T.

C FIRAT NVERSTES MHENDSLK FAKLTES BYOMHENDSLK BLM

Dersin Ad: Biyomhendislik Laboratuar III Deneyin Ad: Hcre Kinetii Sabitlerinin Belirlenmesi retim Elamann Ad:Yrd. Do. Dr. Serhat ELEK

Hazrlayan Grup: 4 10205523 Bahar KARAKU 10205524 Dilek Nur KARATA 10205530 Muhammed BEKMEZC

Deney Tarihi:24.11.2013

Teslim Tarihi:06.12.2013

ELAZI,2013

indekiler Tablosu
GR ............................................................................................................................................ 2 LTERATR ZET.......................................................................................................................... 2 MATERYAL METOT ......................................................................................................................10 BULGULAR ..................................................................................................................................11 TARTIMA ...................................................................................................................................11 KAYNAKLAR ................................................................................................................................17

HCRE KNETK SABTLERNN BELRLENMES 1.GR Hcreler belli mikrobiyal reme dnglerinde yaamlarn srdrrler. Bununla birlikte yaamlar boyunca enzim,hormon protein veya sekonder metabolitler gibi rnler sentezlerler. Hcreler iin nemli olan strese tabi olmadan remek ve yan rnlerini ortaya karmaktr. Yaplm olan bu deneyde yan rnlerden ziyade hcrenin hcre etkinliinin llmesi hedeflenmitir. 2.LTERATR ZET Mikrobiyal Byme Kinetikleri: Biyoteknolojide fermantasyonlar kesikli (batch), kesikli beslemeli (fed-batch) veya srekli (continous) yntemlerle yrtlmektedir. Kesikli Fermantasyon: Kesikli fermantrler kapal sistemler olarak dnlebilir. Kesikli sistemlerde fermantasyon ortam hazrlanr ve mikroorganizma alanr. Sistemin pH, scaklk ve dier deerleri ayarlandktan sonra ortama yeni substrat veya mikroorganizma ilavesi olmaz. Fermantasyon, ortamdaki besin elementleri tkeninceye kadar veya evresel koullarda gzlemlenen deiikliklere gre sonlandrlr. Fermantasyon boyunca fermantre oksijen, kpk nleyici ve pH ayar iin ilave edilen asit ve bazlar hari herhangi bir madde ilave edilmez. Kltr ortam, biyomas ve metabolit konsantrasyonu hcre metabolizmasnn bir sonucu olarak srekli olarak deiiklik gsterir. Kesikli fe rmantasyonda steril besiyerine inokule edildikten sonra, uygun koullar altnda inkbasyona braklan mikroorganizmada drt temel byme faz grlr. ekil 4.1.

ekil 3.1. Kesikli kltrde hcre bymesinin kinetii.

Lag Faz: Sterilize edilmi byme ortamna a kltrnn ilavesinden hemen sonra lag faz boyunca mikroorganizma saysnda art olmaz. Lag fazn uzunluu veya ksal hcrelerin inokulum ncesi hangi fazda olduklarna baldr. Hcrelerin inokulum ortam ile fermantasyon ortam arasnda farklla gre de bu sre uzun veya ksa olabilir. Log Faz: Lag fazn sonunda hcre yeni kltr ortamna adapte olmu olarak hzla remeye balar. Hcre ktlesi bu aamada hzla artar. Hcre says logaritmik olarak artarken, kltrn spesifik byme hz sabit kalmaktadr. Spesifik byme hz matematiksel olarak ifade edilebilmekte ve baz tahminler yaplabilmektedir. yle ki: Biyomasn konsantrasyonu, X (mg/L) substratn biyomas tarafndan kullanlmasyla zamana bal olarak artar. = spesifik byme hz sabiti olup substrat konsantrasyonu (S) nun fonksiyonudur. Byme orann tanmlayan iki sabit kullanlmaktadr. m (mg/L) Maksimum byme hz olup substrat konsantras yonunda herhangi bir snrlama olmad durumlarda elde edilen deerdir. Ks sabiti ise m = m m/2 olduu zaman Substrat konsantrasyo nudur (ktle /hacim) ekil 3.2. = spesifik byme hz t:= zaman Spesifik byme hz , u parametrenin bir fonksiyonu olarak bulunabilir: S: snrlayc substrat konsantrasyonu, max: Maksimum byme hz, Ks: Substrat spesifik sabiti. Buna gre aadaki eitlik karlabilir.

Monod Eitlii ) Bu eitlikte Ks maksimum byme orannn yarsna ulald anda (=0,5max) elde edilen substrat konsantrasyonudur.

Monod eitliinde, ortamda bol miktarda substrat varsa = m olacaktr. Ve Kltr log faznda maksimum byme oranna sahip olacaktr. Eer substrat bileenlerinden her hangi biri tkenirse ve dier bileenler hala mevcutsa bu durumda mikroorganizma kalan substratlara gre ikinci bir log faz yaayacak ve buna bal ikinci bir deerine sahip olacaktr. Bu durumda monod eitliini geniletmek gerekir. Ks deeri genellikle ok dktr. rnein E. colide glikoz iin 1,0mg/l, triptofan iin1,1 mg/l olarak llmtr. Maksimum spesifik byme hz sabitinin endstriyel nemi ok byktr. m m organizmaya ve fermantasyon koullarna bal bir sabittir. Aadaki tabloda baz funguslara ait m deerleri verilmitir. Tablo.1. Baz funguslarn glikozda maksimum byme hz deerleri Organizma Aspergillus niger TC 30 m (h-1) 0,20 0,41 0,61 0,40 0,090 0,148 0,215 Jenerasyon zaman(h) 3,46 1,7 1,1 1,73 7,72 4,68 3,23

Geotricum candidum 25 Geotricum candidum 30 Neurospora sitophila 30 Aspergillus nidulans 20 Aspergillus nidulans 25 Aspergillus nidulans 30

Monod denkleminin geerli olmad durumlar da vardr. rnein mikroorganizma kompleks besin ortamlarnda oaltlrsa genellikle birden fazla log faz grlebilir. Bu fazlarn ayrm mikroorganizmann katabolik represyonu na dayanr. Mikroorganizma kolay kullanabilecei (genellikle glikoz) ekeri paralamak iin enzimlerini sentezlerken dier kayna kullanacak enzimlerin retimini basklar. Durgun Faz: Bu fazda ortamdaki karbon kayna gibi kritik bir maddenin tkenmesi veya metabolik son rnlerin birikmesi ile hcre ktlesindeki hzl art durmakta ve hcre durgun faza girmektedir. Bu fazda net byme gzlenmez, biyomas miktar sabit kalr. Bu faz biyoteknolojide baz rnlerin eldesinde nemlidir. nk sekonder metabolitlerin sentezi bu dnemde yaplmaktadr. r. Antibiyotikler lm Faz: Hcrenin enerji rezervlerinin tamamen tkendii ve metabolik aktivitenin durduu dnemdir. Ticari ilemlerde lm faznn hibir deeri yoktur. Bu aamaya gelir gelmez fermantasyon kesilir.
4

Kesikli Beslemeli (Fed-Batch) Fermantasyon: Kesikli beslemeli fermantrler kesikli ve srekli sistemlerin avantajlarn beraberce tad iin endstride yaygn olarak kullanlrlar. (Penisilin retiminde) Katabolik represyona ak olan substratlarn sisteme kontroll verilmesine olanak tanyan bir yntemdir. ekil 4.2 de tipik bir geri beslemeli proseste biyomasn zamana bal olarak deiimi gsterilmitir. Proses balangta kesikli olarak balar. Besin elementleri t kenmeye balaynca substrat, fermantasyon srasnda eitli zamanlarda azar azar ortama ilave edilir. lave besin eklenmesi hem logaritmik hem de durgun faz srasnda yaplr. Bu hem biyomas hem de sekonder metabolit miktarnn artmasna neden olur. zellikle rekombinant mikrorganizmalardan protein retiminde kesikli beslemeli fermantasyon tipi benimsenmektedir. Ancak kritik neme sahip besin elementinin konsantrasyonu ok iyi takip edilmelidir. Balangta fermantre konan substratn mmkn olduu kadar konsantre olmas istenir. Bylece reaktr hacminin neden oluu problemler de alm olur. Kesikli beslemeli fermantasyonun en nemli avantaj hem reaksiyon orannn hem de metabolik reaksiyon hznn substratn ilave oranna gre kontrol edilebilmesidir. Ok sijen transferi ve soutma gibi fermantasyona etki eden parametreler reaksiyon oran kontrol edilerek kontrol altnda tutulabilir. Srekli (Continuous) Fermantasyon: Ak sistemlerdir. Bu sistemde steril besin biyoreaktre ilave edilirken, eit miktarda rn ve onunla birlikte mikroorganizma sistemden alnr. rnn alm srasnda kaybedilen mikroorganizmalar, reaktrdeki hcre blnmesiyle dengelenir. Srekli fermantasyon ynteminde iki temel uygulama vardr. Homojen karmn saland biyoreaktrler ve tapa akl reaktrler. Homojen karmn saland reaktrlerde kemostat veya trbidostat olarak alabilir. Kemostat sisteminde fermantasyonunun kararll substratlardan bir tanesinin konsantrasyonu ayarlanarak hcre bymesi kontrol edilerek salanr. Trbidostat yntemine ise fermantasyonda biyomas konsantrasyonu trbidimetrik olarak llr ve elde edilen verilere gre besin ilave edilerek kararllk salanr. Tapa akl reaktrlerde ise kltr solsyonu silindirik yapda bir reaktrde kartrma olmakszn ilerler. Silindirik tpn kesitlerinde hcre says veya rn konsantrasyonu farkllk gsterir. Srekli fermantasyonda kararl hal durumunda biyoreaktrden alnan mikroorganizmalardan dolay sistemden ayrlan mikroorganizmalar reaktr iinde hcrelerin blnmesi ile dengelenir.
5

D= dilsyon oran= Volumetrik ak oran (l/s)/biyoreaktrn sabit hacmi= D= F/V D=dx/dt.1/x= Kararl bir srekli fermantasyonun elde edilmesi iin <m olmaldr. Monod denklemine uyarlanrsa Y x s= Biyomas(g)/Substrat tketimi (g) Bu denklemde Y rn sabiti olmaktadr. X= Yx s(S0- (D. Ks/m-D) Bu denklemde X hcre younluunu gstermektedir. S= (D. Ks/m-D) (monod denkleminin srekli sisteme uyarlanmas) Bu denklemde biyoreaktrdeki substrat konsantrasyonunu gstermektedir. S0 sisteme giren besin ortamnn konsantrasyonunu gstermektedir. Sisteme substratn ak ok dk olduu zaman substrat tamamen hcreler tarafndan tketilir. Bu durumda S sfra yaklar ve hcre konsantrasyonu X= S0/Y olur. Eer substatn reaktre akm oran yani D deeri artarsa X deeri dmeye balar ve; D=m Olduu zaman X sfra yaklar. X sfr olursa aadaki eitlik elde edilir. Dm= m.S0/(Ks+S0) Sonu olarak S0/(Ks+S0) bire yaklarsa Dm=m olur. Dm deeri zerine kld zaman reaktrde kararl halin olumas mmkn deildir. Eer ak oran Dm in hemen altnda olursa sistem d etkilere kar ok hassas bir duruma gelir ve hcre veya sistemden ayrlan kltr zerinde hafif bir deiiklik biyomas zerinde ok byk deiiklikler meydana getirebilir. Maksimum byme hz sabiti endstriyel retimlerde en ok verim ve en kk fermantr hacmini karlayacak ekilde ayarlanmaldr. Srekli fermantasyon sistemlerinde ak hz ok yava veya ok hzl olursa monod denklemi uygulanamaz.
6

Srekli fermantasyon ok eitli ekillerde uygulanabilir. Sadece tek bir fermantrn kullanld sistemler, geri beslemeli srekli fermantrler (sistemden uzaklatrlan ktlenin bir ksm sisteme yeniden verilir), ve iki veya daha fazla fermantrn beraberce kullanld srekli sistemler gibi. Asetik asit, etanol, glukonik asit, laktik asit, btanol, subtilin, ekmek mayas, bira gibi rnler bu sistemle ticari olarak retilmektedir. Endstriyel fermantasyonlarda temel konu maliyetlerin minimuma, rn veriminin maksimuma karlmasdr. Bu ama iin her proses iin en etkili fermantasyon yntemlerinin belirlenmesi gerekmektedir. Srekli kltrlerde elde edilen hcre biyomasnn retim maliyeti, kesikli fermantasyona gre daha dktr. Ticari olarak ayn miktardaki rn retmek iin, srekli kltrlerde, kesikli kltrlere gre daha kk lekli biyoreaktrler gerekmektedir. Byk lekli kesikli fermantasyonlar tamamlandktan sonra hcrelerin hasad, paralanmas, veya metabolitlerin izolasyon ve saflatrlmas iin byk lekli ekipmana ihtiya vardr. Srekli kltrde ise rn ortama azar azar alnd iin bu ilemler iin daha az ekipman gerekmektedir. Srekli fermantasyonda kesikli kltrlerdeki gibi biyoreaktrn yeniden kullanm iin hazrlanmas gibi bir zaman kayb yoktur. Endstride karlalan en nemli problem biyoreaktrlerin temizlii ve sterilizasyonudur. Bu zaman kaybna yol amakta srekli fermantasyonda ise fermantasyon daha uzun sre gerekletirildii iin temizlik vs. iin daha az zaman gerekmektedir. Srekli fermantasyonda hcrelerin fizyolojik durumu uniform olduundan rn verimi daha tutarldr. Srekli fermantasyon yntemi ile ticari olarak baz antibiyotiklerin, baz solventlerin retildiini gryoruz. Srekli fermantasyon sresi 500-1000 saat arasnda deimektedir. Bu srenin uzun olmas rekombinant teknolojisi ile protein retiminde dezavantaj oluturur. nk rekombinant organizmaya yeni gen ilavesi hcrenin enerji ihtiyacn artrr. Bu yzden organizma belli bir sre sonra plazmitlerini atma eilimi gstermektedir. Buda rn veriminin azalmasna yol aabilir. Endstriyel lekte uzun zaman boyunca sterilitenin korunmas, ayrca kltr ortamnn hep ayn kalitede salanmas gtr ve verimlilii etkiler.

lek Bytme (Scale Up) Laboratuar koullarnda yaplan kk lekli bir biyoteknolojik ilemin endstriyel boyuta dntrlmesi ilemine lek bytme denir. Laboratuar leinde yaplan denemelerde saptanan deerler ou kez endstriyel lekte ayn baar ile uygulanamaz. Bunun bir ok nedeni vardr.

 Havalandrma ve kartrma: Laboratuar leinde yaplan fermantasyonlarda havalandrma ve kartrma kolaydr, ancak endstriyel apta yaplan retimlerde havalandrma ve kartrma zor olmaktadr. Ekipman Hacmi: Ekipman hacmi bydke yzey/hacim oran deiecektir. Kresel bir mikroorganizmann hacmi 4/3r3 tr. Alan ise 4r2 dir. Alan/Hacim= 3/rdir. Dolaysyla hacim arttka yzey alannn (mikroorganizmann) kldn grrz. Sonu olarak kk bir hcre byk bir hcreye gre daha etkin alabilmektedir. Gaz Transferi: Fermantr hacminden ok maruz kalnan yzeye bal olduu iin kartrma ok byk nem kazanmaktadr. Yzey/hacim oran nedeniyle oksijen transferini byk lekte salanmas ok zordur. Havalandrma iyi yaplamazsa verim der. Havalandrma ok ksa sreli dahi kesilse fermantasyon iinde ksmi anaerobik koullar olutuu iin verimi byk oranda etkiler. Kartrmann daha az etkili olduu blgelerde cep denilen blgeler olumakta ve mikroorganizma byle ceplere girerse fermantasyon koullarndan farkl evresel koullara maruz kalaca iin verim dmekte ama d eyler geliebilmektedir. lek bytme ekip almasn gerektirir. Kimya mhendisi, biyokimya, mikrobiyolog, gda mhendisi gibi. lek bytmede rol oynayan olay vardr. Termodinamik fenomen, mikrokinetik fenomen ve transport fenomenler. r: Oksijenin svda znrl, reaktrn boyutuna bal deildir. Ama kartrma zaman, kartrma hz ve pervane geometrisi nemlidir. Mikroorganizmalarn mikrokinetik davranlar fermantr boyutuna bal deildir (besin konsantrasyonu, pH, scaklk vb. faktrler nemlidir). Bu iki fenomen lekten bamszdr. Transport prosesleri lee baldr. r: oksijenin svda transportu, svdaki besinin ve oksijenin hcreye transportu gibi. Transport prosesi iin lek arttka zaman sabiti iin iine girmektedir. Transport ilemleri iyi bir ekilde yaplmazsa zaman uzar. Bunun uzamamas iin kartrmann ok iyi yaplmas gerekir. Bu fenomen dnda s transferi nemlidir. lek bydke s artmakta ve sratle soutma gerekmektedir. Birde a kltrnn kararll nemlidir. Mikroorganizmann sahip olduu baz zellikler lek bytmede sorun oluturur. r: Bir hcre ekstraselular proteinaz sentezliyorsa svnn vizkositesini artracaktr.

lek bytmede ilk almalar laboratuar erlenlerinde yaplr. Burada baar elde ediliyorsa kk hacimli bir laboratuar fermantrne (5-10lt) gei yaplr. Bu aamalarda kullanlan denemenin maliyeti dk ilem parametrelerini test etmek kolay olduu iin avantajldr. nc basamakta pilot bazda denemeye geilir. Genellikle 300-3000lt hacimli bir fermantrde almalar devam ettirilir. Buradaki koullar ticari hacme olduka yakndr. Ama maliyet yine dktr. Bilgisayar destei ile, laboratuar koullarnda elde edilen deerlere yakn deerler elde edilir. Son safha 10000-400000 lt hacimli fermantrlerin kullanld endstriyel basamaktr. Burada artk hibir sorunun ortaya kmamas gerekmektedir. lek bytme almalarnda en nemli ey fermantrde oksijen orannn fermantr boyutu arttka sabit tutulmasdr. r: Kk bir fermantrde optimum verim elde etmek iin 200mmol/saat oksijen gerekiyorsa lek ne kadar byrse bysn ayn orann temin edilmesi gerekir. Bunun iin kartrmann hzl olmas ve daha gl hava flenmesi gerekmektedir. lek bytme ilemlerinde nerilen yntemler ksaca aadaki gibidir. enerji giriinin sabit kabul edildii almalar, kartrma zamannn sabit kabul edildii almalar, oksijen transfer katsaysnn sabit kabul edildii almalar, evresel koullarn (znm oksijen gibi) sabit kabul edildii almalar. Endstriyel bir biyoprosesin laboratuar ortamndan ticari fermantre tanmas aadaki aamalardan sonra gerekleir. alkalamal erlen denemeleri Laboratuvar lekli fermentor (5-10 L) Pilot lekli fermentor (300-3000 L) Ticari fermentor (10,000-500,000 L) alkalamal erlen denemelerinde hedeflenen optimizasyon parametreleri unlardr: 1. pH 2. Scaklk 3. Oksijenin znrl 4. Substrat seimi 5. Substrat konsantrasyonun optimizasyonu
9

6. Dierleri

Laboratuvar lekli fermantrde ise u parametreler optimize edilmeye allr: Kartrma Soutma ve stma Hava giri ve k pH kontrol Besin ilavesi Inokulasyon Laboratuar lekli denemelerde kesikli proses, kesikli beslemeli proses, srekli proses veya yar srekli proses uygulanabilir. Elde edilen parametreler bir sonraki admda ticari lee yakn bir pilot fermantre uyarlanarak lek biraz daha bytlr. Son adm endstriyel boyutta fermantr uygulamas olup bu aama da sorun kmas istenmez. 3.MATERYAL-METOT 3.1 MATERYAL Escherichia colinin 24 saatlik sv kltr 250 mllik erlende nutrient broth Spektrofotometre Kvetler

3.2 METOT Deneyde farkl oranlarda kltr edilmi mikroorganizmalar saf kltr 0,25 seyreltik kltr 0,50 seyreltik kltr her 20dk periyotlarla inkbasyondan rnekleri alnarak reme aralklarna baklr. Bu ekilde hem hcre byme fazlarnn belirlenmesi hem de kinetik sabitlerinin belirlenmesi salanm olur.

10

4.BULGULAR Deneyde yaplan denemeler sonucunda aadaki sonular elde edilmitir. Zaman(t) 0 20 40 60 80 100 120 NB 0,195 0,178 0,324 0,558 0,906 1,338 1,214 0,25seyreltik NB 0,176 0,244 0,302 0,512 0,717 1,740 1,686 td=0,0323 dk 0,50 seyreltik NB 0,241 0,313 0,444 0,758 1,176 0,816 0,630

0,0077=/2,303 ise =0,0177(NB)

0,0090=/2,303 ise =0,0207(0.25 NB) td= 0,0467 dk 0,0045=/2,303 ise =0,01036(0.50NB) td=0,0096 dk

5.TARTIMA Absorbansn zamana gre deiim grafikleri

NB
1.5 absorbans 1 0.5 0 0 50 zaman 100 150 y = 0.0106x + 0.0348 R = 0.9073 NB Linear (NB)

ekil 4.1: Nb zeltisinde reme grafii

11

Chart Title
2 hcre remesi 1.5 1 0.5 0 -0.5 0 50 zaman 100 150 y = 0.0142x - 0.0822 R = 0.8339 Series1 Linear (Series1)

ekil 4.2: 0.25 seyreltik zeltide reme grafii

Chart Title
1.5 hcre remesi 1 0.5 0 0 50 zaman 100 150

y = 0.0052x + 0.3142 R = 0.4744

Series1 Linear (Series1)

ekil 4.2: 0.50seyreltik zeltide mikrobiyal reme grafii Log x e karlk zaman grafii Absorbanslar direk hcre younluu olarak alalm. Ve verilerin logaritmalarn alalarak grafik izelim . elde ettiimiz grafikten hcre kinetii sabitlerine bakalm . Zaman(T) 0 20 40 60 80 100 120 Log NB -0,710 -0,556 -0,489 -0,253 -0,043 0,123 0,119 Log 0,25NB -0,754 -0,613 -0,521 -0,291 -0,145 0,241 0,227 Log 0,50 NB -0,618 -0,353 -0,505 -0,120 0,235 -0,088 -0,201

12

Chart Title
0.4 0.2 0 log X -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 zaman 0 50 100 150

y = 0.0077x - 0.7182 R = 0.967

Series1 Linear (Series1)

Log zaman grafii yalnz NB hcre kltr

Chart Title
0.4 0.2 0 -0.2 0 -0.4 -0.6 -0.8 -1 y = 0.009x - 0.8038 R = 0.9612 50 100 150

log X

Series1 Linear (Series1)

zaman

LogX-zaman grafii 0,25 seyreltilmi hcre kltr

Chart Title
0.4 0.2 0 logX -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 zaman 0 50 100 150

y = 0.0045x - 0.5058 R = 0.4628

Series1 Linear (Series1)

logX-zaman grafii 0,50 seyrelmi hcre kltr Bu grafik denklemlerinde eim =/2,303 denkleminde yerine koyarak her bir ortam iin spesifik byme hzn bulabiliriz.
13

Birinci grafikten; 0,0077=/2,303 ise =0,0177 0,0090=/2,303 ise =0,0207 0,0045=/2,303 ise =0,01036 kilenme sreleri ; Lnx/x0=t olduunu bilmekteyiz. Ln(1,214/0,195)=0,0177t ise t = 0,0323 dk olarak bulunur .

KR (BASELNE ) VE NUTRENT BROTH Spektrofotometrik cihazlarn birounda (zellikler UV, FTIR) absorpsiyon lm yaplrken k sadece hedef molekllerle deil zelti ile de etkileime girer. Dolaysyla cihaz bize hedef molekln absorpsiyon spektrumunu vermez, zeltinin spektrumunu verir. Bunu nlemek iin, sadece hedef molekl trnn absorpsiyonunu renmek iin kr (blank) alnr. Bu ilemin bir dier ad dara almaktr. ift k yollu spektroskopilerde bir hcreye numune konulurken dierine zc konulur. Tek k yollu spektroskopilerde ilk nce zcn kuvartz kvete konularak dara alnr. Daha so nra lm alnr. Baka bir kaynakta kr yle tanmlanmtr: Spektrofotometrede okuma yapmadan nce absorbans sfra veya %transmittans 100e ayarlamak iin kullanlan zeltidir. Bu amala yaplan ileme kr ayar veya 0 ve 100 ayar denir. tip kr zeltisi vardr. Bunlar: Optik kr; standart zelti serisi hazrlanrken stok standart zelti hari dier kimyasallarn konulmasyla hazrlanan 0.0 konsantrasyonlu zeltidir. zeltilerden ve kvetten gelebilecek absorbanslar ortadan kaldrmak iin kullanlr. Bunun analiz ncesi yaplmas zorunlu olmakla beraber analiz srasnda da yaplmas gerekebilir. Reaktif kr; bulank veya renkli reaktifler kullanldnda iinde sadece o reaktifin olduu kr zelti olup o reaktiften gelebilecek absorbans tespit etmek iin kullanlr. Numune kr; renkli veya bulank numunelerin kullanld lmlerde numunenin renginden gelebilecek absorbans tespit etmek iin kullanlan, iinde
14

sadece numunenin bulunduu kr zeltidir. Spektrofotometre optik kre kar sfra ayarlanmsa reaktif krnn absorbans deeri, numune ve standartlarn absorbansndan karlr. Numune krnn absorbans ise sadece numunenin absorbansndan karlarak hesaplama yaplr. NUTRENT BROTH Nutrient Broth (Merck 1.05443) AOAC ve BAM ynergelerine uygundur. In vitro (canl hcre dnda) yaplan standart mikrobiyolojik analizlerde genel sv besiyeri olarak kullanlr. Zor gelien (fastidious) mikroorganizmalar bu besiyerinde geliemeyebilir. Bileim Peptone from meat 5,0 g/L; Meat extract 3,0 g/L Hazrlanmas Dehidre besiyeri, 8,0 g/L olacak ekilde damtk su iinde eritilir ve amaca uygun kaplara (tp, erlen vs.) datlr ve otoklavda 121 oC'da 15 dakika sterilize edilir. Hazrlanm besiyeri berrak ve sarms kahve renkli olup, 25 oC'da pH's 7,00,2'dir. Besiyeri bileimine %0,05 potasyum tellurit ilavesi ile Listeria monocytogenes iin zenginletirme besiyeri hazrlanabilir. Dehidre besiyerinin depolanmas 15-25 oC'da ve besiyeri kutusu skca kapal tutulmak zere, kutu alm olsa dahi son kullanma tarihine kadar gvenle kullanlabilir. 1 kutu ile hazrlanacak besiyeri miktar 500 g olan 1 kutu dehidre besiyerinden, 62,5 L besiyeri hazrlanr. Kalite Kontrol Test Mikroorganizmalar Gelime Staphylococcus aureus ATCC 25923 orta / ok iyi Streptococcus pyogenes ATCC 12344 orta / ok iyi Listeria monocytogenes ATCC 19118 orta / ok iyi Escherichia coli ATCC 25922 orta / ok iyi Salmonella typhimurium ATCC 14028 orta / ok iyi Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 orta / ok iyi Bacillus cereus ATCC 11778 orta / ok iyi DENEYSEL HATALAR Yaplm olan deneyde sterilizasyona bal olarak belli bir hcre lmleri olduu grlmektedir. zellikle 0.25 orannda seyreltik besiyerinde lag fazndan kma aamasnda gecikme olduu spektrofotometre okunan absorban deerlerine baklarak dahi anlala bilinir.

15

alkalamal etvde s kayplar ani olduu gze arpmaktadr. Etv kapandan sonra sy korumak amacyla bir hat ile daha korunmas mikroorganizmann termik oklardan saklanmas mmkn olabilir. Mikoorganizma n ekim odas ile alkalamal etv ve spektrofotometre ayn lab. odasna getirilerek hem almada kolaylk hemde kontamine riskine kar nlem alnm olunabilir. Btn bunlarla birlikte spektrofotometre okunan deerler mikroorganizmann normal reme evresinde seyrettiini gstermektedir.

16

6.KAYNAKLAR Rengin Eltem Mikrobiyal fizyoloji ders notlar Basic Biotechnology. John Bulock, Bjorn Kritiansen. Academic Press. Orlano, Florida. 1987. Biotechnology. Wulf Crueger, Anneliese Crueger. A Textbook of Industrial Microbiology. 1989, second edition. Sinauer press.
http://biyokure.org/kor-blank-ya-da-baseline-alma/5357/

17