PRODUCCION DE ENZIMA AMILASA MICROBIANA MEDIANTE FERMENTACION EN SUSTRATO LQUIDO

FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA CENTRO DE INVESTIGACIONES MONTERIA CORDOBA 2008

A.

INFORMACION GENERAL Produccin de enzimas amilasa microbiana, mediante fermentacin en estado lquido

Ttulo del proyecto Lder principal responsable del proyecto Miembros e integrantes )nidad acad"mica Empresa donde realizar( el proyecto *ec$a de inicio *ec$a de finalizacin %osto total del proyecto 0incluyendo descargas 1 pago de personal 234 Montos de contrapartida 0Entidad o dependencia que cofinancia34 Lnea de traba:o o (rea del conocimiento en la cual se inscribe el proyecto4

Eder Durango Ballesteros

lfonso Batista !im"nez #bet$ %epeda !im"nez &"ctor lberto Tobn 'uzm(n *acultad de #ngeniera groindustrial )ni+ersidad Pontificia Boli+ariana !unio de ,--. !unio de ,--/

5 ,64.,74,.6 5 /48,94..6
Desarrollo de nuevos materiales y nuevas aplicaciones

B. RESUMEN El surgimiento de plantas de alco$ol carburante de primera generacin a partir de almidn, en la regin %aribe, implica la transformacin de la materia prima por procesos de $idrlisis mediante la accin de un comple:o de amilasas capaces de degradarlo en azucares4 La implementacin de $idrlisis enzim(tica conlle+a generar altos costos de produccin, factor que genera una problem(tica en las empresas de este g"nero y a su +ez en buscar soluciones para dic$a tem(tica4 Este proyecto tiene el principio de desarrollar e implementar aplicaciones microbiolgicas y biotecnolgicas para la produccin de un comple:o de amilasa microbial a partir de fermentacin en un estado liquido, con el ob:eto de buscar soluciones factibles en cuanto a la problem(tica planteada del proceso de $idrlisis del almidn4 C. DESCRIPCION DEL PROYECTO:

1. Pl !"# $%#!"& '#l ()&*l#$ : La tendencia actual y las altas e;igencias ambientales $an impulsado el desarrollo de nue+as t"cnicas agroindustriales4 ctualmente, en %olombia se plantea un d"ficit general en torno a la agroindustria enzim(tica a causa de la carencia de in+estigacin, infraestructura y poca moti+acin para desarrollar empresas que basen sus fundamentos en el progreso de este campo de la biotecnologa4 <u desarrollo, as como el de otras (reas de la biotecnologa, est( afectado por problemas como la creciente brec$a cientfica y tecnolgica con respecto a los pases industrializados4 <eg=n la firma internacional, F)&+" , S-ll%. !, analistas dedicados al estudio de mercados mundiales, el comercio de enzimas esta seccionado en distintos segmentos dependiendo la industria y la aplicabilidad de estas4 <eg=n el estudio, para el a>o ,--? se gener cerca de 68, millones de dlares solo en la industria alimenticia siendo el sector m(s inno+ador el de la ingeniera gen"tica a partir de organismos modificados, @'M4 %on un 894?A, las
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enzimas destinadas al procesamiento del almidn 0amilasas3 y los azucares componen el sector mas amplio en la industria46 Esta crisis remarcada en el ficticio mercado enzim(tico colombiano afecta gran di+ersidad de industrias incluso las que est(n en +a de desarrollo como las de alco$ol carburante de primera generacin cuya materia prima para produccin es el almidn, ya que para la transformacin de "sta se $ace necesario catalizar el polisac(rido por medio de un comple:o de enzimas amilasas capaces de desdoblar este compuestoB el uso de este comple:o representa el 6,A del +alor total de produccin de alco$ol a base de esta materia prima4 En la costa %aribe el empleo de estas enzimas esta concretamente en el #ngenio <icarare 0%odazzi2%esar3 y en la planta piloto de %@CP@#% 2T)C#P D en %rdoba, lo que les incrementa el +alor por litro de producto dado la necesidad de importacin de este comple:o4 Las plantas de alco$ol carburante de primera generacin con base en almidn se +en obligadas a importar comple:os de amilasas para la $idrlisis del polisac(rido, lo que implica un aumento significati+o en los costos de produccin de las compa>as por el $ec$o de incurrir en gastos de importacin, aranceles y dem(s impuestos4 Las enzimas a escala industrial, son importadas de di+ersos pases de Europa, !apn, Estados )nidos, %anad( y M";ico4, En conclusin, la creciente agroindustria de los biocombustibles de primera generacin a partir de almidn $a establecido un $ec$o que e+idencia la necesidad de producir comple:os de amilasas para reducir costos de operacin4 Por lo que se plantea esta in+estigacin para buscar alternati+as de produccin de enzimas amilolticas y su aplicacin en las plantas de alco$ol carburante en base de almidn4
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Consultado en: < www.agrobio.org/bioboletines.php?id=3 !. bolet"n 3 publicado en #unio de $%% &en l"nea'( consultado el %) de *ebrero de $%%+.
$

% CCEC , !orgeB produccin y aplicacin de las enzimas industriales4 ,. de febrero de ,--?4 Ce+ista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial4 p 6-4

2. I$( /"& #+(#) '&

%on este proyecto se busca incorporar soluciones biotecnolgicas para establecer un protocolo de produccin de un comple:o de enzimas amilasas para cat(lisis de almidn4 Ba:o esta tem(tica se permitir( lograr a+ances en t"rminos de in+estigacin en el (rea enzim(tica4 La profundidad de esta in+estigacin radica en buscar fuentes org(nicas capaces de producir comple:os amilolticos para $idrlisis del almidn con el fin de me:orar el desarrollo de este proceso4 0. M )/& "#1)%/& 2 #+" '& '#l )"#: 0.1 A!"#/#'#!"#+ Mundialmente, la produccin de enzimas esta desarroll(ndose aun m(s, ba:o el principio de optimizar procesos y con+ertirlos en bioprocesos4 La aplicacin de esta industria gira en torno a pases industrializados que tienen la capacidad de in+estigar y producir a gran escala estas protenas, lo cual margina a pases menos desarrollados a causa de carencia de recursos, infraestructura y desarrollo en el campo biotecnolgico4 <in embargo, esta afirmacin no $a sido un impedimento para que en di+ersos lugares del mundo se in+estigue en el (rea de la enzimologa y el impacto que estas ocasionan en los procesos y reacciones qumicas4 Enzimas amilasas son las mas estudiantes en este campo debido a su influencia directa en la degradacin del almidn, uno de los productos alimentarios mas e;plotados a ni+el mundial4 O*"#!/%1! '# $%l + + 34!5%/ + ( )"%) '# Aspergillus +(., %+l '& '#

+#$%ll + '# l#!"#6 +0. Este proyecto se lle+o a cabo en Bogot( 2 %olombia y su
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CASTRO C.; NAVAS C.; CARO O; PIEROS Y. Obtencin de amilasas fngicas a partir de Aspergillus sp. aislado de semillas de lentejas. %onsultado en pagina oficial de )ni+ersidad !orge Tadeo Lozano, Bogot(

ob:eti+o fue aislar microorganismos productores de amilasas para producir enzimas $idrolticas del almidn4 El agente productor detectado fue una cepa del genero Aspergillus sp. Euien fue aislado de granos de lente:as4 Este microorganismo fue lle+ado a medio de culti+o en agar FPD ba:o par(metros especficos de incubacin4 Luego de 6. das se realizo cambio de sustrato a sal+ado de trigo y se lle+o a cabo pruebas de Lugol, medicin de acti+idad enzim(tica y e;traccin del comple:o enzim(tico4 Los resultados indican que las amilasas presentes en el comple:o enzim(tico obtenido del culti+o de Aspergillus sp4, sobre sal+ado de trigo, fueron acti+as en el desdoblamiento de la mol"cula de almidn a p& G4- y temperatura de ?9H% demostrando su car(cter d"bilmente (cido y su pro+eniencia mesfila4 El equi+alente de de;trosa como medida cuantitati+a de la $idrlisis del polisac(rido fue de 74G, e+idenciando la capacidad enzim(tica amiloltica del comple:o enzim(tico obtenido4 En este traba:o se confirm teora antes mencionada y la capacidad de $ongos del g"nero Aspergillus sp4, para la produccin de amilasas4

P)&'-//%1! '#

$%l + + (&) $#'%& '# Aspergillus niger +-$#)5%'&+ #!

/-l"%.&+ '# 5- + '# l . '& '# '&+ #$()#+ + l%$#!" )% + 74 El ob:eto de este proyecto fue de analizar la produccin de enzimas amilasas por cepas de Aspergillus niger en aguas de la+ado de industrias cer+eceras y c(rnicas para determinar la capacidad de produccin de proteasas, amilasa y de depuracin de medio donde crecen4 La metodologa aplicada se baso en la creacin de un medio de culti+o de aguas de la+ado con aplicacin de nutrientes que me:oren la adaptacin del agente4 <e implement pruebas de azucares, ni+eles de nitrgeno y fosforo y demanda qumica de o;igeno 0DE@34 <e analizaron los par(metros de produccin de enzima, p&, temperatura y concentracin de iones4 Los resultaron indican que los ni+eles de amilasa y proteasa obtenidos son marcadamente
1 %olombia4 III4utadeo4edu4co4 *ec$a de consultaJ-, de marzo de ,--.4 < L < &, MabelB C@DC#')EK C, MariluB PECEK '4, ManuelB PECEK C, Cenato4 Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. -G de marzo de ,--G4 !ournal of *ood Engineering4

dependientes de la concentracin inicial de almidn en el medio de culti+o4 Las fuentes de nitrgeno 0peptona, amino(cidos y e;tracto de le+adura3 fueron totalmente influyentes en la produccin de enzimas4 El p& ptimo encontrado fue de 84/G en las amilasas y la temperatura fue de G-H%4 P)&'-//%1! '# $%l + + '# l#. '-) + 3l&/-l !"#+ 84 Este proyecto desarrollado en PaList(n se destino en la consecucin de seis especies de le+aduras productoras de amilasas4 Para analizar sus ni+eles de produccin ba:o el medio de culti+o agar almidn y como fuente de carbono se agrego e;tracto de le+adura, almidn y una muestra se suplemento con amilasa sali+al4 El medio estu+o contenido de los nutrientes ideales para el crecimiento y adaptacin del microorganismo incubado a una temperatura de ,GH%4, se realizaron pruebas de produccin de enzima, degradacin de sustrato, turbidimetra y +elocidad de crecimiento4 Del la metodologa e:ecutada se aislaron ? cepas de le+adura correctamente4 El me:or resultado se obtu+o en la cepa que traba: con sali+a $umana, produciendo ,. )Mml, la cual present una estabilidad en el rango de ,G2 7-H%4 Los ni+eles de las dem(s cepas fueron muy inferiores al registrado anteriormente4

D#"#)5#!"# /&! 3&)$-l /%1! #!9%$:"%/ '# $%l + &*"#!%' '# Aspergillus niger. U! #+"-'%& /&$( ) "%.& #! '#"#)5#!"#+ /&$#)/% l#+ ;. El proyecto manifiesta una problem(tica de la necesidad de compuestos naturales y eficaces para la industria de detergentes4 El presente articulo describe la produccin, purificacin y parcial caracterizacin de un comple:o de amilasa producido por A. niger y uso potencial en formulacin de detergentes . <e dise>o un culti+o con distintos microorganismos a la espera de conocer el agente que me:or resultados otorgar( en cuanto a produccin de amilasa se refiere4 <e traba:o con medio PM
,

D &N#, #ra:B EMT# K#, 'iti 4 Production of " Amylase by Flocculant Yeast. Pa istan !ournal of "iological #ciences. $%%& M#T#D#EC#, <ydneiB <@)K , nneB <%&C DO, ugusto, &EDD#D', Marilene4 Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus nigerJ comparati+e study Iit$ commercial detergent formulations4 Bioresource tec$nology4 6/ de agosto de ,--G4

usando residuos industriales de protena de soy y almidn como fuente de carbono adem(s de minerales4 <e realizaron ensayos analticos con pruebas de DD<, iodometra y control de los par(metros de p& y temperatura4 .l e/tracto obtenido del comple#o en0im1tico *ue comparado en tres *ormulaciones comerciales de detergentes para determinar su actividad de limpie0a en e2uipos de hospitales3 cirug"a y endoscopia. 4os resultados indicaron 2ue el microorganismos con me#or per*ormance en la producci5n de amilasa *ue el Aspergillus niger con una producci5n de 3.) 6/ml en medio sumergido y una actividad e/celente de degradaci5n de en el rango de ,%7,,8C y un p9 de .%.

0.2 E!9%$

$%l + : A//%1! 2 /l +%3%/ /%1!

Las amilasas son enzimas las cuales $idrolizan mol"culas de almidn dando como productos de;trinas y polmeros compuestos progresi+amente por unidades de glucosa7 Esta familia de enzimas $idrolticas esta compuesta por a protenas catalticasJ alfa2amilasa, beta2amilasaB glucoamilasaB isoamilasa4 <e encuentran ampliamente distribuidas en te:idos +egetales, donde :uegan un rol muy importante en la degradacin del almidn en la germinacin de las semillasB en te:idos animales, cumpliendo una misin digesti+aB y en di+ersas especies de microorganismos como $ongos y bacterias84 %omo bien es conocido las cadenas de almidn est(n compuestas por dos grandes sub2cadenas, amilosa y amilopectina4 La alfa2amilasa se caracteriza por atacar los enlaces 6,82alfa2glicosdicos en el centro de la cadena de los

<'&EC M4B ! N #D M4B C &M D <4)B LE''E C4L4B A t'ermostable a(amylase from a moderately t'ermop'ilic "acillus subtilis strain for starc' processing4 ,/ de marzo de ,--74 !ournal of *ood Enginnering4 P /G+

TC#P T&# Palla+iB LE''#@, LeilaB M D<*ELD, !o$annaB )LBC#%&2&@*M DD, CenateB Oayast$a, r+ind4 ap'a( amylase of mung bean )vigna radiata* correlation of bioc'emical properties and terciary structureby 'omology modelling. ,? de mayo de ,--94 P$ytoc$emistry4 p4 67,?4

polisac(ridos, por lo que se la conoce como endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligosac(ridos4 La enzima alfa2amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y

peque>os compuestos de glucosa4 <in embargo, esta enzima solo es capaz de degradar parcialmente la amilopectina y el glucgeno debido a que no es capaz de desdoblar los enlaces glicosidicos627 encontrados en los puntos de ramificacin de la cadena del polisac(rido4 Por otro lado, La beta2amilasa, presente en plantas y bacterias, tambi"n cumple la funcin de degradar los enlaces 6,82a2glucosdicos pero comienza su accin por el e;tremo libre no reductor del almidn, liberando maltosa al igual que la enzima alfa2amilasa4 La $idrlisis se detiene en los puntos de ramificacin de la amilopectina y el residuo se conoce como de;trina lmite4 La pululanasa o isoamilasa, tambi"n perteneciente a la esta familia, $idroliza los enlaces 6,72alfa2glicosdicos quitando las ramas de la amilopectina o las de;trinas4 <i e;iste un acompa>amiento general del comple:o de las amilasas se puede lograr efecti+a una degradacin total del almidn4
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En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de la familia amilasa, mundialmente se reconoce a la comisin enzimologica 0E4%43 quien es el encargado de identificar a todas y cada una de las enzimas e;istentes4 Este instituto reconoce la enzima alfa2 milasa como E4%4 ?4,46464 <u nombre sistem(tico es alfa26,82glucan282 glucano$idrolasa4 @tros nombres comunes en el comercio y el (mbito cientfico son glucogenasa y endoamilasa4 Estas se caracterizan en lle+ar a cabo la reaccin de endo$idrlisis que se sit=a de los enlaces 6,82alfa2D2glucosidicos en polisac(ridos que contienen ? o m(s enlaces 6,82alfa2D2glucosidicos4 Los grupos reducidos son liberados en una configuracin alfa4 Este termino alfa, esta relacionado con la configuracin anom"rica inicial de los grupos de azucares liberados104
)

% CC#LL@ Leonor4 Microbiologa grcola4 ,--?4)ni+ersidad Dacional de <alta4 ISBN <8=><081>1;>8 #)BMB, Enzyme Domenclature4 Pen lneaQ4 R$ttpJMMIII4c$em4qmul4ac4uLMiubmbMenzymeME%?M,M6M,4$tmlS4 Pconsultado el 6- de febrero de ,--.Q
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T2amilasa bacteriana 0E% ?4,464634 La T2amilasa $idroliza el enlace glucosdicos interno dando lugar a productos de ba:o peso molecular, solubles y menos +iscosos, cuya ruptura est( limitada por la presencia de los enlaces glucosdicos a2627 en los puntos de ramificacin de la mol"cula del almidn nati+o 0amilopectina34 Los productos de $idrlisis tienen configuracin a en la glucosa del e;tremo reductor4 <e piensa que la enzima act=a por la accin combinada de los grupos carbo;ilo e $istidina del centro acti+o4 Las a2amilasas obtenidas de "acillus subtilis +ar amyioli+,tedaciens tienen un ion calcio fuertemente ligado por mol"cula, que es necesario para la acti+idad deU enzima y que lo estabiliza en gran medida frente aU calentamiento4 <e utiliza como enzima soluble en tratamientos de dos $oras a .G V% y p& G,G29 como una alternati+a a la utilizacin de (cido clor$drico que produce e;cesi+os compuestos coloreados y la formacin de productos de re+ersin4 Debido a que los almidones de patata y de cereales cerosos no pueden tratarse por gelatinizacin, se les somete a un proceso en dos etapas, en el que se a>ade una segunda dosis de enzima y se contin=a et tratamiento $asta lograr el contenido deseado de glucosa 664 La enzima Beta2amilasa es reconocida en la comisin enzimolgica como E4%4 ?4,464,4, su nombre sistem(tico corresponde al de 6,82alfa2D2glucan malto$idrolasa4 <u funcin es actuar en la reaccin de $idrlisis de los enlaces alfa26,82glucosidicos del almidn con in+ersin en la configuracin del carbono 6 pas(ndolo de la configuracin alfa a la betaB as como de remo+er las unidades de maltosa continuas presentes en los terminales no2reductores de la cadena polisac(rida4 Los grupos sulfi$idrilos son esenciales para la acti+idad, por lo que la

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W#<EM D, lan4 Manual de biotecnologa de las enzimas4 Editorial cribia, Karagoza 2 Espa>a4 6/.G4 p4?6/

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enzima se inacti+a por o;idacin, por los metales pesados y sus sales4 producto es beta2maltosa4

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4 <u

Beta2amilasa $a sido descrita como una protena abundante la cual se puede encontrar en grandes cantidades tanto en te:idos de almacenamiento de almidn y rganos de plantas134 Muc$os %ereales contienen tambi"n la enzima beta2amilasa y alfa2amilasa aunque esta ultima en concentraciones menores, tan solo ocupa apro;imadamente ?-A de contenido total de protenas sintetizadas durante la germinacin4 Estas dos amilasas pueden ser distinguidas una de otra, mediante el punto de inacti+acin que presentan a un p& determinado4 La enzima alfa2amilasa es inacti+ada a un p& en el rango de 84. 2 G4-4 Mientras que a este mismo rango la beta2amilasa es estable4 La enzima E4%4 ?4,464,4, es inacti+ada en un p& alrededor de 74-294-, y en caso reciproco condiciones144 @tra enzima perteneciente a esta peculiar familia es la 'lucoamilasa tambi"n reconocida como amiloglucosidasa4 En la nomenclatura internacional esta identificada como E4%4?4,464?4, y su nombre sistem(tico es 6,82alfa2D2glucano gluco$idrolasa4 <u funcin es actuar en la reaccin de $idrlisis en cadenas de polisac(ridos operando en los enlaces 6,82alfa2D2glucosa que est(n de manera residual despu"s de $aberse e;puesto la cadena a la accin de alfa y beta amilasa154 El principal producto final de la accin de la glucoamilasa sobre el
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las alfa2amilasa son estables ba:o estas

% CCEC , !orgeB produccin y aplicacin de las enzimas industriales4 ,. de febrero de ,--?4 Ce+ista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial4 p 664
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@L#NE#C !oao CB N#E#C dairB K %K)O B4 PriscilaB %@CDED)D<# BeatrizB M #D CD# !anaXYna 4B P)C' TT@ EduardoB L !@L@ *ranco4 "eta(amylase e-pression and starc' degradation during banana ripening4 6- de no+iembre de ,--G4 Post$a+erst Biology and Tec$nology4 p 86
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@L)< D!@ 4 #saacB D' %&# 4 Edit$B #&)@M @4 *lorence4 .omparative studies on a(amylases from malted mai/e )0ea mays*1millet )2leusine coracana* and #org'um )#org'um 4 G de mayo de ,--74 %arbo$yfrates Polymers4 P 9,4
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#)BMB, Enzyme Domenclature4 Pen lneaQ4 R$ttpJMMIII4c$em4qmul4ac4uLMiubmbMenzymeME%?M,M6M,4$tmlS4 Pconsultado el 6- de febrero de ,--.Q

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almidn es glucosa, lo que la diferencia claramente de la alfa y beta amilasas4 La enzima tambi"n produce peque>as cantidades de oligosac(ridos4 La sacarificacin del almidn puede alcanzar $asta /7A de de;trosa4 La accin de la enzima causa in+ersin de la configuracin, produciendo beta2glucosa4 Las glucoamilasas son inacti+as sobre almidn nati+o4 <u acti+idad es m(;ima entre p& 8 y G4G, y temperatura alrededor de GG27G -%4 La rata de reaccin cae r(pidamente a medida que disminuye el tama>o de la mol"cula de sustrato, siendo m(;ima sobre almidones pre+iamente sometidos a licuefaccin 164 miloglucosidasa 0E% ?4,464?34 Las amiloglucosidasas 0glucoamilasa, a2amilasa o a2628 gluco$idrolasa3 catalizan la etapa de $idrlisis de los enlaces T2628 del almidn y los oligosac(ridos, liberando mol"culas de Z2glucosa a partir del e;tremo no reductor de la cadena4 Los enlaces ramificados T2628 tambi"n se $idrolizan, pero muc$o mas lentamente, form(ndose un :arabe de glucosa, un contenido de glucosa del /G al /9 A en peso y de un ?- a un G A de oligosac(2 ridos grandes4 El enzima es capaz de $idrolizar tambi"n, aunque lentamente, los enlaces a262?4 La glucosa formada se utiliza como :arabe o se cristaliza para obtener glucosa pura slida4 La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la in2 dustria de procesado del almidn en tanques discontinuos a GG27- V% y p& de 8,G y con perodos de incubacin de 8.2/, $oras, para transformar las de;trinas formadas por la a2amilasa en glucosa4 El calcio la estabiliza frente a la desna2 turalizacin por el calor o los (lcalis, y la $idrlisis puede lle+arse a cabo f(cil2 mente a>adiendo el enzima soluble al almidn una +ez que la a2amilasa $a rea2 lizado del 6G al ?- A de la $idrlisis posible 694 )na +enta:a particular en el uso de enzimas en lugar de &%l para la $idrlisis del almidn es que puede utilizarse una materia prima menos pura, ya que las
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% CCEC , !orgeB produccin y aplicacin de las enzimas industriales4 ,. de febrero de ,--?4 Ce+ista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial4 p 66
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W#<EM D, lan4 Manual de biotecnologa de las enzimas4 Editorial cribia, Karagoza 2 Espa>a4 6/.G4 p4?,-

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protenas contaminantes no se $idrolizan $asta amino(cidos, que podran dar lugar a reacciones de pardeamiento4 Despu"s de la sacarificacin con amiloglucosidasa, el :arabe resultante se filtra para eliminar protenas y grasas y se purifica con columnas de carbn acti+o seguido de otras con resinas de intercambio inico4 La glucoamilasa es un enzima e;tracelular producido por di+ersas especies de Aspergillus o 3'i/opus. La amilogluosidasa de 3'i/opus puede separarse en isoenzimas con propiedades seme:antes a los isoenzimas de A. niger. El enzima es una glicoprotena que contiene ma>osa, glucosa, galactosa y (cido urnico, y tiene un p& ptimo de 8,?28,G4 )na de sus des+enta:as es su relati+a falta de acti+idad frente a los enlaces T2627, lo que $ace necesario el uso de grandes dosis o de grandes perodos de incubacin para lograr el grado de $idrlisis deseado4 Por tanto, se $a propuesto el uso combinado de amiloglucosidasa y la enzima desramificante pululanasa, logrando aumentos del contenido de de;trosa del 6 al , A, a pesar de lle+ar a cabo la reaccin a p& G,G27,-, en el que la amiloglucosidasa es menos acti+a6.4 El resto de la cadena del polisac(rido es atacado por la enzima isoamilasa o pululasa, reconocida oficialmente como E4%4 ?4,4647.4 Participa en la reaccin de $idrlisis de polisac(ridos especficamente en los enlaces 6,72alfa2D2glucosidicosB su nombre sistem(tico es glucgeno alfa26,72glucoano$idrolasa4 <u actuar es directamente sobre la amilopectina, glucgeno y de;trinas, pero es incapaz de $idrolizar el pululano y las alfa2de;trinas limite4 <u misin en participar en la reaccin de $idrlisis de ramificacin que contengan enlaces 6,72alfa2glucosidicos por lo que tambi"n se le conoce como enzimas desramificadora4 <u nombre sistem(tico es glucgeno 6,72alfa2D2glucano$idrolasa 194
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El =nico producto de

W#<EM D, lan4 Manual de biotecnologa de las enzimas4 Editorial cribia, Karagoza 2 Espa>a4 6/.G4 p4?,1) #)BMB, Enzyme Domenclature4 Pen lneaQ4 R$ttpJMMIII4c$em4qmul4ac4uLMiubmbMenzymeME%?M,M6M,4$tmlS4 Pconsultado el 6- de febrero de ,--.Q

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reaccin es maltosa4 La temperatura ptima est( alrededor de 8G -% y el p& entre 8yG 0.0 U+&+ 2 (l%/ /%1! '# l + #!9%$ + Las enzimas +uel+en los procesos eficientes y menos costosos, en muc$os casos, a que tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad 0sua+es condiciones de traba:o34 dem(s, lograr m(s material procesado con el mismo equipo y menos l utilizar enzimas en la industria consumo de energa tambi"n a$orra costos4 alimentaria nos ofrece la +enta:a deJ Ceducir +iscosidad 0$idrlisis34 Me:orar e;tracciones 0degradacin de pectina34 &acer biocon+ersiones 0glucosa a fructosa34 %ausar separaciones 0separacin del suero en queso34 <ustitucin de ingredientes y coadyu+antes en procesos4 $orro con procesos m(s eficientes obteniendo menos subproductos

indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento de rendimiento de producto4 'ananciaJ me:ora propiedades deseables obteniendo un producto =nico 0:arabe de alta concentracin de fructosa3420 Las enzimas amilasas por su capacidad $idroltica $an tenido gran significancia en las =ltimas d"cadas en di+ersas industrias que $an +isto una me:or manera de optimizar sus procesos aplicando t"cnicas biotecnolgica e;tensi+as basadas en enzimas4 #ndustrias como la panadera, repostera, alimentaria, te;tilera, cer+ecera, papel, azucarera entre muc$as m(s $an +isto en estas protenas una gran oportunidad de comercio4 Las amilasas ocupan cerca de un ,GA en el mercado enzim(tico llegando a sustituir completamente procesos de $idrolisis
$%

M)DD@ L#MEDT C#@4 plicacin de las enzimas en la produccin industrial4 %onsultado enJ $ttpJMMIII4alimentariaonline4comMapadminMimgMuploadMM --,[enzimas8W<*4pdf4 PconsultadoJ6- de febrero de ,--.Q

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qumica en la industria del almidn4 Esto se debe a una caracterstica esencial dentro de esta familia de protenas4 La termoestabilidad de esta enzima, industrialmente, $a $ec$o que las amilasas tengan gran aplicabilidad en di+ersos procesos421 P)&/#+&+ %!'-+")% l#+ ?-# (l%/ ! #!9%$ +22 '#l l$%'1! 2 '#l 94/ ). Dependiendo de las enzimas

3.4

0.7.1 I!'-+")%

utilizadas, a partir del almidn se pueden obtener :arabes de diferente composicin y propiedades fsicas4 Los :arabes se utilizan en una +ariedad de alimentos tales como gaseosas, dulces, productos $orneados, $elados, salsas, alimentos para beb"s, frutas enlatadas, conser+as4 &ay tres etapas b(sicas en la con+ersin enzim(tica del almidnJ licuefaccin, sacarificacin e isomerizacin4 0.7.2 P)&'-/"&+ L:/"#&+. La aplicacin de enzimas en el procesamiento de lec$e est( bien establecida, por el uso del cua:o 0quimosina3 en la produccin de queso, que tal +ez representa el empleo m(s antiguo de enzimas en alimentos4 @tras enzimas que participan en la produccin de quesos son las lipasas presentes en la lec$e, las cuales $idrolizan el componente graso, proporcionando cambios caractersticos en el sabor4 Para algunos quesos se pueden aumentar las lipasas naturales, a>adiendo enzima e;tra4 Por otra parte, tambi"n se recomienda agregar enzimas e;genas de tipo proteoltico para acelerar el proceso de maduracin de algunos quesos4 0.7.0 M&l%!#)&+ 2 P ! '#)@ . El uso de enzimas en estas industrias se debe principalmente a la deficiencia en el trigo y en la $arina, de las enzimas naturalmente presentes4 El contenido de a amilasa de la $arina depende de las condiciones de crecimiento y de cosec$a4 En climas $=medos la tendencia ser( a
$1

<'&EC M4B ! N #D M4B C &M D <4)B LE''E C4L4B A t'ermostable a(amylase from a moderately t'ermop'ilic "acillus subtilis strain for starc' processing4 ,/ de marzo de ,--74 !ournal of *ood Enginnering4 P /G-4 $$ % CCEC , !orgeB produccin y aplicacin de las enzimas industriales4 ,. de febrero de ,--?4 Ce+ista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial4 p 6?

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tener alta acti+idad de a amilasa debido a germinacin de los granos, en tanto que en climas secos el ni+el de a amilasa ser( ba:o debido a escasa germinacin4 Esto conlle+a a grandes diferencias en el contenido de amilasa de diferentes lotes de $arina4 3.4.4 T) !+3&)$ /%1! '#l l$%'1!.20Los procesos encaminados a la produccin

de edulcorantes est(n basados en la degradacin del almidn y $an sido empleados durante muc$os a>os, aunque originalmente se lle+aba a cabo mediante $idrlisis catalizada por (cidos4 Durante el curso del desarrollo y la e;pansin de la transformacin industrial del almidn, se $a producido un cambio de la cat(lisis acida por el uso de enzimas4 La ele+ada especificidad de estas reacciones enzim(ticas, acopladas con la gran acti+idad de las preparaciones disponibles, $a permitido directamente el que pueda ser incrementada y adem(s la formacin de deri+ados indeseables se $a minimizado4 De todas las aplicaciones a escala industrial, la m(s afortunada es la produccin de :arabe de maz con fructosa ele+ada 0&*%<34 El propsito de este proceso es obtener un material de poder edulcorante seme:ante a la sacarosa a partir de una materia prima de ba:o precio 0almidn de maz34 Esta con+ersin requiere el uso secuencial de tres enzimas4 En primer lugar, el almidn 0un polmero de la D2 glucosa3 se degrada parcialmente, empleando alfa2amilasa microbial4 Este material es degradado posteriormente para rendir una solucin donde el carbo$idrato presente est( en forma de D2glucosa en una concentracin del /82/7 A4 La glucosa tiene algunas aplicaciones en las industrias de alimentacin y farmac"uticas, pero su uso est( restringido debido a su solubilidad limitada a concentraciones ele+adas y a su ba:o poder edulcorante comparado al de la sacarosa4 Por estas razones, la glucosa total obtenida se transforma en una

$3

;<C.=<3 >eter( 96??4.3 @ohn. Aecnologia de las en0imas. .ditorial <cribia3 Barago0a7 .spaCa. 1))%. p.111

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mezcla de glucosa y fructosa mediante el empleo de la enzima glucosa ismerasasa4 3.4.5 P)&'-/"&) + '# A-5&+ '# F)-" +.24 Las primeras enzimas empleadas en ctualmente las enzimas p"cticas se usan en el

las industrias de :ugos de frutas fueron las enzimas p"cticas para la clarificacin del :ugo de manzana4 procesamiento de muc$as otras frutas, :unto con amilasas y celulasas4 Durante el procesamiento de los :ugos cuando se desintegran los te:idos +egetales, parte de la pectina, que es un componente estructural de las frutas, pasa a la solucin, parte se satura con el :ugo y parte permanece en las paredes celulares4 Las enzimas p"cticas se usan para facilitar el prensado, la e;traccin del :ugo y la clarificacin ayudando a la separacin del precipitado floculante4 0.7.; F#)$#!" /%1! Al/&B1l%/
28

El almidn pro+eniente de maz, patatas,

cebada, yuca y otras fuentes debe someterse a un tratamiento pre+io con $idrolasas, con ob:eto de producir su licuacin y sacarificacin, antes de $acerlo fermentar mediante le+aduras u otros organismos para obtener alco$ol utilizable4 Estas enzimas son T y Z amilasas y amiloglucosidasas, que pueden agregarse en forma de malta 0cebada germinada3, aunque este proceso es caro4 La malla no slo contiene T y Z amilasas sino tambi"n enzimas que degradan los enlaces T262 7 de las de;trinas limite4 Cecientemente se $an a>adido enzimas bacterianas para suplementar las enzimas endgenas asociadas con el almidn4 Por e:emplo, en los procesos discontinuos americanos para la produccin de alco$ol para bebidas, la adicin de a2amilasa bacteriana durante la coccin para $idrolizar parcialmente el almidn gelatinizado representa una +enta:a, puesto que reduce la +iscosidad de la mezcla facilitando su agitacin y mezclado4 Posteriormente, la mezcla se enfra y despu"s se a>ade a2amilasa bacteriana para continuar la $idrlisis, que se
$

% CCEC , !orgeB produccin y aplicacin de las enzimas industriales4 ,. de febrero de ,--?4 Ce+ista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial4 p 68 $, W#<EM D, !o$n4 Manual de biotecnologa de las enzimas4 Editorial acribia, Karagoza 1 Espa>a4 6/.G4 p4 ??G4

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completa mediante la adicin de amiloglucosidasa4 Despu"s se inoculan en la mezcla le+aduras, de forma que contin=e la sacarificacin y fermentacin simult(neamente $asta el agotamiento de la de;trosa, y se destila el alco$ol4 La produccin comercial de alco$ol industrial, destinado a usarse como carburante en motores de combustin interna se $a incrementado r(pidamente en las =ltimas d"cadas, particularmente en Brasil, que lo obtiene de la fermentacin de Ua ca>a de az=car o de la yuca4 Tambi"n se $a propuesto el empleo de c"lulas inmo+ilizadas4 <e $a obtenido etanol a partir de melazas de ca>a diluidas, no est"riles, durante medio a>o4 3.4.7 I!'-+")% C#).#/#) . La cebada se utiliza tradicionalmente para la

fabricacin de bebidas alco$licas como la cer+eza4 En su produccin se deben considerar dos operaciones distintasJ la maltera y la cer+ecera4 La preparacin de la malta se logra por germinacin de la cebada, durante la cual se incrementa el contenido de alfa2amilasa4 Las enzimas alfa y beta amilasas naturalmente presentes en el grano act=an sobre el almidn produciendo de;trinas y maltosa, que sir+en como sustratos para la fermentacin posterior4 La sacarosa es $idrolizada por al enzima in+ertasa la cual queda di+ida en una mol"cula de glucosa y una mol"cula de fructosa, ambas podran ser asimiladas de forma glucolitica4 Tambi"n las enzimas cumplen la funcin de transportar la maltosa y la maltotriosa a las c"lulas de las le+aduras para posteriormente ser con+ertidas en glucosa por la maltasa264 @tra aplicacin patentada recientemente en industrias inglesas consiste en el uso de la enzima T2acetolactato descarbo;ilasa, aislada de 2nterobacter aerogenes4 Esta protena es capaza de desintegrar o eliminar el T2acetolactato y T2 aceto$idro;ibutirato de la cer+eza reci"n fermentada en ,8 $oras a 6- V% para de este modo conseguir ni+eles de Diacetilo y ,,?2Pentanodiona por deba:o de los
$-

% MPBELL <ara$ L4B T$e continuous breIering of beer Pen lneaQ dsiponible en III4re+ista+irtualpro4com4 consultado -G de no+iembre de ,--94

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umbrales permitidos para productos de este tipo4 <e consigue con ello grandes a$orros427 &ay muc$as enzimas disponibles comercialmente para el proceso cer+ecero, pero todas ellas caen en tres categorasJ proteasas, amilasas y glucanasas4 La accin de estas enzimas durante las primeras etapas consiste en me:orar la licuefaccin del almidn, regular el contenido de az=car y nitrgeno, me:orar la e;traccin, facilitar la filtracin y controlar la turbidez4 En la filtracin del mosto reduccin de las gomas y de la +iscosidad4 En la ebullicin, control de la turbidez, eliminacin final del almidn4 En esta etapa se inacti+an las enzimas4 Durante la fermentacin y maduracin la adicin de enzimas sir+e para controlar la turbidez4 0.7.8 P)&/#+ $%#!"& '# C )!#. Las enzimas importantes para ablandar carne son proteasas de origen +egetal o de microorganismos 0 "acillus subtilis y Aspergillus ory/ae34 Las enzimas se inyectan antes del sacrificio al animal o se trata la carne con las enzimas antes de cocerla, con lo que se logra un franco ablandamiento sin pro+ocar una protelisis importante4 3.4.9 I!'-+")% + '# G) + + 2 A/#%"#+.28 El uso de enzimas en las industrias de

aceites y grasas es muy ba:o, aunque se encuentran disponibles enzimas que pueden resol+er algunos problemas, por e:emplo minimizar los subproductos indeseables4 Las enzimas tambi"n se pueden usar para producir aceites y grasas no+edosas4 Lipasas especficas, pueden seleccionar los (cidos grasos de algunas posiciones del triglic"rido, para incorporar determinados (cidos grasos, sin cambiar los de otras posiciones4 De tal manera que es posible modificar por interesterificacin el contenido de (cidos grasos, o por transesterificacin lograr el reordenamiento de algunos de ellos4 Por e:emplo la mantequilla de cacao se
$:

% <T \E,*4]4B D MM, <4 44 Los tanques cilindro42conicos y el tiempo de guarda de la cer+zeza4 #ndustria cer+ecera4 Pen lineaQ4 Disponible en III4re+ista+irtualpro4com4 %onsultado el 9 de agosto de ,--94
$+

% CCEC , !orgeB produccin y aplicacin de las enzimas industriales4 ,. de febrero de ,--?4 Ce+ista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial4 p 68

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requiere en la produccin de c$ocolate y con frecuencia la disponibilidad y el costo fluct=an ampliamente4 <in embargo, aceites como el de palma son baratos y se encuentra buen abastecimiento4 Lo que se plantea es modificar el aceite de palma por reaccin con (cido este(rico mediante interesterificacin enzim(tica4 La grasa resultante tiene propiedades similares a la mantequilla de cacao 4

0.8 P)&'-//%1! 2 +-+") "& F-#!"#+ '# #!9%$ +. Las c"lulas microbianas son la fuente usual de enzimas para uso industrial e;cepto para algunos enzimas pro+enientes de animales y plantas utilizados tradicionalmente como las proteasas de la papana, ficina y bromelaina, que se utilizan para el ablandamiento de la carne, y la quimosina, empleada en la manufactura del queso4 La inmensa mayora de los enzimas microbianos se producen a partir de apro;imadamente ,G organismos, incluyendo una docena de $ongos, pero se $a calculado que slo apro;imadamente el , ^o de los microorganismos e;istentes en el mundo $an sido estudiados como fuente de enzimas,/4 Tradicionalmente se $an obtenido pocas enzimas de origen animal 0lipasa pancre(tica y tripsina3 debido a que "stas pueden ser reemplazadas por otras similares deri+adas de microorganismos4 <in embargo, los sustitutos microbianos, aunque catalticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en sus propiedades que pueden ser cruciales en el proceso de su aplicacin4 Los recientes a+ances en este campo $an permitido la adaptacin de las t"cnicas del DD recombinante para posibilitar que ciertos genes de mamferos sean clonados en las bacterias o le+aduras idneas, facilitando as la produccin de enzimas originariamente de animales por medio de la tecnologa con+encional de la fermentacin4

$)

W#<EM D, p4,.6

lan4 Manual de biotecnologa de las enzimas4 Editorial

cribia, Karagoza 2 Espa>a4 6/.G4

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Las plantas tambi"n $an sido fuente tradicional de un cierto n=mero de enzimas4 partir del l(te; producido por la papaya, $iguera, pi>a y, en menor grado, otras especies se $a aislado sobre todo, cistein2proteinasas4 Estas plantas tienen la +enta:a de que su l(te; es f(cil de obtener, principalmente a partir de los frutos y utilizando mano de obra no cualificada4 Las enzimas microbianas son m(s =tiles que los deri+ados de las plantas o animales por la gran +ariedad de acti+idades catalticas de que disponen, y porque usualmente pueden obtenerse en cantidades abundantes, baratos, de forma regular y de calidad uniforme, ocasionalmente mediante culti+o de superficie o usualmente mediante t"cnicas de fermentacin aerbica de culti+os profundos, t"cnica muy utilizada en la produccin de antibiticos4 dem(s los enzimas microbianos son en general m(s estables que los $omlogos de las plantas o animales, y su proceso de produccin es m(s f(cil y seguro que el seguido con plantas y animales4 La manipulacin gen"tica y ambiental para incrementar el rendimiento, o la acti+idad enzim(tica de las c"lulas $aciendo a "ste de inter"s constituti+o?-4 Estas t"cnicas son especialmente importantes en el caso de la acti+idad o estabilidad del enzima que sea la etapa limitante en con+ersiones multienzimas, cuando $aya que eliminar los controles de regulacin normales en la sntesis de la enzima deseada, cuando se desea reducir o eliminar la in$ibicin por el substrato o el producto, mecanismo este =ltimo para pre+enir la sobreproduccin del producto de una +a metablica, o para obtener algunas otras caractersticas fa+orables?64 'eneralmente el ob:eti+o es ma;imizar la +elocidad de formacin del enzima y la concentracin de enzima en las c"lulas o en el caldo de fermentacin para minimizar los costos de produccin de la enzima4 El ideal es combinar de forma
3%

;<C.=<3 >eter( 96??4.3 @ohn( Aecnolog"a de las en0imas. .ditorial acribia3 Barago0a D .spaCa. 1))%. p.1-. 31 EF=.G<H3 <lan( Ganual de biotecnolog"a de las en0imas. .ditorial acribia3 Barago0a D .spaCa. p.$+1

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ptima la cepa seleccionada de microorganismo, las condiciones de recuperacin y fermentacin y el equipo m(s apropiado en buenas condiciones de traba :o4 )sualmente, las c"lulas crecen sumergidas, en fermentadores bien agitados y aireados, aunque un n=mero significati+o de enzimas importantes industrialmente se obtienen en fermentadores slidos o semislidos, entre los que se incluyen la lactasa, la a2amilasa y una proteasa de A. ory/ae1 la pectinasa, una proteasa de A. niger1 la a2amilasa de 3'i/opus1 y el cua:o de 4ucor pusi5us&$. Las plantas superiores no son generalmente fuentes satisfactorias de enzimas para usos clnicos e industriales, y acumulan productos de desec$o en las +acuolas4 Estos compuestos son frecuentemente in$ibidores enzim(ticos yMo to2 ;inas, particularmente cuando se o;idan al contacto con el aire4 Estos desec$os, muc$os de los cuales son fenoles, se liberan al romperse la c"lula, contaminando y frecuentemente inacti+ando cualquier enzima e;trado4 Las $idrolasas son ampliamente utilizadas en los procesos industriales4 Dentro de ellas podemos encontrar las enzimas alfa2amilasa, beta2amilasa como las m(s comunes para las sntesis del almidn produciendo productos de ba:o peso mol"cula4 Estas enzimas son producidas, especialmente alfa2amilasa, por gran di+ersidad de microorganismos, Producen amilasas muc$os $ongos del suelo as como bacterias de los g"neros "acillus1 Pseudomonas1 #treptomyces entre otras4 El principal genero que esta siendo tratado para la produccin de dic$a enzima es el bacillus. Las especies registradas como productoras de enzima en este genero son el "acillus lic'eniformis1 "acillus stearot'ermop'ilus1 y "acillus amyloli+uefacien quienes son aplicados en procesos industriales para alimentos, te;tiles, fermentacin, papelera entre otros??4
3$

EF=.G<H3 @ohn. Ganual de biotecnologia de las en0imas. .ditorial acribia3 Barago0a D .spaCa. 1)+,. p.$+$
33

K@E O, Maria4 .oproduction of Alfa( amylase and beta(galatosidase by bacillus subtitulis in comple- organic substrates4,- de diciembre de ,--G4 Bioresource Tec$nology44p 6G-4

22

Tambi"n otros g"neros $an sido reportados en proyectos de in+estigacin4 La especie Aspergillus produce una amplia +ariedad de enzimas e;tracelulares entre las cuales adem(s de estar las amilasas se puede identificar las proteasas4 Aspergillus ri/'opus esta identificado como un gran productor de enzimas ?84 La induccin de amilasa tipo alfa requiere un sustrato que contenga enlaces alfa2 6,8 glucosdicos, adem(s de maltosa, de;trina y almidn4 La 'lucosa, as como es el producto final de la $idrolisis, tiene la posibilidad de reprimir la sntesis de enzima como un mecanismo conocido como represin catabolitica4 <in embargo, se $a encontrado que algunos microorganismos en distintos sustratos que tienen como fuente de carbono a los carbo$idratos no inducen la produccin de amilasas?G4 Este $ec$o contrasta con los registrados en artculos de in+estigacin y compa>as dedicadas a la produccin de enzimas donde la fuente de produccin de las protenas son microorganismos4 La produccin industrial $a desarrollado t"cnicas de apro+ec$amiento de recursos o residuos de produccin de di+ersas industrias con el ob:eto de adquirir enzimas utilizando sustratos de ba:o costo, as como los desec$os agrcolas4 En a>os recientes, se $a presentado un incremento en el esfuerzo y la aplicacin eficiente del bagazo de ca>a de az=car como medio de produccin4 Este es un subproducto agroindustrial de e;tensa cadenas celulsicas4 Esta es una importante fuente de carbono que $a sido empleada en los =ltimos a>os para la produccin de enzimas y a su +es la fermentacin de azucares para la elaboracin de etanol4 <e $a

< L < &, MabelB C@DC#')EK C, MariluB PECEK '4, ManuelB PECEK C, Cenato4 Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on two wastes from food industries. -G de marzo de ,--G4 !ournal of *ood Engineering4 p /84
3,

D & < Ely, W LDEM C#D Mirela M.6 .ontrol of amylase production and growt' c'aracteristics of Aspergillus oc'raceus 4 re+ista latinoamericana de microbiologia4 Nol _64 Enero de ,--,4 p4G

23

identificado que el microorganismo optimo para reproducirse en este medio y sintetizar alfa2amilasa es el "acillus subtilis&74 Los medios de culti+o $an facilitado para los microorganismos el desarrollo de enzimas con propiedades fsico2qumicas muy deseables4 La produccin de alfa2 amilasa puede darse en medio sumergido o en estado solido o por procedimientos de fermentacin4 La concentracin de metabolitos para el crecimiento de los agentes microbiales es importante4 #nfluye directamente la composicin del medio as como las fuentes de carbono, de nitrgeno y el contenido de sales inorg(nicas374

En cuanto a t"rminos de aplicabilidad industrial, es necesario estudiar la produccin de enzimas y analizar el factor de termoestabilidad, ya que se $a demostrado que la temperatura esta ligada directamente a la +elocidad de reaccin de la enzima, menor +iscosidad en el sustrato y disminucin de la contaminacin microbiana4 Los microorganismos apropiados para la produccin de enzimas deben tener ciertas propiedades como rapidez de crecimiento, adaptacin a nutrientes relati+amente baratos y sin necesidad de inductores4 dem(s, se debe obtener un alto rendimiento de enzima, de forma que sea f(cil aislarlo, purificarlo y concentrarlo sin que se produzca la formacin concomitante de metabolitos t;icos o inmunog"nicos?.4 Tambi"n puede ser una estrategia =til la de seleccionar cepas que $iperproduzcan enzimas a partir de organismos gen"ticamente modificados @M' que no tengan
3-

C ! '@P L D 'obinat$, OC#<&D D %$andrara:B a(Amylase production from catabolite derepressed "acillus subtilis 8..9%& utili/ing sugarcane bagasse 'ydrolysate -6 de :unio de ,--94 Bioresource Tec$onology4 p4,
37

D!EOC#*2D O&M@)%&E <4B '&EC#B#2 @)LM# KB MEC #&# K4 BEDD M@)D L44 Application of a statistical design to t'e optimi/ation of culture medium for a(amylase production by Aspergillus niger A:.. 97;%; grown on orange waste poIer4 66 de marzo de ,--G4 !ournal of *ood Engineering4 p 6/6
3+

EF=.G<H3 <lan( Ganual de biotecnolog"a de las en0imas. .ditorial <cribia =.<. Barago0a7 .spaCa. 1)+,. >.$:1

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necesidad de inductores debido a que sus centros represores est(n inacti+os, a que tienen una ba:a represin por los catabolitos, a que sufren retroin$ibicin o a que tienen enzimas relati+amente resistentes a la in$ibicin por el producto final4 De $ec$o, a pesar de los enormes a+ances obtenidos recientemente en el campo de la ingeniera gen"tica, las t"cnicas cl(sicas de seleccin de enzimas son toda+a muy producti+as, particularmente cuando se estudian ambientes nue+os yMo e;ticos, para buscar c"lulas microbianas que desarrollen enzimas con propiedades e;epcionales4 Entre ellos destacan los enzimas clorantes obtenidos a partir de microorganismos marinos, y un enzima que produce un nue+o az=car, la isomatulosa, de forma muy producti+a a partir de una bacteria patgena del ruibarbo4 Muy recientemente se $an $ec$o descubrimientos m(s e;cepcionales si cabe, por e:emplo, los microorganismos que crecen a unos $<% H% en fuentes +olc(nicas en aguas marinas profundas que poseen enzimas e;tremadamente estables al calor, o un microorganismo del intestino de un gusano que perfora la madera, que es capaz de degradar la celulosa y de fi:ar el nitrgeno ?/4 En resumen, la mayora de los enzimas empleados com=nmente en la industria son de origen microbiano y se producen por fermentacin sumergida aerobia con+encional, que permite un mayor control de las condiciones de crecimiento que la fermentacin en estado slido4 <e sabe muc$o acerca de la seleccin de cepas de organismos y condiciones de culti+o, aunque menos sobre la regulacin de la sntesis, degradacin y secrecin de la enzima por el organismo productor4 Estas enzimas son con frecuencia e;tracelulares, lo que facilita su aislamiento y purificacin4

7. O*6#"%.&+

3)

EF=.G<H3 <lan( Ganual de biotecnolog"a de las en0imas. .ditorial <cribia =.<. Barago0a7 .spaCa. 1)+,. >.$:$

25

7.1 G#!#) l @btener amilasa microbiana por fermentacin lquido para aplicacin en procesos agroindustriales de alco$ol carburante a base de almidones4 7.2 E+(#/@3%/&+ #dentificar microorganismos productores de enzimas amilasa mediante t"cnicas de aislamiento microbiolgicas Determinar la cin"tica del crecimiento de los microorganismos aislados mediante fermentacin en estado lquido4 %omparar la acti+idad del comple:o enzim(tico obtenido con respecto a la acti+idad de una enzima comercial <T C'ED --64

8. M#"&'&l&5@ P)&(-#+" : 8.1 A%+l $%#!"& # %'#!"%3%/ /%1! '# l&+ $%/)&&)5 !%+$&+ Los microorganismos ser(n obtenidos de c$ips de yuca e;puestos a la intemperie a contaminacin ambiental, por un tiempo de entre 6- a 6G das4 Para ello se realizaran c$ip con grosores comprendido entre 6 y 6G mm4 F se dispondr(n en bande:as4 )na +ez obtenido el o los microorganismos que est"n e:erciendo un proceso degradati+o de los c$ips, se pasaran a una solucin con 6-A de $arina de yuca, con agitacin constante a 6,- rpm, durante G das, al cabo del cual se realizaran pruebas de azucares reductores, para determinar el o los microorganismos con mayor capacidad de degradacin, y se sembraran en medio solido de FP<, para su purificacin e identificacin4

26

5.2.1

M#'%& S1l%'& '# YPS 0Feast Peptone <oluble starc$3 4 404 De acuerdo con

distintos microorganismos presentes en la solucin de yuca, se aislar(n cada uno de ellos de manera independiente y se colocaran en ca:as de petri esterilizadas sobre las que se ser+ir( medio microbiolgico FP<4 Para descartar contaminacin ambiental, se sembraran , blancos con 6 ml de agua destilada est"ril sobre medio el mismo culti+o4 8.2.2 M#'%& ( ) 3#)$#!" /%1!. <e preparan 9-- ml, en un erlenmeyer de 6 Litro, de medio de culti+o FP< lquido4 %onteniendo en 0gMl3J -4G de e;tracto de le+aduraB O&,P@8, 6-B 0D&83,<@8, 6-4GB Mg<@8 9&,@, -4?B %a%l,, -4GB *e<@8 9&,@, -4-6?B Mn<@8 9&,@, -4--8B Kn<@8 &,@, -4--8, %o%l 7&,@, -4--79 y $arina de yuca al 6 6-A como fuente de carbono, se Esterilizar(n a 66-V% durante 6G minutos y se colocar(n en agitacin orbital a 6,- r4p4m por un periodo de G das4 El medio de culti+o para fomentacin ser( inoculado con un comple:o de dos microorganismos aislados, utilizando G ml de solucin del comple:o microbial4
5.2.3

Cuantificacin de Biomasa del complejo 41. <e $ar( determinacin por el

m"todo de peso seco y el m"todo de protenas . Peso Seco. <e tomaran una muestra de ? ml cada ? $oras durante G das4 Las muestra de lle+aran $asta peso seco constante en una estufa a 6-G grados4

B) ,E4 4 64 D@, <4 4 ! ME<, D4 B4B CaI starc$ degrading amylase production by mi;ed culture of Aspergillus niger and #acc'aromyces cerevisae groIn on sorg$um pomace4 EnJ African Journal of Biotechnology. Vol. 4 (8), pp. 785-790, August 2005.

IJH=J64< Boe3 4F<IJ>J64J67IKLF<IFD.= Garia. Co7production o* a7amylase and b7 galactosidase by ?acillus subtilis in comple/ organic substrates. ?ioresource Aechnology. $% de diciembre de $%%,. p. 1,$

27

 Determinacin de protenas42. <e tomara ? ml de medio cada ? $oras4 El proceso se lle+ar( a cabo realizando c$oque t"rmico y centrifugado de las muestras durante 6- minutos a G--- rpm4 El sobrenadante obtenido se le determinara protenas totales por el m"todo de Biuret4 Las muestras se leer(n a una longitud de onda de GG- nm4 Los datos obtenidos se compararan con una cur+a patrn de B< , para determinar la concentracin de protenas presentes en la muestra4 8.2.7 edicin de producto8?. <e tomar(n ? ml del medio de culti+o, cada ?

$oras durante G das y se realizar( prueba de azucares reductores con ?,G acido dinitrosaliclico, las lecturas se $ar(n a G8- nm, para glucosa y a G,- nm para maltosa, los datos obtenidos se comparan con cur+as patrones de glucosa y maltosa respecti+amente4 8.2.8 edicin de sustrato44. <e tomaran ? ml de muestra de la fermentacin a las cuales se le se agregan del reacti+o yoduro2yodato y se

cada ? $oras,

realizaran lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 7,- nm4 Los datos se compararan con la cur+a est(ndar preparada con $arina de yuca para determinar la concentracin presente de sustrato en la muestra4 8.2.; Cur!a '# C l%*) /%1! ( ) ()&"#@! . <e $ar(n determinaciones de al -,G A y se

protenas partiendo de una protena conocida 0 lb=mina del suero Bo+ino o B< de <igma34 Para ello se preparara una solucin est(ndar de B< diluir(n como se muestra en la Tabla ?4

$ =9.E<4. =atish D.( ><HDFA <niruddha ?. 9ydrolysis o* soluble starch using ?acillus licheni*ormis a7amylase immobili0ed on superporous C.4?.<D=. $+ de *ebrero de $%%:. p. ))+ 3 <=;9.L G.3 @<M<FD G. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. @ornal J* Nood .ngineering. $) de mar0o de $%%-. p.),1

C9.LLK 9.G.( 9J==<FH Aowhid( <HE<L G.H. Extracellular Glucoamylase from the Isolate Aspergillus fumigates. >aOistan @ournal o* ?iological =ciences. $%% . p. 1)+).

28

Tabla ?4 Diluciones para la construccin de la cur+a de calibracin para Biuret4

Tubos <olucin 0ml3 Biuret <olucin Est(ndar B< &,@ 6 .4,4-4, .4647 -48 ? .464, -4. 8 .4-4. 64, G .4-48 647 7 .4-4,4-

<e mezcla bien, y se de:a reposar por ?- minutos, para leer en el a una `4 a GGnm 8.2.= C-). '# C l%*) /%1! ( ) M l"&+ 2 Gl-/&+ . <e establecer( una cur+a con D2Maltosa y otra con D2glucosa, para con+ertir las lecturas de absorbancia de las muestras de fermentacin a unidades de acti+idad enzim(tica de la amilasa, es decir, la liberacin de un micromoles de az=car reductor, calculado como maltosa o glucosa por minuto ba:o las condiciones del ensayo 0+er Tabla 834 Tabla 84 Diluciones para la construccin de la cur+a de calibracin para Maltosa4
Tubos <olucin 0ml3 DD< <olucin Est(ndar Maltosa o 'lucosa al -,GA &,@ 6 64,4G 74G , 64,494? 6464G 94G 8 6464.4G 64-4G .4G 7 64-4/4-

las solucin de D2maltosa y D2glucosa se les adicionara DD< y se pondr(n en agua $ir+iendo por G minutos, se de:a reposar, y se le agrega agua $asta completar 6- ml seg=n la tabla, las lecturas se realizaran a ` a G,- nm para maltosa y a G8- nm para glucosa El comple:o enzim(ticos obtenido en cada muestra en los diferentes das, se leer(n a la misma longitud de onda que las cur+as de calibracin4 Para ello se

29

realizaran ? repeticiones para cada muestra, tanto para determinar maltosas, glucosas y protenas4

8.2.8 C%!C"%/

'#l /&$(l#6& #!9%$:"%/&.

El comportamiento enzim(tico del se comparara con el comple:o

comple:o obtenido por la fermentacin lquida

comercial de amilasa 0stargen --63, determinando los factores que afectan la accin cataltica del comple:o de amilasas, analiz(ndolos ba:o un modelo superficie de respuesta, con dise>o compuesto centralJ ,^? b principal, de acuerdo con los ni+eles y factores mostrados en la tabla G4 Los datos obtenidos se analizaran con el softIare estadstico <tatgrap$ics +ersin G46 Tabla G4 *actores y ni+eles para e+aluar la acti+idad enzim(tica
F /"&)#+ Dosis p& Temperatura U!%' '#+ ml de caldo enzim(ticoMg de pulpa base seca dimensional H% N%.#l#+ I!3#)%&) S-(#)%&) -4G 648 G4G ?-4G-

;. R#+-l" '&+ E+(#) '&+ La base del estudio, an(lisis, desarrollo y aplicacin de este proyecto es producir un comple:o de enzimas amilasas a partir de $ongos, con el ob:eto de determinar la aplicabilidad de dic$as protenas en los procesos agroindustriales del departamento4 Este comple:o ser+ir( como base para la planeacin de muc$os procedimientos industriales como la $idrlisis del almidn, el cual presenta ele+ados costos en las empresas del departamento de %rdoba, especialmente plantas de biocarburantes4

=. E+") "#5% C&$-!%/ /%1!:

30

Los resultados de este proyecto ser(n editados mediante formatos de informes o traba:os de in+estigacin en re+istas y ponencias en encuentros de in+estigacion4 dem(s, 8. E+") "#5% + /&! #l $#'%& tra+"s de conferencias, foros yMo ponencias institucionales internas yMo e;ternas, es un medio apto para la promulgacin del ob:eto, m"todo, resultados y alcance del estudio de este proyecto4 Ba:o este concepto, se desea di+ulgar el propsito de lle+ar a cabo este proyecto y a su +ez demostrar la realidad de los efectos que traera consigo aplicarlo en escala industrial4

<. C)&!&5) $ '# /"%.%' '#+

T%#$(& A/"%.%' ' Cecopilacin de bibliografa Ta:ado de c$ips de yuca y seleccin de lugar para contaminacin microbial islamiento e #dentificacin de microorganismos Preparacin de los medios de culti+o solido y liquido Muestreo y an(lisis del medio Estudio de la cin"tica %omparacin de cin"tica con <T C'ED --6 #nterpretacin de los resultados Publicacin de informe final 1 2 0 7 8 M#+#+ ; = 8 < 10 11 12

31

10. B%*l%&5) 3@ B), E4 4 64 D@, <4 4 ! ME<, D4 B4B CaI starc$ degrading amylase production by mi;ed culture of Aspergillus niger and #acc'aromyces cerevisae groIn on sorg$um pomace4 EnJ frican !ournal of Biotec$nology4 Nol4 8 0.3, pp4 9.G29/-, ugust ,--G <'&EC M4B ! N #D M4B C &M D <4)B LE''E C4L4B A t'ermostable a( amylase from a moderately t'ermop'ilic "acillus subtilis strain for starc' processing4 ,/ de marzo de ,--74 !ournal of *ood Engineering4 % MPBELL <ara$ L4B T$e continuous breIering of beer Pen lneaQ dsiponible en III4re+ista+irtualpro4com4 consultado -G de no+iembre de ,--94 % CCEC , !orgeB produccin y aplicacin de las enzimas industriales4 ,. de febrero de ,--?4 Ce+ista de biotecnologa en el sector agropecuario y agroindustrial4 % <T \E,*4]4B D MM, <4 4 Los tanques cilindro2cnicos y el tiempo de guarda de la cer+eza4 #ndustria cer+ecera4 Pen lineaQ4 Disponible en III4re+ista+irtualpro4com4 %onsultado el 9 de agosto de ,--94

% <TC@ %4B D N < %4B % C@ @B P#\EC@< F4 Obtencin de amilasas fngicas a partir de Aspergillus sp. aislado de semillas de lentejas. %onsultado en pagina oficial de )ni+ersidad !orge Tadeo Lozano, Bogot( 1 %olombia4 III4utadeo4edu4co4 *ec$a de consultaJ-, de marzo de ,--.4

%&ECCF &4M4B &@<< #D, ToI$idB DW C M4D4 2-tracellular =lucoamylase from t'e >solate Aspergillus fumigates. PaListan !ournal of Biological <ciences4 ,--84 p4 6/./ D!EOC#*2D O&M@)%&E <4B '&EC#B#2 @)LM# KB MEC #&# K4 BEDD M@)D L4 pplication of a statistical design to t$e optimization of culture medium for a2amylase production by spergillus niger T%% 678-8 groIn on orange Iaste poIer4 66 de marzo de ,--G4 !ournal of *ood Engineering4
32

D &N#, #ra:B EMT# K#, 'iti 4 Production of " Amylase by Flocculant Yeast. Pa istan !ournal of "iological #ciences. $%%& #)BMB, Enzyme Domenclature4 Pen lneaQ4 R$ttpJMMIII4c$em4qmul4ac4uLMiubmbMenzymeME%?M,M6M,4$tmlS4 Pconsultado el 6- de febrero de ,--.Q M#<OEN#%& *4B %oc$ran, B4B Lunday, D4 Euantitati+e nalysis of mylase Enzyme Oinetics4 %onsultado en R $ttpJMMIII4tamu2 commerce4eduMfacultyMfmisLe+ic$MS4 ?consultadoJ-6 de marzo de ,--.Q4 M#T#D#EC#, <ydneiB <@)K , nneB <%&C DO, ugusto, &EDD#D', Marilene4 Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus nigerJ comparati+e study Iit$ commercial detergent formulations4 Bioresource tec$nology4 6/ de agosto de ,--G4 M)DD@ L#MEDT C#@. Aplicacin de las en/imas en la produccin industrial. %onsultado enJ $ttpJMMIII4alimentariaonline4comMapadminMimgMuploadMM --,[enzimas8W<*4 pdf. ?consultadoJ6- de febrero de ,--.Q @L#NE#C !oao CB N#E#C dairB K %K)O B4 PriscilaB %@CDED)D<# BeatrizB M #D CD# !anaYna 4B P)C' TT@ EduardoB L !@L@ *ranco4 "eta(amylase e-pression and starc' degradation during banana ripening 4 6- de no+iembre de ,--G4 Post$a+erst Biology and Tec$nology @L)< D!@ 4 #saacB D' %&# 4 Edit$B #&)@M @4 *lorence4 .omparative studies on a(amylases from malted mai/e )0ea mays*1millet )2leusine coracana* and #org'um )#org'um4 G de mayo de ,--74 %arbo$yfrates Polymers C ! '@P L D 'obinat$, OC#<&D D %$andrara:B a(Amylase production from catabolite derepressed "acillus subtilis 8..9%& utili/ing sugarcane bagasse 'ydrolysate -6 de :unio de ,--94 Bioresource Tec$onology4 C M %& DDC D <umitraB P TEL nil, M D& N D Oesa+anB %& DDC D <and$ya4 Alp'a Amylase from a Fungal .ulture =rown on Oil .a es and >ts Properties. Brazilian arc$i+es of biology and tec$onology4 !unio de ,--84 < L < &, MabelB C@DC#')EK C, MariluB PECEK '4, ManuelB PECEK C, Cenato4 Amylase production by Aspergillus niger in submerged cultivation on
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two wastes from food industries. -G de marzo de ,--G4 !ournal of *ood Engineering4 <&EW LE <atis$ D4B P DD#T nirudd$a B4 &ydrolysis of soluble starc$ using Bacillus lic$eniformis a2amylase immobilized on superporous %ELBE D<4 ,. de febrero de ,--9 TC#P T&# Palla+iB LE''#@, LeilaB M D<*ELD, !o$annaB )LBC#%&2 &@*M DD, CenateB Oayast$a, r+ind4 lp$a2 amylase of mung bean 0+igna radiata3 correlation of bioc$emical properties and terciary structureby $omology modelling4 ,? de mayo de ,--94 P$ytoc$emistry W#<EM D, lanB Manual de biotecnologa de las enzimas4 Editorial <4 4 Karagoza2 Espa>a4 6/.G4 cribia

K@E O, Maria4 .oproduction of Alfa( amylase and beta(galatosidase by bacillus subtitulis in comple- organic substrates 4,- de diciembre de ,--G4 Bioresource Tec$nology

11. "suarios Directos e #ndirectos Entre los interesados en los resultados de este proyecto se encuentranJ Plantas de alco$ol carburante 'rupos y centros de in+estigaciones 12. Posi$les Pares %!aluadores N&$*)#+ 2 A(#ll%'&+ C )5& I!+"%"-/%1! T#lC3&!&

34

D.

P)#+-(-#+"&

Tabla 1. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR FUENTES DE FINANCIACION RUBROS

PEC<@D L EE)#P@ M TEC# LE< N# !E< B#BL#@'C *# c <@*TW CE P)BL#% %#@DE<c <ECN#%#@< TE%D#%@< %@D<TC)%%#@DE< M DTED#M#EDT@ DM#D#<TC %#@D @TC@<c

FUENTES F /-l" ' '# I!5#!%#)@ A5)&%!'-+")% l 5 6,4?/.48-5 648.-4---

P ")&/%! '&) 5 ?-4.784-85 ,48G?4.86

TOTAL 5 6,4?/.48-5 ?,4?884-85 ,48G?4.86

TOTAL
Tabla 2. PRESUPUESTO GLOBAL DE LA PROPUESTA POR VIGENCIAS RUBROS
PEC<@D L EE)#P@ M TEC# LE< N# !E< B#BL#@'C *# <@*TW CE P)BL#% %#@DE< <ECN#%#@< TE%D#%@< %@D<TC)%%#@DE< M DTED#M#EDT@ DM#D#<TC %#@D @TC@<

D 7=.1<;.281

AEO 1

AEO 2

AEO 0

TOTAL

5 6,4?/.48-5 ?,4?884-8-

5 6,4?/.48-5 ?,4?884-8-

5 ,48G?4.86

5 ,48G?4.86

TOTAL

D 7=.1<;.281

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Tabla 3. DESCRIPCION DE LOS GASTOS DE PERSONAL

P )"%/%( !"# N&$*)# Eder Durango Ballesteros lfonso Bautista !im"nez #bet$ %epeda !im"nez &"ctor Tobn 'uzm(n FORMACION Ms%4 Biotecnologa Ms%4 Microbiologa Esp, #ng4 De alimentos4 #ng4 groindustrial FUNCION DEDICACION FORAS 84 ,4 ,4 74 DEDICACION N&. MESES 6, G G 6, RECURSOSG#! (#+&+ /&l&$*% !&+H

FUENTE 1 *ac4de #ng4 groindustrial *ac4 de #ng4 groindustrial *ac4 de #ng4 groindustrial *ac4 de #ng4 groindustrial

TOTAL

#n+estigador Principal %oin+estigador %oin+estigador u;iliar

5 8477G47-5 /9,4--5 /9,4--5 G49..4.-D 12.0<8.700

TOTAL

Tabla 4. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA ADQUIRIR

EQUIPO Planc$a de calentamiento marca sc$ott 2 modelo slL,2 con AUSTIFICACION Preparacin de muestras y pruebas de an(lisis %ensar temperatura de las muestras n(lisis y determinacin de compuestos en muestra %onser+acin de muestras %ontrol de tiempo en las pruebas &omogenizacin y preparacin de medios Medicin de alco$ol RECURSOS

P ")&/%! '&) ] ] ] ] ] ] ]

TOTAL

placa en cer(mica
Termmetro digital Espectrofotmetro De+era2congelador de / pies

%ronometro digital4 %assio modelo $s2? gitador magnetico Cefractmetro digital port(til TOTAL

5 7,-4--5 .7?4-85 ,G4---4--5 9--4--5 .64--5 ,46--4--5 64G--4--D 00.8;7.070

Tabla 5. DESCRIPCION DE LOS EQUIPOS QUE PLANEA UTILIZAR

EQUIPO
gitador orbital %entrfuga eba,p&metro Balanza analitica

AUSTIFICACION
gitacin de los medios de culti+o <eparacin de slidos Medicin de p$ de las muestras y soluciones Pesa:e de reacti+os para soluciones

UNIDADGESH A LA CUAL PERTENECE EL EQUIPO

Lab4 De biotecnologa Lab4 De biotecnologa Lab4 De biotecnologa Lab4 De biotecnologa

F&) + '# +%5! /%1! l ()&2#/"& . , 6 ,

V l&) B&)

V l&) "&" l 5 .--4--5 ,.-4--5 6G-4--5 ,G-4--D 1.780.000

TOTAL

Tabla . DESCRIPCIONDE LOS !ATERIALES A UTILIZAR

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MATERIAL
Erlenmeyer ,G- ml Erlenmeyer 7-- ml Erlenmeyer 6--- ml Transferpipetas de 6-- a 6---

AUSTIFICACION
Cecipiente para culti+os Cecipiente para culti+os Cecipiente para culti+os %ontrol de muestras tomadas

RECURSOS U!%' '#+ P ")&/%! '&) A/ 'C$%/ + 5 ,4/--,-5 84-7-,-5 ?8.,-5 ,4?,-,-5 ?./4975 6,64.-5 6?749.9 5 ,-748.5 ,6G4779 5 ,9G4G-5 ?6?4,-5 G?4G,, 5 ,774.-5 ,?,4--5 68?4?97 5 ./4?,-

TOTAL 5 ,4/--,-5 84-7-,-5 ?8.,-5 ,4?,-,-5 ?./4975 6,64.-5 6?749.9 5 ,-748.5 ,6G4779 5 ,9G4G-5 ?6?4,-5 G?4G,, 5 ,774.-5 ,?,4--5 68?4?97 5 ./4?,D 2.780.871

glucosa an$idra 0G--g3 maltosa 06--g3 B< 0G--'3 agar pda e;tracto de le+adura 0G--g3 sulfato acido de potasio0,G-g3 sulfato de magnesio $epta$idratado0G--g3 sulfato de manganeso tetra$idratado06--g3 sulfato de zinc mono$idratado0G--g3 sulfato de $ierro $epta$idratado0G--g3 cloruro de cobalto $e;a$idratado06,Gg3 sulfato de amonio06Lg3 TOTAL

Preparacin de est(ndares para cur+as de calibracin Preparacin de est(ndares para cur+as de calibracin Preparacin de est(ndares para cur+as de calibracin Multiplicacin y aislamiento de microorganismos <uplemento para el medio de culti+o <uplemento para el medio de culti+o <uplemento para el medio de culti+o <uplemento para el medio de culti+o <uplemento para el medio de culti+o <uplemento para el medio de culti+o <uplemento para el medio de culti+o <uplemento para el medio de culti+o

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