MARCO METODOLGICO.DESCRIPCIN DEL ESTUDIO.El presente trabajo de investigacin es tipo de observacional, transversal. POBLACIN EN ESTUDIO ENFOCADA.

Las muestras de pacientes fueron provistas por el laboratorio CEADES Cochabamba, del estudio Chagas - !" las mismas #ue se recolectaron de diferentes centros durante .................$ "ospital iedma, %acientes del Centro Departamental de !nformacin igilancia & 'eferencia (CD !') Cochabamba, Casa de los ni*os +i#uipa&a & el !nstituto de Desarrollo "umano. CRITERIOS DE INCLUSIN.!ngresaron al estudio, las muestras de a#uellos pacientes #ue acudieron al servicio de !nfectolog,a del "ospital Cl,nico Departamental de !nformacin !ED-A & %acientes del Centro igilancia & 'eferencia (CD !'), de Cochabamba,

Casa de los ni*os, !nstituto para el Desarrollo "umano, de los cuales se tomo en cuenta los siguientes criterios de inclusin$ Diagnstico positivo para !". S!DA, confirmada por EL!SA & /ester bloth pacientes #ue contaban con su ficha clinica completa #ue inclu&e recuento celular de CD0, CD1, carga viral, resultados del test de Chagas por EL!SA, ant,geno total & ant,geno recombinante. -uestras de pacientes #ue cuenten con datos completos en ficha cl,nica de$ CD0, CD1, carga viral, resultados de EL!SA, ant,geno total & ant,geno recombinante %acientes ma&ores de edad o ma&ores de 21 a*os CRITERIOS DE EXCLUSION.%ara este estudio se consideraron como criterios de e3clusin$ -uestras de pacientes con diagnstico negativo para !" .S!DA

 -uestras de pacientes sin datos o datos incompletos en ficha cl,nica de acuerdo a los criterios de inclusin. %acientes menores de 21 a*os. 1. MUESTRAS 1.1 LUGAR DE PROCESAMIENTO Y conserv c!on "e RECLUTAMIENTO DE MUESTRAS.Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio CEADES Salud & -edio Ambiente, Cochabamba -unicipio Cercado, Cons!"er c!ones # r $%es&r s.El presente estudio de investigacin se llevar4 acabo en el laboratorio CEADES Salud & -edio Ambiente Cochabamba, evalu4ndose por %C' un total de 5.muestras (sangre con ED+A-guanidina (6,7-)) 89 de pacientes diagnosticados con !".S!DA & Chagas, empleando los primers +c :2, +c :;, & 2;2, 2;;, para la deteccin del AD< de T. cruzi. El diagnstico de !".S!DA por el m=todo de EL!SA & /estern >loth, la

cuantificacin de la carga viral por %C' a +iempo 'eal as, como el recuento de c=lulas CD0 & CD1 por citometr,a de flujo9, se reali? en el laboratorio >iolog,a -olecular de la facultad de -ED!C!<A LA>!-ED !!>!S-ED de la @niversidad -a&or de San Simn. A la totalidad de las muestras incluidas en el estudio se les reali? el diagnstico de Chagas por medio de pruebas inmunolgicas de EL!SA Ant,geno total & Ant,geno recombinante marca /!E<E' version ....., procesados en laboratorio CEADES Cochabamba.

COSIDERACIONES DE CONSER'ACIN DE LAS MUESTRAS.%ara el presente trabajo de investigacin, se cont con sangre e3tra,da (por venopuncin) recolectada en un tubo con anticoagulante ED+A en tubo de hemlisis est=ril, al #ue se a*adi un volumen E< 'ELAC!A< 2$2 DE de guanidina-ED+A (6,7-). La refrigeracin de 0 BC. PERIODO Las muestras fueron recolectadas en el periodo de enero a diciembre ;622 & almacenadas en el laboratorio CEADES a 0 B C. 1.( MATERIALES Y REACTI'OS.MATERIALES).................... 1.(.1 RECATI'OS TRIS ACETATO EDTA TAE 1* X.AL@-E< muestra se almacen a temperatura de

Se utili? el reactivo comercial$ +AE 26C de la marca %romega, el cual fue diluido hasta una concentracin de 2 C para la preparacin de geles de agarosa, & como buffer de electroforesis. (ver ane3o) TE.-

+ris-"Cl 26m-D ED+A (p" 1,6) 2m-. Euente$ Duff& (;626) Desarrollo & aplicacin de estrategias de %C' para la genotipificacin & cuantificacion de Tripanosoma cruzi .+esis Doctoral @niversidad de buenos aires facutad de ciencias e3actas & naturales, Dep. de fisiolog,a & >iolog,a -olecular & Celular.p, ;-20F.

EDTA *+, M #- . /0,*$12.-

0G,7g ED+AD 2H7ml ";6D agitar con calorD llevar a p" 1,6 con <aA" 26<. Esterili?ar en autoclave. Euente$ Duff& (;626) Desarrollo & aplicacin de estrategias de %C' para la genotipificacin & cuantificacion de Tripanosoma cruzi .+esis Doctoral @niversidad de buenos aires facutad de ciencias e3actas & naturales, Dep. de fisiolog,a & >iolog,a -olecular & Celular.p, ;-20F.

Tr!s--C1 1M #- .+* /1L2.+ris >ase 2;2gD ";6 H66mlD llevar a p" 1,6 con "Cl 7<.Completar con ";6. Eunete$ Duff& (;626) Desarrollo & aplicacin de estrategias de %C' para la genotipificacin & cuantificacion de Tripanosoma cruzi .+esis Doctoral @niversidad de buenos aires facutad de ciencias e3actas & naturales, Dep. de fisiolog,a & >iolog,a -olecular & Celular.p, ;-20F.

SOLUCIN DE BROMURO DE ETIDIO.Se prepar una solucin de bromuro de etidio a una concentracin 6.7 ug .ml a partir de una solucin madre de concentracin 26 mg .ul, para la tincin de geles de agarosa. (ver ane3o) Euente$ Eerrer E, Da Conceicao E, Campioli %, Lares -, Lpe? -, 'ivera -I, iettri -, -edina -, Salcedo -, -orocoima A, "errera L.(;661) alidacin de protocolos de %C' para el diagnstico molecular de la Enfermedad de Chagas. >iolog,a molecular - alidacin de %C'. Salus online ol.2;-Sup.2 p.2GJ SOLUCIN DE ALCO-OL ABSOLUTO.A partir de una solucin de Alcohol Absoluto de grado molecular ( marca -E'C) , se prepar una solucin de alcohol al H6 K para lavado de AD< con Lit de e3traccin /i?ard. Euente$ !nserto de Lit /i?ard

SOLUCIN DE ISOPROPANOL Se utili? una solucin comercial de isopropanol al FF,7K ( marca C!CA'ELL!) de grado molecular, para lavado durante la e3traccin de AD< con Lit Mi?ard A3UL DE BROMOFENOL.Dilucin99 MARCADOR DE PESO MOLECULAR DE ADN 1** 4# DNA 1 ""er /Pro$e5 2) %esos moleculares (pb)$ 266- ;66- J66- 066- 766-G66- H66- 166- F66- 2.6662.766 (!nserto de -arcador de %eso -olecular %romega)

M6TODOS.PURIFICACIN DNA GENOMICO /7IT 8I3ARD 9 GENOMIC DNA

PURIFICACIN : Pro$e5 2 FUNDAMENTO.Este Lit se basa en un proceso de cuatro pasos, #ue inclu&e la purificacin por medio de la lisis de los glbulos rojos en la solucin de lisis celular, seguido por la lisis de glbulos blancos (tanto c=lulas como nNcleos) con la solucin de nuclelisis, opcionalmente se puede reali?ar una etapa de digestin con '<asa, luego se utili?a una solucin salina #ue precipita las prote,nas de la muestra, dejando el AD< en solucin. Einalmente se concentra presipita & desala con isopropanol Luego por accin de una solucin salina presipita las prote,nas, dejando el AD< de alto peso molecular en solucin, luego el AD<, se concentra desala & se presipita con !sopropanol

PROCEDIMIENTO .RESUMEN R;PIDO.-

E1 s!5%!en&e #roce"!$!en&o se %&!1!< r= # r %n vo1%$en "e (** %1 "e s n5re.2.- En un tubo eppendorf limpio de capacidad 2.7 ml se a*adir4 F66 ul de solucin de lisis celular de acuerdo a la t=cnica. Es importante #ue la sangre tenga ED+A, heparina o citrato para prevenir la coagulacin. ;.- Agitar suavemente & transferir la sangre al tubo #ue contiene la solucin de lisis celular, luego invertir el tubo de 7 a G veces para me?clar. J.- !ncubar por 26 minutos a temperatura ambiente invirtiendo de ; a J veces durante la incubacin, para lisar glbulos rojos. Centrifugar de 2J.666 a 2G666 3g por ;6 segundos a temperatura ambiente. 0.-'etirar el sobrenadante evitando tocar el precipitado blanco visible. Debe #uedar apro3imadamente entre 26 O ;6 ul de l,#uido residual. Si la muestra se congel repetir los pasos 2-0 hasta #ue el precipitado est= de color blanco. %uede haber algo de p=rdida de AD< en muestras congeladas. <ota.- %uede haber algunos glbulos rojos o restos celulares visibles, junto con los glbulos blancos. Si el pellet parece contener solo glbulos rojos, a*adir una al,cuota adicional de solucin de lisis celular, despu=s de eliminar el sobrenadante por encima del pellet celular & repetir los pasos J, 0. 7. Agitar en el vorte3 de 26 a 27 segundos vigorosamente hasta lograr la resuspensin de glbulos blancos. 'esuspender completamente los glbulos blancos, para obtener la lisis celular eficiente

G.- A*adir J66 ul de solucin de nuclelisis, al tubo #ue contiene las c=lulas resuspendidas. - %ipetear (me?clar con pipeta) la solucin de 7 -G veces para lisar los glbulos blancos. La solucin debe #uedar mu& viscosa - Si los grumos de c=lulas son visibles, despu=s de la me?cla se incuba la solucin a JHBC hasta #ue los grumos se disuelvan (rompan). - Si despu=s de una hora los grumos son visibles, a*adir 266 ul de solucin de nuclelisis adicional & repetir la incubacin. H.- A%C!A<AL$ - A*adir 2.7 ul de solucin de '<Asa al lisado nuclear. - me?clar la muestra invirtiendo ;-7 veces el tubo. - !ncubar 27 minutos a JH B C, luego enfriar a temperatura ambiente. 1.- A*adir 266 ul de solucin de precipitado de prote,nas al lisado nuclear & agitar vigorosamente en vorte3 por 26 a ;6 segundos. Los pe#ue*os grumos de prote,nas pueden ser visibles despu=s de la agitacin, en vorte3

Si en el paso G se a*adi solucin de nuclelisis adicional. agregar 2J6 ul de solucin de precipitacin de prote,nas.

F.- Centrifugar a 2J.666 -2G.666 3g por J minutos a temperatura ambiente. Debe observarse un precipitado de color marrn oscuro de prote,nas. En caso de no observarse referirse a la seccin 0 26.- +ransferir el sobrenadante a un tubo eppendorf limpio de capacidad 2,7 ml #ue contiene J66 ul de isopropanol a temperatura ambiente. <ota.- Algunos sobrenadantes pueden permanecer en el tubo original #ue contiene la prote,na de pellets. Deje este l,#uido residual para evitar contaminacin de la solucin de AD< con la prote,na presipitada. 22.- -e?clar suavemente por inversin hasta #ue se forme una masa visible de AD<. 2;.- Centrifugar a2J.666 2G.666 3g por un minuto a temperatura ambiente, el AD< se visuali?ar4 como un precipitado de color blanco.

2J.- Desechar el sobrenadante, para #uedarnos con el sedimiento (decantar), & a*adir un volumen de etanol al H6 K invertir el tubo suavemente varias veces para lavar el precipitado de AD< & los bordes del tubo de microcentr,fuga - Centrifugar 2J.666 O 2G.666 rpm por un minuto a +B ambiente 20.- Aspirar cuidadosamente el etanol con una pipeta %asteur o tip, teniendo cuidado con el sedimento de AD< &a #ue en este punto est4 mu& flojo. (evitar aspirar el pellet con la pipeta) !nvertir el tubo, sobre el papel absorbente limpio & con aire seco. Dejar secar durante 26 a 27 minutos. - Dejar secar al ambiente por 26 a 27 minutos el sedimento obtenido. 27.- A*adir 266 ul de solucin de rehidratacin de AD< e incubar a G7 BC durante 2 hora, peridicamente me?clar la solucin d4ndo suaves golpes al tubo. - A rehidratar el AD< por incubacin a temperatura ambiente durante toda la noche, o a 0 BC. - Almacenar el AD< obtenido de ; a 1 BC. F%en&e) >ibliograf,a inserta en Lit /i?ard %romega P!+ /!:A'D Q IE<A-!C D<A %@'!E!CAC!R< O %romega. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR SECUENCIA DE INICIADORES Y CUALES FUNDAMENTO.La %C' es la amplificacin e3ponencial in vitro de secuencias espec,ficas de 4cidos nucleicos. La reaccin se reali?a cuando se me?cla un molde templado de AD<, los cebadores, la ta# polimerasa, los d<+%Ss, & buffer de reaccin posteriormente de acuerdo a condiciones programadas en un e#uipo termociclador. se produce el inicio de los ciclos de desnaturali?acin del AD<, el alineamiento de los cebadores & la s,ntesis e3ponencial de los productos de amplificacin.

(Fuente: Iu,a pr4ctica sobre la t=cnica de %C' Capitulo 2H Espinosa L. disponible en http$..MMM;.ine.gob.m3.publicaciones.libros.7J6.cap2H.pdf) I. PROCEDIMIENTO Tc 31 > Tc 30.%ara el caso de los cebadores, +c :2 & +c :;,D!'!I!DAS AL D<A SALEL!+AL se espera tener como producto,DE amplE!CAC!A< @<A >A<DA de 211 pb,A>+E<!DAS %A' LA 'EACC!A< %C'CA< ES+AS inciadores espec,ficos para detectar EL D<A DE T. cruzi, #ue son capaces de amplificar todos los linajes con la misma sensibilidad (Fuente: irre&ra -, +orrico E. +ru&ens C., et al ;66J)

Secuencia de cebadores$ +C:2O7CIAIC+C++ICCCACACIII+IC+ +C:; O 7T CC+CCAAICAICIIA+AI++CAII 2.- La siguiente tabla ilustra la preparacin de los reactivos para la 'eaccin en Cadena de la %olimerasa
'EAC+! AS CA<CE<+'AC!R< E!<AL 2 C, %'A-EIA %rotoclo volumen del reactivo -aster mi3 p ;7 ul Ferrer E. Da Conceicao F. Campioli P. et al, 2006 olumen una muestra

>uffer de reaccin d<+%Ss mi3 ;.7 m-gCL 76 m+c :2 +c :;

2;.7 ( 2 C) 6.;7-;.7 ul u-) 6.;7-;.7 ul ;66 umol.l ;mmol.L (6.2-2.6 6.7 u-U umol.L (6.2-2.6 6.7 u2@

( 2 C) (6.7 u-) (6.7 u-)

2;.7 ul 2.;7 ul 2.;7 ul

u-) AD< +a# polimerasa Agua libre de ;7 ul nucleasas AD< molde 2-7 ul

7 ul 7 ul

AL@-E< E!<AL

;7 ul

CA<D!C!A<ES @+!L!:ADAS %A' ul Ferrer E. Da Conceicao F. Campioli P. et al, 2006 ;.- Alicuotar a ;6 ul de la me?cla en tubos %C' de 6.; ml. J. A*adir 7 ul AD<. 0.- Dar un sp,n & colocar los tubos en el termociclador program4ndolo de la siguiente forma$ Ease Desnaturali?acin inicial Desnaturali?acin "ibridacin +emperatura enBC F0 BC F0 BC 7G BC +iempo 26 minutos J6 seg J6 seg <B de ciclos

J6 ciclos

E3tensin H; BC J6 seg E3tensin final H; BC 26 minutos Ferrer E. Da Conceicao F. Campioli P. et al, 2006 acondicionado a laboratorio CA<CL@!DA LA 'EACC!A< DE %C' SE I@A'DA LAS %'AD@C+AS DE . (Fuente: -oser D, Pirchhoff L, Donelson W.et al 2F1FD Ferrer E. Da Conceicao F. Campioli P. et al, 2006 ). ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA FUNDAMENTO.El objetivo es separar fragmentos de 4cidos nucleicos de AD< , '<A por medio de un gel de agarosa & detectarlos, mediante la tincin con bromuro de etidio, bajo lu? ultravioleta. El proceso de separacin de mol=culas se produce por$ A-%L!E!CAC!A< A 0VC "AS+A LA 'EAL!:AC!A< DE LA ELEC+'AEA'ES!S

La corriente cont,nua %eso & carga de las mol=culas.

PROCEDIMIENTO.Se utili?ar4 gel de agarosa al ;K, utili?ando +AE 2C & un sistema de electroforesis hori?ontal con un voltaje de 5., Los geles se te*ir4n con 6.7 g.ml de >romuro de Etidio. El tama*o de las bandas obtenidas se compar4n con el marcador de AD< de 266 pb (%romega). Debiendo ser observadas a nivel de 211 pb. De a cuerdo al protocolo de Ferrer E. Da Conceicao F. Campioli P. et al, 2006 )

4. PROCEDIMIENTO. %reviamente preparar la solucin de >romuro de Etidio hasta una concentracin de 6.7 ug.ml Llenar la c4mara electrofor=tica con solucin de +AE 2 C, hasta un volumen suficiente para sumergir el gel. %reparar la cubeta para electroforesis a utili?arse, lav4ndola con agua destilada. Sellar los bordes de la cubeta con los sujetadores de goma. %esar agarosa al ;K & adicionar la solucin de +AE 2 C (6.; gramos de agarosa X volumen de ;7 ml de +AE 2C para obtener un gel de H 3 H cm) Colocar en horno microondas, J6 segundos hasta la disolucin total de la agarosa. (intensidad9) Enfriar a ba*o maria o por medio de movimientos rotatorios Dispensar la preparacin de agarosa, sobre la cubeta preparada, e inmediatamente colocar la peineta de pocillos, posteriormete esperar su completa gelificacin.

Desprender cuidadosamente los sujetadores de goma de la cubeta adheridos al gel. Encender & programar la fuente de poder para la electroforesis a5 voltios por5 min. Colocar la cubeta con el gel preparado en la c4mara electrofor=tica. Dispensar en cada pocillo cuidadosamente los productos de amplificacin de %C' ( 7 ul AD< amplificadoX J ul de buffer de carga a?ul de bromo fenol) & el marcador de peso molecular(266 %>) ( sin buffer de carga, puesto #ue &a viene incorporado)

+ranscurrido el tiempo sacar el gel de la c4mara, & cuidadosamente 'E ELADA DE LAS IELES DE AIA'ASA !<C@>AC!A< E< >'A-@'A DE ED+!D!A sumergirlo en la solucin de bromuro de etidio 6.7 ug.ml por J6 minutos E< ASC@'!DAD %'E !A-E<+E %'E%A'ADA. Conectar el transiluminador de lu? @ . Despu=sDE LAS J6 -!<@+AS DE !<C@>AC!A<, con las debidas precauciones de bioseguridad, retirar el gel de la solucin de bromuro de etidio, & colocarLa sobre el e#uipo de trasiluminacin C@< L@: @ para la identificacin de bandas amplificadas.

Con a&uda de la c4mara digital tomar fotos del resultado de la amplificacin.

INTERPRETACION DE RESULTADOS EL TAM?O DE BANDA ESPERADA ES DE 1.. PB+ CON LA AYUDA DEL MARCADOR DE PESO DE 1** PB SE PODRA DECIR @ LA MUESTRA DONDE SE OBSEREA UNA BANDA APROXIMADA A 0** PB DEL MARCADOR SERA MUESTRA POSITI'A POR #cr PARA T. CRU3I.

BIBLIOGRAFAA.Iu,a pr4ctica sobre la t=cnica de %C' Capitulo 2H Espinosa L. disponible en http$..MMM;.ine.gob.m3.publicaciones.libros.7J6.cap2H.pdf) !nserto de P!+ /!:A'D Q IE<A-!C D<A %@'!E!CA+!R< P!+ O %romega, Eor in vitro reseach use Arl& 266 insolations !nserto de -arcador de %eso -olecular >ench+op 266 pb D<A Ladder %romega Corporation. Duff& (;626) Desarrollo & aplicacin de estrategias de %C' para la genotipificacin & cuantificacion de Tripanosoma cruzi .+esis Doctoral @niversidad de buenos aires facutad de ciencias e3actas & naturales, Dep. de fisiolog,a & >iolog,a -olecular & Celular.p, ;-20F. Eerrer E, Da Conceicao E, Campioli %, Lares -, Lpe? -, 'ivera -I, -edina -, Salcedo -, -orocoima A, "errera L.(;661) iettri -,

alidacin de protocolos de

%C' para el diagnstico molecular de la Enfermedad de Chagas. >iolog,a molecular - alidacin de %C'. Salus online ol.2;-Sup.2 p.2GJ -oser D, Pirchhoff L, Donelson W. (2F1F) Detection of Tr panosoma cruzi b& D<A Amplification @sing the %ol&merase Chain 'eaction. W. Clin -icrobiol. 2F1FD ;H$ 20HH-1;.

ANEXO CALCULO PARA DILUCION DE TAE 1* X A 1X +AEU 26 C A 2C C2U 26 C 2U 9 C;U 2 C ;U 766 ml. C2 Y 2 U C; Y ; U 76 ml +AE

26 C Y 2 U 2 C Y 766 ml. 2 U 2 C Y 766 ml. 26 C

CALCULO PARA SOLUCIN DE BROMURO DE ETIDIO.Concentracin de reactivo$ 26 mg .ul (solucin madre) %reparacin para tincin en gel.Solucin de bromuro de etidio 6.7 ug .ml. CALC@LA$ 766 ml-----------26666 ug.ml C ----------- 6..7 ug .ml CU 6.6;7 ml. ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

2 ml---------------2666 ul 6.6;7 ml ------- 3

ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ CU ;7 ul %ara 766 ml de agua destilada se a*adir4 ;7 ul de bromuro de etidio