Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Zacatecas Ingeniera en alimentos Bioseparaciones Fluido-Fluido c. Dr. en C.

Denys Kristalia Villa Gmez Alumnos: Mara T. Herrera Longoria & Martn Calvillo Muoz Proyecto de investigacin (Procesos de separacin de las protenas unidad II)

Cules son los procesos tpicos de separacin de las protenas del suero de la leche? Ultrafiltracin cromatografa lquida, cromatografa de intercambio anionico y cromatografa de exclusin molecular1. Explique los diferentes procesos incluyendo claramente cul es la fuerza impulsora separante de cada proceso ULTRAFILTRACIN La Ultrafiltracin se caracteriza por poseer un espectro de corte que va de 3000 a 100.000 KDa. El corte ms comn para sistemas de lechera es 10.000. Este es el tamao de poro tradicional para separar las protenas del suero de la lactosa, para producir concentrados de protena de suero (WPC) desde 35% a 85%2. La ultrafiltracin (UF) es una tcnica que opera gracias a una diferencia de presin como fuerza impulsora, logrando separar partculas que se encuentran en el rango entre 0,001 m a 0,05 m, equivalente a pesos moleculares entre 0,5 y 500 Kdalton, aproximadamente. El solvente y los solutos de bajo peso molecular (tales como azcares, sales, aminocidos) pasarn a travs de la membrana, quedando retenidas las grandes molculas. Por esto, la principal aplicacin de la UF es la concentracin, fraccionamiento y purificacin de macrosolutos en solucin acuosa, tales como protenas y carbohidratos2. En ultrafiltracin el tamao de poros se expresa en trminos del peso molecular de las sustancias que pueden ser retenidas por la membrana, teniendo como referencia protenas de tipo globular. Para la UF, el gradiente de concentracin causado por la acumulacin de sustancias de alto peso molecular, en el lquido adyacente a la membrana, determina un efecto osmtico despreciable. En ausencia de fenmenos de incrustacin superficial el flujo de permeado, JP, se rige por la ley de Darcy, por ende es directamente proporcional a la diferencia de presin aplicada e inversamente proporcional a la viscosidad de la fase lquida2. El equipo empleado consta de un cassette de Pellicon con membranas de polisulfona, corte de peso molecular de 10 kDa. Las soluciones se impulsan con una bomba de velocidad variable. Se emplea un cartucho de microfiltracin para proteger la membrana de UF del ensuciamiento provocado por partculas de mayor tamao. La concentracin de protenas por UF se realiza eliminando continuamente el flujo de permeado, el proceso se detiene cuando se logra la concentracin deseada de slidos en el concentrado3.
1

Etapa de liofilizacin: Los concentrados proteicos obtenidos por UF son congelados a 40 C y liofilizados empleando un liofilizador a un bar de presin durante 48 horas. Durante este proceso las molculas de protenas pueden sufrir la prdida de su conformacin es decir desnaturalizarse, debido a la eliminacin del agua. Para evitar o minimizar este fenmeno, el concentrado de plasma bovino fue liofilizado utilizando azcares como agentes protectores3.

Ilustracin 1. Esquema equipo de ultrafiltracin3. En la ilustracin uno se muestran las partes que conforman el equipo de ultrafiltracin: 1) Bao termosttico; 2) Serpentn; 3) Tanque de alimentacin; 4) Termmetro; 5) Bomba peristltica; 6) Entrada de la solucin de alimentacin; 7)Flujo de permeado; 8) Flujo de concentrado; 9) Celda de UF; 10) Sensores de presin3.

Ilustracin 2. Esquema ultrafiltracin leche/suero4.

CROMATOGRAFA LQUIDA Es una forma de cromatografa de lquidos que a menudo se utiliza para analizar o purificar mezclas de protenas. Al igual que en otras formas de cromatografa, la separacin es posible debido a que los diferentes componentes de una mezcla tienen diferentes afinidades para dos materiales, una fase mvil fluido en movimiento puede contener imidazol que pasa a travs de un slido poroso. En FPLC de la fase mvil es una solucin acuosa, o "tampn". La tasa de flujo del lquido intermedio se controla mediante una bomba de desplazamiento positivo y normalmente se mantiene constante, mientras que la composicin del tampn se puede variar mediante la elaboracin fluidos en diferentes proporciones a partir de dos o ms depsitos externos. La fase estacionaria es una resina compuesta de perlas, por lo general de agarosa reticulada, embalado en un vaso cilndrico o columna de plstico. FPLC resinas estn disponibles en una amplia gama de tamaos de grano y ligandos de la superficie dependiendo de la aplicacin5. En la estrategia de FPLC ms comn, de intercambio inico, una resina se elige de manera que la protena de inters se unir a la resina mediante una interaccin de carga, mientras que en el tampn A pero disociarse y volver a la solucin en tampn B. Una mezcla que contenga uno o ms protenas de inters se disuelven en 100% de tampn A y se bombea a la columna. Las protenas de inters se unen a la resina mientras que otros componentes se llevan a cabo en el tampn. La velocidad de flujo total de la memoria intermedia se mantiene constante, sin embargo, la proporcin de tampn B se incrementa gradualmente de 0% a 100% de acuerdo con un cambio en la concentracin programada. En algn momento durante este proceso, cada una de las protenas unidas se disocia y aparece en el efluente. El efluente pasa a travs de dos detectores que miden la concentracin de sal y la concentracin de protenas. Como se eluye cada protena que aparece en el efluente como un "pico" en la concentracin de protena y se puede recoger para su uso posterior5. Las muestras se disuelven en una fase mvil (FM) lquida que se hace pasar a travs de una fase estacionaria (FE) inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o lecho cromatogrfico. Los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la FM y FE dependiendo de la afinidad por ambas fases, desplazndose a velocidad distinta, debido a la distinta movilidad, los componentes se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativamente y/o cuantitativamente. Fuerzas polares6. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO Mtodo usado principalmente para la separacin de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos en dos fases: estacionaria y mvil7. Las retenciones de la protena de suero pueden tener su origen en dos fenmenos de interaccin entre las dos fases: adsorcin y absorcin7. Mtodo de separacin que permite la separacin de molculas basadas en sus propiedades de carga elctrica7. Fase estacionaria: Insoluble, lleva en la superficie cargas electrostticas fijas que retienen contraiones mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil7.

Fase mvil: Disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene que contiene especie inicas en forma generalmente de buffer. Los iones de la fase mvil compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria7. Principio: las molculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases: Las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable.Se eluye de la columna con tampones de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del tampn con el material, por los sitios de unin.La fuerza impulsora es un gradiente de fuerzas inicas7. Este tipo de mtodo de separacin se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el solvente y los sitios cargados de la fase estacionaria, la cual consta de una matriz (R) con grupos funcionales cargados (A) y contraiones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse en especies de la misma carga contenidas de la fase mvil (X). Fuerzas inicas8. RA M+ + X+ RAX+ + M+ (intercambio catinico) 8. RA+M + Y RA+Y + M (intercambio aninico) 8.

Ilustracin 3. Cromatografa de intercambio inico8. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel o de tamiz molecular) es una de las tcnicas ms sencillas de las empleadas en la separacin de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza en columnas cilndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por grnulos (partculas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamao de dimetro determinado9. Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de una columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el dimetro de los poros de las partculas, slo podrn moverse en su camino, a travs de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se vern retrasadas en su descenso. En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las partculas se vern retrasadas por la fase

estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen en este tipo de cromatografa por orden decreciente de tamao molecular9.

Ilustracin 4. Mecanismo de la cromatografa de exclusin9.

Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partculas de menor masa molecular. De ah que las partculas de mayor peso molecular salgan primero9.

Ilustracin 5. Diferentes compartimentos dentro de la columna9. REFERENCIAS:

1

Separacin de protenas de suero de leche por cromatografa lquida. Disponible en: http://revistas.unitru.edu.pe/index.php/scientiaagrop/article/view/12 fecha de consulta 8 de noviembre de 2013. 2 Disponible en. upcommons.upc.edu/pfc/bitstream/2099.1/6233/4/03_Memria.pdf. Fecha de consulta 8 de noviembre de 2013. 3 Disponible en: Propiedades ultrafiltracin. http://www.fcai.uncu.edu.ar/upload/03atcfurlan-unsl.pdf. Fecha de consulta 8 de noviembre de 2013.

Obtencin de derivados lcteos por ultrafiltracin. Disponible en: http://www.gruposeta.com/imagenes/pdf/articulo-revista-alimentaria-201302.pdf. Fecha de consulta 12 de noviembre de 2013. Cromatografa lquida rpida de protenas, Componentes del sistema FPLC, Columnas FPLC, Optimizacin de la purificacin de protenas. Disponible en: http://centrodeartigos.com/articulos-informativos/article_66342.html. Fecha de consulta 12 de noviembre de 2013. 6 Disponible en: Separacin de protenas de suero de leche por cromatografa lquida http://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=3710919 Fecha de consulta: 9 septiembre 2013. 7 Cromatografa de intercambio inico. Disponible en: http://www.slideshare.net/valentinapaz90/cromatografia-de-intercambio-ionico. Fecha de consulta 12 de noviembre de 2013. 8 Disponible en: Cromatografa http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qa3/Clases_Teoricas/HPLC_primera%20parte.pdf fecha de consulta: 12 de noviembre de 2013 9 Separacin de protenas por cromatografa de exclusin molecular. Disponible en: http://bioquibi.webs.ull.es/practicas/6.pdf. Fecha de consulta 12 de noviembre de 2013.