Alcoholemiaporcromatografíadegas

ACADEMIA DE POLICA WALTER MENDOZA MARTNEZ INSTITUTO DE ESTUDIOS SUPERIORES
POSTGRADO EN CRIMINALISTICA TESIS PARA OPTAR AL TITULO DE PERITO QUIMICO
TEMA: VERIFICACION DE LA LINEALIDAD DEL MTODO PARA DETERMINAR ALCOHOLEMIA POR CROMATOGRAFA DE GAS. PRESENTADO POR: ING. ARMANDO SALVADOR ARCE VALLE ING. JULIO CESAR MONDOY PEREZ
MANAGUA, 18 DE MAYO DEL 2006.
VERIFICACION DE LA LINEALIDAD DEL MTODO PARA DETERMINAR ALCOHOLEMIA POR CROMATOGRAFA DE GAS.
DEDICATORIA
A NUESTRO DIOS, QUE NOS PERMITE TENER LA SABIDURA, INTELIGENCIA Y CONOCIMIENTO PARA LA ELABORACIN DE ESTE TRABAJO.
A NUESTRAS MADRES QUE NOS HAN APOYADO INCONDICIONALMENTE CON EL ANEHELO DE AYUDAR EN NUESTRA LABOR A FAVOR DE LA SOCIEDAD NICARAGENSE.
A NUESTROS AMIGOS QUE DE ALGUNA MANERA CONTRIBUYERON CON SU EXPERIENCIA Y NOS DIERON EL APORTE NECESARIO PARA REALIZAR EL ESTUDIO.
AGRADECIMIENTOS
A DIOS QUE NOS HA GUIADO PARA ALCANZAR NUESTRAS METAS.
A NUESTRAS MADRES, ESPOSAS, HIJOS Y AMIGOS QUE EN TODO MOMENTO NOS HAN BRINDADO SU APOYO Y COMPRENSIN.
A NUESTRA ASESOR, Lic. FRANCISCO ARMANDO PEREZ GARCIA, QUIEN NOS ORIENTO Y AYUDO PARA PODER ELABORAR ESTA INVESTIGACIN CIENTFICA.
A TODOS LOS AMIGOS Y PERSONAS QUE NOS AYUDARON DE DIVERSAS FORMAS, EN ESPECIAL AL SUBMISIONADO ABELARDO ALVARADO MARTINEZ E ING. RAMONA MEDINA OPORTA.
INDICE
INTRODUCCION 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 Aspectos Introductorios Justificacin Problema Metodologa Hiptesis Objetivos General y Especficos Marco Terico 1.7.1 Toxocintica 1.7.1.1 Absorcin 1.7.1.2 Distribucin 1.7.1.3 Metabolismo 1.7.2 Factores que Modifican la Cintica del Etanol 1.7.2.1 Edad 1.7.2.2 Consumo Cronico de Alcohol 1.7.2.3 Ayuno 1.7.2.4 Sexo 1.7.2.5 Tabaquismo 1.7.2.6 Peso 1.7.2.7 Interaccin con Frmacos 1.7.3 Tipos de Muestras para Anlisis de Alcoholemia 1.7.4 Cromatografa de Gas 1.7.4.1 Representacin del Cromatgrafo de Gas 1.7.4.2 Parmetros Relevantes en un Cromatgrama de Gas 1.7.4.2.1 Tiempo de Retencin 1.7.4.2.2 rea del Pico 1.7.4.2.3 Factor de Capacidad 1.7.4.2.4 Platos Tericos 1.7.4.2.5 Factor de Selectividad 1.7.4.2.6 Resolucin 1.7.4.3 Calibracin del Cromatgrafo de Gas 1.7.4.3.1 Modelos de Calibracin 1.7.4.4 Protocolos de Calibracin 1.7.4.4.1 Calibracin Externa 1.7.4.4.2 Calibracin Interna 1.7.4.4.3 Mtodo de Dilucin Isotpica
1 1 3 4 5 6 7 8 9 9 10 10 11 11 12 12 12 12 12 13 13 15 15 16 16 17 18 19 19 19 20 21 23 23 23 24 3
1.7.4.4.4 Agregado Patrn 1.7.5 Verificacin de Linealidad
24 24
DISEO METODOLOGICO 2.1 2.2 2.3 2.4 Tipo de Estudio Universo Instrumentos de Recoleccin de la Informacin Montaje del Mtodo de Determinacin de Alcohol en Sangre por Cromatografa de Gas 2.4.1 Materiales 2.4.2 Reactivos 2.4.3 Equipos 2.4.4 Preparacin del Reactivo Patrn 2.4.5 Preparacin del Patrn Interno 2.4.6 Preparacin del Reactivo Inico 2.4.7 Procedimiento para la Preparacin de Muestras Construccin de la Curva de Calibracin Verificacin de la Linealidad del Mtodo 2.6.1 Regresin por Mnimos Cuadrados
26 26 26 26 26 27 27 27 27 28 28 29 29 29 30
2.5 2.6
PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
32
Capitulo 3.1 Clculos para la Preparacin del Reactivo Patrn 32 Capitulo 3.2 reas del Etano y Propanol Ledas en el Cromatograma 34 Capitulo 3.3 Procesamiento de la Informacin en Microsoft Excel 35
CONCLUSIONES
37
RECOMENDACIONES
38
BIBLIOGRAFIA
39
7.
GLOSARIO
41
ANEXOS
43
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.7.1 Concentracin y Efecto de las Diferentes Alcoholemias Tabla 2.1 Patrones Standars para Calibrar el Mtodo Determinacin de Alcoholemia Tabla 3.1 reas de Etanol y N-Propanol ledas en los Cromatogramas Tabla 3.2 Datos Procesados en Microsoft Excel
15 28 34 35
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.7.1 Figura 1.7.2 Figura 1.7.3 Figura 3.1
Distribucin de Alcohol en el Cuerpo Esquema del Cromatgrafo de Gas Ilustracin de un Cromatograma Ri Versus Concentraciones (g/L)
11 16 18 36
1.
INTRODUCCION
En este capitulo se presentan los Aspectos Introductorios, Justificacin, Problema de la Investigacin, Metodologa utilizada, Hiptesis, Marco Terico, Objetivos General y Especficos. 1.1 ASPECTOS INTRODUCTORIOS
El alcoholismo es una causa de degeneracin orgnica y psquica (aspecto social). De acuerdo a la mayor parte de las estadsticas, aproximadamente el 10% de la poblacin adulta tiene patrones de consumo patolgico de alcohol. Por tanto, el alcoholismo es un problema mdico-social, tanto en sus orgenes como en sus consecuencias y al tiempo es un problema de salud individual. El problema econmico, social y sanitario que genera el alcoholismo, es sin duda muy superior al de los otros txicos sociales (tabaco, narcticos, alucingenos, etc.)
Est ampliamente demostrada la relacin directa entre la concentracin de alcohol en la sangre y el grado en que las reacciones y las decisiones del ser humano se ven afectadas. El estudio de todo lo referente a esta sustancia es de un alto inters, tanto cientfico como humano.
El mtodo de oxidacin-reduccin fue el primero que se utiliz en el Laboratorio Central de Criminalstica con el nombre de mtodo de Widmark, para determinar alcohol etlico en sangre lquida, este fue introducido por la hermana repblica de Cuba durante el periodo de los 80s, como un aporte para el desarrollo y modernizacin de tcnicas cientficas de investigacin criminalstica.
Desde el ao 1996, es aplicado en el Laboratorio Central de Criminalstica de la Polica Nacional de Nicaragua el mtodo de determinacin de alcohol etlico en sangre liquida por cromatografa de gas, tanto el mtodo como la tcnica, fueron aportados por la Cooperacin Espaola. En el ao 1998, se deja de aplicar la cromatografa de gas debido a la desestabilizacin del sistema electrnico del equipo, y es hasta en el ao 2003 que se logra poner nuevamente en funcionamiento. Han transcurrido aproximadamente seis aos desde que se inicia a aplicar la tcnica de cromatografa de gas para determinar alcohol etlico en sangre liquida, sin embargo hasta la actualidad el mtodo, no ha sido sometido a un proceso de verificacin y mucho menos de validacin.
Debido a la gran responsabilidad que conllevan los resultados de los anlisis emitidos en los informes periciales del Laboratorio Central de Criminalstica ante la sociedad de Nicaragua, este estudio se enfoca en verificar la capacidad del mtodo de alcoholemia de producir resultados que son directamente proporcionales a la concentracin de etanol en sangre liquida.
El Laboratorio Central de Criminalstica esta en camino a ser un laboratorio acreditado de alta competencia tcnica de acuerdo a la norma ISO 17025. El cumplimiento de la norma ISO 17025 supone la incorporacin en los procedimientos de trabajo de nuevos requisitos tcnicos, de gestin y organizacin. El estudio sobre la verificacin de la linealidad del mtodo de alcoholemia juega un papel fundamental en el proceso de acreditacin ya que es una gua sobre si se debe validar el mtodo, modificarlo o desecharlo.
1.2.
JUSTIFICACION
El mtodo para determinar alcoholemia, por cromatografa de gas, aplicado actualmente y facilitado por la cooperacin espaola en su noble propsito de contribuir a la
modernizacin de mtodos y tcnicas cientficas del laboratorio central de criminalstica, no tiene ningn estudio, que demuestre en trminos cuantitativos su confiabilidad.
Reviste gran importancia realizar un estudio experimental, que permita demostrar la confiabilidad de la tcnica cromatogrfica para determinar alcoholemia, y para lograr establecer un procedimiento adecuado sobre la calibracin y verificacin del la linealidad de la misma.
1.3.
PROBLEMA DE LA INVESTIGACION
El Laboratorio Central de Criminalstica de la Polica Nacional de Nicaragua, cuantifica el grado de intoxicacin de personas por alcohol en la sangre, a travs de la tcnica cromatogrfica de gas, pero no hay un estudio que sustente la confiabilidad de esta determinacin que se emite en los peritajes qumicos y es defendida en juicio oral y publico.
La falta de un estudio que verifique la confiabilidad del mtodo para determinar alcoholemia por cromatografa de gas, puede originar ante los tribunales de justicia y por ende ante la sociedad nicaragense, una percepcin de desconfianza sobre la forma en que el Laboratorio Central de Criminalstica de la Polica Nacional contribuye en el esclarecimiento de una gran cantidad de hechos delictivos en los que se ven involucrados sujetos sospechosos de haber consumido alcohol.
1.4
METODOLOGA
Para verificar la linealidad del mtodo para determinar alcoholemia por cromatografa de gas se sigui la siguiente metodologa
(6)
Se Preparararon soluciones de muestra a seis niveles de concentracin, los cuales se encuentran dentro de los intervalos establecidos para este tipo de anlisis. Se evalu estadsticamente la regresin lineal del mtodo. Se Calcul el coeficiente de regresin con la totalidad de los datos
10
VERIFICACION DE LA LINEALIDAD DEL MTODO PARA DETERMINAR ALCOHOLEMIA POR CROMATOGRAFA DE GAS. 6. Guzmn, Silka. Procedimiento General para Validacin de Mtodos y Manipulacin de Items de Ensayo, segn la Norma 17025:2005, seccin 5.4 y 5.8. 2006.
1.5
HIPTESIS
La Linealidad del Mtodo de Determinacin de Alcoholemia por Cromatografa de Gas, permite afirmar que este mtodo es adecuado para efectuar los anlisis de las pericias qumicas relacionadas con alcohol etlico en sangre liquida.
11
1.6
OBJETIVOS
1.6.1 OBJETIVO GENERAL
Verificar la linealidad del Mtodo para Determinar Alcoholemia por Cromatografa de Gas a travs del calculo del Coeficiente de Regresin Lineal (r).
1.6.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Describir el procedimiento analtico para realizar La Verificacin de la Linealidad del Mtodo para Determinar Alcoholemia por Cromatografa de Gas.
2. Aplicar el modelo lineal de la ecuacin de la recta punto-pendiente, para obtener el coeficiente de linealidad a travs del Mtodo de Regresin Lineal.
12
1.7
MARCO TEORICO
El Etanol es una sustancia de Importancia toxicolgica dada su accin farmacolgica depresora del sistema nervioso central (SNC) y el abuso creciente del consumo de bebidas alcohlicas lo convierte en un problema de importancia mdico social debido a que los individuos alcoholizados pueden ser causa de trastornos y accidentes de los cuales son imputables.
Las vas de penetracin posibles de los alcoholes son la digestiva, la respiratoria, y la absorcin a travs de la piel. En el caso del etanol, la intoxicacin ms frecuente ocurre cuando el individuo ingiere cantidades excesivas de esta sustancia por el consumo de bebidas alcohlicas fermentadas y/o destiladas
(1)
Las bebidas alcohlicas se emplean desde la antigedad como forma de almacenar alimentos, pueden dividirse en tres grupos (2):
I.
Bebidas De Bajo Contenido Alcohlico
Se tratan fundamentalmente de las cervezas, con graduaciones alcohlicas de 2 a 6 .
II.
Bebidas De Contenido Alcohlico Medio
Se trata fundamentalmente de los vinos, con graduaciones que oscilan entre los 6-8 de los vinos afrutados jvenes a los 18-20 de vinos excepcionalmente 0fuertes. Por termino medio, los vinos de mesa tienen entre 11y 14 .
1. Ladron J. Toxicologa Medica. McGraw-Hill-Interamericana de Espaa. Madrid. 1995. 2. Belitz H.D. Qumica de los Alimentos. ACRIBIA, S.A. Zaragoza, Espaa. 1988.
13
III.
Bebidas Destiladas
Se trata de bebidas obtenidas por destilacin de vinos (brandy) o fermentos de maltas (whisky, ginebra, etc.) u otras soluciones azucaradas. Actualmente, salvo bebidas de gran calidad o regidas en fabricacin por normas muy estrictas, suele recurrirse a proceso de fabricacin denominado eufemsticamente destilacin en fro, consiste en la mezcla de alcohol, agua y otros aditivos. Estas bebidas suelen tener una graduacin de 40-50 , pero frecuentemente la superan, incluso sin anunciarlo en la etiqueta con el fin de disimular mediante el sabor ardiente del alcohol la escasa calidad del producto. Algunas bebidas destiladas alcanzan hasta 80 . Este grupo de bebidas no slo resultan txicas por el etanol, sino por otros compuestos que sirven para darles sus especiales caractersticas organolpticas, pero tambin tienen efectos txicos especficos. 1.7.1 TOXOCINTICA
El alcohol pasa del estomago a la sangre por simple mecanismo de difusin, al cabo de una o media hora y se reparte por todo el organismo.
La defensa del organismo contra la intoxicacin, viene en seguida por la oxidacin y eliminacin de etanol 1.7.1.1
(1).
Absorcin
La gran solubilidad del etanol en agua y grasas le permite atravesar fcilmente por difusin pasiva las distintas membranas biolgicas, pudiendo ser absorbido por cualquier va, y distribuyndose rpidamente en el organismo. La ruta mas importante es la digestiva. Entre los 30-60 minutos siguientes a su ingestin se absorbe aproximadamente el 80-90 % de la dosis.
14
El contenido gstrico, y las comidas grasas especificas, frenan notablemente la absorcin y multiplican por dos o tres el tiempo de la misma. Puesto que las bacterias del lumen del tubo digestivo son capaces de metabolizar el metanol, si el tiempo es prolongado (2-3 horas), hasta un 20% de la dosis ingerida puede ser catabolizada de esta forma. 1.7.1.2 Distribucin
El etanol se distribuye rpidamente en los tejidos, de acuerdo a su contenido en agua. Los tejidos ms perfundidos componen su compartimento superficial. La mayor parte del alcohol circula en agua plasmtica, mantenindose una relacin de1.3/1 en su concentracin entre plasma y sangre total.
1.7.1.3 Metabolismo
Dependiendo de la velocidad de ingreso, aproximadamente el 80-90 % del etanol absorbido se metaboliza. Puesto que el etanol se produce en numerosos procesos de fermentacin, incluso espontneos, el organismo humano esta bien adaptado a su metabolizacin en la que se obtiene 7.1 kcal/g. El metabolismo, y por tanto en trminos generales la eliminacin del etanol sigue un proceso cintico de orden cero a partir de alcoholemias superiores a 0.16 g/L. La velocidad media de disminucin de la alcoholemia es de 15-20 mg/dL/h (0.15-0.2 g/L/h). Existen tres grupos de enzimas que oxidan el alcohol, la ADH (alcohol deshidrogenasa), el MAOS (sistema microsomal oxidante de etanol) y las catalasas, las cuales eliminan un tomo de hidrogeno de la molcula produciendo acetaldehdo. La mayor parte de su proceso biotransformativo se desarrolla en el hgado, si bien otros tejidos, como el rin, intestino etc. son tambin metablicamente activos.
Etanol acetaldehido CH 3 CH 2 OH CH 3 Acetaldehido CH 3 CHO acetato CH 3
CHO
COO
15
Efectuado por el sistema enzimtico, la combustin completa llega a bixido de carbono y agua con desprendimiento de 7.1 cal/g de alcohol. La eliminacin de alcohol se hace
por medio de los pulmones y riones pasa a la orina por difusin a una concentracin prxima a la de la sangre. La desintoxicacin por va pulmonar y renal, no representa mas que el 1 al 5 % .
Fig. 1.7.1 Distribucin del Alcohol en el Cuerpo
1.7.2 FACTORES QUE MODIFICAN LA CINTICA DEL ETANOL
El comportamiento cintico del alcohol etlico varia en los consumidores en dependencia de los factores que a continuacin se describen.
1.7.2.1
Edad
Los mayores tienen, en general un volumen de distribucin menor que los de mediana edad por acmulo de tejido adiposo y ello facilita que se incremente la alcoholemia respecto al grupo de sujetos jvenes. 16
1.7.2.2
Consumo Crnico de Alcohol (Alcohlicos)
Aquellos que tienen una severa afectacin funcional heptica disminuyen el metabolismo del etanol y tienden a incrementar la alcoholemia.
1.7.2.3
Ayuno
La ingesta alcohlica en ayunas origina una alcoholemia superior a la que se produce con el estomago lleno por una mayor absorcin en el intestino, al facilitar la evacuacin gstrica y permanecer menos tiempo que en el estomago. 1.7.2.4 Sexo
Los niveles de alcohol sanguneos en mujeres son superiores a los ms alcanzados por varones a causa de que tiene una mejor absorcin porque presentan escasos metabolismos gstricos, adems por su mayor proporcin relativa de tejido adiposo. 1.7.2.5 Tabaquismo
El consumo de cigarrillos disminuye el nivel de alcoholemia al facilitar el metabolismo del etanol.
1.7.2.6
Peso
La presencia de abundante tejido adiposo origina una disminucin en el volumen de distribucin del sujeto lo que conlleva aun incremento de la alcoholemia en comparacin con sujetos delgados , de poca grasa que tienen un volumen de distribucin relativo mas amplio y por tanto la alcoholemia en iguales condiciones de consumo ser menor en estos ltimos.
17
1.7.2.7
La Interaccin con Frmacos
Incrementa la alcoholemia, en el caso de anestsico se incrementa el nivel de anestesia, en barbitricos aumenta la depresin, en las benzodiazepinas acta similar a los barbitricos, y en caso contrario hay algunos que bloquean el metabolismo del etanol. 1.7.3 TIPOS DE MUESTRAS PARA ANLISIS DE ALCOHOLEMIA La posibilidad de que la intoxicacin etlica coexista con otras intoxicaciones y/o estados patolgicos justifica que en todo enfermo en que se sospeche esta intoxicacin se practique una determinacin de alcoholemia. De esta forma, no solo se confirma el diagnstico, sino que a la vista de las concentraciones de etanol en sangre, puede establecerse con cierta seguridad, si el cuadro puede ser debido slo a la impregnacin alcohlica, o por el contrario intervienen factores intercurrentes. Las muestras mas frecuentemente empleadas en el diagnostico de la intoxicacin por etanol son: sangre, orina, y aire exhalado.
Las determinaciones en sangre son, evidentemente, las ms eficaces, y mediante el anlisis del resto de los biofluidos, lo que en realidad se intenta es calcular las concentraciones de etanol en sangre. Las determinaciones en sangre requieren que se tome sangre venenosa, previo lavado de la piel con una solucin desinfectante exenta de alcohol. Debe emplearse un anticoagulante de los que el mas indicado es el fluoruro sdico (NaF), que no solo acta como anticoagulante al secuestrar el calcio, sino que adems inhibe el metabolismo de las clulas sanguneas y otros microorganismos, que como contaminantes, pueden hallarse en la muestra. Esto tiene la doble ventaja de que impide el metabolismo del alcohol presente en la muestra, as como la fermentacin alcohlica de los azcares, lo que evita errores en la determinacin por defecto o exceso, respectivamente.
18
El recipiente en el que se guarde la muestra debe permanecer hermticamente cerrado hasta su procesamiento en el laboratorio, y la cmara de aire ha de ser mnima, al igual que ocurre con los otros txicos voltiles. Si es necesario hacer la determinacin en suero o plasma, debe hacerse en la relacin de etanol suero/sangre total es 1.3/1. Debe tenerse en cuenta que las muestras muy contaminadas , o aquellas en que ha llegado a producirse fermentacin (putrefaccin), los niveles de etanol pueden ser alterados, tanto por defecto (consumo de alcohol por las bacterias), o exceso (produccin de alcohol por fermentacin alcohlica de los azucares), por los que los niveles obtenidos son tan solo orientados, y carecen de valor judicial. Hasta su llegada al laboratorio de criminalista, si las muestras han de permanecer almacenadas ms de 10 horas, conviene mantenerlas refrigeradas a 4 0C.
Las determinaciones de alcohol en orina no son tiles, en la prctica, para conocer el grado de impregnacin alcohlica, pues tan solo la orina uretral es vlida para ello. Sin embargo, pueden ser tiles en el diagnostico de la ingesta crnica de alcohol, especialmente como control de sustancias de abuso, y en la orientacin rpida de enfermos en quienes se sospecha la intoxicacin aguda.
Las determinaciones en aire espirado son extraordinariamente tiles como diagnostico orientativo de la intoxicacin, y de hecho, se han impuesto en la practica, como elemento de prueba en los controles de embriaguez en conductores, e incluso encuentran inters en la practica clnica. El aire til para el anlisis es solamente el aire alveolar, por lo que los dispositivos de medida han de desechar la primera porcin del aire exhalado, que proviene de las vas areas superiores. Si el paciente ha ingerido alcohol u otro compuesto que interfiera en la determinacin, durante los 10-15 minutos previos a la determinacin, los resultados pueden falsearse, al pasar al aire parte de la sustancia disuelta en la saliva. Generalmente se considera como limite de tiempo para hacer este tipo de anlisis desde la ultima ingesta de alcohol 15 minutos, durante los cules solo puede beberse agua
(3).
19
El mtodo de cromatografa de gas permite cuantificar la concentracin de alcohol etlico en la sangre, que indican el grado de intoxicacin de la persona como se puede observar en la Tabla 1.7.1
3. http://www.etanolemia y etilometria.prc.ds/008/cologica/.pdf
TABLA 1.7.1 CONCENTRACION Y EFECTO POR LAS DIFERENTES ALCOHOLEMIAS
CONCENTRACIN % (mg/L) 0 50 100 150 200 300 400
EFECTOS Negativo Ausencia de Intoxicacin, no hay sntomas que afecten la conduccin de un vehculo Se observan trastornos perdida de equilibrio, mala coordinacin as como variaciones en el pulso. Sntomas de embriaguez Embriaguez bien definida, no apto para conducir Posibilidad de coma, embriaguez completa Coma, posible muerte
Fuente: Ladron J. Toxicologa Medica. McGraw-Hill-Interamericana de Espaa. Madrid. 1995.
1.7.4
CROMATOGRAFIA DE GAS
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija y otra mvil. En cromatografa gaseosa, la fase mvil es un gas que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. Esta fase fija puede ser un slido poroso (cromatografa gasslido o CGS), o bien una pelcula lquida delgada que recubre un slido particulado o las paredes de la columna (cromatografa gas-lquido o CGL). En el primer caso, el proceso que produce la separacin es la adsorcin de los componentes de la mezcla sobre la superficie slida y en el segundo, la particin de los mismos entre las fases lquida y gaseosa.(4)
20
1.7.4.1
Representacin del Cromatgrafo de Gas
Un instrumento para cromatografa gaseosa puede representarse por el siguiente esquema (Fig. 1.7.2):
3. http://www.ataonline.org.ar/002/acta_toxicologica/ATA11-2.pdf
Fig. 1.7.2 Esquema del Cromatgrafo de Gas. El gas portador (fase mvil) proviene de cilindros provistos con vlvulas reductoras de presin. La muestra se introduce en el inyector con una microjeringa a travs de un septum de goma. All se produce la vaporizacin instantnea de la misma y su introduccin en la corriente de gas. La columna se halla dentro de un horno de temperatura variable, lugar donde se realiza la separacin de los componentes de la muestra. El detector produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia a medida que cada componente separado fluye a travs de l. Esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma); idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El integrador calcula adems el rea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia. (4) 1.7.4.2 Parmetros Relevantes en un Cromatgrama
Los parmetros que a continuacin se presentan son los resultados de un anlisis de cromatografa de gas (5).
21
1.7.4.2.1 Tiempo de Retencin (tr) Es el tiempo transcurrido desde la inyeccin de la misma hasta la aparicin del mximo correspondiente al pico de ese componente. Un caso especial lo constituye un componente que no es retenido por la fase fija (no se reparte entre fases), el cual saldr de la columna antes que cualquier sustancia a un tiempo llamado tiempo muerto (t 0). De esta manera, es posible definir tr como el tiempo que un cierto componente permanece en la fase estacionaria:
t' r
(Ecc. 1.7.1)
1.7.4.2.2 rea del Pico Existen varias tcnicas para la determinacin de esta rea de un pico cromatogrfico:
Integracin manual. Se realiza con los mtodos siguientes:
Mtodo geomtrico Triangulacin : en esta tcnica se trazan lneas tangentes a cada lado del pico. La altura se mide desde la lnea base hasta la interseccin de las dos tangentes. El ancho se mide tomando la interccin de las dos lneas tangentes con la lnea base. Utilizando la formula A= * altura del pico * la base del pico. Las limitaciones de esta tcnica estn en el trazado de las lneas tangentes, un pequeo error al trazar las tangentes puede afectar las medidas de la altura. Altura por ancho a la mitad de la altura.
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Mtodo mecnico Planimtricos
Corte y pesada: esta tcnica requiere recortar el pico del Cromatgrama, luego pesar en una balanza analtica. El recorte y pesada depende de mucho de la habilidad del operador. Puede introducirse errores por cambio del papel, la grasa de la mano del operador, homogeneidad del papel. Generalmente se recomienda utilizar una fotocopia del Cromatgrama para no destruir el original.
Integracin automtica Electromecnica Electrnica.
La siguiente figura (1.7.3), es la de un cromatgrafo tpico donde se puede ilustrar los resultados que se obtienen en un anlisis de CG
(5)
Fig. 1.7.3 Ilustracin de un Cromatograma
23
1.7.4.2.3 Factor de Capacidad (k) Se define como:
k'
molesdel componente en la fase estacionaria molesdel componente en la fase gaseosa

(Ecc.1.7.2)
que, en funcin de la constante de particin (K), del volumen de la fase fija (V L) y del volumen de la fase mvil (VG) se puede escribir como:
k' k
V L V G
(Ecc. 1.7.3)
y en funcin de los tiempos de retencin:
k'
1.7.4.2.4 Plato Terico
r t 0
t' r t 0
(Ecc. 1.7.4)
Con respecto a la columna, se define como plato terico a una capa estrecha de la misma en donde se produce el equilibrio de particin de un compuesto entre la fase fija y la mvil. Para una columna de longitud L, el nmero de platos tericos (N) es:
t L 16 r H W
2
(Ecc. 1.7.5)
siendo H la altura de plato terico, uno de los parmetros que determina la capacidad del proceso cromatogrfico para separar dos compuestos dados, y W el ancho de los picos a la altura de la lnea de base.
A partir de las definiciones anteriores, es posible definir parmetros asociados a la separacin de dos sustancias A y B que caracterizan la eficiencia de una separacin. Siendo B la sustancia con mayor tr estos parmetros son:
24
1.7.4.2.5 Factor de Selectividad Se define como:

k' B K' A t ' (B) r t ' (A) r
(Ecc. 1.7.6)
1.7.4.2.6 Resolucin
Se define como:
R 1 1 k' 4 1 k' N 1 1 k' 4 1 k' L H
(Ecc.1.7.7) Teniendo en cuenta que k, , L y H dependen de la temperatura, tipo de fase fija, longitud de columna y flujo de fase mvil, es posible mejorar una separacin optimizando estos parmetros experimentales (5).
1.7.4.3 Calibracin del Cromatgrafo de Gas Se entiende por calibracin al conjunto de operaciones que establece, bajo condiciones especficas, la relacin entre las seales producidas por un instrumento analtico y los correspondientes valores de concentracin o masa del juego de patrones de calibrado.
Los factores que determinan la calidad de una calibracin son: La precisin de las medidas: estimada a travs de la repetitividad y la reproducibilidad de las medidas. La repetitividad se evala a travs del clculo de la desviacin estndar relativa (RSD%) de la medida de los patrones de calibrado. En la prctica puede ocurrir que la repetitividad para los patrones sea ms pequea que para las muestras, por lo que ser necesario fabricar patrones similares a las muestras o agregar el analito a las mismas. 25
Exactitud de los Patrones. El valor de concentracin o masa asignado a cada patrn trae aparejado un error pequeo si es preparado a partir de reactivos puros (grado analtico) con estequiometra bien definida. Este error en general se desprecia, frente al error en las medidas de las seales producidas por el instrumento. Validez de la Calibracin. Generalmente es el factor ms importante. Cuando se calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que ste responder de igual manera a los patrones as como a las muestras, aunque estas tengan una matriz relativamente diferente. Si estas diferencias son muy grandes, pueden llegar a invalidar el proceso de calibracin. Es necesario estar completamente seguro de que el calibrado es vlido antes de utilizarlo para obtener el valor de concentracin
de muestras incgnita. En caso contrario, pueden cometerse serios errores en la determinacin.
1.7.4.3.1 Modelos de Calibracin
La forma de calibracin ms sencilla es la que utiliza un solo patrn. Este modelo es til slo cuando el patrn es absolutamente confiable. Adems, se supone que la seal cero del instrumento corresponde al cero de concentracin de la especie que se quiere determinar. Entre el cero y valor obtenido para el patrn se realiza una interpolacin lineal, pero la extrapolacin ms all de la concentracin de patrn no es recomendada. El modelo correspondiente es: seal = constante x concentracin y=mx (Ecc.1.7.8)
La constante m es llamada sensibilidad y corresponde a la constante de proporcionalidad entre la seal y la concentracin. Esta proporcionalidad es til sobre un restringido intervalo de valores. 26
A valores muy bajos de concentracin la seal es demasiado pequea y est sujeta a una gran incertidumbre. A valores muy altos la proporcionalidad dada en ecuacin (1.7.8) puede dejar de ser vlida. Este modelo es utilizado en muy pocos casos.
Si la respuesta a concentracin cero de analito no es conocida de antemano, es necesaria una calibracin con un mnimo de dos puntos. Para esta calibracin se utiliza un modelo lineal con un trmino constante:
seal = seal del blanco + constante x concentracin y=b+mx (Ecc.1.7.9)
El trmino b indica la magnitud de la seal estimada del blanco, mientras que m es la pendiente de la recta de calibrado e indica nuevamente la sensibilidad.
Estadsticamente, una calibracin realizada a partir de dos puntos es muy pobre y su construccin a partir de un nmero mayor de patrones es obligatoria . El procedimiento estadstico para determinar los coeficientes b y m de la ecuacin (1.7.9) se denomina regresin por mnimos cuadrados. La regresin por mnimos cuadrados es una herramienta muy til, sin embargo, deben conocerse sus limitaciones. Adems de la regresin por mnimos cuadrados siempre debe hacerse una inspeccin grfica de los datos obtenidos, para detectar puntos anmalos o fallas en la linealidad.
Para aplicar el mtodo de mnimos cuadrados en la calibracin instrumental se realizan las siguientes suposiciones:
a.- La incertidumbre en la concentracin de los patrones es despreciable frente a la desviacin estndar de la seal medida. Para ello los patrones de calibrado deben ser preparados con una precisin superior a la de la medicin de la seal.
27
b.- Todas las medidas son estadsticamente independientes unas de otras. Cualquier tendencia de las seales a travs del tiempo (derivas de la lnea de base o contaminaciones secuenciales) invalida el calibrado.
c.- Todas las medidas tienen igual desviacin estndar, la cual no depende del valor de la seal observada, por lo tanto las seales altas tendrn igual desviacin estndar que las pequeas. Esta suposicin es particularmente discutible si se trabaja en un amplio intervalo de concentraciones. Si no se cumple, es necesario utilizar un mtodo de calibracin ponderado por las desviaciones estndar de las medidas.
d.- Las medidas estn normalmente distribuidas. En general, el error en una medida analtica es una suma de errores independientes provenientes de distintas partes del
instrumento. Aunque el error de cada fuente individual no sea normalmente distribuido, la suma de esas contribuciones, producir una distribucin normal.
1.7.4.4
Protocolos de calibracin
Para la determinacin de la concentracin pueden ser utilizados distintos modos de calibracin dependiendo del analito que son:
1.7.4.4.1 Calibracin Externa Se preparan muestras de patrones de concentracin conocida que se analizan y permiten construir una curva de calibracin para cada componente a cuantificar. Con este mtodo es necesario medir exactamente los volmenes inyectados tanto de los patrones como de la muestra incgnita. Otros modos tambin son utilizados: calibracin interna, mtodo del agregado patrn y tcnicas de dilucin isotpica.
28
1.7.4.4.2 Calibracin Interna Si antes de la determinacin se le agrega a la muestra una cantidad fija de una sustancia con caractersticas qumicas similares a las de la especie a determinar, esta sustancia es llamada estndar interno y el mtodo se denomina de calibracin interna o mtodo del estndar interno. El agregado sirve para calibrar un paso crtico que de otra manera introduce una gran incerteza, por ejemplo el volumen de muestra inyectado en una corrida de Cromatografa Gaseosa. La seal producida por este estndar interno es producida en las mismas condiciones que la de los analitos, porque se encuentran juntos en la muestra. Para averiguar la concentracin de los analitos, se aplica alguno de los modelos lineales vistos anteriormente utilizando como seal del patrn, la seal producida por el estndar interno. La concentracin del estndar interno puede variarse para comprobar la linealidad y construir una curva de calibrado, o puede usarse un modelo de un nico patrn. Hay que tener en cuenta que si el estndar
interno no tiene la misma sensibilidad en el detector que los analitos, hay que corregir las seales de estos con un factor de respuesta. Estos factores de respuesta se calculan a priori mediante estndares de los compuestos a determinar (ver Willett, J. E., Gas Chromatography, Analytical Chemistry by Open Learning, Wiley, 1987).
1.7.4.4.3 Mtodo de Dilucin Isotpica La forma ms sofisticada del mtodo del estndar interno es el mtodo de dilucin isotpica. Aqu se opta por agregar a la muestra una sustancia que es qumicamente igual a la sustancia a determinar pero an as discernible de la original. Este mtodo utiliza la misma sustancia como patrn pero con al menos un tomo de su estructura reemplazado por un istopo. Para este mtodo debe utilizarse un tcnica selectiva a istopos, generalmente espectrometra de masa.
29
1.7.4.4.4
Agregado patrn
En el mtodo del agregado patrn se le agrega a la muestra, concentraciones crecientes del analito de inters. La seal obtenida se deber a la cantidad de analito originalmente presente en la muestra sumados a la cantidad agregada. El propsito de este mtodo es generalmente corregir efectos de interferencias multiplicativas debidas a la matriz de la muestra. (5) 1.7.5 VERIFICACIN DE LA LINEALIDAD Para verificar la linealidad de un mtodo se siguen los siguientes procedimientos
(6)
Preparar soluciones de muestra al menos a cinco niveles de concentracin, los cuales deben encontrarse dentro de los intervalos establecidos para cada tipo de anlisis, y que fueron verificados previamente al llevar a cabo la determinacin de la linealidad del sistema. Este procedimiento debe repetirse en forma independiente por lo menos 3 veces, para evaluar estadsticamente la regresin lineal del mtodo. Con estos datos se grafica la respuesta de la medicin, contra la concentracin del analito. Se verifican datos con comportamiento atpico mediante mediciones adicionales. Realizar un anlisis de varianza de la regresin lineal. Calcular el coeficiente de regresin con la totalidad de los datos (por los menos dos curvas independientes). Calcular y graficar los residuos (valor real de la concentracin el calculado por la ecuacin de regresin para cada valor de X)
30
6. Guzmn, Silka. Procedimiento General para Validacin de Mtodos y Manipulacin de Items de Ensayo, segn la Norma 17025:2005, seccin 5.4 y 5.8. 2006.
2.
DISEO METODOLGICO
En este capitulo se explica la metodologa a seguir para cumplir con cada uno de los objetivos de este trabajo investigativo.
2.1 TIPO DE ESTUDIO Se realizo un estudio experimental que segn su orientacin en el tiempo es de tipo transversal, ya que se determino la linealidad del mtodo para determinar alcoholemia por cromatografa de gas, a travs de datos obtenidos en el momento del estudio (relacin rea de etanol versus rea de Propanol); este estudio no se haba realizado en el Laboratorio Central de Criminalstica de la Polica Nacional. 2.2 UNIVERSO Se prepararon seis disoluciones de etanol de 100 ml, con concentraciones de 1g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L y 6 g/L, de cada una de estas disoluciones se prepararon cinco muestras, para un total de 30, que se inyectaron al cromatgrafo de gas.
2.3 INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE LA INFORMACIN Una vez que se preparon las muestras, estas se inyectaron en el cromatgrafo de gas, obtenindose a travs del cromatograma los datos de reas de etanol y propanol, esta informacin se registr en una hoja de clculo de Microsoft Excel para su procesamiento.
31
2.4 MONTAJE DEL MTODO DE DETERMINACION DE ALCOHOL EN SANGRE POR CROMATOGRAFIA DE GASES. Montar el mtodo requiri de los siguientes materiales, reactivos y procedimientos: 2.4.1 Materiales 1 Micropipeta de 0.5 ml. 1 Micropipeta de 0.1 ml. 100 Puntas de Pipetas de 0.5 ml. 1 Bureta de 100 ml. 2 Beaker de 1000 ml. 1 Beaker de 100 ml.
1 Jeringa de 5 ml para cromatografa de gas. 1 Pizeta de 50 ml. por espacio de cabeza y seis agujas. 50 Puntas de Pipetas de 0.1 ml. 50 Tubos de ensayos de 5 ml. 1 Baln de 1000 ml con su tapa. 6 Balones de 100 ml con sus tapas. 1 Soporte Universal 1 Gradilla. Papel toalla. Cinta de Parafina. Una caja de Guantes.
2.4.2 Reactivos
Solucin de Etanol (C2H5OH) [7.9 g/L]) Standards externos de etanol en el rango de concentracin de 1 g/L hasta 6 g/L. N-Propanol (C3H7OH) Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 Agua destilada
2.4.3 Equipos
Cromatgrafo de Gas Perkin Elmer, modelo AUTOSYSTEMXL. Refrigerador. Destilador de agua.
32
2.4.4 Preparacin del Reactivo Patrn (ETANOL)
Se Tom 12.7 ml de etanol absoluto y se afor a 1000 ml, para tener una concentracin aproximada a 7.9 g/L, a partir de dicha disolucin se prepararon los siguientes stndars:
Tabla 2.1 Patrones Standards para Calibrar el Mtodo Determinacin de Alcoholemia
Patrn 0 1 2 3 4 5 6
Volumen a tomar (ml) 60 50 40 30 20 10
Concentracin (g/l) 7.90 6 5 4 3 2 1
Volumen Total (ml) 100 100 100 100 100 100
Fuente: Prez Garca, A. Folleto del Curso de Cromatografa de Gas. Managua, Nicaragua, 2005.
Nota: conservamos los standars a 4 C. Los clculos sobre la preparacin del reactivo patrn se presentan en el capitulo I, de la presentacin y discusin de resultados. 2.4.5 Preparacin del Patrn Interno
Al utilizar est tcnica y un equipo GC-FID fue imprescindible utilizar un patrn interno, como es el N- Propanol.
Dicho patrn se prepar de la forma siguiente, se tom 5 ml de N- propanol y se afor hasta 1000 ml con agua desinizada.
Para la preparacin de la muestra estndares se le adicion 0.1 ml del patrn interno.
33
2.4.6 Preparacin del Reactivo Inico
Se utiliz H2SO4 1M, saturado con (NH4)2SO4 anhidro, para preparar el H2 SO4 1M, se tom 5.32 ml de cido concentrado y se afor hasta 100 ml con agua desinizada.
2.4.7
Procedimiento para la Preparacin de las Muestras
En tubos de ensayos de 5 ml, se tom con micropipeta de boca desechable 0.5 ml, de la muestra (patrn de cualquier concentracin). Se aadi 0.1 ml de patrn interno (N Propanol disuelto). Se aadi 0.5 ml del reactivo inico. Se Agit suavemente durante dos minutos y se dej en reposo durante 10 min. a temperatura ambiente. Con la jeringa de gases se tom 2 ml de gas del espacio de cabeza que se inyect en el cromatgrafo. CONSTRUCCION DE LA CURVA DE CALIBRACIN
2.5
Se construy la curva de calibracin a travs de patrones de concentraciones conocidas de: 1 g/L, 2 g/L, 3g/L, 4 g/L, 5 g/L y 6 g/L. De cada una de estas disoluciones se hicieron dos inyecciones, para un total de 12. Una vez calibrado el mtodo cromatogrfico de alcoholemia, se prepararon e inyectaron las muestras. 2.6 VERIFICACION DE LA LINEALIDAD DEL METODO
Para la verificacin de la linealidad se utiliz un modelo lineal con un trmino constante que se define con la ecuacin punto-pendiente:
seal = seal del blanco + constante x concentracin y=b+mx (Ecc. 2.1.1)
34
El trmino b indica la magnitud de la seal estimada del blanco, mientras que m es la pendiente de la recta de calibrado e indica la sensibilidad.
La ecuacin punto- pendiente, se obtuvo por medio del mtodo de regresin por mnimos cuadrados. 2.6.1 Regresin por Mnimos Cuadrados.
Para la ecuacin 2.1.1, la pendiente de la recta puede ser calculada de la siguiente manera:
N x m i -1 N x i 1 i -1 x i x y i y 2
(Ecc. 2.1.2)
Los coeficientes de la ecuacin 2.1.1, se pueden calcular con las siguientes ecuaciones:
y mx
(Ecc. 2.1.3)
Donde x , y son los promedios aritmticos de los valores de x (patrones de concentracin) y valores y (seales). En la ecuacin (2.1.2), el numerador es simbolizado Sxy y el denominador Sxx La expresin
N y i 1 i y 2
(Ecc. 2.1.4) se denota con el smbolo Syy. 35
Las diferencias entre las seales observadas y las predichas se denominan residuos. A partir de estos valores se calcula:
2 y S Y i yi N 2 Syy m 2Sxx N 2
(Ecc. 2.1.5)
SY es llamada desviacin estndar y tiene unidades correspondientes a la seal Observada.
La siguiente ecuacin puede ser usada para calcular la concentracin de una muestra incgnita:
y b m
(Ecc. 2.1.6)
Nota: Para la determinacin del coeficiente de linealidad no se utiliz ninguna de las ecuaciones planteadas anteriormente, ya que los clculos se elaboraron en el programa de Microsoft Excel, que ya trae programada la metodologa de calculo de cada una de estas ecuaciones, y esto nos permiti obtener resultados directos.
36
PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS
En esta seccin se presentan las ecuaciones, clculos para la preparacin de disoluciones, procesamiento de la informacin, a la vez que la discusin de los resultados.
CAPITULO 3.1: CLCULOS PARA LA PREPARACIN DEL REACTIVO PATRN (ETANOL)
n L
10g 46.07g/mol 1L
0.2170609g 1L
(Ecc. 3.1)
Los clculos de la preparacin de las seis disoluciones de etanol de las que se hacen referencia en acpite 2.2, del diseo metodolgico, se hicieron en base a la ecuacin de la ley de las concentraciones C V 1 1 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, y 6 g/L; V2 = 100 ml
V , siendo la C1 = 10 g/L; C2 = 1 g/L, 2 g/L, 2
0.1 L, V1 = ?
Clculo de la concentracin de 1 g/L:
10
g g V 1 0.1L 1 L L V 0.01L 1
10
g g V 2 0.1L 1 L L V 0.02L 1
37
g g V 3 0.1L 1 L L V 0.03L 1 Clculo de la concentracin de 4 g/L: 10
10
g g V 4 0.1L L 1 L V 0.04L 1
10
g g V 5 0.1L 1 L L V 0.05L 1
10
g g V 6 0.1L 1 L L V 0.06L 1
El V1, es la cantidad de alcohol etlico, disuelto en 100 ml de agua deshionizada.
38
CAPITULO 3.2
AREAS
DE
ETANOL
PROPANOL
LEIDAS
EN
EL
CROMATOGRAMA
Las lecturas de las reas de etanol y propanol de las concentraciones de 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L y 6 g/L preparadas con el procedimiento descrito en el acpite 2.4.7 del diseo metodolgico, se presentan a continuacin en la siguiente tabla:
TABLA 3.1 AREAS DE ETANOL Y N - PROPANOL LEDAS EN LOS CROMATOGRAMAS.
Ci (g/L)
AREA ETANOL 2266.48 2247.22 2424.39 2431.98 2051.68 4855.36 4748.71 5118.85 5323.76 4025.02 5148.93 6319.77 6206.47 5944.36 5618.53 9484.9 9526.22 9299.32 9845.87 8438.27 9945.4 9928.96 9706.04 10106.75 9626.55 11049.33 10443.36 10923.51 11964.02 11860.25
AREA PROPANOL 3172.29 3507.92 3656.32 3894.41 3806.91 4369.75 3799.72 3349.2 2617.21 3122.03 2608 2246.94 2935.71 2995.91 2797.26 3193.76 3302.46 3066.4 3134.42 2739.51 2239.61 2891.77 2898.98 2928.57 2803.92 2378.69 2253.33 2326.37 2762.04 2523.1
39
CAPITULO 3.3
PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIN EN MICROSOFT EXCEL
La determinacin del coeficiente de linealidad se obtuvo por el mtodo de regresin lineal, a partir del clculo de las medias de las desviaciones estndares y las medias de las relaciones (Ri): reas de Etanol / reas de Propanol, de cada una de las concentraciones de las disoluciones preparadas, los resultados segn la hoja de clculo de Microsoft Excel son los siguientes: TABLA 3.2
Ci (g/L) Ri
DATOS PROCESADOS EN MICROSOFT EXCEL 1 _ R S i 2
0.71446179 0.64061324 0.66306833 0.6244797 0.53893578 1.11112993 1.24975261 1.52837991 2.03413559 1.28923169 1.97428298 2.81261182 2.11412912 1.9841584 2.0085834 2.9698224 2.88458301 3.03265067 3.14120954 3.08021142 4.44068387 3.43352341 3.34808795 3.45108705 3.43324703 4.6451324 4.63463407 4.69551705 4.33158825 4.70066585
0.63631177
0.06415591
242.955446
3.58089454
1.44252595
0.3632688
7.57781162
0.11168856
2.17875314
0.35867325
7.77323923
0.11456895
3.02169541
0.09914432
101.733571
1.4994403
3.62132586
0.45979103
4.73019465
0.06971784
4.60150752
0.15372628
42.3159166
0.62368981
40
Las desviaciones estndares de los Ri de etanol y propanol no varan significativamente con respecto a la media, indicando precisin en la preparacin de muestras e inyeccin de las mismas en el cromatgrafo de gas.
El coeficiente de ponderacin W, es igual a seis (6) que es el nmero de concentraciones de las muestras en las cuales se fundament el estudio, lo cual indica que el procesamiento estadstico de los datos es exacto.
La determinacin del coeficiente de linealidad, a travs del modelo de regresin lineal integrado en el programa de Microsoft Excel, da un resultado de 0.9976, que no es mas que la confiabilidad con que pueden emitirse los resultados periciales relacionados con intoxicacin por consumo de alcohol.
La grafica siguiente presenta los resultados obtenidos:
5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 2
y = 0.7773x - 0.1368 R2 = 0.9976
Ri
4 Cg/L
Figura 3.1. Ri Vs. Concentraciones (g/L)
41
4. CONCLUSIONES
La linealidad del mtodo para determinar alcoholemia es de 0.9976, este parmetro indica, que el mtodo es adecuado para la determinacin de alcoholemia.
Se cuenta con los materiales instrumentales necesarios para calibrar el cromatgrafo de gas, para el mtodo de alcoholemia.
No hay factores externos que afectan la cuantificacin de alcohol en sangre, sin embargo se podra obtener un coeficiente de linealidad mayor que 0.9976, utilizando viales mbar de 5 ml los que se han agotados en el laboratorio.
En este estudio se plantea con claridad el procedimiento para programar el mtodo de determinacin de alcoholemia por cromatografa de gas.
A travs del calculo del coeficiente de linealidad se logro demostrar la capacidad del mtodo de producir resultados que son directamente proporcionales a la concentracin del analito en la muestra.
42
5. RECOMENDACIONES
Se recomienda la calibracin y verificacin del mtodo para determinar alcoholemia por cromatografa de gas utilizando patrones de referencia debidamente cerificados para obtener resultados mas exactos.
Debido a que al equipo cromatogrfico, se le da mantenimiento cuatro veces al ao se recomienda la verificacin del coeficiente de linealidad cada tres meses, de esta manera se ajustara el mtodo a las condiciones de funcionamiento del equipo.
Se recomienda validar el mtodo con su procedimiento actual de trabajo ya que el calculo del coeficiente de linealidad de 0.9976, indica que es capaz de producir resultados confiables.
Los Parmetros que recomendamos partiendo del estudio de la verificacin de la linealidad, para una futura validacin del mtodo son: Recuperacin, Sensibilidad,
Selectividad, Robustez, Limite de Deteccin, Limite de Cuantificacin, Reproducibilidad, Repetibilidad, Sesgo, e Incertidumbre.
Es necesario crear un sistema de registro o base de datos sobre la calibracin del mtodo.
43
BIBLIOGRAFIA
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METODOLOGA
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44
9. Esquema Bsico para la realizacin de un protocolo e informe final. Universidad Nacional Autnoma de Nicaragua, Facultad de Ciencias Medicas.
10. http://www.eqi/utili_cromatografia de gas/edu.pdf
11. http://www.ataonline.org.ar/002/acta_toxicologica/ATA11-2.pdf.
45
7.
GLOSARIO
COEFICIENTE DE CORRELACIN: Estadstico que cuantifica la correlacin. Sus valores estn comprendidos entre -1 y 1 COEFICIENTES DE REGRESIN: En un modelo de regresin lineal son los valores de a y b que determinan la expresin de la recta de regresin y=a + bx. CORRELACIN: Expresa la concordancia entre dos variables segn el sentido de la relacin de estas en trminos de aumento disminucin.
DESVIACIN ESTANDAR (TPICA): Caracterstica de una muestra o poblacin que cuantifica su dispersin o variabilidad. Tiene las mismas unidades que la variable. la desviacin tpica es invariante con respecto al origen de la distribucin. Su cuadrado es la varianza.
EXACTITUD: (VERACIDAD): Expresa la cercana entre el valor que es aceptado, sea como un valor convencional verdadero (material de referencia interno de la firma), sea como un valor de referencia aceptado (material de referencia certificado o estndar de una farmacopea) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de anlisis un cierto nmero de veces.
LINEALIDAD: Habilidad (dentro de un mbito dado) del procedimiento analtico de obtener resultados de prueba que sean directamente proporcionales a la concentracin de analito en la muestra.
MEDIA: Es una medida de centralizacin para una variable continua. Se obtiene sumado todos los valores mustrales y dividiendo por el tamao muestral.
46
PRECISION: expresa la cercana de coincidencia (grado de dispersin) entre una serie de mediciones obtenidas de mltiples muestreos de una misma muestra homognea bajo condiciones establecidas.
REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisin obtenida bajo las mismas condiciones de operacin en un intervalo corto de tiempo (mismo da), por un mismo analista, en la misma muestra homognea y en el mismo equipo. REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisin entre laboratorios como resultado de estudios interlaboratoriales diseados para estandarizar la metodologa. ROBUSTEZ: Medida de la capacidad de un procedimiento analtico de permanecer inafectado por pequeas pero deliberadas variaciones en los parmetros del mtodo y provee una indicacin de su fiabilidad en condiciones de uso normales.
SELECTIVIDAD: Describe la habilidad de un procedimiento analtico para diferenciar entre varias sustancias en la muestra y es aplicable a mtodos en los que dos o ms componentes son separados y cuantificados en una matriz compleja.
SESGO: Se usa en el sentido de exactitud de un promedio a largo plazo (valor esperado) de una serie de promedios. Es la diferencia en el valor esperado (tericamente igual al promedio de un nmero infinito de valores individuales independientes) del valor verdadero, correcto o asumido.
UNIVERSO: Conjunto infinito de elementos o unidades generado por un modelo terico. Conjunto real de todos los elemento que comparten unas condiciones de admisin en el conjunto.
VALIDACIN: Confirmacin que se da por la recopilacin y anlisis de la evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso especfico propuesto. 47
48
PROGRAMACION DEL CROMATOGRAFO DE GAS PARA LA VERIFICACION DE LA LINEALIDAD DEL METODO DE ALCOHOLEMIA.
PANTALLA 1: PROGRAMACIN DEL CROMATGRAFO DE GAS PARA EL MTODO DE ALCOHOLEMIA
49
PANTALLA 2: ALCOHOLEMIA
RESUMEN
DE
LAS
CONDICIONES
DEL
METODO
DE
50
PANTALLA
3: PROGRAMACIN DE LOS TIEMPOS DE EVENTOS
51
PANTALLA 4: PROGRAMACIN DE DATOS QUE SE REFLEJAN EN EL REPORTE GRAFICO
52
PANTALLA
5: DATOS DEL CROMATOGRAFO Y ACCESORIOS
53
PANTALLA
6: SELECCIN DEL CANAL A (DETECTOR A)
54
PANTALLA
7: PROGRAMACIN DE LOS FLUJOS DE LOS GASES
55
PANTALLA
8: PROGRAMACIN DE LA TEMPERATURA DEL HORNO
56
PANTALLA
9: PROGRAMACIN DE LAS CONDICIONES DEL DETECTOR
57
PANTALLA 10: PROGRAMACIN DE LAS ESCALAS PARA LA PRESENTACIN DEL REPORTE GRFICO EN TIEMPO REAL.
58
59
FOTOGRAFIA 1. AREA FISICOQUMICA. MATERIALES Y REACTIVOS NECESARIOS PARA LA PREPARACIN DE LAS DISOLUCIONES.
FOTOGRAFIA 2 Y 3: ETAPA DE PREPARACIN DE LAS SOLUCIONES STANDARS
60
FOTOGRAFIA 4 Y 5: PREPARACIN DE LAS MUESTRAS A INYECTAR
FOTOGRAFIA 6: PROGRAMACIN DEL METODO EN EL CROMATOGRAFO DE GAS. 61
FOTOGRAFIA 7: INYECCIN DE LAS MUESTRAS EN EL CROMATOGRAFO DE GAS
FOTOGRAFIA 8: A LA IZQUIERDA EL PICO CROMATOGRFICO DE ETANOL Y A LA DERECHA EL PICO DEL N-PROPANAOL.
62

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ACADEMIA DE POLICA WALTER MENDOZA MARTNEZ INSTITUTO DE ESTUDIOS SUPERIORES

POSTGRADO EN CRIMINALISTICA TESIS PARA OPTAR AL TITULO DE PERITO QUIMICO

MANAGUA, 18 DE MAYO DEL 2006.

A DIOS QUE NOS HA GUIADO PARA ALCANZAR NUESTRAS METAS.

1.7.4.4.4 Agregado Patrn 1.7.5 Verificacin de Linealidad

PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS

Figura 1.7.1 Figura 1.7.2 Figura 1.7.3 Figura 3.1

1.6.1 OBJETIVO GENERAL

1.6.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Bebidas De Bajo Contenido Alcohlico

Se tratan fundamentalmente de las cervezas, con graduaciones alcohlicas de 2 a 6 .

Bebidas De Contenido Alcohlico Medio

Etanol acetaldehido CH 3 CH 2 OH CH 3 Acetaldehido CH 3 CHO acetato CH 3

Fig. 1.7.1 Distribucin del Alcohol en el Cuerpo

1.7.2 FACTORES QUE MODIFICAN LA CINTICA DEL ETANOL

Consumo Crnico de Alcohol (Alcohlicos)

El consumo de cigarrillos disminuye el nivel de alcoholemia al facilitar el metabolismo del etanol.

La Interaccin con Frmacos

TABLA 1.7.1 CONCENTRACION Y EFECTO POR LAS DIFERENTES ALCOHOLEMIAS

CONCENTRACIN % (mg/L) 0 50 100 150 200 300 400

Fuente: Ladron J. Toxicologa Medica. McGraw-Hill-Interamericana de Espaa. Madrid. 1995.

Representacin del Cromatgrafo de Gas

Integracin manual. Se realiza con los mtodos siguientes:

Mtodo mecnico Planimtricos

Integracin automtica Electromecnica Electrnica.

Fig. 1.7.3 Ilustracin de un Cromatograma

1.7.4.2.3 Factor de Capacidad (k) Se define como:

molesdel componente en la fase estacionaria molesdel componente en la fase gaseosa

y en funcin de los tiempos de retencin:

1.7.4.2.5 Factor de Selectividad Se define como:

de muestras incgnita. En caso contrario, pueden cometerse serios errores en la determinacin.

1.7.4.3.1 Modelos de Calibracin

seal = seal del blanco + constante x concentracin y=b+mx (Ecc.1.7.9)

Cromatgrafo de Gas Perkin Elmer, modelo AUTOSYSTEMXL. Refrigerador. Destilador de agua.

2.4.4 Preparacin del Reactivo Patrn (ETANOL)

Volumen a tomar (ml) 60 50 40 30 20 10

Concentracin (g/l) 7.90 6 5 4 3 2 1

Volumen Total (ml) 100 100 100 100 100 100

Para la preparacin de la muestra estndares se le adicion 0.1 ml del patrn interno.

2.4.6 Preparacin del Reactivo Inico

Procedimiento para la Preparacin de las Muestras

seal = seal del blanco + constante x concentracin y=b+mx (Ecc. 2.1.1)

(Ecc. 2.1.4) se denota con el smbolo Syy. 35

SY es llamada desviacin estndar y tiene unidades correspondientes a la seal Observada.

PRESENTACIN Y DISCUSIN DE RESULTADOS

CAPITULO 3.1: CLCULOS PARA LA PREPARACIN DEL REACTIVO PATRN (ETANOL)

V , siendo la C1 = 10 g/L; C2 = 1 g/L, 2 g/L, 2

Clculo de la concentracin de 1 g/L:

Clculo de la concentracin de 2 g/L:

Clculo de la concentracin de 3 g/L:

g g V 3 0.1L 1 L L V 0.03L 1 Clculo de la concentracin de 4 g/L: 10

Clculo de la concentracin de 5 g/L:

Clculo de la concentracin de 6 g/L:

El V1, es la cantidad de alcohol etlico, disuelto en 100 ml de agua deshionizada.

PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIN EN MICROSOFT EXCEL

DATOS PROCESADOS EN MICROSOFT EXCEL 1 _ R S i 2

La grafica siguiente presenta los resultados obtenidos:

5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 2

y = 0.7773x - 0.1368 R2 = 0.9976

Figura 3.1. Ri Vs. Concentraciones (g/L)

1. Ladron J. Toxicologa Medica. McGraw-Hill-Interamericana de Espaa. Madrid. 1995.

4. Macias Pilar. Alcoholes, bebidas alcohlicas y alcoholemia. Managua, Nicaragua. 1984.

6. Velzquez. McGraw-Hill-Interamericana de Espaa. Madrid. 1996.