I Curso Universitario de Formacin en Medicina Reproductiva

Frazer Paula Bioqumica, Especialista en Embriologa Clnica Laboratorio de Reproduccin Asistida, Perinat

A pesar del amplio uso de las TRA, aproximadamente dos de tres ciclos fallan y ocho de diez embriones trasferidos no implanta. A fin de prevenir fracasos, histricamente los centros eligen la transferencia de mltiples embriones, aceptando el riego de embarazos mltiples. En Estados Unidos se transfirieron un promedio de 2.45 embriones en ciclos con ovocitos propios en el ao 2006, con una tasa de nacidos vivos de 34% por transferencia y de los cuales el 32% fueron nacimientos mltiples. (Nagy Z.P, 2009) 5% de todos los neonatos de TRA son producto de gestaciones mltiples, con una frecuencia 15-20 veces mayor que con concepcin natural.

La mayor tasa de embarazo mltiple asociada con las TRA tiene consecuencias significantes en la salud de la poblacin. (Seli E, 2008) La tasa incrementada de partos pretrmino en neonatos de embarazos mltiples, comprometen las chances de sobrevida. A pesar de que los embarazos mltiples constituyen solo el 3% de todos los nacimientos en Estados Unidos, constituyen
el 13% de los nacimientos pretermino (<37 semanas), el 25% de los nios con muy bajo peso al nacer (<2000Kg).

La incidencia de parlisis cerebral es 8 veces mayor en mellizos y 47 veces en trillizos, mientras que la muerte infantil est incrementada 6 veces en mellizos y 17 veces en trillizos. Los embarazos mltiples tambin constituyen un riesgo para las madres, incluyendo 2-4 veces la hipertensin inducida por el embarazo y hemorragias post parto.

Para limitar la tasa de embarazos mltiples y las complicaciones asociadas, muchos pases restringieron el nmero de embriones transferidos en TRA. Sin embargo la mayora de los pases todava no adoptaron regulaciones estrictas con respecto a las prcticas de las TRA, probablemente debido a los altos costos de los tratamientos y la decisin de los pacientes de incrementar sus chances de embarazo por ciclo.
Consecuentemente, disminuir las gestaciones mltiples manteniendo o aumentando la tasa de embarazo es una meta importante de los tratamientos de infertilidad, y los avances en los mtodos de seleccin de los embriones seran beneficiosos para este propsito.

Donde podemos mejorar los resultados de las 80% TRA? Captacin

Estimulacin ovrica ovocitaria 95% 15%

Ovocitos fertilizados

Falla 70 % de los ciclos

Seleccin embrionaria 50% Transfer

xito 30 % de los ciclos

Crio

El desafo es seleccionar el mejor embrin

Transfer o crio <30% de la corte

Mtodos invasivos:

Mtodos no invasivos
Genmica Transcriptmica Proteomica Metabolmic

Biopsia de CP Biopsia de blastmeras Biopsia de trofoectodermo

1. Morfologa tradicional 2. Omics

3. Monitoreo continuo 4. Nuevas herramientas

Marcadores bioqumicos Consumo de oxgeno

Una evaluacin precisa de la calidad del embrin es de suma importancia para sostener con xito el programa de Reproduccin Asistida. En la mayora de las clnicas de TRA en todo el mundo, esta evaluacin de la calidad se basa principalmente en la evaluacin morfolgica de embriones en fase de divisin. Los embrilogos deben ser capaces de correlacionar las caractersticas observadas en el microscopio ptico con el potencial de implantacin de cada embrin en particular. (Alfa cientficos en Medicina Reproductiva y ESHRE Grupo de Inters Especial de Embriologa, 2011 ).

Se han desarrollado muchos sistemas de puntuacin basado en las caractersticas morfolgicas del embrin dividiendo ( Giorgetti et al , 1995. ; Veeck, 1999 ; Fisch et al ., 2001 ; de Plcido et al , 2002. ; Baczkowski y col ., 2004 ; revisado por Rienzi et al , 2005. ; Torell et al , 2005. ; Holte et al ., 2007). Clasificacin I a IV Clasificacin IV-I Clasificacin 1,2,3 Bueno, regular y malo Consenso de Estambul (2011)

Atlas of Human Embryology: from Oocytes to Preimplantation Embryos Volume 27 suppl 1 August 2012

Este sistema de evaluacin

clasificacin embrionaria esta basado en la

del nmero de blastmeras el grado de fragmentacin la simetra de la blastmeras la presencia de multinucleacin y el grado de compactacin.

El propsito de este captulo es ilustrar morfolgicamente los aspectos tiles para la evaluacin del potencial de implantacin de los embriones.
Consenco de Estambul (Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011).

El estado de desarrollo del embrin definido como el nmero de blastmeras en el da 1, 2 o 3 luego de la inseminacin es un factor predictor esencial de implantacin. Day 1, 2-cells (26+1 h post-ICSI, 28+1 h post-IVF) Day 2 (44+1 h), 4-cells Day 3 (68+1 h), 8-cells

(Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011).

La primera mitosis ocurre antes en ICSI (26+1 h) que en FIV (28+1 h) y se correlaciona con embriones de buena calidad. (Lundin et al., 2001; Fenwick et al., 2002)

Despus de dos clivajes el zigoto se convierte en un embrin de 4 clulas. Estas cuatro clulas normalmente estn ubicadas formando un tetraedro. En algunos casos la ubicacin de las mismas es en un plano, producto de una incorrecta orientacin de los ejes de divisin. Esto puede asociarse con alteraciones en la polaridad del embrin. (Edwards and Hansis, 2005).

Cuando el embrin alcanza el estadio de 8 clulas las blastmeras comienzan a mostrar un aumento en la adherencia clula-clula, este es el comienzo de la compactacin. (Veeck, 1999). Si alguna de la blastmeras queda excluida en este proceso de compactacin, el embrin puede reducir el potencial para formar un blastocisto normal. (Tao et al., 2002).

Numerosos estudios mostraron que la transferencia de embriones de 4 clulas en da 2 resulta en tasa de implantacin significativamente ms alta que transferencias con embriones de menos o ms numero de clulas. (Thurin et al., 2005; Holte et al., 2007; Scott et al., 2007).

Con respecto a las transferencias en da 3 la tasa de implantacin y la tasa de nacido vivo se correlaciona positivamente con embriones de 8 clulas (van Royen et al., 1999; Racowsky et al., 2011).

Frecuentemente en el proceso de mitosis los embriones externalizan parte del citoplasma resultando en la presencia de fragmentos sin ncleo rodeado de membrana plasmtica (Antczak and van Blerkom, 1999). El tamao y la distribucin de los mismos es importante. (Alikani et al.,1999). La cantidad de los fragmentos es til para predecir el potencial de implantacin del embrin y la fragmentacin podra estar relacionada a aneuploidia. (Ebner et al., 2001; Ziebe et al., 2003; Munne, 2006). Si los fragmentos son menos que el 10% del volumen total del embrin, no tiene impacto en el desarrollo del mismo. (Van Royen et al., 2001; Holte et al., 2007).

217-220

La mitosis debera formar dos clulas hijas de igual tamao. Cuando la divisin es asimtrica, una de la blastmeras hereda menos de la mitad de citoplasma, (proteinas, RNAm, mitocondrias, etc) llevando a un defecto en el linaje del embrin.

Los embriones de 4 y 8 clulas con igual tamao de blastmeras tienen menos multinucleacion y aneuplidias, con mayor grado de implantacin. (Hardarson et al., 2001; Van Royen et al., 2001; Hnida et al., 2004; Scott et al., 2007)

Cada blastmera del embrin debe tener un nico ncleo. La multinucleacin se ha asociado con desordenes genticos del embrin (Kligman et al., 1996; Hardarson et al., 2001). Tambin se ha asociado con mayor tasa de aborto (Meriano et al., 2004). La multinucleacin puede ser evaluada en el da 1, 2 o 3 del desarrollo embrionario. (Van Royen et al., 2003).

A pesar de que el primer embarazo de TRA reportado fue con transferencia de un blastocisto (Edwards and Brody, 1995), la transferencia de embriones domino hasta la actualidad. Esto fue debido a la dificultad del cultivo de los embriones hasta el estadio de blastocisto ya que los medios utilizados no permitan el normal desarrollo de los mismos.

En la dcada del 90 el conocimiento de los requerimientos del embrin permiti el desarrollo de medios secuenciales y complejos.

Esto aumento la proporcin de embriones que llegaban a blastocisto y las trasferencias en da 5 del desarrollo embrionario.
El objetivo del cultivo a blastocisto fue aumentar las tasas de xito debido a la mejor seleccin luego de la activacin genmica del embrin y mejor sincrona endometrial. El cultivo a blastocisto es utilizado como herramienta para seleccionar el embrin ms viable de la cohorte con la consecuente reduccin del nmero de embriones transferidos. El consenso de Estambul (Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011) se baso en el sistema de clasificacin de Gardner and Schoolcraft.

Un momento crucial en el desarrollo del embrin es cuando comienza a acumularse fluido entre la clulas y comienza a aparecer una cavidad, el blastocele. Esto normalmente ocurre entre el da 4 y da 5 del desarrollo en embriones humanos y marca una nueva etapa en la vida del embrin: el estadio de blastocisto. El aumento del fluido junto con el incremento en el numero de celulas (24 a 322, Hardarson, 2003) causan un progresivo aumento en el tamao del blastocisto y adelgazamiento de la zona pelucida.

304 307

321 324

328 329

336 338

Informacin La observacin visual da la informacin esencial sobre el desarrollo.

Estrs Mover los embriones de la incubadora cambia:

La evaluacin en varios momentos del desarrollo mejora la capacidad de seleccionar el embrin viable.

Condiciones adversas del ambiente:

Luz Humedad etc.

Temperatura CO2-O2

Errores de manipulacin

Las limitaciones de la eleccin de los embriones basada en la morfologa y la tasa de clivaje, llev a los investigadores a buscar tecnologas para determinar al embrin con mejor potencial reproductivo.

Varios parmetros metablicos del desarrollo embrionario fueron estudiados usando una variedad de tcnicas no invasivas. (Botros L., 2008) Mtodos no invasivos de protemica y metabolmica no estn disponibles actualmente para la prctica clnica.

Existen dos vas en la generacin de ATP que son necesarias para el metabolismo celular embrionario: la gliclisis aerbica, conocida como el ciclo del cido tricarboxlico (Krebs); y la gliclisis anaerbica, va de EmbdenMeyerhof. El metabolismo del acido carboxlico predomina en el desarrollo de la preimplantacin temprana, donde el piruvato y el lactato son la fuente de energa del embrin en estado de clivaje y el consumo de glucosa en esta etapa del desarrollo es mnimo. En consecuencia, el consumo de piruvato por los embriones en cultivo ha sido investigado como un posible marcador de la viabilidad y de potencial de crecimiento.

Ya en la dcada del 90 Hardy y Gott reportaron el aumento del consumo de piruvato en embriones que desarrollaban hasta el estadio de blastocisto. Sin embargo Conaghan y cols. reportaron resultados contradictorios y demostraron una relacin inversa entre el consumo de piruvato por embriones de 2-8 clulas. Estudios posteriores sugirieron que los embriones presentaban un gran rango en los valores de consumo del piruvato, pero que estas variaciones se reducan en aquellos embriones capaces de implantar.

La capacidad de metabolizar la glucosa aumenta significativamente en la transicin de mrula a blastocisto, reflejando la viabilidad y el potencial embrionario. Varios estudios demostraron que los embriones que resultaban en embarazo tenan un consumo significativamente mayor de glucosa que los embriones que fallaban en la implantacin.

Sin embargo otros estudios no pudieron demostrar la relacin entre el consumo de glucosa y el desarrollo a blastocisto en embriones humanos.

La incidencia de embarazo fue 2.52 veces mayor con embriones HLA-G positivo comparado con embriones HLA-G negativo. La expresin de HLA-G es un marcador no invasivo valioso en mejorar las tasas de embarazo y reducir los embarazos mltiples.

Relacin con implantacin

Tajera et al, 2010: mayor potencial de implantacin en embriones provenientes de ovocitos con alto consumo de oxigeno.

Limitaciones: El instrumento para medir el consumo de oxgeno no esta disponibles para su utilizacin en la clnica.

El sistema de clasificacin embrionaria usado actualmente se basa en el clivaje embrionario y en la morfologa. Aunque este sistema de clasificacin permite mejoras significativas en las tasas de implantacin y la tasa de embarazo, la exactitud es insuficiente para reducir el nmero de embriones transferidos a tal punto que los embarazos mltiples sean raros o eliminados.

Mtodos no invasivos de protemica y metabolmica no estn disponibles actualmente para la prctica clnica.
La seleccin morfolgica es todava el nico mtodo de seleccin disponible para evaluar la calidad embrionaria en la prctica clnica.

Los procedimientos para la seleccin de los gametos y los embriones son subjetivos, limitados y necesitan de manipulacin externa (Braner 2006) Una gran proporcin de fallas de implantacin debe ser atribuida al embrin (Patrizio 2009) Son necesarias nuevos procedimientos para mejorar la evaluacin de la calidad embrionaria.

60-90% de todos los embriones transferidos mueren (Sart 2006) La habilidad para identificar el embrin ms viable es fundamental (Neuber 2003) Hay una necesidad de mejorar la seleccin embrionaria humana en TRA (Scott 2008) La evaluacin de la calidad ovocitaria y embrionaria esta basada en la morfologa y en la cintica con tiempos de seleccin arbitrarios.

Wong et al, 2010: El desarrollo embrionario es un proceso dinmico aunque los embriones viables siguen un patrn de tiempo predefinido.

Elegir el momento de observacin que de ms informacin y disminuir el estrs.

Sakkas2001 early cleavine of IVF human embryos. Fertil steril

Son importantes diferentes momentos de observacin.

1.

Incorporar un microscopio en la incubadora

Cryo innovation

2.

Llevar una cmara de incubacin al microscopio

Nikon tokaittit

3.

Cambinacion de los tres elementos

Nikon Bio Station IM-Q InCu-View Live Sanyo EmbryoScope D Unisense Fertilitech

El desarrollo embrionario es un proceso dinmico en el cual la morfologa cambia significativamente en el tiempo. La prctica observacional convencional puede no detectar diferencias sutiles entre los embriones evaluados. El uso de un instrumento automatizado programable permite la recoleccin de datos durante el desarrollo y cuantifica el timing exacto de cada divisin celular.

6 pacientes 12 embriones por paciente 7 imgenes cada 20 minutos de cada embrin 15000 imgenes por paciente (400MB) Analisis de las imgenes Timing y duracin de las divisiones celulares Tamao celular y multinucleacin >100 variables por paciente Habilidad aumentada de documentar los cambios 46 Embryoscope en 13 pases Dinamarca, Espaa, Italia, Francia, Estados Unidos. Etc. 30 para uso clnico.

El CT se debe anotar en la primer imagen donde se identifica el corte de las blastmeras

Permite la medida del tamao de las blastmeras

Resorcin de fragmentos

La adquisicin de las imgenes y el anlisis permite la deteccin del timing exacto del clivaje embrionario sin afectar las condicione de cultivo.

Es una herramienta para seleccionar los embriones con mayor potencial de implantacin basada en el timing exacto de los clivajes y otros eventos relacionados al desarrollo embrionario.
Estudios futuros evaluaran el timing de otros eventos del desarrollo embrionario en orden de mejorar la seleccin embrionaria. Estudios prospectivos randomizados en proceso, demostraran al utilidad de este nuevo mtodo de seleccin embrionaria.

Seleccionar embriones viables en D2-D3 mediante mtodos no invasivos.

Evitar el cultivo hasta el estadio de blastocisto.

Mejorar el xito de la transferencia embrionaria en D2-D3.

Reducir los embarazos mltiples con la seleccin de un nico embrin.