UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS Francisco Garca Salinas

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS BIOLGICAS

EVALUACIN DE LAS CONDICIONES FISICOQUMICAS EN LA FERMENTACIN DURANTE LA PRODUCCIN DEL MEZCAL DE Agave weber EN ZACATECAS

TESIS
PARA OBTENER EL NIVEL DE

LICENCIADA EN BIOLOGA
PRESENTA

MARA DE JESS HERNNDEZ ARTEAGA

ZACATECAS, ZAC. DICIEMBRE, 2013

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS Francisco Garca Salinas

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS BIOLGICAS

EVALUACIN DE LAS CONDICIONES FISICOQUMICAS EN LA FERMENTACIN DURANTE LA PRODUCCIN DEL MEZCAL DE Agave weber EN ZACATECAS

TESIS
PARA OBTENER EL NIVEL DE

LICENCIADA EN BIOLOGA
PRESENTA

MARA DE JESS HERNNDEZ ARTEAGA

DIRECTOR DE TESIS: M. en C. Edgar Len Esparza Ibarra Dr. en C. Francisco Javier Cabral Arellano

CO-DIRECTORES DE TESIS: M. en C. Luca Delgadillo Ruz Dra. en C. Mara del Roco Rodrguez Aguirre

ZACATECAS, ZAC. DICIEMBRE, 2013

AGRADECIMIENTOS
A las instituciones: A la Universidad Autnoma de Zacatecas. A la Unidad Acadmica de Ciencias Biolgicas de la UAZ por su brillante desempeo en mi formacin profesional. Al Laboratorio de Biotecnologa de la Unidad Acadmica de Ciencias Biolgicas de la Universidad Autnoma de Zacatecas. A mis asesores: Al M. en C. Edgar Len Esparza Ibarra por su confianza, asesora y revisin del presente trabajo de investigacin. Al Dr. en C. Francisco Javier Cabral Arellano por la asesora y facilidades para culminar este trabajo. A la M. en C. Luca Delgadillo Ruiz por el tiempo brindado, por su paciencia y por todas las facilidades otorgadas desde el inicio y hasta la culminacin de mi tesis experimental. Al Dr. en C. Francisco Javier Macas Rodrguez por la revisin y asesora en el anlisis estadstico del presente trabajo. A la Dra. en C. Dra. en C. Mara del Roco Rodrguez Aguirre, por su participacin en los comentarios realizados a mi trabajo de tesis. Al M. en C. Miguel Alvarado Rodrguez por la revisin de la presente tesis experimental.

DEDICATORIA
A mis padres Jos Hernndez Macas y Mara de Jess Arteaga Padilla, por el amor y la confianza que me han brindado, as como por su esfuerzo y apoyo incondicional, gracias al cual he culminado esta etapa de mi vida profesional.

A mis hermanos, Juanita, Ernestina, Jos Luis, Francisco Javier, Gerardo y Ma. Guadalupe por todo su apoyo y cario.

A Salvador Hctor Acevedo Rodrguez por su compaa y apoyo durante toda la carrera profesional.

NDICE GENERAL

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... i LISTA DE TABLAS ..................................................................................................... ii LISTA DE GRFICAS ................................................................................................. iii RESUMEN ................................................................................................................. iv ABSTRACT ................................................................................................................. V I.- INTRODUCCIN .................................................................................................... 1 II.- ANTECEDENTES .................................................................................................. 3 2.1 Produccin de Mezcal en el Sur de Zacatecas. ............................................ 3 2.2 Proceso de fermentacin. ........................................................................... 10 2.2.1 Fermentacin alcohlica. ................................................................ 10 2.2.2 Condiciones para la fermentacin. .................................................. 12 2.2.3 Crecimiento y divisin celular de las levaduras. .............................. 14 2.3 Azcares. .................................................................................................... 16 2.3.1 Clasificacin de los azcares. ......................................................... 17 2.3.2 Azcares reductores totales. ........................................................... 18 2.3.3 Inulina. ............................................................................................. 18 IV.- JUSTIFICACIN ................................................................................................ 21 III.- HIPTESIS ......................................................................................................... 22 V.- OBJETIVOS ........................................................................................................ 23 VI.- MATERIAL Y MTODOS ................................................................................... 24 6.1 Lugar de trabajo.......................................................................................... 24

6.2 Obtencin de los jugos de Agave. ............................................................. 24 6.3 Proceso de fermentacin. ........................................................................... 25 6.4 Pruebas realizadas ..................................................................................... 28 6.4.1. Determinacin de temperatura ....................................................... 28 6.4.2 Determinacin del pH. ..................................................................... 28 6.4.3 Determinacin del porcentaje de acidez. ........................................ 29 6.4.4 Determinacin de azcares reductores totales (ARTs). ................. 30 6.4.5 Determinacin de la densidad celular ............................................. 31 6.4.6 Determinacin del porcentaje de viabilidad. .................................... 33 6.4.7 Determinacin de los grados Brix .................................................... 34 6.4.8 Determinacin del porcentaje de alcohol. ....................................... 35 6.4.9 Diferencia mnima significativa (Prueba de Tukey). ........................ 36 VII.- RESULTADOS Y DISCUSIN .......................................................................... 37 VIII.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 63 IX.- LITERATURA CITADA ....................................................................................... 64 X.- APNDICE .......................................................................................................... 69

LISTA DE FIGURAS Pg. Figura 1. Estados con denominacin de origen Mezcal. Figura 2. Regiones Sur y Sureste del estado de Zacatecas productoras de Mezcal. Figura 3. Jima del Maguey en el Tel de Gonzlez Ortega, Zac. Figura 4. Autoclave de acero inoxidable. Figura 5. Molinos con banda transportadora. Figura 6. Fermentacin en tina de acero inoxidable. Figura 7. Alambique de destilacin. Figura 8. Maduracin del Mezcal en barricas de 200 litros. Figura 9. Envasado y etiquetado. Figura 10. Reacciones de la gluclisis y la fermentacin alcohlica. Figura 11. Ciclo de la divisin celular (reproduccin asexual) en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Figura 12. Fases tpicas del crecimiento celular de una levadura. Figura 13. Estructura base de la inulina. Figura 14. Pias de Agave weber. Figura 15. Jugos de Agave fermentando dentro de la incubadora. Figura 16. Medicin de la temperatura. Figura 17. Potencimetro marca Corning. Figura 18. Prueba del porcentaje de acidez en relacin al cido actico. Figura 19. Prueba del porcentaje de azcares reductores totales. Figura 20. Cmara de Neubauer. Figura 21. Partes de la cmara de Neubauer. Figura 22. Prueba de la viabilidad celular. Figura 23. Refractmetro. 2 3 4 5 6 7 8 9 9 11 14 15 19 24 25 28 29 30 31 32 33 34 35

LISTA DE TABLAS Pg. Tabla 1. Valores iniciales de la fermentacin en cada uno de los tratamientos empleados. Tabla 2. Determinacin de la densidad celular (clulas/ml). Tabla 3. Anlisis estadstico de la densidad celular en las fermentaciones (P<0.05). Tabla 4. Valores determinados del pH. Tabla 5. Anlisis estadstico del pH de las fermentaciones (P< 0.05). Tabla 6. Determinacin del porcentaje de acidez. Tabla 7. Anlisis estadstico del porcentaje de acidez de las fermentaciones (P< 0.05). Tabla 8. Determinacin del porcentaje de azcares reductores totales (ARTs). Tabla 9. Anlisis estadstico de los azcares reductores totales de las fermentaciones (P< 0.05). Tabla 10. Determinacin de los grados Brix. Tabla 11. Anlisis estadstico de los grados Brix de las fermentaciones (P< 0.05). Tabla 12. Determinacin de la viabilidad celular. Tabla 13. Anlisis estadstico de la viabilidad celular de las fermentaciones (P< 0.05). Tabla 14. Determinacin del porcentaje de alcohol volumen a 20 C. 37 38 41 42 45 46 49

50

53 54

56 57 60 61

II

LISTA DE GRFICAS Pg. Grafica 1. Determinacin de la densidad celular (clulas/ml). Grafica 2. Determinacin del pH. Grafica 3. Determinacin del porcentaje de acidez. Grafica 4. Determinacin del porcentaje de azcares reductores totales (ARTs). Grafica 5. Determinacin de los grados Brix. Grafica 6. Determinacin de la viabilidad celular. Grafica 7. Determinacin del porcentaje de alcohol volumen a 20 C. 51 55 58 62 39 43 47

III

RESUMEN Zacatecas es el segundo productor de Mezcal a nivel nacional con alrededor de diez millones de litros de produccin anual. En el Estado, se cuenta con al menos 20 empresas dedicadas a la elaboracin de Mezcal. stas se ubican en el Sur y Sureste de la entidad. En las plantas ubicadas al Sur del Estado, el Mezcal se elabora de manera industrial; mientras que las plantas productoras de Mezcal ubicadas en el Sureste, lo elaboran de manera artesanal. En la mayora de las fbricas mezcaleras de todo el Pas, predomina la fermentacin espontnea, lo que tiene como consecuencia bajos rendimientos y altos costos de produccin, as como tambin se obtiene un producto con caractersticas organolpticas variables y es por eso que este trabajo est orientado principalmente en determinar y estandarizar las condiciones a las cuales debe llevarse a cabo la fermentacin del jugo de Agave de tal forma que se optimicen los recursos y llevar a cabo la fermentacin en las mejores condiciones para obtener mayor produccin de Mezcal y que tenga alta calidad con caractersticas homogneas. Para ello en el presente trabajo, se modificaron varios parmetros fisicoqumicos tales como, concentracin de levadura, pH, acidez, grados Brix, porcentaje de azcares y temperatura durante la fermentacin del Mezcal, con el fin de evaluar y tener las condiciones ptimas para su produccin en el Sur de Zacatecas; en donde se utilizan los jugos de Agave weber. Los resultados obtenidos fueron que a mayor concentracin de levadura, la fermentacin es ms rpida a un pH ligeramente cido en el rango de 4, siendo el mejor para la produccin de alcohol, a una temperatura de 30 C. En cuanto a la viabilidad celular en todas las condiciones de fermentacin, sta disminuy al igual que los azcares desde el inicio de la fermentacin. En cuanto al pH, ste se mantuvo sin muchos cambios, pero la acidez aument conforme transcurra la fermentacin debido a la produccin de cido actico, por lo que al producir el Mezcal, se recomienda destilar a las 96 horas el mosto fermentado antes de que se acidifique y disminuya la concentracin de alcohol para elaborar el Mezcal.

IV

ABSTRACT Zacatecas is the second largest producer of Mezcal nationwide with about ten million liters of annual production. In the State there are at least 20 companies engaged in production of Mezcal, which are located in the South and Southeast of the entity. In plants located in the South of the State, Mezcal is industrially produced, while in the production plants of the Southeastern part of the State, Mezcal is made by hand. In the most of Mezcal factories nationwide, spontaneous fermentation predominates, which results in low yield and high production costs, and also is obtained a product with organoleptic variables, that's why this work is mainly oriented to standardize conditions under which the agave juice fermentation should be conducted in such a way as to optimize resources, and carry out the fermentation in the best conditions to increase production of Mezcal with high quality and homogeneous characteristics. Therefore, in the present work were modified several parameters such as yeast concentration, pH, acidity, degrees Brix, sugar percentage and temperature during the Mezcal fermentation in order to have the optimal conditions of production in the South of Zacatecas, where Agave weber juices are used. Results obtained were that a higher concentration of yeast fermentation is faster and a slightly acid pH in the range of 4 is the best for the production of alcohol at a temperature of 30 C. Regarding the cell viability under all conditions of fermentation, it decreased, as well as decreased the reducing sugars from the beginning of fermentation. Regard to pH, it remained largely unchanged, but acidity increased as fermentation progressed due to the production of acetic acid, so that when producing the Mezcal, it is recommended to distill for 96 hours the fermented mash, before it acidifies and before decreases the concentration of alcohol, to produce Mezcal.

I.- INTRODUCCIN El gnero Agave, cuyo significado es admirable o noble fue descrito por Carlos Linneo en 1753 y es uno de los grupos de plantas que identifican a Mxico en el mundo y que ha jugado un papel importante en el desarrollo de la cultura Mexicana y de otros pueblos de Amrica (Gentry, 1982).

La familia Agavaceae est compuesta de 8 gneros con 273 especies aproximadamente; 205 crecen en Mxico (75%) y 151 son endmicas (55%). En Mesoamrica, el Agave o Maguey ha sido importante desde hace 9,000 aos y desde el punto de vista de grupos tnicos como los Huicholes, fue la primera planta creada por Dios. Adems segn descripciones tiene ms de 100 usos y actualmente se reportan por lo menos 70 formas de empleo, entre las que destacan la produccin de bebidas como el aguamiel, el pulque, el tequila y el Mezcal entre otros (Granados, 1993).

El Mezcal se define como una bebida alcohlica regional obtenida por destilacin y rectificacin de mostos preparados directa y originalmente con los azcares extrados de los tallos maduros pias, de diferentes especies del gnero Agave, previamente hidrolizados o cocidos, y sometidos a fermentacin alcohlica con levaduras, cultivadas o no. El Mezcal, es un lquido de olor y sabor sui gneris de acuerdo a su tipo e incoloro o ligeramente amarillento cuando es reposado o aejado en recipientes de madera de roble blanco o encino, o cuando se aboque sin reposarlo o aejarlo (NOM-070-SCFI, 1994).

Por otra parte, la denominacin de origen permite designar y hacer el reconocimiento de que un producto es originario de una regin geogrfica de un Pas, regin o localidad cuando sus caractersticas y calidad obedecen exclusivamente al medio geogrfico, incluidos los factores naturales y humanos (Errzuriz, 2010). La Denominacin de Origen para el Mezcal, fue publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 28 de noviembre de 1994, incluyndose a: Durango, Guerrero, Oaxaca, San Luis Potos, Tamaulipas y Zacatecas, como entidades productoras de 1

Maguey y de Mezcal, que cuentan con las caractersticas que establece esta denominacin que fue registrada el 9 de marzo de 1995 por la Organizacin Mundial de la Propiedad Intelectual con sede en Ginebra, Suiza; por gestiones del Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial (IMPI) a peticin de los productores de Oaxaca y por conducto de la Secretaria de Desarrollo Industrial y Comercial (SEDIC) del Gobierno del Estado de Oaxaca. En el ao 2001 se incorpora a la denominacin de origen Mezcal el Municipio de San Felipe, Guanajuato y en el 2003 se incluyen 11 municipios del estado de Tamaulipas. (Sistema Producto Maguey-Mezcal, 2004). Posteriormente, en el ao 2012, se incluye tambin 27 municipios del estado de Michoacn (DOF, 2012) (Figura 1).

Figura 1. Estados con denominacin de origen Mezcal. (Sistema Producto Maguey - Mezcal, 2004)

II.- ANTECEDENTES 2.1 Produccin de Mezcal en el Sur de Zacatecas. La Regin centro norte del Pas, tiene una antigua tradicin Mezcalera y con ello una importante oportunidad de desarrollo econmico para sus regiones. En el 2004 se logr la conformacin del Consejo Mexicano Regulador de la Calidad del Mezcal (COMERCAM), el cual es el organismo que regula el cumplimiento de la NOM-070SCFI-1994 para la elaboracin del Mezcal. El proceso para la produccin del Mezcal en Zacatecas es diferente, ya que presenta dos regiones: en la regin Sureste que se elabora el Mezcal con Agave salmiana de manera rstica y en el Sur, donde se utiliza el Agave weber y que la produccin del Mezcal es totalmente tecnificada su elaboracin. Los municipios productores de Mezcal en la regin Sur de Zacatecas son: Apozol, Apulco, Florencia de Benito Jurez, Garca de la Cadena, Huanusco, Jalpa, Juchipila, Mezquital del Oro, Moyahua, Nochistln, Tabasco, Tel de Gonzlez Ortega y Tlaltenango (Martnez et al., 2005) (Figura 2).

Figura 2. Regiones Sur y Sureste del Estado de Zacatecas productoras de Mezcal.

A continuacin se mencionan las etapas que se llevan a cabo en la produccin del Mezcal en la regin Sur:

a)

Materia prima.

La materia prima que se utiliza en la elaboracin del Mezcal, procede de diferentes especies del gnero Agave, que reciben el nombre comn de Maguey y que pertenecen a la familia Agavaceae. En la regin Sur de Zacatecas, la especie que generalmente se utiliza es el Agave weber, el cual se caracteriza por ser una planta suculenta perenne con tallo corto. Sus hojas se disponen en rosetas y tienen forma lanceolada (forma de lanza), rgidas, carnosas, acabadas en espina y con los mrgenes dentados y espinosos. Al tallo de la planta donde reside la base de las hojas o pencas se le denomina comnmente como pia (Quiroz, 2000). b) Recoleccin.

Para la recoleccin de la materia prima (Agave), son necesarias ciertas condiciones o caractersticas, tales como una coloracin verde - amarillenta en la base de las pencas y parda en la base del Maguey, as como la presencia de pencas secas en esta zona (Nobel, 1998). La recoleccin o jima del Maguey (Figura 3) sigue tres operaciones principales: corte de las pencas, extraccin de la pia y rasurado, que tienen la funcin de completar la eliminacin de las pencas de tal forma que slo quede el corazn de la pia (Castillo, 2003).

Figura 3. Jima del Maguey en el Tel de Gonzlez Ortega, Zac.

c)

Cocimiento.

Durante la coccin de las pias de Maguey, se generan azcares fermentables (fructosa y glucosa) por hidrlisis de la inulina (fructano) presente en el Agave; cuyos monosacridos son ms disponibles por la accin de la levadura para favorecer la fermentacin. El cocimiento se realiza con vapor de agua a presin en autoclaves de acero inoxidable (Figura 4) con capacidad de 15 hasta 40 toneladas; el tiempo de coccin dura de 9 a 12 horas aproximadamente a una temperatura promedio de 105 grados centgrados (Mancilla y Lpez, 2002).

Figura 4. Autoclave de acero inoxidable.

d)

Molienda.

En la molienda o trituracin, se extrae el jugo de las pias cocidas (Figura 5), por lo que esta etapa es fundamental en el rendimiento del proceso ya que se realiza con diferentes equipos automatizados (desgarradores, molinos, prensa, etc.) y sistemas que tienen que ver con el rendimiento de extraccin del jugo (Badui, 1996).

Figura 5. Molinos con banda transportadora.

e)

Fermentacin.

En la fermentacin, los azcares extrados de las pias se transforman en etanol por medio de la fermentacin alcohlica, ruta metablica propia de las levaduras. Los pasos a seguir durante la fermentacin son los siguientes: 1. Adicin de agua caliente: Cuando se termina de colocar el jugo de la molienda, se adiciona agua caliente con la finalidad de crear el ambiente apropiado para el crecimiento de las levaduras. Finalizada esta operacin, debe esperarse aproximadamente 24 horas para que alcance el estado apropiado o punto para la etapa siguiente. Este estado se caracteriza por la presencia de espuma que cubre la tina y por la existencia del sonido caracterstico de un burbujeo intenso y uniforme en toda la tina de fermentacin (Figura 6). 2. Adicin de agua fra: Alcanzado el estado anterior, es necesario regular el crecimiento de las levaduras con la finalidad de que no exista una transformacin acelerada a alcohol, de forma que pueda originarse cido actico de manera posterior (Mancilla y Lpez, 2002).

3. Revoltura: Ya controlado el crecimiento microbiano, debe efectuarse una homogeneizacin de tal forma que no existan zonas donde la fermentacin sea menor o no exista. 4. Detencin de la fermentacin: En este paso la intencin es disminuir el ritmo de trabajo de las levaduras lo ms posible. Para esto se permite la entrada de oxgeno a las tinas de fermentacin efectuando el levantamiento de la capa superior de la pulpa que cubre la dems materia fermentada. El tiempo de fermentacin vara de acuerdo con la temperatura ambiental y esta a su vez cambia con cada poca del ao. Sometida a bajas temperaturas en invierno, la fermentacin se puede prolongar hasta ms de 10 das.

Figura 6. Fermentacin en tina de acero inoxidable.

f)

Destilacin.

En esta operacin se efecta la separacin del alcohol del agua aprovechando para ello sus diferentes puntos de ebullicin. El etanol, debido a su estructura molecular, tiene un punto de ebullicin ms bajo que el agua (78.5 C a nivel del mar), por lo tanto, se separa de sta al alcanzar esa temperatura (Kister, 1992). El dispositivo utilizado para la destilacin es el alambique (Figura 7). Este equipo est conformado por cuatro elementos fabricados en acero inoxidable o cobre debido a su alta conductividad trmica, de tal forma que facilita la transferencia de calor calentndose y enfrindose fcilmente alcanzando as la temperatura apropiada de separacin (Leaut, 1990). Aqu es muy importante el control de la temperatura, 7

debido a que una temperatura muy alta o muy baja tiene repercusiones negativas en la obtencin del Mezcal (Prado, 2002).

Figura 7. Alambique de destilacin.

g)

Refinacin.

Al Mezcal obtenido en la operacin anterior, se le llama Mezcal de primera destilacin (ordinario). El Mezcal en la primera destilacin tiene una graduacin de alcohol baja para los requerimientos del envasado, de ah que necesiten refinarse (redestilar) para elevar su contenido de alcohol (Dvila, 2001). h) Composicin del Mezcal.

Debido a las variaciones de la graduacin alcohlica del Mezcal obtenido en las operaciones de destilacin y refinacin, es necesario mezclar los productos de la primera destilacin (puntas y colas) con aquellos obtenidos en la refinacin (incluyendo el agua destilada) hasta alcanzar el grado alcohlico requerido para la venta. Cabe mencionar que cada empresa tiene su particular manera de llevar a cabo la destilacin, en los llamados cortes de puntas, corazn y colas (Sols y Trujillo, 2008). i) Maduracin.

Este paso consiste en el almacenamiento del Mezcal en barricas hechas de roble blanco o encino (Figura 8) con la finalidad de dar un aporte especial a las caractersticas organolpticas del Mezcal, como suavizar el sabor y conferirle una 8

coloracin obscura agradable a la vista (NOM-070-SCFI, 1994). El perodo de maduracin vara segn el tipo de Mezcal que se desee obtener, ya que el Mezcal reposado se almacena por un perodo de dos meses y el Mezcal aejo se almacena por un perodo de un ao (NOM-070-SCFI, 1994).

Figura 8. Maduracin del Mezcal en barricas de 200 litros.

j)

Envasado.

Finalmente se realiza el envasado en distintos tipos de recipientes dependiendo de lo que se vaya a envasar (Zacatecas: tierra, plata y Mezcal 2004), ya sea Mezcal blanco (minero), reposado o aejo (Figura 9).

Figura 9. Envasado y etiquetado.

2.2 Proceso de fermentacin. Al alcohol lo conoce la humanidad desde hace muchos siglos; su origen fue la fermentacin natural de los azcares para la produccin de bebidas y licores. Existen evidencias arqueolgicas del uso de la fermentacin desde hace ms de 8000 aos de antigedad, desde entonces, el hombre supo fermentar mostos que contenan carbohidratos con tcnicas muy depuradas, e incluso a partir del siglo XV aprendi a destilar el alcohol para aumentar su concentracin en las bebidas. Esto se logr sin tener idea en ese tiempo de la existencia de los microorganismos, ni del papel clave que desempean (Robinson, 1994). El descubrimiento de los microorganismos, se asocia con el desarrollo del microscopio en el siglo XVII. La primera persona que descubri su existencia, en 1680, fue el holands Antonie Van Leeuwenhoek, fabricante aficionado de microscopios. A partir de entonces se empez a desarrollar la microbiologa, es decir, el estudio de los microorganismos como bacterias, hongos y levaduras, elementos clave de los procesos fermentativos (Hernndez et. al., 2003). En 1857, investigaciones realizadas por Louis Pasteur sobre la fermentacin de cerveza y vino demostr que las levaduras fermentaban el azcar en etanol y dixido de carbono, cuando eran obligadas a vivir en ausencia de aire (Pez, 2010).

2.2.1 Fermentacin alcohlica. La fermentacin alcohlica, consiste en la transformacin de los azcares en alcohol y en otros compuestos en cantidades menores, pero que juegan un papel importante en las caractersticas finales del producto. Consta de tres etapas principales: a) el transporte de los azcares al interior de la clula, b) la transformacin de los azcares en piruvato por medio de la gluclisis y c) la conversin de piruvato en etanol (Surez, 2004) (Figura 10).

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Figura 10. Reacciones de la gluclisis y la fermentacin alcohlica (Lehninger, 1990).

a) Transporte de los azcares Esta etapa depende de las protenas transportadoras de la membrana de la clula, que llevan a cabo el transporte de los monosacridos, principalmente fructosa y glucosa, y cada transportador tiene una afinidad diferente para estos azcares. Se le considera a esta etapa el elemento limitante del metabolismo de los azcares, ya que la inhibicin del transporte de los azcares, puede provocar la interrupcin espontnea de la fermentacin, incluso con azcares fermentables todava presentes en el mosto (Lehninger, 1990).

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b) Gluclisis La gluclisis es catalizada por la accin consecutiva de al menos diez enzimas. Todos los compuestos intermediarios son fosforilados, los cuales tienen tres funciones fundamentales: en primer lugar proveen a la molcula un grupo polar cargado negativamente que le impide pasar a travs de la membrana celular. Posteriormente, los enlaces de fosfato actan como grupos enlazantes o de reconocimiento en los compuestos enzima - sustrato y finalmente la conservacin de la energa, ya que al final se transforman en grupos fosfato terminal del ATP en el transcurso de la glucolisis. La gluclisis requiere de diversos compuestos para llevar a cabo las reacciones como: compuestos fosforilados, cationes divalentes (Mg2+ o Mn2+), iones metlicos divalentes (Ca2+ o Fe2+), nucletidos en forma oxidada o reducida (NAD+ y NADH) y cationes de metal alcalino (K+, Rb+ o Cs+) (Lehninger, 1990). c) Conversin del piruvato a etanol. La transformacin de piruvato a etanol tiene solo un intermediario, el acetaldehdo, esta reaccin requiere de NADH y Mg2+ y genera CO2 (Lehninger, 1990). La enzima que lleva a cabo esta reaccin es la alcohol - deshidrogenasa (ADH). La etapa crtica para la productividad y la calidad del Mezcal, es en la fermentacin que se realiza en forma natural con las levaduras nativas presentes en el mosto y en el medio ambiente en donde se realiza. La importancia del conocimiento de la microflora radica en que est formada por especies de diferentes gneros, que coexisten en el tiempo y se suceden secuencialmente en funcin de su resistencia a la concentracin de azcares, produccin de alcohol y metabolitos secundarios (Surez, 2004).

2.2.2 Condiciones para la fermentacin. Dentro de las condiciones necesarias para que se lleve a cabo la fermentacin se encuentran:

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a) Temperatura. Las levaduras son microorganismos mesfilos, esto hace que la fermentacin pueda tener lugar en un rango de temperaturas desde los 13 - 14 C hasta los 33-35 C. Dentro de este intervalo, cuanto mayor sea la temperatura, mayor ser la velocidad del proceso fermentativo siendo tambin mayor la proporcin de productos secundarios. Sin embargo, a menor temperatura es ms fcil conseguir un mayor grado alcohlico, ya que parece que las altas temperaturas que hacen fermentar ms rpido a las levaduras llegan a agotarlas antes (Arellano, 1999). b) Aireacin. Durante mucho tiempo, se pens que las levaduras eran microorganismos anaerobios estrictos, es decir, deba realizarse la fermentacin en ausencia de oxgeno. Sin embargo, es un hecho errneo ya que requieren una cierta aireacin. Con una aireacin sumamente excesiva no se obtendra alcohol, sino agua y anhdrido carbnico debido a que las levaduras, cuando viven en condiciones aerbicas, no utilizan los azcares por va fermentativa si no oxidativa, para obtener con ello mucha ms energa (Cedeo, 2003). c) pH. El pH inicial del mosto es de 4.5 y en el transcurso de la fermentacin tiende a bajar hasta alcanzar en el mosto muerto, valores de alrededor de 3.5 a 3.9. Cuanto menor es el pH, la capacidad de las levaduras para fermentar disminuye, aunque ms protegido se encuentra el mosto ante posibles ataques bacterianos que pueden generar prdidas en los rendimientos de conversin de los azcares en alcohol (Cedeo 2003). d) Concentracin de azcares. La concentracin inicial de azcares vara entre el 11 y 14 por ciento y finaliza con un 3 a 5 por ciento cuando la fermentacin se desarrolla de manera adecuada. La disminucin de la concentracin de los azcares, incrementa la concentracin de

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etanol y de otros compuestos que se generan durante la fermentacin (Arrizon, 2001). 2.2.3 Crecimiento y divisin celular de las levaduras. La forma ms comn de reproduccin de las levaduras, es la asexual o por gemacin; tambin se puede observar fisin binaria, seguida de formacin del micelio por elongacin de la cadena. El crecimiento de las levaduras se asocia con la formacin de las gemas, las cuales alcanzan el tamao de la clula madura, al tiempo que se separan de la clula madre (Tortora et al., 1993), como se observa en la Figura 11.

Figura 11. Ciclo de la divisin celular (reproduccin asexual) en la levadura Saccharomyces cerevisiae (CIATEJ, 2004).

Las levaduras entran en una fase de reproduccin sexual cuando las condiciones nutricionales no son ideales, por ejemplo: en caso de una carencia prolongada de nitrgeno (Tortora et al., 1993). Por otra parte, cuando las condiciones son favorables, como es el caso de las fermentaciones para la obtencin de bebidas alcohlicas, stas se reproducen asexualmente y con facilidad se puede observar al

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microscopio sus gemas. La formacin de las gemas ocupa la totalidad del ciclo celular (Pringle et al., 1993).

Es importante conocer las fases de crecimiento de las levaduras. En general todas las cepas presentan un comportamiento similar, aunque con caractersticas especficas para cada cepa. Su crecimiento puede dividirse en cuatro fases (Werner et al., 1993), las cuales se representan en la Figura 12.

Figura 12. Fases tpicas del crecimiento celular de una levadura. (http://www.geocities.com/roberto_raul/crecimiento.html).

1) Fase log o de retraso, antes de que la divisin celular comience. 2) Fase exponencial o logartmica de crecimiento, cuando las clulas se dividen a una velocidad constante. 3) Fase estacionaria, cuando la divisin celular cesa. 4) Fase de muerte.

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2.3. Azcares. Los azcares o carbohidratos son compuestos formados por carbono, hidrgeno y oxgeno, presentan la frmula general Cn(H2O)n y tienen estructura de

polihidroxialdehdo o de polihidroxiacetona; adems todos los carbohidratos presentan grupos funcionales C = O OH. A partir del dixido de carbono y agua, las plantas sintetizan los carbohidratos, en un proceso denominado fotosntesis (Badui, 2006).

El pigmento verde de las plantas, la clorofila, pone a disposicin del vegetal, la energa que absorbe de la luz solar. En este proceso tienen lugar numerosas reacciones catalizadas por enzimas (no todas las reacciones enzimticas se comprenden), queda el CO2 reducido como carbohidrato y a su vez se libera oxgeno. As la energa solar qued transformada en energa qumica a disposicin de las plantas y de animales, los cuales metabolizan los carbohidratos realizando la operacin inversa y utilizando la energa para diversos fines (Solomons, 2004).
Cn(H2O)n
+

nO2

nCO2

n(H2O)

energa

Los azcares son de gran importancia en la naturaleza ya que son el almacn qumico principal de la energa del Sol. Una vez fabricados en forma de carbohidratos solubles durante la fotosntesis, stos se almacenan en formas insolubles, sobre todo en forma de almidn. En el caso particular del Agave, se almacenan en forma de inulinas. La energa retenida en estas reservas de azcares se moviliza cuando se parten los azcares solubles de que estn hechos. De esta forma, los carbohidratos constituyen la principal fuente de energa tanto para las plantas como para los animales que se alimentan de ellas. Los azcares o carbohidratos, tambin son importantes como compuestos estructurales,

principalmente en las plantas. La energa almacenada en los azcares se libera

16

cuando los animales o las plantas a travs de su metabolismo transforman los azcares en dixido de carbono y agua.

El metabolismo de los carbohidratos tambin se lleva cabo a travs de una serie de reacciones catalizadas por enzimas, en las cuales cada paso generador de energa es una oxidacin (o la consecuencia de una oxidacin). Los humanos ingerimos cereales como fuente de carbohidratos, pero estos cereales, como el arroz, el maz, etctera, contienen los carbohidratos en forma de almidones, stos son macromolculas polimricas de glucosa, que nuestro organismo procesa y transforma con sus enzimas para nuestro beneficio (Solomons, 2004).
Enzimas

Almidn

Glucosa

2.3.1 Clasificacin de los azcares. Los carbohidratos se clasifican en monosacridos, oligosacridos y polisacridos. Un monosacrido, es una unidad que ya no se subdivide ms por hidrlisis cida o enzimtica, por ejemplo glucosa, fructosa o galactosa. Los oligosacridos estn constituidos por dos a diez unidades de monosacridos. La palabra viene del griego, oligo = pocos. Digamos el azcar que utilizamos es un disacrido y por tanto un oligosacrido.
H / H 2O o Enzimas
+

Sacarosa

Glucosa

Fructosa

Monosacridos

Los polisacridos, son macromolculas con alto grado de polimerizacin, por hidrlisis producen muchos monosacridos, entre 100 y 90 000 unidades. Dentro los polisacridos se encuentran la inulina, el almidn y la celulosa (Badui, 2006).

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Almidn

Hidrlisis cida prolongada

Glucosa (muchas molculas)

2.3.2 Azcares reductores totales. Los azcares que contienen en su estructura grupos aldehdicos o cetnicos libres reaccionan como agentes reductores dbiles y se llaman azcares reductores. Estos incluyen a todos los monosacridos y los disacridos maltosa, lactosa y celobiosa. La importancia de los azcares reductores en la industria Mezcalera, radica en que al ser monosacridos provenientes de las inulinas que previamente fueron hidrolizadas por vapor durante la etapa del cocimiento en hornos o autoclaves, son el sustrato para que las levaduras efecten la fermentacin de estos para la produccin del Mezcal. La determinacin precisa de los azcares reductores fermentables, nos indica cuanta cantidad de alcohol podremos obtener a partir de la cantidad exacta de azcares fermentables; tambin para la formulacin de los mostos de fermentacin, ya que a mostos con un valor mayor a 18 grados Brix (Bx), la levadura no fermenta, si no que se inhibe la fermentacin; mientras que un mosto de 13 -16 Bx es fcil llevar un control adecuado de la fermentacin (Miller, 2001). Finalmente cuando se requiere conocer el mosto muerto (cuando la fermentacin ha llegado a su fin) y detener el proceso antes de que contine la formacin de cido actico, es necesario saber qu cantidad de azcares reductores an estn presentes en el mosto, que en este caso se espera encontrar de 1 a 5 Bx, como indicativo de que la fermentacin alcohlica ha llegado a su fin (CIATEJ, 2004).

2.3.3 Inulina. La inulina, es un carbohidrato de reserva presente en determinadas familias de monocotiledoneas como las Agavceas, Liliceas, Amarilidceas, Gramneas y dicotiledneas como la familia de las Asterceas. Se encuentra en cantidades significativas en vegetales usados habitualmente para el consumo humano como: trigo, banana, achicoria, alcachofa, esprrago, cebolla y ajo. De hecho, se ha 18

estimado que los americanos consumen de 1 a 4 gramos diarios de inulina y los europeos de 3 a 11 gramos diarios (CIATEJ, 2004). Su estructura qumica, es de un polisacrido heterocclico con una D-glucopiranosa o D-fructopiranosa (anillo de 6 carbonos) y de una cadena lineal compuesta de varias unidades de D-fructosa (anillo de 5 carbonos) unidos por enlaces -(2,1) (Figura 13). La longitud de la cadena polimrica puede variar de 20 a 200 monmeros de fructosa, dependiendo el grado medio de polimerizacin de la fuente de donde se obtiene, siendo para el caso de los agaves de 30 a 35 unidades de D-fructosa (CIATEJ, 2004). La inulina en la fisiologa del agave tiene la funcin de ser almacn de energa como producto de la fotosntesis en las hojas o pencas del agave, conforme ste madura, la inulina es transportada de las pencas al tallo de la planta (o pia como se le conoce una vez jimada). La cantidad de inulina presente en las pias vara segn la edad de la planta, el tipo de agave y la poca de ao en que es jimado. De ah que existan diferencias considerables en su contenido de azcares (inulina), para el caso de los Agaves Zacatecanos, es de un promedio de 6 a 8 % para Agave salmiana y de 24 a 30 % para el Agave weber (Delgadillo, 2010).

Figura 13. Estructura base de la inulina (CIATEJ, 2004).

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Como se mencion anteriormente, la inulina no fermenta en forma directa, ya que para la obtencin de azcares fermentables (mono o disacridos) en la produccin de Mezcal, se requiere de una hidrlisis previa; la cual se da por va fisicoqumica durante el cocimiento en hornos o autoclaves. Como producto de esta hidrlisis por medio de vapor, obtenemos carbohidratos ms simples, en especial los monosacridos, ya que son la materia prima fundamental para que los microorganismos produzcan el Mezcal (CIATEJ, 2004). Durante la fermentacin alcohlica, los microorganismos utilizan azcar y otros constituyentes de las materias primas como sustratos para su crecimiento, convirtindolos en etanol, dixido de carbono y otros metabolitos que contribuyen a la composicin qumica y calidad sensorial del producto (CIATEJ, 2004).

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III.- JUSTIFICACIN Zacatecas produce cerca del 40 por ciento del Mezcal que se consume en el Pas (10 millones de litros), superando a otras entidades como Durango, Guanajuato, Guerrero, Michoacn, San Luis Potos y Tamaulipas. Existen dos regiones productoras de Mezcal en el Estado de Zacatecas; que presentan diferencias en la produccin y en el proceso de elaboracin del Mezcal. Para el Sureste del Estado se produce de Agave salmiana de manera rstica o artesanal, mientras que para el Sur lo es de manera tecnificada con el Agave weber; por lo que la bebida obtiene un sabor caracterstico dependiendo de la regin y el proceso en la que es elaborado (Esparza, 2010). Actualmente, se estiman alrededor de 20 empresas en el Estado, dedicadas a la produccin y comercializacin de Mezcal (Destiladora El Zacatecano S.A. de C.V, Mezcal de Agave Huitzila, S.A. de C.V, Mezcales de Calidad Don Aurelio Lamas, S.A. de C.V, Mezcal El Caxcan, S.A. De C.V, Industrias Mezcaleras Bauelos, S.A. de C.V, Pin Gigante SPR de RL, Diamante del Desierto S.C. de C.V, Escorpin la Estancuela SPR de RI, Grupo San Jos de Allende, SPR de RI, Industrializadora de Agave Mezcalero El Chino S. de R.L, Compaa Vincola La Pendencia, S.A. de C.V, Envasadora y Distribuidora La Perla S.A de C.V, Empresa Integradora Regional de Organizaciones Magueyeras de Zacatecas, S.A. de C.V, Cristeros Santuarios Jalpa, SPR de RI, Sociedad Mezcalera Saldaa, S.A. de C.V, Magueyeros y Mezcaleros de Zacatecas, S.C. de C.V, Agrcola Curiel, SPR de RL, Empresa Integradora La Caxcana SA de CV, Empresa Integradora Tres Pueblos SA de CV, Mezcales del Can SPR de RL) (De Anda, 2013). En las fbricas Mezcaleras de Zacatecas y todo el Pas, predomina la fermentacin espontnea, lo que tiene como consecuencia bajos rendimientos y altos costos de produccin; as como tambin se obtiene un producto con caractersticas organolpticas variables (Reyes 2008). Y es por ello, que este trabajo est orientado principalmente en estandarizar las condiciones a las cuales debe llevarse a cabo la fermentacin de los jugos de Agave, de tal forma que se optimicen los recursos y lleven a cabo la fermentacin en las mejores condiciones para obtener mayor produccin de Mezcales con caractersticas organolpticas homogneas y de alta calidad. 21

IV.- HIPTESIS La variacin de caractersticas fisicoqumicas como lo son: el pH, porcentaje de acidez, temperatura, concentracin de levaduras y azcares, durante el proceso de fermentacin, afectan la produccin del Mezcal.

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V.- OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Evaluar el comportamiento de la fermentacin al variar diferentes condiciones fisicoqumicas que intervienen en el proceso de produccin del Mezcal de Agave weber en Zacatecas.

OBJETIVOS ESPECFICOS Obtener jugos hidrolizados de las pias de Agave weber

Modificar de manera independiente las condiciones de pH, porcentaje de

acidez, temperatura, concentracin de levaduras y azcares, durante el proceso de fermentacin en la produccin del Mezcal.

Evaluar el comportamiento de cada fermentacin dadas las modificaciones,

determinando la densidad celular, viabilidad, pH, acidez, grados Brix, azcares reductores totales y porcentaje de alcohol.

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VI.- MATERIAL Y MTODOS 6.1 Lugar de trabajo. El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de Biotecnologa de la Unidad Acadmica de Ciencias Biolgicas, de la Universidad Autnoma de Zacatecas ubicado en el campus II en Zacatecas, Zac.

6.2 Obtencin de los jugos de Agave. Se recolectaron pias jimadas de Agave weber las cuales provenan del Sur del estado de Zacatecas y fueron partidas en 5 y 8 partes (Figura 14) para introducirlas en la autoclave para su hidrlisis y la cual se llev a cabo en un tiempo de 7 horas a 120 C. Para las pias cortadas en 5 y 8 partes, el tiempo que permaneci en la autoclave fue de 5 horas a una temperatura de 120 C. Transcurrido el tiempo de cocimiento, se dejaron enfriar los trozos de pias para despus extraer los jugos de Agave de manera manual.

Figura 14. Pias de Agave weber.

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6.3 Proceso de fermentacin. Durante el proceso de fermentacin, se modificaron diferentes condiciones fisicoqumicas para observar su comportamiento y las cuales se enlistan a continuacin:

Condiciones de fermentacin: 1) Fermentacin No. 1 (Concentracin de levaduras).

En ese experimento, se modificaron las concentraciones de levaduras, en concentraciones de 0.05, 0.07, 0.10, 0.14 y 0.18 gramos de levadura por cada 100 ml de medio. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les aadi la levadura (Saccharomyces cerevisiae), despus fueron sometidos a aireacin durante cinco minutos y fueron llevados a la incubadora a una temperatura de 35 C (Figura 15). Cada fermentacin, se realiz en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave y fue monitoreada cada 24 horas hasta las 96 horas despus del inicio de la fermentacin, determinndole acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azcares reductores totales.

Figura 15. Jugos de Agave fermentando dentro de la incubadora.

25

2)

Fermentacin No. 2 (pH).

En este experimento, se modific el pH inicial en valores que fueron en el rango de: 3, 4, 6 y 8. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les aadi 0.07 gramos de levadura por cada 100 ml, siendo sometidos a aireacin durante cinco minutos en la incubadora a una temperatura de 35 C. Cada fermentacin, se realiz en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave (17 Bx) y fue monitoreada cada 24 horas hasta las 96 horas despus del inicio de la fermentacin, determinndole acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azcares reductores totales. Para aumentar el pH, se utiliz hidrxido de potasio (KOH) 5N, y para disminuirlo se utiliz cido ctrico al 30 %.

3)

Fermentacin No. 3 (Porcentaje de acidez).

En este experimento, se modific la acidez inicial en los valores que fueron de: 0.0202 %, 0.0813 %, 0.2751% y 1.3116 %. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les aadi 0.07 gramos de levadura por cada 100 ml, siendo sometidos a aireacin durante cinco minutos en la incubadora a una temperatura de 35 C. Cada fermentacin, se realiz en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave (17 Bx) y fue monitoreada cada 24 horas hasta las 96 horas despus del inicio de la fermentacin, determinndole acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azcares reductores totales, Para modificar la acidez, se utiliz KOH 5N y para disminuirla, se utiliz cido ctrico al 30 % para aumentar la acidez.

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4)

Fermentacin No. 4 (Temperatura).

En este experimento, se modific la temperatura en valores que fueron de: 20, 25, 30, 35 y 37 C. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les aadi 0.07 gramos de levadura por cada 100 ml, siendo sometidos a aireacin durante cinco minutos en distintas estufas, a temperaturas de 20, 30, 35 y 37 C respectivamente. Tambin se dej un fermento a temperatura ambiente (alrededor de 25 C). Las fermentaciones, se realizaron en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave (17 Bx) y fueron monitoreadas cada 24 horas hasta las 96 horas despus del inicio de la fermentacin, determinndoles acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azcares reductores totales.

5)

Fermentacin No. 5 (Azcares).

En este experimento, se modific la concentracin de azcares mediante la adicin de miel de Agave, obtenida durante la coccin de las pias con el fin de aumentar la concentracin de los mismos y adicionando agua como diluyente para reducir su concentracin. Los valores iniciales de los azcares en el jugo de Agave fueron de: 10 %, 11 %, 14 %, 18 % y 27 %. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les aadi 0.07 gramos de levadura por cada 100 ml, despus fueron sometidos a aireacin por cinco minutos en la incubadora a una temperatura de 35 C. Cada fermentacin se realiz en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave y fue monitoreada cada 24 horas hasta las 96 horas despus del inicio de la fermentacin, determinndole acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azcares.

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6.4 Pruebas realizadas 6.4.1 Determinacin de temperatura. Se emple un termmetro de mercurio con escala de 0 a 100 C para medir la temperatura en el jugo de Agave, tomando las lecturas al inicio de la fermentacin y cada 24 horas, para de esta manera identificar el rango de temperatura en el que se lleva a cabo toda la fermentacin (Figura 16).

Figura 16. Medicin de la temperatura.

6.4.2 Determinacin del pH. El mtodo se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos caras de una membrana de vidrio, expuestas a disoluciones acuosas que difieren en su valor de pH. En primera aproximacin, a temperatura constante, la magnitud de esta diferencia de potencial es directamente proporcional a la diferencia de pH entre dichas disoluciones (NMX-AA-008-SCFI-2000). La calibracin consiste en efectuar los ajustes apropiados del medidor de pH para que las lecturas proporcionadas por dicho equipo, sean las mismas que los valores de pH asignados a los patrones operacionales utilizados. Las soluciones reguladoras o buffer son capaces de mantener la acidez o basicidad de un sistema dentro de un intervalo reducido de pH, por lo cual tienen mltiples aplicaciones, tanto en la 28

industria como en los laboratorios. Este procedimiento de calibracin permite compensar las deficiencias de respuesta del electrodo de vidrio. Para determinar el pH de la disolucin problema, se sumergen los mismos electrodos ya calibrados en dicha disolucin (NMX-AA-008-SCFI-2000). Se utiliz un potencimetro marca Corning (Figura 17), para determinar el pH del jugo de Agave, haciendo tres determinaciones por muestra.

Figura 17. Potencimetro marca Corning.

6.4.3 Determinacin del porcentaje de acidez. Para la determinacin del porcentaje de acidez, se pesaron 10 gramos de muestra y se mezclaron con 25 ml de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Por ltimo se agregaron de 2 a 3 gotas de azul de bromotimol (ver apndice) y se titularon con hidrxido de sodio al 0.1 N (ver apndice) hasta que la muestra tom una coloracin ligeramente azul (Figura 18). NOTA: Se anot el volumen gastado en la titulacin para los clculos, tomndose lectura de las alcuotas por muestra.

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Figura 18. Prueba del porcentaje de acidez en relacin al cido actico.

6.4.4 Determinacin de azcares reductores totales (ARTs). Los azcares se pueden determinar mediante el mtodo volumtrico de Lane Eynon, el cual est basado en la reduccin de sales metlicas en solucin alcalina, comnmente se usan las sales de cobre; y as la capacidad de reducir en soluciones alcalinas, el cobre del estado cprico (Cu+2) al estado cuproso (Cu+1) y por ende la cantidad de cobre reducido es proporcional a la cantidad de azcares reductores presentes. Por esto se hace uso del reactivo de Fehling, que est compuesto por una sal de cobre. 1) 2) Se pesaron 25 g de la muestra y esta se afor a 250 ml con agua destilada. Esto se filtr con un embudo y un papel filtro, del filtrado se tomaron unas

gotas para medir los grados Brix en el refractmetro. Esta debe tener 1 Bx, si tiene ms de 1 grado se hacen diluciones hasta obtenerlo. 3) Cuando se obtuvo la muestra en 1 Bx, entonces se tomaron 50 ml y se

pasaron a un matraz de aforo de 100 ml. se le adicionaron 20 ml de agua y por las paredes lentamente 10 ml de cido clorhdrico concentrado. 4) En un bao mara se dej hasta que alcanz 68- 70 C de temperatura, al 30

llegar a esta temperatura se mantuvo durante 15 min. Al pasar este tiempo se dej

enfriar hasta una temperatura ambiente. Se agreg hidrxido de sodio (NaOH) al 50 % para neutralizar la solucin verificndolo con azul de bromotimol. Al vire azul se dej de agregar el hidrxido de sodio y se afor con agua destilada hasta 100 ml. 5) Con esta solucin se llen la bureta (50 ml), en otro matraz se prepar con 5

ml de la solucin Fehling A, 5 ml de la solucin Fehling B y 20 ml de agua destilada. Este matraz se puso a calentar hasta ebullicin y en ese momento se comenz a aadir la muestra de 5 a 10 ml, entonces se le agreg el azul de metileno y se continu con la titulacin hasta que apareci un precipitado rojo y el sobrenadante fue transparente (Figura 19).

Figura 19. Prueba del porcentaje de azcares reductores totales.

Los resultados se calcularon a partir de la frmula para el clculo de los ARTs que viene dentro de la tcnica oficial del COMERCAM (NMX-F-496-1987 y NOM-V-61993). 6.4.5 Determinacin de la densidad celular Para la densidad celular, se observ directamente al microscopio utilizando una cmara de conteo. Para esto se utiliz la cmara de Neubauer (Figura 20) que tiene una cavidad de dimensiones conocidas, contndose los microorganismos presentes 31

en una porcin de volumen. Este mtodo permite determinar el nmero de microorganismos contenidos en un volumen conocido de lquido (UNAM, 1986).

Figura 20. Cmara de Neubauer.

La cmara est dividida en tres partes: dos laterales y una central. La parte central es la ms baja (0.1 mm) que las dos laterales. Adems tiene una cuadrcula de 1mm que est dividido en 400 pequeos cuadros de 1/20 mm de lado. Estos 400 cuadros estn agrupados a su vez en 25 cuadros grandes que hacen el total de la cuadricula. Sobre las dos partes laterales se coloca un cubre objetos que deja un espacio de 0.1 mm de profundidad para la cmara de Neubauer, el cual es llenado con la suspensin celular (Figura 21). La muestra se coloc por un costado de la cmara, la cual se distribuy por capilaridad. El conteo se realiz en cinco cuadros grandes de la cmara, comnmente cuatro de los extremos y el central. La cuenta total debe ser de al menos 150 clulas; aproximadamente 30 clulas por cuadro grande. Si hay menos de esa cantidad de clulas se deben contar ms de cinco cuadros y cuando el nmero de clulas es superior a 150 se hace una dilucin. La principal ventaja de los recuentos microscpicos es que no necesitan ningn tiempo de incubacin, por lo que su utilizacin se reserva habitualmente para aplicaciones en que el tiempo es el factor principal (Tortora et al., 1993).

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Figura 21. Partes de la Cmara de Neubauer. (http://www.idrc.ca/openebooks/147-7/).

La concentracin de clulas por mililitro (X), est dada por la frmula siguiente: X = No. de clulas contadas / No. de cuadros contados x D x (25 x 105) D = Dilucin de la muestra.

6.4.6 Determinacin del porcentaje de viabilidad. Para el ensayo de viabilidad celular, se tom 1 ml de cada muestra y se le agreg 2 gotas del colorante azul de Tripano al 0.4 %. Despus, se mezcl homogneamente y se esper 5 minutos manteniendo las muestras a temperatura ambiente (Figura 22). Posteriormente se carg la cmara de Neubauer con 20 l de muestra con la ayuda de una micropipeta y se observ al microscopio con el objetivo de 40X, contando las clulas incoloras (vivas) y las clulas teidas de azul (muertas). Cuando la concentracin de clulas presentes se mostr alta, fue necesario hacer primero la dilucin y despus se realiz el conteo de las clulas.

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Clculos: (%) Porcentaje (Clulas totales X 100).

de Viabilidad = (Clulas totales Clulas muertas) /

Figura 22. Prueba de la viabilidad celular.

6.4.7 Determinacin de los grados Brix Los grados Brix (Bx), son un representante de la unidad de azcar contenido en una solucin acuosa. Un grado Brix, corresponde a 1 gramo de sacarosa en 100 gramos de solucin y por tanto representa la fuerza de la solucin como un porcentaje en peso en sentido estricto, en masa (% w/w). Si la solucin contiene slidos disueltos excepto la sacarosa pura, como otros azcares, minerales, entonces el grado Brix slo aproxima el contenido de slidos disueltos. La determinacin del grado Brix, tradicionalmente se ha empleado en vinos, azcar, jugos de fruta, miel y otras industrias (Badui, 1996). Los grados Brix se determinan por refractmetra (Figura 23), los refractmetros de mano son utilizados para hallar la concentracin de slidos disueltos en una solucin y pueden ser usados para una amplia gama de soluciones, como la concentracin de azcar en zumos y bebidas, la concentracin de salsas, champ, leche, aceites industriales, sal marina, anticongelante, etc. (Badui, 1996).

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Figura 23. Refractmetro.

Su manejo es rpido y sencillo, simplemente se coloca una gota de la muestra sobre el prisma y se lee el resultado en la escala; por lo que en segundos se obtiene el resultado.

6.4.8 Determinacin del porcentaje de alcohol. En un matraz volumtrico se midieron 200 cm3 de la muestra a la temperatura de 293 K (20 C), luego se transfirieron cuantitativamente con 40 cm3 de agua al matraz de destilacin con perlas de vidrio y se conect al refrigerante mediante el adaptador.

El destilado se recibi en el matraz volumtrico (200 ml), utilizado para medir la muestra y en el que previamente se puso un poco de agua para que el destilado borboteara evitando prdidas por falta de condensacin. Es recomendable que el matraz volumtrico se encuentre sumergido en un bao de hielo durante el curso de la destilacin (NMX-V-013-S-1980).

Cuando la cantidad del destilado contenida en el matraz volumtrico se acerc al aforo, se suspendi la destilacin y se complet el volumen con agua a la temperatura que se midi la muestra, despus se homogeniz y transfiri a la probeta. Se tom la temperatura del lquido y cuando sta se encontr a 288 K 35

(15C), se introdujo el alcoholmetro y se efectu la determinacin (NMX-V-013-S1980).

6.4.9 Diferencia mnima significativa (Prueba de Tukey).

Para la realizacin del anlisis estadstico, los datos obtenidos en los resultados numricos del experimento, se manipularon mediante un diseo experimental completamente al azar y se manejaron mediante una diferencia mnima significativa (prueba de Tukey), la cual permite controlar las fuentes de variacin presentes en el material experimental de manera que se puedan hacer comparaciones entre los efectos de los tratamientos libres de interferencias. Otra manera de evitar el problema de errores acumulados en las conclusiones del experimento, es usar mtodos alternativos a la prueba de diferencia mnima significativa. La idea fundamental es que la probabilidad de cometer el error de tipo I (declarar falsamente diferencias significativas) se mantenga en el nivel especificado () para todo el experimento, aunque esto implique que para cada comparacin tomada individualmente la probabilidad disminuya. Es decir, se hace para cada prueba individual ms conservadora, de manera que globalmente la probabilidad de cometer al menos un error de tipo I, se mantenga razonablemente cerca del nivel especificado (usualmente 5 %).

La prueba de Tukey, se desarrolla con esta idea en mente y consiste en usar un nivel crtico mayor que el de diferencia mnima significativa. Este valor crtico es

Donde q (t, v) se busca en la tabla con t tratamientos y grados de libertad en el cuadrado medio del error. Los datos se analizaron con el paquete estadstico SAS versin 9.1.3 portable. Y se trabaj con un =0.05 %.

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VII.- RESULTADOS Y DISCUSIN La levadura empleada en las fermentaciones fue la Saccharomyces cerevisiae y se trabaj modificando las condiciones de pH, temperatura, acidez, concentracin de levaduras y azcares. En la tabla 1 podemos observar las condiciones iniciales de cada fermentacin, las cuales fueron monitoreadas a diferentes tiempos (0, 24, 48, 72 y 96 horas), como se muestra en las tablas 2, 4, 6, 8, 10 y 12 donde se observan las determinaciones de cada parmetro medido (Densidad celular, pH, porcentaje de acidez, porcentaje de azcares, grados Brix y pocentaje de viabilidad celular).
Tabla 1. Valores iniciales de la fermentacin en cada uno de los tratamientos empleados. Tratamiento Bx 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 22 15 28 11 17 T (C) 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 20 25 30 35 37 35 35 35 35 35 pH 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 3.12 4.08 5.94 7.84 3.12 4.08 5.94 7.84 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 % Acidez 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % % ARTs 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 10 % 11 % 14 % 19 % 27 % Densidad celular (cels/ml) 2310 1365 682.5 682.5 1680 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365

Fermento No.1 Concentracin de levaduras

0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr 3.12 4.08 5.94 7.84 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 20 C 25 C 30 C 35 C 37 C 10 % 11 % 14 % 19 % 27 %

Fermento No.5 % ARTs

Fermento No.4 Temperatura

Fermento No.3 % de acidez

Fermento No.2 pH

37

La tabla 2, determina las variaciones de densidad celular en cada una de las fermentaciones, las cuales son posteriormente mostradas de forma grfica.

Tabla 2. Determinacin de la densidad celular (clulas/ml). Tratamiento

Fermento No.3 Fermento No.1 Fermento No.2 Porcentaje de Concentracin de pH acidez levaduras

0 hrs 2310 1365 682 682 1680 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365

24 hrs 3202 735 1522 2887 5827 210 735 1470 1680 210 735 1470 1680 4147 3045 2572 735 1207 735 2047 735 1050 1417

48 hrs 2782 2467 6720 3255 5722 525 2467 1417 3360 525 2467 1417 3360 6142 3360 2940 2467 1575 1522 2677 2467 1942 2100

72 hrs 1050 2362 2257 1260 2782 5040 2362 1470 2887 5040 2362 1470 2887 5302 4462 2625 2362 1575 2047 2677 2362 2362 2835

96 hrs 630 630 1732 262 1260 1155 630 840 787 1155 630 840 787 2100 2782 1365 630 735 1627 577 630 1155 2205

0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr 3.12 4.08 5.94 7.84 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 20 C 25 C 30 C 35 C 37 C 10 % 11 % 14 % 19 % 27 %

En la grfica 1 se observa, que en el primer tratamiento de las fermentaciones 2 y 3, la fase logartmica se retrasa debido al pH tan bajo presente, mientras que los mejores resultados se obtuvieron en el tratamiento con 0.18 gr de levadura del fermento no. 1 y a una temperatura de 20 C en el fermento no. 4; ya que presentan de manera muy similar las fases del crecimiento celular de una levadura y las cuales

Fermento No.5 % ARTs

Fermento No.4 Temperatura

38

son las cuales son fase de retraso, fase exponencial, fase estacionaria y por ltimo fase de muerte.
Grfica 1. Determinacin de la densidad celular (clulas/ml).

39

En la tabla 3, se muestran los resultados del anlisis estadstico de la densidad celular, donde se puede observar que en las fermentaciones no.1, no. 2, no. 3 y no. 5, no hay diferencia significativa entre los tratamientos; mientras que en el fermento no. 4 existe diferencia significativa entre los tratamientos con temperaturas de 20 C y 25 C, as como ste ltimo tratamiento (25 C) es diferente al de 30 C y al de 35 C; y a su vez ste ltimo tratamiento (35 C) presenta deferencias al de 37 C. Adems puede observarse que tambin numricamente, los mejores tratamientos fueron el de 0.18 gr de levadura, an cuando no presenta diferencias significativas entre los dems tratamientos del mismo fermento; as como el tratamiento de 20 C, el cual s presenta diferencias. Estos resultados se pueden observar tambin en la grfica 1, donde los tratamientos del fermento no. 4 presentan un comportamiento de fases tpicas del crecimiento celular de las levaduras. En cada tratamiento el nmero de clulas iniciales fue de 1365 clulas/ml, las cuales incrementaron en diferentes rangos y terminaron con un nmero entre 630 y 2782 de clulas/ml (ms de 2000 clulas de diferencia).

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Tabla 3. Anlisis estadstico de la densidad celular de las fermentaciones (P< 0.05). *Tukey A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A C C C C C A A A A A A A A A Media clulas/ml 3454.2 2582.6 1994.8 1669.2 1511.8 2015.8 1659 1511.8 1312.4 2015.8 1659 1511.8 1312.4 3811.2 3002.8 2173.4 1511.8 1291.400 1984.4 1868.6 1574.8 1511.8 1459.200 Tratamiento 0.18 gr 0.1 gr 0.05 gr 0.14 gr 0.07 gr 7.84 3.12 4.08 5.94 1.3117 % 0.0203 % 0.0813 % 0.2751 % 20 C 25 C 30 C 35 C 37 C 27 % 11 % 19 % 14 % 10 %

Fermento No. 4 Temperatura Fermento No. 5 % ARTs

Fermento No. 3 Acidez

B B B B B

Fermento No.2 pH

Fermento No. 1 Concentracin de Levaduras

41

En la tabla 4, se muestran los valores que se determinaron al medir el pH de cada una de las fermentaciones, cada 24 horas hasta las 96 horas de la fermentacin. Estos resultados pueden observarse posteriormente de forma grfica.
Tabla 4. Valores determinados del pH Tratamiento
Fermento No.1 Concentracin de levaduras

0 hrs 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 3.12 4.08 5.94 7.84 3.12 4.08 5.94 7.84 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08 4.08

24 hrs 3.98 3.98 4.00 3.96 3.98 3.18 3.98 4.59 5.15 3.18 3.98 4.59 5.15 3.94 3.95 3.98 3.98 3.97 4.05 4.03 3.98 4.00 4.03

48 hrs 3.98 3.98 3.98 3.98 4.02 3.2 3.98 4.52 4.88 3.2 3.98 4.52 4.88 3.95 3.95 3.97 3.98 3.98 4.03 4.03 3.98 4.02 4.02

72 hrs 3.98 4.00 4.00 4.02 4.04 3.22 4.00 4.54 4.81 3.22 4.00 4.54 4.81 3.98 3.99 3.97 4.00 3.97 4.03 4.03 4.00 4.00 4.01

96 hrs 3.98 3.98 4.00 4.02 4.00 3.15 3.98 4.47 4.81 3.15 3.98 4.47 4.81 3.98 3.96 3.96 3.98 3.97 4.03 4.02 3.98 3.98 4.01

0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr 3.12 4.08 5.94 7.84 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 20 C 25 C 30 C 35 C 37 C

Fermento No.4 Temperatura

Fermento No.3 Porcentaje de acidez

Fermento No.2 pH

Fermento No.5 % ARTs

10 % 11 % 14 % 19 % 27 %

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En la grfica 2, se observa que en las fermentaciones no. 2 y no. 3, se presenta una disminucin del pH en el ltimo y penltimo tratamiento a partir de las 24 hrs despus de que inici la fermentacin, mantenindose constante durante las 48, 72 y 96 horas. En los dems tratamientos puede observarse que el pH present una conducta casi lineal; esto significa que en los diferentes tiempos, se mantiene con los valores iniciales de la fermentacin
Grfica 2. Determinacin de pH.

43

En la tabla 5, se muestran los resultados estadsticos del comportamiento del pH determinado durante la fermentacin, donde se puede observar que las fermentaciones no. 1, no. 4 y no. 5 no muestran diferencias significativas entre los tratamientos, mientras que las fermentaciones no. 2 y no. 3 presentan una diferencia significativa y un comportamiento similar entre ellos. Estos resultados tambin pueden observarse en la grfica 2, donde el ltimo y penltimo tratamiento de las fermentaciones no. 2 y no. 3 tienen un comportamiento que tiende a disminuir conforme transcurre el tiempo, mantenindose constantes en las 48, 72 y 96 horas, sin embargo, los dems tratamientos mantienen un comportamiento casi lineal. Numricamente, el tratamiento con la media ms alta determinada en el anlisis estadstico del pH de las diferentes fermentaciones, en base a la prueba de Tukey; es el tratamiento del 10 % de ARTs ya que presenta una media de 10.56, an cuando no presenta diferencias significativas con los dems tratamientos y a pesar de que grficamente tampoco se encuentra una relevancia diferente de los dems tratamientos graficados.

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Tabla 5. Anlisis estadstico del pH de las fermentaciones (P< 0.05). Tukey A A A A A A A A A A A B A B A B C C C A A B A B A B C C C A A A A A A A A A A A A A A A A A A Media pH 4.024 4.012 4.012 4.004 4.000 5.498 4.812 4.004 3.174 5.498 4.812 4.004 3.174 4.04 3.994 3.992 3.986 3.986 10.56 9.28 9.136 8.898 7.842 Tratamiento 0.18 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.07 gr 0.05 gr 7.84 5.94 4.08 3.12 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 35 C 37 C 30 C 25 C 20 C 10 % 11 % 27 % 19 % 14 %

Fermento 5 % ARTs

Fermento 4 Temperatura

Fermento 3 Acidez

Fermento 2 pH

Fermento 1 Concentracin de Levaduras

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En la tabla 6, se muestran los valores que se determinaron al medir el porcentaje de acidez de cada una de las fermentaciones. Estos resultados pueden observarse posteriormente de forma grfica.
Tabla 6. Determinacin del porcentaje de acidez Tratamiento 0 hrs 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 24 hrs 0.3089 % 0.3719 % 0.3960 % 0.3678 % 0.4633 % 1.2181 % 0.3719 % 0.1955 % 0.0905 % 1.2181 % 0.3719 % 0.1955 % 0.0905 % 0.3328 % 0.3374 % 0.3712 % 0.3719 % 0.3902 % 0.3298 % 0.3805 % 0.3719 % 0.5144 % 0.4801 % 48 hrs 0.4205 % 0.4044 % 0.4112 % 0.4850 % 0.4588 % 1.2333 % 0.4044 % 0.2972 % 0.2171 % 1.2330 % 0.4044 % 0.2972 % 0.2171 % 0.4292 % 0.4341 % 0.4116 % 0.4044 % 0.4393 % 0.3340 % 0.4238 % 0.4044 % 0.5303 % 0.4983 % 72 hrs 0.4546 % 0.4208 % 0.4616 % 0.5028 % 0.4999 % 1.3014 % 0.4208 % 0.3487 % 0.2665 % 1.3014 % 0.4208 % 0.3487 % 0.2665 % 0.4533 % 0.4412 % 0.4751 % 0.4208 % 0.4612 % 0.3700 % 0.4401 % 0.4208 % 0.5424 % 0.6001 % 96 hrs 0.4606 % 0.4832 % 0.5004 % 0.5104 % 0.5177 % 1.3001 % 0.4832 % 0.3890 % 0.2914 % 1.3001 % 0.4832 % 0.3890 % 0.2914 % 0.4663 % 0.4593 % 0.4914 % 0.4832 % 0.4950 % 0.3842 % 0.4624 % 0.4832 % 0.5513 % 0.6331 %

Fermento No.1 Concentracin de levaduras

0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr pH 3.12 pH 4.08 pH 5.94 pH 7.84 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 20 C

Fermento No.4 Temperatura

Fermento No.3 Porcentaje de acidez

Fermento No.2 pH

25 C 30 C 35 C 37 C 10 %

Fermento No.5 % ARTs

11 % 14 % 19 % 27 %

En la grfica 3, se observa que en las fermentaciones no. 2 y no. 3, el primer tratamiento de ambos (pH 3.12 y 1.3117 % de acidez), tienen un comportamiento 46

irregular, esto debido a que el pH es muy bajo, mientras que los otros tratamientos presentan un aumento gradual. Grficamente, el fermento no. 4, es el que presenta mejor comportamiento ya que su incremento es de manera uniforme.
Grfica 3. Determinacin del porcentaje de acidez

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En la tabla 7, se muestran los resultados estadsticos del anlisis de diferencia mnima significativa con prueba de Tukey, donde se observa que en el fermento no. 1 existen diferencias significativas entre los tratamientos de concentracin de levaduras (0.14, 0.1 y 0.07), siendo diferentes entre ellos. En el fermento no. 2, hay diferencia significativa entre sus tratamientos, ya que los tratamientos con pH de 3.12 y 4.08, muestran diferencias significativas y stos a la vez son diferentes significativamente al tratamiento de a pH de 5.9, pero no presenta diferencia significativa al tratamiento de pH de 7.84. El fermento no.3, presenta el mismo comportamiento que el fermento no. 2, por lo tanto, hay diferencia significativa entre sus tratamientos, mientras que en el fermento no. 4 no la hay entre ninguno de ellos. Por ltimo, el fermento no. 5 presenta una diferencia significativa entre los tratamientos con 11 % y 19% de ARTs, pero sin presentarla en los tratamientos restantes del mismo fermento. Los resultados anteriores pueden compararse en la grfica 3, en la cual se observan los resultados del comportamiento del porcentaje de acidez, donde el fermento no. 4 presenta en todos sus tratamientos, un comportamiento casi igual y el cual aumenta constantemente conforme transcurre el tiempo. Numricamente, el tratamiento con 27 % de ARTs, es el que presenta una media ms alta en cuanto al anlisis de acidez y grficamente tambin se observa que este tratamiento es el que termina en un nivel relativamente ms elevado, con lo cual se determina que este tratamiento podra ser el menos adecuado; ya que produce una mayor acidez al final de la fermentacin y esto no es lo ms adecuado en la produccin del Mezcal.

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Tabla 7. Anlisis estadstico del porcentaje de acidez de las fermentaciones (P< 0.05). Media Acidez 0.444 0.43 0.41 0.39 0.382 1.272 0.39 0.264 0.178 1.272 0.39 0.264 0.178 0.414 0.406 0.392 0.39 0.39 0.498 0.482 0.396 0.39 0.338

Tukey

Fermento No. 3 Fermento No.2 Fermento No. 1 Acidez pH Concentracin de levaduras

B B B B B B B A B C C C A B C C C A A

A A A A A A A

Tratamiento 0.18 gr 0.14 gr 0.1 gr 0.07 gr 0.05 gr 3.12 4.08 5.94 7.84 0.02 % 0.08 % 0.28 % 1.31 % 37 C 30 C 20 C 25 C 35 C 27 % 19 % 11 % 14 % 10 %

Fermento No. 4 Temperatura

A A A A A A A A A

Fermento No. 5 % ARTs

A B B B B B

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En la tabla 8, se muestran los valores que se determinaron al medir el porcentaje de azcares reductores totales de cada una de las fermentaciones cada 24 horas hasta las 96 horas de la fermentacin. Estos resultados pueden observarse posteriormente de forma grfica.
Tabla 8. Determinacin del porcentaje de azcares reductores totales (ARTs). Tratamiento
Fermento No.1 Concentracin de levaduras

0 hrs 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 14.02 % 9.90 % 10.72 % 14.02 % 18.64 % 27.49 %

24 hrs 11.01 % 9.60 % 9.25 % 8.08 % 6.38 % 13.51 % 9.60 % 11.35 % 10.54 % 13.51 % 9.60 % 11.35 % 10.54 % 13.65 % 13.79 % 13.50 % 9.60 % 13.61 % 7.06 % 9.36 % 9.60 % 16.61 % 25.60 %

48 hrs 10.66 % 7.49 % 5.48 % 3.34 % 3.62 % 12.50 % 7.49 % 4.96 % 4.18 % 12.50 % 7.49 % 4.96 % 4.18 % 9.04 % 9.04 % 10.25 % 7.49 % 11.15 % 3.83 % 5.53 % 7.49 % 14.59 % 22.79 %

72 hrs 6.01 % 4.41 % 2.62 % 3.34 % 2.22 % 12.05 % 4.41 % 4.96 % 4.18 % 12.05 % 4.41 % 4.96 % 4.18 % 5.34 % 5.21 % 5.43 % 4.41 % 7.98 % 3.83 % 5.53 % 4.41 % 12.67 % 19.79 %

96 hrs 6.01 % 3.69 % 2.22 % 3.34 % 2.22 % 11.52 % 3.69 % 4.96 % 4.18 % 11.52 % 3.69 % 4.96 % 4.18 % 2.44 % 4.34 % 2.48 % 3.69 % 6.05 % 3.83 % 5.53 % 3.69 % 11.02 % 18.43 %

0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr

Fermento No.2 pH

pH 3.12 pH 4.08 pH 5.94 pH 7.84

Fermento No.3 Porcentaje de acidez

1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 20 C

Fermento No.4 Temperatura

25 C 30 C 35 C 37 C 10 %

Fermento No.5 % ARTs

11 % 14 % 19 % 27 %

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En la grfica 4, puede observarse que el primer tratamiento de las fermentaciones no. 2 y no. 3 (pH de 3.12 y 1.3117 de acidez) se comporta de manera distinta a los dems debido a su pH bajo, el cual inhibe a la levadura y sta no lleva a cabo la fermentacin de manera correcta. El mejor comportamiento, se observ en el fermento no. 4; mientras que en el fermento no. 1 y no. 5, el comportamiento es aceptable, porque presentan una disminucin gradual de los ART s.
Grfica 4. Determinacin del porcentaje de azcares reductores totales.

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En la tabla 9, se observan los resultados del anlisis estadstico en base a la prueba de Tukey, donde pueden observarse diferencias significativas en cada una de las fermentaciones. En el fermento no. 1 se observa que los tratamientos con 0.18 gr y 0.05 gr de levadura, son diferentes entre ellos, sin embargo, los tratamientos restantes pertenecientes a este fermento, son iguales entre s. El fermento no. 2 presenta el mismo comportamiento que el anterior, aqu solamente el tratamiento a pH de 3.12 es diferente al de pH de 5.94. El mismo caso es presentado para el fermento no. 3, donde solamente la acidez al 0.0203 % es diferente a la de 0.2751 % y en el resto de los tratamientos se encuentran similares, es decir, no se encuentran diferencias significativas. En las fermentaciones no. 4 y no. 5 se observan las mayores diferencias significativas entre sus tratamientos correspondientes, ya que todos son diferentes entre ellos. Lo cual significa que tienen un comportamiento irregular. Estos resultados los podemos observar tambin en la grfica 4, en la cual, el comportamiento irregular es ms notorio al observarlo grficamente, donde el fermento no. 4 presenta una notoria diferencia entre los tratamientos con temperaturas de 25 C, 30 C, 35C y 37 C; mientras que en el fermento no. 5, hay un comportamiento de disminucin conforme transcurre el tiempo, pero este no es constante, por lo que cada uno expresa una marcada diferencia. Numricamente, en los resultados del anlisis estadstico de los ARTs, el tratamiento con la media ms alta, es el de 27 % de ARTs, esto es porque es el tratamiento que se modific con la mayor cantidad de azcares, por lo tanto, relativamente tambin se debieron consumir en gran cantidad.

52

Tabla 9. Anlisis estadstico de los azcares reductores totales de las fermentaciones (P< 0.05). Tukey A A A A A A A B A B B B B B A B B B B B A A B B B B B B B A A A A A A Media ART 7.842 6.718 6.424 5.692 0.096 12.72 8.05 7.842 7.42 12.72 8.05 7.842 7.42 10.56 9.28 9.136 8.898 7.842 22.82 B C C C 14.7 7.84 7.33 5.690 Tratamiento 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr 0.05 gr 3.12 5.94 4.08 7.84 0.0203 % 0.2751 % 0.0813 % 1.3117 % 37 C 25 C 30 C 20 C 35 C 27 % 19 % 14 % 11 % 10 %

Fermento No. 5 % ARTs

Fermento No. 4 Temperatura

Fermento No. 3 Fermento No. 2 Acidez pH

B B D D D

Fermento No. 1 Concentracin de levaduras

53

En la tabla 10, se muestran los valores que se determinaron al medir los grados Brix de cada una de las fermentaciones cada 24 horas hasta las 96 horas de la fermentacin. Estos resultados pueden observarse posteriormente de forma grfica.
Tabla 10. Determinacin de los grados Brix. Tratamiento 0 hrs 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 11 15 17 22 28 24 hrs 15.49 15.4 14.2 13.29 12.6 16.6 15.4 14.97 14.77 16.6 15.4 14.97 14.77 16.85 16.45 15.2 15.4 15 8.2 11 15.4 19.17 26.2 48 hrs 14.69 13.2 12 12.64 10 16.4 13.2 12.24 12.4 16.4 13.2 12.24 12.4 15.25 15.45 12.84 13.2 13.45 6.35 8.89 13.2 19.15 25.18 72 hrs 12.72 11.2 10 9.52 9.2 16.2 11.2 9.8 10.48 16.2 11.2 9.8 10.12 13.17 13.57 10.07 11.2 11.87 5.27 7.07 11.2 18.75 23.07 96 hrs 11.29 9.6 9.6 9.44 9.2 16.2 9.6 9.68 10.12 16.2 9.6 9.68 10.48 11.6 11.88 8.34 9.6 10.14 5.14 7.14 9.6 18.2 21.35

Fermento No.3 Fermento No.1 Fermento No.2 Porcentaje de Concentracin de pH acidez levaduras

0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr pH 3.12 pH 4.08 pH 5.94 pH 7.84 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 20 C 25 C 30 C 35 C 37 C

Fermento No.4 Temperatura

Fermento No.5 % ARTs

10 % 11 % 14 % 19 % 27 %

En la grfica 5, puede observarse, que en el fermento no. 4 la disminucin de grados Brix fue de manera uniforme en cada uno de los tratamientos, mientras que en el fermento no. 2 y no. 3, se observa una pequea disminucin en el tratamiento 1 de ambas fermentaciones, esto se debe a que el pH de 3.12 es muy bajo (cido). 54

Grfica 5. Determinacin de los grados Brix

En la tabla 11, se observa el anlisis estadstico en base a la prueba de Tukey de los grados Brix de las fermentaciones, donde puede observarse la existencia de diferencias significativas ms evidentes en los fermentos no. 1 y no. 5, encontrndose stas entre los tratamientos de 0.07 gr, 0.1 gr y 0.14 gr de concentracin de levadura, siendo stos diferentes entre s, en el primer fermento. En el fermento no. 5 se observa que todos los 55

tratamientos son diferentes el uno del otro, esto puede observarse tambin en la grfica 5, donde todos los tratamientos de ste ltimo fermento tienen mayor dispersin entre los valores graficados. Numricamente, el tratamiento con la media ms alta es el de 27 % de ARTs, esto es debido a que con la concentracin ms alta de azcares, hay relati vamente un mayor consumo de los mismos y esto se ve reflejado al momento de determinar los grados Brix, ya que estos tambin disminuirn relativamente junto con el consumo de azcares.

Tabla 11. Anlisis estadstico de los grados Brix de las fermentaciones (P< 0.05). Tukey A A B A B C B C B C C C A B B B B B A B B B B B A A A B B B B B B A B C D E Media Brix 14.238 13.28 12.56 12.378 11.600 16.48 13.28 12.954 12.738 16.48 13.28 12.954 12.738 4.04 3.994 3.992 3.986 3.986 24.76 19.45 13.28 9.82 7.190 Tratamiento 0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr 3.12 4.08 7.84 5.94 0.0203 % 0.0813 % 1.3117 % 0.2751 % 25 C 20 C 37 C 35 C 30 C 27 % 19 % 14 % 11 % 10 %

Fermento No. 5 % ARTs

Fermento No. 4 Temperatura

Fermento No. 3 Fermento No. 2 Acidez pH

Fermento No. 1 Concentracin de levaduras

56

La tabla 12, determina las variaciones del porcentaje de viabilidad celular en cada una de las fermentaciones, las cuales pueden observarse posteriormente de forma grfica.
Tabla 12. Determinacin de la viabilidad celular. Tratamiento 0 hrs 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 24 hrs 90.56 % 87.23 % 93.75 % 90.32 % 94.33 % 90.00 % 87.23 % 93.75 % 96.36 % 90.00 % 87.23 % 93.75 % 96.36 % 95.45 % 96.03 % 98.55 % 87.23 % 90.00 % 97.43 % 94.11 % 87.23 % 95.55 % 96.29 % 48 hrs 90.16 % 86.66 % 87.87 % 83.33 % 89.18 % 88.88 % 86.66 % 89.28 % 93.75 % 88.88 % 86.66 % 89.28 % 93.75 % 93.10 % 94.93 % 97.82 % 86.66 % 90.00 % 94.73 % 94.11 % 86.66 % 95.00 % 92.50 % 72 hrs 80.00 % 78.57 % 79.31 % 81.81 % 79.16 % 78.12 % 78.57 % 89.28 % 93.75 % 78.12 % 78.57 % 89.28 % 93.75 % 90.58 % 92.30 % 96.42 % 78.57 % 86.95 % 93.51 % 89.74 % 78.57 % 94.59 % 96.29 % 96 hrs 50.00 % 33.33 % 16.27 % 40.00 % 6.42% 16.66 % 33.33 % 81.48 % 86.66 % 16.66 % 33.33 % 81.48 % 86.66 % 90.56 % 87.50 % 88.46 % 33.33 % 64.28 % 82.92 % 81.81 % 33.33 % 86.36 % 78.72 %

Fermento Fermento Fermento No.1 Fermento No.4 No.3 No.2 Concentracin Temperatura Porcentaje pH de levaduras de acidez Fermento No.5 % ARTs

0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr pH 3.12 pH 4.08 pH 5.94 pH 7.84 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 20 C 25 C 30 C 35 C 37 C 10 % 11 % 14 % 19 % 27 %

En la grfica 6, puede observarse que el comportamiento es similar en todas las fermentaciones. Los tratamientos que presentan mayor porcentaje de viabilidad al finalizar la fermentacin, son los tratamientos 2 y 3 del fermento no. 4 el cual corresponde a las temperaturas de 20 C y 30 C respectivamente. Mientras que el menor ndice de viabilidad se presenta en el tratamiento 5 (0.05 gr de levadura) del fermento no. 1.

57

Grfica 6. Determinacin de la viabilidad celular.

58

Los resultados del ltimo anlisis estadstico realizado en este trabajo, por medio de la prueba de Tukey pueden observarse en la tabla 13; donde se muestra el comportamiento del porcentaje de viabilidad, en el cual los fermentos no. 2 y no. 3 que no presentan diferencias significativas entre sus tratamientos, mientras que en el fermento no. 1, slo el tratamiento con una concentracin de levadura de 0.5 gr es diferente al de 0.18 gr y esto puede relacionarse a que el primero presenta la menor concentracin de levadura al inicio de la fermentacin; mientras que el segundo es el que presenta la concentracin en mayor cantidad. Los fermentos no. 4 y no. 5 presentan diferencias significativas entre sus tratamientos. Puede determinarse que en el fermento no. 4, los tratamientos a temperaturas de 25 C, 20 C, 37C y 35C son todos diferentes entre ellos. Al igual que en los casos anteriores, estos resultados pueden observarse en la grfica 6, donde la expectativa es que conforme transcurre el tiempo de fermentacin, exista una mnima disminucin del porcentaje de viabilidad de las clulas.

Numricamente, puede observarse en la tabla 13 de los resultados del anlisis estadstico para la determinacin de la viabilidad celular, que la media ms alta la encontramos con el tratamiento de temperatura de 30 C, el cual, estadsticamente tiene diferencias significativas en relacin con los dems tratamientos, lo cual significa que es recomendable usar esta temperatura durante el proceso de fermentacin del Mezcal; ya que mantiene una viabilidad celular relativamente constante, sin que exista muerte o disminucin de viabilidad de las clulas de manera considerable, si no hasta aproximadamente las 90 horas de la fermentacin, o sea casi al final de que sta se produjo totalmente.

59

Tabla 13. Anlisis estadstico de la viabilidad celular de las fermentaciones (P< 0.05). Tukey Media Viabilidad 79.092 77.158 75.44 73.818 0.822 94.104 90.758 77.158 94.104 90.758 77.158 74.732 96.25 94.098 93.938 86.246 77.158 94.38 94.3 A A A 92.76 91.954 77.158 Tratamiento 0.14 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.18 gr 0.05 gr 7.84 5.94 4.08 1.3117 % 0.2751 % 0.0813 % 0.0203 % 30 C 25 C 20 C 37 C 35 C 10 % 19 % 27 % 11 % 14 %

Fermento No. 1 Concentracin de levaduras

A A A A A A A B A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A

Fermento No. 4 Temperatura

Fermento No. 3 Fermento No. 2 Acidez pH

B B B B B B B

Fermento No. 5 % ARTs

A A A A B B B B B

60

Por ltimo, se realiz la determinacin del porcentaje del grado alcohlico mediante las especificaciones de la NMX-V-013-NORMEX-2005, dicha determinacin es mostrada en la tabla 14.
Tabla 14. Determinacin del porcentaje de alcohol volumen a 20 C Tratamiento
Fermento No.1 Concentracin de levaduras
0.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.14 gr 0.18 gr pH 3.12 pH 4.08 pH 5.94 pH 7.84 1.31 % 0.28 % 0.08 % 0.02 % 20 C 25 C 30 C 35 C 37 C

Grado alcohlico 16.2 17.6 16.4 13.7 15.4 No Determinado 17.6 16.6 13.7 No Determinado 17.6 16.6 13.7 14.1 16.8 23.8 17.6 9.5 1.5 10.9 17.6 15.6 6.0

Fermento No.4 Temperatura

Fermento No.3 Porcentaje de acidez

Fermento No.2 pH

Fermento No.5 % ARTs

9.90 % 10.72 % 14.02 % 18.64 %

27.49 %

61

En la grfica 7, se observan los resultados mostrados en la tabla anterior, en la cual se puede observar que se obtuvo un rendimiento mayor en la muestra del fermento no. 4 en el tratamiento a temperatura de 30 C, donde se obtuvo 23.8 % de alcohol. Mientras que la muestra del fermento no. 5 del tratamiento de 9.9 % de ARTs, solo se obtuvo 1.5 % alcohol. En dos muestras no fue posible medir el grado alcohlico porque la cantidad de muestra obtenida no fue la suficiente para hacer la determinacin.

Grfica 7. Determinacin del porcentaje de alcohol volumen a 20 C.

Grado Alcohlico
25 20 15 10 5 0

% Alc. Vol. a 20C

0.1 gr

0.28%

3.12

4.08

5.94

7.84

20 C

25 C

30 C

35 C

37 C

10%

11%

14%

19%

1.31%

0.08%

0.05 gr

0.07 gr

0.14 gr

Fermento No. 1 Fermento No. 2 Fermento No. 3 Fermento No. 4 Concentracin de pH Acidez Temperatura Levaduras

0.18 gr

0.02%

Fermento No. 5 ART

27%

62

VIII.- CONCLUSIONES

Despus de haber modificado las condiciones fisicoqumicas a las que se produjo la fermentacin de cinco mostos con valores iniciales iguales, con el fin de evaluar el comportamiento que llev a cabo la concentracin de levaduras, pH, acidez, temperatura, grados Brix, azcares y porcentaje de viabilidad celular; se observ que las mejores condiciones a las que las fermentaciones reaccionaron, fueron a una concentracin de levadura de 0.07 %, con un pH de 4.08, con 0.2751 % de acidez, a 17 Brix, con 14 % de azcares y a una temperatura de 30 C; obteniendo con estas condiciones, el mayor grado alcohlico para la produccin de Mezcal

63

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68

X.- APNDICE Acidez

Solucin de Fenolftalena Pesar 0.5 gr de fenolftalena y transferirlos a un matraz volumtrico de 50 ml. Adicionar un poco de solucin de etanol al 50 % para disolver. Una vez disuelto, aforar con etanol al 50 % y homogeneizar. Guardar la solucin en un frasco gotero color mbar. CALCULOS: . % = ( ) ()

N = Normalidad de la solucin de NaOH usado para titular V = Volumen de la solucin de NaOH usado para titular v = Volumen de la muestra 0.06 = meq de cido Actico

Azcares Reductores Totales. NaOH 50% Pesar 50 g de Hidrxido de sodio (NaOH) y disolver en un vaso de precipitado con aproximadamente 100 ml de agua destilada, transferir a un matraz de aforo.

Solucin de Fenolftalena Pesar 0.5 gr de fenolftalena y transferirlos a un matraz volumtrico de 50 ml. Adicionar un poco de solucin de etanol al 50 % para disolver. Una vez disuelto, aforar con etanol al 50 % y homogeneizar. Guardar la solucin en un frasco gotero color mbar. 69

 Reactivo de Fehling: Solucin A

Pesar 34.639 gr de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O) y transferir a un matraz volumtrico de 500 ml. Adicionar de 250 a 300 ml de agua destilada y agitar el matraz hasta disolver perfectamente el sulfato de cobre. Completar el volumen con agua destilada hasta 500 ml. Homogenizar perfectamente la solucin, con agitacin. Dejar en reposo hasta que clarifique y filtrar con papel filtro (Whatman No. 4). Guardar en un frasco mbar y Conservar en lugar fresco, fuera del alcance de la luz.

Solucin B:

Pesar 173 g de Tartrato de Sodio y Potasio tetrahidratado (KNC4 H4O6.4H2O) disolver en un volumen de 250 a 300 ml de agua destilada y transferir a un matraz volumtrico de 500 ml. Por otra parte, pesar 50 g de Hidrxido de sodio (NaOH) y disolver en un vaso de precipitado con aproximadamente 100 ml de agua destilada. Adicionar al matraz volumtrico de 500 ml, junto con la solucin de Tartrato de sodio y potasio. Agregar agua destilada hasta la marca de 500 ml y homogenizar perfectamente la solucin, con agitacin. Dejar reposar por 24 hr y aforar nuevamente agitando la solucin para homogeneizar. Dejar en reposo hasta que clarifique y filtra a travs de lana de vidrio o con un crisol gooch con capa de asbesto, guardar en botella de vidrio resistente a la alcalinidad.

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 Solucin de Azul de metileno Pesar 1.0 g de azul de metileno y transferirlo a un matraz de 100 ml. Agregar un poco de agua destilada para disolver. Una vez disuelto, ajustar a la marca con agua destilada y homogenizar. Guardar la solucin en un frasco gotero color mbar.

Solucin patrn de azcar invertida. Pesar 4.7500 gr de sacarosa previamente secada en estufa a 60C, hasta peso constante, o en desecador durante una semana; y se transfieren a un matraz volumtrico de 500 ml. Aadir aproximadamente 50 ml de agua destilada para disolver los cristales. Adicionar lentamente y escurriendo por las paredes del matraz, 2.5 ml de la solucin de cido clorhdrico concentrado, agitar con movimiento rotatorio. Tapar el matraz y dejar en reposo a temperatura ambiente por 72h hasta completar la hidrlisis. La hidrlisis puede acelerarse colocando la solucin de sacarosa con el HCl en bao mara a una temperatura de 68 - 70 C por 15 min. Considerando que los 15min deben comenzar a contarse cuando la solucin alcance la temperatura indicada. Despus de este tiempo, enfriar la solucin hasta la temperatura ambiente. En cualquiera de estos dos casos, completada la hidrlisis, es necesario neutralizar la solucin, para lo cual se utiliza fenolftalena como indicador, comenzando la neutralizacin con NaOH 2N y al final con NaOH 0.1N, hasta obtener el color rosado dbil en el vire de la fenolftalena (que indica un pH final de 7.0 a 8.5). Completar entonces el volumen del matraz hasta el aforo de 500 ml, con agua destilada y homogeneizar perfectamente con agitacin y finalmente guardar en frasco de vidrio, en refrigeracin y utilizarla en un plazo no mayor a 2 das.

Estandarizacin de la Solucin de Fehling Se toman 50 ml de la solucin de azcar invertido, neutra, y se lleva a un matraz volumtrico de 250 ml. Se afora con agua destilada y se homogeniza perfectamente. 71

Esta dilucin contiene 2 mg de azcar invertido por ml (2 mg/ml). Verter esta solucin a una bureta de 50 ml. Por otra parte, en un matraz Erlenmeyer de 300 ml, adicionar 5 ml de la solucin de Fehling A, 5 ml de la solucin de Fehling B y 20 ml de agua destilada. Agitar para mezclar, adicionar de 5 a 6 perlas de vidrio para controlar la ebullicin. Agregar, de la bureta, 18 19 ml de la solucin de azcar invertido y mezclar. Calentar, en una parrilla elctrica o mechero, hasta ebullicin. Una vez iniciada la ebullicin, esperar por 2 minutos y agregar 3 gotas de la solucin de azul de metileno y, sin que se interrumpa la ebullicin, agregar gota a gota la solucin de azcar invertido hasta que desaparezca completamente el color azul y se torne rojizo. En este momento termina la titulacin. Anotar el volumen de azcar invertido utilizado para la titulacin. El tiempo, desde que inicia la ebullicin de la solucin de Fehling, hasta que termina la titulacin debe ser de tres minutos. El volumen de la solucin de azcar invertido utilizada para la titulacin de la solucin de Fehling debe ser de 20.37 0.05 ml, para considerar esta solucin estandarizada. Si se gasta menos, deber aadirse Sulfato de cobre disuelto, si se gasta ms, deber diluirse la solucin de Fehling con agua destilada. En cualquiera de los casos anteriores, deber realizarse nuevamente la titulacin de esta solucin para comprobar el gasto final. La titulacin deber realizarse por duplicado.

CLCULOS
% azcares reductores =

F.F. (V) x 100 x F.D. B (C)

F.F.= factor de fehling 72

V = volumen del aforo de la primera dilucin B = volumen de solucin de la muestra hidrolizada utilizada en la titilacin C = peso de la muestra en gramos F.D. = factor de dilucin de la muestra (alcuota/volumen total).

Viabilidad Colorante azul de Tripano 0.4 % Preparar 100 ml de colorante pesar 0.4 g de azul de Tripano y agregar 100 ml de agua destilada, Mezclar y almacenar en un frasco mbar.

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