Medicin del crecimiento Microbiano

Determinacin del nmero de microorganismos en una muestra. Determinacin de la actividad metablica, biomasa y protenas. Mtodos para el conteo de microorganismos viables
Cuenta en placa Vaciado en placa Extendido en placa Asa calibrada Miles y Mirsa Filtracin

Nmero ms probable (NMP)

Mtodos para el conteo de microorganismos totales

Recuento microscpico Cuenta de Breed Cmara de Neubauer Cmara de Prettof Hausser

Turbidimetra

Mtodos para el conteo de microorganismos viables

Estos mtodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos. Requieren al menos 24 horas para el cultivo y la interpretacin de resultados. Se emplean medios de cultivo generales, enriquecidos selectivos y diferenciales dependiendo de los microorganismos a cuantificar.

Cuenta en placa
Se determina el nmero de microorganismos en una muestra en relacin a las colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean soluciones diluidas o diluciones de una muestra concentrada para que cada colonia formada provenga de un solo microorganismo aunque algunas agrupaciones no pueden ser separadas por las diluciones. Se utilizan principalmente para la cuantificacin de bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Se reporta como: UFC ****/unidad de volumen o peso

Diluciones y cuenta en placa

http://people.rit.edu/~gtfsbi/IntroMicro/20081Mic robialGrowthCh6.htm

Vaciado en placa y extendido en placa

Cuenta de colonias
Criterio: 25 a 250 UFC por placa

Pueden emplearse medios selectivos y diferenciales

Miles y Misra
Involucra la preparacin de diluciones seriadas de una suspensin bacteriana. Las placas son divididas en sectores separados. Se inocula cada sector una gota empleando una Pipeta Pasteur calibrada o bien micropipetas inoculando 0.02mL. Las placas se incuban de 18 a 24 horas a la temperatura adecuada (37C). Se toman en cuenta los sectores donde hay menos de 20 UFC. El nmero de bacterias viables se obtiene calculando la media de cada dilucin en las repeticiones realizadas.

Asa calibrada
La utilizacin de agujas o asas calibradas permite tomar volmenes pequeos, que son inoculados en la superficie del agar mediante la tcnica de siembra masiva. Las colonias son contadas y se multiplican por el factor de dilucin del asa empleada. El uso ms frecuente de est mtodo es en el urocultivo. Se determinan las UFC/g o mL de muestra.

Filtracin

La membrana de celulosa retiene a los microorganismos en su malla con poros de 0.250.45mm. Esta membrana se transfiere a un medio de cultivo para el desarrollo de colonias.

Nmero Ms Probable (NMP)

Tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, proporciona una estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.

Nmero Ms Probable (NMP)

10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. Cochran, W. C. (1950). Estimation of bacterial densities by means of the most probablenumber Biometrics 6, 105-116.

Tablas de Cochran (1950)

Pos. tubes 0.10 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0.01 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0.001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 MPN/g <3.0 3.0 3.0 6.1 6.2 9.4 3.6 7.2 11 7.4 11 11 15 16 Conf. lim. Low -0.15 0.15 1.2 1.2 3.6 0.17 1.3 3.6 1.3 3.6 3.6 4.5 4.5 High 9.5 9.6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 0.10 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Pos. tubes 0.01 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 0.001 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 MPN/g 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 Conf. lim. Low 4.5 8.7 8.7 8.7 8.7 4.6 8.7 17 9 17 37 40 18 37 High 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420

2
2 2 2 2

0
0 0 1 1

0
1 2 0 1

9.2
14 20 15 20

1.4
3.6 4.5 3.7 4.5

38
42 42 42 42

3
3 3 3 3

2
2 3 3 3

2
3 0 1 2

210
290 240 460 1100

40
90 42 90 180

430
1,000 1,000 2,000 4,100

27

8.7

94

>1100

420

--

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#tab5

Anlisis Microbiolgico del Agua

Mtodos para el conteo de microorganismos totales

Estos mtodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos y muertos los cuales no se pueden distinguir. Son rpidos pero se requiere contar en algunos casos con curvas de calibracin.

Recuento microscpico

Cmaras de Petroff-Hausser y de Neubauer

Limitaciones: Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero de muestras. No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean observadas al microscopio. No distinguen clulas vivas de muertas.

Cuenta de Breed
Muestra a evaluar (directa o diluida) Microscopio Objetivo micromtrico Asa calibrada o micropipeta Portaobjetos Colorantes de Gram u otros colorantes.

Cuenta de Breed
A
10mL
2 cm 1cm

Teir

rea de la muestra = bxh y convertir a mm2

Observar 10 campos, contar las bacterias de cada uno de ellos y obtener el promedio X

B C
Factor= Am/Ac

Calcular el nmero de bacterias por mL X x Factor x 100 = bacterias_____ /mL 100 es la dilucin inicial al tomar 0.01mL
1mL = 1000mL 1cm = 10 000mm

Determinar el rea del campo: A= pxr2 (mm2)

Extra: Uso del equipo micromtrico

Nefelometra (Turbidimetra)

La turbidez producida por el crecimiento microbiano de microorganismos unicelulares puede ser medida de acuerdo a la capacidad de absorber la luz. La muestras a determinar son generalmente translcidas cuando no presentan crecimiento microbiano.

Longitud de onda (l) Bacterias 540nm Protozoarios 580nm Levaduras 600nm

Turbidez

La turbidez se determina por la densidad ptica (DO) que puede ser expresada como Absorbancia, % de Transmitancia o Unidades Klett (UK).

Escala de Mc Farland
Tubo
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Vol (mL) H2SO4 1%

10 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1

Vol (mL) BaCl2 1%

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

# de celulas /mL
0 3x108/mL 6x108/mL 9x108/mL 12x108/mL 15x108/mL 18x108/mL 21x108/mL 24x108/mL 27x108/mL

10

9.0

1.0

30x108/mL

Klett-Summerson Colorimeter

Actividad metablica (produccin de CO2)

CO2 + 2NaOH Na2CO3 + H2O Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2NaCl NaOH (residual) + HCl NaCl + H2O

1. 2. 3. 4.

Muestra de suelo Recipiente con agua Solucin de NaOH 0.5 N Aguja #20 (Venocat calibre 17) 5. Jeringa desechable de 20mL 6. Tubo de plstico flexible de 12 mm de dimetro 7. Plastilina

Peso seco y determinacin de protena

El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Es til para grandes volmenes. La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

La protena se relaciona al crecimiento, por lo que un incremento en la cantidad de protena en el paquete celular indica que hay mayo concentracin de clulas.

Curva patrn para la determinacion de protenas por el mtodo de Lowry

Curva de crecimiento Viables vs Totales