ESTAPHILOCOCCUS

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

INTRODUCCIN Stapylococus: gnero de bacterias perteneciente a la familia de las Micrococcaceae, gram positivos, no esporulados, aerobios facultativos, inmviles. Su nombre, que en griego significa racimo de granos, deriva del hecho de que este germen tiende a agruparse en masas desordenadas que recuerdan los racimos de uva, si bien tambin se pueden encontrar como elementos nicos o en pares, en grupos de cuatro o en cadenas cortas de tres o cuatro clulas. Se han identificado unos 3 serotipos. !resentan una gran variedad de en"imas, to#inas, hemolisinas y componentes celulares. $ntre los factores de virulencia de estas bacterias est% su actividad coagulasa, siendo mayor la virulencia cuanta mayor actividad coagulasa tenga. &asi todas las inflamaciones del cuerpo est%n asociadas con este germen. &erca del ' ( son resistentes a la penicilina. $ste gnero de bacterias comprende numerosas especies: albus, anaerobius, aureus, epidermis, etc. Se har% un sembrado de Stapylococus en un medio selectivo slido )aird !ar*er y medio &hapman para ello utili"aremos muestras, yema de huevo y queso fresco comprados del mercado del &allao +Santa ,osa- las muestras se preparan mediante las diluciones decimales el procedimiento del sembrado y conteo de colonias traba.o. se e#plicara en transcurso del desarrollo del presente

I.-OBJETIVOS

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

GENERALES: /eterminar si e#iste la presencia de estafilococos en una muestra de queso fresco y en la yema de huevo ESPECIFICOS: Mediante el mtodo de diluciones decimales se anali"ar% la muestra $l conteo de bacterias se reali"ar% mediante un mtodo indirecto ,ecuento de viables en placa Se utili"ar% medios de cultivos selectivos0 &hapman y 1gar )aird !ar*er

II.-GENERALIDADES TERICAS TAXONOMIA /ivisin 22: Firmicutes &lase 2: Firmibacteria 3amilia: Micrococcaceae 4nero: Staphylococcus GNERO Staphylococcus $l gnero Staphylococcus comprende microorganismos que est%n presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y de otros mam5feros y aves, incluyendo a 36 especies y 78 subespecies, muchas de las cuales se encuentran en los humanos. 9as especies que se asocian con m%s frecuencia a las enfermedades en humanos son Staphylococcus aureus :el miembro m%s virulento y conocido del gnero;, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophticus, Staphylococcus capitis, <Staphylococcus afarensis< y Staphylococcus haemolyticus. Segn Manual )ergey: 7=8> y se clasifican en estafilococos coagulasa positivos :$&!; y estafilococos coagulasa negativos :$&?; $stafilococo coagulasa variable. Mencionaremos a los m%s representativos Estafi !"!"!s "!a#$ asa %!siti&!s 'ECP( o S.aureus o S.intermedius

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

o S.delphini o S.schleiferi subsp coagulans Estafi !"!"! "!a#$ asa &a)ia* + o S.hyicus Estafi !"!"!s "!a#$ asa ,+#ati&!s 'ECN( o S. epidermidis, o S. warneri o S. simulans; CARACTER-STICAS GENERALES 9os estafilococos crecen f%cilmente sobre casi todos los medios bacteriolgicos, en condiciones aerbicas se da el me.or crecimiento. Su mayor velocidad de crecimiento es a 8 @ 68 A&0 pero tambin se puede ver en activa fisin binaria entre 3 y 6> A&. 1dem%s, producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos. Biene importancia mdica principalmente el S. aureus, y en humanos adem%s de ste, el S. saprophiticus y el S. epidermidis. sus caracter5sticas mas comunes son: &lulas esfricas de ,8 C 7,8 Dm de di%metro, solos, de apares, ttradas o grupos irregulares. 4ram positivos, 2nmviles, no forman esporos. !ared celular contiene pptidoglicano y %cido teicoico. 1naerobios facultativos. &atalasa positivas. Metabolismo: ,$S!2,1BE,2EF3$,M$?B1B2GE. 9a mayor5a de las cepas crecen en presencia de 7 ( &l?a, y entre 7' y H I&. Jptimo 3> I&F6H horasFatmsfera normal. ?utricionalmente, no e#igentes. /esarrollan en medios comunes. $n general presentan pigmentos carotenoides &omensal de la piel y mucosas :digestiva y rinofaringe; /istribucin mundial. Microorganismo m%s e#tendido en la naturale"a.

./*itat

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

!atgenos oportunistas para animales y humanos. !ueden aislarse de productos de origen animal :carne, leche, queso; y ambiental :suelo, polvo, aire;

Ti%! 0+ a i1+,t! $nsalada de pollo Macarrones Mamburguesa Barta de chocolate Melado

R+"$+,t! +stafi !"!"!s 2# 7,> K 7

L

6,L K 7 > 6K7 6 >,3 K 7

6

?egativo N7 Ca)a"t+)3sti"as "$ t$)a +s 0+ Staphylococcus C)+"i1i+,t! +, 1+0i! 34$i0! Fg

Burbide" homognea con abundante depsito en el fondo del tubo. &recimiento en forma de anillo en la superficie

C)+"i1i+,t! +, 1+0i! s5 i0!:

&olonias redondas de 7 a 6 mm, bordes netos, superficie lisa, opacas o mucoides.

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

M+0i!s 0+ "$ ti&!s s+ +"ti&!s 6 0if+)+,"ia +s %a)a ais a1i+,t! 0+ +stafi !"!"!s 1gar Manitol Salado :manitol, ro.o de fenol; 1gar Staphylo 77 1gar )aird !ar*er :yema de huevo, telurito de

MEDIDA DEL N7MERO DE INDIVIDUOS '"!,t+! 0+ as *a"t+)ias( MTODOS DIRECTOS 8( C/1a)a 0+ )+"$+,t! 0+ P+t)!ff-.a$s+): &onsiste en un portaob.etos especial con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas: $#cavacin con . 6 mm de profundidad. Orea de 7 mm6, dividida en un ret5culo de 68 cuadrados grandes. &ada cuadrado grande est% subdividido a su ve" en H#H P 7L cuadrados pequeQos. sea, la muestra se distribuye en 7L # 68 P H pequeQos;. 9a muestra, una ve" dispensada entre el porta y el cubre, se de.a reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en varias celdillas :normalmente en 7L, equivalentes a uno de los cuadros grandes;. Se anota el nmero n de clulas observadas en esas 7L celdillas. $ntonces, la concentracin celular es f%cil de establecer: , 9 :; 9 ;< 9 8<<< = "!,"+,t)a"i5, +, "> $ as21 . celdillas :cuadros

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

V+,ta?as: es un mtodo muy r%pido. I,"!,&+,i+,t+s: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas :R7 #7 L cls.Fml;. !or deba.o de este valor el nmero de clulas vistas en el campo del microscopio es muy pequeQo y poco significativo estad5sticamente. $n bacterias mviles, hay que inmovili"arlas previamente, con una me"cla de alcohol y agua.

:( C!,ta0!)+s + +"t)5,i"!s 0+ %a)t3"$ as 'ti%! C!$ t+);: Se hace pasar una suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. &ada ve" que por un orificio :3 mm di%metro; pasa una part5cula :p. e.., bacteria; se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamaQo de las part5culas que van pasando. :$l tamaQo detectado es funcin de la intensidad del pulso de volta.e al paso de la part5cula;. C!1+,ta)i!s: hay que usar suspensiones absolutamente libres de part5culas e#traQas :las pequeQas ser5an contabili"adas errneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato;. MTODOS INDIRECTOS 1) R+"$+,t! 0+ &ia* +s +, % a"a

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

9os mtodos de recuento de nmero de clulas que hemos visto hasta ahora :los directos; no distinguen entre clulas vivas y muertas. $n muchos casos conviene contar las clulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. :Sna clula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capa" de dividirse y dar descendencia;. $l mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeQas al5cuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de !etri con medio slido :con agar;. &ada clula viable dar% origen a una colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin. &ontando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de al5cuota utili"ado, es f%cil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original. :!ara esto, mira el e.emplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la pr%ctica correspondiente, que se suele reali"ar en la 3T tanda;. Mientras tanto, y para luego repasar esa pr%ctica, puedes reali"ar un e#perimento on@line sobre crecimiento bacteriano P)+"a$"i!,+s: o !ara minimi"ar los errores estad5sticos de muestreo, se recomienda sembrar 8 placas de cada dilucin0 o May que usar pipetas nuevas en cada dilucin0 o &ontar las placas donde e#istan entre 8 y 3 colonias.

o &omo no podemos garanti"ar que cada colonia no proceda de m%s de un indiviudo :y esto es especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 6 o m%s clulas;, el recuento se refiere no a +clulas viables reales- sino a +unidades formadoras de colonia:S3&;. !or lo tanto, una S3& corresponde, como m5nimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con agrupaciones, la medida por siembr en placa infravalora el nmero real de individuos, porque cada S3& puede corresponder a dos o m%s individuos que estaban .untos al ser sembrados en la placa.

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

R+"$+,t! 0+ &ia* +s %!) si+1*)a +, % a"as %+t)i

:( R+"$+,t! s!*)+ fi t)!s: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles :con un di%metro de poro que retiene las bacterias pero permite el tr%nsito de sustancias;. !osteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. 9as colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas. /ichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hi"o pasar por el filtro. III.-PROCEDIMIENTO ESPERIMENTAL MATERIALES !ipetas de 7 estriles
MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

$stufa de cultivo 1sa de vidrio estril 1sa de cultivo !lacas de !etri de = mm de di%metro

M+0i!s 0+ "$ ti&! 6 )+a"ti&!s Medio slido selectivo )aird !ar*er :) !; Medio slido selectivo &hampman Uema de huevo 7 ml Vueso fresco 7 g

M$+st)as

PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO BAIRD PAR@ER Composicin: Briptona 7 g $#tracto de carne 8 g $#tracto de levadura 7 g !iruvato sdico 7 g 4licina 76 g &loruro de litio 8 g 1gar 6 g 1gua destilada 7. m9

/isolver por calentamiento y agitacin. 1.ustar el pM a L,= W ,6. $sterili"ar en autoclave a 767 A& durante 6 minutos. $nfriar a 8 A& y aQadir 8 g de emulsin estril yema de huevo@telurito :apartado siguiente;. Me"clar uniformemente y preparar placas de !etri. E1$ si5, 0+ 6+1a 0+ A$+&!-t+ $)it! Composicin

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

$mulsin de yema de huevo 8 g Belurito pot%sico 3,8 por 7 Sulfameta"ina ,6 por 7 1gua destilada 7. m9

9a yema de huevo se prepara partiendo de huevos frescos de gallina, bien lavados y que hayan permanecido en alcohol al > por 7 , entre 6@3 horas. Se e#@trae eX huevo aspticamente, y, de la misma forma, se separan las claras de las yemas. 9a emulsin se obtiene me"clando 8 m9 de yema de huevo con la misma cantidad de solucin salina estril. 9a me"cla se homogenei"a en homogenei"ador estril. 9a solucin de telurito pot%sico al 3,8 por 7 se esterili"a por filtracin. ,8 g del producto

!ara preparar la solucin de sulfameta"ina, se disuelven destilada.

puro en 68 m9 de hidr#ido sdico ?iX E, completando hasta 68 m9 con agua

Y El cloruro de litio y el telurito potsico que forman parte del medio inhiben el desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sdico y la glicocola favorecen el crecimiento de los estafilococos. PREPARACIN DEL MEDIO C.APMAN C!1%!si"i5, '+, #)a1!s %!) it)!( $#tracto de carne 7. !oliptepona 73. /@Manitol 7 . &loruro de sodio >8. ,o.o fenol . 68 1gar 73.

@ pM final >,H ZF@ ,6

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Y Es selectivo para el aislamiento de estafilococos.

a mayor!a de las

bacterias que no sean estafilococos" son inhibidas por la alta concentracin de cloruro de sodio. #or lo general los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol de $ste medio haci$ndolo virar al amarillo. Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. os estafilococos coagulasa negativos" presentan colonias rodeadas de una ona ro!a. PREPARACIN DE LA MUESTRA Pas! 8 1spticamente se pesan 7 g de muestra :queso; y se mide 7 ml de yema de huevo. $l queso se triturar% en un vaso con una esp%tula y el huevo se batir% ligeramente en un vaso.

Pas!: 9uego se diluyen en = m9 de agua peptonada o destilada ambas muestras

Pas!B

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Momogeni"ar la me"cla en el Stomacher durante 7 a H minutos :el tiempo var5a segun el tipo de alimento; :defectivamente reali"arlo por trituracin en un vaso esterili"ado de una trituradora de cuchillas @tipo batidora@ a una velocidad apro#imada de 7H. rpm y en un tiempo medio de L @= segundos;, pero en nuestro caso utili"aremos un agitador magntico.

PREPARACIN DE LAS DILUCIONES DECIMALES Pas!8 Segn el nmero de microorganismos esperado y sobre la base de la dilucin inicial de 7 g en = m9 :dilucin 7 7
@3 @7

;, preparar diluciones decimales de 7

@6

, etc., usando pipetas o puntas estriles para cada dilucin, tomando 7 m9

de la solucin anterior en = m9 de agua peptonada, y evitando que se forme espuma

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

Pas!: Me"clar mec%nicamente cada dilucin en un agitador mec%nico tipo vorte# : o manualmente agit%ndo el tubo 68 veces en > segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un %ngulo de abertura apro#imado de L A entre bra"o y antebra"o;.

SIEMBRA POR EXTENSIN EN SUPERFICIE 1 partir de la <serie de diluciones decimales< , se siembra con la ayuda del asa de *hole de cada dilucin sobre la superficie bien seca de agar )aird@!ar*er y en el medio &M1!M1? contenido en placas de !etri, se podria sembrar de las siguentes formas.

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

I,"$*a"i5, 0+ as % a"as 2nvertir las placas de !etri e incubarlas en estufa a 3> A& durante H' horas, con lectura a las 6H horas.

L+"t$)a 0+ as % a"as 6 )+"$+,t!s 0+ "! !,ias Seleccionar para el recuento las placas inoculadas con la dilucin que contengan entre 6 y 6 colonias t5picas.

CCLCULOS D EXPRESIN DE LOS RESULTADOS

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

$n las placas que se ha efectuado el recuento, multiplicar por el inverso de la dilucin y e#presar el resultado como Snidades 3ormadoras de &olonias por g de alimento :S3&Fml;. N=C9D /onde: ?P Snidades formadoras de colonia por gramo de muestra :S3&Fg o S3&Fm9;. &P Media del nmero de colonias en las dos placas. /P 3actor o inverso de la dilucin. RESULTADOS EXPERIMENTALES Se sembraron las muestras de dilucin 7
@8

,7

@L

,7

@>

, en sendas placas petri.

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

@L

,7

@>

,7

@8

,7

@>

respectivamente

.ACIENDO UN RECUENTO DE COLONIAS R+"$+,t! 0+ &ia* +s +, % a"a:

en la placa de dilucin 7

@8

, se contaron 78 colonias
@L @>

en la placa de dilucin de 7 en la placa de dilucin de 7

, se contaron 68 colonias , se contaron 7 colonias

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

1plicando la formula para hallar la Snidades 3ormadoras de &olonias por g de alimento :S3&Fml;. N=C9D ?P78 #7 8P78#7 ?P68#7 LP68#7 ?P7 #7 >P7 #7
L L

S3&Fml

S3&Fml
L

S3&Fml

CONCLUSIONES se concluye que en la muestra de queso fresco e#iste gran cantidad de estafilococos esto se puede reconocer porque la coloracin del agra &hapman que inicialmente es ro.o se tiQe de amarillo porque el estafilococos fermenta el manitol produciendo acido. Se sembr en una placa la mitad una muestra de queso y la otra mitad de yema de huevo y se observo que hay m%s estafilococos en la muestra de queso.

MICROBIOLOGIA

ESTAPHILOCOCCUS

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS http:FF[[[.fcv.unlp.edu.arFsitios@catedrasF=>FmaterialFBeorico(6 1po (6 2(6 estafilococo.pdf http:FF[[[.pncq.org.brFbibliotecaFactualidades6 http:FF[[[.higiene.edu.uyFcefaF9ibro6 f http:FF[[[.anali"acalidad.comFanmic.pdf http:FF[[[.bri"uela@lab.com.arFproducto.htm :http:FFvirus.usal.esF[ebFdemo\microaliFSaureusFSaureus!laca.html; ]6 8 9aboratorio de Becnolog5a $ducativa. /epartamento de Microbiolog5a y 4entica. Sniversidad de Salamanca. http:FFes.[i*ipedia.orgF[i*iFStaphylococcus 8\77.pdf

6F&ap(6 7=.pdf

http:FFenlinea."arago"a.unam.m#FdidactaFbiologiaFmicorri"asFMicrobiol.pd

Material profesora

,adiacin\rangos

,adiacin

MICROBIOLOGIA