Micrbios na natureza Aula prtica

Demonstrar a presena de micrbios na Natureza.

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Meta da aula

objetivos

Esperamos que, aps o estudo do contedo desta aula, voc seja capaz de: detectar a presena de micrbios no ar e associados ao corpo de animais (seres humanos e peixes); discutir a importncia das bactrias bioluminescentes na cadeia alimentar marinha.

AULA

Pr-requisitos
Para uma boa compreenso desta aula, voc dever recordar os contedos sobre tcnicas asspticas e colorao de Gram (Aula 5); esterilizao de meios de cultura (Aula 6); ao de desinfetantes sobre os micrbios (Aula 7), composio de meios de cultivo bacteriano (Aula 8) e meios seletivos para crescimento bacteriano (Aula 9).

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INTRODUO

Os micrbios so os seres que podem ser encontrados em todos os ambientes da biosfera. Voc j deve ter tomado conscincia dessa premissa medida que vem avanando no contedo desta disciplina. Nesta aula prtica, voc vai executar procedimentos para capturar e cultivar micrbios que esto presentes no ar que voc respira e associados superfcie da pele e das mucosas dos animais. Os da pele sero recolhidos da sua mo e os das mucosas a partir das guelras ou da cloaca de um peixe marinho fresco. Para cultivar micrbios voc precisa oferecer-lhes nutrientes e condies ambientais favorveis para que eles se propaguem. Mas, se eles esto em todos os lugares, que artifcio deve ser feito para que os micrbios que voc pretende capturar no necessitem competir com aqueles que j esto no local que voc escolheu para cultiv-los? Muito simples. Todo material a ser usado deve ser esterilizado antes. A esterilizao dos utenslios e dos meios de cultura pode ser efetuada por autoclavao (como voc viu na Aula 6). Lembre-se de que certos componentes nutritivos, por serem termolbeis, devem ser esterilizados por filtrao ou exposio radiao gama e depois adicionados, de maneira assptica, ao restante do meio de cultura que j foi autoclavado. Recordando a diversidade metablica dos micrbios voc deve levar em conta que, nem sempre, os componentes nutricionais includos nos meios so passveis de atender s exigncias nutritivas de todos os micrbios. Por isso, necessrio preparar meios de cultura de diferentes composies. Uns podem ser adicionados de ingredientes que inibam o crescimento de alguns tipos, mas favoream outros. Este tipo de meio de cultura classificado como seletivo para o tipo ou tipos microbianos que so favorecidos. Os meios de cultura seletivos podem ainda servir para diferenciar dois grupos bacterianos. Para isto, so adicionados de mais um ingrediente qumico (lactose, por exemplo) que pode ser metabolizado ou no pelas espcies bacterianas que suportam a presena do agente seletivo. Este tipo de meio de cultura empregado largamente nos trabalhos de classificao bacteriana (apresentados na Aula 9) e conhecido como sendo seletivo-indicador.

MATERIAIS NECESSRIOS PARA A EXECUO DA PRTICA

Para realizar esta aula prtica, que dividida em trs partes, voc vai precisar dos seguintes materiais: uma ala metlica para trabalhos bacteriolgicos; swabs esterilizados por raios gama;

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de metileno); uma cultura de bactria marinha bioluminescente, em tubo; duas placas de Petri com meio de cultura (Triptose-soja-agar-TSA ou de Agar nutritivo-AN) para demonstrao de micrbios no ambiente e associados s mos; uma ou duas placas de Petri com meio de cultura (Agar Nutritivo SalgadoANS) para cultivo de bactrias marinhas; um peixe marinho fresco; um bico de Bunsen ou uma lamparina a lcool; uma proveta ou uma pipeta com bulbo, para medir 15 mL do desinfetante; um aposento ou local escuro ou ento um pano preto grosso.

EXECUO
Lembre-se de que, para garantir a plenitude dos resultados, o material deve ser manipulado com tcnicas asspticas, conforme voc aprendeu na Aula 5. Por isso, recomendamos a utilizao de lamparina a lcool ou bico de Bunsen para flambar as alas e criar um campo de trabalho esterilizado, em volta da chama.

1a Parte: Demonstrao de micrbios no ambiente

Vamos ver quem captura mais micrbios? Para executar esta prtica voc vai utilizar uma placa de Petri contendo meio de cultura slido, constitudo de agar-agar (15g/L), hidrolisado enzimtico de protenas bovinas (15g/L), hidrolisado acdico de protena de soja (5g/L) e cloreto de sdio (5g/L), disponvel comercialmente sob a designao de TSA (triptonasojaagar). Para observar os resultados, voc dever levar as placas embrulhadas para casa e quard-las em cima da geladeira. Cada estudante deve escolher um local e abrir a placa, por cinco minutos, para capturar os micrbios presentes no ar. Esperar os micrbios carem na superfcie do meio de cultura da placa aberta uma maneira passiva de participar desta aula. Voc pode aumentar a eficincia deste processo correndo com a placa aberta para esbarrar com as clulas microbianas que esto no ar.
Figura 11.1: Uma maneira de segurar a placa com TSA para capturar micrbios do ar.

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um frasco com 200 mL de desinfetante (formol/detergente/azul

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toalhas de papel;

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Outra forma voc procurar um local onde exista um raio de luz que lhe permita observar as partculas que esto em suspenso. Assim voc os capturar facilmente. Lembre-se de que o que voc v no so os micrbios, mas sim a sombra deles. Para voc associar esse fenmeno a algo que lhe bem familiar, observe a Figura 11.2 onde mostrada a imagem de um ser humano que, ao servir de anteparo aos raios solares forma uma sombra. Voc no v a pessoa, mas percebe que ela est l.

Figura 11.2: Sombras ampliadas, ao entardecer em Fortaleza.

Depois disso, as placas devem ser mantidas fechadas, com a tampa para baixo (lembra da Aula 5?), em estufa a 37oC ou temperatura ambiente. Voc deve tomar providncias para evitar que formigas ou outros insetos penetrem nas placas e, para isso, voc pode embrulhlas com papel ou coloc-las dentro de um saco plstico, como aquele usado para congelamento de alimentos. Observe diariamente as placas para verificar a formao de colnias, resultantes da multiplicao dos micrbios que foram capturados quando a superfcie do meio de cultura foi exposta ao ambiente. Quem conseguir a placa com maior nmero de colnias, aps 48 horas, ser considerado o(a) vencedor(a). A classificao pode ser tambm em funo daquele(a) que conseguir a maior diversidade de tipos de colnias. Vocs decidem! Para saber o tipo morfolgico dos micrbios que formam as colnias na placa, voc pode preparar uma lmina de microscopia e cor-la pelo mtodo de Gram. Para pr em prtica essa sua iniciativa, voc deve desengordurar a lmina e, depois que estiver limpa e seca, usar a ala metlica para colocar uma gota dgua no local da superfcie da lmina onde far o esfregao. Depois flambe a ala, remova um pouco da colnia e espalhe junto com a gota dgua colocada na lmina. Espere

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Gram uma tcnica rpida e muito elucidativa. Utilizando-a voc ter a oportunidade de visualizar os tipos microbianos que estavam no ar e que encontraram condies satisfatrias para crescer no meio de cultura da sua placa de Petri. Ao terminar esta etapa do experimento, adicione 15 mL do desinfetante na placa e deixe em repouso por 24 horas, para depois descart-la. Voc deve estar se perguntando, por qu? fcil: como voc viu na Aula 7, o desinfetante agir eliminando os micrbios, mas para isso necessrio o fator tempo. Aps este procedimento, as placas podero ser descartadas no lixo, sem perigo de contaminao microbiana para o ambiente.

2a Parte: Demonstrao de micrbios associados ao corpo humano

Para realizar esta parte da aula, voc deve utilizar uma placa com meio TSA. Inicialmente, voc deve usar uma caneta que escreva em plstico e fazer uma marcao, no fundo da placa, dividindo-a em quatro quadrantes, identificando-os 1, 2, 3, 4. A seguir, realize as seguintes etapas: a) com a placa voltada para baixo, carimbe a impresso digital do seu dedo indicador no quadrante 1, conforme voc pode ver na Figura 11.3.a. ATENO: a consistncia da camada de meio de cultura bem frgil, por isso, toque-a delicadamente;

b Figura 11.3: Carimbando a digital na placa.

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chama. Prossiga conforme voc aprendeu na Aula 5. A colorao de

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o esfregao secar e promova a fixao expondo a lmina ao calor da

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b) em seguida, lave bem as mos com sabo e, depois de sec-las ao ar, carimbe a mesma impresso digital no quadrante 2 (Figura 11.3.b); c) faa nova lavagem das mos e, como no item b, carimbe agora o quadrante 3 (Figura 11.3.c); d) repita o item c, carimbando agora, o quadrante 4 (Figura 11.3.d); e) leve as placas para uma estufa a 37C por 24 ou 48 horas ou mantenha-as temperatura ambiente por mais tempo, com os devidos cuidados para evitar que insetos tenham acesso a elas; f) observe, diariamente, as placas para notar a formao de colnias nos locais onde houve o toque com a ponta do seu dedo; g) analise os resultados.

Alguns comentrios
A higiene feita ao lavar as mos no elimina todos os micrbios. Mas claro que os que so estranhos sua microbiota so retirados. Os seus, so seus, e no lhe fazem mal. Por isso, ao lavarmos as mos nos livramos dos micrbios dos outros. Como resultado desta aula prtica, voc ver que, mesmo lavando as mos, seus dedos tm micrbios e que no so poucos. Talvez voc perceba que o primeiro quadrante, onde voc carimbou seu dedo seco, o local em que apareceu o menor nmero de colnias. Porm ser nesse quadrante que voc encontrar a
Figura 11.4: Cultivo de bactrias da microbiota das mos sem lavar e aps trs lavagens.

maior diversidade delas. Na Figura 11.4 voc pode observar o resultado obtido em uma placa onde foi realizado este tipo de experimento. medida que voc lavava as mos ia umedecendo, progres-

EPITLIO
Camada celular que cobre todas as superfcies internas e externas do corpo. O tecido epitelial, de acordo com o nmero de camadas celulares que o compe, classificado em simples e estratificado. Na pele o epitlio estratificado.

sivamente, as reentrncias da pele e, dessa forma, os micrbios presentes nesse micronicho foram carreados para a superfcie do EPITLIO, e assim transferidos para o meio de cultura da placa. No se esquea de que s h crescimento se o meio de cultura for adequado aos seus micrbios. Voc pode compreender melhor esse fenmeno observando a Figura 11.5, onde mostrada, de forma ampliada com aumentos mltiplos de 10 vezes, a topografia do epitlio da mo.

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Figura 11.5: Em escala de 10, a topografia da pele da mo observada, notando-se as estruturas que a compem, de acordo com a ampliao utilizada. O quadrado central de cada imagem representa a rea que est sendo ampliada.

STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS

Um tipo de micrbio muito comumente associado pele humana o STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS. Para se perceber a olho nu a presena de micrbios, em um ambiente qualquer, necessrio o fator tempo, do qual dependem todos os fenmenos biolgicos. Neste caso, necessrio o tempo para que ocorram as divises sucessivas da clula, que vo aumentando em nmero, at formar colnias de tamanhos visveis. Nada diferente de um processo de gravidez, onde tambm o nmero de clulas aumenta em funo do tempo, at que a clula ovo se transforme num ser visvel, quer um exemplo biolgico melhor? Para saber o tipo de micrbios que formam as colnias na placa, voc s precisa repetir a prtica de microscopia com colorao de Gram. Para descartar a placa deste experimento, voc deve proceder conforme recomendado na primeira parte desta aula.

um tipo microbiano comumente encontrado na microbiota da pele e das mucosas das pessoas. Em face da sua ampla distribuio pelo corpo, so facilmente detectados em exames bacteriolgicos que buscam diagnosticar a presena de micrbios no ambiente onde h atividade humana. comum haver relatos da presena deste tipo de bactrias em maanetas, corrimes, telefones pblicos e cdulas ou moedas. Agora at d para voc entender por que se encontram mais micrbios nas cdulas de R$1,00 do que nas de R$100,00, que circulam no comrcio! Mais detalhes voc pode obter acessando o site: http://medinfo.ufl.edu/ year2/mmid/bms5300/ bugs/staepid.html

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BIOLUMINESCNCIA
Emisso de luz fria e visvel por seres vivos, resultante da oxidao orgnica de compostos proticos (luciferinas), mediada pela atividade cataltica da enzima luciferase. observada em vrios organismos, de bactrias at peixes, e constitui uma forma amplificada de um processo mais geral que ocorre em toda clula: a quimioluminescncia.

3a Parte: Demonstrao de bactrias produtoras de BIOLUMINESCNCIA, associadas microbiota de peixes marinhos

luciferina + O2 luciferase oxiluciferina + luz

Para executar esta prtica, voc deve trazer um peixe marinho (tem de estar fresco ou conservado na geladeira sem adio de nenhum conservante). A esta altura, j desnecessrio lembrar que os trabalhos tm de ser realizados com as manobras asspticas e que voc deve usar as placas com meio Agar Nutritivo Salgado (ANS). A composio desse meio a mesma do Agar nutritivo descrito na Aula 8, porm com a concentrao de cloreto de sdio aumentada para 3,5%, ou seja, semelhante quela da gua do mar. Leia e discuta com seu tutor ou com seus colegas de plo a seqncia dos procedimentos desta etapa da aula, para depois executlos: 1- marque as placas de ANS respectivamente com as letras P (peixe) e B (bactrias). Se s tiver uma placa, divida-a e marque os respectivos locais; 2- abra o invlucro do swab e, segurando-o pelo cabo, recolha uma amostra da microbiota do peixe. Para isto, esfregue o algodo da ponta do swab na cloaca ou na guelra do animal. Em seguida, encoste a ponta do swab em um ponto na superfcie da placa, marcada com P. O swab, aps o uso, deve voltar para o invlucro para ser descartado; 3- o prximo passo vai ser espalhar, pela superfcie da placa, os micrbios que foram depositados no local onde o swab encostou. Para isto, voc vai precisar da ala metlica. A haste da ala est fixada num cabo de madeira, por isso, antes de flamb-la molhe bem o cabo para no queimar; 4- flambe a ala e a use para espalhar, pela superfcie da placa, o material que foi semeado com o swab. A melhor maneira de espalhar fazendo um movimento em ziguezague. primeira vista, parece que nada foi colocado na superfcie do meio de cultura. No se preocupe, assim mesmo, pois o resultado desse tipo de experimento s vai poder ser visualizado aps 18 a 24 horas;

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bioluminescentes que est no tubo. Um simples toque suficiente. Use essa ala impregnada de bactrias para semear a placa B, repetindo o processo de espalhamento, conforme descrito no item 4. O objetivo do espalhamento distribuir as bactrias de tal maneira que voc consiga separ-las individualmente. Cada bactria isolada dar origem a uma colnia, ou seja, a uma populao clonada. A Figura 11.6 mostra o resultado de um processo de obteno de clones microbianos. Outra opo para o trabalho com bactrias bioluminescentes usar um swab para semear as bactrias da suspenso e usando de sua criatividade, faa desenhos na placa. uma forma ldica de trabalhar em Microbiologia.

Figura 11.6: Modelo de crescimento bacteriano, aps semear a placa pelo processo de espalhamento, conforme indicado pela posio das setas.

A placa deve ser incubada temperatura ambiente (cuidado com formigas e outros insetos!) e, logo aps o aparecimento das colnias (18 a 24 horas), ela dever estar com o aspecto semelhante ao observado na Figura 11.6. Para conseguir observar a bioluminescncia voc deve examinar as placas num local sem luz, como um aposento que possa ser deixado completamente escuro. Se voc no dispuser desse aposento, pode usar como artifcio uma caixa de papelo, onde as placas so colocadas e observadas atravs de um pequeno orifcio. Outra possibilidade cobrir-se com um pano preto grosso o suficiente para impedir a passagem de luz, conforme ilustrado na Figura 11.7.
Figura 11.7: Usando criatividade para observar o fenmeno da bioluminescncia bacteriana. CEDERJ 15

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encoste sua ponta sobre a massa celular da cultura de bactrias

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5- dando continuidade, flambe novamente a ala e, assepticamente,

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Como a bioluminescncia s pode ser observada em locais escuros, a pessoa na Figura 11.7 est mimetizando as condies do fundo do mar. A bioluminescncia s aparece na presena de oxignio, pois as bactrias necessitam do O2 para que ocorra o fenmeno, conforme voc pode ver no fundamento da reao apresentado na figura do verbete bioluminesccia. Voc pode apreciar o belo efeito da bioluminescncia em um experimento laboratorial na Figura 11.8.

Figura 11.8: Placa com cultura de bactrias bioluminescentes, observada aps 24 horas de incubao temperatura ambiente. esquerda a placa vista em ambiente iluminado e direita observada no escuro.

Para manter a bioluminescncia das colnias por um tempo maior, guarde as placas na geladeira ou use a ala depois de flambada para espalhar as clulas das colnias por uma maior superfcie da placa. desnecessrio lembrar que ao final do experimento, necessrio adicionar desinfetante na placa e aguardar o tempo necessrio para depois descart-la, conforme foi feito nas etapas anteriores.

CONSIDERAES SOBRE O PAPEL DO FENMENO DA BIOLUMINESCNCIA NO AMBIENTE MARINHO

No ambiente marinho, durante a noite ou, de forma contnua, nas regies abissais, a bioluminescncia desempenha importante papel na cadeia alimentar. Quando as bactrias bioluminescentes que, normalmente, esto em suspenso na gua do mar, do de encontro com

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o crescimento populacional, a massa microbiana passa a ser detectada em funo da luminescncia que emite. No ambiente escuro, esse brilho atrai peixes, que se alimentam desses resduos. As bactrias continuam se multiplicando no intestino desses peixes que, ao defecarem, colocam mais dessas bactrias no mar, e assim garantem a prxima refeio. Voc j reparou que os pescadores alegam que se pescarem noite pegam mais peixes? Depois de jogarem a isca, esperam, esperam e... fisgam! No seria mais rpido se banhassem a isca com uma suspenso concentrada de bactrias bioluminescentes? A relao peixes abissais x bactrias bioluminescentes to ntima que alguns deles, como o peixe-lanterna, tm colnias dessas bactrias incorporadas em seu corpo, como rgos luminosos que acendem e apagam em funo do abrir e fechar da membrana onde esto contidas.Voc pode observar um exemplo dessa interao na Figura 11.9.

Figura 11.9: Peixe-lanterna com o rgo bioluminescente na parte inferior do olho.

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mortos afundando, utilizam esses fragmentos como meio de cultura. Com

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qualquer fragmento de matria orgnica, tal como resduos de animais

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Em funo das propriedades bioluminescentes serem dependentes da presena de oxignio molecular, esse fenmeno tem sido explorado como um processo bioindicador da qualidade da gua pois, quanto mais poluda for a gua, menor o teor de oxignio nela dissolvido. Dessa forma, suspenses contendo 109 bactrias bioluminescentes da espcie Vibrio fisherii so adicionadas a uma amostra da gua e o grau de bioluminescncia exibido vai ser diretamente proporcional concentrao de O2 dissolvido. Esse tipo de experimento utilizado pelas empresas exploradoras de petrleo como uma forma de vigilncia ambiental onde atuam. Mais detalhes sobre esse aspecto tcnico podem ser encontrados na pgina da empresa Corbis (www.corbis.com).

CONCLUSO
Como voc observou, os micrbios fazem parte de todos os ecossistemas da Natureza, quer seja terrestre, aqutico ou o corpo dos seres humanos ou de outros animais. Tambm viu que eles podem ser observados quando lhes so dados nutrientes e tempo para o seu desenvolvimento. Os micrbios do ar geralmente esto sob a forma de esporos ou, em casos especiais, como num espirro, formas bacterianas vegetativas ficam em suspenso no ar. Nas regies afticas do mar, as bactrias bioluminescentes desempenham importante papel na cadeia alimentar, sinalizando para os animais marinhos encontrarem seu alimento. Podem, ainda, ser utilizadas como indicadoras de poluio da gua, por s se desenvolverem em ambiente no poludo.

RESUMO
Nesta aula, foram desenvolvidas tcnicas que permitiram a comprovao da presena dos micrbios associada ao corpo humano (mos), ao corpo de peixes marinhos e ao ar. Para detect-los, o ar ambiente, partes do corpo humano e de peixes marinhos foram postos em contato com meios contendo nutrientes que favoreceram o crescimento populacional desses micrbios. Todo esse processo aconteceu em funo do tempo decorrido. Voc verificou que, com a lavagem

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mas os seus permanecem. No ar tambm h micrbios, como voc pde constatar ao ca-los com uma placa de meio de cultura deixando-a incubando por um tempo superior a 24 horas. O fenmeno da bioluminescncia bacteriana tambm foi demonstrado, destacando a influncia do mesmo para as reas afticas do ambiente marinho.

INFORMAO SOBRE A PRXIMA AULA

Na prxima aula, voc ver mais detalhes sobre os micrbios eucariticos.

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das mos, os micrbios que no fazem parte da sua microbiota so removidos,

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