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Introduccin a los Mtodos

Cromatogrficos
Captulo 26
Cromatografa de Gases (GC)
fase mvil: Gas
Cromatografa de Lquidos (HPLC)
fase mvil: Lquido
Cromatografa de Fluido Supercrtico (SFC)
fase mvil: Fluido Supercrtico
Electroforesis Capilar (CE)
fase mvil: Ninguna o Lquida
Clasificacin de los mtodos cromatogrficos en columna
2
Equilibrios Qumicos empleados por Tcnica
Cromatografa de Gases (GC)
Adsorcin
Particin
Cromatografa de Lquidos (HPLC)
Adsorcin
Particin
Intercambio Inico
Exclusin Molecular
Afinidad
3
4
Definiciones y Trminos comnmente empleados en los
mtodos cromatogrficos
1. Tiempo de retencin (t
R
) - Tiempo (en segundos usualmente) que la muestra
pasa en la columna. Es medido a partir del punto de inyeccin a el momento en
que aparece la altura mxima del pico. Es caracterstico para cada analito en la
determinada fase mvil/fase estacionaria.
2. Tiempo muerto (t
M
o t
o
) - Tambin conocido por tiempo cero tiempo de
retencin del disolvente. Representa el tiempo requerido para que eluya un
compuesto no retenido por la columna. Puede ser empleado para medir el
volumen o espacio dentro de una columna.
3. Tiempo de retencin relativo (t
R
) - Tambin conocido como tiempo de
retencin ajustado. Representa el tiempo que el soluto pasa absorbido dentro
del empaque de la columna. Se calcula restando al tiempo de retencin (t
R
) el
tiempo muerto (t
M
).
t
R
= t
R
- t
M
Definiciones y Trminos comnmente empleados en los
mtodos cromatogrficos
4. Ancho de base (W
b
) - Es la porcin de la lnea base intersectada por
tangentes dibujadas en el pico. Es igual a 4s de un pico tipo Gauss y es
necesaria para calcular los platos tericos y la resolucin. (W
1/2
) es el ancho
del pico a la mitad de la altura del pico, generalmente es ms usada que W
b
para calcular el numero de platos tericos por ser ms representativa del pico.
5. Velocidad lineal de la fase mvil ( o u) - Se emplea en la elaboracin de
grficas para efectuar estudios de eficiencia en columnas. Se grfica
generalmente H vs m para obtener grficas conocidas como: grficas de van
Deemter.
= L
c
/ t
M
= Largo de la columna (cm) / Tiempo muerto (sec)
6. Nmero de platos tericos (N) - Es la longitud de columna requerida para que se
establezca un equilibrio del soluto entre las fases mvil y estacionaria. El nmero de
platos tericos mide que tan buena es una columna, la cual debe tener un nmero
grande de platos tericos y producir picos angostos. Algunas formas empleadas
para incrementar los platos tericos incluye: Alargar la columna, disminuir el
dimetro de la columna, mejorar el empaque, disminuir la cantidad de muestra y
optimizar el flujo de fase mvil. La definicin de plato terico (y altura de plato) a
permanecido desde la teora propuesta por Martin y Syle, postulada para tratar de
explicar eficiencias en las separaciones cromatogrficas; Segn esta teora la
columna se encuentra formada por un nmero N de capas angostas y sucesivas
llamadas platos dentro de los cuales se efectuaban equilibrios del analito entre las
fases mvil y estacionaria.
N = 16 (t
R
/W
b
)
2
= 5.54 (t
R
/w
1/2
)
2
7. Altura de un plato terico (HETP H) - Representa el largo de columna requerida
por un plato terico. Segn Syle y Martin: representa la longitud de las capas
continuas (platos) que componen una columna. H es empleada como medida de la
eficiencia de una columna. Cuando el valor es pequeo representa una eficiencia
mayor. H es empleada adems como parmetro para determinar el ensanchamiento
de una banda.
H = L
c
/ N
t
R
, W
b
y W
1/2
se colocan en
las mismas unidades (tiempo
o distancia)
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8. Coeficiente de particin (K) - Es el valor de la constante de equilibrio formado
por el analito entre las fases mvil y estacionaria. Es constante para una
temperatura y caracterstica para cada relacin de analito-fase mvil-fase
estacionaria.
K = C
S
/ C
M
K = k x
9. Factor de retencin (k) - Tambin conocida como relacin de capacidad,
representa la relacin de tiempo que el soluto pasa en la fase estacionaria con
respecto al que pasa en la fase mvil.
k = [(KV
S
)/ (V
M
)] = t
R
/ t
M
10. Volumen de fase mvil (V
M
) - Volumen de fase mvil contenida en la columna
V
M
= ( t
M
)( F ) F = Flujo de fase mvil
Conc. Analito en la fase estacionaria [gr/ml]/Conc.
Analito en la fase mvil [gr/ml]
= V
M
/ V
S
= Volumen fase mvil / Volumen
fase estacionaria
11. Factor de separacin () - Conocida adems como Selectividad factor de
retardacin. Determina las separaciones entre picos, un valor de =1
representa tiempos de retencin iguales y por lo tanto no existe separacin. Un
nmero ms grande significa una columna ms selectiva y una mejor
resolucin . Los valores grandes de a son el resultado de una fase estacionaria
selectiva.
=K
2
/K
1
= t
R(2)
/ t
R(1)
= k
(2)
/ k
(1)
12. Resolucin (R
S
) - Es una medida cuantitativa del grado de separacin de dos
picos. Un valor de 1.5 representa una separacin hasta la lnea base de
ambos picos, y un valor de 1.0, representa una resolucin del 90%, en algunos
casos esto es suficiente para los clculos del rea de los picos (anlisis
cuantitativo).

t
R
es el intervalo entre los picos, W
1
y W
2
son
los anchos de los picos 1 y 2. Ambas medidas
en las mismas unidades ( tiempo o centmetros)
1 = Primer compuesto en salir, (eluir)
2 = Segundo compuesto en eluir
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Fig. 26-12 Separacin
a tres valores de:
Rs=2Z/(WA+WB).
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13. Ecuacin de resolucin maestra - Esta ecuacin es derivada de las
definiciones de N, R
S
y . Muestra que la resolucin es el producto de tres
factores independientes.
Otra frmula importante la cual se deriva de definiciones anteriores es:
R
N k
k
S =

4 1 1

'
'
( )
( ) ( )
( )
t
R H k
k
R B
S B
B
=

16
1
1
2
2
3

'
'
Simetra en los picos cromatogrficos
Para realizar una buena determinacin cromatogrfica es necesario tener,
adems de una resolucin adecuada (1.0) que los picos sean simtricos ya
que el tailing puede afectar la calidad de la separacin entre otros factores. Es
pues necesario encontrar una forma para cuantificar la cantidad de asimetra
(tailing) en un pico cromatogrfico y determinar si cumple con los
requerimientos del anlisis. Existen varias formas para determinar el tailing
entre ellas podemos encontrar el Asymmetry factor (As) y el US
Pharmacopeia (USP) tailing factor (Tf) .
Valores Aceptables?
Los valores tanto para el Asymmetry factor (As) como para el Tailing
Factor (Tf) recomendados se encuentran entre 0.9 - 1.2. Aunque el valor
depende del anlisis, se considera aceptable si se tiene un valor menor
de 2.0.
Que causa el tailing?
Los picos presentan Tailing porque existe mas de un mecanismo de
retencin en el proceso de separacin. (ej. En HPLC en columnas de
fase inversa existen grupos no polares (C18, fase estacionaria) y grupos
polares (Silanol, soporte)). Algunas veces ocurre debido a dead volume
en la columna o conexiones en el sistema.
Que problemas crea el tener tailing?
Puede afectar la separacin/resolucin cromatogrfica
Afecta los lmites de deteccin/cuantificacin
Afecta la aplicacin de los algoritmos de deteccin de los sistemas de
procesamiento (rea detectada)
Puede ocultar la presencia de componentes menores/trazas en el
tailing
Afecta el tiempo que se necesita para realizar un anlisis
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Que se puede hacer con el tailing?
Aadir un agente supresor del tailing en la fase mvil (ej. Agregar
Trietilamina en concentraciones de 20 mM o mas)
Emplear columnas que no tengan mecanismos de retencin alternos
(ej. eliminar grupos silanol y metales en soporte)
Controlar el pH de la fase mvil (ej. pH < 3.0 suprime la ionizacin de
los grupos silanol del soporte)
Eliminar Dead volumes en columnas y conexiones del instrumento
Emplear condiciones de temperatura controlada (GC) y gradiente (LC)
La rea de los picos cromatogrficos es
preferido sobre la altura de pico para
realizar anlisis cuantitativo porque es
mucho mas reproducible
Area vs Altura de pico?
Variables Cinticas que afectan la eficiencia de las columnas
La eficiencia de una columna cromatogrfica se puede medir en funcin al
ensanchamiento de las bandas cromatogrficas. Al aumentar el ancho de las
bandas se disminuye la eficiencia. Entre mas lentos sean los procesos de
transferencia de masa entre fase mvil y fase estacionaria, cuando el soluto
migra a travs de la columna, mas ancha ser la banda al salir. Algunas de las
variables pueden ser controladas para mejorar las separaciones.
* Se incrementa al aumentar la temperatura y disminuir la viscosidad
** DM para lquidos 10
-5
cm
2
s
-1
; gases DM 10
5
veces mayor que lquidos
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Teora del Ensanchamiento de Bandas
La eficiencia de una columna cromatogrfica se puede aproximar con la
expresin matemtica:
La ecuacin es conocida como la Ecuacin de van Deemter y fu empleada
por Ud. Para realizar la determinacin del flujo ptimo en el exp. de GC1
(http://www1.uprh.edu/jorcas/paginas_laboratorio/info_adicional_lab/det_flujo_
optim2.pdf).
H A B u Cu
H A B u C C u S M
= + +
= + + +
/
/ ( )
Termino multicaminos (A) - Es ocasionado por la multitud de caminos de
diferente longitud, creados dentro del empaque de la columna, as
dependiendo del camino tomado por las partculas, estas llegaran al final de la
columna a diferentes tiempos por lo que se ensanchan los picos
cromatogrficos. A este fenmeno se le llama tambin Difusin de Eddy.
Adems en este factor se encuentra el efecto ensanchante provocado por la
presencia de lagunas de fase mvil dentro del empaque. Aumenta este
factor al aumentar el flujo de fase mvil.
Figura 26-9 Trayectorias tpicas
de dos molculas durante la
elucin. Note que la distancia
que viaja la molcula 2 es mayor
que la distancia que viaja 1. Por
tanto la molcula 2 llegara
despus que la molcula 1
Factor de Difusin longitudinal (B/u ) - Depende del coeficiente de difusin
del analito en la fase mvil, lo cual resulta en ensanchamiento de los picos
cromatogrficos. Resulta muy importante a bajos flujos de fase mvil, pero
conforme se aumenta el flujo se hace cada vez ms pequeo, debido a que la
muestra reside en la columna menos tiempo y por tanto el efecto de la
difusin es menor. Como la difusin es mayor para un gas que para un
lquido, este termino es importante en GC.
Factor de transferencia de masa entre las fases (Cu) - La fase
estacionaria es, generalmente una pelcula que recubre a un soporte, cuando
las molculas de soluto entran en la columna, algunas de ellas sern dejadas
atrs dependiendo de la interaccin que tengan con la fase estacionaria, tal
interaccin depender de: el coeficiente de difusin del soluto en la fase mvil,
el ancho de la pelcula y del factor de capacidad, cuando se trate de fases
estacionarias lquidas; y solo del factor de capacidad (que tan fuerte es
absorbido o des-absorbido el soluto) y del dimetro de la partcula, en el caso
de soportes slidos. El termino se divide en C
S
u (transferencia de masa en y
de la fase estacionaria) y C
M
u (Transferencia de masa en la fase mvil)
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* Se incrementa al aumentar la temperatura y disminuir la viscosidad
** DM para lquidos 10
-5
cm
2
s
-1
; gases DM 10
5
veces mayor que lquidos
A
Cuando en una separacin se aproxima a la unidad,
incrementar N y optimizar k no son suficientes para
obtener una separacin satisfactoria de dos solutos en
un tiempo razonable
1. Cambiar la composicin de la fase mvil
2. Cambios de pH en la fase mvil
3. Cambiar la composicin de la fase estacionaria
4. Cambiar la temperatura de la columna
5. Usar efectos qumicos especiales
Opciones empleadas para aumentar
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