UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MONOGRAFIA CEFALOSPORINAS

PRODUCCION DE CEFALOSPORINAS C
ELENA ALICIA PONCE TORRES 5/18/2011

TITULAR DE LA MATERIA: DR. RUBEN MARQUEZ M.

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INDICE 1. INTRODUCCION.. 4 2. CEFALOSPORINAS...5 3. ESTRUCTURA6 4. CLASIFICACION.8 4.1 GENERACIONES DE CEFALOSPORINAS.8 5. MECANISMOS DE ACCION...10 6. BIOSINTESIS DE CEFALOSPORINAS11 6.1 MECANISMOS DE REGULACIN DE LA BIOSNTESIS DE CPC.14 6.1.1 REGULACIN POR LA FUENTE DE CARBONO.14 6.1.2 REGULACIN POR LA FUENTE DE NITRGENO.15 6.1.3 AMINOCIDOS COMO PRECURSORES Y MEDIADORES DE LA REGULACIN15 6.1.4 REGULACIN POR FOSFATO16 6.1.5 REGULACIN POR PH AMBIENTAL.16 6.1.6 EFECTO DEL OXGENO EN EL SISTEMA RESPIRATORIO Y EN LA PRODUCCIN DE CPC..18 7. PRODUCCION DE CEFALOSPORINAS..18 7.1 PRODUCCIN DE ANTIBITICOS18 7.2 FERMENTACION24 7.2.1 CULTIVOS EN MEDIO LQUIDOS..25 7.2.2 CULTIVOS EN MEDIO SLIDOS26 7.3 SINTESIS DE CEFALOSPORINAS27 7.3.1 SECUENCIA GENERAL DE SINTESIS..27 7.4 ECONOMIA.28 BIBLIOGRAFIA..29

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INDICE DE TABLAS TABLA 1 ESTRUCTURA DE CEFALOSPORINAS Y CEFAMICINAS..7 TABLA 2 CLASIFICACION DE CEFALOSPORINAS POR GENERACIONES9 TABLA 3 RUTA DE BIOSINTESIS DE LA CEFALOSPORINA.13 TABLA 4 EFECTOS DE PH EN PRODUCCION.....17 IMAGEN 6 PREPARACION DE INOCULO..19 TABLA 7 PERFIL DE FERMENTACION20 IMAGEN 8 PLANTA TIPICA DE FERMENTACION..22 IMAGEN 9 VASIJA TIPICA DE FERMENTACION23

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INTRODUCCION Los antibiticos betalactmicos son los antimicrobianos ms prescritos, tanto en atencin primaria como en los hospitales. A pesar de que no se dispone de ningn betalactmico realmente nuevo desde hace ms de dos dcadas, el aumento incesante de las resistencias y los avances en el conocimiento de sus mecanismos moleculares han condicionado que exista una gran cantidad de informacin en la literatura sobre cada uno de los componentes de esta familia de antibiticos.(1) La presencia de un anillo betalactmico define qumicamente a esta familia de antibiticos, de la que se han originado diversos grupos: penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas, monobactamas e inhibidores de las betalactamasas. (1) En el presente trabajo, se har referencia a las cefalosporinas en especial, antibiticos beta lactamicos de gran importancia econmica, se abordaran temas como su clasificacin, estructura qumica, mecanismos de accin, biosntesis, tipo de fermentacin utilizado para su fabricacin, as como el sustrato utilizado, caractersticas del medio, parmetros termodinmicos, a la vez que tambin se comentara su importancia econmica y se hablara de las empresas que lo producen. Cabe mencionar que este tema ha sido seleccionado debido, a que, adems de ser de inters personal, la industria farmacutica es una de las ms importantes a nivel mundial, debido a su capacidad econmica, inters social, adems de que varios de los grandes avances cientficos que se han venido dando, surgieron en este ramo en particular. El descubrimiento de las cefalosporinas se debe a Giuseppe Brotzu, en la Universidad de Cagliar (Cerdea, Italia).Brotzu trabaj con la hiptesis de que en la autodepuracin del agua deban existir microorganismos capaces de inhibir el crecimiento de grmenes patgenos. En 1948, Brotzu, aisl por vez primera una cefalosporina a partir del hongo Cephalosporium acrenmonium. Los lquidos donde se cultivaba este hongo contena tres tipos de antibiticos definidos: cefalosporina P, activa nicamente contra microorganismos grampositivos, cefalosporina N, una estructura con la cadena lateral derivada del acido Dalfaminoadipico, efectiva frente a bacterias gramnegativas y grampositivas y la cefalosporina C menos potente que la cefalosporina N pero con igual gama de efectividad.(2) despus de experimentos preliminares con Cephalosporium acremonium (CM 49137) por hetley en Oxford, el hongo fue crecido a gran escala en un laboratorio de investigacin en Clevendon, los cultivos en caldo fueron transportados a Oxford para su estudio. El primer antibitico que se detecto, se le llamo cefalosporina P, eso fue por que mostraba actividad contra algunas cepas bacterianas gram positivas, fue purificada por Burton y Abraham en 1951. Se demostr que la cefalosporina P es un acido mono carboxlico perteneciente al grupo de los triterpenos tetraciclicos est relacionada estructuralmente con el acido helvolico ya conocido con anterioridad pero menos efectivo y ms potente que el acido fusidico que se encontr que tenia usos limitados en la prctica clnica. Muestra una proteccin limitada en ratn contra infecciones estafiloccicas. La cefalosporina P es solo activa contra algunas especies de bacterias gram positivas, esto mostro que por s sola no tena el amplio espectro que Brotzu sealo. En la fase acuosa resultante de la extraccin por solventes, fue
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encontrada la cefalosporina N, la llamaron as por que muestra actividad contra bacterias gran negativa, particularmente contra cepas de salmonella thypi, as como contra estafilococos sensibles a penicilina. Sin duda esta era la sustancia que Brotzu haba dado a conocer. Las cefalosporina N que es hidrofilica es inactivada por preparaciones crudas de penicilinas de Bacillus cereus. Se aisl semi-pura y se demostr que era una nueva penicilina con una unin de la cadena lateral de -aminoadipil en lugar de la cadena lateral fenilacetil (C6H5CH2CO) de la benzilpenicilina.(8) Con filtrados impuros de cultivo liquido realiz pruebas clnicas con xito en infecciones experimentales. En 1948 public su trabajo en una revista sin proyeccin internacional, haciendo constar el deseo de que su labor continuase en centros mejor dotados. Su hallazgo posiblemente hubiera quedado olvidado sin la intervencin de Blyth Brook, quien durante la 2~ Guerra Mundial haba sido oficial de Salud Pblica en Cerdea. Brook dio cuenta de aquellos resultados al equipo que haba purificado la penicilina en la Universidad de Oxford. Brotzu envi la cepa a Inglaterra y aos ms tarde, en 1955, se estableci la estructura del antibitico beta-lactmico cefalosporina.(3) En esta monografa se hablara especficamente de las cefalosporinas C, ya que de su derivado 7-ACA se obtienen la mayoria de las cefalosporinas semisinteticas de importancia comercial. Las cefalosporinas C estn constituidas por un anillo beta- lactmico, que caracteriza a todos los antibiticos de este tipo; y un anillo de dihidrotiazina, en lugar de tiazolidina, que las distingue de las penicilinas. La cefalosporina C tiene poco poder antibitico y por va qumica se transforma en cido 7aminocefalosporanico (7-ACA), punto de partida de toda una serie de cefalosporinas semisintticas. La diferencia entre las cefalosporinas se debe a los grupos sustituyentes de los carbonos 3 y 7. (3) Las modificaciones en la posicin 7 estn asociadas a cambios en las propiedades antibacterianas y las sustituciones en la posicin 3 del anillo dihidrotiazinico se asocian a cambios en el metabolismo y a la farmacocintica del medicamento. (2) Estos compuestos con diferencias en sus cadenas laterales han sido clasificados por generaciones.

CEFALOSPORINAS Las cefalosporinas son antibiticos -lactmicos modernos cuyas caractersticas bactericidas le ofrecen al mdico y a los pacientes diversas ventajas: pocos efectos adversos, la habilidad de adaptar el tratamiento para combatir infecciones de microorganismos grampositivos, infecciones mixtas, o infecciones por microorganismos anaerobios; la disponibilidad de formas de administracin oral, tpicas e inyectables; y una eleccin entre agentes de accin corta o prolongada, dependiendo de la naturaleza de la infeccin bacteriana, incluyendo cepas bacterianas resistentes a los antibiticos existentes. (4)

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ESTRUCTURA Los estudios estructurales acerca de la CPC fueron considerablemente facilitados por el conocimiento previo de las propiedades de las penicilinas. Como la penicilina N, la CPC se Comportaba como un cido monoaminodicarboxlico y contena un residuo -D-aminoadipilico unido al resto de la molcula a travs de su grupo -carboxlico. El espectro de absorcin infrarroja de su sal sdica mostraba una banda fuerte a 1782 cm caracterstica del carbonilo -lactmico y similar a la frecuencia de extensin del correspondiente carbonilo en las penicilinas. A pesar de estas similitudes, la CPC mostraba algunas diferencias marcadas con la penicilina N. En la hidrlisis cida, no produca D-penicilamina, sino produca un nmero de fragmentos sulfurados que carecan de nitrgeno. Estos y otros resultados no eran consistentes con la presencia de un sistema de anillos -lactamicos-tiazolidinicos fundidos, y en esta etapa fue propuesta la estructura que contena el sistema de anillos dihidrotiaznicos. Esta estructura mostr ser consistente con las propiedades qumicas y fsicas de la CPC conocidas y subsecuentemente fue confirmada por cristalografa de rayos X. Como se esperaba, la inestabilidad del anillo -lactmico en condiciones bsicas acoplada a la presencia de otros sitios reactivos resultaba en la completa degradacin de la molcula a pH alto. (4) Durante la purificacin de la CPC en buffer de acetato de piridina, se observ la formacin de una betana de piridinio. Esta reaccin mostr ser una reaccin general con una variedad de bases heterocclicas dbiles y posteriormente se le encontr una aplicacin extensiva en la produccin de cefalosporinas semisintticas.(4)
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ESTRUCTURA QUIMICA DE LA CEFALOSPORINA C(4)

En esta imagen se pueden observar los carbonos 3 y 7, lugares donde ocurre la sustitucin de compuestos, responsables de las distintas generaciones de cefalosporinas.

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TABLA

Estructuras

de

cefalosporinas

cefamicinas

(6)

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CLASIFICACION A partir de la cefalosporina C se obtiene el cido 7-aminocefalospornico (7-ACA), que ha sido modificado con diferentes cadenas laterales, dando lugar a tres generaciones bien diferenciadas y a una cuarta que se est iniciando en la actualidad. Las variaciones introducidas en C7 del 7-ACA modifican su actividad antibacteriana, la sustitucin en posicin 3 del anillo dihidrotiaznico origina modificaciones de carcter farmacocintico, y la presencia del grupo metiltiotetrazol en la posicin 3 del anillo dihidrotiazolidnico est relacionado con efectos adversos concretos: alteraciones de la coagulacin e intolerancia al alcohol. Las molculas con un grupo metoxi en posicin 7 del 7-ACA constituyen el grupo de las cefamicinas, que la mayora de los autores no han reconocido como independiente. Se est ensayando producir cefalosporinas con efecto antibacteriano dual, las cuales resultan qumicamente estables y han demostrado tener una gran actividad contra un amplio nmero de bacterias gram-positivas y gram-negativas. Estas cefalosporinas de accin dual se crean enlazando quinolonas a la posicin 3 de la cefalosporinas a travs de un enlace ester, a una funcin carbonato o a una unin a travs de un nitrgeno cuaternario.(5) Generaciones de Cefalosporinas: Las cefalosporinas de primera generacin son para administracin oral y parenteral. Las orales son llamadas fenilglicinas o derivados hidroxifenilglicinas que incluyen la cefalexina, cefadroxilo y cefradina; entre las parenterales se cuenta con la cefalotina, cefazolina, cefradina (administracin oral tambin) y cefapirina. Este grupo de antibacterianos incluye sustitutos de la penicilina G que son resistentes a las penicilinasas de los Staphylococcus, por tanto tienen una buena actividad contra bacterias aerobias gram-positivas (con excepcin de Enterococos, Staphylococcus resistentes a la meticilina, Staphilococcus epidermidis y pneumococos resistentes a penicilina), y algunos organismos gramnegativos adquiridos en la comunidad (P. mirabilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae y Moraxella catarrhalis).(5) Las cefalosporinas de segunda generacin ofrecen una cobertura mayor frente a los bacilos gramnegativos que las de primera generacin. Todas estas cefalosporinas tienen actividad contra la mayora de los microorganismos destruidos por agentes de la primera generacin, pero su cobertura es ms extensa ya que incrementan su actividad contra microorganismos gram-negativos, en especial tres: Haemophilus influenzae y Neisseria sp. Existe un subgrupo entre estos agentes, los cuales son cefoxitina -es la ms potente del sub-grupocefotetan y cefmetazole que son activos contra el grupo de B. fragilis. Con excepcin de la cefuroxima, las cefalosporinas de segunda generacin no deben administrarse en meningitis. Estas, al igual que las de primera generacin se dividen en orales y parenterales. Las primeras son llamadas tambin steresprodrogas e incluyen al Loracarbef (que a pesar de ser una droga fenilglicina, se puede clasificar como de segunda generacin por sus propiedades antibacterianas), cefaclor, cefuroxime axetil y cefprozil. Las segundas son el
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cefamandol, cefonicid, cefmetazole.(5)

cefoxitina,

ceforinida,

cefuroxime,

cefotetan

el

Las cefalosporinas de tercera generacin suelen resultar ms eficaces in vitro frente a los bacilos gramnegativos y frente a los cocos grampositivos (excepto S. Aureus) que los frmacos de primera y segunda generaciones. Las cefalosporinas de tercera generacin son el tratamiento de eleccin en la meningitis por bacilos gramnegativos y se utilizan tambin para combatir otras infecciones por bacilos gramnegativos. Todo este grupo de tercera generacin son extremadamente activas contra la mayora de las bacterias gram-negativas (excepto Enterobacter y Citrobacter) incluyendo las mencionadas anteriormente, es decir, las Enterobacteriaceae y otros organismos entricos y Serratia marcescens, y tambin contra bacterias productoras de Beta-lactamasas. La ceftazidime y el cefoperazone son activas contra Pseudomonas aeruginosa, pero son menos activas que otros agentes de tercera generacin contra cocos gram-positivos. Estos antibiticos no estn indicados en la profilaxis quirrgica de rutina. Al igual que en los grupos anteriores hay parenterales y orales. Cefixime, cefdinir, cefpodoxima proxetil y ceftibuten son las orales y cefoperazone, ceftazidime, moxalactam, cefotaxime, ceftizoxime, cefmenoxime y ceftriaxone son parenterales. Las ltimas cinco son aminotiazolil-iminometoxi-cefalosporinas.(5) Las cefalosporinas de cuarta generacin de incluyen el cefepime y el cefpirone ambas de administracin parenteral- tienen un extenso espectro de accin comparadas con las de tercera generacin y tienen una gran estabilidad contra Beta-lactamasas mediadas cromosomalmente y por plsmidos, adems de poca o ninguna capacidad para inducir la produccin de Beta-lactamasas tipo I. Cubren Enterobacter y Citrobacter y tiene particular uso teraputico en el tratamiento de infecciones debidas a bacilos aerobios gram-negativos resistentes a cefalosporinas de tercera generacin con lo cual se logra su erradicacin y tienen mejor actividad contra algunos gram-positivos.(5) Actualmente se encuentran en estudio un nuevo grupo de cefalosporinas inyectables, las cuales incluyen el cefozopran, cefpiramide, E 1100, FK 037 y DQ2556. Esta ltima ha resultado ms activa que el cefepime pero menos activa que el cefpirone contra bacterias gram-positivas, adems de ser el compuesto ms activo contra los miembros de las Enterobacteriaceae. (5)

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TABLA 2

MECANISMOS DE ACCION Las cefalosporinas pueden llegar a matar a las bacterias susceptibles y aunque su mecanismo de accin an no se conoce completamente, existen conocimientos que permiten conocer el fenmeno bsico. (7) Las paredes celulares de las bacterias son esenciales para su crecimiento y desarrollo y el peptidoglicn es un componente heteropolimrico de dicha pared que asegura estabilidad mecnica rgida en virtud de su estructura de enrejado con abundantes uniones cruzadas, las cuales tienen caractersticas individuales para cada microorganismo; la biosntesis del peptidoglicn involucra unas 30 enzimas y pueden considerarse 3 etapas, la tercera etapa o etapa de transpeptidacin es la que ocurre por fuera de la membrana celular y produce el entrecruzamiento completo entre las 2 cadenas donde actan los betalactmicos,

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e inhiben la enzima transpeptidasa encargada de este proceso y que inician los eventos que llevan a la lisis y muerte bacteriana.(7) Recientemente se han revelado en la membrana citoplasmtica de las bacterias, mltiples protenas, a las cuales se unen los betalactmicos especficamente por enlaces covalentes, stas se han dominado protenas de unin a las penicillinas; varan de una especie bacteriana a otra y se clasifican de acuerdo con su nmero y peso molecular. Algunas de ellas parecen tener actividad transpeptidasa. Se han observado cambios morfolgicos, tales como la formacin de esferoblastos osmticamente estables, protoblastos y formas filamentosas no tabicadas donde se encuentra inhibida la divisin celular inducida por betalactmicos. (7) Hay tres mecanismos de resistencia frente a los antibiticos B-lactmicos: menor permeabilidad, mutaciones en las PBPs o ruptura enzimtica por 13 lactamasas. Las cefalosporinas son resistentes a algunos tipos de 5 lactainasas a las que las penicilinas son sensibles.(3) Su eficacia se relaciona ms con el tiempo de actuacin que con la concentracin en el medio activo, son bactericidas de efecto lento slo en fase de crecimiento bacteriano. Su efecto bactericida mximo es a concentraciones 4 veces superiores a la concentracin inhibitoria mnima. El efecto posantibitico dura aproximadamente 2 horas frente a cocos grampositivos, y es menor o inexistente ante los cocos gramnegativos.(7) BIOSINTESIS DE CEFALOSPORINAS La mayora de los pasos implicados en la biosntesis de las cefalosporinas han sido caracterizados en el aspecto bioqumico, si bien muchos aspectos relacionados con las reacciones llevadas a cabo por las diferentes enzimas se mantienen dentro del campo de la hiptesis. Y ello a pesar de su gran inters desde los puntos de vista mdico e industrial. (4) Estudios en los que se utilizaron extractos acelulares condujeron a la observacin de un tripptido: el -(L--aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina o en su forma abreviada ACV, que se forma en A. chrysogenum., al igual que en Penicillium, por condensacin de los aminocidos L-alfa-aminoadpico, L-cistena y D-valina (aunque el precursor es el ismero L) a travs de la enzima ACV sintetasa codificada por el gen pcbAB. El tripptido ACV sera posteriormente ciclado para formar isopenicilina N debido a la accin de la enzima Isopenicilina N sintasa que es codificada por el gen pcbC. (4) La isopenicilina N es un intermediario que posee una cadena lateral de L-aminoadipilo unida al anillo -lactmico. (4) Las rutas biosintticas de cefalosporinas y cefamicinas son, hasta este punto, similares a la de la penicilina. De hecho, el tripptido ACV y la isopenicilina N son intermediarios en la biosntesis de estos tres grupos de ant ibiticos -lactmicos y en los tres casos la isopenicilina N es el resultado de la ciclacin del tripptido. A
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partir de este punto las rutas divergen en los microorganismos productores de cefalosporinas y cefamicinas.(4) En el caso de A. chrysogenum la isopenicilina N es convertida en penicilina N por un sistema de dos protenas: la codificada por el gen cefD1, que muestra una alta similitud a las acil CoA sintetasas de cadena larga; y la codificada por el gen cefD2, el cual muestra una alta similitud a las acil CoA racemasas. La transformacin final a penicilina N requiere tambin una hidrlisis del CoA tioester la cual ha sido reportada ocurre en forma no estereoespecfica a travs de diferentes tioestearasas. (4) La penicilina N es transformada en desacetoxicefalosporina C por medio de una enzima que convierte el anillo tiazolidnico de cinco miembros caracterstico de las penicilinas en un anillo dihidrotiaznico de seis miembros (tpico de cefalosporinas y cefamicinas). La desacetoxicefalosporina C es posteriormente hidroxilada, formndose desacetilcefalosporina C. En A. chrysogenum las actividades de expansin del anillo y posterior hidroxilacin se encuentran asociadas en una nica protena: la DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa, codificada por el gen cefEF, mientras que en los microorganismos productores de cefamicina se localizan en enzimas separadas codificadas por genes separados. El ltimo paso de la ruta de biosntesis de cefalosporina es la acetilacin de la desacetilcefalosporina C a cefalosporina C paso catalizado por el producto del gen cefG: la Acetil CoA DAC acetiltransferasa. (4)

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TABLA 3 Ruta de Biosintesis de la Cefalosporina, cuadro tomado de la referencia (4)

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- Mecanismos de regulacin de la biosntesis de CPC Los estudios sobre la regulacin de la biosntesis de antibiticos -lactmicos son tiles para mejorar los procesos de fermentacin. La produccin de antibiticos lactmicos tiene lugar mejor bajo condiciones de desequilibrio de nutrientes y a velocidades de crecimiento bajas. Adems existen factores ambientales como el pH y el nivel de oxgeno que afectan el crecimiento microbiano y la formacin de productos. (4) Regulacin por la fuente de carbono Diferentes fuentes de carbono ejercen marcados efectos sobre la produccin de CPC. Concretamente, las fuentes de carbono que proporcionan un rpido crecimiento (glucosa, glicerol, maltosa) ejercen un efecto negativo en la produccin de -lactamas. Ya se han estudiado los pasos de la biosntesis de CPC y, en particular los mecanismos involucrados, que son afectados por represin por glucosa. En Acremonium chrysogenum, los resultados obtenidos del anlisis de la actividad enzimtica en cultivos en crecimiento y/o en micelio en suspensin indicaron que la ACV sintetasa est sujeta a inhibicin por carbono. (4) Otras enzimas examinadas, tales como la isopenicilina N sintasa y la DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa, parecen estar inhibidas a nivel de la sntesis de novo, lo cual implica represin transcripcional o traduccional. Estudios realizados por Jekosh y Kck (2000) acerca de la fisiologa molecular del gen pcbC que codifica para la isopenicilina N sintasa, indican represin transcripcional del gen por glucosa en una cepa silvestre de A. chrysogenum, sin observarse algn evento regulador a nivel traduccional. Por otro lado, en una cepa de A. chrysogenum mejorada en cuanto al nivel de produccin de CPC (A3/2), no se observ la represin del gen pcbC observada en la cepa silvestre. Similarmente, Shen y col. (1986) notaron una reducida actividad isopenicilina N sintasa en una cepa silvestre diferente en presencia de glucosa, mientras que no observaron cambios en esta actividad en otra cepa productora (C10). Estas observaciones los llevan a la conclusin de que el mejoramiento gentico en A. chrysogenum est correlacionado con una reducida respuesta de la expresin del gen pcbC a la glucosa. (4) La investigacin de Jekosh y Kck (2000) tambin apoya la hiptesis de que la expresin del gen cefEF que codifica para la DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa es el principal blanco de la regulacin por glucosa, a travs de la represin de la sntesis de novo y de la misma forma en que se observa para la isopenicilina N sintasa. (4) La represin ejercida por la fuente de carbono tambin es importante en las fermentaciones de C. acremonium, con respecto a la degradacin no deseable de la cefalosporina C por la acetilhidrolasa (Hinnen y Nesch, 1976). Esta enzima es
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producida tardamente en la fermentacin y es reprimida por glucosa, maltosa y sacarosa, pero no por glicerol ni succinato. (4)

Regulacin por la fuente de nitrgeno La formacin de antibiticos -lactmicos por A. chrysogenum (Shen y col., 1984) y por P. chrysogenum est fuertemente regulada por la fuente de nitrgeno usada, siendo los iones amonio los que muestran el efecto negativo ms fuerte, no debindose este efecto a su esqueleto carbonado. Concentraciones de amonio superiores a 110 mM interfieren fuertemente en la
+

produccin de CPC por A. chrysogenum. La adicin de NH

reprime la DAOC

sintetasa/DAC hidroxilasa pero no la IPN sintasa (ciclasa). La represin de la expandasa (DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa) es paralela a altos niveles de amonio en el caldo de cultivo durante la fermentacin. La L-asparagina y la Larginina son mejores fuentes de nitrgeno que el amonio para la produccin de antibiticos. (4) Aminocidos como precursores y mediadores de la regulacin Penicillium y Acremonium requieren determinadas fuentes de azufre para la produccin ptima de sus respectivos antibiticos beta-lactmicos. Para la sntesis eficaz de cefalosporinas, Acremonium chrysogenum obtiene este azufre a partir de la metionina por transulfuracin inversa. (4) Los organismos productores de antibiticos beta-lactmicos pueden utilizar la metionina como nica fuente de nitrgeno y azufre. En adicin, si se aade durante la fase de crecimiento vegetativo de Acremonium chrysogenum, este aminocido ejerce un importante efecto estimulador sobre la produccin de cefalosporinas. A travs de diferentes investigaciones para dilucidar el papel de la metionina en la sntesis de CPC se ha podido concluir que este aminocido no es solamente un precursor de la sntesis de cefalosporina, sino que tambin es inductor de sta. (4) En las cepas prottrofas de Acremonium chrysogenum la sntesis de antibitico no es inhibida por adicin de lisina exgena ni promovida por el cido alfaaminoadpico. Sin embargo, esto se debe a la impermeabilidad y no a la falta de sensibilidad a estos aminocidos. As, los auxtrofos de lisina bloqueados despus del alfa-aminoadpico son capaces de crecer bien cuando se aade lisina al caldo y, si la concentracin de este aminocido es excesiva, se paraliza la formacin de cefalosporinas por inhibicin de la homocitrato sintetasa. (4)
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Tambin es interesante resear que en ciertos mutantes de Acremonium altamente productores, la actividad especfica de la enzima glutamato deshidrogenasa est desreprimida mientras que en los mutantes de baja produccin esta actividad enzimtica est reprimida. La alteracin de la regulacin de la glutamato deshidrogenasa puede aumentar la asimilacin del nitrgeno favoreciendo as la sntesis de CPC. (4)

Regulacin por fosfato Se encontr que un exceso de fosfato ejerca un efecto negativo en la produccin de CPC por A. chrysogenum W5325. Las bases de este efecto todava son materia de debate, y el mecanismo molecular todava no se comprende. Se sugera que el fosfato incrementaba la velocidad de consumo de glucosa, incrementando as la represin por glucosa, mientras que experimentos con micelio en suspensin indicaron que en ausencia de glucosa, el fosfato mismo disminua el flujo completo para la formacin de CPC (Martn y col., 1982). Esto fue posteriormente apoyado por Zhang y col. (1988), quienes encontraron un efecto negativo directo del fosfato en la formacin de varias enzimas (ACVS, IPNS, y DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa) de la ruta de biosntesis de cefalosporina. Se sugiri que el fosfato actuaba sobre la IPNS y la DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa a travs de la formacin de un complejo con el hierro, necesario para la actividad enzimtica, porque la inhibicin de estas dos enzimas poda ser revertida a travs de la adicin de hierro en forma de sal ferrosa. Sin embargo, an la inhibicin de la ACVS, que no requiere hierro en forma de sal
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ferrosa para su actividad, era revertida por Fe Por lo tanto la causa del efecto inhibitorio del fosfato todava no est completamente entendida. (4) Regulacin por pH ambiental Para determinar el efecto del pH en la expresin de los genes de biosntesis de CPC en A. chrysogenum, Schmitt y col. (2001) analizaron los niveles de transcripcin en cultivos en crecimiento en medio amortiguado entre valores de pH de 5 y 8. El anlisis de ARN total en dos cepas de Acremoniun mostraron que: en la cepa silvestre ATCC 14553 el gen pcbC (que codifica para la protena IPNS) es expresado a niveles apreciables solamente por encima de pH 5, mientras que el transcrito del gen cefEF (que codifica para la DAOC sintetasa/DAC hidroxilasa) no es detectable por hibridacin de Northern an a pH 8. En contraste con esto, la cepa semiproductora A3/2 expresa ambos transcritos sobre el intervalo completo de pH estudiado. Los niveles ms altos de trascripcin fueron observados para cultivos creciendo entre pH 6 y pH 7. (4)

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En hongos filamentosos el factor de transcripcin PACC es importante para la expresin gnica en respuesta al pH del ambiente. El estudio de Schmitt y col. (2001) caracteriz el gen pacC de A. chrysogenum, mostrando que su protena PACC se una a todas las secuencias consenso PACC que estn presentes en las dos regiones intergnicas conocidas de los genes de biosntesis de CPC. (4)

TABLA 4 EFECTOS DE Ph EN PRODUCCION

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Efecto del oxgeno en el sistema respiratorio y en la produccin de CPC La velocidad completa de la sntesis de CPC es severamente reducida en condiciones de concentracin baja de oxgeno. La reduccin en la provisin de oxgeno lleva a la acumulacin de penicilina N, un precursor de la CPC. El mecanismo de control del oxgeno sobre la sntesis de CPC no est completamente comprendido. Posiblemente, los bajos niveles de oxgeno afectan directamente a la ruta biosinttica de la CPC, la cual incluye tres reacciones de oxidacin. Tambin es posible que un metabolismo completo ms eficiente provisto por niveles ms altos de oxgeno, indirectamente resulte en niveles mayores de produccin de CPC. Una revisin de Sandor y col. (2003) indica que A. chrysogenum posee una ruta respiratoria en su mitocondria resistente al cianuro, que se vale de una llamada oxidasa alternativa (AOX) para realizar su funcionamiento. Esta AOX responde de manera primaria a procesos que involucran la generacin de especies que contienen oxgeno reactivo (ROS), incluyendo el incremento de aireacin, el catabolismo de ciertas fuentes de carbono y el envejecimiento. Se prob que la actividad de la AOX juega un papel crucial en la sobreproduccin de CPC a travs de la remocin de equivalentes reductores, permitiendo as que el catabolismo del carbono proceda. Bajo condiciones no productoras, esta relacin se pierde. Sin embargo, una inhibicin de la generacin de ROS resultara inevitablemente en la disminucin de la actividad de la AOX y subsecuentemente en una produccin de CPC reducida, independientemente de la tecnologa de produccin utilizada. PRODUCCION DE CEFALOSPORINAS Las cefalosporinas se pueden obtener directamente por fermentacin o tambin por desasilacion enzimtica hasta formar el acido 7-amino-afalosporanico (7-ACA) seguido de acilacion para introducir la cadena lateral deseada. Por otra parte, los anillos de 5 atomos de las penicilinas pueden alargarse qumicamente a 6 obtendiendo el anillo dihidrotiazina de las cefalosporinas y la cadena lateral puede eliminarse enzimticamente sin necesidad de proteger los grupos reactivos. (9) Como ejeplo, Toyo Jozo Co. Eplea una enzima desasilante de Bacillus megaterium para producir acido 7-aino-desaseloxi-cefalosporanico (7-ADCA) a partir de fenilacetil-7-ADCA. La enzima esta absorbido en celita en un reactor columna empaquetado obtenindose un rendimiento del 85%. Tambin se ha utilizado una enzima similar obtenida de Proteus rattgeri con un rendimiento del 90%. Abbot y Berry emplearon una enzima de Streptoyces capillispira para desesterificar esteres etlicos de las cefalosporinas. (9) En todas las reacciones se acumulan preferentemente los productos estables termodinmicamente; sin embargo, como todas las reacciones son reversibles a nivel microscpico, si seleccionan las condiciones apropiadas se pueden producir la reaccin inversa. Por ejemplo la enzima inmovilizada de B. metaterium puede emplearse para la reaccin inversa, la acilacion de 7-ADCA a 7-ACA. (9)
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Produccin de antibiticos Una cepa de alta produccin es un prerrequisito esencial en cualquier proceso de produccin de antibiticos. Una vez se consigue esto es de la mayor importancia retener las caractersticas y la viabilidad de la cepa durante largos periodos de almacenamiento. El cultivo conservado es una propiedad valiosa y como tal debe ser utilizado tan moderadamente como sea posible. Por tanto es poco deseable inocular directamente un gran fermentador con las grandes cantidades de material conservado que sera necesario para asegurar el desarrollo satisfactorio. Generalmente se toman las cantidades ms pequeas se amplifica mediante crecimiento sobre superficies solidas o en medio liquido el inoculo resultante se encuentran generalmente en la forma de una suspensin preparadas con varios das de antelacin. Para optimizar la productividad del fermentador final generalmente se lleva a cabo parte de la fase de crecimiento en un fermentador de inoculo separado. Producir la cantidad mxima de biomasa en un estado metablico adecuado para conseguir un rpido arranque de la etapa final. IMAGEN 6

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Los antibiticos son metabolitos secundarios; por consiguiente para conseguir la productividad mxima es necesario limitar este crecimiento y encauzar el organismo hacia el metabolismo secundario. Esto se lleva a cabo generalmente diseando el medio de forma que un nutriente clave sea consumido en el momento apropiado, la eleccin del nutriente limitante es importante. En muchas fermentaciones de hongos y estreptomicetos se opera un proceso de alimentacin discontinua en el que la fase de produccin se extiende alimentando nutrientes a lo largo de la fermentacin. En lo que se conoce, ningn antibitico se produce comercialmente por cultivo continuo, aunque este procedimiento es utilizado extensamente para el trabajo experimental en la industria. TABLA 7

El antibitico es solo un componente menor del medio completo (entre 3 y 35 % de los solutos totales en el caldo). La etapa inicial en su recuperacin y purificacin es generalmente la separacin de los microorganismos de la fase liquida por filtracin o centrifugacin. Las tcnicas de procesamiento utilizados para el aislamiento y la purificacin de los antibiticos pueden incluir la extraccin con solventes, el intercambio inico, la ultrafiltracin, la osmosis reversa, la precipitacin y la cristalizacin. Finalmente la masa del producto se seca se utiliza para la preparacin de derivados o para la fabricacin de preparaciones farmacuticas. Las vasijas (para la preparacin del medio) y los esterilizadores no son esenciales para la operacin, puesto que el medio puede prepararse y esterilizarse en el propio fermentador.
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El esterilizador puede ser un esterilizador discontinuo o un esterilizador continuo. Los esterilizadores continuos producan menor dao en el medio, se requiere menos energa para esterilizar un volumen equivalente de medio. Las vasijas de alimentacin que se utilizan para suministrar nutrientes o materiales precursores durante el curso de la fermentacin. La recuperacin de los antibiticos requiere la separacin del organismo, lo que se lleva acabo utilizando un filtro o una centrifuga. Un proceso de recuperacin eficiente es tan esencial como un proceso de fermentacin eficiente.

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IMAGEN 8

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La vasija mas importante es el propio fermentador final. Existe un conjunto de criterios que deben cumplirse cuando se disea un fermentador. Debe tener tanto una alta transferencia de masa gas/liquido, para asegurar un suministro adecuado de oxigeno, como una alta transferencia de nutrientes en la interface para asegurar que los nutrientes sean distribuidos y suministrados rpidamente al organismo. Debe tener buenas caractersticas de mezclado de la masa para asegurar la homogeneidad dentro de la vasija. Por consiguiente deben ser buenos cambiadores de calor. IMAGEN 9

Las fermentaciones comerciales de antibiticos se lleva a cabo en fermentadores de diseo tradicional capaces de mantener entre 30 y 200 metros cbicos de liquido.la altura de las vasijas es de entre 2 y 4 veces el dimetro y se adaptan a las paredes del recipiente un numero de cortacorrientes verticales (4-6) de aproximadamente 1/10 del dimetro de la vasija.

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La agitacin del caldo se realiza mediante una serie de paletas de hoja plana (Rushton). Para mejorar las caractersticas de mezclado de la masa, las paletas superiores pueden ser de tipo marino, de hojas oblicuas o de diseo patentado, por ejemplo la paleta Sabre. El calor generado debe ser eliminado rpidamente a su temperatura optima, tpicamente 24-26C. el calor producido se elimina mediante agua de refrigeracin. El agua se recirculariza a travs de un sistema de torres de enfriamiento que reduce su temperatura a entre 15 y 20 C. Utilizando agua as esta temperatura es posible enfriar fermentaciones de hasta aproximadamente 100 metros cuadrados mediante una camisa o una espiral externa estrechamente adosada. Para volmenes mas grandes el aire disponible para transferir calor es insuficiente a menos que se utilice agua refrigerada (4-8 C) o salmuera refrigerada (0-4 C). Mantener el fermentador por encima de la presin atmosfrica tiene la doble ventaja de impedir la entrada de organismos contaminantes desde el exterior y de aumentar el potencial transferencia de oxigeno al interior del sistema. Los fermentadores tienen adaptadas puertas que permitan la entrada de varias sondas, tradicionalmente para medida del pH y deteccin del nivel de espuma. Algunas fermentaciones de antibiticos requieren la adicin de substancias a lo largo del proceso. El mtodo establecido durante mucho tiempo es la adicin va un sistema bureta que se llena hasta un nivel establecido de volumen y descarga a la vasija a tiempos determinados. Aunque es adecuado para alimentar nutrientes, no es completamente satisfactorio cuando se utiliza para aadir cidos o lcalis para el control del pH. (11) FERMENTACION Cepas de alto rendimiento de A. chrysogenum se utilizan en gran escala, en fermentaciones fed-batch. Los principales productores por fermentacin de C cefalosporina obtienen rendimientos en el rango de 20-25 g / l. las fermentaciones a escala de produccin utilizan como fuente de carbono carbohidratos simples o complejos que son incorporados al medio durante la fase de crecimiento. Conforme avanza la fermentacin la alimentacin de azucares se reduce y son generalmente reemplazadas por aceites de mayor energa tales como aceite de soja o el aceite de man. La conservacin de energa apartir de aceite como sustrato como sustrato es considerablemente menos eficiente y conduce a un crecimiento ms lento, del micelio vegetativo. (10)

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Cultivos en medio lquidos Los trabajos ms recientes que reportan la produccin de CPC por cultivos de Acremonium chrysogenum C10 (ATCC 48272) utilizan medios que contienen dos fuentes de carbono, glucosa y sacarosa. El proceso de produccin de CPC en biorreactores en lote muestra dos fases distintas: durante la primera fase, una fuente de carbono fcilmente metabolizable como la glucosa es rpidamente consumida y es cuando se realiza la mayor parte del crecimiento; mientras que en la segunda fase, una fuente de carbono que se consume lentamente como la sacarosa es asimilada y la sntesis de antibitico empieza. Este es un tpico efecto diauxico del consumo de dos carbohidratos. El lento metabolismo de la sacarosa en la produccin de CPC puede ser explicado por la baja actividad de la enzima responsable de la hidrlisis del azcar durante el proceso, y esto provee de buenas condiciones para la produccin de altas concentraciones de antibitico en procesos en lote convencionales.(4) Algunos trabajos acerca de la produccin de CPC en biorreactor en lote reportan el mejoramiento de la produccin utilizando un medio de cultivo con glucosa y sacarosa, mientras que en otras investigaciones se trabaja con procesos de lotes alimentados, en los que la sacarosa y la metionina se adicionan lentamente, obtenindose mejoras significativas. Sin embargo, la sacarosa es de por si un azcar lentamente metabolizable, y el mejoramiento obtenido por este tipo de aproximaciones debera ser explicado por la adicin de metionina. (4) La informacin acerca de los parmetros cinticos para la produccin de CPC es muy escasa en la literatura. Los parmetros de velocidad especfica de crecimiento y de velocidad de consumo de sustrato ( y Y ) fueron estimados
mx. x/s

por Araujo y col. (1996) para esta misma cepa en experimentos en lote siendo los
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valores calculados 0.0645 h y 0.655g de biomasa/g de sustrato, en experimentos con medio de cultivo con glucosa y sacarosa. Chu y Constantinides (1987) presentan un valor estimado igual a 0.02217 g de biomasa/g de sustrato h y Araujo y col. (1996) obtuvieron 0.036 g de biomasa/g de sustrato h, estos valores se refieren al consumo de sacarosa. No es posible comparar los diferentes valores presentados, debido a que han sido obtenidos bajo condiciones de cultivo significativamente diferentes. (4) En estudios ms recientes, realizados con el objeto de modelar y optimizar la produccin de CPC en biorreactor alimentado, durante la fase de crecimiento solamente se proporcion glucosa como fuente de carbono y en la fase de produccin solamente se adicion sacarosa hidrolizada. Se estimaron los valores de diferentes variables del proceso y se desarroll un modelo matemtico para representar el proceso de produccin de la CPC en el lote alimentado, el cual predice una produccin de CPC mxima estimada de de aproximadamente 2300 g/mL al final de un proceso de 5 das, lo cual es significativamente mayor a lo obtenido mediante la fermentacin en lote bajo condiciones de cultivo lo ms
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similares posible. Sin embargo, los autores no realizan ningn experimento para confirmar esta prediccin, adems de que considerando las proporciones de las dos fuentes de carbono del medio utilizado para realizar la alimentacin del lote es difcil entender como el sustrato se dirige a la produccin de CPC siendo la concentracin de glucosa muy similar a la del medio inculo donde la glucosa tiene como principal finalidad el crecimiento y no la produccin de CPC.(4)

Cultivos en medio slidos Wang y col. (1984) investigaron la produccin de CPC en FS con arroz como sustrato basal. Entre diferentes granos estudiados como sustrato basal, el arroz Tsailai fue el mejor. Se determin la mejor frmula (Anexo 6A) para el medio de fermentacin en la base de 10 gramos de arroz y utilizando la cepa M8650-R-3
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de Acremonium chrysogenum, con una densidad de inculo de 2.8 X 10 esporas/g de sustrato, humedad inicial de 49-51% y temperatura de fermentacin de 25 C. Despus de 7 das de fermentacin, la produccin mxima de CPC fue de 6420 g/g de sustrato. Resulta complicado el anlisis del medio de cultivo en este caso debido a que se podra presumir una alta concentracin de fuente de carbono aprovechable del soporte (arroz Tsailai), pero no existe evidencia de la proporcin de sta que realmente es accesible para el hongo, ya que no se realizan mediciones de biomasa o sustrato consumido.(4) En estudios en los que se utiliza como soporte cebada, y Acremonium chrysogenum C10 como microorganismo productor (Jermini y Demain, 1989), apenas se alcanza una produccin mxima de 950 g/g de sustrato despus de 10 das de fermentacin slida. (4) Otros estudios acerca de la produccin de CPC empleando Acremonium chrysogenum ATCC 48272 (cepa C-10) por cultivo en medio slido, indican que los mejores resultados fueron observados con 10 g de trigo crudo adicionado con sustratos complementarios (Anexo 6B), obteniendo una produccin de CPC de 22281 g/g de sustrato despus de un perodo de incubacin de 5 das, a 30 C,
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inoculado con 2 X 10 esporas/g de sustrato, con una humedad del 80% y un pH de 6.5. En este estudio tambin se observa la carencia de mediciones de produccin de biomasa y consumo de sustrato, por lo que no se indican tampoco reportes acerca de la eficiencia del proceso, adems de que no hay un seguimiento cintico de este. (4)

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SINTESIS DE CEFALOSPORINAS Por ser el enlace Betalactmico de una elevada sensibilidad frente a cidos y bases, requieren todos los procesos de sntesis y semisntesis donde est involucrado el anillo betalactamico la presencia de agentes que acten activando posiciones, grupos protectores que pueden ser eliminados fcilmente y temperaturas de reaccin tan bajas como sea posible. Estas condiciones son muy generales para la obtencin de todas las cefalosporinas. SECUENCIA GENERAL DE SINTESIS - Ruptura qumica o enzimtica de la cefalosporina C a 7-ACA. - Desplazamiento del residuo 3-acetoxi en el 7-aca con nuclefilos S Y N. - Sntesis del cido de la cadena lateral y si es necesario la proteccin de los grupos funcionales. - Acoplamiento del cido con la cadena lateral con el esqueleto 7-amino cefem y si es necesario la remocin de los grupos protectores. - Preparacin de sales estables y fisiolgicamente bien toleradas. En nuestra Empresa Farmacutica " 8 de marzo" han sido obtenidas tres cefalosporinas de primera generacin por la va de la sntesis qumica: - Cefalexina monohidrato a escala semi-industrial . - Cefadroxil monohidrato a escala de laboratorio. - Cefalexina sdica escala de laboratorio. Otras modificaciones en el anillo dihidrotiazinico y diferentes sustituciones en el anillo B-lactmico conllevaran a la obtencin de nuevas estructuras ms potentes y especficas contra bacterias resistentes a estas dos familias de las cuales les hemos comentados en estos dos nmeros. La investigacin para obtener antibiticos ms potentes tendrn que permanecer como una tarea permanente del desarrollo quimioteraputico, si queremos mantener un alto nivel en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Las nuevas drogas tendrn que ser seleccionadas y evaluadas de acuerdo a la eficacia, tolerancia y necesidad de acuerdo a criterios muy estrictos antes de que sean usadas en la prctica clnica.

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ECONOMIA La produccin de antibiticos ha sido sin duda un negocio altamente provechoso para la industria farmacutica en el mundo industrializado. El comercio mundial de estos productos tiene un valor superior a los 5 millones de dlares por ao y es el segmento mas valioso del mercado farmacutico total (unos 200 millones de dlares). Gracias a las innovaciones tecnolgicas, a medida que las ventas de antibiticos se incrementan disminuyen sus costos de produccin. En 1992, las cefalosporinas (productos derivados de la cefalosporina C y de las penicilinas G o V) constituyen uno de los sectores de negocios mas importantes dentro del mercado farmacutico global, con unas ventas de 8.3 millones de dlares. (12) CONCLUSION La produccin de antibiticos es una industria en vas de desarrollo sobre todo la de las cefalosporinas ya que queda mucho por descubrir aun. Las cefalosporinas son antibiticos muy eficaces, pero su produccin por vas fermentativas aun esta limitada ya que sus niveles de aprovechamiento son reducidos en comparacin con el de la penicilina, por lo tanto i conclusin es que vale la pena centrar la atencin en las cefalosporinas ya que son compuestos con mucho potencial tanto por la salud como econmicamente.

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BIBLIOGRAFIA
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TRANSFORMACIN, TESIS DOCTORAL, 1993. PAG 1, 2.

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ACREMONIUM CHRYSOGENUM C10, TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN BIOTECNOLOGA, 2004. PAG 4.

(5) RIVAS, KB, RIVAS, MA, DAVILA, EL ET AL. CEFALOSPORINAS: DE LA PRIMERA A LA CUARTA GENERACIN. RFM, DIC. 2002,
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(6) NDUKA OKAFOR; MODERN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY; SCIENCE PUBLISHERS; 2007. PAG. 458 (7) DR. REN ZAMORA MARN,DR. ALEJANDRO AREU REGATEIRO,DR. JOS GUNDIN,DR.RUBN MANRESA,DRA. JULIETA
SNCHEZ Y RAFAEL MORALES SIRGADO ; CEFALOSPORINAS; REVISTA ACTA MEDICA, 1998, VOL 8.

(8) PEREZ VARGAS SILVIA. MONOGRAFA CEFALOSPORINAS (REQUISITO PARA TITULO DE LICENCIATURA, QBP)
, UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIHUAHUA, 1996, PAG. 4,

(9) A WISEMAN, MANUAL DE BIOTECNOLOGA DE LOS ENZIMAS, EDITORIAL ACRIBIA, S.A. 1991, PAG. 363 Y 364. (10) R.P. ELANDER.INDUSTRIAL PRODUCTION OF BETA-LACTAM ANTIBIOTICS, (11) (12) E. SMITH JOHN. BIOTECNOLOGIA, ED. ACRIBIA S.A. 2004. PAG 134.

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