24.8.

BIOCATLISIS O CATLISIS ENZIMTICA

a. Caractersticas de la catlisis enzimtica. Las reacciones catalizadas por enzimas
se caracterizan generalmente por cuatro aspectos:
i. El incremento de velocidad es enorme (del orden de 10
6
a 10
12
veces).
ii. Presentan una especiIicidad alta, entendiendo por especiIicidad que la enzima es
capaz de catalizar selectivamente la reaccion de ciertos compuestos llamados sus
tratos; sin embargo no actua Irente a otras moleculas.
iii. Tienen caracter de catalisis microheterogenea, en el sentido de que, si bien es
Iormalmente homogenea, el catalizador es una macromolecula que posee
algunos puntos activos en los que se cataliza la reaccion de manera analoga a
como ocurre en la catalisis heterogenea.
iv. Presentan un pH optimo y una temperatura optima.
En la actualidad, es bien conocido que todas las enzimas estan Iormadas por moleculas
de proteina. Asimismo, una enzima puede tener uno o mas sitios activos donde la
reaccion con el sustrato tiene lugar. Un sitio activo suele contener solamente unos pocos
residuos de aminoacidos, sin embargo el resto de la molecula de proteina se requiere
para mantener la integridad de la estructura tridimensional:
Se ha propuesto que la especiIicidad de una enzima se puede explicar en terminos de la
teoria llave-cerradura. Asi, el sitio activo se supone que tiene una estructura rigida,
como si Iuese una cerradura, mientras que la molecula de sus trato tiene la estructura
complementaria y Iuncionaria como una llave (Iig. 24-5). En ciertos aspectos esta teoria
ha sido modiIicada para tener en cuenta la Ilexibilidad de las proteinas en disolucion y
para explicar los Ienomenos de cooperatividad, no obstante, puede ser en principio un
simil adecuado.

A continuacion se van a exponer las bases matematicas del tratamiento de la cinetica
enzimatica.
b. Anlisis de los datos en cintica enzimtica. En cinetica enzimatica se preIiere
utilizar el metodo diIerencial de las velocidades iniciales en lugar del metodo de
integracion. Las razones son varias: puede haber cambio de pH, darse un Ienomeno de
inhibicion por producto, etc., pero la mas importante es que las reacciones enzimaticas
normalmente no tienen un orden sencillo, sino que presentan ecuaciones de velocidad
complejas.
Para analizar esta ultima causa imaginemos, por ejemplo, una serie de experimentos
cineticos en los que mantenemos la concentracion de enzima constante pero variamos la
concentracion inicial de sustrato (Iig. 24-6):
i. Si la concentracion de sustrato es baja, la reaccion parece comportarse como de
orden 1, Y si aplicaramos el metodo de integracion a la curva cinetica
observariamos una tendencia hacia el orden 1 (Iig. 24-6 a).
ii. Si la concentracion de sustrato es alta, la reaccion parece comportarse como de
orden 0 (Iig. 24-6 b).
iii. Para concentraciones de sustrato intermedias el metodo de integracion no
revelaria ni como aproximado, ningun orden (ni 1 ni 0) sino la necesidad de una
ecuacion de velocidad compleja (Iig. 24-6 c).














Para evitar estos problemas los estudios de cinetica enzimatica se llevan a cabo
midiendo las velocidades iniciales a distintas concentraciones de sustrato. Esto es Iacil,
ya que una representacion de la concentracion de sus trato Irente al tiempo da
generalmente una linea recta en al menos el primer 5-10 de reaccion, de Iorma que,
hallando la pendiente de estos tramos rectos iniciales, se obtendran las velocidades
iniciales a las distintas concentraciones de sustrato (Iig. 24-7). Viniendo estas
velocidades en unidades de concentracion/tiempo, por ejemplo mol de sustrato/l/min,
y las concentraciones de sus trato en mol/l.
Si hacemos estas medidas para un margen amplio de sustrato (p. ej., 10
-5
M10
-3
M) y
representamos los resultados, tendremos en muchos casos un comportamiento como el
de la Iigura 24-8.

Es decir, al principio la velocidad se incrementa notablemente con el aumento de |S| y
al Iinal se va estabilizando en un valor constante mediante un comportamiento de tipo
asintotico.
Matematicamente esta curva esta representada por la ecuacion de una hiperbola
rectangular:
[ ]
[ ]

+
= |24.35|
Esta seria, pues, la ecuacion empirica de velocidad, donde y son parametros.
Conocido este comportamiento experimental, el siguiente paso sera proponer los
mecanismos adecuados que puedan explicar esta ecuacion de velocidad.
c. Mecanismo de Michaelis-Menten bajo la aproximacin del equilibrio rpido. En
1913, Michaelis y Menten propusieron un mecanismo para explicar la dependencia de la
velocidad inicial con la concentracion de sustrato. El esquema que ellos consideraron
Iue el siguiente:
E P ES S E
k
k
k
+ +

2
1
1

donde E y S son la enzima y el sustrato, ES es un complejo enzima-sustrato y P es el
producto Iormado. La enzima E que se libera en la ruptura del complejo ES vuelve a
iniciar la ruta de nuevo.
Las concentraciones de la enzima y el sustrato inmediatamente despues de empezar la
reaccion seran:
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] ES S S
ES E E
=
=
0
0

Sin embargo, las condiciones experimentales generalmente son tales que:
|S|
0
~~ |E|
0

por lo que
|S|
0
~~ |ES|
y por tanto
[ ] [ ]
0
S S
Michaelis y Menten asumieron que k
-1
~~ k2, por lo que el primer paso (Iormacion del
complejo ES) se puede tratar como un proceso de equilibrio rapido. La constante de
equilibrio para la disociacion de este complejo viene dada por:
[ ][ ] [ ] ES S E k k K
s
= =
1 1
|24.36|
Teniendo ahora en cuenta el siguiente balance de materia
[ ] [ ] [ ] ES E E + =
0

se deduce que
[ ] [ ] [ ] ES E E =
0

de manera que al sustituir |E| en la ecuacion |24.36| queda:
[ ] [ ] ( )[ ] [ ] ES S ES E K
s
=
0

de donde
[ ] [ ] [ ] [ ][ ] S ES S E ES K
s
=
0

y por tanto
[ ] [ ] [ ] ( ) [ ] ( ) S K S E ES
s
+ =
0

Y como la velocidad de reaccion viene dada por
[ ] ( ) [ ] ( ) [ ] ES k dt P d dt S d
2
= = =
se tiene que
[ ] [ ]
[ ] S K
S E k
s
+
=
0 2
|24.37|
que vemos que tiene la misma Iorma de hiperbola rectangular que la ecuacion empirica
de velocidad |24.35|
[ ] [ ] ( ) S b S a + =
donde
[ ]
s
K b v E k a = =
0 2

Para comprender el signiIicado Iisico de la ecuacion |24.37| veamos algunos casos
limites de esta:
i. A concentraciones bajas de sustrato, cuando |S| K
s
, entonces la ecuacion se
reduce a
( )[ ] [ ] S E K k
s 0 2

de Iorma que la reaccion es de orden 1 respecto a |S| ya que
[ ] ( ) 1 orden S cte =
comportamiento que
puede apreciarse en la
Iigura 24-9.


ii. A concentraciones altas de sus trato se tiene que:
[ ] [ ]
0 2
E k K S
s

y entonces la ecuacion de velocidad se hace de orden O respecto al sustrato,
alcanzandose un valor maximo de velocidad que ya no se ve incrementado por
sucesivos aumentos de |S| (Iig. 24-10); es decir, en estas condiciones todas las
moleculas de enzima se encuentran practicamente bajo la Iorma de complejo ES.

Se dice entonces que la enzima se encuentra saturada por sustrato. Este valor maximo
es:
[ ]
max 0 2
J E k =
con lo cual la ecuacion de |24.37| queda:
[ ]
[ ] S K
S J
s
+

=
max

esta expresion recibe el nombre de ecuacion de Michaelis-Menten y presenta dos
parametros: V
max
, conocido como velocidad maxima, y Ks, conocido como constante de
disociacion del complejo ES.
d. Mecanismo de Michaelis-Menten bajo la aproximacin del estado estacionario.
Formalmente el mecanismo es identico al anterior:
E P ES S E
k
k
k
+ +

2
1
1

En 1925 Briggs y Haldane demostraron que no es necesario hacer la suposicion de
Michaelis y Menten segun la cual la enzima y el sustrato se encuentran en equilibrio
termodinamico. Postularon en su lugar que, al poco tiempo de mezclar la enzima y el
sustrato, la concentracion del complejo enzima-sustrato alcanzara un valor constante, de
Iorma que se puede aplicar el tratamiento del estado estacionario, el cual se deIine como
aquel en que la concentracion de ES permanece practicamente constante.

La Iigura 24-11 muestra la variacion a lo largo del tiempo de las diIerentes especies
participantes en la reaccion y pone de maniIiesto la situacion del estado estacionario.
Bajo la hipotesis del estado estacionario, se tiene que
[ ] [ ][ ] [ ] [ ] ES k ES k S E k dt ES d
2 1 1
0 =


y considerando de nuevo el balance de materia
[ ] [ ] [ ] ES E E + =
0

resulta que
[ ] [ ] ( )[ ] [ ] [ ] ES k ES k S ES E k
2 1 0 1
0 =


que, resolviendo para |ES|, queda
[ ] [ ] [ ][ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ] [ ] ( )
2 1 1 0 1
2 1 1 0 1
k k S k S E k ES
ES k ES k S ES k S E k
+ + =
+ + =

De nuevo, como [ ] ES k
2
= , tenemos ahora que
[ ] [ ] [ ] ( ) S k k k S E k k
1 2 1 0 1 2
+ + =


dividiendo ahora numerador y denominador por k
-1
, nos queda
[ ] [ ]
[ ] S
k
k k
S E k
+
+
=

1
2 1
0 2

y llamando ahora constante de Michaelis al termino (k
-1
k
2
)/k
1
se tiene que
[ ] [ ]
[ ] S K
S E k
M
+
=
0 2

y haciendo k
2
|E|
0
V
max
, igual que antes, resulta que
[ ]
[ ] S K
S J
M
+

=
max

ecuacion llamada tambien de Michaelis-Menten y que presenta los parametros V
max

(velocidad maxima) y K
M
(constante de Michaelis). La Iorma de esta ecuacion es la
misma que la deducida originariamente por Michaelis y Menten |24.38|, solo que ahora
K
M
=K
s
a menos que k
-1
k
2
en cuyo caso K
M
y K
s
coincidirian. Por tanto, la K
M
en rigor
no es la constante termodinamica de equilibrio para la disociacion del complejo enzima-
sustrato; desaIortunadamente, sin embargo, algunas veces se le asimila este signiIicado
y se suele pensar en terminos de que a una K
M
alta (disociacion alta) corresponde una
baja aIinidad del sustrato por la enzima, y viceversa, que a una K
M
baja (disociacion
baja) corresponde una gran aIinidad del sus trato por la enzima.
En resumen, pues, el tratamiento del estado estacionario es el mas general para el
mecanismo de Michaelis-Menten y debe preIerirse Irente al tratamiento del equilibrio
rapido, el cual por otra parte no es sino un caso particular del primero cuando se cumple
que k
-1
~~ k
2

e. Determinacin grfica de los parmetros K
M
y V
max
. Existen diIerentes
representaciones graIicas que permiten obtener los parametros K
M
y V
max
de la ecuacion
de Michaelis-Menten. A continuacion se describiran los procedimientos mas usuales.
i. Representacion directa. Como [ ] [ ] ( ) S K S J
M
+ =
max
, la representacion de u Irente a
|S| nos proporciona la graIica de la Iigura 24-12.
Como se deduce
Iacilmente de la
ecuacion el valor de
la asintota cuando
[ ] S es igual al
valor de V
max
y la
pendiente a la curva en el origen es igual a V
max
/K
M
. Por ultimo, cuando la velocidad
inicial es igual a la mitad de la velocidad maxima, tenemos que
[ ] [ ] ( ) S K S J J
M
+ =
max max
2
de donde
[ ] S K
M
=
Esta representacion no parece muy adecuada para la determinacion de los parametros,
debido a la diIicultad practica de trazar una asintota a la curva. Por eso, se han
propuesto algunas Iormas de linealizar la ecuacion de Michaelis-Menten que se exponen
a continuacion.
ii. Representacion doble inversa (o de Lineweaver-Burk). Tomando inversos en la
ecuacion de Michaelis-Menten queda:
[ ] S J
K
J
M
1 1 1
max max
+ =

|24.40|
Asi, una representacion
de l/u Irente a 1/|S| (Iig.
24-13) da una linea
recta de ordenada en el
origen 1/V
max
y de
pendiente (K
M
/V
max
).
Por otra parte cuando
(l/u) 0 (abscisa en el
origen), entonces:

iii. Representacion de Eadie-Hofstee. Si en la ecuacion doble inversa |24.40|
multiplicamos por u*V
max
nos queda:
[ ] S J
K J
J
J J
M
1
max
max
max
max max

|24.41|
de donde
[ ] ( ) S K J
M
1
max
+ =
y por tanto
[ ] ( ) S K J
M
=
max

Segun esta transIorma-
cion, si representamos u
Irente a /|S| (Iig. 24-14) obtendremos una linea recta de ordenada en el origen V
max
y
de pendiente -K
M
. La abscisa en el origen vale V
max
/K
M
.
iv. Representacion de Hanes. Multiplicando en la ecuacion doble inversa |24.40|
por |S| nos queda:
[ ]
[ ] S
J J
K S
M
+ =
max max
1

|24.42|
de manera que si representamos |S|/ Irente a |S| se obtendra una recta de ordenada en
el origen K
M
/V
max
y
de pendiente 1/V
max

(Iig. 24-15). La abs-
cisa en el origen
vale -K
M
.

Si cada punto experimental se hubiese obtenido como el valor medio de cinco replicas,
tendriamos entonces que cada valor de llevaria asociada su desviacion estandar:

media
+o con lo que las representaciones nos quedarian como en la Iigura 24-16, donde
se han simulado datos por ordenador para una enzima de V
max
10 y K
M
5 * 10
-5
, con
10 puntos espaciados logaritmicamente entre 10
-5
y 10
-3
M en sustrato, y donde las
barras de error corresponden a unas desviaciones estandar de +0,10 .
Aunque la representacion doble inversa es la mas utilizada en los estudios cineticos, en
realidad no es la mejor graIica ya que distribuye los puntos de una manera poco
uniIorme y ademas tiende a dar mas importancia a los puntos de menor concentracion
en sustrato, que son los mas inexactos. La representacion de Eadie-HoIstee distribuye
mas uniIormemente los puntos y es la mas aconsejable, sobre todo para detectar
posibles desviaciones de la linealidad. La representacion de Hanes no distribuye tan
uniIormemente los puntos
como la de Eadie-HoIstee,
pero es mejor que la de
Lineweaver-Burk porque da
mas importancia a los
puntos de mayor
concentracion, que son los
mas exactos (Iig. 24-16).
f. Unidades de los parmetros V
max
y K
M
. Como se acaba de ver, la ecuacion de
Michaelis-Menten queda
[ ] [ ] ( ) S K S J
M
+ =
max

donde V
max
representa la velocidad maxima alcanzable, es decir, la velocidad cuando la
concentracion total de enzima se encuentra Iormando el complejo ES. Como tal
velocidad que es, vendra expresada en las unidades en que se expresa la velocidad ,
bien en (mol/l)/s, en (mol/l)/min, (mol/l)/s, ... etc.
Por otra parte:
[ ]
0 2 max
E k J =
de donde
[ ]
0 max 2
E J k =
esta constante k
2
es llamada numero de recambio (turnover number) y normalmente se
expresa en s
-1
:
( ) ( ) ( ) [ ] ( ) l mol E s l mol J s k
0 max
1
2
=

El nombre de numero de recambio (turnover number) viene a signiIicar el numero de
veces que la enzima actua por segundo, o, lo que es lo mismo, cuantas veces pasa a
traves del complejo ES y es regenerada (turn over) al liberarse el producto. En otras
palabras, el numero de recambio es el numero de moleculas de sustrato transIormadas
por segundo por una sola molecula de enzima, eso si bajo condiciones tales que la
enzima este completamente saturada con sustrato. Los numeros de recambio de la
mayoria de las enzimas para sus sustratos Iisiologicos caen en el intervalo de 1 a 10
5
s
-l
.
Como se deduce de su determinacion, k
2
solo se puede evaluar si se conoce
perIectamente |E|
0
(V
max
se determina graIicamente), lo que supone saber su
concentracion en mol/l (por tanto es necesario conocer la masa molecular de la enzima);
es decir, supone trabajar con enzimas puras y bien caracterizadas. En caso contrario |E|
0

es una cantidad desconocida, cosa Irecuente en la practica, ya que es diIicil obtener
enzimas muy puriIicadas. Por esta razon, muchas veces en lugar de utilizarse el numero
de recambio, lo que se maneja es la llamada actividad especiIica (A
esp
) que se expresa
como:
[ ]

l
E mg
E
l mol
mgE
mol
A
esp
0
min
min

donde es la velocidad de reaccion en unas condiciones estandar de pH, temperatura y
concentracion saturante de sustrato, |E|
0
es la concentracion de enzima y mgE signiIica
miligramos de enzima. Tambien se puede expresar la actividad especiIica en Iorma de
unidades/mgE, donde una unidad (U) se deIine como la cantidad de enzima que cataliza
la transIormacion de 1 mol de sustrato en productos en 1 minuto, bajo condiciones
estandar, es decir:

E mg
U
A o
E mg
mol
A
esp esp
min

LaUnion Internacional de Bioquimica ha recomendado una nueva unidad, el katal (kat),
que es la cantidad de enzima que cataliza la transIormacion de 1 mol de sustrato en
productos en un segundo, bajo condiciones estandar. El Iactor de conversion es 1 kat
6 * 10
7
unidades.
En cuanto a K
M
, vimos que venia dada por K
M
(k
-1
k
2
)/k
1
expresandose
normalmente en unidades de mol/l (como se deduce Iacilmente recordando que K
M
es la
concentracion de sustrato para la que la velocidad es la V
max
/2, o tambien poniendo las
unidades correspondientes para k
-1
, k
2
y k
1
y simpliIicando). Los valores de K
M
para la
mayoria de las enzimas estan entre 10
-2
y 10
-7
M.
24.9. INHIBICIN DE LA CATLISIS ENZIMTICA
Un inhibidor es una sustancia que, cuando interactua con una enzima, origina una
disminucion de la actividad catalitica.
En la naturaleza existen muchos inhibidores de enzimas que tienen como mision
controlar el metabolismo dentro de la celula. Por ejemplo, la actividad de muchas
enzimas es regulada por un mecanismo de tipo retroalimentario o Ieedback, por el cual
el producto Iinal de una ruta metabolica actua como inhibidor especiIico de la primera
enzima de la cadena:
) * '


... ..........
2 1

Desde un punto de vista Iarmaceutico, son de gran importancia tambien los inhibidores
sinteticos, como ocurre en la actualidad con algunos Iarmacos. Ademas, los inhibidores
son una poderosa herramienta en el estudio de los mecanismos de reaccion enzimaticos,
naturaleza del sitio activo ... , etc.
Hay dos tipos de inhibidores: reversibles e irreversibles. En la inhibicion reversible se
Iorma un complejo de adicion, no covalente, entre la enzima y el inhibidor, existiendo
un equilibrio entre la enzima y el inhibidor. Por su parte en la inhibicion irreversible se
Iorma un enlace covalente entre la enzima y el inhibidor, la inhibicion aumenta
progresivamente con el paso del tiempo y se puede alcanzar una inhibicion completa si
la concentracion del inhibidor irreversible supera la de la enzima.
a. Tipos de inhibicin reversible. Existen principalmente cuatro tipos de inhibicion
reversible que se discuten a continuacion.
i. Inhibicion competitiva. El sustrato y el inhibidor compiten por el mismo sitio
activo de la enzima, las reacciones que se producen son
EI
k k
I
oductos E ES S E
k
k
k
1 1
Pr
2
1
1

+
+ +

El complejo EI no Iorma productos, es lo que se llama un complejo no reactivo (dead
end).
Aplicando ahora el tratamiento del estado estacionario a ES y EI, Y considerando de
nuevo el balance de materia
[ ] [ ] [ ] [ ] EI ES E E + + =
0

se llega a la siguiente ecuacion de velocidad
[ ]
[ ]
[ ] S
K
I
K
S J
I
M
+

=
1
max
|22.44|
donde K
I
es la constante de disociacion del complejo EI:
i i I
k k K

=
y K
M
y V
max
tienen el signiIicado habitual: K
M
(k
-1
k
2
)/k
1
V
max
k
2
|E|
0
.
Como puede observarse, la Iorma de ecuacion de velocidad es de tipo Michaelis-
Menten, que en general podriamos escribir denominando los parametros como aparentes
(ap) en la Iorma:
[ ] [ ] ( ) S K S J
ap
M
ap
+ =
max

siendo para este caso
[ ] ( )
I M
ap
M
ap
K I K K
J J
+ =
=
1
max max

En deIinitiva, la presencia del inhibidor competitivo deja la V
max
inalterada y multiplica
la K
M
por el Iactor (1 (|I|/K
I
)).
El comportamiento graIico de esta ecuacion de velocidad se puede deducir de Iorma
analoga a lo ya visto para la ecuacion de Michaelis-Menten, como se detalla a
continuacion. Aunque ya se ha comentado que la representacion de Eadie-HoIstee es
mejor que la de Lineweaver-Burk (doble inversa), esta ultima se utiliza mas en los
estudios de inhibicion.
- Representacion directa. Una representacion de Irente a |S| segun la ecuacion |24.44|
aparece en la Iigura 24-19. Como puede verse en esta Iigura, la V
max
no se modiIica
(esto es logico si pensamos en
terminos topologicos del
mecanismo, ya que un exceso de
sustrato desplazaria toda la
enzima del complejo El para
Iormar ES). Por su parte la
ap
M
K
varia con la concentracion de
inhibidor.

- Representacion doble Inversa. Tomando inversos en la ecuacion anterior |24.44|
queda la siguiente expresion:
[ ]
[ ] S K
I
J
K
J
I
M
1
1
1 1
max max

+ + =

de manera que al representar l/ Irente a 1/|S| se obtendran lineas rectas de la misma
ordenada en el origen 1/V
max

y de pendiente (K
M
/V
max
)
(1|I|/K
I
) que se incrementa
con la concentracion de
inhibidor, comportamiento
que puede apreciarse en la
Iigura 24-20.
Un ejemplo de inhibicion
competitiva podria ser la reaccion de deshidrogenacion del succinico:
COOH
H C HOO
CH
COOH C H
Fumarico CH
COOH
Succinico
succinica nasa deshidroge
2
2


Se da una inhibicion competitiva en presencia de acido malonico (COOH-CH
2
-COOH);
esta inhibicion se origina debido a la gran semejanza entre succinico y malonico. Algo
analogo ocurre con el acido oxalico (COOH-COOH) que actua tambien como inhibidor
competitivo.
ii. Inhibicion no competitiva clasica. En este tipo de inhibicion se admite que el
inhibidor, I, puede Iormar complejos tanto con la enzima libre (E) como con el
complejo enzima-sustrato (ES); el mecanismo seria el siguiente:
ESI EI
k k
I I
k
oductos E ES S E
k k
i i

+ +
+ +
1
2 1
Pr

Suponemos que la constante de disociacion (K
I
k
-i
/k
i
) es la misma para la disociacion
del complejo EI que para la del complejo ESI. Por otra parte, EI y ESI serian complejos
del tipo que hemos llamado no reactivo (dead end). Aplicando de nuevo el tratamiento
del estado estacionario, la ecuacion de velocidad que se obtiene es
[ ] ( )
[ ]
[ ] S K
S
K I
J
M
I
+

+
=
1
max
|24.46|
Esta ecuacion es de la Iorma
[ ] [ ] ( ) S K S J
ap ap
M
+ =
max

que comparada con
[ ] [ ] ( ) S K S J
M
+ =
max

queda
[ ] ( ) ( )
I
ap
K I J J + = 1 1
max max

y
M
ap
M
K K
Es decir, en este tipo de inhibicion se modiIica la V
max
pero la K
M
permanece inalterada.
- Representacion directa. La
representacion de Irente a
|S| segun la ecuacion |24.46|
conduce a los resultados de
la Iigura 24-21, donde puede
apreciarse como la V
max

disminuye a medida que
aumenta la concentracion de
inhibidor, mientras que la
K
M
no se ve inIluida por la concentracion de inhibidor.
- Representacion doble inversa. Tomando inversos en la ecuacion |24.46| queda:
[ ] [ ]
[ ] S K
I
J
K
K
I
J
I
M
I
1
1 1
1 1
max max

+ +

+ =

|24.47|
de manera que al representar 1/ Irente a 1/|S| se obtiene el comportamiento que
aparece en la Iigura 24-22, es decir que todas las rectas tienen pendientes y ordenadas
en el origen que aumentan con la concentracion de inhibidor y que convergen en un
mismo punto sobre el eje 1/|S|.

Ejemplos de inhibiciones no competitivas clasicas son las reacciones reversibles entre
los grupos sulIhidrilos de los residuos de cisteina y los iones de los metales pesados:
iii. Inhibicion acompetitiva. El modelo para esta inhibicion asume que el inhibidor I
puede combinarse solamente con el complejo enzima-sustrato, quedando el
siguiente mecanismo de reaccion
ESI
k k
I
k
oductos E ES S E
k k
i i

+
+ +
1
2 1
Pr

La ecuacion de velocidad que se obtiene aplicando el tratamiento del estacionario es:
[ ] ( )
[ ]
[ ] ( )
[ ] S
K I
K
S
K I
J
I
M
I
+
+

+
=
1
1
max
|24.48|
donde K
I
k
-i
/k
i
es la constante de disociacion del complejo ESI. Esta ecuacion tiene la
Iorma:
[ ]
[ ] S K
S J
ap
M
ap
+

=
max

de donde
[ ] ( ) ( )
I
ap
K I J J + = 1 1
max max

y
[ ] ( ) ( )
I M
ap
M
K I K K + = 1 1
y tambien
M
ap
M
ap
K J K J
max max
=
Es decir, se modiIica la V
max
y la K
M
pero no el cociente V
max
/K
M

- Representacion directa. la representacion de Irente a |S| segun la ecuacion |24.48|
conduce a los resultados de
la Iigura 24-23, donde
puede apreciarse como
varia la V
max
y la K
M
en
presencia del inhibidor.




- Representacion doble inversa. tomando inversos en la ecuacion |24.48| queda
[ ]
[ ] S J
K
K
I
J
M
I
1
1
1 1
max max
+

+ =

de manera que al
representar 1/ Irente a
1/|S| se obtiene el
comportamiento que nos
aparece en la Iigura 24-24.
Como ya se ha podido
comprobar, el cociente K
M

V
max
permanece inalterado,
por esta razon las rectas resultan paralelas en esta representacion.
Ejemplos de inhibicion acompetitiva son la inhibicion de pepsin-peptidasa por
hidracina, la inhibicion de arilsulIatasa por cianuro o hidracina, y la inhibicion de
algunas deshidrogenasas por cianuro, hidroxilamina o tioles.
iv. Inhibicion no competitiva mezclada (o inhibicion mezclada). En la inhibicion no
competitiva clasica se hizo una suposicion bastante restrictiva, segun la cual KI
era la misma para la union del inhibidor tanto a la enzima libre (E) como al
complejo enzima-sustrato (ES). Un mecanismo mas general seria suponer que
son distintas:
ESI EI
k k k k
I I
k
oductos E ES S E
k k
i i
i i
' '
1
2 1
Pr

+ +
+ +

que da una ecuacion de velocidad de estado estacionario:
[ ] ( )
[ ]
[ ] ( )
[ ] ( )
[ ] S
K I
K I
K
S
K I
J
I
I
M
I
+
+
+

+
=
'
'
max
1
1
1
|24.50|
donde
I
K y
'
I
K son las constantes de disociacion de EI y ESI. Esta ecuacion es de la
Iorma
[ ]
[ ] S K
S J
ap
M
ap
+

=
max

Es decir, ahora tanto V
max
como K
M
y el cociente V
max
/K
M
se ven alterados:
[ ] ( ) ( )
[ ] ( ) [ ] ( ) ( )
( ) [ ] ( )
I M
ap
M
ap
I I M
ap
M
I
ap
K I K J K J
K I K I K K
K I J J
+ =
+ + =
+ =
1
1 1
1 1
max max
'
'
max max

En la inhibicion mezclada, V
max
siempre disminuye a medida que la concentracion de
inhibidor aumenta, mientras que la variacion de K
M
depende de los valores relativos de
I
K y
'
I
K : si
I
K
'
I
K entonces
ap
M
K aumenta en presencia del inhibidor, y viceversa, si
I
K ~
'
I
K ,
ap
M
K disminuye en presencia del inhibidor.
- Representacion directa. La representacion de Irente a |S| segun la ecuacion |24.50| y
para el caso
I
K
'
I
K
conduce al comportamiento
observado en la Iigura 24-
25. El caso
I
K ~
'
I
K seria
analogo pero con
ap
M
K
disminuyendo con la
concentracion de inhibidor.

- Representacion doble inversa. Tomando inversos en la ecuacion |24.50|, queda
[ ] [ ]
[ ] S K
I
J
K
K
I
J
I
M
I
1
1 1
1 1
max
'
max

+ +

+ =

|24.51|
de manera que al
representar l/ Irente a l/|S|
para el caso de
I
K
'
I
K
obtendremos los resultados
de la Iigura 24-26, en la que
puede observarse como las
lineas rectas se
interseccionan por encima
del eje 1/|S|.
Por el contrario si
I
K ~
'
I
K , las lineas rectas se interseccionan por debajo del eje l/|S|
(Iig. 24-27).

b. Inhibicin irreversible. En este caso, el inhibidor Iorma una union covalente con la
molecula de enzima, modiIicando de Iorma permanente un grupo Iuncional necesario
para la catalisis. Ahora el inhibidor no se puede separar por tecnicas de dialisis o
similares como ocurre en la inhibicion reversible.
La eIectividad de un inhibidor irreversible no se determina por la constante de equilibrio
sino por la constante de velocidad a la que se produce la union.
Un ejemplo puede ser la inhibicion de la acetilcolinesterasa por diisopropilI1uoroIosIato
(gas nervioso utilizado en la guerra). La acetilcolina es un neurotransmisor que actua
como mensajero entre el nervio y la celu1a del musculo y debe ser destruido una vez
que ha desempeado su mision, pues de lo contrario se presentarian convulsiones. La
destruccion de la acetilcolina se lleva a cabo por la siguiente reaccion de hidrolisis
catalizada por la enzima acetilcolinesterasa:
( ) ( )
colina na acetilcoli
COOH CH CH CH HOCH O H CH N CH COO CH + +
3 3 3 2 2 2 3 3 2 3

La inhibicion irreversible por diisopropilIluoroIosIato se produce mediante la Iormacion
de un enlace covalente entre el atomo de IosIoro y el oxigeno hidroxilico de un residuo
de la enzima:
3 3
3 3
3
3 3
CH CH
H C CH H C CH
O CH O
HF H C O P O En:ima H C O P F OH En:ima
CH O CH O

+ +

El estudio cinetico de estos inhibidores irreversibles se hace de manera convencional
segun el metodo de integracion; para ello se admite que la concentracion inicial de
enzima (|E|
0
) es proporcional a
0
y la concentracion de enzima a un tiempo t (|E|) es
proporcional a
t
. Un mecanismo sencillo podria ser el siguiente:
I E I E
k
+
el cual sigue una cinetica de pseudoprimer orden respecto a E, cuando la concentracion
de inhibidor esta en exceso:
[ ][ ] [ ] E k v E I k ' = =
que tiene como ecuacion integrada la siguiente:
t k
t
' ln
0
=

que usualmente se maneja como:
t k
t
' ln
0
=

De manera que al representar ln (v
t
/v
0
) Irente a t debe dar una linea recta que pasa por el
origen y de cuya pendiente negativa se obtiene k'. Como por otra parte k' k|I|, se
determina Iinalmente el valor de k a partir de la concentracion del inhibidor.