170

CAPTULO

INTRODUCCIN A LAS PROTENAS: NIVEL PRIMARIO DE LA ESTRUCTURA PROTEICA

ANLlSls DE L9S AMINOCIDOS

DE LAS PROTEINAS
Los mtodos actuales para detelminar la composicin de aminocidos de las protenas comportan tres pasos bsicos:

poliestireno tiende a retener los aminocidos ms hidro-

segundo lugar,

la

natutaleza hidrofbica

del

mismo

1. Z. 3.

Hidrtisis de la protena a sus aminocidos constituyentes.

ibi"ot como la leucina y la fenilalanina. En la Figura 58.1 se presenta un ejemplo de este tipo de anlisis'

Separacin de los aminocidos de la mezcla' Cuantificacin delosaminocidos individuales'

pequeas

variaiiones en muchos laboratorios. Primero se purifica una pequea muestra de la protena, quiz mediante una .o*bitt"in de los mtodos descritos en Herramientas de la Bioqumica 5.A. La protena se disuelve en HCl 6 M y se se[f la solucin en una ampolla al vaco. A contioC durante aproximadanuacin se calienta a 105-110 mente 24horas. En estas condiciones, 1os enlaces peptdicos metaestables entre los residuos se hidrolizan
totalmente.

Aqu se describe una tcnica utilizada con

Obsrvese el orden de aparicin de los aminocidos, que va del ms cido al ms bsico. Los analizadores de aminocidos modernos estn completamente programados y llevan a cabo la separacin cromatogrfica de los aminocidos y su cuantificacin. Cadavez ms, los investiga-

dores optan por la HPLC (vase Herramientas de la Bioqumica 5A) para la separacin de aminocidos. Sus
ventajas son la rapidez y una resolucin incluso mejor' u.
R

cH*coo
Aminocido

A continuacin la muestra hidrolizada se separa en los aminocidos constituyentes en una columna de intercambio catinico. Las clases de resina que se utilizan normalmente son las de poliestireno sulfonado:
*
CH,

o
il

L C (-

\ou

cor,

R-

CHO

-cH*

A w

CH,

-cH-

o
Ninhidrina

ll

)'r

tI \-/

sot

Sot

Este tipo de resina separa los aminocidos de dos

modos. En primer lugar, al estar cargada negativamente,

oo tll cc o..a ** *a/ ta c/ llil oo

tiende a hacer pasar los aminocidos cidos primero y retener los bsicos. El pH del tampn eluyente se aumenta durante la elucin para facilitar esta separacin. En
a a
.g .9
C

Compuesto azul prPura

FrcuRA

58.2 Reaccin de la ninhidrina.

c
o

c a 6 C f '6 o
f

,@

o o6 ac
.9

o o
o a c .E o o
I E .6

.o

oE !o .<F

c '=

o.)

o
"6

o
.g
C

c ,6

o
.=

o o
.g

Fs c

.g .9

o)

c
o
E

(L

rrcunn 58.1 Anlisis de un hidrolizado proteico en un analizador de aminocidos de columna nica.

Reproducido con autorizacin de Beckman lnstruments, lnc

ANL]SIS oe

Ios IiNocTDos

DE LAs PROTENAS

; "*; :i::,9.1
b

nuacin se detectaba

(Figura 58.2). La ninhidrina se ";;;;;lrina mezctab" y r";;;;aba a 100 oC con los aminocidos que eluyen

1Tl ".ig:, nores udlizaban Ia reaccin

Existen muchos mtodos-para detectar y cuantificar los que er uyen

d"

17',|

;;;;;:t

J.,,e.ni"u, un,"_

il ; il :;i ;::TJTfi'"?::xJT::,:

"i an'"ior; a conti_

fi:li. ilffil"ff::crarse

aminocido) n et mismo-.r1.","?",". ir.:,",,ff Con es,u unos (1s-,

Algunos aminocidos presentan problemas en. Ia reacci" compuestos utilizados para la dereccin; ti prorina, oaoo que es un aminocido "; cctico, de modo diferente o no reaccio""-", algunos aminocidos tienden a "ur"j*". resultar pu."iumJnt" destruidos durante ta hidrtisis

a partir del comenhrio,anterior.

.";';;, p;;i; ;""[ ;;;;nar t!r._",

il;;;;-ores

inr"nru.-al*iJ'rro..,o

del anlisis ha mejorado en sran meida;;;;;; d".Jll,uo, fluores_ centes y deteccin flur Por ejeTPlo, los aminocidos ;;;;::""T^'::,1T' o-rtalaldehdo para producir un complejo ,il:::::ffi:on
H

Ms recientemente,,la sensibilidad

^] (}.):
I

+ H3N-CH -COO + HS-CH, _ CH, _OH Aminocido p_Mercaptoetanol

.t

oFtalaldehdo

;;;. "on,.lr,0" iil" reacc n, ::3: vv'ru T',T.T|;: r4r usrras ;il::ffi*:**i:*: reacclones de degradacin antes mencio_ nadas, puede evirarse utilizando "r;";il;#ris enzimri_ ca, con una meicla d, raniroi,sis";,rr:.::"":1ffi::":::J,1:l;;;tJffi
i

er triptfano y medianre un analrsls por separado, normalmenr" "r" en su fuerte absorbancia ultravioleta ueuw iu-iffij]u.l ru serina, Ia treonina y la tirosina tambin ,iE""" degradarse duranre la hidrjisjs larga. Fsras dif;;;il"d., tarse en gran medida realtzandoreal;;i"es pueden evi_ prorecroras previas o midiendo el conrenido en momentos disrintos.de "p**]iaminocido ta hidrlisisl Jxlpotndolo al momenro cero de ra rr1.lrorjlis mrna se hidrolizan invariabteme;r;;;"0", y la gtuta_ los cidos asprrico y gtutmico. d. ,od; rotat de

l::ll:T,'

;;;. il..,n;;:|"

presenra

"

il"W;;;a

\A
I

.-

CH:

CH,

_
+

OH

presenta inconvenientes, porque a veces es

\-J=,,N

i cH

-coo

2H,o + H'

Derivado isoindol del aminocido

ex

mrcroetecrroforesis v, dereccin
re nd

;; "i"?i :113i,'":;,':: l%rff:il:' :::i1 ?l: avances recientes que.utilizan ifi

t0
do esra sen s i hi t,i uo 'u mot). Esra canridag
i

Tales tcnicas Dro

A pesar de estas complicaciones menores, el anlisis de aminocidos mediante unrzuJo."r l"i"rn"Urros se ha converlido en una ooeracin _,i;;;;;'*"hos labora_ torios. Uno de los oiimeros anlisis O" friq"ri.rprorena

:1^111'ti:is mrnarse anbs del anlisis.

completa.y ru,

.ir_u;;;;;",

difcil lograr
deben eli_

,g;

ffii3,ffi::bierra
Bibliografa

es

inuaraureme;;* ;;:;oosicin

de

miles de molculas.

aminocidos de protena que contiene unu munhu ,nu'"t""t oforesis en get bidimensi onat "n unuiir*J""" lurouo. "u"" Por supuesto, estos'Droc"imi"nios . ," ," sencillos m presenran tun po.o, prour"_u, deducirse

.9;$;; o,,u oo.o, o" fr"o, i, ,*t#;" ,no, han uesado h;ri;.";;;o;. antisis de ta canridad
*"

sisrema de ';il;;"r.encia ";';"; l; han io.j. d"' ;i:; ;;;ffi ,i:;

n*

cheng. y.-F. ,, Lru.

Chang, J. y., R. Knecht y D. Braun. (19g1) Amino acid analv_ sis ar rhe picomole teue.r.

r I 972 ) Derr Erzyiot'i,+il-s."'"t^ination of

analysis by crpillarv zon_e elecrropn.r.rl, flug1e9ence.ci"re 2a2:562_50i. -!J,J

T.-

i. lbGoi sss y N. Dovichi. ,,r;'r;#ffi-Jte amino

ftyptopha

Biochin.

,r laser_induccd u,,u
n.
Methods

acict

y.

",'""pJrr"

172

CAPTULO

INTRODUCCIN A I,AS PROTENAS: NIVEL PRIMARIO DE LA ESl'RUCTURA PROTEICA

DETERMINACIN DE LOS RESIDUOS N-TERMINAL Y C-TERMINAL DE UNA PROTENA

N-Terminal Existen distintos mtodos para la identificacin rpida de los residuos N-terminal de un polipptido.

O.-:c:s
*oo
H,N
Fen
iI

isotiocia nato

Reactivo de Sanger

El compuest o 2,4 - dinitr ofl uorobenceno (DNF) reacciona con el grupo amino N-teminal de un polipptido en solu_
cin alcalina:

- CH C NH-CH -CI

|il

R.l

R2

l-\ o,ir { \-r \-_/

NO, DNF

RO
+ HrN

iil

N-terminal de la cadena

-CH -C-

+
I

I
H

Paso

I
O

Residuo N-terminal

HRO
orN
NO, Derivado DNp

N-CH-C-

tt

il

+Fl*+ F-

O l ti H_N_.CH-C-NH_CH_C_il tt Rr
R2

N-C:S

Derivado feniltiocarbamilo de la cadena peptdica

Si a continuacin se hidroliza el polipptido, el amino_ cido N-terminal quedar marcado con el grupo dinitroben_ ceno, que le confiere un color amarillo vivo. Los amino_ cidos pueden separarse por electroforesis o cromatografa en papel (vase Henamientas de la Bioqumica 2A 5,{) t y la mancha del residuo N-teminal, que s amarilla, puede identificarse por comparacin con la migracin de d^eriva_ dos de DNP (dinitrofenilo) conocidos.

".1'"""
H

.lt \C:o H'N

nu
R1

N-C-S

H3N

.il
I

a)

-CH -C R2

Cadena peptdica

Cloruro de dansilo El compuesto cloruro de dansilo (cuyo nombre com_ pleto es cloruro de dimetilaminonaftilsulfonilo) tambin

acortada en una unidad

Paso 3

IY\ w

N(CHr),

RO
+ H'N-CH-C-

til

(,l--\ )- N- c:s \,//r /\ CNH //\,/ OCH

R1

sorcl
Aminocido

Cloruro de dansilo

Derivado feniltiohidantona de

R,

prcunn 5C.1

Degradacin de Edman.

Residuo N-terminal dansilado

l

,I
I

;t

DETERMINACION DE I,oS RESIDUOS N-TERMNAL Y C,TERMINAL DE UNA PRoTENA

173

reacciona con los gnlpos amino N-terminal a pH elevado:

mtodo qumico ms importante utiliza la hidrazinlisis:

La reaccin y el anilisis son muy similares al mtodo de Sanger, pero el cloruro de dansilo tiene la ventaja de que es
intensamente fluorescente. Con este reactivo, puede detectarse la concentracin de un residuo de hasta 1 nrra (10re mol/L).

El reactivo de Edman La secuencia de reacciones descubierta por Pehr Edman es muy importante, ya que no slo identifica los N-terminales sino que tambin proporciona un mtodo para la
secuenciacin completa de polipptidos largos cuando se utiliza repetidamente (vase Heramientas de la Bioqui mica 5D). Se hace reaccionar el compuesto fenilisotiocianato en lcali con el grupo amino terminal para produ-

Esta reaccin produce la fragmentacin, con la modificacin de todos los residuos excepto el C-terminal, que puede distinguirse entonces fcilmente. Sin embargo, la existencia de varias reacciones que complican este mtodo ha favorecido a otra tcnica. Esta otra tcnica se basa en la utilizacin de una enzima proteoltica denominada carboxipeptidasa. Existen diversas enzimas de este tipo; cada una de ellas cataliza

R*rOR*,OR,

lllllll

-NH -CH -C -NH -CH -C -NH

Hro

CH

COO

cir un derivado de feniltiocarbamilo del pptido (Figura 5C.1, paso l). Este derivado se trata a continuacin con un cido anhidro fuerte que produce la rotura del enlace peptdico entre los residuos I y 2 (paso 2). El derivado del residuo N-terminal se reordena para producir un derivado de feniltiohidantona (PTH) del
aminocido (paso 3). Se han logrado dos cosas importantes. En primer lugar, se ha marcado el residuo N-terminal con una etiqueta identificable, como con los mtodos del cloruro de dansilo y de Sanger. Pero en la reaccin de Edman no se ha destruido el resto del polipptido; sencillamente se ha acortado en un residuo. A continuacin puede repetirse toda la secuencia de reacciones y determinarse el segundo residuo. Por repeticin continuada, puede <leerse> un polipptido largo empezando desde el extremo N-terminal. Este procedimiento es la base de un
importante mtodo para secuenciar cadenas polipeptdicas.

--t.

-_I

Residuo C-terminal

\ J

Carboxpeptidasa

R*, O

rilt

R*,

//
I

o
H3N

-NH-CH-C-N-CH-C
H

\o

-cH - coo

I'

Residuo C-terminal

Cadena peptdica acortada en un residuo

especficamente la hidrlisis del ltimo enlace peptdico (la mayora el C-terminal) de una protena:

G-terminal

No existen tantos mtodos apropiados para determinar los residuos carboxi terminales de los polipptidos. El
H3N

. l ll------NFFCH t- il
-CH -C

R" O

R^,.

R^,

t'

-CH -COO -C -NH !--Residuo

Los primeros estudios utilizaron carboxipeptidasa A pancretica, pero en la actualidad se prefiere la carboxipeptidasa Y de levadura, porque elimina cualquier residuo C-terminal, incluso la prolina. A medida que la reaccin contina, extrayendo uno a uno los residuos a partir del extremo C-terminal, se produce con bastante rapidez una mezcla confusa de productos. Un investigador habilidoso (y afortunado) puede ser capaz de determina siguiendo la produccin de aminocidos libres, qu residuo sale primero, cul es el segundo y as sucesivamente. De este modo, pueden identificarse varios residuos antes de que los resultados sean demasiado confusos.
Bibliografa
Gray, W. R. (1972) End group analysis using dansyl chloride. Methods Enzymol. 25 :l3l -138. Schroeder, W. A. (1972) Hydrazinolysis. Methods Enzymol. 25:138-143. Este volumen de Methods n Enzymology contiene tambin otros captulos sobre anlisis de grupos terminales.

Polipptido de N aminocidos
H2N

C-terminal

+H*

NH2 Hidrazina

H3N

.til
-

Rro
CH

-C -NHNH'
+

.t + H.N_CH_COO
Residuo

R^,

R^,.
H3N

CH

t-

C-terminal

il

-C -NHNH'

Derivados de hidrazina de todos los aminocidos excepto el residuo C-terminal

174

CAPITULO

INTRODUCCIN A LAS PROTENAS: NIVEL PRIMARIO DE LA ESTRUCTURA PROTEICA

cvro

SECUENCTAR UNA PROTEINA

La determinacin de la estructura primaria de una protena, como el anlisis similar de los cidos nucleicos,
suele denominarse secuenciacin. Hoy en da, prcticamente todas las secuenciaciones directas se realizan mediante la degradacin de Edman (vase Herramientas de la Bioqumica 5C) y se realizan casi enteramente de forma automtica en instrumentos conocidos como
secuenciadores. Estos dispositivos pueden realizar todo el conjunto de reacciones que aparece en la Figura 5C.1 una y ofravez. El secuenciador acumular en un tubo separado el derivado de feniltiohidantona de cada residuo de aminocido existente en el polipptido, empezando con el

a)

o
il

N-CH-CHI
!

il

CH,

o
H

-C-N-CH Hl
CH,

;
I

-C//\oou
cido perfrmico

5o.
S.

I I

ir

CH, o lll N- CH- CH

cH"

-N-CH -CH

l'

o
ll

residuo N-terminal y siguiendo durante tantos ciclos como desee el operador o petmita la precisin. Los derivados PTH suelen identificarse por cromatografa lquida
de alta resolucin.

La reduccin con p-mercaptoetanol es una tcnica ms

suave.

La protena que utilizaremos como ejemplo es la insulina bovina. Esta eleccin es adecuada, ya que fue la primera protena secuenciada por Frederick Sanger y sus colaboradores a principios de los aos 50. (Evidentemente, los mtodos que describimos son mucho ms sofisticados que los que dispona Sanger en su trabajo
pionero.) Los pasos del procedimiento se presentan en la Figura 5D.1. El investigador que desge secuenciar una protena primero deber asegurarse de que el material es puro. La protena puede separarse de otras protenas por una combinacin de los mtodos descritos en Herramientas de la Bioqumica 5,A. y comprobarse su pureza mediante electroforesis, enfoque isoelctrico o los dos mtodos a la vez. A continuacin, deber determinarse si el material contiene ms de una cadena polipeptdica, ya que en algunos casos los puentes disulfuro enlazan cadenas de modo covalente. La determinacin del grupo terminal (vase Henamientas de la Bioqumica 5C) y la electroforesis en gel con dodecilsulfato sdico (SDS) en presencia

- NH- CH- CcH.

5

il

t'
I

+ 2(HS-CHTCHzOH)

cH,

B-Mercaptoetanol

l'll

o o
il

-NH-CH-C-

-NH-CH-CI

CH,
I

SIJ

gH

*f
5

cH'cu'ot1

cH, o

-CH2CHTOH

lil

-NH-CH-CEsta reaccin deja grupos sulfhidrilo libres, que suelen estar colocados de modo que es probable la reoxidacin para formar de nuevo el enlace disulfuro. En consecuencia, suelen bloquearse los sulfhidrilos para impedirlo. Ul agente bloqueante comn es el yodoacetato: o
il

y ausencia de agentes reductores puede responder a esta pregunta. En el ejemplo de la insulina, el investigador observara que hay dos cadenas, A y B, como muestra la
Figura 5D.1. Estas cadenas deben separarse y secuenciarse individualmente. Existen distintas reacciones para romper los enlaces disulfuro y as separar las cadenas. A continuacin se describen las dos reacciones ms importantes de este tipo. La oxidacin con cido perfrmico es la tcnica utilizada en la Figura 5D.1, paso 1. El fuerte agente oxidante cido perfrmico producir cido cisteico:

o
il
I

-NH-CH-Cll CH" t' SH

-NH-CH -C-

Ct-t,

QH,
I

+ H-

-'

COO

s
.L
I

c00
Residuo de cistena Yodoacetato
Residuo de -carbo-

ximetilcistena

cMo sEcuENcren uN pnorN

175

Si se lleva a cabo alguno de estos dos mtodos con la insulina, la protena completa se fragmenta en cadenas A y B.A continuacin pueden separarse estas cadenas por mtodos cromatogrficos. Antes de secuenciar las cadenas individuales, suele determinarse su composicin de aminocidos (vase Henamientas de la Bioqumica 5B). Esta determinacin puede sealar composiciones poco habituales y de este modo alefiar al operador ante problemas potenciales.
Adems, los datos de composicin servirn para compro-

bar los resultados de la secuenciacin, ya que la secuencia determinada debe concordar con la composicin. En este momento puede iniciarse la secuenciacin. El investigador debe tener presente que ni siquiera las mejores tcnicas de secuenciacin de Edman pueden producir resultados fiables ms all de 40-60 residuos. A parlir de este punto, las impurezas acumuladas y las reacciones incompletas producen resultados ambiguos. Si la electroforesis en gel SDS ha indicado que la cadena es de esta longitud o superior, primero ser necesario fragmentarla

Cadena

A:

GIVEQCCASVCSLYOLENYCN

s-s tt
110
S

121
J

Cadena

lt B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA
1', 10',
@

Secuencia de toda la molcula de insulina bovina, que contiene tres enlaces disulfuro

20'

30,

OxiOaciOn de los enlaces disulfuro y separacin de los productos

So.Cadena

A:

j-i
I I

?o,
1

so"l

so^-

GIVCCASVCSLYOLENYCN

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA

t'

so.-

so^J

ll

Cadena B:

,/ /
SO.I

Rotura de la cadena B . \ con trpsina ( ) y separacin productot de los

\ \

Q -

Rotura de la cadena B con quimotripsina {l) y separacin de los productos

So"-

T1: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGTR T2:

l"

SO"-

l"

C1:

FVNOHLCGSHLVEALY

SO.i

GFYTPK

C2: C3:

LVCGERGFF YTPKA

T3: 4

ldentificacin de los pptidos utilizando secuencias que se solapan

FVNOHLCGSHLVEALYLVCGR

so,Cl: TVNOHLCGSHLVEALY

t"

so^C2:

l'

LVCGERGFF
GFFYTPK

T2:
C3:

YTPKA

T3:

FrcuRA 5D.1

Secuenciacin de la cadena B de la

SO.l

so^-

insulina.

Secuencia: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA

t'

176

CAPTULO

lNrnooucclN

I-s pnorpNs: NrvEL pRlMARlo

DE LA ESTRUCTURA pROrurcA

en partes de tamao manejable. En el caso de la insulina bovina, las cadenas A y B son tan cortas que las tcnicas modernas podran secuenciarlas en una sola operacin del secuenciador. Pero para presentar los mtodos necesarios para protenas ms grandes, supondremos que el investigador debe fragmentar las cadenas de insulina en polipptidos pequeos. (En realidad, ste fue el caso en los estudios pioneros de secuenciacin de Sanger sobre la insulina.) Supongamos que debe secuenciarse la cadena B de la insulina. El primer paso sera fragmentar partes alcuotas de la cadena con dos o ms de los reactivos fragmentadores especficos descritos previamente. La tripsina y la quimotripsina, por ejemplo, produciran los conjuntos de pptidos que aparecen en los pasos 2 y 3, respectivamente, de la Figura 5D.1. A continuacin se aislaran los pptidos individuales de cada una de las dos mezclas utilizando, por ejemplo, cromatografa de intercambio inico, y podran determinarse sus secuencias (Figura 5D.1, paso 4). En la actualidad se utllizan varias tcnicas instrumentales para secuenciar pptidos mediante la tcnica de Edman. A continuacin se presentan las descripciones de dos de ellas.

mafriz suele ser una membrana polimrica delgada, que se mantiene en el recipiente de reaccin. De nuevo, se aaden los reactivos, se produce la reaccin y los pro-

ductos se extraen automticamente. En una variante reciente de esta tcnica, la secuenciacin en fase gaseosa, muchos de los reactivos y productos son gaseosos, lo cual permite un manejo ms fcil y una contaminacin menor. Estos mtodos en fase slida pueden secuenciar cantidades muy pequeas de polipptidos; en ocasiones es suficiente con slo 1zg (10 3 mg). Volviendo a la secuenciacin de la insulina bovina. supongamos que se han secuenciado todos y.cada uno de los pptidos que aparecen en la Figura 5D.1 (paso 4). A pesar de que con slo los pptidos trpticos se cubre toda la secuencia, no son suficientes para permitirnos escribir la secuencia de la cadena B de la insulina, ya que no conocemos el orden en el que aparecen en la cadena. Sin embargo, tambin tenemos los pptidos quimiotrpticos, que solapan los trpticos; en consecuencia, se elimina toda ambigedad. Slo una disposicin de la cadena completa concuerda con las secuencias de estos dos conjuntos de pptidos, como puede verse comparando las
secuencias que se solapan (paso 5). Finalmente, la caracterizacin completa de la estructu-

En el mtodo del secuenciador de vaso rotatorio

(Figura 5D.2a), el vaso de reaccin es un vaso rotatorio. El polipptido precipita sobre la pared del vaso y se aai

den los reactivos, extrayendo del vaso los productos y el exceso de reactivos. Todas las reacciones tienen lugar en

ra covalente de una protena requiere localizar las posiciones de todos los enlaces disulfuro. En la preparacin
para la secuenciacin, estos enlaces habrn sido destruidos, pero se habrn determinado las posiciones de todas las cistenas, algunas de las cuales pueden haber estado implicadas en el enlace. La pregunta es: qu cistenas estn unidas de este modo en la protena nativa y cul est conectada a cul? Para determinar la disposicin de los enlaces disulfuro, el investigador empieza de nuevo con la protena nativa, la insulina en el ejemplo que aparece en la Figura 5D.3.

el vaso y se recogen los derivados de feniltiohidantona en un colector de fracciones. La tcnica de vaso rotatorio
I
1

rl
I

es el mtodo automatizado original. Precisa de cantidades bastante grandes de la protena y presenta la desventaja de que puede ser difcil mantener insolubles los polipptidos cortos correspondientes a los ltimos escasos aminocidos.

En el secuenciadrr de fase slida (Figura 5.26, el polipptido se acopla de modo covalente mediante su C-terminal a una matriz de sostn de fase slida. Esta

La reaccin con yodoacetato marcado radiactivamente sealar los residuos de cistena libres, y la fragmentacin de la protena en los mismos pptidos de la secuenTubo para aadir reactivos

:;
Mezcla de reaccin

Tubo para aadir reactivos y eliminar reactivos y productos

Disco de fibra de vidrio Vaso rotatorio Disco de

Protenas

depositadas en las paredes del vaso

polmero

Molculas protecas fijadas covalentemente al disco de polmero

Tubo para eliminar reactivos y productos

(al FrcuRA 5D.2
(b)

Recipientes de reaccin en los dos tipos principales de secuenciadores automticos. (a) Vaso rotatorio. (b) Fase slida

cMo

SECUENCIAR UNA PRoTENA

o
.--, uaoena I A: GTVEOCCASVCSLyeLENyCN

't77

ca dena

B:

@? -s
/
f
/
paso r:

o,+
r

rvrronr-ie

s r-r. u u o

rio

,li::?:

JcERGFFyTpKA o" ",*"n,u _su

*F;

i a^..t-de , insulina Molcula sin alte

P""o 2, Frugrn"n1"iil

:"i1.#ff::"J:y,::1f;:H:
consulfhidrilo

s
I

s
I

*r.r"r"-".-J

"l"t

srupos

-sH

ribres

LVCGERGFF

de toda la molcula con quimotripsina

raso 3: Hidrlisis cida suave

toda la molcula

j
ldentificacin del enlace @ como A20 - Bi9

..-J ,_t

d .l

c4 ?As *A' 9sg

,.io

.Qc.

i-t

$ve

._______r___Jsvc
l

'vFec

?-r

laentrcacij oer enlace @ como 47 _ 87

lentificacil oel enlace @ como 46 _ A11

rrcuRa 5D.3

/ J

se agentes frugr"ntudol^1" lu protena intacta con vaios

tas posiciones .ir;;;;;';; Ji: ': identiriquen lpaso l)' A conrinuacin de f.agmenn";;;,;l'1'das
esras

ciacin permirir

or

de prorenas disrinras "ru" ""'rl'lll'.,|t"na' ,r;;;;;.iil,.rr^i,.]p*, primera"";l;,#;H".'.T,T:,i,i::H,l,TTil*fl en

orirr.lr. llevado,

estrucrura

,r, """itr:?::il::iJH: ":lltt dis.ulfuro para qr" irn,i"n"!:-llces Hasra er momenro'^1* '": o"i iJilt?* "' """:'li pu." e.m;;;J:'? nemos descriro el modo;;';l qr"
pptido

r;H H 3:i ; f ff 31; *i:'i, ;Hx i l3;: r tt"ni";;Jr'"^t:'1"t por estos nlac "t't ti' a ra1se. Y romper

pueda llevarse prueba convincente a cabo es una oJt^:i uc cada protena QUe tura primari 6".;. ene una estruc-

de que tal secuencia<

;ruU:;r

Bibliografa
Edman. p.. and G. Beo,

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