

[S]

VVmaxKs

60

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales.
20 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/l. En buffer fosfato de pH=7.4, con EDTA,
0.5 nM.
Agua destilada.
reactivo Nessler.
Bao de hielo.
Equipos y material de vidrio.
fiolas de 50 y 100 ml.
07 tubos de ensayo de 10 ml.
02 matraz de 100 ml.
pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
Equipo de bao mara.
01 espectrofotmetro Espectronic 20D+
01 termmetro de 0- 100 C
IV. PROCEDIMIENTO.
Preparacin de muestras.
Hacer los clculos y preparar la solucin patrn de sulfato de amonio al
5x10-4 M
Hacer los clculos y preparar la solucin de urea 0.3 M
Calibracin del Espectrofotmetro.
A fin de transformar los valores de intensidad de color en valores de
concentracin del producto formado (NH3), y por tanto de actividad de la
enzima se trazar una curva de equivalencia de Densidad ptica (Abs) vs.
Concentracin. Con ese fin se preparan soluciones de amoniaco de
concentracin conocida, las que se neutralizan con reactivo Nessler, para
obtener diversas intensidades de color. Por la dificultad del uso del NH3 se
usar soluciones de sulfato de amonio.
Preparar solucin madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M
Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de Sulfato de
Amonio, calcular las nmol de NH3 que liberan cada una y su equivalencia
con nmol de rea. Completar la siguiente tabla.

61

Tabla N 1
PATRON n

Sol. de
sulfato(ml)

Contenido nmol Contenido nmol Equivalencia en

de sulfato
de NH3
nmol de rea

50

100

150

200

250

300
Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibracin de la prctica
anterior.

Tabla N 2

Completar la siguiente tabla.

Muestra N

Volumen de sulfato NH3 en la muestra Absorbancia

tomado ( ml)
(nmol)

Blanco
1
2
3
4
5
6
Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuacin que relaciona DO vs
[NH3], haciendo los tratamientos estadsticos que sean necesarios.
Pruebas cinticas.
A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6 muestras y un
blanco para completar la tabla 3 como se muestra.
Preparar solucin madre de ureasa 6gr/l en buffer fosfato

62

Tabla N 3
Tubo

Urea

Urea Buffer Incubar Ureasa Incubar Bao Nessler Reposar Volumen Abs
37C
hielo ml
final
Mol o.3M fosfato 37C
ml
5 min.
420
ml
ml
3 min
15 min
ml
nm.

Blanco 0

7.0

0.5

0.5

60

0.2

6.8

0.5

0.5

120

0.4

6.6

0.5

0.5

180

0.6

6.4

0.5

0.5

240

0.8

6.2

0.5

0.5

300

1.0

6.0

0.5

0.5

360

1.2

5.8

0.5

0.5

Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que reacciona ( de la curva

de calibracin), y completar la tabla 4
Tabla N 4
Muestra
1
2
3
4
5
6
Blanco

[urea]
en Densidad ptica Nmol de NH3 Nmol de urea
-2
nmol/ml x10
(Abs)
producidos
que reaccionan
0.1
1.0
3.0
4.0
5.0
6.0
-

Tratamiento de datos.
Para cada muestra calcular la velocidad de reaccin mediante la relacin v =
P/t, donde (p) es nmol de NH3 producidos, y (t) es el tiempo de reaccin
enzimtica ( 15 min.) y completar la siguiente tabla.

63

Tabla 5
Muestra

[S] nmol/ml.

1/[S]

V(nmol/min.)

1/v

1
2
3
4
5
6
Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.

Estimar el valor de Vmax.

Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una lnea recta.

Determinar grficamente los valores de Vmax. Y Ks.

Escribir la ecuacin que representa a esta reaccin enzimtica.

64

V. OBSERVACIONES

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

65

PRACTICA 12
PRACTICA
EXTRACCION
DE ADN12
DE HIGADO
DE
EXTRACCION DE ADN DE HIGADO
DEPOLLO
POLLO

66

I.

OBJETIVO
Extraer ADN de un tejido animal

II.

MARCO TEORICO
El ADN y ARN son biomolculas que intervienen en el almacenamiento y la
transferencia de la informacin gentica. Son componentes fundamentales de la
clula y constituyen en conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.
Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando ncleo
protenas, ya que suelen unirse a determinados tipos de estas, como las histonas.
El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el ncleo , mitocondrias
y cloroplastos, mientras que el ADN se sita fundamentalmente en el ncleo de la
clula y tambin cloroplastos y mitocondrias en pequeas cantidades.
Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a
cabo la sntesis de protenas, y por tanto de las enzimas necesarias para el
funcionamiento celular.
Por otra parte el ADN es el vehculo de la herencia que se transmite de padres a
hijos de generacin en generacin.

III.

FUNDAMENTO:
El ADN se puede aislar mediante una tcnica relativamente sencilla, consiste en
primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los ncleos, para ello
se tritura el hgado de pollo en un mortero.
Al aadir una solucin hipertnica, como el NaCl 2M, se produce el estallido de
los ncleos, el detergente forma un complejo con las protenas y las separa del
ADN, El alcohol tiene como funcin precipitar el ADN que se va agrupando para
dar lugar a la formacin de unas fibras blancas visibles a simple vista, que se pueden
colorear mediante un colorante selectivo para ADN como el anaranjado de
acridina.

67

IV.

MATERIALES

V.

Hgado de pollo 10 gr
Cloruro de sodio 2M
Etanol 96|
SDS 20%
Arena
Varilla de vidrio
vasos de precipitados
Mortero
Embudo
Pipetas
Probetas
Gasa

METODOLOGA
1.- Triturar 10 gr de hgado de pollo, dentro de un mortero, con la adicin de 5gr
de arena lavada, para promover el rompimiento de las membranas celulares.
2.- Aadir al triturado de hgado 50 ml de agua destilada hasta obtener una papilla.
3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando separar los restos de
tejido que quedaron sin romper membranas.
4.- Medir el volumen del filtrado final.
5.- Aadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo a un vaso de
precipitados.
6.- Aadir 1 ml de SDS 20%.
7.- Aadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol fro, por las paredes, logrando
se formen dos capas, en la interface precipita el ADN.
8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la misma direccin
tratando de hilar las fibras de ADN; sobre la varilla se van adhiriendo unas
fibras blancas de ADN visibles a simple vista, que es el resultado de la
agrupacin de muchas fibras de ADN.

68

VI.

CUESTIONARIO
1. De qu est formada la cromatina?
2. Durante la extraccin del ADN Cul es la razn de triturar el hgado?, para qu
aadimos arena al triturado?
3. Por qu crees que estallan los ncleos al aadir NaCl 2M?
4. Qu accin tiene el ADN sobre la cromatina?
5. Durante la extraccin del ADN se utiliza un detergente y etanol, con que finalidad

VIII. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

IX. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

X. BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

69