FACULTAD DE INGENIERA ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

EFECTO DEL TIEMPO DE EXTRACCIN DE EXTRACTOS DE HOJAS DE Manihot esculenta (YUCA), EN LA CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA (CMI) Y CONCENTRACIN MNIMA BACTERICIDA (CMB) EN Staphylococcus aureus ATCC 25923.
TESIS PARA OBTENER EL TTULO PROFESIONAL DE: INGENIERO AGROINDUSTRIAL AUTOR: Cerna Julin, Geiner Julio ASESOR: Dr. Gonzlez Cabeza, Jos LNEA DE INVESTIGACIN: Cultivos Agroindustriales TRUJILLO PER
2013

Efecto del tiempo de extraccin de extractos de hojas de Manihot esculenta (Yuca), en la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Cerna Julin, Geiner Julio Autor

Presentada a la Escuela Acadmico Profesional de Ingeniera Agroindustrial de la Universidad Csar Vallejo para su aprobacin.

M.Sc. Lennis Reyna L. Presidente

M.Sc. Gabriela Barraza J. Secretario

Dr. Jos Gonzlez C. Vocal

TRUJILLO PER
2013

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DEDICATORIA A Dios por guiarme, iluminarme y darme su fortaleza divina en el transcurso de mi vida, para poder de esta manera alcanzar todos los objetivos trazados. A mis padres Mara y Alberto por todas sus enseanzas, por el apoyo mutuo e incondicional en el transcurso de mi vida, por su confianza, afecto, y por dejarme muy claro que con esfuerzo y entrega se puede lograr todo en la

vida.
A mis abuelos por su apoyo incondicional y por sus grandes consejos. A mis hermanos Harry y Jheyson por todo su apoyo y sobre todo por su confianza y amistad.

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AGRADECIMIENTOS A la Universidad Csar Vallejo, por la formacin profesional durante todo este tiempo y por permitirme terminar esta etapa en mi vida universitaria. La elaboracin del presente Proyecto de Tesis, no hubiese sido posible sin el apoyo de las siguientes personas mencionadas a continuacin, a quienes agradezco mucho por todos sus conocimientos facilitados. Al Dr. Jos Gonzlez Cabeza, Asesor Especialista de mi Proyecto de Tesis, por sus conocimientos facilitados, por su orientacin, paciencia y por todo su apoyo en el desarrollo de este trabajo de investigacin. A la Ing. Mara Elena Len Marrou, Asesora Metodloga, en la primera parte de mi Proyecto de Tesis, por su paciencia, tiempo y por su apoyo constante para realizar de manera idnea este trabajo de investigacin. A la Ing. Gabriela Barraza Juregui, Asesora Metodloga, por sus enseanzas, sugerencias y por el apoyo facilitado en la segunda parte de este Proyecto de Tesis, orientndome de este manera a desarrollar este trabajo de manera organizada y ordenada. Finalmente muestro mi gratitud encarecida a todas las personas mencionadas anteriormente que hizo posible la realizacin de este trabajo de investigacin.

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DECLARATORIA DE AUTENTICIDAD Yo, Geiner Julio Cerna Julin con DNI N 45992245, a efecto de cumplir con las disposiciones vigentes consideradas en el Reglamento de Grados y Ttulos de la Universidad Csar Vallejo, Facultad de Ingeniera, Escuela de Ingeniera

Agroindustrial, declaro bajo juramento que toda documentacin que acompao es veraz y autentica. As mismo, declaro tambin bajo juramento que todos los datos e informacin que se presenta en la presente Tesis son autnticos y veraces. En tal sentido asumo la responsabilidad que corresponda ante cualquier falsedad, ocultamiento u omisin tanto de los documentos como de informacin aportada por lo cual me someto a lo dispuesto en las normas acadmicas de la Universidad Csar Vallejo.

Trujillo, 22 de Julio del 2013

Geiner Julio Cerna Julin

PRESENTACIN

Seores Miembros del Jurado: En cumplimiento con la normativa establecida de Grados y Ttulos de la Facultad de Ingeniera, Escuela Acadmico Profesional de Ingeniera Agroindustrial de la Universidad Csar Vallejo, presento a su consideracin el Proyecto de Tesis que tiene por ttulo: Efecto del tiempo de extraccin de extractos de hojas de Manihot Esculenta (Yuca), en la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en Staphylococcus aureus ATCC 25923. El presente proyecto de investigacin, es de gran importancia considerando que actualmente no se puede observar la utilizacin de las hojas de Manihot esculenta (Yuca) en la Industria Alimentaria, las cuales podran contener compuestos naturales antimicrobianos, optando as por su posible insercin como un empaque o envase biodegradable, que ayude a la reduccin de la contaminacin microbiana producida en demasa por Staphylococcus aureus ATCC 25923 en productos alimentarios, generando de esta manera una posible solucin a los problemas expuestos anteriormente, como tambin al uso excesivo de lminas plsticas, las cuales generan contaminacin a corto, mediano y largo plazo. De esta manera espero que el esfuerzo realizado en la ejecucin de este trabajo de investigacin cumpla y satisfaga sus expectativas.

Cerna Julin, Geiner Julio vi

NDICE GENERAL PGINA DEL JURADO...............................................................................................................ii DEDICATORIA .......................................................................................................................... iii AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................iv DECLARATORIA DE AUTENTICIDAD...................................................................................... v PRESENTACIN ......................................................................................................................vi NDICE GENERAL ................................................................................................................... vii NDICE DE CUADROS ..............................................................................................................ix NDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ x NDICE DE ANEXOS ................................................................................................................ xii RESUMEN ............................................................................................................................... xiii ABSTRACT.............................................................................................................................. xiv I. INTRODUCCIN ................................................................................................................. 1 II. MARCO METODOLGICO .............................................................................................. 10 2.1. Variables ...................................................................................................................... 10 2.1.1. Variables independientes ........................................................................................ 10 2.1.2. Variables dependientes .......................................................................................... 10 2.2. Operacionalizacin de variables .................................................................................. 10 2.3. Metodologa ................................................................................................................. 11 2.4. Tipos de estudio .......................................................................................................... 11 2.4.1. De acuerdo a la orientacin .................................................................................... 11 2.4.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin ............................................................... 11 2.5. Diseo de investigacin ............................................................................................... 11 2.6. Poblacin, muestra y muestreo ................................................................................... 11 2.6.1. Insumos .................................................................................................................. 11

2.6.2. Materiales y equipos ............................................................................................... 11 2.6.3. Esquema experimental ........................................................................................... 12 2.6.4. Descripcin del proceso experimental .................................................................... 13 2.6.4.1. Estudio piloto ..................................................................................................... 13 2.6.4.2. Preparacin de la cepa ...................................................................................... 13 2.6.4.3. Over Night .......................................................................................................... 13 2.6.4.4. Control positivo .................................................................................................. 14 2.6.4.5. Control negativo ................................................................................................. 14 2.6.4.6. Preparacin de los extractos.............................................................................. 14 2.6.4.7. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria ...................................... 14 2.6.4.8. Determinacin de la Concentracin Mnima Bactericida .................................... 15 2.7. Mtodos de anlisis de datos ......................................................................................... 15 2.7.1. Desviacin estndar .................................................................................................. 15 2.7.2. Anlisis de varianza ................................................................................................... 16 2.7.3. Prueba de tukey ......................................................................................................... 16 III. RESULTADOS ................................................................................................................... 17 IV. DISCUSIN ....................................................................................................................... 28 V. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 32 VI. RECOMENDACIONES ...................................................................................................... 33 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................. 34 VIII. ANEXOS .......................................................................................................................... 40

NDICE DE CUADROS Cuadro 1. Operacionalizacin de variables ............................................................................... 10 Cuadro 2. Modelo de aplicacin de anlisis de varianza (ANVA) .............................................. 16 Cuadro 3. ANVA aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1, T2 y T3 ......................................................................................................... 21 Cuadro 4. Prueba de Tukey aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1 (temperatura ambiente 0 minutos) ............................................... 22 Cuadro 5. Prueba de Tukey aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T2 (100 C 15 minutos) ..................................................................... 22 Cuadro 6. Prueba de Tukey aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T3 (100 C 30 minutos) ..................................................................... 23 Cuadro 7. Resultados de la Concentracin Mnima Bactericida para T1 (temperatura ambiente 0 minutos), T2 (100 C 15 minutos) y T3 (100 C 30 minutos) ........................... 27 Cuadro 8. Concentracin Mnima Inhibitoria en S. aureus ATCC 25923, para T1 ..................... 49 Cuadro 9. Concentracin Mnima Inhibitoria en S. aureus ATCC 25923, para T2 ..................... 49 Cuadro 10. Concentracin Mnima Inhibitoria en S. aureus ATCC 25923, para T3 ................... 49

NDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema experimental ................................................................................................. 12 Figura 2. Efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1, en la CMI en S. aureus ATCC 25923 .......................................................................................................... 17 Figura 3. Efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T2, en la CMI en S. aureus ATCC 25923 .......................................................................................................... 18 Figura 4. Efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T3, en la CMI en S. aureus ATCC 25923 .......................................................................................................... 19 Figura 5. Efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1, T2 y T3, en la CMI en S. aureus ATCC 25923............................................................................................... 20 Figura 6. Resultados de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923, en Agar Meller-Hinton (T1) ............................................................................................. 24 Figura 7. Resultados de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923, en Agar Meller-Hinton (T2) ............................................................................................. 25 Figura 8. Resultados de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923, en Agar Meller-Hinton (T3) ............................................................................................. 26 Figura 9. Obtencin de T1 (Temperatura ambiente 0 minutos) ................................................. 41 Figura 10. Obtencin de T2 (100C 15 minutos) y T3 (100C 30 minutos) ............................. 41 Figura 11. Filtrado de Extractos de Hojas de M. esculenta (Yuca) .............................................. 42 Figura 12. Extractos Estriles procedentes de T1 (temperatura ambiente 0 minutos) .............. 42 Figura 13. Extractos Estriles procedentes de T2 (100C 15 minutos) ..................................... 43

Figura 14. Extractos Estriles procedentes de T3 (100C 30 minutos) ..................................... 43 Figura 15. Medio de Cultivo Caldo LB ...................................................................................... 44 Figura 16. Crecimiento en Caldo LB del vial sembrado de S. aureus ATCC 25923 .................... 44 Figura 17. Agar Manitol Salado Medio Selectivo para S. aureus ATCC 25923 ........................ 45 Figura 18. Proceso de Fermentacin de Manitol Salado S. aureus ATCC 25923 .................... 45 Figura 19. S. aureus ATCC 25923 ............................................................................................... 45 Figura 20. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Sin Incubar (T1) .......................... 46 Figura 21. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Incubados (T1) ........................... 46 Figura 22. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Sin Incubar (T2) .......................... 47 Figura 23. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Incubados (T2) ........................... 47 Figura 24. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Sin Incubar (T3) .......................... 48 Figura 25. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Incubados (T3) ........................... 48

NDICE DE ANEXOS Anexo 1. Formato de ensayo macro-dilucin en caldo ................................................................ 40 Anexo 2. Proceso de obtencin de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca) .......................... 41 Anexo 3. Preparacin de la cepa (S. aureus ATCC 25923)......................................................... 44 Anexo 4. Determinacin de la CMI en S. aureus ATCC 25923 con extractos estriles procedentes de T1........................................................................................................................ 46 Anexo 5. Determinacin de la CMI en S. aureus ATCC 25923 con extractos estriles procedentes de T2........................................................................................................................ 47 Anexo 6. Determinacin de la CMI en S. aureus ATCC 25923 con extractos estriles procedentes de T3........................................................................................................................ 48 Anexo 7. Resultados de la Concentracin Mnima Inhibitoria en S. aureus ATCC 25923 ........... 49

RESUMEN En el presente trabajo de investigacin, se evalu la actividad antimicrobiana in vitro de extractos de hojas de Manihot esculenta (Yuca), recolectadas del Valle de Vir, La Libertad Per, en la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en Staphylococcus aureus ATCC 25923. Para esto se obtuvieron extractos acuosos por trituracin de hojas de M. esculenta (Yuca), con posterior proceso de extraccin (tratamiento trmico), en un matraz Erlenmeyer aforado con agua destilada, tales procesos de extraccin se dieron de la siguiente manera, T1 (Temperatura ambiente 0 minutos), T2 (100 C 15 minutos) y T3 (100 C 30 minutos), para luego ser filtrados con papel de nitrocelulosa con tamao de poro de 0,45 m y finalmente pasar un control de calidad. La Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI), se determin utilizando el mtodo de Macro dilucin en caldo, para esto se trabaj con concentraciones decrecientes, en este caso los extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1 (Temperatura ambiente 0 minutos), T2 (100 C 15 minutos) y T3 (100 C 30 minutos), los cuales fueron agregados en el medio de cultivo LB, con la cepa ( S. aureus ATCC 25923). Para luego de 24 horas de incubacin a 37 C, definirse como Concentracin Mnima Inhibitoria, aquella donde el primer tubo de ensayo aparezca sin crecimiento (turbidez). La Concentracin Mnima Bactericida (CMB), se determin mediante la metodologa de difusin en placas, para esto se tom alcuotas de 100 L del ensayo de la Concentracin Mnima Inhibitoria con previo proceso de incubacin, las cuales fueron sembradas en agar Meller-Hinton e incubadas a 37 C durante 24 horas, finalmente se verifico bajo que concentracin ya no existe crecimiento bacteriano. Se concluye que los extractos de hojas de M. esculenta (Yuca) (T1, T2 y T3), presentaron poder Inhibitorio (CMI) frente a S. aureus ATCC 25923, mas no poder bactericida (CMB), resaltndose como mejor tratamiento a T3 (100 C 30 minutos), frente a la CMI de S. aureus ATCC 25923.

Palabras claves: Antimicrobiano, Hojas, Yuca, Extractos.

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ABSTRACT In this research work, the antimicrobial activity "in vitro" of leaves extracts from Manihot esculenta (Yucca), collected from Vir Valley, La Libertad - Per, in the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bacterial Concentration (MBC) on Staphylococcus aureus ATCC 25923, was evaluated. For this aqueous extracts were obtained by crushing of leaves Manihot esculenta (Yucca), with subsequent extraction process (thermal treatment), in a volumetric Erlenmeyer flask with distilled water, such extraction processes were the following way: T1 (ambient temperature - 0 minutes), T2 (100 C - 15 minutes) and T3 (100 C 30 minutes), for then be filtered with nitrocellulose paper with a pore size of 0.45 pm and finally pass quality control. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined using the method of Macro - broth dilution, for this we worked with decreasing concentrations, in this case the leaves extracts from Manihot esculenta (yucca), originating from T1 (ambient temperature - 0 minutes), T2 (100 C - 15 minutes) and T3 (100 C - 30 minutes), which were added in the middle of LB cultivation, with the strain (S. aureus ATCC 25923). To after 24 hours of incubation at 37 C, defined as the minimum inhibitory concentration, that where the first test tube appeared without growth (turbidity). Minimum Bacterial Concentration (MBC), was determined by the plate diffusion method, for this was taken in 100 L assay Minimum Inhibitory Concentration with prior incubation process, which were sown in Mueller-Hinton agar and incubated at 37 C for 24 hours, finally verified under that concentration the bacterial growth no longer exists. It is concluded that the leaves extracts from Manihot esculenta (yucca) (T1, T2 and T3), presented inhibitory power (MIC) against S. aureus ATCC 25923, but not bactericidal power (MBC), highlighting as best treatment to T3 (100 C - 30 minutes), against the MIC of S. aureus ATCC 25923.

Keywords: Antimicrobial, Leaves, Yucca, Extracts.

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I. INTRODUCCIN Para una mejor orientacin en la elaboracin de este trabajo de investigacin se tomaron como referencia trabajos in vitro realizados con anterioridad, con referencia a extractos y sus posibles propiedades antimicrobianas, los cuales se citan a continuacin: Estrada (2011) evalu la actividad antibacteriana in vitro de los extractos de Romero y Tomillo frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Klebsiella pneumoniae. ATCC 13883, Candida albicans ATCC 10231 y Pseudomonas aeruginosa. ATCC 27853. Para tal estudio obtuvieron extractos por maceracin de las hojas y tallos en un baln aforado con hexano y alcohol agua, luego realizaron el control de calidad y evaporaron el solvente por bao Mara. Posteriormente usaron tres

concentraciones diferentes, frente a distintas bacterias y comprobaron sus propiedades antimicrobianas utilizando el mtodo de Mitscher el cual consiste en la determinacin del crecimiento de los microorganismos en presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano en este caso los extractos, que se encuentran diluidos en el medio de cultivo. Luego de 24 y 48 horas de incubacin; observaron que los extractos de ambas plantas presentaban actividad antibacteriana destacndose la mezcla de los extractos hexnicos a concentraciones de 10000 y 1000 g/mL frente a Staphylococcus aureus, Candida albicans y Pseudomonas aeruginosa debido a los compuestos fenlicos como el timol, carvacrol y cineol presentes en el aceite esencial por lo cual recomendaron la utilizacin de la mezcla de los extractos de Romero y Tomillo en infecciones causadas por bacterias y hongos. De La Paz et al., (2012) realizaron una investigacin orientada a la comprobacin de la accin antimicrobiana de los extractos elaborados a partir de la planta Luffa cylindrica L obtenindose las tinturas al 20 %, los extractos hexnicos, clorofrmicos, acetato de etilo, acuosos y los

correspondientes extractos secos de tallos, hojas y fruto verde. En los posteriores ensayos microbiolgicos in vitro las tinturas al 20 % de hojas y 1

tallos y los extractos en diferentes solventes presentaron accin antimicrobiana frente a cepas de referencia y salvaje de Sthaphylococcus aureus y Escherichia coli y cepa salvaje de Candida sp como tambin los extractos obtenidos del fruto. Cruz et al., (2010) indicaron que uno de los temas ms importantes es la resistencia bacteriana. En ese contexto optaron por la bsqueda de nuevos principios activos con actividad antibacteriana, para lo cual eligieron determinar las propiedades antibacterianas de cuatro especies vegetales, recolectadas en la ciudad de Tunja (Boyac). Prepararon extractos etanolitos, a partir de las hojas secas de Bidens pilosa, Lantana camara, Schinus molle y Silybum marianum, las cuales, fueron sometidas a un anlisis microbiolgico in vitro, para establecer su actividad antibacteriana y sus concentraciones mnimas inhibitoria y bactericida, en respuesta a Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa. Las actividades, se compararon con un frmaco estndar, cloranfenicol o gentamicina. Los extractos mostraron actividad contra S. aureus; la que exhibi la mejor actividad fue B. pilosa y L. camara, S. molle y S. marianum manifestaron capacidad moderada para inhibir el crecimiento de S. aureus. Finalmente concluyeron que las plantas seleccionadas tienen actividad antibacteriana frente a S. aureus. Thoene et al., (2008) evaluaron la actividad antimicrobiana de extractos etanlicos de hojas y corteza secas de P. australis frente a Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Para tal investigacin maceraron hojas y cortezas secas en etanol 70 % por 5 das, las cuales fueron filtradas, secadas y esterilizadas. La actividad antimicrobiana fue evaluada mediante el mtodo de difusin en placas de agar. Posteriormente establecieron las concentraciones mnima inhibitoria (CMI), bacteriosttica (CBS) y bactericida (CMB). Analizaron el efecto del extracto etanlico sobre la morfologa de S. aureus y P. aeruginosa por microscopia electrnica de transmisin. Concluyendo que los extractos etanlicos de hojas y corteza secas de P. australis mostraron actividad antimicrobiana contra S. aureus y P. aeruginosa. El extracto etanlico de corteza 2

present menos actividad antimicrobiana que el de hojas, el cual result bactericida contra S. aureus y bacteriosttico contra P. aeruginosa. Por otro lado, Suarez y Merderos (2011), sealan que las hojas de M. esculenta (Yuca) son simples y estn compuestas por la lmina foliar y el pecolo. La lmina foliar es palmeada y profundamente lobulada. El nmero de lbulos en una hoja es variable y por lo general impar, oscilando entre tres y nueve. Los lbulos miden entre 4 y 20 cm de longitud y entre 1 a 6 cm de ancho; los centrales son de mayor tamao que los laterales. El tamao de la hoja es una caracterstica tpica de cada cultivar, aunque depende mucho de las condiciones ambientales. Son de color verde oscuro, a veces con matices rojizos en los nervios. Las hojas producidas en los primeros tres a cuatro meses de vida de la planta son ms grandes que las producidas luego del cuarto mes. El color de las hojas tambin es una caracterstica varietal, pero que puede variar con la edad de la planta. Forma parte de la familia Euphorbiaceae; la especie en concreto es Manihot esculenta Crantz. Con referencia a los compuestos txicos presentes en toda la estructura de la yuca, (Gmez, 1982, citado por Aristizbal y Snchez, 2007) menciona al cianuro como compuesto toxico principal, constituido por dos tipos de glucsidos cianognicos: linamarina y lotaustralina. Aproximadamente el 8590 % del cianuro total de los tejidos en la yuca se encuentra como cianuro ligado o linamarina y solo el 1015 % como cianuro libre o lotaustralina. Los glucsidos linamarina y lotaustralina al hidrolizarse por medio de la accin de la enzima linamarasa, dan origen a glucosa y cianhidrina, donde esta ltima se descompone en acetona y cido cianhdrico libre gaseoso; este ltimo es el que puede ocasionar toxicidad en el organismo cuando supera los niveles de seguridad (Aristizbal y Snchez, 2007).

Linamarasa Linamarina + Agua C10H17O6N H2 O Glucosa + Cianhidrina C6H12O6 C4H7NO Acetona + Ac. Cianhdrico C3H6O HCN

Estos compuestos tambin son considerados responsables de la repelencia que las plantas ejercen sobre algunos insectos fitfagos o herbvoros en general. Lo mismo sucede en variedades con altos contenidos de estos glucsidos en lo que respecta a la tolerancia a ciertas enfermedades. El nivel de glucsidos cianognicos o cido cianhdrico total presente en la raz o hojas de yuca, determina la diferencia entre variedades amargas (de mayor toxicidad) y variedades dulces. Segn las experiencias del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en manejo de variedades de yuca (Snchez, 2004, citado por Aristizbal y Snchez, 2007), las variedades con menos de 180 ppm de HCN (en base seca) se clasifican como variedades dulces, las que poseen entre 180 300 ppm se clasifican en el rango intermedio y las que tienen un contenido de HCN mayor de 300 ppm son consideradas como variedades amargas. La concentracin de cianuro en las hojas vara, siendo mayor en las hojas tiernas o jvenes que en las hojas adultas y, en general, las hojas poseen concentraciones similares a las encontradas en la cscara de las races (Aristizbal y Snchez, 2007). En forma natural, la liberacin del HCN se debe a la accin de la enzima linamarasa, la cual se encuentra normalmente en los tejidos de la planta de yuca, especialmente en la cscara de la raz y en las hojas. El contacto de la enzima con la linamarina ocurre cuando los tejidos sufren daos mecnicos o por trituracin o destruccin de la estructura celular de la planta o tejidos. Por lo tanto, cuanto mayor sea la trituracin ms fcil es la liberacin del HCN en la yuca; adems, la temperatura y la humedad aceleran el proceso de liberacin del HCN. Al picarse las races, la proporcin de cianuro libre aumenta rpidamente a rangos de 3040 % del cianuro total comparado con los niveles

de 1015 % de cianuro libre observados en la cscara o en la pulpa cuando se analizan por separado (FAO y OMS, 1991). El mtodo comercial ms efectivo para eliminar total o parcialmente el HCN, se basa en la accin controlada del calor. Temperaturas entre 4080 C son efectivas para eliminar la mayor parte del cido cianhdrico libre. La liberacin del HCN puede ocurrir por deshidratacin natural por accin de los rayos solares, a temperatura entre 3040 C el cual es un sistema seguro para destruir el cido cianhdrico, sin afectar la accin de la enzima linamarasa (Gmez et al., 1979, citado por Aristizbal y Snchez, 2007). Usando temperaturas mayores a 40 C es posible eliminar hasta cerca del 80 % del cido cianhdrico libre y cuando la temperatura llega a 60 C se puede eliminar ms del 90 %. El calentamiento a temperaturas mayores de 70 C, con poca o ninguna humedad, elimina el cido cianhdrico libre; sin embargo, con este mtodo tambin se destruye la enzima linamarasa que es la enzima que permite que los glucsidos continen transformndose en cido cianhdrico libre. El rango de temperatura ptimo para realizar la mxima liberacin del HCN est comprendido entre 6070 C. Cooke y Maduagwu (1978) demostraron que los procesos de secamiento lentos a baja temperatura remueven el cianuro residual de manera ms efectiva que los procesos rpidos a alta temperatura. El proceso de coccin en agua es efectivo para eliminar el HCN libre y es posible eliminar ms del 90 % de este cocinando la yuca durante 15 minutos. El cianuro libre es mucho ms fcil de eliminar que el cianuro ligado. Si se sumergen los trozos de yuca en agua fra antes del proceso de coccin, se puede eliminar la mayor parte del HCN libre despus de 45 horas, es decir el 1015 % del HCN total de la yuca. Sin embargo, con este mtodo el HCN ligado (8590 % del HCN total) permanece casi intacto y es por ello que es necesario someter la yuca a mayores temperaturas (Aristizbal y Snchez, 2007).

La FAO (1997), menciona que los estafilococos son organismos ubicuos y se pueden encontrar en el agua, aire, polvo, leche, aguas residuales, pavimento, otras superficies y todos los artculos que entran en contacto con el hombre, adems, sobreviven muy bien en el medio ambiente. No obstante, su principal reservorio y hbitat es la nariz, garganta y piel del hombre y animales. La tasa de portadores humanos puede ser hasta del 60 % de los individuos sanos, con una media del 2530 % de la poblacin que es positiva para las cepas productoras de enterotoxinas. La enfermedad causada por S. aureus es una intoxicacin. Los sntomas comunes, que pueden aparecer entre 2 y 4 horas despus del consumo de alimentos contaminados, son nuseas, vmitos y algunas veces diarrea. Normalmente, los sntomas no duran ms de 24 horas, pero en casos graves, la deshidratacin puede llevar a la conmocin y al colapso. As mismo, Ray (2010) seala que S. aureus, es un coco Gram positivo, que por lo regular se presentan en grupos semejantes a racimos. La mayor parte de las cepas fermentan manitol y producen coagulasa, termonucleasa y hemolisina, pero difieren en su sensibilidad a los bacterifagos. Las clulas mueren a una temperatura de 66 C en 12 minutos y a 72 C en 15 minutos. S. aureus, son anaerobios facultativos, pero prosperan con rapidez en condiciones aerbicas. Tienen la capacidad de fermentar carbohidratos y tambin de causar protelisis por medio de las enzimas proteolticas extracelulares. Son mesfilos y crecen a un rango de temperatura de 7 a 48 C con proliferacin mayor entre 20 y 37 C. Otras caractersticas importantes de su crecimiento son su capacidad para multiplicarse a una (aw) relativamente baja (0.86) y pH bajo (4.8). S. aureus, produce enterotoxinas comnmente asociadas con enfermedades transmitidas por los alimentos (Brock, 1993). Muchos alimentos han sido asociados al brote de enfermedades por estafilococos. En general, las bacterias proliferan en los alimentos y producen toxinas cuya presencia no afecta a la calidad del producto pero si a la salud del consumidor. Entre los principales alimentos que se relacionan con este 6

microorganismos, resaltan; jamones, carnes, ensaladas, productos horneados que incluyen algn tipo de crema, pudines, aderezos para ensaladas, salsas y quesos. Asimismo las carnes de cerdo, res, pavo y pollo, as como huevos y productos horneados, se relacionan con altos porcentajes de brotes. Diferentes tipos de ensaladas junto con una manipulacin excesiva y exposicin a temperaturas inadecuadas, se han implicado con un nmero relativamente alto de casos con envenenamiento con estafilococos. Los tres factores que ms contribuyen a estos brotes son; inadecuada temperatura de conservacin, higiene personal deficiente y contaminacin de los equipos (Ray, 2010). A su vez, Ray (2010) menciona que actualmente se observa una disminucin de S. aureus que tal vez haya sido resultado de mejor uso de temperaturas de refrigeracin para almacenar los alimentos y mejores prcticas sanitarias que controlan su contaminacin y proliferacin. Por otro lado este proyecto de investigacin trata de profundizar principalmente en el estudio de las posibles propiedades antimicrobianas de las hojas de yuca (Manihot esculenta) las cuales podran contener compuestos naturales inhibidores (cido cianhdrico), para esto se utilizara uno de los principales microorganismos de inters agroindustrial como; S. aureus, tal agente microbiano ser inoculado en extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sin previo tratamiento trmico (temperatura ambiente 0 minutos) y con tratamiento trmico (100 C 15 minutos) y (100 C 30 minutos), para de esta manera poder determinar las posibles propiedades antimicrobianas, presentes en dichas hojas. Por tanto ante los motivos sealados anteriormente, este proyecto justifica la utilizacin de las hojas de yuca (M. esculenta) en la posible inhibicin de microorganismos de inters agroindustrial y su utilizacin futura como material de conservacin de alimentos, ya que actualmente no se observa su participacin en el mercado alimentario, rescatando de esta manera sus posibles propiedades protectoras y beneficios para la salud que se podran dar por su 7

utilizacin como un envase o embalaje biodegradable, as mismo una reduccin en la utilizacin de lminas plsticas en el mercado alimentario como material de envase, las cuales a largo plazo generan contaminacin por su posterior utilizacin y desecho. Asimismo se observ que el problema real, es la falta de conocimiento por parte del agricultor en el uso de este material orgnico, ya que en la actualidad al obtener su cosecha aprovecha solamente su fruto o pulpa, generando de esta manera un gran desperdicio por el desecho de hojas de M. esculenta (Yuca), las cuales no son utilizadas para ningn fin. La presente investigacin se realiz con el propsito de originar una mayor importancia sobre la utilizacin de las hojas de Yuca, rescatando de esta manera sus posibles propiedades protectoras en beneficio del mercado alimentario. La Yuca un tubrculo originario de Sudamrica, se caracteriza por ser una planta herbcea perenne de la familia de las euforbiceas, que alcanza generalmente los 3m de altura, se reproduce con mayor eficacia a travs de esquejes, por ser un producto habitual de Sudamrica recibe diferentes nominaciones en los diferentes pases en donde es cultivada en el Per es conocida generalmente como yuca, mandioca guacamota. Las hojas estn dispuestas en espiral, y tienen de 5 a 15cm de longitud, palmeadas, con 3 a 7 lbulos lanceolados y acuminados, a veces pubescentes en las nervaduras del envs. Son de color verde oscuro y en algunas ocasiones con matices rojizos en los nervios (Santos, 2006). En la actualidad esta raz, bsicamente sus hojas no son lo suficientemente valoradas en nuestra regin y pas, desconociendo de esta manera las bondades que se pueden encontrar en sus hojas, las cuales se podran aplicar al mercado alimentario. Se puede observar que en el comercio con los mercados locales, este producto es adquirido y se aprovecha tan solo la pulpa con fines alimentarios, generando de esta manera grandes cantidades de desperdicios los cuales incluyen principalmente hojas.

Por otro lado compuestos naturales repelentes presentes en las hojas de M. esculenta (Yuca), como son los glucsidos cianognicos (linamarina y lotaustralina) que por accin de la enzima linamarasa, son convertidos en cido cianhdrico (Box, 2005), podran utilizarse como inhibidores de microorganismos de inters agroindustrial como por ejemplo; S. aureus, tales agentes microbianos generan innumerables riesgos para la salud por un posible insercin en productos alimentarios, como tambin generan degradacin de los mismos. Ante lo sealado anteriormente, se plantea como problema de investigacin lo siguiente: Afectar el tiempo de extraccin de extractos de hojas de Manihot esculenta (Yuca), en la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923? Asimismo, la hiptesis que se formula en el presente trabajo de investigacin, es la siguiente: La aplicacin de un tiempo de extraccin de 30 minutos en extractos de hojas de Manihot esculenta (Yuca), afectar la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923. Ser este extracto, el que presente mayor poder antimicrobiano. Por otro lado, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto inhibitorio y bactericida de extractos acuosos de hojas de M. esculenta (Yuca), sobre una bacteria patgena importante y frecuentemente vinculada con alimentos como S. aureus ATCC 25923.

II. MARCO METODOLGICO 2.1. Variables 2.1.1. Variables independientes Tiempo de extraccin (0, 15 y 30 minutos). 2.1.2. Variables dependientes Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI). Concentracin Mnima Bactericida (CMB). 2.2. Operacionalizacin de variables Cuadro 1. Operacionalizacin de variables
VARIABLE DEFINICIN CONCEPTUAL Se Magnitud Tiempo fsica con DEFINICIN OPERACIONAL determin usando un INDICADOR ESCALA DE MEDICIN

la cronometro, controlando as 0, 15 y 30 Minutos Intervalo

que medimos la duracin tiempos de o separacin

de minutos para la obtencin de los extractos de hojas de M. esculenta (Yuca).

acontecimientos.

Es la concentracin ms baja Concentracin Mnima inhibitoria (CMI) de un que Se determin mediante el Absorbancia Intervalo

antimicrobiano inhibe visible el

crecimiento mtodo de macro dilucin en de un caldo.

microorganismo despus de su incubacin. Es Concentracin Mnima bactericida (CMB) la menor Se determin mediante el mtodo de difusin en placas en agar Meller-Hinton. UFC/mL Razn

concentracin capaz de destruir o matar

bacterias en 1 mL de medio de cultivo, tras 24 horas de incubacin.

10

2.3. Metodologa Mtodo Experimental 2.4. Tipos de estudio 2.4.1. De acuerdo a la orientacin: Aplicado 2.4.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin: Experimental 2.5. Diseo de investigacin Experimental Puro Factorial 2.6. Poblacin, muestra y muestreo Para la presente investigacin se trabaj con hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de valle de Vir, La Libertad Per. Para lo cual se tom como muestra 270 gr de hojas de M. esculenta (Yuca). 2.6.1. Insumos Triptona o Peptona Extracto de Levadura NaCl Agar Meller-Hinton Agar Manitol Salado Alcohol 96 Agua destilada 2.6.2. Materiales y equipos Tips de Micro pipeta Tubos de ensayo Pipetas Vasos de precipitado Placas Petri Matraces Mechero Autoclave 11

Incubadora Espectrofotmetro 2.6.3. Esquema experimental En la Figura 1 se muestra el esquema experimental del presente trabajo de investigacin.
Hojas de M. esculenta (Yuca)

T1

T2

T3

Extractos de Hojas de M. esculenta (Yuca)

Concentracin Mnima Inhibitoria

Concentracin Mnima Bactericida

d1

d2

d3

d4

d5

d6

d7

d8

d9

p1

p2

p3

p4

p5

p6

p7

p8

p9

Se realiz tres tratamientos T1 (0 min temperatura ambiente), T2 (15 min 100 C) y T3 (30 min 100 C), ejecutndose un numero de tres repeticiones por cada tratamiento mencionado anteriormente. Dnde: T1= Temperatura ambiente durante 0 minutos T2= 100 C durante 15 minutos T3= 100 C durante 30 minutos d= diluciones p= placas Petri

12

2.6.4. Descripcin del proceso experimental 2.6.4.1. Estudio piloto En el presente proyecto de investigacin, se trabaj con diluciones seriadas de 101109, tal procedimiento fue dado para los extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sin tratamiento trmico (0 minutos) y con tratamiento trmico durante (15 y 30 minutos), obtenidos por filtracin y previamente estriles, tales muestras de extractos se dispensaron con la cepa a ensayar (S. aureus ATCC 25923) en tubos de ensayo conteniendo caldo LB, para posteriormente ser llevadas a incubar durante 24 horas. 2.6.4.2. Preparacin de la cepa La cepa microbiana empleada fue S. aureus ATCC 25923, recuperado a partir de viales criognicos (-40 C), este vial se incub durante 2 horas a temperatura de refrigeracin (4 C) y posteriormente fue colocado a temperatura ambiente. A partir de este cultivo, se efectuaron siembras en agar nutritivo (Placas Master) y verifico las caractersticas fenotpicas de la cepa mencionada, ms adelante se obtuvieron cultivos puros en caldo LB, incubados a 37 C durante 24 horas. Posteriormente fueron sembradas en placas con agar Manitol Salado, las cuales se constituyeron como material biolgico para ensayos posteriores. 2.6.4.3. Over Night Para la ejecucin de los ensayos, a partir de las placas master, fueron obtenidas 23 colonias y se efectuaron los over night; los cuales consisten en cultivos de noche a 37 C durante 24 horas. Pasado este tiempo, se efectuaron resiembras de 4 mL del over night sobre 16 mL de caldo fresco LB, hasta alcanzar una densidad ptica similar al tubo N1 del sistema Nefelmetro de McFarland, que es equivalente a una carga microbiana de 3x108 UFC/mL. 13

2.6.4.4. Control positivo Se determin agregando 100 L de S. aureus, en 2 mL de caldo LB. Finalmente se incubo, a 37 C durante 24 horas. 2.6.4.5. Control negativo Se determin utilizando 2 mL de Caldo LB, finalmente se incubo, a 37 C durante 24 horas. 2.6.4.6. Preparacin de los extractos Se emplearon hojas de M. esculenta (Yuca) en estado ptimo de desarrollo, recolectadas del valle de Vir, La Libertad Per. De esta planta se recolect la parte area, es decir, hojas, las cuales fueron evaluadas por el investigador y asesor especialista, para su posterior utilizacin. Un grupo de hojas de M. esculenta (Yuca), fueron sometidas a tratamiento trmico 100 C, durante 15 y 30 minutos, resultando como control negativo las muestras sin tratamiento trmico posterior. De cada uno de los extractos, se obtuvieron muestras estriles para su utilizacin en los ensayos posteriores, para tal fin dichas muestras fueron previamente filtradas, empleando papel de nitrocelulosa con un tamao de poro de 0,45 m. 2.6.4.7. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria Se determin la Concentracin Mnima Inhibitoria, mediante la tcnica de macro dilucin en caldo. Para ello, cada sistema de ensayo estuvo constituido por 9 tubos de ensayo; los cuales presentaron diluciones seriadas (101109) de extracto acuoso de hojas de M. esculenta procedentes de cada tratamiento trmico (2 ml de Caldo LB + 2 ml de Extracto). Posteriormente se adicion 100 L de la cepa a ensayar (S. aureus ATCC 25923). 14

Los sistemas de ensayo fueron incubados a 37C durante 24 horas, definindose como Concentracin Mnima Inhibitoria, aquella donde el primer tubo de ensayo aparezca sin crecimiento (turbidez). Finalmente se efectu, las correspondientes lecturas de las diluciones ensayadas en el espectrofotmetro a 620 nm. 2.6.4.8. Determinacin de la Concentracin Mnima Bactericida A partir de cada uno de los sistemas de ensayos establecidos en el prrafo anterior, se tomaron alcuotas de 100 L seguidamente estas fueron sembradas en agar Meller-Hinton, y de esta manera se estableci la Concentracin Mnima Bactericida. Las placas fueron incubadas a 37C durante 24 horas, pasado este tiempo se verific bajo que concentracin ya no existe aparicin de colonias bacterianas. 2.7. Mtodos de anlisis de datos 2.7.1. Desviacin estndar (DS) Es una medida de dispersin que indica cunto pueden alejarse los valores respecto al promedio (media), por lo tanto se aplica para contrastar la variabilidad de los resultados obtenidos.

Dnde:

S: desviacin estndar : sumatoria _ X: valor de la media X: valor de un dato

15

2.7.2. Anlisis de varianza (ANVA) El anlisis de varianza se deriva de la participacin de la variabilidad total en los componentes del modelo, intentando explicar las razones de la variabilidad. En el Cuadro 2 se presenta el modelo de anlisis de varianza (ANVA) que se utilizar para la presente investigacin. Cuadro 2. Modelo de aplicacin de anlisis de varianza (ANVA)
Fuente de Variables Factor A Error Total Suma de Cuadrados SCA SCE SCT Grados de Libertad a-1 a(n-1) N-1 Cuadrados Medios CMA CME F calculado SCA/CME p Probabilidad

2.7.3. Prueba de Tukey La prueba de Tukey es la prueba ms aplicada, pues controla de mejor manera los dos errores ampliamente conocidos en la estadstica ( y ) (Montgomery 2003). Esta prueba permite hacer todas las posibles comparaciones de tratamientos de dos en dos, y por eso se considera la ms completa de las pruebas estadsticas.

16

III. RESULTADOS

Consecuencia de las experiencias obtenidas, se presentan en la Figura 2 los resultados producto del efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca). Este primer proceso de extraccin careci de tratamiento trmico, mostrando as que en la primera dilucin (d1) con absorbancia de 0.207, presentara un efecto inhibitorio en el crecimiento de S. aureus ATCC 25923, no obstante a partir del resto de diluciones existi crecimiento significativo; de todo lo mencionado anteriormente se deduce que luego del periodo de incubacin, esta dilucin fue la que present menor crecimiento bacteriano con referencia a los dems resultados obtenidos; asimismo en la misma Figura 2 se exponen, los respectivos controles positivo y negativo, concernientes de este tratamiento (T1).
1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 Absorbancia 0.60 0.50
0.471 0.734 0.742 0.942

1.058
0.900

0.767

0.589

0.588

D. Estandar Control (-) Control (+)

0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 d1 d2 d3 d4 d5 d6 UFC/mL d7 d8 d9 d10

0.053 0.051 0.033 0.026 0.016 0.035 0.207 0.089 0.058 0.016 0.029

Promedio (T1)

Figura 2. Efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1, en la CMI en S. aureus ATCC 25923

17

Por otro lado, en la Figura 3 se presentan los resultados obtenidos del efecto de extractos acuosos de hojas de M. esculenta (Yuca), consecuencia de ser sometidos a extraccin durante 15 minutos 100 C. Se puede observar en este tratamiento (T 2) que las diluciones d1, d2 y d3 con absorbancias de 0.406, 0.383 y 0.401, presentaron un mayor efecto inhibitorio sobre S. aureus ATCC 25923, deducindose de esta manera que luego del periodo de incubacin, estas concentraciones fueron las que mostraron menor crecimiento bacteriano en comparacin a los dems resultados reportados en este tratamiento; asimismo en la Figura 3 se presentan, los controles positivo y negativo, correspondientes a este tratamiento (T2).
1.10 1.00 0.90 0.80
0.743 0.763 0.705

1.027

0.70 Absorbancia
0.689

0.702 0.626

0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00

0.067 0.049 0.021 0.018 0.406 0.383 0.401

D. Estandar Control (-) Control (+) Promedio (T2)

0.028

0.019

0.024

0.018

0.037

0.031

d1

d2

d3

d4

d5 d6 UFC/mL

d7

d8

d9

d10

Figura 3. Efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T2, en la CMI en S. aureus ATCC 25923

18

Posteriormente en la Figura 4 se exponen, los resultados obtenidos del efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), producto de haber sido sometidos a extraccin durante 30 minutos 100 C (T3). Se puede observar que las diluciones d1, d2, d3 y d4 con absorbancias de 0.100, 0.075, 0.133 y 0.140, presentaron un mayor efecto inhibitorio en S. aureus ATCC 25923, rescatndose que los valores de absorbancias reportados para estas diluciones fueron las que mostraron una menor formacin de biomasa, luego del periodo de incubacin; adems en la Figura 4 se presentan, los respectivos controles positivo y negativo, correspondientes a este tratamiento (T3).
1.000

1.225
0.900

0.800

0.700 Absorbancia
0.633

0.600
0.575 0.527

0.500

D. Estandar Control (-) Control (+)

0.400
0.376 0.321

Promedio (T3)

0.300

0.200
0.133 0.100 0.075

0.140 0.093 0.068

0.100
0.036 0.007

0.019

0.024 0.006

0.000

0.009

0.009

0.016

d1

d2

d3

d4

d5 d6 UFC/mL

d7

d8

d9

d10

Figura 4. Efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T3, en la CMI en S. aureus ATCC 25923

19

En la Figura 5 se presentan los resultados obtenidos del efecto de extractos acuosos de hojas de M. esculenta (Yuca), consecuencia de los tres procesos de extraccion empleados, sin tratmiento termico (T1), con tratamiento termico de por medio durante 15 minutos 100 C (T2) y con tratamiento termico durante 30 minutos 100 C. Se puede observar que de los tres tratamientos usados en este estudio, las diluciones correspondientes a T3 presentaron un mayor efecto en la Concentracion Minima Inhibitoria (CMI) en S. aureus ATCC 25923, deducindose de esta manera que los valores de absorbancia reportados, para T3, mostraron poco crecimiento bacteriano en comparacin a los dos tratamientos restantes T1 y T2.
1.00
0.942 0.900

0.90

0.80
0.734 0.742 0.689 0.626 0.702

0.767 0.743 0.705

0.763

0.70 Absorbancia
0.589

0.633 0.588 0.527 0.575

0.60

0.50
0.406 0.383 0.401

0.471

T1 T2
0.376 0.321

0.40

T3

0.30
0.207

0.20
0.133 0.100 0.140

0.10

0.075

0.00 d1 d2 d3 d4 d5 UFC/mL d6 d7 d8 d9

Figura 5. Efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1, T2 y T3, en la CMI en S. aureus ATCC 25923

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En el Cuadro 3 se presenta el Anlisis de Varianza (ANVA), aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sometidos a extraccin T1 (temperatura ambiente 0 minutos), T2 (100C 15 minutos) y T3 (100C 30 minutos), dicha prueba estadstica nos indica, que los extractos mencionados anteriormente, presentaron efecto inhibitorio sobre S. aureus, ya que se puede observar que p<0,05. Cuadro 3. ANVA aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1, T2 y T3
Variable Fuente de Variacin Tiempo de extraccin CMI - d1 Error Total Tiempo de extraccin CMI - d2 Error Total Tiempo de extraccin CMI - d3 Error Total Tiempo de extraccin CMI - d4 Error Total Tiempo de extraccin CMI - d5 Error Total Tiempo de extraccin CMI- d6 Error Total Tiempo de extraccin CMI - d7 Error Total Tiempo de extraccin CMI - d8 Error Total Tiempo de extraccin CMI - d9 Error Total Suma de Cuadrados 0.144 0.003 0.147 0.652 0.007 0.658 0.315 0.006 0.321 0.369 0.003 0.372 0.216 0.003 0.220 0.242 0.017 0.259 0.104 0.025 0.129 0.207 0.004 0.211 0.107 0.013 0.120 Grados de Libertad 2 6 8 2 6 8 2 6 8 2 6 8 2 6 8 2 6 8 2 6 8 2 6 8 2 6 8 0.05 0.00 25.268 0.001 0.10 0.00 170.019 0.000 0.05 0.00 12.647 0.007 0.12 0.00 42.729 0.000 0.11 0.00 191.865 0.000 0.18 0.00 348.923 0.000 0.16 0.00 153.609 0.000 0.33 0.00 296.288 0.000 Cuadrados Medios 0.07 0.00 F 137.944 p 0.000

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En el Cuadro 4 se muestra la Prueba de Tukey, aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sin tratamiento trmico T1 (temperatura ambiente 0 minutos), dicha prueba estadstica, nos muestra que al realizar las comparaciones correspondientes de las diferentes diluciones en este tratamiento, d1 con absorbancia de 0.207, sera la mejor concentracin con poder inhibitorio frente a S. aureus, con referencia a las dems diluciones ensayadas en este tratamiento T1. Cuadro 4. Prueba de Tukey aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T1 (temperatura ambiente 0 minutos) SUBGRUPOS DILUCIN 1 2 3 4 5 d1 0.207 d4 0.471 d5 0.588 d3 0.589 d2 0.734 d6 0.742 d7 0.767 d9 0.900 d8 0.942 En el Cuadro 5 se expone la Prueba de Tukey, aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sometidos a extraccin durante 15 minutos 100 C, la cual nos indica que al realizar las correspondientes comparaciones entre diluciones, se refleja en d1, d2 y d3 con absorbancias de 0.383, 0.401 y 0,406 un mayor efecto en la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) en S. aureus, en comparacin al resto de diluciones en este tratamiento T2. Cuadro 5. Prueba de Tukey aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T2 (100 C 15 minutos) SUBGRUPOS DILUCIN 1 2 3 d2 0.383 d3 0.401 d1 0.406 d4 0.626 d5 0.689 0.689 d6 0.702 d8 0.705 d7 0.743 d9 0.763 22

En el Cuadro 6 se presenta la Prueba de Tukey, aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sometidos a extraccin durante 30 minutos 100 C, dicha prueba nos indica que estadsticamente d1, d2, d3 y d4 con absorbancias de 0.075, 0.100, 0.133 y 0.140 presentaron mayor poder inhibitorio frente a S. aureus, ya que luego de realizar las respectivas comparaciones en este tratamiento (T3), fueron las concentraciones con resultados ms bajos, con respecto a las dems absorbancias reportadas. Cuadro 6. Prueba de Tukey aplicada a los resultados de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), procedentes de T3 (100 C 30 minutos) SUBGRUPOS DILUCIN 1 2 3 4 d2 0.075 d1 0.100 d3 0.133 d4 0.140 d5 0.321 d6 0.376 d7 0.527 d8 0.575 0.575 d9 0.633

23

En la Figura 6 se muestran los resultados producto del efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca). Este primer tratamiento careci de proceso trmico (T 1), mostrndose de esta manera que de las nueve diluciones ensayadas y posteriormente sembradas en agar Meller-Hinton, ninguna presento efecto bactericida sobre S. aureus ATCC 25923, ya que luego del periodo de incubacin, se prolong crecimiento bacteriano en todas las placas Petri ensayadas en este tratamiento T1.

d1 d1

d1 d2

d2 d3

d2 d3

d3

d4

d4

d4

d8 d5 d5 d6 d6 d7

d5

d6

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d7

d8

d8

d9
Figura 6. Resultados de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923, en Agar Meller-Hinton (T1) Control +

d9

d9

24

En la Figura 7 se presentan los resultados obtenidos del efecto de extractos acuosos de hojas de M. esculenta (Yuca), consecuencia de ser sometidos a extraccin durante 15 minutos 100 C. Se puede observar en este tratamiento T 2, que ninguna de las nueves diluciones experimentadas y sembradas en agar Meller-Hinton, presentaron efecto bactericida sobre S. aureus ATCC 25923, ya que luego del periodo de incubacin, se prolong crecimiento bacteriano en todas las placas Petri ensayadas en este tratamiento T 2.

d2
d1

d3

d1

d2

d3

d4

d5 d6 d6 d5

d4

d7

d8

d9

d7 d8

d9

Figura 7. Resultados de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923, en Agar Meller-Hinton (T2)

25

Posteriormente en la Figura 8 se muestran los resultados obtenidos del efecto de extractos acuosos de hojas de M. esculenta (Yuca), consecuencia de ser sometidos a extraccin durante 30 minutos 100 C. Se puede observar en este tratamiento T 3, que ninguna de las nueves diluciones experimentadas y sembradas en agar Meller-Hinton, presentaron efecto bactericida sobre S. aureus ATCC 25923.

d1

d1

d2

d3

d1

d2 d3

d4

d4
d5

d6
d8 d7 d7 d6 d8 d9

d5

d9

Control +

Figura 8. Resultados de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923, en Agar Meller-Hinton (T3)

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En el Cuadro 7 se presentan los resultados del efecto de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), consecuencia de los diferentes tratamientos de extraccin T 1 (temperatura ambiente 0 minutos), T2 (100 C 15 minutos) y T3 (100 C 30 minutos), en la Concentracin Mnima Bactericida en S. aureus, mostrndose de esta manera que ninguno de los tratamientos ensayados anteriormente, present efecto bactericida ya que luego del periodo de incubacin reflejaron crecimiento bacteriano. Cuadro 7. Resultados de la Concentracin Mnima Bactericida para T1 (temperatura ambiente 0 minutos), T2 (100 C 15 minutos) y T3 (100 C 30 minutos) N de Placas p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9 T1 + + + + + + + + + T2 + + + + + + + + + T3 + + + + + + + + +

Dnde: (+): Present crecimiento (-): No present crecimiento

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IV. DISCUSIN Se puede observar en la Figura 2 que el extracto de hojas de M. esculenta (Yuca) (temperatura ambiente 0 minutos) T1, especficamente en d1 con una Abs. 0.207 muestra poder inhibitorio (CMI) frente a S. aureus ATCC 25923, ya que comparndolo con el Control positivo, Abs. 1.058 refleja poca formacin de biomasa, frente al resto de diluciones las cuales mantienen valores relativamente homogneos, los cuales a su vez son elevados, ya que luego del periodo de incubacin reflejaron demasiada turbidez (crecimiento bacteriano). Asimismo, en la Figura 6 se puede apreciar que de las nueve diluciones ensayadas con T1 y posteriormente sembradas en agar Meller-Hinton, ninguna present poder bactericida (CMB) frente a S. aureus ATCC 25923. Contrastando estos resultados obtenidos de T 1 con referencias tericas, sobre el principio activo de las hojas de yuca (cido cianhdrico) Gmez (1982), citado por Aristizbal y Snchez (2007) sealan que bajo trituracin y sin tratamiento trmico de por medio, tan solo es posible liberar el cido cianhdrico libre (lotaustralina) de 10-15%, por tanto al no contar con el 100% de este principio activo, se observa un efecto antimicrobiano poco provechoso, resaltando tan solo a d1(Abs. 0.207) frente a las ocho diluciones restantes, las cuales no mostraron un efecto significativo frente a la CMI y mucho menos frente a la CMB de S. aureus ATCC 25923. Por otro lado, en la misma Figura 2 se puede observar que la desviacin estndar, centrndonos en la dilucin con mejor poder inhibitorio (d1), nos indica que la variacin del crecimiento de S. aureus ATCC 25923 con respecto al promedio de (d1) 0.207, es de 0.033. En el Cuadro 3, el anlisis de varianza (ANVA), estadsticamente nos indica que los extractos de hojas de M. esculenta (Yuca) procedentes de T1 (temperatura ambiente 0 minutos), presentaron efecto inhibitorio, deduciendo de esta

28

manera que el valor de probabilidad (p) experimental (0.000), fue menor que el valor de la probabilidad terica (0.05). En el Cuadro 4 la Prueba de Tukey, nos indica que estadsticamente d1 con Abs 0.207, es la dilucin con mayor poder inhibitorio ya que existe un efecto significativo de esta dilucin frente a la Concentracin Mnima Inhibitoria de S. aureus ATCC 25923, en comparacin a las dems diluciones, rescatndose de esta manera que las proposiciones estadsticas coinciden con los resultados experimentales. Por otra parte, en la Figura 3 se puede observar que el extracto de hojas de M. esculenta (Yuca), sometido a extraccin (100 C 15 minutos) T2, refleja un mayor efecto inhibitorio frente a S. aureus ATCC 25923, ya que en d1 (0.406), d2 (0.383) y d3 (0.401) se observan valores de absorbancia, bajos en comparacin al control positivo, Abs. 1.027 y las dems diluciones las cuales a su vez obtuvieron valores relativamente ms elevados y continuaron un crecimiento homogneo a partir de la d4, Abs. 0.626, diferencindose de esta manera de las primeras diluciones. Adems, en la Figura 7 se observa que de las nueve diluciones realizadas y posteriormente sembradas en Agar Meller-Hinton, ninguna mostro un efecto bactericida (CMB) frente a S. aureus ATCC 25923, ya que se observa crecimiento bacteriano en todas las Placas Petri. Contrastando los resultados anteriormente mencionados del tratamiento T2, con lo citado por la FAO y OMS (1991), tales organismos indican que cuando hay trituracin de las hojas de yuca, en combinacin con la temperatura y humedad de por medio se acelera el proceso de liberacin del cido cianhdrico de las hojas de M. esculenta (Yuca), obtenindose proporciones de HCN libre de hasta un 3040 % en comparacin con los niveles de 1015 % de HCN libre obtenido sin un tratamiento trmico de por medio. Por tanto basndonos en estas referencias tericas, se puede comprobar que el compuesto activo de las hojas de yuca (HCN), pudo haber aumentado por la utilizacin de temperatura y 29

tiempo de extraccin en (T2), por lo cual se mostraron mejores resultados finales frente a la Concentracin Mnima Inhibitoria de S. aureus ATCC 25923. Posteriormente en la Figura 3 se observa que la desviacin estndar, centrndonos en las diluciones con mayor poder inhibitorio (d1, d2 y d3), nos indican que las variaciones del crecimiento de S. aureus ATCC 25923 con respecto a sus promedios d1 (0.406), d2 (0.382) y d3 (0.401) son de 0.021, 0.018 y 0.049. En el Cuadro 3 se puede observar que en el anlisis de varianza (ANVA), la probabilidad experimental (p), fue de 0.000 dicho valor es menor que la probabilidad terica 0.05. Por lo cual esto nos indicara, que los extractos procedentes de T2 (100 C 15 minutos), obtuvieron efecto inhibitorio frente a S. aureus, ya que se observ menor generacin de biomasa, con respecto al control positivo, en los posteriores ensayos realizados. La Prueba de Tukey en el Cuadro 5 nos indica que estadsticamente (d1, d2 y d3) de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sometidos a extraccin (100C 15 minutos) T2, son las diluciones con mayor poder inhibitorio, ya que existe un efecto significativo, frente a la Concentracin Mnima Inhibitoria de S. aureus ATCC 25923, en comparacin a las dems diluciones, rescatndose de esta manera el uso del tiempo de extraccin y una temperatura elevada en la obtencin de este extracto (T2), lo cual influy en los resultados finales. Por otro lado, en la Figura 4 se observa que el extracto de hojas de M. esculenta (Yuca) sometido a extraccin (100C 30 minutos) T3, logr el mejor efecto antimicrobiano, ya que los resultados obtenidos, luego del proceso de incubacin no fueron muy variables, en las cuatro primeras diluciones y tendieron a ser regularmente homogneos a partir de la quinta dilucin (d5), rescatndose de esta manera como el mejor extracto de hojas de M. esculenta (Yuca), frente a la Concentracin Mnima Inhibitoria de S. aureus ATCC 25923. As mismo se resalta que los valores de Absorbancia en d1 (0.100), d2 (0.075), d3 (0.133) y d4 (0.140) se asemejan al Control Negativo, Abs. 0.036 siendo de 30

esta manera los valores ms bajos en comparacin a los otros tratamientos mencionados anteriormente (T1, T2). Posteriormente en la Figura 8 se observa que el extracto de hojas de M. esculenta (Yuca) sometido a extraccin (100 C 30 minutos) T3, no present un efecto bactericida (CMB) frente a S. aureus ATCC 25923. Contrastando estos resultados con lo mencionado por Cooke y Maduagwu (1978) quienes indican, que el rango de temperatura ptimo para realizar la mxima liberacin del HCN est comprendido entre 6070 C. En la obtencin de este extracto, pudo influir en demasa el tiempo de extraccin (30 minutos), ya que al trabajarse con temperatura de 100 C, esto pudo ayudar a una mejor liberacin de HCN por ende influyo en los resultados finales obteniendo de (T3), el mejor extracto frente a la Concentracin Mnima Inhibitoria de S. aureus ATCC 25923. En la Figura 4 se observa que la desviacin estndar, especficamente las diluciones con mejor poder inhibitorio (d1, d2, d3 y d4), nos indican que las variaciones del crecimiento de S. aureus ATCC 25923 con respecto a sus promedios d1 (0.100), d2 (0.075), d3 (0.133) y d4 (0.140) son de 0.007, 0.019, 0.006 y 0.024. En el Cuadro 3 se puede observar que en el anlisis de varianza (ANVA), estadsticamente nos indica, que los extractos procedentes de T 3 (100 C 30 minutos), presentaron efecto inhibitorio, ya que el valor de probabilidad experimental 0.000 fue menor al valor de probabilidad terica 0.05. En el Cuadro 6 la Prueba de Tukey nos indica que estadsticamente (d1, d2, d3, d4, d5, d6, d7, d8 y d9), procedentes de T3 (100C 30 minutos) T3, fueron las mejores diluciones, frente a la Concentracin Mnima Inhibitoria de S. aureus ATCC 25923, en comparacin a las diluciones de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca) procedentes de T1 y T2.

31

V. CONCLUSIONES Se determin el efecto del tiempo de extraccin de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), en la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) en S. aureus ATCC 25923, presentando mayor efecto inhibitorio T3 (100 C 30 minutos) con resultados bajos en cuanto a crecimiento microbiano (Abs. d1 0.100, d2 0.075, d3 0.133 y d4 0.140), en comparacin a extractos procedentes de T2 (100 C 15 minutos) con (Abs. d1 0.406, d2 0.383 y d3 0.401) y T1 (temperatura ambiente 0 minutos) con (Abs. d1 0.207).

Se determin el efecto del tiempo de extraccin de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), en la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) en S. aureus ATCC 25923, obtenindose como resultados finales que tanto T 3 (100 C 30 minutos), T2 (100 C 15 minutos) y T1 (temperatura ambiente 0 minutos) no presentaron efecto bactericida (CMB) sobre S. aureus ATCC 25923.

32

VI. RECOMENDACIONES Se recomienda utilizar los extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sometindolos a tiempos de extraccin ms largos (mayores a 30 minutos), para que de esta forma, se pueda liberar de mejor manera el compuesto activo (HCN), presente en su estructura y pueda ser utilizado como un antimicrobiano ms eficaz.

Se recomienda utilizar otros microorganismos de inters agroindustrial como por ejemplo; Salmonella typhi, Escherichia coli o Pseudomona aeruginosa y ensayar con extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), sometidos a otras temperaturas y tiempos de extraccin.

Se recomienda utilizar solventes orgnicos en la obtencin de extractos de hojas de M. esculenta (Yuca), para de esta manera poder determinar su efecto antimicrobiano en comparacin a los extractos acuosos evaluados.

33

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS RAY, Bibek. Fundamentos de la Microbiologa de los Alimentos. 4ta. Ed. Mxico DF: Editorial Mc Graw., 2010. MOSSEL, David, MORENO, Benito y STRUIJK, Corry. Microbiologa de los Alimentos. 2da. Ed. Espaa: Editorial Acribia S.A., 2006. 413 p. CASP, Ana, REQUENA, Jos. Tecnologa de Alimentos, procesos de conservacin de Alimentos. 2da. Ed. Espaa: Editorial Mundi., 2003. 233 p. RODRGUEZ Leiva, Manuel. Relacin Hospedante parasito mecanismo de patogenicidad de los Microrganismos. Tesis (Magister en Microbiologa).

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39

VIII. ANEXOS ANEXO 1. FORMATO DE ENSAYO MACRO DILUCIN EN CALDO

Diluciones H2O Pdto X Agitar + adicionar Control 10mL Control 5mL 5mL anterior Tubo 1 5mL 5mL Tubo 2 5mL 5mL de T1 Tubo 3 5mL 5mL de T2 Tubo 4 5mL 5mL de T3 Tubo 5 5mL 5mL de T4 Tubo 6 5mL 5mL de T5 Tubo 7 5mL 5mL de T6 Tubo 8 5mL 5mL de T7 Tubo 9 5mL 5mL de T8

CONTROL Control Control LB 2x Diluciones S. aureus Lectura DO 550 Lectura DO 620 2mL 2mL 4mL

Tubo 1 2mL 2mL 100L

Tubo 2 2mL 2mL 100L

Tubo 3 2mL 2mL 100L

Tubo 4 2mL 2mL 100L

Tubo 5 2mL 2mL 100L

Tubo 6 2mL 2mL 100L

Tubo 7 2mL 2mL 100L

Tubo 8 2mL 2mL 100L

Tubo 9 2mL 2mL 100L

ENSAYO LB 2x Diluciones S. aureus incubar Lectura DO 550 Lectura DO 620

Control (+) 4mL 100L 24hrs.

Control (-) 2mL 2mL H2O

Tubo 1 2mL 2mL

Tubo 2 2mL 2mL

Tubo 3 2mL 2mL

Tubo 4 2mL 2mL

Tubo 5 2mL 2mL

Tubo 6 2mL 2mL

Tubo 7 2mL 2mL

Tubo 8 2mL 2mL

Tubo 9 2mL 2mL

100L 100L 100L 100L 24hrs. 24hrs. 24hrs. 24hrs.

100L 100L 100L 24hrs. 24hrs. 24hrs.

100L 100L 24hrs. 24hrs.

40

ANEXO 2. PROCESO DE OBTENCIN DE EXTRACTOS DE HOJAS DE M. esculenta (YUCA) Figura 9. Obtencin de T1 (Temperatura ambiente 0 minutos)

Figura 10. Obtencin de T2 (100C 15 minutos) y T3 (100C 30 minutos)

41

Figura 11. Filtrado de Extractos de Hojas de M. esculenta (Yuca)

Figura 12. Extractos Estriles procedentes de T1 (temperatura ambiente 0 minutos)

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Figura 13. Extractos Estriles procedentes de T2 (100C 15 minutos)

Figura 14. Extractos Estriles procedentes de T3 (100C 30 minutos)

43

ANEXO 3. PREPARACIN DE LA CEPA (S. aureus ATCC 25923) Figura 15. Medio de Cultivo Caldo LB

Figura 16. Crecimiento en Caldo LB del vial sembrado de S. aureus ATCC 25923

44

Figura 17. Agar Manitol Salado Medio Selectivo para S. aureus ATCC 25923

Figura 18. Proceso de Fermentacin de Manitol Salado S. aureus ATCC 25923

Figura 19. S. aureus ATCC 25923

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ANEXO 4. DETERMINACIN DE LA CMI EN S. aureus ATCC 25923 CON EXTRACTOS ESTRILES PROCEDENTES DE T1 Figura 20. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Sin Incubar (T1)

Figura 21. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Incubados (T1)

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ANEXO 5. DETERMINACIN DE LA CMI EN S. aureus ATCC 25923 CON EXTRACTOS ESTRILES PROCEDENTES DE T2 Figura 22. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Sin Incubar (T2)

Figura 23. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Incubados (T2)

47

ANEXO 6. DETERMINACIN DE LA CMI EN S. aureus ATCC 25923 CON EXTRACTOS ESTRILES PROCEDENTES DE T3 Figura 24. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Sin Incubar (T3)

Figura 25. Resultados de la CMI en S. aureus ATCC 25923 Incubados (T3)

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ANEXO 7. RESULTADOS DE LA CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA EN S. aureus ATCC 25923. Cuadro 8. CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA EN S. aureus ATCC 25923, para T1 N Diluciones R1 R2 R3 PROMEDIO D. Estndar d1 0,245 0,190 0,187 0,207 0,033 d2 0,701 0,793 0,708 0,734 0,051 d3 0,559 0,606 0,602 0,589 0,026 d4 0,488 0,457 0,468 0,471 0,016 d5 0,600 0,548 0,615 0,588 0,035 d6 0,792 0,640 0,795 0,742 0,089 d7 0,746 0,722 0,832 0,767 0,058 d8 0,928 0,939 0,959 0,942 0,016 d9 0,871 0,902 0,928 0,900 0,029 Cuadro 9. CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA EN S. aureus ATCC 25923, para T2 N Diluciones R1 R2 R3 PROMEDIO D. Estndar d1 0,423 0,382 0,412 0,406 0,021 d2 0,373 0,404 0,372 0,383 0,018 d3 0,376 0,457 0,370 0,401 0,049 d4 0,604 0,617 0,657 0,626 0,028 d5 0,682 0,711 0,674 0,689 0,019 d6 0,687 0,730 0,690 0,702 0,024 d7 0,728 0,738 0,763 0,743 0,018 d8 0,701 0,670 0,743 0,705 0,037 d9 0,761 0,795 0,734 0,763 0,031 Cuadro 10. CONCENTRACIN MNIMA INHIBITORIA EN S. aureus ATCC 25923, para T3 N Diluciones R1 R2 R3 PROMEDIO D. Estndar d1 0,100 0,107 0,093 0,100 0,007 d2 0,096 0,060 0,070 0,075 0,019 d3 0,129 0,130 0,140 0,133 0,006 d4 0,165 0,117 0,139 0,140 0,024 d5 0,331 0,314 0,319 0,321 0,009 d6 0,384 0,377 0,367 0,376 0,009 d7 0,635 0,477 0,470 0,527 0,093 d8 0,558 0,580 0,588 0,575 0,016 d9 0,711 0,588 0,599 0,633 0,068

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