BACTERIAS PRODUCTORAS DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA) COMO UNA ALTERNATIVA PARA LA REMOCIN DE CARGA ORGNICA DE AGUAS RESIDUALES DOMESTICAS.

Otero Ramrez Ivn Daro 21

Fernndez Izquierdo Pablo

1- Investigador grupo en Biotecnologa Microbiana, Universidad de Nario. ivra636@gmail.com Doctor en Ciencias Biolgicas rea Microbiologa. Director del grupo de investigacin en Biotecnologa Microbiana. Universidad de Nario.pabfdez@gmail.com

INTRODUCCIN Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polisteres intracelulares sintetizados por diferentes especies bacterianas. Las caractersticas fsicas de los PHA como la densidad, punto de fusin, fuerza de tensin y elongacin son similares a los plsticos derivados del petrleo, pero, a diferencia de stos, los PHA se degradan completamente hasta CO2 y H2O, (1,2). El costo de produccin de los PHA es superior al del polipropileno (3, 4). Por esta razn, en los ltimos aos han surgido varias alternativas para mejorar la produccin de estos biopolmeros, entre las cuales se destacan: la utilizacin de microorganismos recombinantes, la polimerizacin in vitro catalizada por PHA polimerasa, y el uso de ingeniera gentica para la sntesis de PHA en plantas (1,2). Con el propsito de reducir los costos de produccin de este tipo de polister, se han realizado investigaciones para obtener polmero a partir de las aguas residuales domesticas e industriales, (5, 6, 7). En el mismo sentido, se propone un sistema integral para la purificacin de aguas residuales con bacterias productoras de PHA, (8). No obstante, para desarrollar un sistema de tratamiento de aguas resdales que a la vez reduzca la concentracin de materia orgnica y obtenga PHA como subproducto, se requiere el conocimiento de los factores que pueden incidir en la sntesis del polmero como la fisiologa del microorganismo, los factores ambientales que inciden en la produccin de PHA, la composicin del sustrato, ente otros. En este sentido, presentamos un estudio a escala de laboratorio donde se evaluaron los factores ambientales que inciden tanto en la remocin de materia orgnica como en la sntesis de PHA a partir de aguas de origen domiciliario. METODOLOGIA: Aislamiento de bacterias productoras de PHA: muestras de agua de diferentes sectores del rio Pasto fueron diluidas con agua peptonada hasta 10-8 y se inocularon en cajas petri con agar plate count suplementado con glucosa y azul nilo al 0,01%. La seleccin de aislados productores de PHA se hizo de acuerdo a la metodologa propuesta por Ostle, A. &Holt, J. (1982), se describi los atributos culturales y microscpicos de los aislados seleccionados (10,11). Aquellos aislados con fluorescencia naranja fueron preservados. Produccin de PHA. Se realiz un diseo experimental de bloques al azar. De cada aislado bacteriano se prepar un inoculo con una densidad ptica de 0,05, de estos se transfirieron 10 ml a caldos de fermentacin constituido por peptona 2,5g/l, extracto de levadura 2,5g/l y glucosa 20g/l, se incubaron a 30 grados centgrados y 100rpm por 72 horas, de cada uno de los aislados se obtuvieron muestras tanto para cuantificacin de biomasa por gravimetra y extraccin del polmero segn metodologa propuesta por (12).

La identificacin de las unidades monomricas del polmero se realiz por cromatografa de gases en un cromatgrafo GCMS QP5000 Shimadzu, equipado con una columna capilar de slica fundida MDNS de treinta metros de longitud, 0.25 mm de dimetro interno y 0.25 m de espesor de pelcula. El inyector y el detector de temperaturas de flama ionizante se configuraron a 250 grados centgrados. El programa de temperatura fue de 60C durante dos minutos incrementndose 6C por minuto hasta un mximo de temperatura de 220 C (12). Adems se utilizaron como patrones de referencia esteres de metilo de 3 hidroxibutirato y 3 hidroxivalerato. Caracterizacin molecular de los aislados bacterianos: Para la extraccin de DNA se sigui el protocolo de Rivera et al 1995. La amplificacin del gen ribosomal rRNA 16s se realiz utilizando los primers A (Directo) 5 GGAGCAAACAGGATTAGATACCC 3 y J (Reverso) 5 TTCTCCTAGGGCTACCTTGTTAC 3. El volumen final de PCR fue de 50ul, y las condiciones de corrida fueron: 95C por 2 minutos; 30 ciclos a 94C por 2 minutos, 55C por 1 minuto y 72C por 3 minutos; una extensin final de 10 minutos a 72C. Los productos de la PCR se enviaron a MACROGEN (Corea) para su secuenciacin; la edicin de secuencias se hizo con los programas BioEdit versin 7.0.4; lite versin 2.01 y la base de datos Chromas RibosomalDatabaseProject fue usada para la caracterizacin parcial a travs de la similaridad con las secuencias del gen ribosomal 16S Efecto de factores nutricionales y operacionales en la remocin de materia orgnica de las aguas residuales domsticas por bacterias productoras de (PHA): Se aplico el diseo experimental factorial Plackett-Burman, teniendo en cuenta 6 factores nutricionales (N, P, Mg, K, SO4 y Zn) y 2 operacionales (aireacin y velocidad de carga orgnica (VCO)). De acuerdo a este diseo, se construy un sistema de fermentacin continua constituido por bioreactores con un volumen de trabajo de 2l; alimentados con agua residual domstica. Los nutrientes NH4 Cl, NaH2 PO4, MgCl2 , KCl, Na2 SO4, ZnCl2 fueron adicionados individualmente a partir de soluciones acuosas a una concentracin del 0,01%. El suministro de aire se realizo a 2 nivel 0,075 y 0,125 VVM/min. Como inoculo para este sistema de fermentacin se utiliz el aislado seleccionado como mejor productor de PHA. El periodo de arranque fue de dos semanas y el tiempo de operacin fue de 2 meses, con tiempos de retencin de 9, 12 y 15 horas. Como variables de respuesta se determin el porcentaje de remocin de carga orgnica medida en DQO y la produccin de PHA. RESULTADOS Y DISCUSION De las 3693 colonias aisladas, el 14.1% presentaron la fluorescencia caracterstica de bacterias productoras de

PHA agrupndose en 44 aislados. De los aislados seleccionados el E1M10 produjo 2g/l de PHA en un medio sin optimizar utilizando glucosa como fuente de carbono. Los anlisis de RNAr 16s indican que el aislado E1M10 corresponde a Bacillus algicola. Es de sealar que ms de 250 especies bacterianas se han descrito como acumuladoras de diferentes tipos de PHA (13). Entre todo este grupo de bacterias las especies del gnero Bacillus tales como Bacillus megaterium, B. cereus, B. sphaericus, B. circulans, B. brevis y B. licheniformis, son reconocidas como productoras de Polihidroxialcanoato (14, 15). Sin embargo, no tememos informacin sobre estudios de produccin de PHA con Bacillus algicola y se deben realizar otros estudios moleculares para confirmar la identificacin de este microorganismo. El anlisis de los tiempos de retencin obtenidos por cromatografa de gases, revelan que el PHA de Bacillus algicola E1M10 se compone por monmeros 3-hidroxibutirato. Entre los factores que inciden tanto en la remocin de materia orgnica como en la produccin de PHA se destaca, N, P, y VCO. Por otra parte, en algunos tratamientos se obtuvieron remociones del 93% y con produccin de PHA de 110 mg/L. Este hecho demuestra que las bacterias que sintetizan polihidroxialcanoatos pueden aplicarse al tiempo tanto para la remocin de materia orgnica como tambin para produccin del biopolmero. CONCLUSIONES Se logr aislar una cepa nativa del genero Bacillus con potencial para la produccin industrial de 3polihidroxibutirato. Se implement a escala laboratorio un sistema de flujo continuo que per miti remover hasta el 93,6% de materia orgnica presente en las ARD de la ciudad de pasto. Se obtuvo hasta 110mg/l de PHB como subproducto del proceso de tratamiento de ARD. Por consiguiente, las ARD de la ciudad de Pasto puedes ser un sustrato barato para la obtencin de bioplstico Las bacterias productoras de PHA pueden utilizarse como una alternativa para el tratamiento de ARD generando desarrollo biotecnolgico para la regin. AGRADECIMIENTOS Los autores manifiestan su agradecimiento a la Vicerrectora de Investigaciones, Postgrados y Relaciones Internacionales de la Universidad de Nario, por la financiacin de este proyecto. BIBLIOGRAFIA 1. Suriyamongkol, P., Weselake, R., Narine, S., Moloney, M. y Shah, S. Biotechnological approaches for the production of polyhydroxyalkanoates in microorganisms and plants A review. Biotechnology Advances 25 pp 148 175. 2007. 2. Harding, K., Dennis, J. Von Blottnitz, H. y Harrison, S. Environmental analysis of plastic production processes: Comparing petroleum based

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