Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Cincias Biolgicas Departamento de Microbiologia

LUCIANE TEIXEIRA DE CASTRO ARAUJO

APLICAES DE LIPASES

Monografia apresentad a a o progra ma d e Ps Graduao em Microbiologia do Depa rta mento de Microbiolog ia do Instituto de C incias Biolgicas . Orientador: Dr. Ary Corra Junior

Belo Horizonte 2009

LUCIANE TEIXEIRA DE CASTRO ARAUJO

APLICAES DE LIPASES

Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Cincias Biolgicas Departamento de Microbiologia Belo Horizonte
2009

"A vida s pode existir custa de uma renovao contnua significando ter que andar cada dia na estrada da evoluo. " " O ritmo mais rpido da vida (...), manifesta-se nas formas orgnicas como uma permuta qumica contnua tal como a vida psquica um veculo em marcha que avana de curva em curva, de estao em estao sem possibilidade de parar, assim a vida orgnica uma renovao constante". " Os caminhos da evoluo no nvel humano so cincia e trabalho. A cincia pela cincia no tem valor, vale apenas como um meio de ascenso da vida. Vossa cincia tem um pecado original: dirigir- se apenas conquista do bem estar material. A verdadeira cincia deve ter como finalidade tornar melhores os homens moralmente. Esta a minha cincia". Pietro Ubaldi - A Grande Sntese

Agradecimentos

Agradeo

tudo

todos

os

que

tornaram

possvel

energeticamente para que fosse realizado este trabalho, mesmo aos que de longe estiveram to perto... Ao ambiente ideal que me foi proporcionado para que tudo acontecesse da forma como aconteceu... e em tempo e espao hbil. Agradeo por saber que tudo pode ser melhorado e que estamos abertos a transformaes e antecipo que serei sempre agradecida e bem acolhida a novas crticas. Agradeo tambm aos que fizeram o inverso, por me fornecer ainda mais energia de ativao, possibilitando ento a concluso desta monografia.

SU MRIO
Pg. 1 2 3 4 4 4 6 8 12 12 17 19 20 23 24 28 36 42 44 45 47 48 49 50 51 54 56 57

1. Res umo 2. Objetiv o 3. Intro duo 4. Rev iso de Literatura 4.1. En zimas 4.1.1. Histrico 4.1.2. Vis o geral 4.1.3. No me nclatura 4.1.4. Propriedades 4.1.5. Mecanis mo de ao 4.1.6. Fatores que afetam a v elo cidade da reao enzimtica 4.1.7. Aplicaes de e nzimas 4.2. L ipases 4.2.1. Fontes de lpas es 4.2.2. Prop ried ades gerais de lipases 4.2.3. Re aes catalisadas po r lipa ses 4.2.4. Lipase s imobilizadas 4.2.5. Aplica es Industriais de lipases 4.2.5.1. Indstria de detergentes 4.2.5.2. Indstria de alimentos 4.2.5.3. Indstria far mac utica 4.2.5.4. Indstria de pap el e celulos e 4.2.5.5. Indstria qu mica 4.2.5.6. Trata mento de e flue ntes 4.2.5.7. Produo de Biodies el 5. Dis cusso 6. Conc luso 7. Referncias Bibliogrficas

Lista de Figuras Pg.

1 - Re pres entao es quemtica da trans fo rmao do su bstrato (s acarose) em p rodu to s (g licose e frut ose ), realizada pe la en zi ma (inv ertase). 2 - Modelo do mecanis mo de chav e fechadura proposto por Emil Fish er. 3 - Reao geral de hidrlise de u m triac ilglicerol ca ta lisada por lipas es. 4 - Hidrlise catalisada por lipase. Triac ilglicer deo (TAG); diac ilglicerdeo (DAG); monoac ilglicerdeo (MAG); cid o grax o liv re (AGL). 5 - Reaes de bio trans formao de lipdio s. 6 - Meca nismo de c atlise por lipases. 7 - Principais mtodos de imo biliza o de enzimas .

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25

29 30 34 39

1.

RESUMO Nesta monografia apresentada uma reviso bibliogrfica sobre

as lipases enfocando suas diversas aplicaes devido ao seu enorme potencial em processos industriais. As enzimas j so utilizadas pelo homem empiricamente h milhares de anos em aplicaes prticas at serem elucidados o modo de ao destes notveis catalisadores biolgicos. Atualmente j se conhecem muitas enzimas e algumas delas so provenientes de bactrias, fungos filamentosos e leveduras sendo que 75% destas enzimas so as lipases que j esto sendo comercializadas. Com o aumento de enzimas conhecidas, criou-se a um sistema para nome-las e numer-las, dividindo-as em seis classes, de acordo com o tipo de reao catalisada devido as ambigidades geradas. As lipases so da classe das hidrolases e so solveis em gua. Agem peculiarmente na interface orgnico-aquosa, o que as tornam catalisadoras enzimticas especializadas utilizadas em processos de biotransformaes de leos e gorduras em diversas aplicaes e finalidades industriais, dentre outras. Estas enzimas so bastante seletivas e favorecem energeticamente a rota da reao atravs da catlise enzimtica. Seu stio ativo liga ao substrato, formando produtos atravs da formao do complexo enzima-substrato, diminuindo assim a barreira energtica entre reagentes e produtos. As lipases microbianas so em sua maioria produzidas fora da celula, ou seja, extracelulares, o que facilita sua extrao, isolamento e purificao. Atravs da catlise em meio orgnico, elas transferem o grupo acila para variveis compostas de aceptores diferentes da gua. Alguns fatores podem afetar a velocidade das reaes e impedirem que as enzimas sejam

reutilizadas ou at mesmo inativ-las irreversvelmente. Fatores tais como inibidores ou ativadores, pH e temperatura do meio reacional podem acarretar desvios de linearidade na molcula da enzima e conseqentemente na sua funo, tornando-as inviveis. Lipases catalisam reaes que geralmente so controladas pelo contedo de gua no meio reacional, como da hidrlise, de sua sntese reversa ou esterificao e, a de interesterificao. Sob condies restritas de gua em reaes resultantes de concorrentes da hidrlise e esterificao, minimizada a hidrlise da gordura mantendo dominante a reao de interesterificao. Lipases esto sendo utilizadas em tcnicas de imobilizao, o que permite seu melhoramento e sua reciclagem propiciando maior estabilidade entre elas e as celulas transformado-as em catalisadores heterogneos. As enzimas quando fisicamente confinadas ou localizadas em regies definidas do espao podem ser reutilizadas, como quando proposta na Primeira Conferncia em Engenharia de Enzimas. Devido a este enorme potencial aplicativo em inmeras atividades, intensificaram-se as pesquisas englobando lpases. importante que haja cada vez mais pesquisas, incluindo a seleo de novas linhagens produtoras e sua otimizao, relacionadas com esses biocatalisadores naturais devido ao fato de minimizarem o impacto ambiental por no gerarem quantidades significativas de resduos poluentes ao meio ambiente, tornando-os to atrativos industrialmente e de grande relevncia nos dias atuais.

2.

OBJETIVO

O objetivo desta monografia fazer uma breve reviso

bibliogrfica sobre as lipases, estas notveis e promissoras enzimas, devido a sua ampla aplicabilidade, seletividade, alta especificidade ao substrato e ao seu grande potencial para diversos fins e em diversas aplicaes em processos industriais.

3. INTRODUO As enzimas so utilizadas em diversos processos industriais, principalmente na indstria alimentcia, qumica, farmacutica, dentre outras. Uma das principais enzimas utilizadas industrialmente so as lipases, que hidrolisam leos e gorduras na interface orgnico-aquosa. As lipases so aplicadas em diversos processos industriais, dentre eles, a modificao de leos e gorduras na indstria leo-qumica, na indstria txtil a enzima melhora a qualidade e as propriedades de tecidos, na indstria alimentcia so usadas para melhorar o sabor de alimentos, como na fermentao de salames e vinhos, so utilizadas na produo de aditivos alimentares, como cidos graxos poliinsaturados e na indstria de detergentes, para a remoo de manchas de difcil remoo. Devido ao grande potencial de utilizao das lipases, vm aumentando gradativamente pesquisas englobando isolamento e seleo de novas linhagens produtoras de lipases, estudos de otimizao da produo e pesquisas utilizando a enzima imobilizada.

4. REVISO DE LITERATURA 4.1. ENZIMAS 4.1.1- HISTRICO O homem vem utilizando as enzimas empiricamente h milhares de anos em diversos processos, tais como a fermentao do suco de uva para a obteno do vinho, na fabricao de pes e queijos. Porm, eram apenas aplicaes prticas, por no conhecerem o modo de ao destes catalisadores biolgicos que s foi elucidado muito tempo depois (NELSON & COX, 2002). Grande parte da histria das enzimas coincide com a da bioqumica. O estudo das enzimas foi inicialmente reconhecido no sc. XVII a partir de estudos sobre a digesto de alimentos por secrees do estmago e posteriormente com pesquisas da converso de amido em acares simples utilizando saliva e vrios extratos vegetais. Jean Baptista Van Helmont considerava a transformao dos alimentos um processo qumico mediado por fermentos. Lazzaro Spallanzani demonstrou que o suco gstrico continha um princpio capaz de digerir a carne (DALLA-VECCHIA et al., 2004; NELSON & COX, 2002). Vrios cientistas se destacaram e propiciaram o progresso da bioqumica, como Gustav Robert Kirchoff que, em 1814, utilizando extrato de trigo demonstrou o fenmeno da converso do amido em acar. J em 1833, Anselme Payen e Jean Franois Persoz demonstraram a converso do malte em extrato etanlico (TIPTON & BOYCE, 2000). Em 1850, Louis Pasteur descobriu que as leveduras catalisavam a fermentao do acar em lcool e postulou que as leveduras eram

fermentos. Na mesma poca, Justus Von Liebig defendia idias opostas s de Pasteur, para ele os processos fermentativos eram reaes qumicas. Em 1876, W. Frederick Khne sugeriu o termo enzima, que vem do grego e significa na levedura, acreditando que este tipo de catalisador s atuava dentro da clula (TIPTON & BOYCE, 2000). Em 1897, Eduard Buchner finalizou a polmica entre Pasteur e Liebig descobrindo que extratos de levedura fermentavam o acar, produzindo lcool, e mesmo que as clulas fossem removidas do meio de cultura, o processo continuava devido existncia de enzimas (NELSON & COX, 2002; TIPTON & BOYCE, 2000). A partir dos estudos envolvendo o isolamento e a cristalizao da urease por James Sumner (1926) foi postulado que toda enzima uma protena, proporcionando um grande avano nos estudos que envolvem enzimas (DALLA-VECCHIA et al., 2004). Essa premissa permaneceu controvertida durante algum tempo at ser completamente aceita aps John Northrop e Moses Kunitz, em 1930, terem cristalizado a pepsina, tripsina e outras enzimas envolvidas no processo da digesto, concluindo que estas tambm eram protenas (NELSON & COX, 2002). Neste mesmo perodo, J. B. S. Haldane sugeriu que as interaes estabelecidas entre a enzima e o substrato seriam fracas e que mesmo distorcendo a molcula do substrato, a reao continuava sendo catalisada representando um importante passo para a elucidao da catlise enzimtica. As pesquisas nesta rea intensificaram-se no final do sc. XX com a

purificao e a compreenso sobre o funcionamento do mecanismo qumico, a estrutura molecular e a ao de vrias enzimas (NELSON & COX, 2002).

4.1.2 - VISO GERAL Para a existncia da vida so necessrias certas condies fundamentais. Para realizar todas as suas atividades como por exemplo movimentar-se, alimentar-se e reproduzir-se, o organismo deve ser capaz de utilizar a energia do meio ambiente como combustvel e de produzir descendentes (NELSON & COX, 2002). Quantidades substanciais de fontes de carbono na forma de polissacardeos consumidas como alimentos so convertidas em acares simples tais como glicose, frutose e maltose, produzindo energia para o organismo. Embora alguns processos liberem energia qumica em segundos, como por exemplo, quando se consome sacarose, outros tendem a ser mais lentos (no-catalisados) mesmo que termicamente favorveis, como por exemplo, no caso do armazenamento do acar, que pode levar vrios anos at que a sacarose se converta em gs carbnico e gua, na presena de oxignio, tornando a vida insustentvel por no ocorrer com velocidade adequada (NELSON & COX, 2002). A diferena est na catlise, que sustenta a vida em tempo hbil, e acelera as reaes qumicas nos sistemas biolgicos com eficincia. As mais notveis e altamente especializadas protenas catalisadoras so as enzimas, que aceleram as reaes qumicas e em geral so mais eficientes do que os catalisadores sintticos ou inorgnicos, por terem grande especificidade pelo

substrato e por funcionarem em solues aquosas sob condies brandas de temperatura e pH, visto que, apenas um nmero limitado de catalisadores possuem tais propriedades relevantes em todos os processos bioqumicos (CHAMPE & HARVEY, 1996; NELSON & COX, 2002). As enzimas so unidades funcionais do metabolismo celular e so encontradas em vegetais, animais e microrganismos. So de natureza protica e so formadas por subunidades ou aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas (NELSON & COX, 2002), atuando em sequncias organizadas, catalisando centenas de reaes em etapas, atravs das quais as molculas de nutrientes so degradadas e as macromolculas so formadas atravs de precursores simples, de forma que a energia qumica da catlise possa ser conservada e transformada, equilibrando as atividades nos sistemas biolgicos (NELSON & COX, 2002). As enzimas esto presentes em todas as clulas em pequenas quantidades, acelerando a velocidade de uma reao qumica sem serem alteradas no processo, permanecendo intactas no final de cada reao (CHAMPE & HARVEY, 1996). A maioria das enzimas so protenas, exceto um pequeno grupo de molculas de RNA cataltico, chamadas ribozimas. A atividade de catlise depende da integridade da conformao protica nativa, ou seja, se uma enzima dissociada em subunidades ou submetida desnaturao, tende-se a perd-la e quando ocorre a quebra em seus aminocidos, sua atividade perdida. Portanto, a integridade das estruturas desde a primria at a

quaternria so fundamentais para manter a atividade cataltica (DALLAVECCHIA et al., 2004; NELSON & COX, 2002). O peso molecular das enzimas pode variar de 12.000 a mais de um milho de Daltons (Da). Algumas podem ser modificadas atravs de ligao covalente, por processos como fosforilao e glicosilao entre outros envolvidos na regulao da atividade enzimtica (NELSON & COX, 2002). Nem toda enzima necessita de um grupo qumico, alm dos resduos de seus aminocidos, outras requerem a presena de co-fatores que podem ser uma molcula orgnica complexa ou metalorgnica (coenzima) e/ou um ou mais ons inorgnicos (Fe2+, Mg2+, Mn2+ ou Zn2+) para concluir sua atividade enzimtica. Denomina-se grupo prosttico quando a parte protica de uma enzima est ligada fortemente ou covalentemente a coenzima e/ou um on metlico. A coenzima e/ou ons metlicos ligados a uma enzima denomina-se holoenzima, sendo a parte protica dessa enzima chamada apoenzima ou apoprotena (NELSON & COX, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001).

4.1.3 - NOMENCLATURA

Inicialmente as enzimas eram identificadas pelo nome do seu descobridor, porm, com o aumento da quantidade de enzimas conhecidas houve a necessidade da criao de uma nomenclatura sistemtica que indicasse a ao especfica de cada enzima e os substratos sobre os quais atua. Assim em 1955 a Unio Internacional de Bioqumica estabeleceu a

Comisso de Nomenclatura e Classificao de Enzimas, para esta finalidade (CHAMPE & HARVEY, 1996; KIELING, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001). De acordo com a nomenclatura utilizada, cada enzima recebe dois nomes, um para o uso no dia-a-dia que o nome recomendado e outro mais complexo, o nome sistemtico. O nome recomendado composto de trs partes: o substrato preferente, o tipo de reao catalisada e a terminao ase. O nome sistemtico utilizado quando a enzima deve ser identificada sem ambigidade, neste caso, utiliza-se o sufixo ase unido a uma descrio da reao qumica catalisada ou ao nome do substrato (CHAMPE & HARVEY, 1996; KIELING, 2002; SANT`ANN A Jr., 2001). Por intermdio do acordo internacional, o sistema criado para nomear e classificar as enzimas dividido em seis classes principais, com subclasses de acordo com o tipo de reao catalisada, conforme apresentado na tabela 1 (CHAMPE & HARVEY, 1996; KIELING, 2002; NELSON & COX, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001).

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Tabela 1. Classificao de enzimas segundo a Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular (IUBMB) (CASTRO & ANDERSON, 1995; KIELING, 2002; SANTANNA Jr., 2001; NELSON & COX,2002; QUEIROZ, 2002). Classe de enzimas 1.Oxidoredutases Algumas subclasses Hidrogenases, oxidases, peroxidases Reaes catalisadas pelas enzimas

Reao de oxidao-reduo ou transferncia de eltrons (ons hidretos ou tomos de hidrognio) atuando em CH-OH, C=O, C=O-, CH-NH-, NADH e NADPH Reaes de transferncia de grupos funcionais entre molculas. Grupos com 1C, aldedo ou cetona, acil, glicosil, fosfatos e enxofre Reaes de hidrlise (steres, ligaes glicosdicas, peptdicas, outras ligaes C-N e anidridos cidos). Transferncia de grupos funcionais para a gua Catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico (=C=C=, =C=O, =C=N-) Transferncia de grupos dentro da mesma molcula para formar ismeros Catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas pr-existentes custa de energia (C-O, C-S, C-N, C-C)

2. Transferases

Transaldolases, transcetolases

3. Hidrolases

Esterases, lipases, peptidases

4. Liases

Descarboxilases, cetocidoliases

5. Isomerases

Racemases, epimerases, mutases Sintetases

6. Ligases

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Atravs deste acordo internacional, alm dos nomes recomendado e sistemtico, criou-se um mtodo para numerar as enzimas. Cada enzima possui um dgito especfico e so identificada pelas letras E.C. (Enzyme Commission) seguidas por um cdigo numrico, composto de quatro dgitos separados por pontos e um nome sistemtico, identificando o tipo de reao catalisada. Cada enzima possui um cdigo com 4 dgitos, conforme observado abaixo (NELSON & COX, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001; TIPTON & BOYCE, 2000). 1 dgito classe 2 dgito subclasse 3 dgito sub-subclasse 4 dgito substrato Podemos exemplificar com a enzima Hexoquinase (nome trivial) que catalisa a reao abaixo. ATP + D-glicose ADP + D-glicose-6-fosfato Ela uma ATP-glicose fosfotransferase que transfere cataliticamente um grupo fosfato do ATP para a glicose. O nmero desta enzima na Comisso E.C.
2.7.1.1. sendo o primeiro dgito indicador da classe a qual pertence a enzima,

neste caso o nmero 2 refere-se a uma transferase. O segundo dgito se refere subclasse dentro de cada classe (o 7 se refere a uma fosfotransferase), o terceiro se refere sub-subclasse, no caso uma fosfotransferase que apresenta um grupo hidroxila aceptor de fosfato. O quarto o dgito usado para identificar individualmente a enzima ou quem o aceptor do grupo e neste

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caso, o dgito 1 indica que a D-glicose o aceptor do grupo fosfato (NELSON & COX, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001; TIPTON & BOYCE, 2000).

4.1.4 - PROPRIEDADES As enzimas so bastante especficas nas transformaes moleculares. Apresentam alguns tipos de especificidade, como absoluta, em grupo, de ligao e estereoqumica (GONALVES, 2007; QUEIROZ, 2002). A especificidade absoluta ocorre quando a enzima catalisa apenas uma reao em particular. Na especificidade em grupo, a enzima dirige a ao cataltica para um grupo funcional especfico na molcula do substrato, como por exemplo distinguir o grupo hidroxila (OH). E na especificidade estereoqumica a enzima atua sobre um tipo particular de ismero ptico ou estreo. Na especificidade de ligao as enzimas atuam sobre um tipo particular de ligao qumica da estrutura molecular, como o caso de algumas que s catalisam a hidrlise de ligaes peptdicas e outras a hidrlise de ligaes ster (GONALVES, 2007; QUEIROZ, 2002; SANT`ANNA Jr., 2001).

4.1.5 MECANISMO DE AO O funcionamento enzimtico aborda a catlise durante a reao, alterando e favorecendo energeticamente a rota de reao alternativa, diferentemente das reaes no-catalisadas. O stio ativo da molcula enzimtica liga-se ao substrato, facilitando quimicamente a catlise (CHAMPE & HARVEY, 1996).

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As reaes qumicas possuem uma barreira energtica que separa a energia dos substratos e um intermedirio de alta energia que ocorre durante a formao do produto, denominada energia livre de ativao. Este pico de energia representa a transio na qual um intermedirio se forma durante a converso do substrato ao produto. Devido energia livre de ativao, as velocidades das reaes qumicas no-catalisadas so mais lentas do que as das reaes catalisadas. A velocidade da reao varia de acordo com a quantidade de molculas energizadas ou seja; quanto menor a energia livre de ativao, mais molculas tm energia suficiente para superar o estado de transio, tornando mais rpida a velocidade de reao. Na ausncia de uma enzima, apenas uma pequena proporo da populao de molculas deve conter energia suficiente para atingir o estado de transio entre substrato e produto (CHAMPE & HARVEY, 1996). Na etapa inicial da catlise enzimtica, ocorre a formao de um complexo enzima-substrato (ES). O substrato liga-se a uma regio especfica da enzima chamada de stio ativo, contendo os radicais ou grupamentos catalticos de aminocidos que participam da quebra de ligaes. As enzimas reagem atravs da formao do complexo enzima-substrato para formarem os produtos (CARLI, 2006; CHAMPE & HARVEY, 1996). Para exemplificar, podemos citar a transformao da sacarose (substrato) em dois produtos: glicose e frutose, sendo esta reao catalisada pela enzima invertase, como pode ser observado na Figura 1. A catlise enzimtica pode ser facilmente entendida atravs do modelo ilustrativo do mecanismo da chave fechadura proposto por Emil Fisher

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em 1894 (conforme observado na Figura 2) e do mecanismo do encaixe induzido de Koshland Jr. desenvolvido no final dos anos 60 (QUEIROZ, 2002; CARLI, 2006). A hiptese da chave e fechadura diz que a especificidade de uma enzima (representando a fechadura) e do seu substrato (representado pela chave) provm da complementaridade das suas respectivas configuraes. Se houver alteraes na forma tridimensional de uma enzima, esta deixar de funcionar, pois no ocorrer o encaixe dos substratos no stio ativo. J o modelo do mecanismo do encaixe induzido, proposto por Koshland Jr., prev um stio de ligao no totalmente pr-formado, mas sim moldvel molcula do substrato, ajustando a enzima ao substrato (CARLI, 2006; QUEIROZ, 2002). Nas reaes catalticas, as enzimas aceleram a velocidade da reao e diminuem a barreira energtica entre reagentes e produtos que ocorrem por elas atrarem em orientaes favorveis os substratos no complexo enzima-substrato (ES) (CARLI, 2006; QUEIROZ, 2002).

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Figura 1: Representao esquemtica da transformao do substrato (sacarose) em produtos (glicose e frutose), realizada pela enzima (invertase) (CARDOSO et al., 2009).

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Figura 2: Modelo do mecanismo de chave fechadura proposto por Emil Fisher (QUEIROZ, 2002).

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As caractersticas mais importantes relacionadas seletividade das enzimas so a quimiosseletividade, a regiosseletividade e a

enantiosseletividade. Na quimiosseletividade, as enzimas atuam sobre um grupamento qumico especfico. Na regiosseletividade, as enzimas distinguem entre grupos funcionais que esto situados em diferentes regies da mesma molcula do substrato devido a sua estrutura tridimensional complexa. Na enantiosseletividade, as enzimas so feitas de L-aminocidos e, portanto, so catalisadores quirais. Como conseqncia, qualquer tipo de quiralidade presente na molcula do substrato reconhecida na formao do complexo enzima-substrato (QUEIROZ, 2002).

4.1.6 - FATORES QUE AFETAM A VELOCIDADE DA REAO A velocidade de reao enzimtica pode ser afetada por alguns fatores como a concentrao de substratos ou da enzima, pH e a temperatura do meio reacional (CHAMPE & HARVEY, 1996). Geralmente, a velocidade de reao diretamente proporcional concentrao de enzimas presentes. Quando a concentrao da enzima constante e ocorre um aumento na concentrao dos substratos h elevaes cada vez menores na velocidade da reao. A presena de substncias txicas, inibidores ou ativadores na soluo da enzima acarretam desvios na linearidade (BRGIDA, 2006; CHAMPE & HARVEY, 1996). Quanto ao pH, pode-se comprovar experimentalmente a influncia deste na velocidade das reaes enzimticas, obtendo-se curvas que indicam

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que as enzimas apresentam um pH timo de atividade, onde a velocidade da reao mxima. O pH pode afetar a reao de vrias maneiras. Modificaes no pH alteram o carter inico dos grupos aminos e carboxlicos da protena, afetando no stio cataltico, atividade e a conformao de uma enzima. Estas mudanas conformacionais influenciam na interao enzima-substrato afetando a estabilidade da enzima (CHAMPE & HARVEY, 1996). Algumas enzimas possuem grupos qumicos ionizveis como carboxilas (COOH), amino (NH2), tiol (SH), imidazol, etc. nas cadeias laterais de seus aminocidos. De acordo com o pH do meio, estes grupos podem ter carga eltrica positiva, negativa ou neutra. Como a conformao das protenas depende, em parte, de suas cargas eltricas, haver um pH no qual a conformao ser a mais adequada para a atividade cataltica. Este o chamado pH timo. Ligeiras mudanas de pH podem provocar a desnaturao da protena. Algumas enzimas apresentam variaes peculiares. A pepsina do estmago apresenta um timo de atividade a pH = 2, e a fosfatase alcalina do intestino a pH = 12 (CHAMPE & HARVEY, 1996). Outro fator que pode alterar a velocidade da reao qumica a temperatura. Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da reao at atingir uma temperatura tima, na qual ocorre a sua atividade mxima. A partir dela, a atividade volta a diminuir por desnaturao da molcula, onde em temperaturas elevadas, alteram-se as estruturas secundrias e tercirias da enzima, afetando a sua configurao espacial. Como a ligao da enzima ao substrato depende da forma da molcula da enzima, se a mesma for alterada, conseqentemente a sua funo tambm ser. Em temperaturas acima de

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70C, normalmente, as

reaes

enzimticas cessam, pois

ocorre a

desnaturao completa e irreversvel da maioria das enzimas (CHAMPE & HARVEY, 1996).

4.1.7 - APLICAES DE ENZIMAS Atualmente j se conhecem muitas enzimas e vrias esto sendo estudadas e aproximadamente 200 so comercializadas. Estas ltimas so provenientes de bactrias, fungos filamentosos e leveduras (CASTRO et al., 2004; JAEGER et al., 1994; SHARMA et al., 2001).

O emprego de enzimas em processos industriais tem um grande potencial devido a sua eficincia. As enzimas executam uma srie de transformaes de modo seletivo e rpido, sendo bastante ativas, versteis e no requerem altas temperaturas ou valores extremos de pH para executar suas atividades enzimticas (DZIEZAK, 1991; GONAVES, 2007; PATEL, 2002).

Das enzimas aplicadas industrialmente, cerca de 75% so hidrolases as quais depolimerizam substncias naturais e dentre elas, as proteases representam 40% de todas as enzimas comercializadas e so usadas em vrias indstrias como de detergentes, alimentos, do couro e farmacutica. Outro grande grupo de hidrolases de aplicao industrial composto pelas carboidrases, utilizadas na panificao, na produo de cervejas, na indstria

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de amido, txteis, de papel, na fabricao de rao animal, etc. (TREVISAN, 2004). Pesquisas sobre enzimas tm ganhado ateno em diversos setores, sendo importante em diversas reas. Por exemplo, sabe-se que em animais a deficincia, a ausncia de uma ou mais enzimas ou sua atividade excessiva pode desencadear algumas doenas genticas hereditrias, tornando as pesquisas sobre enzimas de grande importncia na medicina. Tambm podem ser utilizadas em matrizes para diagnsticos patolgicos laboratoriais, atravs da medio da atividade enzimtica no plasma sangneo, eritrcitos ou amostras de tecidos biolgicos (NELSON & COX, 2002; SAID & PIETRO, 2004).

4.2 - LIPASES As lipases (triacilglicerol acilhidrolases E.C. 3.1.1.3) so enzimas pertencentes famlia das hidrolases, atuando na interface orgnica-aquosa demonstrando nveis considerveis de atividade e estabilidade em ambientes aquosos e no-aquosos, ao contrario de outras enzimas (HASAN et al., 2004; MARTINS et al., 2008; SAXENA et al.,1999). A funo biolgica da lipase catalisar a hidrlise de longas cadeias de triacilglicerdeos (TAG), formando cidos graxos e glicerol, alm de realizarem esterificao, isto , a sntese reversa a partir de longas cadeias de cidos graxos e glicerol. Outra reao catalisada por lipase a

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interesterificao, reao onde um cido graxo, um lcool ou um ster reagem com o TAG produzindo diferentes TAG's. Dependendo do substrato da reao, esta tambm pode ser chamada de alcolise, acidlise ou transesterificao (HASAN et al., 2004; MARTINS et al., 2008; SAXENA et al.,1999). Existe uma vasta aplicabilidade das lipases em diversos processos podendo ser usadas na composio de detergentes, na indstria alimentcia e txtil, na produo de papel, no tratamento de efluentes entre outras aplicaes como pode ser observado na Tabela 2 (JAEGER & REETZ, 1998).

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Tabela 02: Aplicaes de lipases conforme o tipo de reao catalisada (DURLI, 2007). Tipos de Reaes reas de Aplicao Alimentos (laticnios) Aplicaes Produtos

Hidrlise

Hidrlise de gorduras do leite

Agentes flavorizantes para queijos e derivados

Qumica Hidrlise de leos cidos graxos, (processame e gorduras diglicerdeos e nto de leo) monoglicerdeos (emulsificantes, reagentes para anlise de lipdeos) Qumica Remoo de Detergentes de uso (detergentes) manchas de leos em lavanderias e domsticos Medicina Dosagem de triglicerdeos no sangue Kits para diagnsticos

Esterificao

Indstria fina Sntese de geral steres Indstria alimentcia

Intermedirios quirais steres, emulsificantes

Esterificao ou leos ou gorduras, transesterificao flavorizantes e na produo de aromatizantes

Indstria Sntese de Antiinflamatrios farmacutica intermedirios em (naproxeno, medicamentos ibuprofeno, cetoprofen, suprofen) Transesterificao Indstria fina Transesterificao Produo de em leos vegetais Biodiesel

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4.2.1 - FONTES DE LIPASES As lipases podem ser de origem animal (pancretica, heptica e gstrica), vegetal e microbiana (bactrias e fungos) (MARTINS et al., 2008). Nos animais, estas enzimas participam do metabolismo de lipdeos, como a digesto, a adsoro, a reconstituio de gorduras e tambm no metabolismo de lipoprotenas. Nas plantas, so encontradas em tecidos de reserva de energia (SHARMA et al., 2001). Industrialmente e economicamente, as lipases microbianas

apresentam uma srie de vantagens em relao s lipases de origem animal e vegetal. As lipases de microrganismos so em sua maioria extracelulares, apresentando procedimento mais fcil de extrao, isolamento e purificao tendo um custo de produo menor, so mais estveis e possuem propriedades distintas das lipases de origem animal e vegetal (DALLAVECCHIA et al., 2004; LIMA et al., 1975; MARTINS et al., 2008; NAWANI et al., 1998; SHARMA et al., 2001). Dentre as bactrias produtoras de lipase podemos citar os seguintes gneros; Bacillus, Burkholderia, Chromobacterium, Propionibacterium,

Pseudomonas, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus (CASTRO et al., 2004; RAPP & BACKHAUS, 1992; SHARMA et al., 2001). Os gneros de fungos filamentosos produtores de lipases so Aspergillus, Curvalaria, Dreschslera, Fusarium, Geotrichum, Hicrothrix, Mucor, Norcadia, Pcecilomyces, Penicillium, Pycnoporus, Rhizopus, Rhodococcus, Sclerotium, Staurophoma, Syncephalis, Thanatenopjorus, Thielavia,

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Trichocladium, Verticilium, entre outros. Os gneros de leveduras produtoras de lipases so Candida, Cryptococcus, Humicola, Kurtzmanomyces,

Ophiostoma, Pichia, Streptomyces, Yarrowia, entre outros (CASTRO et al., 2004; RAPP & BACKHAUS, 1992; SHARMA et al., 2001).

4.2.2 - PROPRIEDADES GERAIS DE LIPASES As lipases so enzimas que catalisam a hidrlise total ou parcial do triacilglicerol liberando cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris e gliceris (Fig. 3), agindo apenas na interface leo/gua, podendo catalisar tambm reaes de esterificao, transesterificao e interesterificao em solventes orgnicos. As lipases tambm catalisam a formao de amidas a partir de steres no ativados. Estas enzimas podem ser confundidas com as esterases, porm as esterases so enzimas que agem em steres solveis em gua ou que hidrolisam outros lipdeos como as acilhidrolases,

colesterolesterase e tioesterases (BORNSCHEUER et al., 2002; JAEGER & EGGERT, 2002; JAEGER & REETZ, 1998; QUEIROZ, 2002; SAXENA et al., 1999; SHARMA et al., 2001).

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Figura 3: Reao geral de hidrlise de um triacilglicerol catalisada por lipases (JAEGER & REETZ, 1998).

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Durante a ao das lipases, qualquer tipo de interferncias causadas na interface resultam em alteraes na sua sntese e atividade. So vrios os fatores que influenciam a sntese e as propriedades da enzima, entre eles fatores ambientais como a composio do meio de cultura, uso de estimuladores, indutores e inibidores, a concentrao de oxignio, nitrognio e sais inorgnicos, a fonte de carbono, a temperatura e o pH do meio de cultivo, a agitao e agentes capazes de afetar a interface (DOMINGUEZ et al., 2003; GONALVES, 2007; MARTINS et al., 2008; WOOLEY & PETERSON, 1994). Dependendo da fonte, a massa molecular das lipases pode variar entre 20 a 75 quilodaltons (kDa), a atividade em pH na faixa de 4 a 9 e temperatura entre a ambiente at 70C, mas com atividade tima na faixa entre 30 e 40C, variando sua termoestabilidade consideravelmente em funo da origem, sendo as lipases microbianas as de melhor estabilidade trmica (CASTRO et al., 2004). Lipases so serina hidrolases e contm a sequncia G- X1 S X2G como meio cataltico, onde G= glicina, S= serina, X1= histidina e X2= cido asprtico ou glutmico (CASTRO et al., 2004). As lipases microbianas so classificadas em funo da relao da sua especificidade ao substrato e esto classificadas em 3 grupos (CARVALHO et al., 2003; CASTRO & ANDERSON, 1995; CASTRO et al., 2004): - Lipases 1,3 especficas: liberam cidos graxos resultantes da catlise, especificamente nas posies sn-1,3 dos acilgliceris.

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Espcies produtoras de lipases pertencentes a este grupo com tal especificidade esto Aspergillus niger, Mucor miehei e Rhizopus delemar, assim tambm como a tpica lipase

pancretica e de alguns vegetais como colza, mostarda e lupino (CARVALHO et al., 2003; CASTRO & ANDERSON, 1995; CASTRO et al., 2004). - Lipases cido graxos especficas: so biocatalisadores

hidrolticos de tipos especficos de grupos acilas nas molculas de TAG. Uma espcie que hidrolisa preferencialmente grupos acilas de cadeia longa que contm dupla ligao cis na posio 9 a levedura Geotrichum candidum (CARVALHO et al., 2003; CASTRO & ANDERSON, 1995; CASTRO et al., 2004). ipases no especficas: catalisam aleatoriamente a hidrlise de TAG para cidos graxos livres e glicerol no mostrando especifidade com relao ao grupo acil ou posio de esterificao no glicerol. So exemplos, lipases produzidas por Penicilium cyclopium, Corynebacterium acnes, Pseudomonas fluorescens , Staphylococcus aureus e Candida cylindracea (CARVALHO et al., 2003; CASTRO & ANDERSON, 1995; CASTRO et al., 2004). 4.2.3 - REAES CATALISADAS POR LIPASES

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A lipase catalisa in vivo a hidrlise de steres carboxlicos em triacilglicerol (TAG), diacilglicerol (DAG) e monoacilglicerol (MAG), onde cidos carboxlicos e alcois, com um menor nmero de steres so liberados, como pode ser observado na Figura 4 (TREVISAN, 2004). A lipase catalisa as reaes de hidrlise, esterificao e

interesterificao (alcolise, acidlise e transesterificao) representadas na Figura 5 (TREVISAN, 2004). A reao de hidrlise consiste no ataque a ligao ster do TAG para produzir glicerol e cidos graxos, na presena de gua. O tipo e a posio estereoespecifica do resduo de cido graxo esto relacionados com a alta especificidade das lipases, o que propicia um grande nmero de aplicaes. Atravs da hidrlise parcial dos triacilglicerdeos obtm-se flavorizantes utilizados em alimentos animais, inclusive de humanos (OLIVEIRA et al., 2004). A reao de esterificao , em sua essncia, a reao inversa da hidrlise, ocorrendo entre alcois polihdricos e cidos graxos livres do glicerdeo correspondente. A relao entre as velocidades da reao direta (hidrlise) e da reao inversa (esterificao) normalmente controlada pelo contedo de gua do meio de reao (CARVALHO et al., 2003; OLIVEIRA, 2004).

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Figura

4:

Hidrlise

catalisada

por

lipase.

Triacilglicerdeo

(TAG);

diacilglicerdeo (DAG); monoacilglicerdeo (MAG); cido graxo livre (AGL) (TREVISAN, 2004).

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Figura 5: Reaes de biotransformao de lipdios (TREVISAN, 2004).

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O termo interesterificao relaciona-se com a troca de radicais acil entre um ster e um cido (acidlise), um ster e um lcool (alcolise) ou um ster e outro ster (transesterificao). Nestas reaes um cido graxo, um lcool ou outro ster, reagem com o TAG, resultando em um rearranjo dos grupos de cidos graxos do TAG produzindo um novo TAG com propriedades fsicas e qumicas diversas. Este rearranjo resultante de reaes concorrentes de hidrlise e de esterificao (CARVALHO et al., 2003; OLIVEIRA, 2004; TREVISAN, 2004). O rearranjo resultado de reaes concorrentes da hidrlise e esterificao sob condies nas quais, a quantidade de gua no sistema restrita, a hidrlise de gordura pode ser minimizada de forma que a interesterificao seja a reao dominante. A reao tambm tem sido utilizada para tornar os leos vegetais mais ricos em cidos graxos poliinsaturados (AGPIs) de interesse nutricional (CARVALHO et al., 2003; OLIVEIRA, 2004) . Em meio orgnico, as lipases catalisam a transferncia do grupo acila do composto doadores para uma ampla faixa de compostos aceptores diferentes da gua (YAHYA et al., 1998). Em geral, steres sintticos ou no podem sofrer diferentes tipos de transformaes associadas a seletividade das reaes catalisadas por lipases, requerendo mtodos especficos de anlise. A deteco da atividade hidroltica de lipases baseada no monitoramento do substrato utilizado ou do(s) produto(s) (TREVISAN, 2004). Atualmente, os mtodos imunolgicos e fsico-qumicos existentes para ensaio e deteco de lipases so classificados em (TREVISAN, 2004):

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- titrimetria (como meio de crescimento em placas de petri), - espectroscopia, - cromatografia, - radioatividade, - tensiometria interfacial, - turbidiometria, - condutivimetria, - imunoqumica, - microscopia. Podem ser utilizados equipamentos automatizados que permitem o ensaio em paralelo de grandes nmeros de amostras. A formao de halos lipdicos, em volta das colnias em crescimento em placas de gar contendo tributirina, triolena e rodamina B podem ser indicatrios da produo de lipases, medidos por fluorescncia em comprimento de onda a 350 nanmetros (TREVISAN, 2004). O surfactante TWEEN 80 usado em meio slido para deteco simples e confivel de lipase, onde a formao de zonas opacas ao redor da colnia um indicador de que a lipase foi produzida. Para modificaes deste ensaio, podem ser usados diferentes tipos de surfactantes da famlia TWEEN combinados com azul do Nilo e sais de clcio (TREVISAN, 2004). A atividade no sobrenadante pode ser medida atravs da hidrlise de steres p-nitrofenlicos de cidos graxos, com tamanhos de cadeias maiores que 10 carbonos seguida pela deteco espectrofotomtrica em 410 nm (TREVISAN, 2004).

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O stio ativo das lipases consiste da trade cataltica formada SerHist- Asp/ Glu, onde a hidrlise do substrato ocorre em duas etapas (Fig. 6): inicia com um ataque do oxignio hidroflico pertencente ao grupo hidroxila do resduo serina ao carbono da carbonila ativado do ster do lipdeo (Fig. 6A). Forma-se um intermedirio tetradrico, sendo estabilizado o O-, pela interao com dois grupos peptdicos NH (QUEIROZ, 2002; TREVISAN, 2004). A histidina doa um prton ao componente lcool que est deixando o substrato (Fig. 6B) restando ento um intermedirio covalente (enzima acilada), estando o componente cido do substrato esterificado pelo resduo serina da enzima. O resduo histidina ativa uma molcula de gua na vizinhana e o on hidroxila resultante realiza um ataque nucleoflico ao tomo de carbono da carbonila do intermedirio covalente (Fig. 6C). Um prton doado pelo resduo histidina ao tomo de oxignio do resduo serina ativo, quebrando a ligao ster entre a serina e o componente acila, liberando o produto acilado, favorecendo a enzima, para que esta receba uma nova molcula de substrato (TREVISAN, 2004).

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Figura 6: Mecanismo de catlise por lipases (TREVISAN, 2004).

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A ao das lipases triacilglicerdicas so mais ativas em substratos insolveis do que solveis. Entre as teorias que explicam a ativao na presena de interfaces gua-lipdeo, a hiptese que aponta mudanas conformacionais na enzima est suportada para lipases de Rhizomucor miehei, pancretica humana e de Geotrichum candidum, que apresentam tampas que cobrem o stio ativo e se abrem na presena do substrato expondo-o (QUEIROZ, 2002; TREVISAN, 2004). As lipases que so enzimas solveis em gua atuam na interface gua-lipdeo, contrariando as equaes de Michaelis Menten para a cintica enzimtica que so vlidas somente para reaes catalisadas em fase homognea. Geralmente o substrato lipdico utilizado sob forma de emulso em anlises da lipase e medida que vo se formando os produtos e degradando o substrato ocorre variao na composio da interface gualipdeo. Portanto a velocidade da reao determinada pela rea superficial da emulso das partculas por unidade de volume e no pela concentrao de lipdeos na emulso (triacilglicerol) (GONALVES, 2007). O tamanho das gotculas de leo e a rea da interface sofrem sucessivas mudanas variando tanto o tamanho da rea da interface leo-gua quanto a atividade lipsica em funo da concentrao do substrato (GONALVES, 2007; OLIVEIRA, 2000). Para ensaios de controle da atividade lipsica, as gotculas lipdicas da emulso do substrato devero ser amplas, estveis, perfeitamente dispersas, homogneas e estabilizadas, determinando assim a atividade

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lipsica fornecida pelos resultados reprodutivos, onde qualquer tipo de alterao na interface conseqentemente dever refletir na sntese de sua atividade lipoltica (GONALVES, 2007; OLIVEIRA, 2000). Pelas inmeras potencialidades, cada vez mais pesquisas voltadas a rea de diferentes aplicaes e metodologias fsicas, qumicas e enzimticas vm sendo relatados, visando obteno de concentrados de importncia mdica e nutricional de cidos graxos poliinsaturados (AGPI) a partir de substratos microbianos, animais e de leos vegetais, dependente da capacidade de absoro destes cidos pelos humanos (CARVALHO et al., 2003).

4.2.4 - LIPASES IMOBILIZADAS Enzimas imobilizadas esto fisicamente confinadas ou localizadas em uma regio definida do espao, com reteno de suas atividades catalticas e podem ser utilizadas repetidas ou continuamente. Esta definio foi proposta em 1971 na Primeira Conferncia em Engenharia de Enzimas, realizada em Henniker, nos Estados Unidos (CARVALHO et al., 2006; VIRKAJRVI & LINKO, 1999).

Para a catlise enzimtica funcionar eficientemente necessrio proteger a enzima da interao do meio contendo solvente, pois o mesmo poderia provocar sua inativao, impossibilitando a reao. Devido a este problema, tm sido desenvolvidas tcnicas de imobilizao oferecendo maior

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estabilidade, facilitando sua recuperao e manipulao no final do processo, possibilitando sua reutilizao, especialmente na presena de solventes orgnicos. O uso de biocatalisadores imobilizados est aumentando em escala industrial principalmente na indstria farmacutica e alimentcia (JAEGER & REETZ, 1998; SHARMA et al., 2001; VECCHIA et al., 2004; VILLENEUVE et al., 2000).

Esto disponveis comercialmente lipases nativas imobilizadas e atravs de tcnicas de imobilizao de enzimas em snteses e

biotransformaes, onde elas e as clulas so transformadas em catalisadores heterogneos, apesar de que, em muitas outras aplicaes, elas no esto na forma imobilizada (TREVISAN, 2004).

A tcnica permite sua reciclagem e o melhoramento na atividade e estabilidade, sendo ajustveis a um processo contnuo e dependendo da tcnica, as propriedades dos biocatalisadores podem ser alteradas

significativamente para melhor ou pior (QUEIROZ, 2002; TREVISAN, 2004).

Os mtodos utilizados para a imobilizao de enzimas baseiam-se nas ligaes qumicas e fsicas entre a enzima e o suporte. Entre eles esto adsoro fsica (interaes hidrofbicas e de Van der Waals) e qumica (ligao covalente e inica), imobilizao por confinamento em matriz ou microcpsula e ligao cruzada. Na Figura 7 a seguir, podem ser observados esquemas dos mtodos de imobilizao de enzimas (CARDOSO et al., 2009; DALLAVECCHIA et al., 2004).

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39

Figura 7: Principais mtodos de imobilizao de enzimas (CARDOSO et al., 2009).

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O mtodo mais empregado em imobilizao de enzimas o de adsoro. Este mtodo apresenta poucos efeitos deletrios para a atividade e seletividade da enzima, alm de apresentar baixo custo e ser de fcil execuo. Neste mtodo ocorre a adeso da enzima na superfcie do suporte insolvel, que se encontra em meio aquoso, atravs de interaes de Van der Waals, interaes hidrofbicas, ligaes de hidrognio e interaes especficas (CARDOSO et al., 2009; CARVALHO et al., 2006; DALLA-VECHIA et al., 2004).

Na imobilizao por adsoro em membrana polimricas, a carga de enzimas em membranas hidrofbicas tende a ser maior do que nas hidroflicas, porm, resultam em derivados menos ativos do que nas hidroflicas. Foram relatados diversos tipos de aplicaes com lipases imobilizadas em reatores de membranas (TREVISAN, 2004).

Na tcnica de adsoro inica, a enzima se une ao suporte atravs de atraes eletrostticas estabelecidas entre as cargas opostas presentes na enzima e na superfcie do suporte. No mtodo de imobilizao por ligao covalente existe a formao de ligaes covalentes entre os grupos funcionais presentes na superfcie do suporte e nos grupos funcionais dos resduos de aminocidos da enzima (CARDOSO et al., 2009; CARVALHO et al., 2006; DALLA-VECHIA et al., 2004).

Na imobilizao em matriz de gel ocorre a sntese da matriz em torno do biocatalisador a ser imobilizado. Neste mtodo a enzima est com seu

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movimento restrito por uma rede de gel ou polmero. A porosidade da matriz evita a perda da enzima, porm permite o movimento do substrato e do produto. J na imobilizao em microcpsula, a enzima envolvida por membranas semipermeveis ou por micelas reversas formadas por

surfactantes. A enzima permanece livre em soluo, mas com restrio de espao (CARDOSO et al., 2009; CARVALHO et al., 2006).

Na tcnica de imobilizao por ligao cruzada as enzimas esto ligadas imas s outras ou a protenas inativadas (como a albumina) formando uma estrutura tridimensional complexa. Podem ser obtidas por mtodos qumicos e fsicos (CARDOSO et al., 2009).

Vrios materiais podem ser utilizados como suportes para a imobilizao de enzimas. A seleo do suporte depende das propriedades do material como fora mecnica, estabilidade fsica e qumica, carter hidroflico/hidrofbico, capacidade da enzima de adsoro e o custo. A eficincia da adsoro dependente do tamanho que a protena absorvida ter, da rea superficial adsorvente e principalmente da porosidade e do tamanho dos poros (CARVALHO et al., 2006; DALLA-VECHIA et al., 2004).

Dentre os diversos materiais empregados como suporte para a imobilizao de enzimas, temos: alginato, alumina, gar, celulose, cloreto de polivinila, Eupergit C, pectina, poliacrilamida, polivinilalcool, slica, vidros e sintticos como o poli-oxido de etileno, etc. (CANILLA et al., 2006; CARVALHO et al., 2006; DALLA-VECHIA et al., 2004; QUEIROZ, 2002).

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Estudos tm mostrado que suportes como slica, alumina e celite, levam a um aumento da atividade de enzimas da classe das lipases junto aos polmeros hidrofbicos como poli-oxido de etileno e polipropileno onde as enzimas so facilmente absorvidas (QUEIROZ, 2002).

Avanos biotecnolgicos vm permitindo utilizar lipases imobilizadas em reaes e biorreatores, alm de melhorar suas propriedades. H

expectativa de que as lipases futuramente tenham tanta importncia como os catalisadores usados industrialmente (proteases e carboidrases) (TREVISAN, 2004).

4.2.5 - APLICAES INDUSTRIAIS DE LIPASES As lipases so enzimas largamente utilizadas no processamento de alimentos, detergentes e sntese de produtos para qumica fina e frmacos, processamento de leos e gorduras, manufatura de papel e produo de cosmticos, alm de serem utilizadas no tratamento de efluentes gordurosos. Geralmente as lipases industriais so derivadas de fontes fngicas e bacterianas (TREVISAN, 2004). A escolha da enzima ideal conduzida aps cuidadosa investigao sobre os fatores que influenciam sua aplicao em processos industriais tais como mtodos de anlise, especificidade, temperatura, pH e agentes capazes de alterar a reao, o produto e seus custos (SAID & PIETRO, 2004).

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O uso de agentes ativadores ou inibidores depende da indstria em questo, do custo/ benefcio gerado, representando um custo adicional ao processo, pela possvel necessidade de ter que acrescent-los ou exclu-los quando a reao for concluda. Seu custo depende de mltiplos fatores como sua qualidade e processos de produo e recuperao enzimtica, alm do estado de pureza em que est sendo vendida (SAID & PIETRO, 2004). Portanto, quanto mais purificada estiver a enzima, maior custo ela ter e reaes laterais advindas de enzimas parcialmente purificadas comprometem seu produto final, devendo ser levada em conta sua tolerncia por estes processos (SAID & PIETRO, 2004). As lipases por exemplo, degradam preferencialmente cadeias de cidos graxos de diferentes tamanhos, podendo alterar o produto (SAID & PIETRO, 2004). A posio, o tamanho da cadeia e o grau de insaturao dos cidos graxos influenciam as propriedades fsicas e o valor sensorial do triacilglicerdeo (JAEGER & REETZ, 1998). Na fabricao de queijos, por exemplo, o sabor do produto desejado de acordo com a especificidade da enzima escolhida em degradar tipos especficos de cidos graxos (SAID & PIETRO, 2004). 4.2.5.1 - INDSTRIA DE DETERGENTES O uso de enzimas em formulaes de detergentes muito comum em pases desenvolvidos, aproximadamente metade de todos os detergentes comercializados contm enzimas. Na indstria de detergentes utiliza-se principalmente proteases, amilases, celulases e lipases (HASAN et al., 2006; JAEGER & REETZ, 1998; SHARMA et al., 2001).

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A utilizao de lipases em detergente representa aproximadamente 32% da venda de lipases, correspondendo a aproximadamente 1.000 toneladas por ano. A presena de lipases em detergentes aumentam a capacidade de remoo de manchas de leos e gorduras que so difceis de remover em condies normais de lavagem (CARDENAS et al., 2001; HASAN et al., 2006; HEMACHANDER & PUVANAKRISNAN, 2000; JAEGER & REETZ, 1998; KIRK et al., 2002; SAID & PIETRO, 2004). As lipases so atrativas na indstria de formulao de detergentes pois possuem a habilidade de hidrolisar leos e gorduras, devido a suas caractersticas de baixa especificidade ao substrato, capacidade de suportar condies extremas de pH e temperaturas alm de manterem estveis na presena de surfactantes e enzimas (TREVISAN, 2004). A primeira lipase utilizada industrialmente foi a Lipolase, produzida pela Novo Nordisk, lanada em 1994, originada do fungo Thermomyces lanuginosus e expressa em Aspergillus oryzae. Em 1995, duas lipases de bactrias foram introduzidas, a Lumafast produzida a partir de Pseudomonas mendocina e Lipomax, uma alcalina de Pseudomonas alcaligenes M-1, ambas produzidas pela Genencor International (HASAN et al., 2006; JAEGER & REETZ, 1998; SAID & PIETRO, 2004).

4.2.5.2 - INDSTRIA DE ALIMENTOS

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A lipase bastante utilizada na indstria de alimentos. Esta enzima atua no desenvolvimento de sabores e odores especficos de alguns alimentos, como na maturao de queijos e no desenvolvimento de aromas em diversos produtos (TREVISAN, 2004). Lipases so responsveis por caractersticas desejveis ou no, em alguns produtos alimentcios desde que, empregadas em condies

controladas; caso contrrio, elas atuam sobre os lipdeos hidrolisando-os quase que totalmente resultando no aparecimento de sabores indesejveis como em processos de rancificao de carnes, peixes, derivados do leite e de outros produtos ricos em lipdeos (JAEGGER & REETZ, 1998; REED, 1975; ZAREVUCKA et al., 1995). Os resultados so dependentes da posio, do tamanho da cadeia e do grau de insaturao dos cidos graxos e do valor sensorial de um triacilglicerdeo (JAEGER & REETZ, 1998). Na indstria de laticnios, as lipases so empregadas para a hidrlise da gordura do leite. As aplicaes incluem a melhoria do sabor e a acelerao do processo de cura de queijos, manufatura de produtos similares ao queijo e liplise da manteiga e creme de leite. As fontes tradicionais de lipases para a indstria de queijos so os tecidos animais, principalmente glndulas (pncreas e fgado) e tecidos pr-gstricos de ruminantes jovens. Atualmente so utilizados vrios preparados microbianos de lipases, desenvolvidos

especialmente para a manufatura de queijos, como por exemplo da Aspergillus niger, A. oryzae e Mucor miehei PETERSEN,1994). (SAID & PIETRO, 2004; WOOLLEY &

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A vantagem da utilizao do processo enzimtico o bom rendimento obtido alm de uma maior seletividade, menores geraes de rejeitos e produtos indesejveis (CANACKCI, 2007; HASAN et al., 2006; JAEGER & EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO et al., 2005). No processo de fermentao de salsichas, utiliza-se Rhizomucor miehei como produtora de lipase, acelerando o processo de maturao, representando um baixo custo como aspecto positivo (CASTRO et al., 2004). Um campo promissor de aplicao de lipases na indstria de panificao, utilizando a lipase 1,3 especfica pelo seu efeito condicionador da massa, o que facilita sua manipulao nos equipamentos convencionais da indstria de panificao. Podem tambm aumentar o volume do po, conferindo ao miolo uma cor mais clara, melhorando sua textura, com a degradao dos lipdeos do trigo pela lipase, mudando sua interao com o glten permitindo ao mesmo, uma rede mais elstica e resistente (CASTRO et al., 2004; GOMEZ et al., 2004). A lipase muito usada na indstria de panificao. Gandra e colaboradores (2008) empregaram lipase ou monoacilglicerdeo (emulsificante) na produo de pes enriquecidos com fibras visando a melhoria das caractersticas do produto, tais como maciez, textura e aumento da vida de prateleira. O objetivo do trabalho foi verificar a possibilidade de substituio do monoacilglicerdeo utilizado como aditivo qumico amaciador, que complexa com a amilose, dificultando sua recristalizao e a perda de gua do produto pela lipase que atua como um coadjuvante tecnolgico natural. Os

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monoacilglicerdeos so empregados como substncias emulsificantes na indstria de alimentos, cosmticos e frmacos. Neste trabalho, eles obtiveram uma reduo na umidade, responsvel pelo envelhecimento, que causado pela digesto do amido, mantendo assim o miolo mais firme, tanto na formulao controle quanto naquelas contendo lipase e monoacilglicerdeo, porm verificaram que existe possibilidade de substituir o monoacilglicerdeo pela lipase na formulao do po de forma enriquecido com fibras.

4.2.5.3 - INDSTRIA FARMACUTICA A conscincia da crescente importncia da quiralidade na atividade biolgica vem estimulando pesquisas por mtodos de sntese industriais de enantimeros puros na sntese de drogas. O uso de cidos graxos poliinsaturados (AGPIs) como frmacos e aditivos de alimentos tm aumentado visando obterem AGPIs de lipdeos vegetais ou animais que posteriormente sero aplicados na produo de frmacos (TREVISAN, 2004). Peixes de regies frias como as anchovas e sardinhas possuem um tipo de leo com efeitos teraputicos e fisiolgicos que vm atraindo a ateno das indstrias farmacuticas atualmente. Estes atuam no sistema cardaco, circulatrio e imunolgico juntamente aos processos carcinognicos e inflamatrios. Nestes leos, so encontrados cidos graxos de cadeia longa, poliinsaturados do tipo -3 como os cidos licosapentaenoico (EPA) e decosahexaenoico (DHA), respectivamente, na ligao cis 5, 8, 11, 14, 17 e cis 4, 7, 10, 13, 16, 19. Os cidos EPA e DHA perdem muito das suas

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propriedades teraputicas quando so hidrogenados. de interesse industrial obterem triacilglicerdeos homogneos a partir desses cidos. No preparo destes triacilglicerdeos, o processo de esterificao no vivel por destruir parcialmente todas as ligaes cis -3 por migrao de duplas ligaes, isomerizao ou oxidao (CASTRO et al., 2004).

4.2.5.4 - INDSTRIA DE PAPEL E CELULOSE de crescente importncia a aplicao de lipases na indstria de papel para a remoo dos componentes hidrofbicos (triacilglicerdeos e ceras) da madeira, causadores de alguns problemas durante a fabricao do papel (JAEGER & REETZ, 1998). Utilizando-se a lipase produzida por Candida rugosa, possibilitouse controlar o alcatro que constitudo em grande parte por ceras e triacilglicerdeos que causam problemas na manufatura de polpa e papel (TREVISAN, 2004).

4.2.5.5 - INDSTRIA QUMICA As lipases so utilizadas como biocatalisadores, pois apresentam diversas vantagens sobre os catalisadores clssicos industriais. As

caractersticas que as tornam atrativas do ponto de vista industrial so seu alto grau de especificidade, regiosseletividade e enantioseletividade, permitindo a sntese de compostos de alta pureza e gerando poucos subprodutos e

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resduos. Seu uso minimiza a degradao de compostos lbeis e evitam o uso de compostos qumicos com alto potencial poluente (SHARMA et al., 2001). As lipases so muito utilizadas em snteses orgnicas, pois no necessitam de coenzimas e so suficientemente estveis em solventes orgnicos e em temperaturas relativamente altas. Esta estabilidade abriu inmeras possibilidades no campo da sntese qumica, onde as diferentes seletividades de lipases de vrias fontes, aliada s condies suaves de temperatura e presso em que atuam apresentam uma enorme vantagem em relao aos catalisadores convencionais (GULATI et al., 2005; JAEGER & REETZ, 1998; SHARMA et al., 2001). Na dcada de 80 comprovaram que as lipases no desativavam em solventes orgnicos incentivando ento, estudos que possibilitaram que estas enzimas fossem uma ferramenta ideal na qumica orgnica (TREVISAN, 2004).

4.2.5.6 - TRATAMENTO DE EFLUENTES Existe um grande interesse em utilizar lipase no tratamento de efluentes ricos em lipdeos, pois estas enzimas clivam triacilgliceris especficos embora as lipases possam no ser to especficas e catalisam a reao de hidrlise de triacilgliceris, que possuem diferente composio de cidos graxos, o que pode ser um atrativo para a remoo de leos e gorduras de estaes de tratamento que empregam lodo ativado (MENDES et al., 2005).

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A camada de gordura no permite a transferncia de oxignio, comprometendo a degradao da matria orgnica presente e tambm diminui o tempo de vida til dos equipamentos e das estaes de tratamento de esgoto. As lipases podem ser usadas na sua forma bruta (caldo fermentado) ou isoladas na promoo de um pr tratamento antes da digesto anaerbia (HASAN et al., 2006; MENDES et al., 2005). As lipases agem na interface que separa as duas fases distintas, a qual corresponde em nvel molecular a um grupo de duas camadas adjacentes de molculas ordenadas, uma hidrofbica e outra hidroflica. Quanto maior a interface maior a quantidade de enzima adsorvida, aumentando a taxa de hidrlise (HASAN et al., 2006; MENDES et al., 2005). Tcnicas para melhoramento da eficincia em biodigestores incluem a instalao de caixas de gorduras ou de flotadores, adicionando lcalis ou enzimas como as hidrolases e lipases para auxiliarem na remoo deste material gorduroso (HASAN et al., 2006; MENDES et al., 2005). A lipase MY produzida por uma linhagem de Candida sp. tem sido utilizada no tratamento de esgotos em grandes edifcios e hotis, esta enzima utilizada na limpeza da tubulao de plantas de tratamento de esgotos nos Estados Unidos (SEITZ, 1974).

4.2.5.7 - PRODUO DE BIODIESEL

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Os leos vegetais podem ser modificados atravs da reao de transesterificao visando melhorar caractersticas como viscosidade,

densidade especfica, entre outras para serem utilizadas como forma alternativa de combustvel, o biodiesel (ALZUHAIR, 2005; CANAKCI, 2007; JAEGER & EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO et al., 2005). As pesquisas tm sido voltadas atualmente na utilizao das lipases em reaes de transesterificao de molculas de cidos graxos de elevado peso molecular, catalisando a reao do lcool com leos de girassol, colza, soja e gordura animal. O emprego de matrias primas agro-pecuria como fontes de biocombustveis, vm crescendo e destacando nas reas biotecnolgica, social e econmica (CANAKCI, 2007; LEE et al., 2002). O biodiesel definido como monoalquil ster de cidos graxos de cadeia longa, produzido a partir de leos vegetais ou gordura animal, que so produtos provenientes de fontes renovveis, podendo ser utilizados em motores de ignio por compresso ou como misturas em combustveis derivados do petrleo, o diesel (ALZUHAIR, 2005; CANAKCI, 2007; JAEGER & EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO et al., 2005). A obteno do biodiesel ocorre atravs da reao de

transesterificao, onde um leo reage com um lcool, na presena de um catalisador, como um lcalis, um cido ou uma enzima (lipase). A vantagem de se utilizar processo enzimtico devido ao bom rendimento obtido, maior seletividade, inexistncia de rejeito aquoso alcalino e menor produo de

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outros contaminantes (CANAKCI, 2007; HASAN et al., 2006; JAEGER & EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO et al., 2005). Utilizando o biodiesel diminui a produo de xidos de enxofre (ALZUHAIR, 2005; CANAKCI, 2007; JAEGER & EGGERT, 2002; LEE et al., 2002; MARCHETTI et al., 2007; PINTO et al., 2005).

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5. DISCUSSO As enzimas so eficientes catalisadores bioqumicos capazes de catalisarem seletivamente e eficientemente os reatantes (substratos) para rotas teis e, de todos os processos metablicos, mantendo-se inalteradas diante ao processo. As lipases so enzimas que possuem alta especificidade pelo substrato, podendo ser obtidas a partir de diversas fontes produtoras como animais, vegetais e, em especial, as microbiolgicas. No entanto, variantes de lipases e seus produtores juntamente ao nome sistemtico so motivos para confuso, necessitando que se

desenvolvam tcnicas para obteno dessas variantes e de triagem das mesmas, ampliando o leque de pesquisas e necessitando de mtodos bem estabelecidos. Muitas pesquisas tm sido realizadas para a diminuio dos custos de produo das diversas enzimas empregadas industrialmente. Estes estudos vo desde a seleo de novos microrganismos bons produtores, otimizao das condies de produo, imobilizao da enzima at o uso da tecnologia do DNA recombinante e engenharia de protenas (KIRK et al., 2002). Necessitamse mais estudos sobre fatores que influenciam na biossntese lipsica juntamente aos seus efeitos, decorrentes em todos os tipos de

microorganismos produtores da enzima, para otimizarem a produo. Atualmente, a utilizao de lipases ocorre em nmero reduzido em relao s possibilidades de utilizao desta enzima. No futuro sua utilizao est diretamente relacionada com a reduo dos custos dos processos de

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produo e purificao, na busca por novas linhagens produtoras ou no seu melhoramento gentico em espao e tempo hbeis com caractersticas desejveis. Lipases nativas e imobilizadas esto disponveis comercialmente, pois um nmero crescente de aplicaes em sntese e biotransformaes tm exigido esta forma. A utilizao de lipases em diversos processos e em muitos pases uma grande conquista podendo ser um fator indispensvel para a economia mundial, por estas serem enzimas biolgicas e biodegradveis e, no caso das lipases, atuando em diversos processos modificando leos e gorduras e em outras reaes energticamente possveis. Um assunto muito em pauta ultimamente tm sido o biodiesel, utilizando lipases, pelo fato de serem naturais, apresentam bons rendimentos, tm maior seletividade, variabilidade e especificidade, como tambm pela inexistncia de rejeitos e uma diminuio na produo de contaminantes em comparao com as de reaes cidas ou bsicas. Enfim, so uns dentre outros motivos que as tornam to atrativas entre tantas possibilidades de estudos assim como, para uma diminuio dos custos de produo tornando-as ainda mais viveis industrialmente.

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6. CONCLUSO Atravs deste trabalho, vimos que estudos sobre enzimas so de grande importncia prtica e a catlise enzimtica das reaes so essenciais para os sistemas vivos. So catalisadores extraordinrios e so produtos naturais, tendo como funo viabilizar a atividade celular, quebrando molculas ou juntando-as para formarem novos compostos. Diversas enzimas so utilizadas industrialmente devido a sua especificidade ao substrato e pelo fato de no serem txicas, destacando-se as lipases. Conclui-se que as lipases so dotadas de um grande potencial, em diversos tipos de aplicaes e em diferentes processos industriais. As lipases produzidas por microrganismos so geralmente extracelulares, o que permite fcil extrao e possvel reutilizao, diminuindo o custo da produo. So eficientes, estveis e dotadas de alto grau de especificidade, o que as tornam to atrativas no ponto de vista industrial e econmico, alm de diminuir a gerao de sub produtos indesejveis ao meio ambiente. de grande perspectiva futura a utilizao destes notveis biocatalisadores enzimticos em novos processos de biotransformaes a serem desenvolvidos.

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