Importancia de los telmeros y la telomerasa en cncer, envejecimiento y medicina regenerativa. Miguel Foronda, Luis E. Donate y Maria A. Blasco.

Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO). Madrid Introduccin. Los telmeros son unas estructuras celulares compuestas por repeticiones de secuencias de ADN localizadas en los extremos de los cromosomas, cuya funcin es proteger a stos frente a la degradacin que tiene lugar, de forma natural, durante la replicacin de las molculas lineales de ADN tras completarse cada ciclo de replicacin1. A dichas repeticiones se une un grupo de protenas conocidas como shelterinas. Las shelterinas se encargan de proporcionar estabilidad y proteccin a los telmeros, y algunas de ellas participan activamente en su replicacin y cohesin durante las distintas fases del ciclo celular2. La longitud telomrica es muy variable entre las distintas especies, y en cada ciclo replicativo los telmeros se acortan a causa del problema intrnseco de la replicacin de los extremos de las secuencias de ADN lineales (fenmeno conocido en ingls como "end replication problem")3. Se ha postulado que los telmeros podran funcionar a modo de reloj biolgico, reflejando el historial de las divisiones que cada clula ha experimentado a lo largo de su existencia4. De forma anloga, la longitud telomrica en cada tipo celular de nuestros tejidos disminuye con el tiempo, constituyendo por tanto una aproximacin bastante representativa de la edad biolgica de nuestros tejidos y rganos5, 6. La telomerasa es una ribonucleoprotena cuya funcin enzimtica es la de aadir repeticiones telomricas de novo para as poder mantener una longitud telomrica estable a lo largo de la historia replicativa de determinados tipos celulares, aqullos en los que se encuentra presente7, 8. La telomerasa se expresa durante el desarrollo embrionario, restringindose en el adulto a determinados compartimentos celulares tales como las clulas madre adultas, los rganos hematopoyticos y las clulas reproductoras8-10. La activacin de la telomerasa es suficiente para conferir un potencial replicativo ilimitado a las clulas, y, de hecho, es un evento frecuente durante la transformacin tumoral11-13. El mantenimiento de la longitud telomrica, en consecuencia, requiere un delicado equilibrio entre erosin y alargamiento, para evitar un acortamiento excesivo que dara lugar a la aparicin de sntomas asociados al envejecimiento prematuro, o una actividad telomerasa aberrante que podra favorecer la inmortalidad de clulas malignas. En esta revisin trataremos los aspectos ms relevantes de la biologa de los telmeros: en primer lugar describiremos en detalle su funcionamiento y el de las protenas asociadas a ellos, as como la regulacin de la longitud telomrica en el organismo; a continuacin abordaremos la correlacin existente entre los telmeros y el envejecimiento, incidiendo en algunas de las enfermedades humanas descritas asociadas a la disfuncin telomrica, as como los modelos animales de estudio generados para estudiar la relacin causal entre el

acortamiento telomrico y la aparicin de ciertos sntomas de envejecimiento prematuro; tambin trataremos la relacin entre la integridad genmica y la homeostasis telomrica, y sus implicaciones en la aparicin y progresin de distintos tipos de cncer; y, finalmente, repasaremos los descubrimiento ms recientes en la biologa de las clulas madre y su estrecha relacin con la actividad telomerasa y la longitud telomrica, as como las incgnitas que la investigacin en el campo de la biologa de los telmeros deber tratar de resolver en los prximos aos.

Telmeros y telomerasa. Estructura, funcionamiento y regulacin. Los telmeros son estructuras nucleoproteicas situadas en los extremos de los cromosomas, compuestas por repeticiones en tndem de una secuencia de doble cadena de ADN enriquecida en guanina (TTAGGG en todos los vertebrados), que en su extremo 3 presenta una estructura de cadena de ADN sencilla protuberante (denominada G-strand overhang). El ADN telomrico de los mamferos se encuentra asociado a un complejo de seis protenas denominadas shelterinas (del ingls shelter, refugio), compuesto por TRF1, TRF2, TIN2, RAP1, TPP1 y POT1. La principal funcin de las shelterinas es la de proteger a los telmeros de las actividades degradativas que se desencadenan a modo de respuesta ante las roturas de cadena en el ADN bicatenario y la subsecuente aparicin de ADN expuesto de cadena sencilla14. Entre las funciones adicionales de las shelterinas, cabe mencionar las del reclutamiento de la telomerasa, la replicacin de los telmeros, la cohesin entre las distintas shelterinas y la formacin de estructuras terciarias de ADN que favorecen la estabilidad de los telmeros (el denominado t-loop)15-19 (Figura 1). La telomerasa es una ribonucleoprotena cuya funcin es aadir de novo fragmentos de ADN con la secuencia repetitiva TTAGGG en los extremos de los telmeros. A tal efecto, la telomerasa se compone de una estructura proteica que presenta la actividad cataltica de polimerasa en reverso de ADN (el componente TERT, del ingls Telomeric End Reverse Transcriptase). Tambin posee un fragmento de ARN de secuencia complementaria a las repeticiones telomricas que se van a aadir, que la telomerasa utiliza a modo de molde sobre el que copiar los fragmentos que aadir a las repeticiones preexistentes (el denominado componente Terc, del ingls Telomerase RNA component)20-22. La telomerasa, por tanto posee una estructura y funcin anlogas a las retrotranscriptasas virales. La actividad telomerasa constituye el principal mecanismo regulador de la longitud telomrica, si bien existen unos mecanismos alternativos para el alargamiento de la longitud telomrica que funcionan en ausencia de la telomerasa en ciertos tipos de cncer como el osteosarcoma o el glioma multiforme23. Las modificaciones epigenticas en las regiones telomricas y subtelomricas junto a la influencia de ARN telomricos no-codificantes tambin influyen de forma drstica en la longitud telomrica y en su organizacin en dominios de cromatina, generando un nivel adicional de control de la longitud y funcin telomricas15, 24-27.

Foronda y Blasco. Figura 1. a)

ADN

TTAGGG-Cy3

b)

Regin subtelomrica

Regin telomrica

c)

T-loop

TIN2 TPP1 RAP1 POT1 TRF2 TRF1 TERT Terc TPP1 POT1

d)

Dyskerina

Shelterinas

Telomerasa

Figura 1. Estructura de los telmeros. a) Imagen de microscopa de fluorescencia Metafase humana preparada a partir linfocitos de sangre perifrica. La tincin de los cromosomas se realiza con DAPI (ADN, en azul), los telmeros, en los extremos de los cromosomas, se han marcado con una sonda telomrica de fluorescencia in situ (FISH) acoplada a un marcador fluorescente (TTAGGG-Cy3, en rojo). b) Representacin esquemtica de un cromosoma. c) Esquema de la composicin y distribucin del complejo de shelterinas en las regiones telomricas y subtelomricas, as como de las secuencias repetitivas de ADN telomrico (TTAGGG). Los complejos POT1-TPP1 se unen preferentemente a las regiones de cadena sencilla, mientras que TRF1 y TRF2 reconocen secuencias de ADN bicatenario. TIN2 y RAP1 no presentan dominios de unin a ADN, por lo que ejercen su influencia sobre el telmero mediante la interaccin con otras shelterinas: TIN2 une TRF1 y TRF2, y, mediante un dominio distinto a los anteriores, es capaz de unirse a los complejos TPP1-POT1; RAP1 se une exclusivamente a TRF2. El telmero aparece representado en configuracin en Lazo-T o T-loop, ntese la invasin de la hebra de cadena sencilla. d) Representacin esquemtica de los principales componentes de la enzima telomerasa: polipptido cataltico donde radica la actividad de polimerasa en reverso (TERT, en azul), molde de ARN para la adicin de las repeticiones de ADN telomrico (TERC, en rojo) y protena dyskerina de estabilizacin del componente ARN (en azul).

Los telmeros desempean una funcin de importancia crtica en el mantenimiento de la estabilidad genmica, y los efectos de su funcionamiento anmalo tienen un importante impacto en procesos vitales tan relevantes como son el envejecimiento o el cncer28. La funcin protectora de los telmeros fue descrita en el final de la dcada de los aos 1930 de forma independiente y simultnea por los cientficos Brbara McClintock y Hermann Mller gracias a observaciones realizadas en sus diferentes modelos genticos de estudio (Zea mays y Drosophila melanogaster, respectivamente), en los que detectaron que los extremos de los cromosomas era cruciales para asegurar una transmisin correcta y equitativa de la informacin gentica a las clulas hijas durante el proceso de divisin celular29. Los estudios posteriores de Hayflick30, 31 y Harley4 demostraron que durante la divisin celular los telmeros se acortan progresivamente en ausencia de expresin de telomerasa hasta alcanzar una longitud crticamente corta que desencadenaba respuestas de parada del ciclo celular y senescencia. Estas observaciones pioneras sentaron las bases sobre las que estudios posteriores relacionaran la aparicin y el progreso de distintas patologas humanas y envejecimiento con el mantenimiento de la estructura y la longitud telomrica.

Integridad telomrica y actividad telomerasa en envejecimiento. La generacin de un ratn con delecin gentica en homozigosis del componente de RNA de la telomerasa (Terc-/-) puso de manifiesto por primera vez la importancia de la telomerasa en el mantenimiento de la longitud telomrica en el contexto de un organismo vivo. Las clulas derivadas de la primera generacin de ratones Terc-/- (G1) mostraban un acortamiento telomrico acelerado, caracterstica que se manifestaba de manera ms acentuada en la segunda generacin de ratones Terc-/- (G2) y en las sucesivas. Dicho acortamiento telomrico era tambin especialmente notable en los tejidos caracterizados por poseer unas elevadas tasas proliferativas como son la piel o el intestino, manifestndose a su vez en una reduccin progresiva en las vidas mxima y media de dichos ratones en sucesivas generaciones (alcanzando ambas valores mnimos en la cuarta generacin, G4, en la cual los ratones pierden su fertilidad y han tornado incapaces de generar descendencia). Los ratones Terc-/- exhiban adems numerosos sntomas de envejecimiento prematuro, tales como alopecia, pigmentacin anmala de la piel, distrofia ungular, anemia aplsica o leucoplaquia oral, recapitulando ciertas manifestaciones clnicas de algunos sndromes humanos asociados a la disfuncionalidad telomrica, como por ejemplo la diskeratosis congnita (vinculada a la presencia de mutaciones en diskerina, protena estabilizadora de Terc)32-36. La caracterizacin de los ratones Terc-/- sugiere que la actividad telomerasa es uno de los principales determinantes de la longevidad de un organismo. Por otro lado, la expresin ectpica de TERT en cultivos celulares primarios confiere potencial replicativo ilimitado, escapando por tanto al denominado lmite de Hayflick, que establece que las clulas pueden confrontar una serie limitada de divisiones celulares, despus de las cuales se desencadenan

Foronda y Blasco. Figura 2.

ELEVADA actividad telomerasa + Supresin tumoral BAJA actividad telomerasa SUPER-M Terc -/-

ELEVADA actividad telomerasa

K5-TERT

Envejecimiento Cncer

Envejecimiento Cncer

Envejecimiento Cncer

Figura 2. Modelos animales para el estudio de la telomerasa. Influencia de la actividad telomerasa en la longevidad en diferentes contextos de supresin tumoral. En ratones con deficiencias en actividad telomerasa (izquierda, Terc -/-) los telmeros se acortan de forma acelerada, provocando sntomas de envejecimiento prematuro y recapitulando algunas de las manifestaciones clnicas de sndromes humanos generados por mutaciones en telomerasa o en alguno de sus componentes. Los ratones Terc -/-, sin embargo, presentan menos predisposicin a desarrollar cncer. En contraposicin al modelo Terc -/-, los ratones K5-TERT (derecha) con sobreexpresin de telomerasa en epitelio estratificado presentan un retraso en la aparicin de sntomas de envejecimiento pero sin embargo son ms susceptibles a la induccin de tumores por exposicin a carcingenos qumicos. Finalmente, el modelo de ratn SUPER-M presenta alta actividad telomerasa combinada con dosis adicionales de genes supresores de tumores (p53, p16 y p19/ARF); estos ratones presentan una homeostasis tisular incrementada a lo largo de su vida, prolongando la longevidad de los ratones y previniendo la aparicin prematura de tumores.

procesos de senescencia y parada en el ciclo celular. Para poder comprobar en un organismo vivo cules eran los posibles efectos de una actividad telomerasa incrementada, se gener el ratn K5-TERT, en el que se sobreexpresa en el epitelio estratitificado el componente cataltico de la telomerasa37. Los ratones K5-TERT disfrutaban de ciertos beneficios sistmicos ya que resultaban capaces de mantener una homeostasis tisular correcta durante ms tiempo, y, en consecuencia, las patologas degenerativas asociadas al envejecimiento aparecan mucho ms tarde que en los ratones control. Dichos ratones modificados presentaban, sin embargo, el inconveniente de haber adquirido una mayor susceptibilidad al desarrollo de tumores, inducidos por carcingenos qumicos o en presencia de mutaciones en los genes supresores de tumores. Para contrarrestar los efectos no deseados de la sobreexpresin de telomerasa, se gener un ratn que adems de sobreexpresar TERT, tambin contena en su genoma dosis adicionales de los genes supresores tumorales ms importantes en ratones: p53, p16 y p19/ARF. stos ratones transgnicos, que para abreviar fueron denominados ratones SUPER-M, presentaban un retraso notable en la aparicin de patologas degenerativas (prdida de coordinacin neuromuscular, marcadores de dao en el ADN, estructura y funcin epitelial) y tambin en la aparicin de tumores (145 semanas en los ratones SUPERM y 110 semanas en los ratones control)38. La sinergia de estos efectos en homeostasis tisular y prevencin de la aparicin de cncer se traduce en los ratones SUPER-M en un aumento de la longevidad mediana (punto en el que en un grupo de estudio de una edad determinada permanece con vida) en un 40% respecto a su grupo control. En consecuencia, los ratones SUPER-M son la primera demostracin formal en un organismo vivo de que la sobreexpresin de la telomerasa es capaz de influir dramticamente en la determinacin de la longevidad intrnseca a ese organismo concreto. Con posterioridad a los ratones SUPER-M se han generado numerosos modelos animales de estudio en los que se ha realizado la ablacin gentica de alguno de los componentes proteicos estructurales de los telmeros, las shelterinas. La mayora de estas deleciones genticas en las shelterinas conducen a la letalidad en etapas muy tempranas del desarrollo embrionario, por lo que el estudio de la abrogacin de las mencionadas protenas slo puede realizarse en contextos de delecin especfica de tejido. Por ejemplo, la delecin de TRF1 en epitelio estratificado (ratones TRF1;K5Cre) es letal en etapas perinatales debido a una degeneracin masiva y extremadamente acelerada de la piel de estos ratones, lo cual se traduce en su deshidratacin y malnutricin, adems de en una hiperpigmentacin cutnea y una reduccin del tamao de los animales al nacer39. Dicha degeneracin est precedida de un acortamiento masivo en la longitud telomrica de los cromosomas de los queratinocitos junto con una acumulacin de aberraciones cromosmicas generadas por los telmeros disfuncionales (fusiones cromosmicas, recombinacin de cromtidas hermanas, cromosomas carentes de seal telomrica, presencia de seales telomricas mltiples, etc.) recapitulando de nuevo algunas de las enfermedades humanas asociadas a las mutaciones en componentes de la telomerasa. Finalmente, se observ que la letalidad perinatal de los ratones TRF1;K5-Cre poda ser rescatada parcialmente en ausencia del factor de transcripcin p53, sugiriendo que, ante situaciones que comprometan la integridad telomrica, se desencadena una respuesta ante dao en el DNA mediada por p53 que previene la proliferacin celular. La ausencia de p53 en condiciones de disfuncin telomrica rescata los sntomas de envejecimiento prematuro en estos modelos de ratn; la incidencia de cncer en estos ratones, sin embargo, es mucho mayor debido

a la acumulacin de aberraciones cromosmicas que no se traducen en una detencin de la progresin del ciclo celular de dichas clulas aberrantes40. Estamos por tanto, en la encrucijada de dos aspectos fisiolgicos fundamentales en la biologa de los telmeros: la parada celular en las clulas con telmeros disfuncionales como barrera a la propagacin, y la proliferacin de clulas que portan aberraciones cromosmicas, para evitar el desarrollo de cncer (Figura 2a).

Cncer y tumorignesis. Un enfoque centrado en los telmeros. La expresin de la telomerasa en los mamferos est restringida a ciertas etapas tempranas del desarrollo embrionario y, en adultos, a determinados compartimentos de las clulas madre adultas y los linajes celulares altamente proliferativos, como son los linfocitos, los queratinocitos o las clulas germinales. Esta propiedad hace que, como se ha indicado anteriormente, la mayor parte de las clulas de nuestro organismo tengan una vida limitada. La longitud telomrica es una de las principales barreras contra la proliferacin incontrolada, y, de hecho, el 90% de los procesos tumorales cursan en algn momento con una reactivacin anmala de la actividad telomerasa. Estos datos ponen de manifiesto la estrecha dependencia de la adquisicin de un potencial replicativo ilimitado y la capacidad tumorignica de las clulas, si bien la mera reactivacin de la telomerasa no constituye un evento transformante per se12. Los estudios de carcinognesis en ratones que albergan modificaciones genticas en componentes de la telomerasa permitieron, de nuevo, el estudio con un mayor nivel de detalle de la estrecha relacin existente entre integridad telomrica y la tumorignesis. En primer lugar, se observ que los ratones Terc-/- eran menos susceptibles a la transformacin tumoral a causa de un agotamiento replicativo ms temprano debido a la presencia previa de telmeros excesivamente cortos. Las clulas deficientes en telomerasa presentan una mayor proporcin de fusiones cromosmicas y aberraciones telomricas, por lo que se pens inicialmente que los ratones Terc-/- desarrollaran cncer con mayor facilidad. Las mencionadas clulas, sin embargo, presentaron unas tasas proliferativas mucho menores y una mayor propensin a entrar en detencin mittica, siendo finalmente eliminadas del organismo. Cuando los ratones Terc-/- se cruzaron con ratones deficientes a su vez en el supresor tumoral p53 (Terc-/-;p53-/-), la progenie desarrollaba tumores malignos con una frecuencia muy superior a la de sus respectivos controles, confirmando la hiptesis de la eliminacin en los ratones Terc-/- de clulas con aberracione. Los ratones K5-TERT, como ya se ha mencionado, eran ms sensibles a la transformacin tumoral mediada por carcingenos qumicos que estimulan de forma potente la proliferacin celular. Esta predisposicin se cancelaba en presencia de copias extra de los genes supresores tumorales, como suceda en el ratn SUPERM38, 41, 42. Estos datos confirman la hiptesis de que la telomerasa per se no acta a modo de oncogn, si bien favorece la seleccin de clulas malignas en presencia de mutaciones adicionales (especialmente en genes supresores tumorales), y, sin embargo, la longitud telomrica s constituye una firme barrera para la progresin tumoral. De forma anloga, los ratones TRF1;K5-Cre en un fondo p53 no funcional (TRF1;K5-Cre;p53-/-) son capaces de rescatar el fenotipo en envejecimiento prematuro a costa de la proliferacin incontrolada de clulas anormales, lo cual se

manifiesta en la aparicin extremadamente temprana de carcinomas epiteliales como el carcinoma de clulas escamosas39 (Figura 2a y 2b) Estas observaciones plantean la necesidad de buscar inhibidores qumicos de las telomerasa que puedan actuar de forma localizada y controlada, para poder as prevenir la aparicin y el progreso de manifestaciones tumorales sin influir en detrimento de la longevidad ni la homeostasis tisular.

Importancia de la longitud telomrica y actividad telomerasa en clulas pluripotentes. El estudio de la funcionalidad de los telmeros y la telomerasa en la biologa de las clulas madre adultas y embrionarias es un campo a la vez fascinante, por su naturaleza joven e intrigante, y atractivo por el gran potencial de empleo terapeutico tanto en la medicina regenerativa como en los trataminetos de terapia gnica. Las clulas tumorales y pluripotentes comparten numerosas caractersticas comunes, entre ellas la prdida de diferenciacin celular y la reactivacin de la telomerasa. No es de extraar, por tanto, que las clulas madre embrionarias presenten unos telmeros extremadamente largos en los estados de mrula y blastocisto, as como en las clulas rederivadas en cultivos in vitro (si bien en estas condiciones existe una presin selectiva hacia las clulas con menor actividad telomerasa y los telmeros se elongan excesivamente de forma anmala)43. A lo largo del desarrollo embrionario, la actividad telomerasa desaparece en la inmensa mayora de los linajes celulares (producindose consecuentemente un acortamiento progresivo ya in utero) exceptuando las clulas madre adultas. Los estudios de longitud telomrica realizados mediante una tcnica de hibridacin de fluorescecnia in situ (FISH) sobre secciones de tejidos (una metodologa desarrollada en nuestro laboratorio y que hemos denominado telomapping) han demostrado que las clulas con los telmeros ms largos en cada tejido corresponden a las clulas que presentan marcadores tradicionalmente asociados a las clulas madre adultas44. La longitud telomrica en estas clulas que portan los telmeros ms largos disminuye con la edad o con los tratamientos que fuerzan la diferenciacin y/o proliferacin, confirmando que la presencia de telmeros ms largos es un rasgo distintivo y universal de las clulas madre adultas. Utilizando la metodologa de telomapping junto con trazadores de pulso-caza (como el BrdU) en los ratones Terc-/- se pudo estudiar el comportamiento de las clulas madre que portaban telmeros cortos, y se observ que la capacidad de movilizacin de stas se encontraba drsticamente reducida, y que dicho fenmeno era reversible en ausencia de una protena p53 funcional45. Por otra parte, las clulas madre epidrmicas de los ratones K5-TERT eran ms propensas a movilizarse, lo cual anticipa los fenotipos observados en los ensayos de regeneracin (cierre de heridas y crecimiento del pelo ms rpidos)46 (Figura 3a y 3b). p53 parece adems tener una implicacin importante en el control de la proliferacin y la movilizacin de las clulas

Foronda y Blasco. Figura 3.

a)
Telmeros funcionales

Estrs replicativo Activacin oncognica Mutaciones en telomerasa/dyskerina Defectos en shelterinas Dao oxidativo

Telmeros disfuncionales

Telmeros cortos p53 no funcional

Activacin de p53

Apoptosis Parada de ciclo celular Senescencia

Fusiones cromosmicas Endoreduplicacin Aneuploida

Enfermedades degenerativas ENVEJECIMIENTO

Inestabilidad genmica CNCER

b)

Organismo Joven
Nicho de clulas madre adultas Telmeros Normales Actividad Telomerasa Normal

Organismo Envejecido (Terc-/-)

Clulas madre subptimas Telmeros Cortos p53ON Movilizacin reducida

K5-TERT
Sobreexpresin de TERT Actividad Telomerasa incrementada

Movilizacin normal

Movilizacin incrementada

Longevidad

p53?

Envejecimiento

Cncer

Tejido diferenciado

Figura 2. Modelos animales para el estudio de la telomerasa. Influencia de la actividad telomerasa en la longevidad en diferentes contextos de supresin tumoral. En ratones con deficiencias en actividad telomerasa (izquierda, Terc -/-) los telmeros se acortan de forma acelerada, provocando sntomas de envejecimiento prematuro y recapitulando algunas de las manifestaciones clnicas de sndromes humanos generados por mutaciones en telomerasa o en alguno de sus componentes. Los ratones Terc -/-, sin embargo, presentan menos predisposicin a desarrollar cncer. En contraposicin al modelo Terc -/-, los ratones K5-TERT (derecha) con sobreexpresin de telomerasa en epitelio estratificado presentan un retraso en la aparicin de sntomas de envejecimiento pero sin embargo son ms susceptibles a la induccin de tumores por exposicin a carcingenos qumicos. Finalmente, el modelo de ratn SUPER-M presenta alta actividad telomerasa combinada con dosis adicionales de genes supresores de tumores (p53, p16 y p19/ARF); estos ratones presentan una homeostasis tisular incrementada a lo largo de su vida, prolongando la longevidad de los ratones y previniendo la apricin prematura de tumores.

Foronda y Blasco. Tabla 1.

Tabla 1.- Modelos genticos para el estudio del papel de los terlmeros y la telomerasa en cncer y envejecimiento.

Genotipo
Terc -/-

Envejecimiento

Cncer

Terc -/-; p53 -/-

K5-TERT

K5-TERT/sP53/sP16/sP19ARF

TRF1 ; K5-Cre TRF1 ; K5-Cre; p53-/-

Envejecimiento prematuro: alopecia, atrofia intestinal, Menor susceptibilidad a infertilidad, aplasia en mdula sea, disfucin renal, desarrollar tumores por disfuncin cardaca, tamao corporal reducido; movilizacin carcinognesis qumica. de clulas madre adultas reducida, cierre de heridas y regeneracin del pelo retardados Rescate de algunos de los fenotipos (tamao del organismo, Mayor susceptibilidad a cierre de heridas, regeneracin del pelo), supervivencia carcinognesis espontnea e reducida inducida Respuesta proliferativa incrementada en epidermis (cierre de Mayor susceptibilidad a heridas, regeneracin del pelo), mayor facilidad de protocolos de carcinognesis movilizacin de clulas madre adultas epidrmicas, mayor epitelial longevidad en el grupo que no desarrolla tumores Aumento de la longevidad media en un 40%, retraso en la Resistencia a la aparicin de aparicin de sntomas de envejecimiento (prdida de cncer coordinacin neuromuscular, prdida de tolerancia a la glucosa), funcionalidad de barreras epiteliales incrementada Letalidad perinatal a causa de barrera epitelial deteriorada de Aparicin de lesiones preforma prematura, ausencia de folculos pilosos y glndulas neoplsicas sebceas, hiperpigmentacin e hiperqueratosis Rescate de letalidad perinatal y de los defectos en desarrollo Mayor incidencia de carcinoma embrionario y piel de clulas escamosas

madre que portan telmeros no funcionales, previniendo la diseminacin de clulas que albergan aberraciones genmicas. La ausencia de folculos pilosos y el ensamblaje aberrante de algunos marcadores de diferenciacin en los ratones TRF1; K5-Cre, ambos fenotipos reversibles de nuevo en ausencia de p53, confirman el importante papel que desempean la telomerasa y la integridad telomrica en la funcionalidad de las clulas madres, surrogado al control establecido por p53 ante la presencia de anormalidades cromosmicas39 (Tabla 1) Finalmente, un campo extremadamente excitante es el de la generacin de clulas madre pluripotentes iducidas o iPSC (induced-Pluripotent Stem Cells) a partir de clulas adultas diferenciadas47, 48. Esta tecnologa es el pilar sobre el que se apoya el grueso de la investigacin actual en medicina regenerativa y terapia personalizada. Las iPSC adquieren caractersticas propias de las clulas madre embrionarias (mESC), y entre ellas cabe destacar un rejuvenecimiento general de los telmeros, que incluye una reactivacin de la telomerasa y un incremento en la expresin de las shelterinas, la adquisicin de una conformacin epigentica de los telmeros propia de mESC, el incremento en la transcripcin de los ARNs telomricos (TERRAs) y el alargamiento de los telmeros hasta una longitud equivalente a la de las mESC49-52. Algunos de los escollos que dificultaban la generacin de iPSC (un proceso extremadamente ineficiente por naturaleza) empiezan a esclarecerse, y entre ellos, de nuevo tenemos la longitud telomrica como una barrera para la reprogramacin de clulas sub-ptimas dependiente de la activacin de p53 y el establecimiento de una cromatina telomrica en conformacin abierta propia de mESC. Estos descubrimientos son de gran importancia, dado que abren las puertas a la generacin de tejidos a partir de iPSC generadas con clulas de pacientes con telmeros extremadamente cortos, por ejemplo, para as poder tratar de forma personalizada a pacientes afectados de telopatas. El trabajo en los campos de cncer, envejecimiento y medicina regenerativa ha avanzado en los ltimos aos a ritmos vertiginosos, y gran parte del conocimiento que poseemos en la actualidad en estos campos se debe a la generacin y caracterizacin de modelos animales de estudios que han permitido entender los mecanismos moleculares que los gobiernan. La investigacin en telmeros no ha sido una excepcin, y el desarrollo de terapias orientadas a prevenir el acortamiento telomrico, para retrasar la aparicin de enfermedades degenerativas, o bien para contrarrestar la actividad telomerasa, y as evitar la progresin tumoral, o tratar de mejorar las herramientas disponibles en medicina regenerativa constituirn el eje central de la investigacin de los prximos aos.

Agradecimientos. MF posee una beca FPU del Ministerio de Educacin (AP2008-00543) y el laboratorio de Maria A. Blasco tiene soporte econmico del Ministerio de Ciencia e Innovacin (SAF2008-05384 y CDS2007-00017), de la Unin Europea (Proyectos FP7 2007-A201630 y 2007-A-200950 y ERC Advanced Grant GA#232854), Fundacin Lily, Fundacin Krber y Fundacin Botn.

Referencias. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Blackburn, E.H. Structure and function of telomeres. Nature 350, 569-573 (1991). Palm, W. & de Lange, T. How shelterin protects mammalian telomeres. Annu Rev Genet 42, 301-334 (2008). de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science 326, 948-952 (2009). Harley, C.B., Futcher, A.B. & Greider, C.W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature 345, 458-460 (1990). Canela, A., Vera, E., Klatt, P. & Blasco, M.A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 5300-5305 (2007). Harley, C.B. et al. Telomerase, cell immortality, and cancer. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 59, 307-315 (1994). Greider, C.W. & Blackburn, E.H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 43, 405-413 (1985). Collins, K. & Mitchell, J.R. Telomerase in the human organism. Oncogene 21, 564-579 (2002). Liu, L. et al. Telomere lengthening early in development. Nat Cell Biol 9, 14361441 (2007). Harrington, L. Does the reservoir for self-renewal stem from the ends? Oncogene 23, 7283-7289 (2004). Vonderheide, R.H., Hahn, W.C., Schultze, J.L. & Nadler, L.M. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity 10, 673-679 (1999). Hahn, W.C. et al. Creation of human tumour cells with defined genetic elements. Nature 400, 464-468 (1999). Blasco, M.A. & Hahn, W.C. Evolving views of telomerase and cancer. Trends Cell Biol 13, 289-294 (2003). de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev 19, 2100-2110 (2005). Benetti, R., Schoeftner, S., Munoz, P. & Blasco, M.A. Role of TRF2 in the assembly of telomeric chromatin. Cell Cycle 7, 3461-3468 (2008). Blasco, M.A. Mouse models to study the role of telomeres in cancer, aging and DNA repair. Eur J Cancer 38, 2222-2228 (2002). Munoz, P. et al. TRF1 controls telomere length and mitotic fidelity in epithelial homeostasis. Mol Cell Biol 29, 1608-1625 (2009). Tejera, A.M. et al. TPP1 is required for TERT recruitment, telomere elongation during nuclear reprogramming, and normal skin development in mice. Dev Cell 18, 775-789. de Lange, T. T-loops and the origin of telomeres. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 323329 (2004). Autexier, C. & Greider, C.W. Boundary elements of the Tetrahymena telomerase RNA template and alignment domains. Genes Dev 9, 2227-2239 (1995). Autexier, C. & Greider, C.W. Functional reconstitution of wild-type and mutant Tetrahymena telomerase. Genes Dev 8, 563-575 (1994).

22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41.

Bhattacharyya, A. & Blackburn, E.H. Architecture of telomerase RNA. EMBO J 13, 5721-5731 (1994). Lundblad, V. & Blackburn, E.H. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues est1- senescence. Cell 73, 347-360 (1993). Benetti, R., Garcia-Cao, M. & Blasco, M.A. Telomere length regulates the epigenetic status of mammalian telomeres and subtelomeres. Nat Genet 39, 243250 (2007). Blasco, M.A. The epigenetic regulation of mammalian telomeres. Nat Rev Genet 8, 299-309 (2007). Schoeftner, S. & Blasco, M.A. Chromatin regulation and non-coding RNAs at mammalian telomeres. Semin Cell Dev Biol 21, 186-193. Schoeftner, S. & Blasco, M.A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nat Cell Biol 10, 228-236 (2008). Blasco, M.A. Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond. Nat Rev Genet 6, 611-622 (2005). McClintock, B. A Correlation of Ring-Shaped Chromosomes with Variegation in Zea Mays. Proc Natl Acad Sci U S A 18, 677-681 (1932). Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res 37, 614-636 (1965). Hayflick, L. & Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res 25, 585-621 (1961). Blasco, M.A. et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell 91, 25-34 (1997). Herrera, E., Samper, E. & Blasco, M.A. Telomere shortening in mTR-/embryos is associated with failure to close the neural tube. EMBO J 18, 11721181 (1999). Armanios, M. et al. Short telomeres are sufficient to cause the degenerative defects associated with aging. Am J Hum Genet 85, 823-832 (2009). Armanios, M. et al. Haploinsufficiency of telomerase reverse transcriptase leads to anticipation in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15960-15964 (2005). Chen, J.L. & Greider, C.W. Telomerase RNA structure and function: implications for dyskeratosis congenita. Trends Biochem Sci 29, 183-192 (2004). Gonzalez-Suarez, E., Geserick, C., Flores, J.M. & Blasco, M.A. Antagonistic effects of telomerase on cancer and aging in K5-mTert transgenic mice. Oncogene 24, 2256-2270 (2005). Tomas-Loba, A. et al. Telomerase reverse transcriptase delays aging in cancerresistant mice. Cell 135, 609-622 (2008). Martinez, P. et al. Increased telomere fragility and fusions resulting from TRF1 deficiency lead to degenerative pathologies and increased cancer in mice. Genes Dev 23, 2060-2075 (2009). Martinez, P. & Blasco, M.A. Role of shelterin in cancer and aging. Aging Cell 9, 653-666. Cayuela, M.L., Flores, J.M. & Blasco, M.A. The telomerase RNA component Terc is required for the tumour-promoting effects of Tert overexpression. EMBO Rep 6, 268-274 (2005).

42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52.

Gonzalez-Suarez, E., Samper, E., Flores, J.M. & Blasco, M.A. Telomerasedeficient mice with short telomeres are resistant to skin tumorigenesis. Nat Genet 26, 114-117 (2000). Varela, E., Schneider, R.P., Ortega, S. & Blasco, M.A. Different telomere-length dynamics at the inner cell mass versus established embryonic stem (ES) cells. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 15207-15212. Flores, I. et al. The longest telomeres: a general signature of adult stem cell compartments. Genes Dev 22, 654-667 (2008). Flores, I. & Blasco, M.A. A p53-dependent response limits epidermal stem cell functionality and organismal size in mice with short telomeres. PLoS One 4, e4934 (2009). Flores, I., Cayuela, M.L. & Blasco, M.A. Effects of telomerase and telomere length on epidermal stem cell behavior. Science 309, 1253-1256 (2005). Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006). Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872 (2007). Marion, R.M. et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 4, 141-154 (2009). Marion, R.M. et al. A p53-mediated DNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity. Nature 460, 1149-1153 (2009). Marion, R.M. & Blasco, M.A. Telomeres and telomerase in adult stem cells and pluripotent embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol 695, 118-131. Marion, R.M. & Blasco, M.A. Telomere rejuvenation during nuclear reprogramming. Curr Opin Genet Dev 20, 190-196.

Pie de Figuras.

Figura 1. Estructura de los telmeros. a) Imagen de microscopa de fluoresecencia Metafase humana preparada a partir linfocitos de sangre perifrica. La tincin de los cromosomas se realiza con DAPI (ADN, en azul), los telmeros, en los extremos de los cromosomas, se han marcado con una sonda telomrica de fluorescencia in situ (FISH) acoplada a un marcador fluorescente (TTAGGG-Cy3, en rojo). b) Representacin esquemtica de un cromosoma. c) Esquema de la composicin y distribucin del complejo de shelterinas en las regiones telomricas y subtelomricas, as como de las secuencias repetitivas de ADN telomrico (TTAGGG). Los complejos POT1-TPP1 se unen preferentemente a las regiones de cadena sencilla, mientras que TRF1 y TRF2 reconocen secuencias de ADN bicatenario. TIN2 y RAP1 no presentan dominios de unin a ADN, por lo que ejercen su influencia sobre el telmero mediante la interaccin con otras shelterinas:

TIN2 une TRF1 y TRF2, y, mediante un dominio distinto a los anteriores, es capaz de unirse a los complejos TPP1-POT1; RAP1 se une exclusivamente a TRF2. El telmero aparece representado en configuracin en Lazo-T o T-loop, ntese la invasin de la hebra de cadena sencilla. d) Representacin esquemtica de los principales componentes de la enzima telomerasa: polipptido cataltico donde radica la actividad de polimerasa en reverrso (TERT, en marrn), molde de ARN para la adicin de las repeticiones de ADN telomrico (TERC, en rojo) y proteina dyskerina de estabilizacin del componente ARN (en azul).

Figura 2. Modelos animales para el estudio de la telomerasa. Influencia de la actividad telomerasa en la longevidad en diferentes contextos de supresin tumoral. En ratones con deficiencias en actividad telomerasa (izquierda, Terc-/-) los telmeros se acortan de forma acelerada, provocando sntomas de envejecimiento prematuro y recapitulando algunas de las manifestaciones clnicas de sndromes humanos generados por mutaciones en telomerasa o en alguno de sus componentes. Los ratones Terc-/-, sin embargo, presentan menos predisposicin a desarrollar cncer. En contraposicin al modelo Terc-/-, los ratones K5-TERT (derecha) con sobreexpresin de telomerasa en epitelio estratificado presentan un retraso en la aparicin de sntomas de envejecimiento pero sin embargo son ms susceptibles a la induccin de tumores por exposicin a carcingenos qumicos. Finalmente, el modelo de ratn SUPER-M presenta alta actividad telomerasa combinada con dosis adicionales de genes supresores de tumores (p53, p16 y p19/ARF); estos ratones presentan una homeostasis tisular incrementada a lo largo de su vida, prolongando la longevidad de los ratones y previniendo la apricin prematura de tumores.

Figura 3. Disfuncin telomrica como inductor de cncer y envejecimiento. a) Cuando aparece dao en el ADN telomrico, en clulas sanas con telmeros funcionales, ste puede tener orgenes diversos. La activacin oncognica est asociada al estrs replicativo, puesto que puede producirse un acortamiento telomrico a causa de la prdida de longitud telomrica intrnseca derivada del excesivo nmero de divisiones celulares. En clulas que poseen elevadas tasas proliferativas, como las clulas madre, las mutaciones en la telomerasa o la diskerina impiden el mantenimiento de la longitud telomrica. La ausencia de shelterinas funcionales genera desproteccin de los telmeros, que son reconocidos entonces como ADN disfuncional. Todos estos defectos en la estructura y la longitud telomrica desencadenan una respuesta a dao en el ADN, cuyo principal ejecutor es el factor de transcripcin p53, que activa vas de reparacin de ADN, parada del ciclo celular y senescencia; en el contexto de un organismo este tipo de respuestas celulares se manifiestan en forma de envejecimiento prematuro. Por el contrario, en ausencia de p53 funcional, las aberraciones cromosmicas se propagan induciendo la acumulacin de mutaciones y aneuploida, favoreciendo la aparicin de tumores, cncer y metstasis.

b) Modelo general para explicar los procesos de cncer y envejecimiento en funcin de la funcionalidad de los telmeros y la telomerasa en las clulas madre. A pesar de la expresin de telomerasa en compartimentos de las clulas madre adultas en organismos jvenes (izquierda), los telmeros se acortan con el tiempo y en los organismos longevos las clulas madre con telmeros extremadamente cortos (como sucede tambin en el caso de los ratones Terc-/-) pierden la capacidad de movilizarse a sus tejidos diana, perdiendo por tanto su capacidad regenerativa. En presencia de una actividad telomerasa incrementada (como en el caso de los ratones K5-TERT) hay una movilizacin constante de clulas madre hacia sus tejidos destino. En condiciones normales, esta situacin se traduce en una capacidad homeosttica incrementada y en un aumento de la longevidad del organismo, pero en un contexto de supresin mutado (como p53 no funcional) las clulas madre subptimas son capaces de propagarse, favoreciendo procesos de tumorignesis.