UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO PAULO DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA

Relatrio Final

Na espermatognese dos filhotes de ratos nascidos de pais alcolatras e mes normais os receptores do sistema nervoso perifrico seriam modificados?

Relatrio

cientfico

final

de

iniciao

cientfica

desenvolvido no Setor Modo de Ao de Drogas do Departamento de Farmacologia, Escola Paulista de Medicina Universidade Federal de So Paulo.

Acadmico: Valria Lima Fabrcio Orientador: Prof. Dra. Neide Hyppolito Jurkiewicz Nmero de Processo: 2012/25056-0

SO PAULO 2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO PAULO DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA

Assinaturas:

_____________________________________ Neide Hyppolito Jurkiewicz

_____________________________________ Valria Lima Fabrcio

INTRODUO

1. INTRODUO 1.1 Mecanismo de Ao do Etanol O etanol (EtOH) um dos agentes farmacolgicos mais conhecidos e antigos, seu consumo (na forma de bebidas alcolicas) atinge nmeros epidemiolgicos impressionantes e seu uso considerado um dos principais problemas sociais, econmicos e de sade pblica em diversos pases. Muito disso, deve-se ao fato de no se conhecer a magnitude dos efeitos deletrios e, principalmente, os mecanismos moleculares pelos quais ele atua. Teorias sobre o stio de ao do EtOH evoluram ao longo do tempo. Inicialmente, acreditava-se que as aes do EtOH seriam inespecficas, modificando as propriedades fsicas das membranas biolgicas (p.ex. fluidez) (CHIN & GOLDSTEIN, 1977; HARRIS & SCHROEDER, 1982; CREWS et al., 1983). As alteraes nas membranas biolgicas induzidas pelo EtOH acarretariam mudanas funcionais nas propriedades proteicas, modificando atividade enzimtica, transporte inico e secreo de neurotransmissores. Ainda que os efeitos biolgicos do EtOH sejam tradicionalmente considerados como depressores e inespecficos, pesquisas recentes demonstraram que determinados canais inicos, receptores e efetores de vias de transduo de sinais so importantes stios-alvo. Estudos moleculares demonstram que o EtOH possui stios de ao em: (a) canais inicos de potssio (BK) e clcio (voltagem dependente do tipo L); (b) receptores de glutamato N-metil-D-aspartato (NMDA), cido-gamaaminobutrico (GABAA e GABAB), glicina, nicotnico neuronais (nACh), dopamina e serotonina (5-HT3); e (c) adenilato-ciclase (estimulando a produo de AMPc) (CREWS et al., 1996; HARRIS et al., 2007; VENGELIENE et al., 2008; DOPICO; LOVINGER, 2009).

1.2 Efeitos do Etanol no Sistema Reprodutivo de Machos O consumo agudo ou crnico de EtOH tem sido amplamente associado com alteraes na funo reprodutiva masculina tanto em humanos como em roedores. Vrios estudos demonstraram que o EtOH altera a capacidade ejaculatria e diminui

INTRODUO

a qualidade espermtica, entretanto, o mecanismos responsveis por estes efeitos no foram completamente elucidados (ETTENBERG & OLSTER, 1994; ANTUNEZ & PIMENTEL, 1997; CAGIANO et al., 1998; JOO et al., 2012). descrito que a utilizao crnica e moderada de EtOH melhora o processo de ereo e a libido em humanos, os quais esto relacionados a um relaxamento dos corpos cavernosos e a uma diminuio da ansiedade (MILLER et al., 1988). No entanto, estes mesmo autores demonstraram que o EtOH em altas doses pode causar diminuio da libido. Em relao funo testicular, descrito em estudos clnicos e experimentais que o consumo moderado/excessivo de EtOH ( 15,4 g/dia) capaz de atrasar a espermatognese (La VIGNERA et al., 2013) e aumentar o nmero de espermatozoides anormais em humanos (JOO et al., 2012). Estes efeitos podem ser indiretos, pela alterao da funo do eixo Hipotalmico-Pituitrio-Testicular, ou direto, durante o processo de formao dos espermatozoides no testculo (La VIGNERA, et al., 2013). Aps o espermatozoide ser formado no testculo, este se desloca para o epiddimo, onde armazenado at que seja ejaculado. A ejaculao ocorre, principalmente, por meio de contraes rtmicas do ducto deferente (DD), que dependente da ativao do sistema simptico. A ativao simptica e a consequente liberao dos neurotransmissores noradrenalina e ATP ativam os 1-

adrenoceptores e P2x-purinoceptores, respectivamente, gerando contrao da musculatura lisa do DD, a qual dependente do influxo de clcio (Ca2+) extracelular (MULRYAN et al., 2000; WESTFALL & WESTAFALL, 2001). O tratamento in vivo ou in vitro com EtOH capaz de alterar a contrao do DD em reposta a agonistas exgenos. Boseli et al. (2000) evidenciaram que o tratamento agudo com EtOH (3,0 g/Kg) diminuiu a contrao em resposta noradrenalina exgena na poro prosttica do DD sem alterar a respostas contrtil a este agonista na poro epididimal. Alm disso, a contrao mxima induzida pelo alfa,beta-metileno-ATP (agonista dos P2x-purinoceptores) foi significativamente reduzida pelo tratamento agudo de EtOH em ambos os segmentos do DD. Alm disso, a incubao in vitro de EtOH 50 mM no causou alterao sobre a resposta noradrenalina exgena em ambos os seguimentos (prosttica e

INTRODUO

epidimal). No entanto, o efeito contrtil mximo induzido pelo alfa,beta-metileno-ATP mostrou-se potencializado na poro prosttica (BOSELI et al., 2001).

JUSTIFICATIVA DA PROPOSIO

2. JUSTIFICATIVA DA PROPOSIO Estudos do nosso laboratrio demonstraram que o tratamento agudo com EtOH diminuiu a contrao do DD de ratos adolescentes induzida por agentes adrenrgicos e estimulao eltrica, e reduziu drasticamente o contedo neuronal de catecolaminas neste tecido (SILVA JNIOR et al., 2012). Neste contexto, Verde et al. (2009 - Processo Fapesp n 03/09477-2) verificaram que o tratamento crnico com EtOH durante a prenhez e aleitamento causou alteraes na contratilidade dos DD de ratos descendentes. Alm disso, Bielawski & Abel (1997) verificaram que o tratamento crnico com EtOH em ratos machos afetou a prole, induzindo malformaes, mudanas no peso corporal e aumento na taxa de mortalidade. No entanto, os efeitos do tratamento crnico com EtOH nos parmetros espermticos e na reatividade do ducto deferente de ratos descendentes de pais que foram tratados antes acasalamento no foram devidamente estudados. Todos esses achados na literatura nos proporcionam seguras evidencias de que o consumo crnico ou agudo do EtOH altera significativamente a funo reprodutiva masculina. Entretanto, a exata relao entre essas alteraes, as possveis consequncias aos descendentes (filhotes) e os mecanismos pelos quais esses efeitos deletrios ocorreriam so controversos, ou no foram totalmente elucidados. Portanto, a investigao dessas explanaes foi objeto de estudo na desta pesquisa.

OBJETIVO GERAL

3. OBJETIVO GERAL O presente relatrio cientfico tem como objetivo, apresentar os resultados obtidos aps o tratamento crnico com EtOH em ratos que posteriormente foram submetidos ao acasalamento (pais) (Etapa 1). Os seguintes experimentos foram realizados: (a) diferenas na taxa de cruzamento (fertilidade), durao do acasalamento e tamanho da ninhada dos filhotes de pais tratados com EtOH (b) experimentos funcionais in vitro com o DD desses pais, onde os parmetros farmacolgicos Emax (efeito mximo) e pD2 (afinidade aparente) foram analisados para os agonistas: noradrenalina, fenilefrina, serotonina e brio (c) espermatognese dos pais com anlise dos seguintes parmetros reprodutivos: concentrao, morfologia, motilidade e velocidade dos espermatozoides. Os filhotes machos (dos pais tratados) (Etapa 2) foram tratados durante 70 dias com EtOH. Ao trmino do tratamento foram sacrificados e estudamos o efeito do lcool na espermatognese e na neurotransmisso simptica do DD desses animais. Os mesmos parmetros foram observados, exceto anlise da interferncia desta droga no acasalamento, na prenhez e na ninhada. Alm disso, foi avaliada a resposta do DD destes animais ao estimulo eltrico transmural e ao clcio.

MATERIAL E MTODOS

4. MATERIAL E MTODOS 4.1 Animais/Tratamento com EtOH Utilizamos ratos adultos da linhagem Wistar machos de aproximadamente 70 dias ps-natal, com peso corpreo de 27525 g, mantidos em condies ambientais controladas de temperatura (221C), umidade (55%), ciclo dia/noite (12h), comida e agua ad libitum. Prticas estas, realizadas de acordo com princpios internacionais de biotica. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: o grupo controle recebeu veiculo-livre de droga (H2O), e o grupo tratado que recebeu EtOH via oral (v.o) por intubao intragstrica (gavagem) na 1 semana 1,0 g/kg/dia; na 2 semana 1,5 g/kg/dia; na 3 semana 2,5 g/kg/dia e a partir da 4 semana at o trmino do tratamento (8 semanas) foi administrado 4,0 g/kg/dia. Solues hidro-alcolicas a 10%, 15%, 25% e 40% (v/v), respectivamente foram diludas diariamente a partir de etanol absoluto ( 99,5 %).

4.2 ndice de Reproduo Com intuito de verificar possveis alteraes no nmero de dias necessrios para que o acasalamento ocorresse foi colocado na mesma gaiola-moradia 1 macho para 1 fmea (sistema monogmico) por 7 dias consecutivos. Aps esse perodo, realizou-se aferio do peso corpreo das fmeas at a data de nascimento dos filhotes. E com base no dia de nascimento dos filhotes, calculou-se a data provvel do acasalamento, considerando o perodo de gestao de 21 dias. Ressaltando que a utilizao deste mtodo foi possvel, devido a realizao de estudos preliminares que demonstraram a ausncia de m formao dos filhotes de pais submetidos ao tratamento com EtOH. 4.2.1 Taxa de Natalidade / Peso da Ninhada Para investigar possveis alteraes que o uso crnico de EtOH acarretaria no nmero de animais nascidos, logo aps o nascimento, foi observado a quantidade total de animais nascidos, bem como o sexo dos animais. Para isto, observou-se a

MATERIAL E MTODOS

distncia anu-genital (sexagem) de cada filhote. Alm disso, para estudar alteraes corpreas no nascimento dos filhotes, aferiu-se o peso total de cada ninhada. 4.2.2 Tratamento dos descendentes Os descendentes machos dos genitores tratados tambm receberam EtOH. O inicio do tratamento se deu com 25-30 dias de vida e seguiu o mesmo esquema teraputico citado no tpico 4.1. O grupo controle se constituiu dos descendentes dos genitores que receberam soluo salina.

4.3 Montagem do Ducto Deferente em Sistema de Banho de rgo Isolado Aps a 8 semana de tratamento com EtOH, os ratos foram sacrificados por decapitao, seus ductos deferentes (DDs) foram cirurgicamente seccionados 2 cm acima da extremidade prosttica, limpos dos tecidos adjacentes, lavados internamente e colocados em soluo nutritiva de Tyrode modificado, tambm denominada lquido nutritivo vesicular (LNV) que possui a seguinte composio qumica (mM/L): NaCl 138; KCl 5,7; CaCl2 1,8; NaHPO4 0,36; NaHCO3 15 e glicose 5,5, com pH ajustado em 7,3 - 7,4 (PICARELLI et al., 1962). Os DDs foram montados em banho de rgo isolado. A extremidade prosttica foi fixada a uma haste de vidro, enquanto a extremidade epididimal foi conectada a um transdutor de fora isomrico de tenso FT202 ( CB Sciences E.U.A.). Ambas as extremidades foram fixadas com fios de algodo e o transdutor acoplado a um amplificador analgico e conversor digital Power Lab (ADInstruments - E.U.A) com software Chart 5.5 (ADInstruments), para registro das contraes isomricas. 4.3.1 Curvas Concentrao-efeito Cumulativas Curvas concentrao-efeito cumulativas foram realizadas para os agonistas noradrenalina, fenilefrina, serotonina e brio. Esse mtodo consiste na adio de concentraes crescentes e cumulativas de um dos agonistas, iniciando-se a partir de concentraes que no produzam efeito at a concentrao que produza o efeito

MATERIAL E MTODOS

mximo. Em seguida, os parmetros farmacolgicos Emax (eficcia, indicada pela contrao mxima induzida por um agonista) e pD2 (potncia ou afinidade aparente do agonista, definida pelo logaritmo negativo da concentrao necessria pra produzir 50% do efeito - EC50) foram calculados (JURKIEWICZ et al., 1976). 4.3.2 Contrao neurognica O DD foi montado em um banho de rgo isolado entre dois eletrodos de platina conectados a um estimulador eltrico. Foram realizadas curvas de freqncia-resposta atravs da estimulao eltrica transmural (EET) dos DD, objetivando a anlise da contrao mediada pelos neurotransmissores liberados das terminaes axonais simpticas. Aps um perodo de estabilizao de 30 minutos, o rgo ficou sujeito a estmulos de 60 V, 1 ms de durao com freqncias de 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 e 20 Hz, utilizando-se o estimulador Grass S88 (Grass U.S.A.) como previamente descrito. Em cada freqncia o DD estimulado por 60 segundos, seguido de um intervalo de repouso (durao de 60 segundos) entre curvas prximas (Figura 1). A contrao induzida pelo EET apresenta

caractersticas distintas dependendo da freqncia utilizada. Em freqncias de at 0,5 Hz observam-se contraes rpidas de carter purinrgico (ATP-dependente), denominadas de twiches ou respostas fsicas. Freqncias maiores que 0,5 Hz produzem contraes bifsicas, apresentando um componente inicial rpido, que atinge seu pico mximo em aproximadamente 30 segundos (resposta fsica de carter purinrgico) seguida de uma contrao sustentada, de carter

noradrenrgico (resposta tnica) e de menor intensidade que se apresenta aps 1 minuto do EET. Na ilustrao dos dados, optamos por mensurar e ilustrar as respostas neurognicas em 2 e 5 Hz. Este protocolo experimental foi realizado apenas nos animais da etapa 2.

MATERIAL E MTODOS

Figura 1 - Estimulao eltrica transmural com estmulos de 60 V, 1 ms de durao com freqncias de 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 e 20 Hz em ducto deferente de rato. Em cada freqncia o ducto deferente estimulado por 1 minuto e o intervalo de repouso entre curvas prximas tambm de 1 minuto. RF Resposta fsica; RT Resposta tnica.

4.3.3 Resposta temporal para o Clcio As respostas temporais para o clcio (Ca+2) foram realizadas em soluo nutritiva nominalmente livre de Ca+2 conforme Jurkiewicz et al. (1975). O DD foi mantido por 5 minutos na presena do agente despolarizante KCl 80 mM seguido pela adio de uma dose nica de CaCl2 (10mM por 10 minutos). Este procedimento foi repetido at que respostas reprodutveis fossem obtidas. Observam-se duas fases de contrao, uma rpida (durao de 60 segundos), a qual denominamos de resposta fsica, e uma contrao sustentada (aps 5 minutos de estmulo contnuo com o clcio) denominada de resposta tnica (Figura 2). As respostas fsica e tnica foram mensuradas. Este protocolo experimental foi realizado apenas nos animais da etapa 2.

MATERIAL E MTODOS

Figura 2 - Curva tempo-efeito para o clcio em soluo nutritiva nominalmente livre de clcio na presena do agente despolarizante KCl. Notar a caracterstica bifsica da contrao sendo constituda por uma contrao rpida ou resposta fsica (RF) e uma contrao sustentada ou resposta tnica (RT).

4.4 Espermatognese 4.4.1 Coleta / Anlise do Smen Para o estudo da espermatognese foram coletados espermatozoides do epiddimo, seguiu-se a anlise microscpica prvia do smen para a avaliao da motilidade e vigor espermtico. Para tanto foi colocado 10l de smen em uma lmina e por cima a lamnula, ambas previamente aquecidas e mantidas em placa aquecedora (37C). A anlise incluiu a avaliao da motilidade pela anlise computadorizada do movimento espermtico, a anlise funcional da clula espermtica e anlise da resistncia ao estresse oxidativo. 4.4.2 Anlise Computadorizada do Movimento Espermtico Para anlise do movimento espermtico a amostra foi homogeneizada e 7l foram inseridos em uma cmara de contagem Leja previamente aquecida a 37C. Foram observados 5 campos aleatrios, resultando em uma mdia, que foi armazenada para posterior anlise. Os parmetros de movimento espermtico gerados pelo CASA (Hamilton Thorne IVOS) e analisados no experimento corresponderam velocidade mdia de percurso (VAP, m/s), velocidade retilnea (VSL, m/s), velocidade curvilnea (VCL, m/s), retilinearidade (STR, %), linearidade (LIN, %), motilidade (MOT, %) e motilidade progressiva (PROG, %). Adicionalmente,

MATERIAL E MTODOS

os espermatozides foram divididos em 4 grupos, baseando-se na velocidade de movimento, que consistiram de: rpidos (RAP; VAP > 50 m/s; %), mdios (MED, 30 m/s < VAP < 50 m/s; %) lentos (SLOW; VAP < 30 m/s ou VSL < 15 m/s; %). 4.4.3 Avaliao da integridade da membrana plasmtica Para avaliar a integridade da membrana plasmtica foi utilizada a colorao Eosina - Nigrosina (E/N) tcnica one step, que foi descrita por Campbell et al. (1956). Uma alquota de smen (5l) foi misturada ao corante (5l), em mesa aquecida a 37C, e realizado esfregao sobre lminas de microscopia. Sendo analisadas em microscpio ptico convencional, sob aumento de 1000 vezes, em imerso. Foram contadas 100 clulas por lmina, classificadas como (a) membrana ntegra (b) membrana no ntegra. 4.4.4 Avaliao da Integridade da Membrana Acrossomal Para avaliar a integridade da membrana acrossomal foi utilizada a colorao simples Fast Green / Rosa Bengala (POPE et al.,1991). Para isso, a cada tempo, sobre uma lmina de microscopia, uma alquota de cada amostra (5) foi adicionada a 5l de corante, sendo mantida em uma mesa aquecida a 37C durante 70 segundos. Aps a incubao, foram feitos esfregaos, que foram analisados em microscpio ptico convencional, sob aumento de 1000 vezes, em imerso. Foram contadas 100 clulas por lmina, classificadas como: (a) acrossoma ntegro (b) acrossoma no ntegro. 4.4.5 Avaliao da Atividade Mitocondrial A atividade mitocondrial espermtica foi determinada pelo mtodo proposto por Hrudka (1987) baseado na oxidao de 33 diaminobenzidina (DAB) pelo Complexo Citocromo C. Para a realizao dessa tcnica, foram incubados 25l de amostra no DAB (1mg/ml de PBS), na proporo 1:1, a 37C, por uma hora. Aps a incubao, foram feitos esfregaos em lmina de vidro, em uma sala escura, e estas fixadas em formol a 10% durante 10 minutos. As lminas ento foram secas no ar sob proteo da luz. Atravs de um microscpio com contraste de fase, sob aumento de 1000 vezes, em imerso, foram contadas 100 clulas espermticas e classificadas de acordo com o grau de colorao da pea intermediria em 4

MATERIAL E MTODOS

classes: (a) Classe I: totalmente corada, indicando atividade mitocondrial total (b) Classe II: mais de 50% corada, indicando alta atividade mitocondrial (c) Classe III: menos de 50% corada, indicando baixa atividade mitocondrial e (d) Classe IV: totalmente descorada, indicando ausncia de atividade mitocondrial (atividade nula). 4.4.6 Resistncia ao estresse oxidativo / Morfologia A avaliao da resistncia ao estresse oxidativo foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Nichi et al. (2006). Esse mtodo baseado na reao de duas molculas de cido tiobarbitrico (TBA) com uma molcula de malondialdedo (MDA), subproduto da peroxidao lipdica, em alta temperatura e pH cido, resultando em um cromgeno de colorao rsea que pode ser quantificado atravs de um espectofotmetro. Foi utilizado um sistema gerador de espcies reativas ao oxignio (ROS) com posterior mensurao da concentrao de espcies reativas ao cido tiobarbitrico (TBARS), mensurando-se, portanto, a susceptibilidade das clulas peroxidao lipdica. A concentrao de TBARS foi ento quantificada atravs da leitura em espectofotmetro (Ultrospec 3300 Pro), com comprimento de onda de 532 nm. E tambm a quantidade de anormalidade dos espermatozoides foi avaliada por meio de analise morfolgica dos mesmos.

RESULTADOS

5. Resultados 5.1 Pais tratados cronicamente com EtOH (ETAPA 1) Os ratos tratados com EtOH no tiveram diferena significativa no tempo de acasalamento (3,40 0,40 dias n=5) em relao ao controle (5,00 1,22 dias n=5) (Figura 3-A). Em relao a taxa de cruzamento (fertilidade) que representa o nmero total de animais nascidos, tambm no houve alteraes significativas (controle: 9,75 1,03; tratados: 11,60 0,50 n=5) (Figura 3-B). Entretanto, o peso da ninhada dos animais tratados com EtOH ao nascer, mostrou-se menor (7,42 0,09 g n=5) quando comparado ao seu respectivo controle (8,06 0,23 g n=5) (Figura 3-C).

A
8
Controle Tratado EtOH

Tempo (Dias)

6 4 2 0

Nmero de Dias Para Acasalar

B
15
Controle Tratado EtOH

C
10
Controle Tratado EtOH

Nmero Filhotes Nascidos

10

Peso Mdio (g)

8 6 4 2 0

Taxa de Cruzamento

Peso da Ninhada ao Nascer

Figura 3 A-C. (A) Tempo necessrio para o acasalamento (em dias) aps o tratamento com EtOH (14 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H 2O). (B) Taxa de cruzamento (em nmero de filhotes nascidos) aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H2O).(C) Peso mdio (em gramas) dos filhotes nascidos aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H2O). Valores expressos em mdia E.P.M. (*) estatisticamente (p< 0,05) diferente em relao ao controle. Teste t-Student no-pareado.Mnimo 5 experimentos.

RESULTADOS

Em relao funcionalidade dos ductos deferentes (DD), responsveis pela ejaculao e que possui rica inervao simptica, observamos que o tratamento com EtOH diminuiu o efeito mximo (Emax) (1,14 0,06 g n=5) para a noradrenalina em relao ao seu controle (1,53 0,04 g n=4) sem alterar a potncia (pD2) para este agonista (Figura 4-A). Este mesmo padro de efeito (diminuio de Emax sem alterao do pD2) foi observada para os seguintes frmacos testados: fenilefrina (controle: 1,81 0,06 g; tratados: 1,38 0,03 g n=5); serotonina (controle: 1,14 0,08 g; tratados: 0,75 0,04 g n=5); cloreto de brio: (controle: 2,50 0,03 g; tratados: 0,70 0,02 g n=5) (Figura 4 B-D).

A
2.0
Controle Tratado EtOH

B
2.0
Controle Tratado EtOH

Contrao (g)

1.5 1.0 0.5 0.0 -8 -7 -6 -5 -4

Contrao (g)

1.5 1.0 0.5 0.0 -9 -8 -7 -6 -5 -4

-1

-3

Log [Noradrenalina]mol L-1

Log [Fenilefrina] mol L

C
1.5
Controle Tratado EtOH

D
2.5
Controle Tratado EtOH

Contrao (g)

1.0

Contrao (g)

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

0.5

*
-6 -5 -4 -3

0.0 -8 -7 -6 -5
-1

-4

Log [Serotonina]mol L

Log [Bario]mol L-1

Figura 4 A-D. (A) Curvas concentrao-efeito para noradrenalina em DD de animais aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H2O). (B-D) Curvas concentrao-efeito para os seguintes agonistas: fenilefrina, serotonina e cloreto de brio em DD de animais aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H 2O). Valores expressos em mdia E.P.M. (*) estatisticamente (p< 0,05) diferente em relao ao controle. Teste t-Student no-pareado.Mnimo 4 experimentos.

RESULTADOS

Os resultados obtidos na avaliao da integridade da membrana acrossomal, da membrana plasmtica, da atividade mitocondrial, da resistncia e ao estresse oxidativo dos espermatozoides em pais tratados com EtOH, nos mostraram achados interessantes. Em relao leso da membrana plasmtica e da membrana do acrossomo dos espermatozoides no foram observadas diferenas significativas (controle: 3,50 0,86%; tratados: 1,40 0,51% n=5) e (controle: 4,25 0,85%; tratados: 2,80 0,58% n=5), respectivamente (Figura 5 A-B). J a concentrao dos espermatozoides mostrou-se diminuda aps o tratamento com EtOH (45,62 5,14; 10-6 sptz/ml n=5) em relao ao controle (94,37 11,29; 10-6 sptz/ml n=5) (Figura 5-C). A atividade mitocondrial espermtica, classificada de acordo com o grau de comprometimento da atividade em I,II,III e IV demonstrou aumento da atividade apenas na classe III (baixa atividade mitocondrial) aps o tratamento com EtOH (8,60 1,53% n=5) quando compara com seu controle (1,80 0,58% n=5) (Figura 5-D). A avaliao da resistncia ao estresse oxidativo (TBARS) no mostrou diferena significativa aps o tratamento com EtOH em relao ao seu controle (controle: 1858,39 275, 31 sptz ng/ml; tratados: 1757,20 123,73 sptz ng/ml n=5) (Figura 5-E). Alm disso, parametros de anormalidade como: cauda do espermatozide enrolada e dobrada mostraram-se maiores (5,20 0,58% e 3,00 0,77% n=5) respectivamente aps o tratamento com EtOH quando comparado com seus respectivos controles (1,40 0,50% e 0,80 0,37% n=5) (Figura 5-F).

RESULTADOS

A
8

B
% Espermatozides
Controle Tratado EtOH

8 6 4 2 0

Controle Tratado EtOH

% Espermatozides

6 4 2 0

Leso Membrana Plasmtica Espermatozide

Leso Membrana Acrossomo

C
Concentrao Espermatozides (106/ml)

D
Controle

% Espermatozides

150

60

Tratado EtOH

Controle Tratado EtOH

100

40

50

20

*
0

Concentrao de Espermatozides

Classe I Classe II Classe III Classe IV (Alta) (Alta-M dia) (Comprometido) (Ausncia)

E
TBARS Espermatozides (ng/mL)
3000
Controle Tratado EtOH

F
8
Controle Tratado EtOH

% Espermatozides

6 4 2 0

* *

2000

1000

Susceptibilidade Espcies Reativas Oxignio

Cabea Solta

Cauda Cauda Cauda Enrolada Fortemente Dobrada Dobrada

Figura 5 A-F. Avaliao da funo dos espermatozoides aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H 2O). (A e B) Leso da membrana plasmtica e da membrana do acrossomo dos espermatozoides. (C) Concentrao dos espermatozoides. (D) Atividade mitocondrial em classes. (E) Susceptibilidade ao estresse oxidativo (F) Tipo de anormalidades morfolgicas. Valores expressos em mdia E.P.M. ( *) estatisticamente (p< 0,05) diferente em relao ao controle. Teste t-Student no-pareado. Mnimo 5 experimentos.

RESULTADOS

O total de anormalidades dos espermatozoides considerando todas as alteraes morfolgicas mostrou-se maior nos animais tratados com EtOH (11,20 1,80% n=5) quando comparado ao controle (8,45 1,75% n=5) (Figura 6-A). A anlise do movimento espermtico evidenciou aumento significativo no parmetro de velocidade mdia de percurso (VAP) aps o tratamento com EtOH (155,45 8,92 m/s n=5) em relao ao seu controle (123,60 5,07 m/s n=5). Em relao a velocidade retilnea (VSL) no houve alteraes significativas, e a velocidade curvilnea (VCL) mostrou-se aumentada aps o tratamento com EtOH (249,25 12,97 m/s n=5) em relao ao seu controle (211,07 9,49 m/s n=5) (Figura 6-B). J em relao linearidade (LIN) e motilidade (MOT) dos movimentos dos espermatozoides houve aumento significativo aps o tratamento com EtOH (44,50 2,21% e 10,25 4,32% n=5) respectivamente em relao aos seus controles EtOH (38,75 3,22% e 5,25 3,25% n=5) (Figura 6-C). E a velocidade dos movimentos dos espermatozoides no houve alteraes significativas (Figura 6D).

A
15
Controle Tratado EtOH

B
300
Controle Tratado EtOH

% Espermatozides

*
10

Velocidade (m/s)

200

*
100

Anormalidade Total

VAP

VSL

VCL

C
100
Controle

D
25
Controle Tratado EtOH

% Espermatozides

% Espermatozides

Tratado EtOH

75 50 25 0 STR LIN MOT PROG

20 15 10 5 0

* *

Rpido

Mdio

Lento

Figura 6 A-D. Avaliao da funo dos espermatozoides aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H 2O). (A) total de anormalidade (B) velocidade dos espermatozoides (C) Tipo de movimento dos espermatozoides (D) prevalncia dos movimentos dos espermatozoides. Valores expressos em mdia E.P.M. ( *) estatisticamente (p< 0,05) diferente em relao ao controle. Teste t-Student no-pareado. Mnimo 5 experimentos.

RESULTADOS

5.2 Descendentes tratados com EtOH (ETAPA 2) Nesta etapa, observamos que o Emax para a noradrenalina (tratado: 1,10,07g n=6; controle: 0,78 0,17g n=6) e fenilefrina (tratado: 0,90,16g n=7; controle: 0,450,12g n=7) foram reduzidos em aproximadamente 30% e 50%, respetivamente, nos descendentes tratados com etanol (Figuras 7-A e 7-B). Alm disso, observamos que a potencia (pD2) para a noradrenalina (controle: 6,50,15 n=6; tratado: 4,10,4 n=6) foi 230 vezes menor nos descendentes tratados com EtOH enquanto que para a fenilefrina no houve alterao significativa do pD2 (tratado: 5,90,35 n=7; controle: 5,70,47 n=7). No houve alterao significativa do Emax e pD2 para a serotonina (Figura 7-C) e brio (Figura 7-D) entre os descendentes tratados com EtOH comparados aos seus respectivos controles.

A
Contrao (g)

B
1.5

1.5

Controle Tratado EtOH

1.0

Controle Tratado EtOH

Contrao (g)

1.0

*
0.5

0.5

0.0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

0.0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Log [Noradrenalina]mol L -1

Log [Fenilefrina] mol L -1

C
Contrao (g)

D
2.0

1.5

Controle Tratado EtOH

1.0

Controle Tratado EtOH

Contrao (g)

1.5

1.0

0.5

0.5

Figura
0.0 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 0.0 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Log [Serotonina]mol L -1

Log [Brio]mol L -1

7 A-D. (A) Curvas concentrao-efeito para (A) noradrenalina, (B) fenilefrina, (C) serotonina e (D) brio em DD de ratos descendentes aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H 2O). Valores expressos em mdia E.P.M. (*) estatisticamente (p< 0,05) diferente em relao ao controle. Teste t-Student no-pareado. Mnimo 6 experimentos.

RESULTADOS

A figura 8 mostra as contraes induzidas pelo estimulo eltrico transmural (EET) nas frequncias de 2 e 5Hz. Observamos que no houve alterao estatisticamente significativa nas respostas fsica e tnica na frequncia de 2Hz entre os descendentes tratados e controles (Figura 8-A). No entanto, verificamos que a resposta fsica na frequncia de 5Hz foi diminuda em aproximadamente 30% nos descendentes tratados cronicamente com EtOH (tratado: 2,20,18g n=4; controle: 3,10,27g n=4) (Figura 8-B).

A
2.5

EET 2Hz
Controle Tratado EtOH

B
4

EET 5Hz
Controle 3 2 1 0

Contrao (g)

Contrao (g)

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Resposta Fsica

Tratado EtOH

Resposta Tnica

Resposta Fsica

Resposta Tnica

Figura 8 A-B - Resposta fsica e tnica produzidas pelo EET nas freqncias de 2 e 5 Hz em ducto deferente de ratos descendentes tratados cronicamente com EtOH(1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H2O). Grfico de Barras representando a mdiaE.P.M. de no mnimo 4 experimentos. *P<0,05 em relao ao controle.

Alm disso, no foi verificado qualquer alterao significativa na reposta temporal para o clcio (resposta fsica e tnica) em DD dos animais descendentes tratados cronicamente com EtOH (Figura 9).

RESULTADOS

Ca2+ 10 mM por 10 min

2.5 Controle Tratado EtOH

Contrao (g)

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

Resposta Fsica

Resposta Tnica

Figura 9 - Resposta tempo-efeito para o clcio em ducto deferente de ratos descendentes tratados cronicamente com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H2O). Grfico de Barras representando a mdiaE.P.M. de no mnimo 4 experimentos. *P<0,05 em relao ao controle.

Ainda nesta etapa, com auxlio do Departamento de Reproduo Animal da USP, utilizando-se os testculos desde a poro epididimal at a poro prosttica, avaliamos parmetros reprodutores, tais como: avaliao de motilidade e vigor espermtico, morfologia espermtica, avaliao da atividade mitocondrial e avaliao da integridade DNA espermtico. Surpreendentemente, a figura 10 mostra que o tratamento crnico dos ratos descendentes com EtOH no afetou a integridade da membrana acrossomal (Figura 10-A), na concentrao de espermatozoides (Figura 10-B), atividade mitocondrial espermtica (classificada de acordo com o grau de comprometimento da atividade em I,II,III e IV) (Figura 10-C), resistncia ao estresse oxidativo (Figura 10-D) e nos parmetros de anormalidade avaliados (Figura 10-E). Por outro lado, como mostrado na Figura 5 (A-F), o tratamento com EtOH foi capaz de alterar vrios dos parmetros espermticos nos pais dos descendentes tratados cronicamente com EtOH.

RESULTADOS

A
8

% Espermatozides

Controle 6 4 2 0 Tratado EtOH

B
Concentrao Espermatozides (10 6/ml)
150 Controle Tratado EtOH 100

Leso Membrana Acrossomo

C
120 90 60 50 30 0 0
Classe I Classe II Classe III Classe IV (Ausncia)

Controle Tratado EtOH

D
TBARS Espermatozides (10 6/mL)
50

(Alta)

E
50

(Alta-Mdia) (Compro metido)

Controle Tratado EtOH

% Espermatozides

Controle Tratado EtOH

25

40 30 20 10 0

Susceptibilidade Espcies Reativas de Oxignio

Cabea Solta

Cauda Cauda Cauda Enrolada Fortemente Dobrada Dobrada

Figura 10 A-E. Avaliao da funo dos espermatozoides de ratos descendentes aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H2O). (A e B) Leso da membrana plasmtica e da membrana do acrossomo dos espermatozoides. (C) Concentrao dos espermatozoides. (D) Atividade mitocondrial em classes. (E) Susceptibilidade ao estresse oxidativo (F) Tipo de anormalidades morfolgicas. Valores expressos em mdia E.P.M. ( *) estatisticamente (p< 0,05) diferente em relao ao controle. Teste t-Student no-pareado. Mnimo 6 experimentos.

RESULTADOS

Ainda, observamos que o tratamento com EtOH nos ratos descendentes no alterou significativamente o numero total de anormalidade (Figura 11-A), o movimento espermtico (Figura 11-B), velocidade (Figura 11-C) e na prevalncia de movimento dos espermatozoides (Figura 11-D).

A
40

B
Velocidade ( m/s)
30 20 10 0

% Espermatozides

Controle Tratado EtOH

120 90 60 30 0

Controle Tratado EtOH

Anormalidade Total

VAP

VSL

VCL

C
80 Controle Tratado EtOH 60 40 20 0
STR LIN MOT PROG

D
30

% Espermatozides

% Espermatozides

Controle Tratado EtOH

20

10

0
Rpido Mdio Lento

Figura 11 A-D. Avaliao da funo dos espermatozoides de ratos descendentes aps o tratamento com EtOH (1-4 g/Kg/dia v.o por 8 semanas) e seus respectivos controles tratados com veiculo (H 2O). (A) total de anormalidade (B) velocidade dos espermatozoides (C) Tipo de movimento dos espermatozoides (D) prevalncia dos movimentos dos espermatozoides. Valores expressos em mdia E.P.M. (*) estatisticamente (p< 0,05) diferente em relao ao controle. Teste t-Student nopareado. Mnimo 6 experimentos.

CONCLUSES

6. Concluses Diante dos resultados obtidos na 1 etapa, podemos sugerir, que o uso crnico de EtOH capaz de alterar a funo reprodutiva de ratos machos adultos. A contrao mxima do ducto deferente, o qual responsvel pelo transporte de espermatozoides do epiddimo para a uretra, foi menor para todos os frmacos testados em animais tratados com EtOH. Observamos ainda que os parmetros relacionados qualidade desses espermatozoides (anormalidades, velocidade, atividade mitocondrial e motilidade) tambm se mostraram comprometidos. Os filhotes dos ratos tratados com EtOH apresentaram menor peso corpreo ao nascer. A partir destes resultados, sugere-se que o uso crnico (56 dias) em doses moderadas (1-4 g/Kg/dia) de EtOH altera vrios parmetros da funo reprodutiva masculina, e da resposta contrtil do ducto deferente induzida por agonistas adrenrgicos (noradrenalina e fenilefrina), serotonina e brio. J na 2 etapa, observamos que os descendentes dos genitores tratados que tambm receberam EtOH apresentaram uma importante diminuio da resposta contrtil do ducto deferente induzida pela noradrenalina e fenilefrina. No entanto, nenhuma alterao significativa foi encontrada na contrao neurognica e induzida por Clcio. Observamos ainda que no houve nenhuma alterao na quantidade e qualidade dos espermatozoides dos descendentes tratados com EtOH. Embora, a funcionalidade do ducto deferente se mostre comprometida, os parmetros espermticos se mostraram resistentes ao tratamento com EtOH. Portanto, sugerese que esses efeitos podem ser consequncia do efeito crnico do EtOH nos genitores destes animais.

COLABORADORES/AGRADECIMENTOS

7. Colaboradores / Agradecimentos

Colaboradores do projeto: Prof. Dr. Aron Jurkiewicz Ms. Guilherme Henrique Souza Bomfim

Ms. Edilson Dantas da Silva Junior

Nossos sinceros agradecimentos:

ao Prof. Dr. Marcilio Nichi, Profa. Dra. Valquiria Hyppolito Barnabe, e aos psgraduandos Andressa Dalmazzo, Joo Diego de Agostini Losano do Departamento de Reproduo Animal da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo pelo auxilio na realizao dos experimentos de espermatognese;

aos tcnicos do nosso laboratrio Bruno Palmieri, Maria de Lourdes e Hayde Reuter pelo auxilio na realizao dos experimentos funcionais; Fapesp pelo auxlio financeiro.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

8. Referncias Bibliogrficas

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