V.

EFECTO DE BIOCONSERVACIN DE CARNE MOLIDA DE CERDO, TIPO HAMBURGUESA CON Lactobacillus acidophilus cepa ATCC 4356 y Staphylococcus carnosus NRRLO2
Henry Jurado Gmez1, Constanza Montalvo Rodrguez2, Cristina Ramrez Toro3 y Germn Bolvar4
1,2,3

Escuela de Ingeniera de Alimentos. Universidad del Valle. 4 Departamento de Biologa. Universidad del Valle henryjugam@hotmail.com1, consmonta@gmail.com2, crisrami123@gmail.com3, gbolivar11@yahoo.com4

RESUMEN Se evalu el efecto de bioconservacin de hamburguesa de cerdo (HC) con L. acidophilus ATCC 4356 y S. carnosus NRRLO2. El anlisis microbiolgico mostr que el conteo de coliformes totales y fecales alcanz valores de <3 UFC/g durante un perodo de 30 das, a temperatura ambiente por la accin inhibitoria de las bacterias lcticas (BAL), debido a su produccin de cido lctico y otros compuestos inhibidores secretados por los microorganismos. Se observ que ambas cepas fueron resistentes a pH cido y que no hay efecto antagnico entre ellas. Los resultados obtenidos muestran el uso potencial de este mtodo de conservacin como alternativa a la cadena de fro. Palabras claves: bioconservacin, carne molida de cerdo, bacterias lcticas, coliformes totales, inhibicin de bacterias patgenas.

ABSTRACT The bioconservation effect of pork hamburger with L. acidophilus and S. carnosus was tested. Microbiological analysis shown that total and fecal coliforms were <3 UFC/g during a period of time of 30 days at room temperature, by inhibitory action of acid lactic bacteria because of its acid lactic production and another inhibitory compounds secreted by the microorganisms. It was found that both bacteria were resistant to acid pH and there isnt antagonistic effect between them. The results had shown the potential use of this conservation method as refrigeration alternative. Key words: bioconservation, pork hamburger, lactic acid bacteria, total coliforms, pathogenic bacteria inhibition. IINTRODUCCIN proliferacin de gran variedad de microorganismos que provocan su descomposicin (Haynes, 1993). Este problema es severo cuando la falta de refrigeracin o las condiciones

La carne de cerdo por sus caractersticas biolgicas y composicin qumica, es un excelente medio para la

inadecuadas de almacenamiento y transporte provocan la exposicin frecuente del alimento a temperaturas superiores a los 5 C y humedades altas (Minor Prez y Guerrero Legarrete, 2003). La congelacin es el mtodo de conservacin por excelencia, ya que inhibe el desarrollo de microorganismos deteriorativos y patgenos al retardar las reacciones bioqumicas y enzimticas que se producen en los alimentos a travs del descenso de la temperatura del alimento y principalmente por la remocin del agua en forma de hielo (Zaritzky, 2002). Para incrementar la vida til de carnes, en los ltimos aos han surgido diversas alternativas a los mtodos tradicionales de conservacin. Se han empleado cepas de bacterias lcticas (BAL) seleccionadas para conservar carne debido a la produccin de agentes antimicrobianos, como cidos orgnicos o a compuestos como perxido de hidrgeno, diacetilo, acetaldehdo y bacteriocinas entre otros (Caplice y Fitzgerald, 1999; Minor-Prez H., et al. 2002; Magnusson, 2003), los cuales inhiben el crecimiento de la flora patgena y evitan efectos negativos sobre las propiedades funcionales como el color, la textura y el sabor. En el sector alimentario ha habido un rpido incremento de la demanda de productos 100% naturales, desde el punto de vista del consumidor y de las autoridades. El uso de preservantes qumicos en alimentos es cada vez menos recomendado debido a los posibles efectos secundarios producidos a largo plazo. Por ello surge la necesidad

de utilizar nuevas alternativas que permitan la elaboracin de alimentos protegidos naturalmente, que den solucin a problemas de este tipo aportando un mayor beneficio a los productos y al consumidor. Los alimentos funcionales han ganado importancia en el mercado y las BAL juegan un papel importante en esta tendencia. Los probiticos y prebiticos pueden considerarse como las fuerzas conductoras del mercado de los alimentos funcionales. El crecimiento potencial de estos mercados es enorme, especialmente cuando se consideran las aplicaciones al alimento como teraputicas o alimentos funcionales (De Vuyst, 2000). Cultivos de BAL han sido aplicados directamente con xito en diferentes alimentos especialmente en productos crnicos, las bacteriocinas combinadas con lactobacilos han demostrado efecto antilisteria, que puede ser aprovechado en crnicos segn Minor et al. (2002) y Erkkil (2001), quienes describen la conservacin de la carne fresca de cerdo mediante fermentacin lctica. El uso de estas BAL constituye una herramienta importante, ya que ayuda a reducir costos de produccin y procesamiento como los debidos a la refrigeracin y congelacin de la carne y sus diferentes derivados, mientras se mejora su calidad organolptica y microbiolgica al tiempo que reduce el uso de conservantes y aditivos artificiales (Erkkil, 2001). Geisen et al. (1991) confirman que el crecimiento de bacterias patgenas puede ser reducido cuando se aplican cultivos de BAL en la superficie de los productos crnicos no fermentados como salchichas, carnes cortadas y molidas. El

objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de bioconservacin de HC con BAL seleccionadas y reconocidas como aptas para el consumo humano como una alternativa al uso de la cadena de fro. II. MATERIALES Y MTODOS Se utiliz carne de cerdo molida condimentada en forma natural sin aditivos ni conservantes y BAL Lactobacillus acidophilus cepa ATCC 4356 y Staphylococcus carnosus cepa NRRL O2 reconocidas como microorganismos generalmente seguros (GRAS), facilitadas por el laboratorio de Biologa Marina de la Universidad del Valle. 2.1 Condiciones experimentales Caracterizacin de las BAL. Esta caracterizacin fue efectuada con el propsito de verificar si las cepas probadas en el estudio, cumplen con las caractersticas deseadas en el proceso de produccin de inculos y preservacin del producto, siguiendo lo recomendado por Ramrez et al 2006 y Yimin et al, 1999. Se realizaron pruebas de resistencia a diferentes valores de pH (6.0, 4.0, 3.5 y 2.0) de las cepas de BAL para comprobar su crecimiento al descender el pH en el medio de cultivo. Para ello se inocularon en 10 mL de MRS caldo ajustados a cada valor de pH 1 mL de cada suspensin de microorganismo, se tomaron muestras al momento de inoculacin y cada hora hasta 3 h despus de inoculados. Luego se prepararon diluciones hasta 10-10 segn la metodologa de Ramrez (2005) y se sembraron en caja de Petri desde la dilucin 10-6 hasta la 10-10 en Agar-MRS.

Pruebas de antagonismo. Se realiz una prueba de antagonismo entre los dos microorganismos con el fin de evaluar la posibilidad de utilizarlos en mezcla y pruebas de inhibicin de bacterias patgenas contra las cepas de BAL estudiadas, para comprobar que la bioconservacin se produce por inhibicin de microorganismos patgenos. Se realizaron cuatro repeticiones de cada prueba de acuerdo a los mtodos descritos por Ramrez (2005) en cada caso. Elaboracin del inculo. Se prepar un preinculo de cada cepa en caldo MRS (De Man Rogosa and Sharp, 1960) a partir de cepas crioconservadas. A partir del preinculo se prepar 100 mL de inculo segn la formulacin sugerida por Ramrez (2005). Tanto para el preinculo como para el inculo se permiti un crecimiento de 24 h con agitacin constante de 125 rpm, al cabo de las cuales se verific la pureza del cultivo mediante coloracin de Gram. Para obtener HC bioconservadas con BAL se adicion 10% v/p de inculo de cada bacteria con viabilidad de 109 UFC/mL permitindose la impregnacin de las BAL a la carne durante 24 h a 30 oC, al cabo de las cuales se retir el excedente de lquido, posteriormente se molde en muestras de 120 g y se empacaron al vaco. Se realizaron cuatro rplicas del experimento y paralelamente fueron moldeadas y empacadas muestras sin inculo como control. Las hamburguesas empacadas al vaco se almacenaron a temperatura de refrigeracin y ambiente evalundose sus caractersticas microbiolgicas y fisicoqumicas a la primera y cuarta semana de

almacenamiento. La tabla 1, resume los tratamientos empleados.

Tabla 1. Tratamientos evaluados para la bioconservacin de hamburguesa de cerdo.

Temperatura de Almacenamiento

Cepa Ambiente (25 C) Refrigeracin (5 C)

Control Sin inculo M1 M4

Staphylococcus carnosus cepa NRRLO2 M2 M5

Lactobacillus acidophilus cepa ATCC 4356 M3 M6

Evaluacin microbiolgica. Se determin el Nmero Ms Probable (NMP) de coliformes totales y fecales, el recuento de mesfilos aerobios totales (UFC/g) y recuento de BAL para verificar el grado de contaminacin de la carne molida y la disminucin de sta luego del tratamiento con BAL y su evolucin durante el almacenamiento a las temperaturas en estudio segn la metodologa descrita por Ramrez (2005). III. RESULTADOS Y DISCUSIN Elaboracin y caracterizacin del inculo. Se verific que los inculos de S. carnosus y L. acidophilus tenan una viabilidad de 1016 y 1013 UFC/mL y alcanzaron pH de 3.6 y 3.7 respectivamente al ser inoculados en la carne molida de cerdo. Estos valores de viabilidad son reportados por Raibaud y Raynaud (1989) como adecuados para el empleo de estos microorganismos en la obtencin de preparaciones probiticas, al realizar estudios para la seleccin de cepas de Lactobacillus como potenciales probiticos. Estudios realizados por Brizuela (2003) y Bolvar (2008) indican que el anlisis de estabilidad del

probitico a base de bacterias lcticas arrojaron buenos resultados para el producto, tanto a temperatura ambiente como en refrigeracin hasta los 30 das de almacenamiento, manteniendo la concentracin en el orden de 1010 UFC/mL. Anlisis microbiolgico. La tabla 2 muestra los promedios de las cuatro repeticiones efectuadas para el anlisis del NMP. Se observa que el tratamiento con ambas BAL fue efectivo para la inhibicin de microorganismos patgenos, mostrando marcadas diferencias con la muestra control. Esto puede corroborarse con los resultados de los estudios in vitro de antagonismo (Tabla 3), en las que se aprecia inhibicin del crecimiento de bacterias patgenas. El recuento de mesfilos totales report valores superiores a 107 ufc/mL en todas las muestras, correspondiendo con los anlisis efectuados para el conteo de BAL en MRS, lo que sugiere que los mesfilos presentes corresponden a las BAL presentes en el inculo aplicado a las HC. Esto se comprob a travs de coloracin de Gram. Lo anterior coincide

tambin con los resultados obtenidos por Ashenafi, (1991) y Hudault et al., (1997) quienes encontraron que las bacterias lcticas presentaron inhibicin frente a E. coli, Salmonella y Listeria. Esta inhibicin segn algunos autores se atribuye a la produccin de cidos orgnicos, entre ellos el lctico; perxido de hidrgeno, y bacteriocinas (Juven et. al, 1992) y Bolvar (2008). Se presume que el cido lctico es el principal responsable de la reduccin del pH en HC y de la accin inhibitoria. Sobel (1999) plantea que las cepas de Lactobacillus, poseen mayor potencialidad y son los ms utilizados hasta el momento, ya sea de forma individual o en combinacin con otros microorganismos para la obtencin de preparaciones con propiedades probiticas, tiles para la conservacin de carnes.

L. acidophilus ha sido utilizado en la elaboracin de productos crnicos tipo salami, con poblaciones de 108 UFC/ g (Minor-Prez, et al. 2002). Los mismos autores reportaron estudios de la aplicacin de Staphylococcus carnosus y Lactobacillus alimentarius en la conservacin de la carne fresca de cerdo va fermentacin lctica. Los resultados mostraron que las BAL reducen a <3 el NMP de coliformes en el tiempo cuando son almacenadas a temperatura ambiente, indicando la posibilidad de sustituir el uso de la cadena de fro por ste mtodo de conservacin (Betancourt y Quintero, 2002).

Tabla 2*. Nmero Ms Probable reportado para los anlisis de las muestras de coliformes totales y fecales (NMP/g) a la semana 1 y 4 de aplicacin de los probiticos.

T. Ambiente Tiempo Cepa Coliformes totales 23 23 210 <3 <3 350 Coliformes fecales 4 4 120 0 0 210

T. Refrigeracin Coliformes totales 44 37 150 23 21 64 Coliformes fecales 13 13 89 13 11 44

1 semana

Lb. acidophilus S. carnosus Control

4 semanas

Lb. acidophilus S. carnosus Control

*Reporte del promedio de cuatro repeticiones.

Tabla 3. Antagonismo de BAL vs Bacterias Patgenas y entre ellas mismas.

Dimetro Halo de Inhibicin (mm) Bacteria Escherichia coli Klebsiella pneumoneae Staphylococcus aureus Serratia marcescens Proteus vulgaris Salmonella thyphimurium Shigella spp. Pseudomonas aureuginosa Vibrio cholerae Yersinia enterocoltica NRRLO2 ATCC 4356 NRRL O2 4 4 6 6 7 4 5 7 4 7 0 ATCC 43576 4 5 6 5 7 5 5 6 4 8 0 -

*Los valores reportados corresponden al dimetro del halo de inhibicin en mm observado en la prueba de antagonismo. Se report el promedio aritmtico de cuatro repeticiones.

Resistencia de las BAL a pH cidos. Las tablas 4 y 5 muestran los resultados de la prueba de resistencia a diferentes valores de pH. Los resultados indican que el medio de cultivo se acidifica luego de la inoculacin del microorganismo y contina su acidificacin en el tiempo y su viabilidad se mantiene entre 106 y 1011 UFC/mL hasta pH 2,0 para en el caso de Lb. acidophilus y pH 3,5 para S. carnosus. De acuerdo con Ramrez (2005) algunas BAL son capaces de sobrevivir hasta pH 2,0 y segn De Roissart (1994) las BAL tienen crecimiento ptimo a pH 6,5 a 7,0. Los resultados encontrados indican que los microorganismos utilizados pueden crecer en medios cidos, siendo una caracterstica favorable ya que el proceso

no requerira control de pH, resultando econmico a nivel industrial. Pruebas de antagonismo. La prueba de antagonismo entre las dos BAL mostr que L. acidophilus no inhibe el crecimiento de S. carnosus. (Tabla 3). Esto concuerda con lo reportado por Betancourt y Quintero (2002), quienes encontraron que Lb. alimentarius y Lb. animalis no compiten entre s y por tanto los utilizaron en mezcla para bioconservar crnicos marinos obteniendo excelentes resultados. Este resultado habilita la posibilidad de usar inculos con mezcla de ambas cepas para as proporcionar un mayor radio de accin de los probiticos en cuanto a inhibicin de patgenos y propiedades organolpticas del producto.

Tabla 4. Resistencia al pH de S. carnosus NRRL 02

pH 6.0 Tiempo (h) Cambio de pH Viabilidad (UFC/g)
6 6

pH 4.0 Cambio de pH Viabilidad (UFC/g) 2 x 10 6 7 x 10 6 9 x 1011

pH 3.5 Cambio de pH Viabilidad (UFC/g) 5 x 10 7 8 x 10 9 6 x 1010

pH 2.0 Cambio de pH Viabilidad (UFC/g)

1 2 3

5.46 5.39 5.285

5 x 10 7 x 10 2 x 10

4.215 4.14 4.17

3.75 3.685 3.79

2.785 2.86 2.835

0 0 0

Tabla 5. Resistencia al pH de Lb. acidophilus ATCC 4356

pH 6.0 Tiempo (h) Cambio de pH Viabilidad (UFC/g) pH 4.0 Cambio de pH Viabilidad (UFC/g) pH 3.5 Cambio de pH Viabilidad (UFC/g) pH 2.0 Cambio de pH Viabilidad (UFC/g)

1 2 3

5.595 5.5 5.425

4 x 10 4 x 10 3 x 10

4.365 4.325 4.35

2 x 10 8 4 x 10 12 2 x 1010

3.905 3.87 3.89

3 x 10 8 5 x 10 11 14 x 1010

2.545 2.795 2.675

1 x 10 9 3 x 10 11 2 x 1010

10

FIGURA I. ENSAYO DE ANTAGONISMO DE BAL vs. BACTERIAS PATGENAS

IV. CONCLUSIONES Se comprob que las cepas de BAL estudiadas ejercen efecto de bioconservacin en HC al disminuir el conteo inicial de coliformes tras 4 semanas de almacenamiento, mostrando mayor efectividad a temperatura ambiente ofreciendo la posibilidad de sustituir la cadena de fro por este mtodo de conservacin. Este resultado se corrobor con las pruebas de antagonismo realizadas entre BAL y bacterias patgenas. El ensayo de antagonismo entre las dos cepas de BAL estudiadas indica que se pueden usar ambos microorganismos en mezcla para lograr un mejor efecto de bioconservacin. Como recomendacin final, se sugiere realizar pruebas de aceptacin y anlisis sensorial con el fin de evaluar las propiedades organolpticas del producto. As mismo, se propone evaluar el efecto de inhibicin de las BAL contra otras bacterias patgenas como Listeria monocytogenes y Clostridium perfringens, altamente contaminantes de alimentos. Por ltimo, se recomienda realizar ensayos de inhibicin y bioconservacin con sobrenadantes de BAL neutralizados para verificar si la inhibicin se debe a la accin de los cidos orgnicos y otros componentes o a la accin de biocinas producidas por las BAL. V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS American Public Health Association. (1998). Compenduim of methods for the Microbiological Examination of foods. Second edition. 106 107p.

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Zaritzky, N. E. (2002). Preservacin III. Congelacin de Alimentos. Temas en Tecnologa de Alimentos. Volumen 1. CYTED. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo. Instituto Politcnico Nacional. Alfaomega Grupo Editor. Mxico. 131186.

AGRADECIMIENTOS Los autores manifiestan sus agradecimientos a la empresa Cerdos del Valle S.A. (Cervalle S.A.) por el soporte econmico ofrecido a esta investigacin y a la Escuela de Ingeniera de Alimentos de la Universidad del Valle.