Alumnas:

Aguilar Garduo Isis Gizeh Hurtado Zendon Yetlanezi Serrano Vela Rosa Elena
Profesor: Erik Gilbert Garca Asignatura:

10090667 10090737 10090698

BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL
Semestre: 7 Grupo: VA

OBJETIVOS
General:
Obtener biodiesel a travs de las plumas de pollo

Especficos:
Verificar si se obtiene aceite a travs de las plumas de pollo. Observar si las plumas de pollo pueden hidrolizarse. Aprender a esterilizar y preparar el medio de cultivo adecuado para la fermentacin de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Aprender a cultivar la levadura y observar en el microscopio el crecimiento de la levadura.

INTRODUCCIN
La industria avcola genera ms de cinco millones de toneladas de plumas de pollo cada ao en todo el mundo, un material que hasta ahora no se poda aprovechar para otros usos. Estos residuos agroindustriales disponibles, son una fuente importante de celulosa y por tanto se pueden considerar como materias primas para la obtencin de alcohol combustible luego de ser convertidos en azcares por medio de procesos de hidrlisis qumica o enzimtica. La siguiente prctica se hizo con la finalidad de obtener en un principio de obtener biodiesel a travs las plumas de gallina ponindolas a hervir con agua de grifo, al no lograr nuestro objetivo, sometimos las plumas de gallina a una hidrolisis cida utilizando HCl 2N obteniendo as aminocidos digeribles con los cuales preparamos un medio de cultivo con todas la fuentes necesarias para su crecimiento y que resulto un poco favorable para sembrar le levadura de cerveza. (Saccharomyces cerevisiae).Despus de la fermentacin y centrifugacin obtuvimos biomasa de levadura, sin embargo, no se alcanzaron los mejores resultados por lo que destilamos y obtuvimos protena la cual pudimos identificar por el olor que desprenda, y no etanol, que era la sustancia esperada. Las plumas contienen aproximadamente 90% de protenas, compuestas fundamentalmente de queratinas .Los investigadores pretenden aprovechar las propiedades de aislamiento trmico y acstico que ofrece la queratina.

MARCO TERICO
Hidrolisis de las plumas de pollo Las plumas contienen aproximadamente 90% de protenas, compuestas fundamentalmente de queratinas, protenas de tipo fibroso cuyas cadenas polipeptdicas

se ordenan en filamentos. Las queratinas de las plumas estn forman una estructura secundaria, la a-hlice en la que se forman enlaces disulfuro entre grupos SH de cistenas vecinas que estabilizan la estructura e impiden el ataque por las enzimas digestivas de los animales superiores Los tratamientos para mejorar la digestibilidad se basan en provocar la hidrlisis de la queratina por ruptura de los enlaces disulfuro a fin de obtener aminocidos libres o pptidos. Uno de los procedimientos utilizados consiste en someter las plumas a condiciones de alta temperatura y presin durante un tiempo determinado. . La mayora de los autores consultados coinciden en que la hidrlisis cida provoca la destruccin del triptofano, por lo que en general se recomienda realizar una hidrlisis alcalina. La levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae ) Las utilidades industriales ms importantes de esta levadura son la produccin de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dixido de carbono y etanol durante el proceso de fermentacin. Bsicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metablicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energtico, y por tanto no realiza la fermentacin. Nutricin de S. cerevisiae Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varan desde los carbohidratos hasta los aminocidos. Adems, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azcares ha sido tradicionalmente empleada para la caracterizacin de las distintas razas que esta especie presenta. Entre los azcares que puede utilizar estn monosacaridos como la glucosa, fructosa,manosa y galactosa, entre otros. Tambin son capaces de utilizar disacridos como la maltosa y la sacarosa y trisacridos como la rafinosa. Uno de los azcares que no puede metabolizar es la lactosa, utilizndose este azcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces lactis . Tambin es capaz de utilizar otras fuentes de carbono distintas a carbohidratos y aminocidos. Entre las ms destacadas se encuentra la capacidad de utilizar tanto etanol como glicerol. Por norma general, las levaduras mantienen dos tipos de metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones en las que existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la tendencia es a realizar una fermentacin alcohlica de estos, es decir, se realiza la gluclisis y posteriormente se forma etanol. Una vez que estos azcares escasean, se produce la respiracin del etanol, va ciclo de Krebs. Evolutivamente esto es un proceso que, a priori, no es ventajoso por ser energticamente desfavorable para la reproduccin del organismo, dado que se obtiene mucha menos energa en el primer proceso que en el segundo. No obstante, la gran mayora de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha entendido como un proceso de competencia por sustrato. Las levaduras, adems de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrgeno como podran ser el amonio, la urea o distintos tipos de aminocidos como fuentes de fsforo. Adems, son necesarias vitaminas como la Biotina, tambin llamada Vitamina H, y distintos elementos traza.

Preparacin de un medio de cultivo de levaduras Los nutrientes utilizados por las levaduras pueden ser divididos en macro-nutrientes y micro-nutrientes. Sin una cantidad mnima de estos nutrientes, las levaduras no pueden llevar a cabo proceso fisiolgicos bsicos como la sntesis de protenas estructurales, generacin de lpidos para la membrana celular, etc. Sin estos nutrientes las levaduras tampoco podrn llevar a cabo procesos metablicos bsicos como divisin celular, respiracin, etc. Los macro-nutrientes bsicos para las levaduras son la glucosa y la fructosa. Por otro lado, los micro-nutrientes que ms comnmente son requeridos por las levaduras son nitrgeno, fsforo, potasio, cinc, magnesio, etc. La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes: a. b. Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro; y Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc..

c.

Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mezclas de fosfatos o de carbonato de calcio o como ms generalmente se hace, con agregados peridicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma ms conveniente mediante un control automtico de pH. El diseo de un medio especfico para la produccin de cido ctrico debe considerar la influencia negativa que para el proceso tiene un exceso de hierro en su composicin; por lo tanto dicho medio debe disearse de manera tal que su preparacin (a partir de diversas materias primas) considere una eliminacin total del hierro y posterior agregado del mismo en cantidades controladas.

METODOLOGA

Lavado y tratado de plumas

Material 1 Matraz Erlenmeyer de 2 L 1 Barra Magntica 1 Agitador de vidrio 1 Parrilla elctrica 1 Probeta graduada de 250 ml 1 Embudo de decantacin 1 Olla metlica 1 Papel de estraza 1 Topper de plstico 1. Se consiguen plumas de pollo hasta casi llenar una bolsa de plstico 2. Lavar cuidadosamente las plumas de pollo hasta que el agua salga limpia y se hierven. 3. Se separan las plumas de pollo y la solucin lquida, se ponen las plumas de pollo en un papel de estraza para meterlas al horno, la solucin liquida se pone en un matraz Erlenmeyer de dos litros previamente lavado con la barra magntica y le agregamos una gota de hexano reutilizable y una gota de ter etlico (Agitndolo en la parrilla elctrica) 4. Se deja reposar la solucin lquida por una semana para observar si hay una separacin de aceite 5. Como no se observ dicha separacin, se tira la solucin lquida y se hidroliza las plumas de pollo con el HCl Reactivos Agua destilada Hexano reciclable ter etlico Plumas de pollo

Solucin liquida

Se vierte una gota de hexano reutilizable y una gota de ter etlico

Plumas de pollo lavadas

Plumas de pollo en un papel de estraza

Hidrlisis de plumas de pollo

Material 1 Matraz Erlenmeyer de 2 L 1 Refrigerante de rosario 1 Soporte universal 1 Matraz de bola esmerilado 2 Pinzas de tres dedos 2 Pinzas de nuez 2 Mangueras ltex 1 Parrilla elctrica 1 Tina de plstico 1 Bomba acutica 1 Barra magntica 1 Corcho 1 Cinta tefln 1 Matraz aforado de 1L 1 Piseta 6. 7. 8. 9. Reactivos HCl Agua destilada Fenolftalena NaOH Solucin Buffer de 4 Solucin Buffer de 7 Hielo

Se pesan las plumas de pollo en una balanza granataria Preparar un litro de solucin de HCl a 2 N Se instala el aparato de reflujo Se colocan las plumas de pollo con el litro de HCl en el matraz de bolas esmerilado y la barra magntica para ponerlo en la parrilla elctrica, se sujeta bien el matraz de bola con el refrigerante de rosario con un corcho y cinta tefln para evitar desprendimiento de vapor para as calentar la solucin y agitarla cuidadosamente hasta desintegrar las plumas de pollo (Aproximadamente se tarda 2 horas 8 minutos). 10. Se deja enfriar la solucin para despus neutralizarla con NaOH en un vaso de precipitado de 1L (Se neutraliza agregndole unas gotas de fenolftalena y agregando NaOH hasta observar un color rosita) y se mide el PH en el potencimetro, si se pasa de bsico se le agrega acido muritico hasta observar en el potencimetro el PH de 7. 11. Se deja en el cuarto de refrigeracin por doce das

Pesado de plumas de pollo

Preparacin de 1L de HCl a 2N

Instalacin del aparato de reflujo

Desintegrando plumas de pollo

Hidrlisis de las plumas de pollo

Mezcla de Plumas de pollo con HCl

Plumas de pollo desintegradas

Neutralizacin de la solucin

Solucin neutralizada

Realizacin para el medio de cultivo

Material 1 Embudo de polietileno 2 Papel filtro 1 Matraz Erlenmeyer de 1 L 1 Vaso de precipitado de 1L Papel aluminio Masking tape 1 Piseta 1 Esptula

Reactivos Agua destilada Fosfato de Sodio cido tartrico Cloruro de calcio Sulfato de potasio

12. Una vez transcurrido los doce das se separan las capas que aparecen, filtrando con un embudo de polietileno y papel filtro. 13. Se separa para hacer el medio de cultivo con la solucin lquida en un matraz Erlenmeyer de un litro 14. Se pesa 1.68gr de fosfato de sodio, 0.84gr cloruro de calcio, 1.512 gr de sulfato de potasio y 0.8gr de cido tartrico en una balanza analtica. 15. En la solucin lquida se agrega fosfato de sodio, cloruro de calcio, sulfato de potasio y cido tartrico 16. Se sella el matraz Erlenmeyer con papel aluminio y masking tape 17. Se esteriliza y se deja reposar por dos das

Capa solida y lquida de la solucin

Filtracin

Pesado de cloruro de calcio

Pesado de fosfato de sodio

Solucin lquida

Pesado de sulfato de potasio

Pesado de acido tartrico

Agregar lo que se pes

Sellamiento del matraz Erlenmeyer

Agregar la levadura Saccharomyces cerevisiae en el medio de cultivo Material

1 Mechero Fisher 1 Pedazo de pipeta Cinta tefln 1 Matraz Erlenmeyer de 2L Aza 1 Corcho 1 Frasco lavador de gases 1 Piseta 18. Se prende la campana y se limpia con cloro el rea a ocupar 19. Conectar el mechero Fisher en la campana 20. Meter el medio de cultivo en la campana y la levadura Saccharomyces cerevisiae 21. Ponerle un pedazo de pipeta y cinta tefln en medio de un corcho adecuado que deba de embonar en un matraz Erlenmeyer y poner un poco de algodn al lado externo de la pipeta.

Reactivos
Cloro Algodn Levadura Saccharomyces cerevisiae

22. Prender el mechero Fisher y cuidadosamente calentamos el aza hasta que est al rojo vivo, abrir la levadura en un costado enfriar el aza con el agar y tomar un poco de levadura para as agregarla al medio de cultivo inmediatamente taparla con el corcho asegurndose que la pipeta no toque los aminocidos. 23. Conectar una manguera a la pipeta sin quitarle el algodn, y del otro lado de la manguera sumergirla en agua que est en un frasco lavador de gases el cual permite quitar el CO2 evitando su recirculacin. 24. Dejarlo fermentar de 7 das

Separacin de Biomasa y protena de pollo Material

44 Tubos de ensayo con tapa 2 Pipetas desechables de 2ml 1 Botella de plstico 1 Caja petri Mufla Centrfuga 1 Piseta 25. Despus de la fermentacin medir el PH de la solucin 26. Llenar 44 tubos de ensayo previamente lavados con todo lo que contiene el matraz hasta 14ml y taparlos 27. Colocar los tubos de ensayo dentro de la centrifuga dos en dos y encontrados, la velocidad de la centrifuga debe ser de 3500 rpm y dejarlos 10 min (si hay ms tubos de los que contiene la capacidad de la centrifuga se realiza dos veces este paso) 28. Sacar los tubos de ensayo, con una pipeta desechable quitar todo el lquido de los tubos de ensayo y almacenarlo en una botella de plstico, se guarda la botella en el refrigerados por 7 das 29. La parte solida que qued en los tubos de ensayo se coloca en una caja Petri, se etiqueta y se mete a una mufla

Reactivos
Agua destilada

Destilacin para obtener protena de las plumas de pollo Material

2 Soportes universales 2 Pinzas de nuez 2 Pinzas de tres dedos 1 Parrilla elctrica 1 Base de cermica

Reactivos
Agua destilada

1 Refrigerante recto 1 Codo de vidrio de 45 1 Matraz de bola esmerilado 1 Vaso de precipitado de 5ml 1 Portaobjetos 3 Cubre objetos 1 Piseta 2 Mangueras de Ltex 1 Vaso de precipitado de 1 L 1 Bomba acutica 1 Tina de plstico

30. Colocar el equipo de destilacin 31. Antes de destilar se coloca una muestra del liquido en un vaso de precipitado de 5ml para poder observar en el microscopio si hay crecimiento de la levadura. 32. Se agrega la solucin liquida en un matraz de bola esmerilado para as destilarlo y obtener protena de las plumas de pollo en un vaso de precipitado de 1L. 33. Se agrega una gota de la solucin lquida en un portaobjetos y observamos en el microscopio si contiene levaduras posteriormente agregamos un pedazo del material solido en el portaobjetos y observamos en el microscopio para saber que es lo que contiene (sales) 34. Se lava el material y se entrega al profesor

Destilacin para obtener la protena

CLCULOS
Datos: PMHCl = 36.4609 g/mol Del Skoog pgina 85, Octava Edicin: = 1.19 g/ ml Frmulas: ( ) % p/p = 37 % Para preparar 1 L de solucin de HCl a 2 N

Sustitucin: ( ( ) ( ) )

)(

RESULTADOS
Para llevar a cabo la hidrlisis cida preparamos una solucin de HCl 2 N. sta requera de agregarle 165.6148 ml de HCl y aforar a 1 L con agua destilada, sin embargo, agregamos 166 ml de HCl porque en la pipeta graduada no es posible medir la cantidad de HCl requerida. La proporcin de gramos de plumas con respecto a la solucin cida es: 100 g por cada L, as que nicamente ocupamos 900 ml de solucin porque contbamos con solo 90 g de plumas. Calentamos y agitamos (con ayuda de una barra magntica) el hidrolizado de plumas durante aproximadamente 2 horas. El litro de solucin de NaOH al 80% que se ocup para neutralizar el hidrolizado lo prepar el equipo 1. Neutralizamos el hidrolizado con 60 ml de solucin de NaOH, embargo, al corroborar con el potencimetro el valor medido corresponda a un pH bsico, por lo que tuvimos que agregar cido muritico hasta obtener un valor de 7.15. Se agregaron los siguientes nutrientes al hidrolizado con la proporcin indicada para 840 ml: Para 1 L 2g 1g 1.8 g 1g Para 840 ml 1.68 g 0.843 g 1.512 g 0.8 g

Fosfato de sodio Cloruro de calcio Sulfato de potasio cido tartrico

La esterilizacin del medio de cultivo la realiz el profesor en la autoclave. Las tres integrantes del equipo realizamos el cultivo de la levadura para aprender a realizar esa accin. Despus de cultivar la levadura (Saccharomyces cerevisiae) en el gar, dejarlo fermentar de 4 a 5 das, en nuestro caso esperamos 7 das para pasar al siguiente proceso. El valor de pH medio despus de que se realiz la fermentacin fue de 7.06 unidades. La velocidad a la cual se llev a cabo la centrifugacin es fue de 3500 rpm. Una vez salido de la mufla, se pes la caja Petri con (101.407 g) y sin (99.226 g) slido y por una diferencia de pesos, el slido obtenido arroj un valor de 2.181 g. Con ayuda del microscopio observamos tanto la muestra slida (Figura 1) como la lquida (Figura 2). En la primera, podemos notar la formacin de cristales de NaCl y en la segunda se observan levaduras.

Figura 1. Muestra slida

Figura 2. Muestra lquida El producto obtenido de la destilacin fue de 11.5 ml de protena.

CONCLUSIONES
No obtuvimos grasa despus de hervir las plumas de pollo, sin embargo las pusimos a secar para reutilizarlas. Verificamos que las plumas de pollo se hidrolizan en solucin cida. Preparamos el medio de cultivo con la cantidad correspondiente de nutrientes y cultivamos la levadura.

Aprendimos a cultivar la levadura Saccharomyces cerevisiae. Despus de la fermentacin y centrifugar obtuvimos biomasa de levadura, sin embargo, no se alcanzaron los mejores resultados. Lo que nos lleva a concluir que los aminocidos no son una buena fuente de carbono para ste tipo de levadura, es necesario entonces que se cultive en un medio que contenga carbohidratos. Lo anterior se confirma al observar la muestra lquida al microscopio, en la cual podemos ver que existen levaduras pero en pequea cantidad. El destilado fue protena, la cual pudimos identificar por el olor que desprenda, y no etanol, que era la sustancia esperada. Con base a los resultados obtenidos se determina que el proceso que se le dio a las plumas de pollo durante el desarrollo de sta prctica no fue el adecuado para lograr nuestro objetivo general pero existen otros mtodos con los que se puede experimentar para ver si llegamos al fin que queremos, en este caso el etanol.

RECOMENDACIONES
Antes de empezar la prctica es preciso limpiar toda el rea de trabajo con un trapo mojado en una solucin de agua con cloro para asegurarnos que no se contamine nuestro trabajo, as mismo tiene que limpiarse la campana cuando se va a cultivar. Debe tenerse precaucin al preparar la solucin de NaOH debido a que libera mucho calor, as como cuando se utiliza el potencimetro porque es un aparato muy sensible. Para el reflujo y la destilacin, se necesita que el agua que se encuentra en recirculacin se mantenga fra, ya sea agregndole hielos o utilizando una bolsa que contenga refrigerante. Entre ms tiempo dure la fermentacin se obtiene ms producto. Cualquier residuo peligroso que se genere tiene que guardarse en una botella de vidrio o plstico, etiquetarse con el formato correspondiente y colocarse en el rea indicada para que posteriormente pueda drsele el tratamiento necesario.

BIBLIOGRAFA
http://www.biologia.edu.ar/microind/esterilizaci%C3%B3n.htm http://www.biologia.edu.ar/microind/medios.htm http://www.produccionbovina.com/produccion_porcina/00produccion_porcina_general/87-Bauza-Hidrolizado.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae http://www.redalyc.org/pdf/304/30400802.pdf

http://vinospasini.blogspot.mx/2012/02/importancia-del-nitrogeno-paralas.html http://www.espatentes.com/pdf/0421045_A1.pdf http://www.biologia.edu.ar/microind/esterilizaci%C3%B3n.htm http://www.biologia.edu.ar/microind/medios.htm