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UNIVERSIDAD NACIONAL JOS FAUSTINO SNCHEZ CARRIN

FACULTAD DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL Y AMBIENTAL E.A.P ENGENIERA AMBIENTAL

CURSO: Microbiologa TEMA: Prcticas de laboratorio en microbiologa PROFESOR: Blgo_Mbglo. Noriega Crdova, Huberto Williams AUTORES: Chvez Castro, Viky Solano Quispe, Alicia Livias Caldern, Kenji Moreno Marcos, Sulen

CICLO: VI

HUACHO, 2013

PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

PRACTICA N1
PREPARACIN EN FRESCO I. INTRODUCCIN

El examen en fresco es uno de los procedimientos ms simples para observar cualquier microorganismo. Las coloraciones se utilizan para visualizar la morfologa. Las coloraciones simples son las que utilizan un solo colorante (Azul de Metileno, Azul de Lactofeno, Violeta de Genciana). Uno de los aspectos ms notables de los microorganismos es su tamao pequeo. En las bacterias las dimensiones se calculan en unidades de micrmetro (1um = 0.001mm). En cuanto a su forma hay tres tipos distintos; la forma esfrica o cocos, alargadas o bacilos y las espiraladas o espiroquetas. Cuando los cocos se agrupan en pares se denominan diplococos, si es en cadena, estreptococos y si es en racimos, estafilococos. Estas caractersticas morfolgicas proporcionan la base principal para su sistematizacin morfolgica. En cuanto a los hongos pueden presentar la forma redondeada como las levaduras o la forma filamentosa como los mohos. Los virus en cambio solo se visualizan a travs del microscopio electrnico por su tamao menor de 300 nanmetros (1nm=0.000001mm). La morfologa de las bacterias se puede examinar de dos maneras: 1. Observando los microorganismos vivos sin teir. 2. Observando los microorganismos muertos, teidos con colorantes. Las bacterias vivas son casi incoloras y no tienen suficiente contraste con el agua en el cual estn suspendidas. Tindolas se les da contraste en color con respecto al medio que les rodea, con lo cual son ms visibles. La morfologa bacteriana nos ayuda al diagnstico, un examen apropiado y cuidadoso de las bacterias nos proporciona una informacin adecuada (caracterizacin de la especie). Conociendo que el protoplasma bacteriano tiene el mismo ndice de refraccin que el agua, es indispensable emplear procedimientos de tincin que permite visualizarlas.

PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] En esta prctica, empezamos recin a tener contacto con las bacterias, se hace pues necesario utilizar colorantes a fin de hacerlas ms visibles y que permitan estudiar su morfologa. II. OBJETIVOS

Aprender a montar preparaciones frescas Observar microorganismos bacterias, protozoos hongos y virus. Reconocer la estructura y forma de los microorganismos presentes en la muestra. Analizar y comprender los procedimientos de obtencin y manejo de muestras de agua residual mediante tincin simple

III.

FUNDAMENTO TEORICO PREPARACIN EN FRESCO

En microbiologa el trmino a fresco se refiere a preparaciones o suspensiones de una muestra en agua u otro lquido que se colocan entre porta y cubreobjetos. Este tipo de preparaciones constituye el mtodo ms simple rpido para determinar movilidad de microorganismos. En el caso de bacterias, se coloca una gota de un cultivo lquido de menos 18 horas de incubacin, entre una lmina portaobjetos y una laminilla cubreobjetos y se observa con el objetivo de 40X; el contraste es pobre por tratarse de una preparacin sin teir, pero se puede incrementar cerrando el diafragma, aunque esto reduce la resolucin del microscopio. Las bacterias se observan como cuerpos refringentes, se desplazan de un punto a otro si son mviles o vibran cuando no lo son. Idealmente, la observacin debe hacerse en un microscopio de contraste de fases o de campo oscuro. La principal desventaja del mtodo es que la gota se puede secar rpidamente y los microorganismos pueden dejar de moverse por el calor de la fuente de luz del microscopio, que adems favorece la desecacin. Por tanto, si se utiliza este mtodo, la observacin debe hacerse de inmediato. Permite observar en forma, la agrupacin observacin es difcil ndice de refraccin resuelve utilizando el los microorganismos la movilidad, el color, el tamao, la en su forma natural viva sin alteraciones. Sin embargo, la debido al escaso contraste, por la poco diferencia entre el del medio y de los microorganismos. Este problema se microscopio oscuro y el de contraste de fases.
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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] A partir de cultivo en medio lquido: cargar el asa bacteriolgica con una gota de cultivo en medio lquido, depositarla en el portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos (procurando que no queden burbujas de aire). A partir de cultivo en medio slido: colocar una gota de agua sobre el portaobjetos con ayuda del asa. Cargar el asa (estril) con una pequea cantidad de bacterias de una colonia y resuspenderlas en la gota de agua. Observar bacterias vivas al microscopio con el objetivo de inmersin (con una gota de aceite de inmersin), observar motilidad, etc. Preparacin de un frotis en fresco bacteriano Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber.

Tinciones simples En las tinciones simples se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico se basan en el hecho de que las clulas tienen una
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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. Ejemplo: Azul de metileno, safranina etc. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 1. Materiales Para la preparacin de una muestra, se requiere de algunos instrumentos bsicos; los siguientes son los principales: 1. El portaobjetos.- vidrio rectangular de aproximadamente 1mm de espesor y una dimensin de 2,5x7, 5 cm. Sobre l se coloca el objeto que se va observar.

2. El cubreobjetos.- vidrio muy delgado, de aproximadamente 0,2mm de espesor, cuadrado (a veces redondo o rectangular), ligeramente ms angosto que el portaobjetos y generalmente mide 2,2cm de largo. Este debe manipularse con delicadeza, pues es muy frgil. El cubreobjetos se aplica sobre para preparaciones hmedas (preparados con algn liquido), para obtener una superficie aplanada, que facilita la observacin microscpica.

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3. Otros instrumentos utilizados son: goteros, mechero, guantes quirrgicos, agua destilada, agua residual y asa bacteriolgica. Esta ltima es un alambre de platino o nicromio de aproximadamente 1mm de dimetro por unos4-5cm de largo, doblado en su parte distal en un crculo de aproximadamente 3mm de dimetro y montado sobre un mango o soporte de un material aislante.

2. Equipos Microscopio

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3. Reactivos Azul Metileno

V.

DISEO EXPERIMENTAL

Preparacin en fresco La tcnica ms sencilla para observar microorganismos se conoce como preparado in vivo o al fresco. Estos montajes son ms duraderos, y se desechan despus que se examinan, ya que la materia viva se desintegra y la muestra se altera. Para preparar una muestra al fresco, se siguen los pasos que se detallan a continuacin: 1. Se coloca una gota pequea de agua residual con asa bacteriolgica previamente esterilizada en el portaobjetos.

2. Cubrirla con un cubreobjetos dejndolo caer suavemente para que no se formen burbujas.

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3. Llevar la preparacin al microscopio y observarla en los objetivos de 4x, 10x y 40x.

Realizacin del Frotis en fresco

1. Colocar una pequea gota de agua residual (muestra del puerto de Huacho) en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente.

2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado.

PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] 3. Por calor: Flamear varias veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin. En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden deformarse o romperse. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.

TINCIN DEL FROTIS 1. Cubrir el frotis con abundante colorante con azul de metileno y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tincin concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. 2. Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. 3. Observar la preparacin al microscopio llegando hasta el mximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersin.

PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] VI. RESULTADO

Ante este tipo de preparacin y con la muestra tomada de aguas servidas de la descarga del Puerto de Huacho La Viuda observamos los siguientes:

Viernes, 31 de mayo de 2013, 05:22:46 p.m.

Preparacin en fresco Microorganismo Protozoarios Nombre Nombre comn: Ciliate, protozoan, Bursaria Phylum: Protista / Ciliophora Nombre Cientfico: Cerataulina compacta Clase: Bacillariophyceae Cyanophyceae Sptrulina sp

Diatomea

Algas

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VII.

CONCLUSIN

Existen variedad de microorganismos patagones de las cuales pueden perjudicar a la salud pblica si estn en contacto, incluso que contaminan mediante las descargas a medios acuticos como ros, mar y lagos causando grandes impactos a la biodiversidad martima. El examen en fresco es uno de los procedimientos ms simples para observar cualquier microorganismo. En las bacterias las dimensiones se calculan en unidades de micrmetro (1um = 0.001mm). En cuanto a su forma hay tres tipos distintos; la forma esfrica o cocos, alargadas o bacilos y las espiraladas o espiroquetas. Cuando los cocos se agrupan en pares se denominan diplococos, si es en cadena, estreptococos y si es en racimos, estafilococos. Estas caractersticas morfolgicas proporcionan la base principal para su sistematizacin morfolgica. Las bacterias vivas son casi incoloras y no tienen suficiente contraste con el agua en el cual estn suspendidas. Tindolas se les da contraste en color con respecto al medio que les rodea, con lo cual son ms visibles. VIII. BIBLOGRAFIA

http://uni-biologia.blogspot.com/2011/01/preparaciones-en-fresco.html http://books.google.es/books?id=K_ETVnqnMZIC&pg=PA27&dq=preparaci on+en+fresco+microbiologia&hl=es&sa=X&ei=AFnZUa2EHM3a4APs64HoC g&sqi=2&ved=0CEAQ6AEwAw#v=onepage&q=preparacion%20en%20fresc o%20microbiologia&f=false

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PRACTICA N2
LA COLORACIN DE GRAM I. Introduccin El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos que usan unos solo colorantes llamados de tincin simple. Sin embargo, a menudo se utilizan mtodos que no tien de igual modo todas las clulas, es el proceso denominado tincin diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la tincin Gram. Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos: gram positivas y gram negativas. Esta tincin tiene gran importancia en taxonoma bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias. Mientras que las bacterias gram negativas son constantes en su reaccin, los microorganismos gram positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones (son gram lbiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias gram positivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tien por la safranina apareciendo como gram negativas. Anlogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la tcnica. Por este motivo, es preciso atenerse, en la prctica, al procedimiento establecido. Para explicar el mecanismo de la tincin de gram se han propuesto varias hiptesis fundadas en la naturaleza qumica de las paredes celulares de los microorganismos.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] Aqu puedes ver las diferencias estructurales y qumicas de los dos tipos de pared bacteriana:

Pared Gram+ capa densa y uniforme de 200 a 800 A) cidos teicoicos polisacridos protenas (pocas veces) glicopptido (50% del peso seco) Pared Gram capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta por capas externas de densidad menor) lipopolisacridos lipoprotenas protenas glicopptido (10% del peso seco)

El mecanismo de la tincin Gram es el reseado en el siguiente esquema:


Productos que se utilizan 1) Cristal violeta 2) Lugol solucin iodada

Reaccin y coloracin de las bacterias

GRAM + Clulas color violeta

GRAM Clulas color violeta

Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta.

Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta.

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3) Alcohol Se deshidratan las paredes celulares. Se contraen los poros. Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las clulas que continan teidas de color violeta. Clulas no decoloradas; Quedan teidas de color violeta. Eliminacin por extraccin de grasas de las paredes celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la clula.

4) Safranina

Clulas decoloradas; Se tien de color rosado.

II.

Objetivos Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin de Gram Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clnica de la tincin.

III.

Fundamento terico

La tincin de Gram o coloracin de Gram Es un tipo de tincin diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre

al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella. La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen microscpico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clnica pueden detectarse con este mtodo. Las nicas excepciones son: Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las clulas husped (p. ej., clamidias).Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por el microscopio ptico (p. ej.,

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] espiroquetas).Los que tienen una diferente composicin en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias) El cristal violeta sirve como colorante bsico unindose a la pared celular bacteriana, con ayuda del mordiente (lugol) que refuerza la unin del colorante. Las bacterias Gram positivas, debido a la estructura y composicin bioqumica de su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol y aun despus del tratamiento con el decolorante conserva el colorante bsico, por lo que se observan de color prpura o violeta al microscopio. Las bacterias Gram negativas pierden el colorante bsico cuando son tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipdico de la pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular), dando como resultado la prdida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razn por la cual estas bacterias se observan de color rojo al microscopio. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA. Preparacin del extendido:

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] Los mtodos de tincin se utilizan en forma directa con las muestras del paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos en cultivos. Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de lquido aspirado. El material que se va a teir se coloca en forma de una gota (si la muestra es lquida) o se rota (si la esta e un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco.

Es importante evitar la contaminacin de los medios de cultivo; por lo tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estril no debe utilizarse para la inoculacin posterior de medios de cultivo. Para la tincin de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad del cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie del portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o solucin salina 0.9% estril sobre el portaobjeto. En caso de cantidades pequeas que puedan perderse incluso en una gota de solucin fisiolgica se puede utilizar n aplicador de madera estril para obtener el material; luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teir se deja secar y se fija al portaobjeto mediante su colocacin sobre una platina caliente (a60C) durante por lo menos 10 minutos o cubrindolo con metanol al95% durante 1 minuto. Para examinar los microorganismos que crecen en medio lquido se aplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes de la tincin. La preparacin de los frotis vara de acuerdo con el tipo de muestra que se va a procesar y con los mtodos de tincin que se van a utilizar. No obstante la
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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] regla general para la preparacin de frotis es que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciarlos microorganismos. Por ltimo, el mtodo de tincin que se debe utilizar est determinado por el tipo de microorganismo buscado. IV. Materiales, equipos y reactivos Microscopio ptico Porta objetos Agua destilada Pipetas Pasteur asa o asa de siembra Mechero

Cristal Violeta Lugol Alcohol acetona Safranina

V.

Diseo experimental

Esterilizacin del asa de siembra. Aplicacin de colonia bacteriana en el portaobjetos. Re-suspender muestra en el portaobjetos. Secar al mechero. La gota de agua debe Se debe calentar por 5 ser pequea min aproximadamente, hasta que toda el agua se seque. Secado de la muestra sin aproximar demasiado
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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] a la llama para no estropearla fijacin de la muestra para que sea posible su tincin.

Despus de la fijacin el primer paso en la tincin de Gram es laaplicacin del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina ovioleta de genciana) Esperar que transcurra 3 minuto. Escurrir y enjuagar.

Luego debe agregarse el lugol. Este debe aplicarse como el cristal violeta y tambin debe cubrir la muestra por 1 min. Luego se lava con agua corriente.

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El cubrir la muestra con alcohol acetona para decolorarla es el paso ms crtico del procedimiento. Este debe cubrir la muestra y la reaccin debe ser detenida con el lavado con agua corriente. El tiempo debe ser el mismo para todas las muestras. Al ser tiempos por lo general muy cortos, se recomienda agregar el alcohol mientras ya se tiene la llave del agua corriendo, listo para el lavado.

El ltimo paso consiste en agregar una tincin de contraste, para teir las bacterias que pierden el cristal violeta. Para esto se agrega safranina cubriendo la muestra por 2 min, dependiendo. Luego se lava con agua corriente y secar con el flameado.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

Secado de la preparacin con cuidado de no estropearla. Aplicacin de aceite de inmersin para objetivos de 100 aumentos. Adherirlo sobre el portaobjetos sin ponerle cubreobjetos. Colocacin de la preparacin en el microscopio observarla con el objetivo de 100 aumentos aproximar lo mximo.

VI.

Resultado

Se visualizaran las bacterias gram positivas de color violeta y las bacterias gram negativas de color rosado o rojizo. Bacterias gram positivas:

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] Corresponden a las bacterias que mantienen la coloracin del cristal violeta despus del alcohol acetona, lo que les da un color violeta/morado. streptococcus pneumoniae bacteria gram positiva, desde cultivo bacteriano en agar sangre. Bacterias gram negativas: Corresponden a las bacterias que pierden la coloracin del cristal violeta despus del alcohol acetona y se tien con el colorante de contraste (safranina), lo que les da un color rosceo/rojizo. Escherichia coli bacteria gram negativa, cultivo desde agar macconkey

Gram positivos

Gram Negativos

VII.

Conclusin

El tamao de las bacterias dificulta su visin al microscopio, por eso la tincin de estas en la microbiologa es un apartado sumamente trascendente. La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste entre la clula y el medio que la rodea, y una de las ms importantes, tanto por su aplicacin clnica para hacer una identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin y por su practicidad, es la tincin de Gram. Es por eso que esta tcnica se vuelve fundamental en el estudio de la microbiologa, y el conocimiento de su correcta realizacin es prcticamente obligatorio para todo aquel que se encuentra en el aprendizaje las ciencias mdicas. El estudio de la literatura acerca de la tincin de Gram nos permite tener un prembulo para poder diferenciar frente al microscopio los diferentes tipos de microorganismos, .Sin embargo, no hay que pasar por alto que es de suma importancia tener un completo estudio previo de los organismos y
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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] su reaccin a la tincin para poder dar una respuesta certera ante el cuestionamiento de la naturaleza de un microorganismo.

VIII.

Bibliografa Jawetz E., et al. Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Editorial Manual Moderno, 19a Ed. Mxico 2008; 702-703. Murray PR, et al. Microbiologa Mdica. Editorial Elsevier Mosby. 6a Ed. Espaa 2009: 158-159. Caldas A. L., Gua de Microbiologa y Parasitologa bsico clnica. Disponible en:http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/ Tencion_de_gram.pdf.

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PRACTICA N3
SUPERFICIES APTAS Y SEMBRADO DE BACTERIAS

1. INTRODUCCION: Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. Un medio de cultivo est formado, por una parte de componentes indispensables: agua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgnicos (P, N, Mg, S, etc.). Por otra parte, est formado por componentes alternativos: agente solidificante (agaragar), tampones, indicadores de pH, etc. Existen diferentes clasificaciones de medios de cultivo en funcin de: a) Su consistencia: Medios lquidos Medios slidos (en tubo, en placa) Medios semislidos b) Su uso: Medio general: Es aquel medio donde crecen todo tipo de microorganismos, excepto aquellos que necesitan de unas condiciones especiales. Medio diferencial: permiten identificar una especie o grupo por su crecimiento ya sea por su metabolismo, respiracin, etc. Medio selectivo: permiten seleccionar el crecimiento de una especie o grupo determinado (hongos, bacterias entricas, protozoos...)

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] 2. OBJETIVOS: Conocer el procedimiento de siembra de una muestra biolgica en un medio de cultivo. Reconocer las caractersticas de las colonias de los microorganismos aislados en los medios de cultivo

3. FUNDAMENTO TEORICO :

La siembra es el procedimiento por lo cual se pone en contacto el microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin pueda desarrollarse y multiplicarse in vitro. Se siembra con dos finalidades a) Para hacer un aislamiento b) Para hacer un trasplante El aislamiento, permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere de un medio solido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generan su progenie (cepa) por formacin de colonias separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr caracteres especiales. La morfologa bacteriana ser tambin distintiva Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio de cultivo slido adecuado dispuesta en una placa de Petri. Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao , consistencia, etc.. Los tipos de bacterias presentes en la muestra original es visible como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor nmero de estras posible. En las primeras estras aparecern colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estras finales debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo,
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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] debe asegurar que finalmente algunas clulas queden suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie. El trasplante, significa la separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa pura y por subsiguientes trasplantes en medios especiales se logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como resultado, la identificacin especifica. Criterios para la diferenciacin de colonias el aspecto de las colonias, su coloracin, tamao, etc. Permiten diferenciar diferentes bacterias, aunque son propiedades generales muy influenciadas por las condiciones de cultivo, por lo que a continuacin se realiza una descripcin muy general. Las colonias pueden ser opacas, translucidas o transparentes. Algunas producen pigmentos fluorescentes cuando se iluminan con luz ultravioleta. Otras aparecen con superficie pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o poseen anillos concntricos. En ocasiones el olor es tambin caracterstico.

4. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS : Muestra agua (residual y potable) Placas Petri con medios de cultivo (agar) Asas de siembra Mechero de bunsen Plumn indeleble Horno

5. PROCEDIMIENTO: Mtodo por estra en medio solido en tubo 1) El asa de siembra en punta debe ser esterilizada en la llama (flameada al rojo ) mantenindola verticalmente en el mechero y enfriarla

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] 2) Tomar una pequea porcin o alcuota de la muestra con el asa de siembra 3) Deslizar el asa de siembra suavemente en zigzag en el tubo con el medio slido , empezando desde el fondo 4) Esterilizar el asa de siembra ala llama y enfriarla 5) El rotular el tubo con el plumn indeleble 6) Incubar el tubo con la muestra en el horno a 37 C por 24 horas

Mtodo por estra en medio solido en placa Petri 1) El asa de siembra en anillo debe ser esterilizada en la llama (flameada al rojo ) mantenindola verticalmente 2) Tomar el asa de siembra en anillo una cantidad suficiente de muestra (o con el hisopo de madera ) 3) Con la mano izquierda se toma la placa Petri de agar se manipula con los dedos para levantar parcialmente la tapa 4) Con la mano derecha se toma el asa sostenindola suavemente entre los dedos con cuidado de no hundirla en el medio. se distribuye la muestra (inoculo) por estra en zigzag con escasa separacin unas a otras (1 a 3mm) e el medio solido en placa Petri divido en cuatro cuadrantes inoculando la muestra en cantidades menores en cada cuadrante 5) El nmero de estra depende de la cantidad de inoculo y los planos de siembra ensayados (1,2 o 4 planos o cuadrantes). Se debe evitar romper el medio. 6) Esterilizar el asa de siembra ala llama y enfriarla. 7) Rotular la placa Petri con el plumn indeleble 8) Incubar la placa Petri con la muestra en el horno a 37C por 24 horas 9) Al da siguiente observar las placas Petri con el mechero prendido observando que en cada cuadrante se presentara diferente distribucin de colonias.

6. RESULTADOS: Muestra (agua residual): En esta muestra si se encontr enterobacterias las cuales pueden ser Escherichia coli, salmonella, u otro, pero no se puede indicar si se est frente a una lactosa positivo o negativo debido al tiempo que ha pasado.

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7. CONCLUSIONES:

Un medio de cultivo se formula para suministrar todos los nutrientes que un microrganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, tambin es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxgeno, segn el caso y tambin es importante saber que Los mtodos de siembra se utilizan para inocular por distintos mtodos sobre un medio de cultivo una apropiado muestra que contenga bacterias con el fin de reproducirlas para aumentar el nmero de individuos de la poblacin y formacin de colonias.

8. BIBLIOGRAFA: http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap16.htm http://es.wikipedia.org/wiki/identificaci%c3%b3n_bacteriana http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/aislamiento http://es.scribd.com/doc/14173131/5-tecnicas-basicas-para-el-cultivo-demicroorganismos.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] INDICE INTRODUCCIN ............................................................................................. 29 OBJETIVOS ..................................................................................................... 30 FUNDAMENTO TERICO ............................................................................... 30 Morfologa ultramicroscpica de las bacterias: estructuras internas ............. 30 Pared celular.............................................................................................. 30 Membrana Citoplsmica (citoplasmtica o protoplasmtica) ..................... 32 Citoplasma ................................................................................................. 32 Estructuras Citoplasmticas ...................................................................... 32 Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana .......................................................... 33 Cocos......................................................................................................... 33 Bacilos ....................................................................................................... 34 Espirales (Treponemas, Borrelias) ............................................................ 34 Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas .................................................... 34 Cocos Gram-positivos................................................................................ 34 Bacilos Gram-positivos .............................................................................. 35 Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas ................................................... 36 Cocos Gram-negativos .............................................................................. 36 Bacilos Gram-negativos ............................................................................. 36 Otras tinciones de uso habitual ..................................................................... 37 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS ....................................................... 39 DISEO EXPERIMENTAL ............................................................................... 39 RESULTADO ................................................................................................... 42 CONCLUSIONES............................................................................................. 43 BIBLIOGRAFA ................................................................................................ 43

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] INTRODUCCIN El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, el medio ms simple de aumentar el contraste entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce generalmente el encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores de lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopia son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. OBJETIVOS Comprender los pasos necesarios para realizar la coloracin Gram Interpretar la coloracin Gram Reconocer los microorganismos Gram Positivos y Negativos

FUNDAMENTO TERICO MORFOLOGA ULTRAMICROSCPICA DE LAS BACTERIAS: ESTRUCTURAS INTERNAS Pared celular Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cpsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que est en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rgida que da forma a la clula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. Constituyentes importantes de la pared celular son los aminocidos, aminoazcares, azcares y grasas. Estas sustancias (protenas, Hidratos de carbono, grasas) estn enlazadas formando el polmero complejo que forma la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Grampositivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram positivas contienen menos aminocidos que las gram negativas; el contenido graso es mucho ms elevado en las gram negativas que en las gram positivas. Este hecho se ha propuesto como explicacin del mecanismo de la reaccin al gram (ver las dos imgenes juntas).

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del determinante antignico del organismo.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplsmica y la pared celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas de transporte.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] Tambin existen diferencias en la composicin de la pared entre las clulas de las diversas especies. Membrana Citoplsmica (citoplasmtica o protoplasmtica) Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplsmica o protoplsmica y est formada por una bicapa de fosfolpido integral y protenas perifricas empotradas. La membrana citoplsmica tiene una significacin funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la clula y la salida de los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la divisin celular el cromosoma se une a la membrana de la clula en el sitio llamado Mesosoma. Citoplasma El material celular contenido dentro de la membrana citoplsmica puede dividirse en tres partes, regin citoplsmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, regin nuclear o cromatnica, que es rica en DNA, y la parte lquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA, combinado con protenas, forma partculas o corpsculos macromoleculares, de unos 200 A de dimetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partculas de RNA-protena se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partculas que se encuentran en las clulas animales y vegetales.

Estructuras Citoplasmticas Nucleoide (cuerpo cromatnico) Las clulas bacterianas no contienen el ncleo caracterstico de las clulas de las plantas y animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear, el ADN de la clula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es nico y circular, doble hlice sin protenas. Como no se trata de un ncleo discreto, se ha sugerido que se d a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatnico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el mtodo de tincin de Feulgen, especfico para el DNA, y por microscopia electrnica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma circundante.
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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] Ribosomas Tienen estrecha relacin con la sntesis de protenas (30S y 50S para formar un complejo 70S). Plsmidos Lazos extracromosmicos de ADN, algn cdigo para la resistencia a drogas, toxinas y otros factores. Endosporas Algunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. Tambin tienen esta propiedad otros gneros de bacterias verdaderas, pero slo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora. Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la definicin "taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas. En lo relativo a la coloracin, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM: Cocos Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

Bacilos Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos.

Espirales (Treponemas, Borrelias .)

Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas Cocos Gram-positivos Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

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Cadenas: forma tpica Streptococcus grupo B

de

Streptococcus

sp,

como

S.

pneumoniae,

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp

Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii


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Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas Cocos Gram-negativos Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos. Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco Grampositivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y, a menudo, Gram-variable

Bacilos Gram-negativos Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

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Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp

Otras tinciones de uso habitual RODAMINA-AURAMINA Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin morfolgica. NARANJA DE ACRIDINA El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos positivos. ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los actinomicetos (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes).Nocardia spp son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles. El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar. BLANCO DE CALCOFLOR
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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescentes con luz blancoazulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS Colorantes para tincin de Gram (Cristal de Violeta, lugol, Alcohol-acetona, safranina) Agua destilada 1 mechero Asa microbiolgica Pipeta Pizeta Aceite de inmersin Portaobjetos y cubreobjetos Plumn indeleble Muestra DISEO EXPERIMENTAL LA COLORACIN GRAM (BACTERIAS) Preparacin en seco Los microorganismos estn muertos y fijos al portaobjeto. Se espera que si al colorear la muestra est presente un color violeta (gram (+)) o un color rojo (gram (-)) para el caso dela las bacterias. Para llevar a cabo la coloracin Gram se lleva acabo los siguientes procedimientos:

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

Figura 1 la dilucin de la muestra

Figura 2 Se coloca una gota de la mutra y se extiende con la asa

Figura 3 Se flamea para fijar la muestra

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

Figura 4 Se procede a colocar el cristal de violeta y se deja secar durante 3 minutos

Figura 5 Se coloca el luego y se deja secar durante 1 minuto

Figura 6 Se coloca el Alcohol- Acetona y lego se procede al lavado con agua destilada

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

Figura 7 El ltimo paso de la coloracin es colocar la safranina, dejarlo secar durante 2 minutos y luego se lava con agua destilada

Figura 8 Finalmente se procede al flameado y despus se lleva al microscopio RESULTADO

Se observ la presencia de bateras Gram (-) durante la observacin en el microscopio

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

Se observ la presencia de bateras Gram (+) durante la observacin en el microscopio CONCLUSIONES La Coloracin de gram resulta de gran importancia para poder identificar el tipo de bacteria de acuerdo a la clasificacin dada por la composicin de sus paredes en gram positivas y gram negativas, as mismo para la identificacin morfolgica de las mismas. La Coloracin de Gram es una herramienta muy til en el laboratorio de microbiologa as como en los anlisis clnicos y diagnstico mdico siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una correcta interpretacin de los datos que nos otorga la diferenciacin de Gram positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus paredes celulares tendrn o no propiedades patolgicas diferentes.

BIBLIOGRAFA http://es.scribd.com/doc/51627228/PRACTICA-3-La-Coloracion-de-Gram http://www.slideshare.net/Mardj/prctica-2-tincin-de-gram http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] PRACTICA N5 CULTIVO DE HONGOS CON AGAR SABOURAUD

INTRODUCCION En lneas generales, todos los medios de cultivo utilizados en micologa han de contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc). El pH ha de ser ligeramente cido para facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Generalmente utilizaremos varios medios de cultivo diferentes, ya sea en placa o en tubo. Los medios en placa tienen la ventaja de ofrecer una gran superficie para el aislamiento pero, para soportar la deshidratacin durante el largo perodo de incubacin a que van a ser sometidos (un mes o ms), has de contener una gruesa capa de medio (25 a 40 ml). Son ms peligrosos a la hora de su manipulacin y fciles de contaminar. Por contra, los medios en tubo tienen una superficie de trabajo mucho ms pequea, pero ofrecen mxima seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la deshidratacin y a la contaminacin. En el momento de la siembra, y aun sabiendo que ninguna combinacin de medios de cultivo va a cubrir totalmente el abanico de posibilidades, han de seleccionarse adecuadamente los medios a utilizar en funcin del tipo de muestra y de los microorganismos fngicos sospechados. Si la muestra procede de zonas presuntamente contaminadas, es fundamental incluir, junto a los medios normales, medios que contengan sustancias inhibitorias de bacterias y hongos saprofitos (cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida). Ciertos hongos poseen caractersticas muy especiales que les permiten sobrevivir en forma parastica sobre los insectos y en forma saprofita sobre material vegetal en descomposicin. El crecimiento saprofito puede dar como resultado la produccin de conidiforos, conidias y desarrollo miceliano. Esta caracterstica permite que el hongo pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando tcnicas de produccin en masa de bajo costo. Los hongos tienen un gran potencial para ser empleados como biocontroladores. Entre los principales hongos que presentan estas caractersticas estn: Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] I. OBJETIVOS Manejar las tcnicas bsicas para el cultivo e identificacin de hongos. Aplicar las tcnicas de tincin adecuadas para el estudio microscpico de hongos. Aplicar adecuadamente los trminos microbiolgicos para hacer la descripcin colonial y microscpica de este tipo de microorganismos. Reconocer y describir las caractersticas morfolgicas y estructurales de hongos. II. FUNDAMENTO TERICO

El medio de cultivo es una sustancia o solucin que permite el desarrollo de microorganismos, mientras que el cultivo es el producto del crecimiento de un organismo. Los medios utilizados en micologa deben contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo y reproduccin de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc.) y un pH ligeramente cido (6 6.3) para facilitar su crecimiento e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Se puede aadir antibiticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. Los medios pueden ser slidos o lquidos. Para conseguir un medio slido se debe agregar una sustancia solidificante como el agar (gelatina vegetal) o el agar agar (polisacridos provenientes de algas), el cual no tiene valor nutritivo sino que sirve simplemente para mantener la humedad por un tiempo ms o menos prolongado. La humedad es fundamental para el desarrollo de los hongos, porque cuando sta comienza a disminuir, la formacin de micelio tambin disminuye y el hongo tiene que asegurar su perpetuidad formando estructuras propagativas (esporas, conidios) y de conservacin (clamidosporas). El agar empieza a derretirse a partir de 80 C y soporta temperaturas altas sin descomponerse, solidificndose entre los35 y 50 C. Los medios de cultivo se vierten en placas Petri o en tubos inclinados. Los primeros ofrecen la ventaja de tener mayor superficie para el desarrollo del hongo y se utilizan para trabajos rutinarios de aislamientos, aspecto del cultivo, velocidad de crecimiento, etc. sin embargo, son ms fciles de contaminarse. Los tubos, a pesar de tener una superficie mucho ms reducida, ofrecen seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la deshidratacin y a la contaminacin. Se utilizan para conservar cultivos por tiempo ms o menos prolongado. Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] El pH recomendado para el cultivo de hongos en el laboratorio es de alrededor de 7, un pH neutro o ligeramente cido (6.8). Para seguridad del que opera y evitar contaminaciones, los medios den cultivo se deben manipular en campanas de flujo laminar A continuacin se describen los medios de cultivo mayormente utilizados y su composicin.

Agar glucosa de Sabouraud

Este medio fue desarrollado para el cultivo de hongos patgenos, especialmente de los productores de micosis superficiales. En la actualidad se recomienda slo para el aislamiento primario de dermatfitos, con el agregado de cicloheximida y cloranfenicol. El pH final (alrededor de 5,6) es mucho menor que el de la mayora de los medios y tiende a eliminar el crecimiento bacteriano. Los subcultivos de los hongos aislados originalmente en BHI pueden presentar una morfologa ms uniforme en agar glucosa de Sabouraud, por esto es til para la identificacin de hongos una vez aislados. Medio de cultivo recomendado para el aislamiento y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutneas (piel, pelo, etc.). En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH cido, favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias. Adems, al medio de cultivo, pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento.

Tcnicas Aislamiento de hongos ambientales por siembra espontnea

Preparar placas de Petri con medio de Sabouraud glucosa. Colocar las placas abiertas en lugares apropiados. Al cabo de 5 minutos cerrar las placas e incubarlas a 28C durante una semana. Observar. Efectuar una resiembra (repique) de las colonias de inters en tubos con agar inclinado para obtener un cultivo puro.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha]

SIEMBRA La siembra se realiza con el fin de aislar o repicar los hongos para su uso inmediato o para mantenerlos viables por un tiempo corto. La siembra o aislamiento en cultivo puro consiste en dejar crecer el hongo elegido bajo condiciones en las que pueda desarrollar y esporular convenientemente. Para ello es necesario verter el medio de cultivo, dejarlo enfriar, acidificarlo si fuera necesario y colocar una pizca del hongo a sembrar. Se realiza por medio de una aguja o de un ansa, ya sea por un simple toque o por rayado continuo. Generalmente para la siembra se usan placas, tubos y frascos. Despus de la siembra se sellan las placas, tubos y frascos, se coloca la fecha y se incuba durante el tiempo conveniente hasta que se vea que el hongo ha crecido y est esporulando.

III.

EQUIPOS Y MATERIALES Cajas de Petri con agar Mechero Asa micolgica. Lpiz graso o marcador Cultivos de hongos Microscopio Autoclave Cocina elctrica Portaobjetos y cubreobjetos Azul de metileno Agar Sabourraud Agua destilada

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] IV. PROCEDIMIENTO

1. Se agrega en la autoclave 700 ml de agua destilada.

2. Se pesa 7.8g de agar Sabourraud.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] 3. Incorporar el agar Sabouraud 7.8g/120ml de agua destilada en un matraz.

4. Tapar con algodn

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] 5. Llevar la mezcla a la cocina elctrica hasta que se forme una nube blanquecina y luego se clarifique formando una precipitacin de gotas en la superficie del matraz.

6. Luego llevar a autoclave para esterilizar durante 1hora y cuarto aproximadamente.

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] 7. Sacar y dejar enfriar luego vasear hasta la mitad de la placa Petri cerca al fuego a su vez flameando la parte superficie del matraz.

8. Ya frio el agar Sabouraud llevamos a la intemperie de la universidad para capturar hongos.

V.

ANALISIS DE LOS RESULTADOS

Obtuvimos como resultados el cultivo de hongos para cmo se puede observar en la figura

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PRCTICA DE MICROBIOLOGA [Seleccione la fecha] Como se puede observar en la imagen se procede a contar el nmero de colonias de cada una de las placas para posteriormente observarlas bajo el microscopio

VI. CONCLUSIONES El ambiente adecuado influye en el cultivo de los hongos Se puede concluir que al inyectar bacterias en el ambiente adecuado se crea hongos Se puede deducir que hay gran variedad de hongos porque existe diferentes tipos de bacterias Para preparar un excelente medio de cultivo de hongos se debe tener en cuenta que clase de hongos se desea para crear este medio de tal manera que sea el ms adecuado. VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
http://www.danival.org/fungi/fungi_medios.html?pr=7200hongos_-400_laboratorio_medios.html http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/sabouraudgluagar.htm http://www.slideshare.net/AraceliAhumada/manual-hongos

http://www.google.com.pe/url?sa=t&rct=j&q=practica%20AISLAMIENTO%2 0%20y%20conteo%20de%20hongos%20en%20agar%20sabouraud%20%204%20glucosa&source=web&cd=1&cad=rja&ved=0CCkQFjAA&url=http %3A%2F%2Fcipotato.org%2Flibrary%2Fpdfdocs%2FAN65216.pdf&ei=O_z xUfT6Fbiv4AOmhIH4Dg&usg=AFQjCNGa70ttCJAy45lEeGM90p6qozGr5Q &bvm=bv.49784469,d.dmg

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