1.

FUNDAMENTO DE ESPECTROFOTOMETRIA

La medida de la emisin y la absorcin de la luz por parte de las sustancias se denomina espectrofotometra a menudo simplificado como espectrometra. Los trminos absorcin y emisin tienen el mismo significado que el de su uso cotidiano, absorcin significa tomar y emisin significa dar. Cuando coloquialmente se utiliza el trmino luz, nos referimos normalmente a la luz visible para muestras rojas. Sin embargo, la luz visible es nicamente una pequea parte del espectro electromagntico, que incluye la radiaciones de radio, microondas, infrarrojo, visible, ultravioleta, rayos X y rayos gamma. Los instrumentos especficos utilizados para la espectrometra se denominan espectrofotmetro, espectroradimetro o espectrmetro, dependiendo de su construccin. La produccin y deteccin de radiacin requiere de diferentes tcnicas en diferentes regiones del espectro electromagntico. Sin embargo, en todos los mtodos espectromtricos se mide fundamental mente no variable; la longitud de onda (o energa) de la radiacin y la cantidad de radiacin de una longitud de onda. Cuando un material especifico absorbe energa de la luz, absorbe nicamente cierta longitud de onda. Para otras longitudes de onda, el material puede ser transparente. De manera similar, cuando un tomo o molcula emite luz, solo lo hace a sus longitudes caractersticas. A otras longitudes de onda no se produce emisin en resumen se podra decir que la longitud de onda absorbida y emitida dependen de la identidad del compuesto. Estas longitudes de onda permanecen iguales pese a la cantidad de analitos presentes sin embargo la cantidad de luz absorbida o emitida dependen de la concentracin de compuestos presentes en el paso ptico. Dentro de los mtodos pticos de anlisis qumicos, la espectrofotometra de absorcin ocupa un gran espacio, pues la determinacin fotomtrica de absorcin se presenta en gran medida, la fase ultima de la cuantificacin de gran cantidad de analitos, por lo que es importante conocer su fundamento.

NATURALEZA DE LA ENERGIA RADIANTE. Definimos energa radiante como energa transmitida (a travs del espacio a grandes velocidades) en forma de radiaciones electromagnticas, la misma puede ser emitida por sustancias que se someten a gran excitacin, producida por descargas elctricas o por altas temperaturas, por ejemplo: Dicha energa puede ser absorbida, reflejada, absorbida o reflejada por muchas sustancias en diversas fases (slido, lquido o gaseoso) siempre y cuando la radiacin incidente posea una longitud de onda apropiada.

El campo de fuerza de toda radiacin electromagntica conocida posee dos componentes, uno elctrico y otro magntico (perpendiculares entre si y perpendiculares a su direccin y propagacin) La REM (Radiacin electromagntica) posee naturaleza dual al sufrir difraccin, reflexin, refraccin o dispersin, exhibe propiedad de onda, aunque no requiera de un medio fsico para propagarse en los fenmenos de absorcin y de emisin, la REM pone tambin las propiedades de las partculas descritas o paquetes de energa llamada fotones. El espectro electromagntico completo (que colecta todos los tipos de REM conocidos hasta la fecha) abarca algo ms de 20 rdenes de magnitud de longitud de onda (por lo que dicho de paso su representacin se debe hacer a escala logartmica) La subdivisin usual del espectro electromagntico se hace en trminos de reglones, caracterizados por nombres, longitudes de onda y frecuencia. Definimos longitud de onda como la distancia medida a lo largo de la lnea de propagacin entre dos crestas (o dos valles) de dos ondas adyacentes tambin definimos frecuencia como el nmero de ondas que pasan por un punto fijo en la unidad de tiempo (sus unidades cm/s). La frecuencia de la longitud de onda esta relacionada con la ecuacin: = C/ Donde C es la velocidad de la radiacin que es 2.9979x 1010 cm/seg en el vaco. La regin comprendida entre 200 y 2000 nm de longitud de onda es de particular inters en el caso de la espectrofotometra de absorcin. Las bandas de frecuencias comprendidas entre los 400 y 750 nm pueden ser percibidas bajo la forma de color por el ojo humano. Siendo la sensacin de color la respuesta a una serie de estmulos combinados qumicos, fsicos y biolgicos de ciertas partes de la retina del ojo. Para ese rango de longitud de onda. La radiacin ultravioleta cuya longitud de onda es menor que de la regin visible (200 a 400 nm) y la radiacin infrarroja de longitud de onda superior (750 a 2000 nm), no pueden ser registradas por el ojo humano; pero si pueden ser medidas con la ayuda de fotodetectores adecuados (transductores de energa, que transforma REM en energa elctrica).

ABSORCIN Se denomina absorcin al proceso por el cual una especie inica, atmica, o molecular, en un medio transparente, capta selectivamente ciertas frecuencias de radiaciones electromagnticas, como para que esto ocurra total o parcialmente es imprescindible, por supuesto, que la energa asociada a la radiacin incidente sea aquella que requiere la especie para excitarse; si este es el caso, se dice que la energa de radiacin incidente resuena con la sustancia.

FUNDAMENTO DE LA ESPECTROFOTOMETRIA Los mtodos espectroscpicos de anlisis estn basados en la medida de la radiacin electromagntica emitida, absorbida o dispersada por la materia. Los mtodos de emisin utilizan la radiacin emitida cuando un analito es excitado por energa trmica, elctrica o radiante. Por el contrario los mtodos estn basados en la disminucin de la potencia (o atenuacin) de la radiacin electromagntica como consecuencia de la absorcin que se produce en su interaccin con el analito.

INTERFERENCIAS EN ESPECTROFOTOMETRIA Interferencias espectrales: la absorcin o emisin de otros componentes de la matriz que se produce a la(s) misma(s) longitud(es) de onda(s) que la utilizaba para el anlisis. Interferencias qumicas: el material a determinar no se encuentra en la misma forma qumica en todo el intervalo de concentracin del anlisis por la forma varia significativamente con los cambios en la matriz. As parte del comportamiento espectral esperado puede no aparecer a la(s) longitud(es) de onda(s) elegida(s) para el anlisis. Interferencia instrumental: la iluminacin en exceso llega al transductor debido a imperfecciones en el instrumento.

SELECCIN DE LONGITUD DE ONDA Para obtener la mxima selectividad en una determinacin espectrofotometra, el color de la luz que presenta la absorcin mxima o casi mxima debe atravesar la solucin. Una solucin azul absorbe con fuerza el color rojo; por lo que para la determinacin de soluciones de color azul se escoge una longitud de onda situada en la regin roja del espectro. Ocasionalmente se realizan determinaciones intencionadas a una longitud de onda que no coincide con el mximo de absorcin para reducir as la posibilidad de interferencias debida a otras sustancias. Aunque tal situacin no es la ideal, una reduccin de la sensibilidad muchas veces resulta menos crtica que una interferencia. Esta reduccin de sensibilidad suele conseguir la linealidad o la extensin de la porcin lineal de una curva de trabajo. Muchas metodologas seguidas en qumica clnica utilizan esta estrategia para reducir la no linealidad en la reaccin de color especfico. La mayora de los anlisis realizados en el laboratorio de qumica clnica dependen de la determinacin de la cantidad de luz absorbida por cada una de las sustancias examinadas. Estas mediciones tienen lugar en la zona visible del espectro, algunas en la ultravioleta y unas pocas en la regin infrarroja. Sin embargo, los nuevos instrumentos y las mejoras metodologas estn contribuyendo hacer cada vez mas practicas las aplicaciones en el campo de la espectrofotometra infrarroja. En los laboratorios clnicos se utilizan instrumentos infrarrojos para determinar la composicin de clculos renales y biliares, y analizar sustancias toxicolgicas purificadas.

LONGITUDES DE ONDA Y COLORES ESPECTRO VISIBLE Y ULTRAVIOLETA Longitud de onda 180 - 220 220 340 340 - 430 430 - 475 475 495 495 505 505 - 555 555 675 675 600 600- 620 620 -700 Regin UV corto UV Visible Visible Visible Visible Visible Visible Visible Visible Visible

COMPLEMENTARIOS

DEL

Color absorbido No visible No visible Violeta Azul Verde azul Azul verde Verde Verde amarillo Amarillo Naranja Rojo

Color complementario o de la solucin ----Amarillo verdoso Amarillo Naranja Rojo Prpura Violeta Azul Azul verde Verde azul

LEY DE BEER La ley de Beer indica que la concentracin de la sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida. La relacin matemtica existente entre la energa radiante y la concentracin de la solucin esta indicada por la ley de Beer. A = a.b.c A = Log 100/% T A = 2 log % T En donde A es la absorbancia, a, coeficiente de absorcin, b, longitud de la solucin en cm, c, concentracin de la sustancia de inters. Y % T es porcentaje de transmitancia. La transmitancia T, se define como la relacin entre la luz transmitida (I) e incidente (I0). La relacin antes indicada constituye la base de todas las determinaciones espectrofotomtricas de absorcin y es el resultado de las contribuciones de ambos individuos LAMBERT Y BOUGUER. Y otros contribuyeron independientemente a la forma anterior, normalmente denominada ley de Beer.

LIMITACIONES DE LA LEY DE BEER. La ley de Beer es una relacin matemtica terica que en la practica contiene varias limitaciones en este sentido existe tres casos en que no se cumple la ley de Beer; absorbancia simultanea a varias longitudes de onda, absorcin de luz por otra especie y transmisin de luz por otros mecanismos. En conclusin la ley de Beer solo se cumplir

si la radiacin incidente sobre la sustancias de inters es monocromtica, si la absorcin del solvente es insignificante en comparacin con la absorbancia del soluto, si la concentracin de este, se mantiene dentro de los limites lineales, y si no se produce una reaccin qumica entre la molcula de inters y u otro soluto o molcula de solvente.

COMPONENTES DE LOS ESPECTROFOTOMETROS Fuente de energa: la misin de la fuente de energa es proporcional energa radiante de luz visible o no visible; la cual pasa a travs de un monocromador descomponindose en sus diferentes longitudes de onda. A continuacin se hace incidir la luz de longitud de onda adecuada sobre la cubeta en la que se halla la solucin cuya absorcin quiere medirse. Rendija de entrada: la funcin de la rendija es rendir al mximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa penetre en el sistema de filtro monocromtico. Hay que impedir que la luz difusa a traviese la cubeta o de lo contrario no se cumplir la ley de Beer. Monocromtico: asla la longitud de onda especfica de la luz mediante la utilizacin de prisma, rejillas o ambas. Filtro de interferencias: se utilizan para conseguir una pureza espectral en lugar de usar prisma o redes de refraccin. Cubetas: mantiene la solucin en el instrumento mientras se realiza la medicin de la absorcin. Tubo fotomultiplicador como detector: un fotomultiplicador es un tubo de electrones capaz de amplificar de forma significativa una corriente. Se construye de un material sensible a la luz que emite electrones en proporcin a la energa radiante que incide sobre la superficie de dicho material sensible.

Intensidad de a luz incidente (I0)

Intensidad de a luz transmitida (I)

Lmpara

Monocromador

Detector Cubeta de la muestra

Medidor

A
Rendija de entrada

Rendija de entrada

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DEL ANALITO APARTIR DEL ESPECTROFOTOMETRO. Cuando se realizar una medicin a travs de la espectrofotometra absortiva para la determinacin de una concentracin desconocida, debemos contar con la siguiente informacin: Concentracin del estndar (lo da la casa comercial). Densidad ptica del estndar. (se obtiene en el equipo) Densidad ptica de la muestra

Con esta informacin podemos realizar la siguiente relacin:

Cmuestra/DOmuestra = Cestndar/DOestndar Despejando concentracin de la muestra tenemos lo siguiente: Cmuestra = (Cestndar/DOestndar) * DOmuestra

RECOMENDACIONES PARA EL USO DEL ESPECTROFOTOMETRO 1. No dejar abierto ningn compartimiento para evitar la entrada de polvo. 2. Cuando que halla de moverse ha de hacerse con cuidado para no descentrar el sistema ptico. 3. No debe sufrir cambios bruscos de temperatura. 4. Las cubetas deben estar bien limpias y sin rayaduras. 5. No tocar las cubetas con los dedos, especialmente por la cara que recogen y transmiten la luz. 6. No usar el equipo recin encendido ya que la lmpara necesita estabilizarse. 7. No dejar encendido el equipo, ya que la lmpara puede desgastarse o fundirse. 8. Al finalizar la practica dejarlo limpio, tapado y desenchufado.

BIBLIOGRAFA KA. RBINSON Anlisis Instrumental. TUDD SANFORD. Diagnostico y Tratamiento Clnicos Por el laboratorio. PALUMN MONTES ALONSO. PROYECTO uri, Laboratorio II. CASA JAIME. Instrumentacin Qumica Avanzada y Anlisis Qumico Parte I y II.

PRACTICA N 1

3. DETERMINACION DE LAS PROTENAS DEL SUERO SANGUNEO

La concentracin de las protenas plasmticas en un momento dado es el resultado de tres procesos: el ritmo de sntesis, el volumen de lquido en el que se distribuyen y el ritmo de degradacin. La interpretacin clnica de los datos obtenidos debe hacerse teniendo en cuenta estos tres factores.

FUNDAMENTO La solubilidad de una buena cantidad de protenas es funcin de la fuerza inica, el pH y la concentracin de solventes orgnicos. Dicha solubilidad disminuye en presencia de altas concentraciones d sal, por la deshidratacin que estas sufren. En esta prctica al suero sanguneo se le agrega sulfato de sodio hasta obtener una solucin saturada, la cual precipita la seroglobulina pero no a la seroalbumina, que queda en solucin, esta ltima se determina cuantitativamente por el mtodo de Biuret. La reaccin de Biuret es el anlisis proteico total que utiliza la mayora de los analizadores qumicos automticos para determinar protenas sricas totales; se basa en que todas las protenas contienen un gran nmero de enlaces pptidicos; estos enlaces reaccionan con iones cobre en un medio moderadamente alcalino formando un complejo coloreado entre el in cobre y los grupos carbonilos (C=N-H) de los enlaces pptidicos por medio de enlaces coordinados. Las protenas dan un color de rosa a violeta rojizo, la intensidad del color depende, de la cantidad de protenas presentes (cantidad de enlaces pptidicos disponibles para la reaccin). Los aminocidos y dipptidos no pueden dar la reaccin.

CORRELACION BIOQUIMICO CLINICA La determinacin cuantitativa de protenas totales se realiza en suero, como parte de casi todos los anlisis de qumica sangunea, estas estn integradas por la fraccin albmina y la fraccin globulina. La primera principalmente regula la presin osmtica coloidal de la sangre, aporta la nutricin celular, interviene en el equilibrio cido bsico, trasporta los lpidos originando los compuestos que se denominan lipoprotenas, sirve de medio de transporte a multitud de elementos como calciotiroxina, esteroides, hierro, cobre, vitaminas liposolubles como A, D y E. Se sintetiza e el hgado, y representa ms de la mitad de las protenas presentes en el suero. La principal alteracin de la albmina plasmtica es la hipoalbuminemia. La hipoalbuminemia puede ser causada por un aumento de las perdidas proteicas que es ocasionado por enfermedades como: Sndrome nefrtico, glomerulonefritis,

hemorragias extensas por traumatismos, y en pacientes con quemaduras extensas. o puede deberse a una disminucin de la sntesis proteica como consecuencia de una alimentacin defectuosa o una cirrosis. Por ltimo la absorcin reducida de aminocidos tambin conlleva a hipoalbuminemia. La manifestacin ms llamativa de la hipoalbuminemia, es el edema y el estudio debe verificarse por medio electrofortico. La fraccin globulina se sintetiza principalmente por las clulas plasmticas y tiene como misin principal, fabricar anticuerpos (inmunoglobulinas). Cabe notar que cuando hay hemoconcentracin por choque, vmitos diarrea profusa, quemaduras, sudoracin excesiva, fstulas digestivas, entre otras, se obtiene una falsa hiperproteinemia.

PARTE EXPERIMENTAL Agregar a 0.25 ml de suero 3.75 ml de sodio al 23% y 2 ml de eter etlico, agitar bien. Centrifugar 5 minutos aproximadamente a 2.000rpm y observar la capa inferior del tubo que es el centrifugado para la determinacin de albmina.

Centrifugado Suero Muestra Suero Patrn Agua Destilada Hidrxido de Sodio Sulfato de Cobre

Muestra(ml) (Protenas totales) __ . __ 0.1 __ . __ 1.9 8.0 1.0

Patrn __ .__ __ .__ 0.1 1.9 8.0 1.0

Albmina (ml) 1.6 __ .__ __ .__ 0.4 8.0 1.0

Blanco ( ml) __ .__ __ .__ __ .__ 2.0 8.0 1.0

Mezclar, dejar en reposo 10 minutos a temperatura ambiente y leer a 540 nm.

CALCULOS Concentracin de la muestra =

AM Ap

* C.P

Concentracin de Albmina =

A. A * C.P A.P

Concentracin de globulinas = Cmuestra Calbmina AM = Absorbancia de la Muestra AP Absorbancia del patrn AA Absorbancia de la Albmina.

Valores de referencia: Albminas: Globulinas: Protenas totales: 3.5 5.5 mg/dL 2 3 mg/dL 5.5 8.5 mg/dL

PREGUNTAS A INVESTIGAR 1. Cuales son las protenas del plasma sanguneo. 2. Cuales son los valores de referencia para protenas totales, albmina y globulinas. 3. Enumere las principales funciones de las protenas plasmticas y de ejemplo de ello. 4. Explique el fundamento para la determinacin de protenas totales en el laboratorio. 5. Mencione los diferentes tipos de proteinuria y explique cada una de ellas. 6. Esquematice el patrn electrofortico de las protenas del suero. 7. En la tcnica de separacin de protenas por salazn que fraccin proteca es la que se cuantifica en forma directa? 8. Mencione las diferentes causas de hipoalbuminemia, con sus respectivos ejemplos.

BIBLIOGRAFA Anderson Cockayne Qumica Clnica. Mc. Graw Hill. Lpez Colome Ana Mara. Bioqumica y Biologa Molecular. Manual de Prcticas del Laboratorio. Facultad de Medicina U.N.A.M. ( Mxico). Departamento de Bioqumica 1999 2000. Roskoski J. R. Bioqumica MC Graw Hill. Interamericana. 1997. Thelma del Castillo, Alvear Ciro. Acevedo Berta. Tcnicas bsicas de la Bioqumica en el Laboratorio. Universidad de Cartagena. Facultad de medicina. 1993. Kaplan pesce. Editorial mdica Panamericana. 1986.Qumica clnica. Tcnicas de Laboratorio Fisiopatologa mtodos de anlisis. Teora, anlisis y correlacin. J. M. Gonzles de Buitrago, E. Anilla ferreiro. E Col. Bioqumica Clnica. Mc Grw Hill. Interamericana 1999. Laboratorio al da. Protenas de utilidad Clnica. Volumen 5 No 2, 1995.P 93 102.

HOJA DE REPORTE

Titulo de la Prctica. ____________________________________________

Nombre de los alumnos

Muestra Albmina

Absorbancia Muestra

Absorbancia del patrn

Concentracin Del patrn

Concentracin de la Muestra

Globulina

Protenas totales

OBSERVACIONES. ________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

CONCLUSIONES. ______________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

FECHA.___________________

VoBo DOCENTE.________________________