Accin De Los Microorganismos Sobre Diversos Sustratos INTRODUCCION

Saber el comportamiento de los microorganismos sobre diversos sustratos desde un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos prontos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. Entre las pruebas que utilizamos en esta prctica fueron: Hidrlisis del almidn, fermentacin de azucares, reaccin de Vogues Proskauer, Formacin del indol, Produccin del hidrogeno sulfurado, Hidrlisis de la urea, asimilacin del citrato. I. DEGRADACION DE CARBOHIDRATOS Las pruebas de hidrlisis y fermentacin de carbohidratos son muy importantes para la identificacin de las bacterias. Los medios, para estudiar la degradacin de estos compuestos, se preparan por lo general aadiendo 0.5% del carbohidrato a un medio bsico sin carbohidrato. Algunas bacterias son capaces de usar molculas complejas como fuentes de carbono, utilizan hidrolasas, que fragmentan sus molculas y liberan otras ms pequeas, que pueden ser transportadas al interior de la clula bacteriana. En trminos generales, las hidrolasas son enzimas inducidas. Po lo tanto para estudiar la capacidad hidrolitica de determinada bacteria, es deseable cultivarla previamente en un medio cuya fuente de carbono sea nicamente la sustancia cuya hidrolasa se desea detectar, para que la bacteria induzca su sntesis. a) HIDRLISIS DEL ALMIDN El almidn es un homopolisacarido de la glucosa, cuyos componentes son la amilosa lineal y la amilopectina ramificada. Para utilizarlo, algunas bacterias sintetizan una exoenzima llamada amilasa que hidroliza los enlaces glucosidicos alfa1-4, liberan maltosa

y isomaltosa, que ingresan a la clula y pueden metabolizarse. Para evidenciar la presencia de amilasa, se recurre a que el almidn, forma un complejo de color azul intenso con el yodo. Las bacterias de la amilopectina dan solo un color caf rojizo y el almidn hidrolizado no dan ninguna coloracin. Por lo tanto, la ausencia de color azul indica que el almidn ha sido hidrolizado. La produccin de amilasa es til para diferenciar especies de bacillus, de streptococcus, y de lactobacillus. De igual forma se aplica a esquemas de diferenciacin de algunas bacterias aerobias y anaerobias como Actinomyces bacteroides, clostridium y fusobacterium. MATERIALES Primer periodo * Cultivos de 18 a 24 horas de escherichia coli y de aeromonas hydrophila, cultivados en agar nutritivo con 0.2% de almidn. * 1 placa petri con agar nutritivo con 0.2% de almidn. Segundo periodo * Botella gotero con solucin de yodo al 1% en alcohol al 50%( tambin puede utilizarse yoduro acuoso de gran o solucin de lugol). METODOS Primer periodo Con lpiz de cera marcar una lnea que divida el fondo del plato de agar nutritivo con almidn en dos sectores. Con el asa, inocular el microorganismo en cada sector, hacer una estra que no toque las paredes de la placa; as quedara una zona central sin inocular entre las 2 estras, que servir de control. Incubar a 35C durante 48 horas. Segundo periodo Despus de la incubacin. Levantar con el asa parte del crecimiento de ambas bacterias e inundar el plato con la solucin de yodo. Observar la apariencia que toma el agar. CUIDADOS * El reactivo (yodo) debe guardarse en botella mbar en refrigeracin. * El reactivo debe probarse semanalmente con una cepa positiva y otra negativa para esta prueba, pues durante el almacenamiento la solucin pierde color. La solucin debe descartarse cuando una cepa positiva conocida de una reaccin negativa o dbilmente positiva. * La prueba debe interpretarse inmediatamente luego de aadir el reactivo, debido a que el color azul tiende a desvanecerse con el tiempo. * El medio de cultivo no debe sobrecalentarse debido a que el almidn puede hidrolizarse y dar resultados positivos falsos. * b) REACCIN DE VOGES-PROSKAUER (VP) Determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, la

acetil-metil carbonil a partir de la fermentacin de glucosa. La reaccin de VP se basa en la deteccin de acetil-metil carbonil como producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. sta es metabolizada en cido pirvico, intermediario clave en la gluclisis. A partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir muchas vas. La produccin de acetil-metil carbonil (precursor de la produccin de 2,3butanediol) que es uno de los ciclos para la degradacin de la glucosa en las bacterias. La formacin de acetil-metil carbonil y butilenglicol es una va alternativa del metabolismo del cido pirvico. Las bacterias que utilizan esta va producen solo pequeas cantidades de cidos mixtos que son insuficientes para disminuir el pH del medio de rojo de metilo, lo bastante como para producir un cambio de color. Por este motivo muchas de las especies de Enterobacterias son VP positivas, con pocas excepciones son RM negativas y viceversa. El primer reactivo agregado a una alcuota incubada es el catalizador alfa-naftol porque ste acta como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reaccin sin prdida de su especificidad. El segundo reactivo es el KOH que cuando se agrega al medio de VP contribuye a la absorcin de CO. No debe excederse de un volumen exacto. El KOH reaccionar con la peptona dando un color rosado salmn y con el agregado posterior de alfa-naftol no habr alteracin del color. REACTIVOS ADICIONALES a) Alfa naftol al 5%, intensificador del color b) Hidrxido de potasio 40%, agente oxidante Agregar directamente los reactivos al tubo despus de la incubacin en el siguiente orden: 1) 0.6ml de alfa naftol 2) 0.2ml de KOH 3) Agitar el tubo suavemente, dejar reposar de 10 a 15 minutos antes de la interpretacin. PRECAUCIONES El orden de adicin de los reactivos es importante, ya que la inversin de incorporacin dar como resultado un dbil positivo o falso negativo. No debe excederse un volumen exacto de KOH ya que el exceso puede ocultar una reaccin VP dbilmente positiva. INTERPRETACIN * Positivo: Rojo rosado en la superficie del medio (presencia de acetil-metil carbonil). * Negativo: Amarillo. Puede formarse un color cobrizo pero an as la reaccin es negativa. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS Y OTRAS SUSTANCIAS NITROGENADAS

Para la demostracin del metabolismo bacteriano sobre las protenas, se realizaran las siguientes pruebas produccin de indol y produccin de H2S. Otras sustancias nitrogenadas susceptibles a ser descompuestas por los microorganismos son la urea y los nitratos. a) FORMACION DE INDOL El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indol actico. Diversas enzimas intracelulares que intervienen en ste proceso reciben el nombre de triptofanasa, lo que implica el sistema completo de enzimas vinculadas con la produccin del indol. El principal intermediario en la degradacin del triptfano es el cido indol pirvico. La degradacin del triptfano libera indol, cido pirvico, amoniaco y energa. El cido pirvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucoltico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO de energa. El NH y H2O y una gran produccin Puede ser utilizado para sintetizar nuevos aminocidos empleando la energa que se encuentra para la reaccin anablica. La prueba de indol se bas en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo de p-dimetilaminobenzaldehdo (sustancia activa del reactivo de Kovacs). La formacin de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono. La elevada acidez producida por la fermentacin de la glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o inhibir la enzima. El agregado de triptfano estimula la produccin de indol mientras que la glucosa la inhibe. PRUEBA DE INDOL Reactivo de Kovacs * Adicionar 5 gotas y agitar suavemente el tubo Interpretar inmediatamente. Conservacin: Los reactivos debern guardarse en el refrigerador (4 C) mientras no se usan, su estabilidad es variable, por lo tanto se har todas las semanas un control de calidad, desechndolos si muestran una reaccin dbil o negativa con un organismo positivo conocido.

b) PRUEBA DE CIDO SULFHDRICO La proteolisis de las protenas en aminocidos (aa.) individuales, algunas especies

bacterianas son capaces de liberar azufre enzimticamente de los diferentes aa. Que as contienen, produciendo el gas cido sulfhdrico (SH). La peptona, cistena y tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan distintos compuestos o aa. Que contienen azufre para producir S2H. La enzima responsable de sta actividad es la cisteinasa. TSI Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono especfico incorporado en un medio de crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto con la determinacin de posible cido sulfhdrico. El agar AHK es un medio diferencial que determina tanto la fermentacin de los hidratos de carbono y la produccin de cido sulfhdrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, caractersticas que son utilizadas para la diferenciacin de stas, principalmente para las Enterobacterias. Este medio contiene lactosa con una concentracin de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observacin de la fermentacin de uno o de ambos carbohidratos por parte de Las bacterias, adems de la produccin de gas y de cido sulfhdrico. Primera etapa: La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reaccin de reduccin que da un sulfito y un sulfato. Este es un proceso de respiracin anaerbica donde el tomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la oxidacin de los sustratos orgnicos. El tiosulfato reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es una fuente de azufre para el organismo. Segunda etapa: El gas incoloro S2H reacciona con una sal pesada, citrato frrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfuro ferroso. Bacteria (medio cido) + tiosulfato de sodio gas S2H S2H + iones frricos sulfuro ferroso (pp. negro) INTERPRETACIN 1. cido sulfhdrico * Positivo: Ennegrecimiento del medio * Negativo: Sin ennegrecimiento 2. Indol

* Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio. * Negativa: No se produce color * Negativa: Color naranja en la superficie del medio. Indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser el precursor de la formacin de indol. * La reaccin positiva despus de 24 horas indica una prueba completa. * Si el cultivo de 24 horas es negativo deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. ACCION SOBRE LOS LIPIDOS Los lpidos como las grasas, son hidrolizadas por lipasas microbianas a glicerol y cidos grasos. El glicerol es metabolizado por los microorganismos por la va conectada con el metabolismo de los carbohidratos.los cidos grasos son oxidados por la remocin sucesiva de acetil-CoA (B oxidacin). Esta molcula de dos carbonos puede entrar al ciclo de Krebs para su oxidacin. a) ASIMILACION DEL CITRATO Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad. El medio incluye citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimtico sin la intervencin de la coenzima A. Esta enzima se denomina citritasa o citrato desmolasa. Citrato Oxalacetato + acetato

Piruvato + CO Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio: pH bsico: Citrato CO2 + cido frmico + 2 cido actico

pH cido: 2 Piruvato acetato + CO2 + lactato 2 Piruvato acetona + 2CO2 PRECAUCIONES

El inoculo debe ser liviano. S ste es demasiado grande, compuestos orgnicos preformados dentro de la pared celular de las bacterias que estn muriendo pueden liberar suficiente carbono y nitrgeno como para dar un resultado falso positivo. Cuando se inocula una serie de tubos de medios de cultivo diferenciales con un microorganismo desconocido, es importante sembrar primero el medio citratado para prevenir el arrastre de protenas o carbohidratos de los otros medios, aunque se supone se esteriliza el asa en cada inoculacin. INTERPRETACIN * Positivo: Crecimiento aunque no exista cambio de color. Crecimiento y el medio de color azul intenso en Pico de flauta. * Negativo: No se observa crecimiento y medio de color verde. Si se utiliza carbono a partir de citrato de sodio, tambin se extrae nitrgeno del fosfato de amonio contenido en el medio, liberndose amoniaco. En ocasiones se detecta un crecimiento visible a lo largo de la lnea de siembra antes de la aparicin de color. Este crecimiento visible tambin indica resultado positivo. Reporte de resultados * Negativo (-) * Positivo (+) POSITIVO NEGATIVO a) AGAR LISINA HIERRO: LIA Mide la capacidad enzimtica de un organismo para descarboxilar un aminocido (lisina y arginina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo carboxilo dando una amina o una diamina y anhdrido carbnico. La descomposicin de los aminocidos se produce anaerbicamente. El proceso de descarboxilacin es irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima comn, el fosfato de piridoxal. El aminocido L-lisina sufre la descarboxilacin para dar cadaverina y CO2 Por accin de la enzima especfica lisinadescarboxilasa.

REPORTE DE RESULTADOS

A = cido K = Alcalino N = Neutra R = Rojo (desanimacin oxidativa) INTERPRETACIN K/K = azul de Prusia /azul de Prusia Desaminacin oxidativa / descarboxilacin K/A= azul de Prusia / lila No desanimacin Produccin de H2S = Ennegrecimiento del medio Produccin de gas = Burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las paredes del tubo. Conclusin Mediante diferentes pruebas bioqumicas se puede ver que no todo los microorganismos reaccin igual en cada una de las pruebas, algunos no presentaran cambios en el medio mientras que otros s. Otros necesitan de otros aditivos para poder ver como acta con el medio como es el caso de la prueba del rojo de metilo y otras pruebas ,mientras que otras solo basta el tiempo de incubacin para poder ver como se han comportado con el medio donde se encuentran.