BSQUEDA DEL MEJOR MEDIO DE CULTIVO Y

MODELAMIENTO CINTICO PARA LA OBTENCIN DEL

CIDO LCTICO A PARTIR DE GLUCOSA POR VA FERMENTATIVA
MARIA PATRICIA OROZCO MURILLO
JUAN ANDRS SOLARTE
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MANIZALES
FACULTAD DE INGENIERA Y ARQUITECTURA
INGENIERA QUMICA
2003
BSQUEDA DEL MEJOR MEDIO DE CULTIVO Y MODELAMIENTO CINTICO
PARA LA OBTENCIN DEL CIDO
LCTICO A PARTIR DE GLUCOSA POR
VA
FERMENT
ATIVA
MARIA
P
A
T
R
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C
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A

O
R
O
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C
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UNIVERSIDAD
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FACULTAD DE
INGENIERA Y
ARQUITECTURA
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2
0
0
3
DEDICATORIA
A Dios por darme la oportunidad de
realizar mi sueo, a mis padres por
su amor, comprensin y esfuerzo, a
mi dems familia por su sacrificio y
apoyo, a mi esposo por su
dedicacin incondicional y constante;
Maria Patricia.
CONTENIDO
RESUMEN 11
ABSTRACT 12
NTRODUCCON 13
1. ASPECTOS FUNDAMENTALES 16
1.1 CDO LCTCO 16
1.1.1 Propiedades del cido lctico 17
1.1.2 Obtencin de cido lctico 18
1.1.3 Antecedentes 21
1.1.4 Algunos procedimientos industriales 24
1.1.5 Recuperacin y purificacin 27
1.1.6 Utilizacin del cido lctico 28
1.2 MCROORGANSMO ( LACTOBACILLU ) 31
1.3 MEDO DE CULTVO 35
1.3.1 Preparacin del medio de cultivo 37
1.4 MODELAMENTO CNTCO 39
1.4.1 Modelos cinticos de procesos simples 40
1.4.2 Modelos de crecimiento microbial 42
1.4.3 Fases del ciclo de crecimiento en un cultivo por lotes 43
1.4.4 Modelos de crecimiento no estructurados 48
1.4.5 El modelo de Monod 49
1.4.6 Otros modelos constitutivos del crecimiento celular 51
2. DSEO METODOLGCO 55
2.1 MATERALES Y EQUPOS 55
2.1.1 Equipos de anlisis. 56
2.1.2 Equipos de proceso. 57
2.2 MTODOS 57
2.2.1 Mtodos Analticos 57
2.2.2 Mtodo de procedimiento general 59
2.3 PREPARACN DE LA CEPA DE LACTOBACILLU D!LB"U!C#II
$""L B%&'( 61
2.3.1 Activacin de la cepa 64
2.3.2 Mantenimiento de la cepa y seleccin del medio de mantenimiento 64
2.3.3 Conservacin de la cepa 65
2.4 DETERMNACN DEL MEDO PTMO DE FERMENTACN 66
2.4.1 Etapa de adaptacin 66
2.4.2 Etapa de produccin 67
2.5 DSEO EXPERMENTAL PARA EL MEJOR MEDO DE CULTVO 68
2.6 BOSNTESS DE CDO LCTCO 70
2.6.1 Recuperacin de cido lctico 73
2.6.2 Determinacin de las curvas biocinticas 74
2.6.3 Modelamiento de la cintica de la fermentacin 75
3. RESULTADOS Y ANLSS 76
3.1 MTODOS ANALTCOS 76
3.1.1 Caracterizacin del jarabe de glucosa 76
3.1.2 Curva patrn de azcares reductores 76
3.1.3 Curva patrn de cido lctico 77
3.2 PREPARACN DE LA CEPA 78
3.2.1 Seleccin del medio de activacin de la cepa 78
3.2.2 Conservacin de la cepa 78
3.3 DSEO EXPERMENTAL PARA EL MEJOR MEDO DE CULTVO 79
3.4 BOSNTESS DEL CDO LCTCO 83
3.4.1 Determinacin de las curvas biocinticas 83
3.4.2 Modelamiento de la cintica de la fermentacin 84
CONCLUSONES 91
RECOMENDACONES 93
BBLOGRAFA 94
Formula emprica C
3
H
6
O
3
Peso molecular 90,08 g/mol
Gravedad especfica 1,249 15 C / 4 C
Punto de fusin
D(+) y L(-): 52,8 a 54 C
D y L (segn su composicin): 16,8 a 33 C
ndice de refraccin 1,4414
Calor de combustin 3616 cal/g
Viscosidad 28,5 cp
Densidad 1,1748 g/mL
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP + 2Pi
2CH
3
CHOHCOO
H + 2ATP
Glucosa Adenosin Fosfato Ac. Lctico Adenosin
(PM = 180) difosfato
inorgni
co (PM = 90,08) trifosfato
productos como cido actico, etanol, glicerol y dixido de carbono
dependiendo de las materias primas utilizadas.
C
6
H
12
O
6

+ 2 ADP + 2 Pi
CH
3
CHOHCOOH + CH
3
CH
2
OH + CO
2 + 2 ATP
Glu cos a
Adenosi
n
Fosfat
o Ac. Lctico Alcohol Dixido de
Adenos
in
(PM = 180)
difosfat
o
inorgni
co (PM = 90,08)
(PM =
46) carbono
trifosf
ato
Las bacterias que tienen este tipo de metabolismo son: Lacto)acillus
)re*is,
Lacto)acillus )uc+neri, Lacto)acillus )ifidus, adems incluye las bacterias
del genero Leuconostoc [14].
F-6,)' 5; Diferentes vas metablicas a partir de glucosa en bacterias cido lcticas.
GLUCOSA
Fructosa 1,6 P Fructosa 6 P Glucosa 6 P
Acetil P + Eritrosa 4 P Gluconato 6 P
Fructosa 6 P
Pentosa P
Xilulosa 5P +
CO
2
Triosa 3P Acetil P + Triosa 3P
Acetil P + Triosa
3P
Piruvato Piruvato Piruvato
Lactato
Aceta
to Lactato
Lactato
Acetato
GLICOLISIS VIA BIFIDA
GLUCONATO
#P
(Homofermentativos) (Heterofermentativos)
F,&%3&< SURDERP, Chahal. ULLMAN'S Encyclopedia of industrial chemistry: cido lctico. 5 edition. De
Barbara Elvers editors. A15, (1995); p 97-104.
20
Aunque cada tipo de fermentacin ocurre dependiendo el tipo de bacterias
existentes, una fermentacin homolctica se puede convertir en heterolctica
cambiando las condiciones de cultivo.
5;5;3 A%3&/&(&%3&4; El cido lctico obtenido por fermentacin, despierta el
inters de los investigadores a mltiples estudios sobre el proceso metablico de
su obtencin por algunas especies lcticas.
Segn Ullmann [37], antiguamente se obtena el cido lctico agregando a las
soluciones azucaradas, queso en estado de descomposicin y oxido de zinc o
carbonato de zinc, a una temperatura entre 35-50 C. Tambin se produca,
cuando al suero extrado por filtracin de la leche agria se le adicionaba xido de
zinc y se dejaba fermentar entre 25-35 C; de esta manera se formaba un lactato
de zinc, que se descompona despus de su cristalizacin por adicin de cido
sulfrico. Estos procesos tienen un rendimiento bajo y frecuentemente se obtiene
mas cido butrico y actico que lctico. Esto oblig a buscar nuevos
procedimientos, para una mayor produccin de cido lctico a escala industrial y a
investigar las especies y sus condiciones de vida antes de utilizarlas para la
produccin de dicho cido.
Segn Pederson
1
, la produccin comercial de cido lctico se inicio en 1881. En
1893 Lafar y en 1896 Leichmann, se dedicaron a cultivar en estado de pureza los
hongos del cido lctico. Wehmer en 1895, fue el primero que aplic en gran
escala cultivos puros; Kowntzki en 1902 cultivo las bacterias del cido lctico en
equipos con una capacidad de 1000 2000 litros.
Tatum y Peterson (1935), describieron la produccin de cido lctico L(+) a
pequea escala utilizando glucosa como sustrato. Ellos reportan resultados de
1PEDERSON, Carl S. Microbiology of food fermentations, 2ed, Westport. Edit. Conn Avi, 1979. p 384.Citado por GUZMN,
M. Rosmery y HERNANDEZ, A. Martha Lucia. Fermentacin anaerobia del suero lctico desproteinizado. Medelln, 1990.
Trabajo de grado. Universidad Nacional de Colombia.
21
rendimiento con base a azcar total, lo que corresponde al rendimiento real de la
fermentacin (Rr), a partir de tres cepas diferentes cuyo metabolismo es
homolctico (Tabla 2) [38].
T'71' 2; Produccin de cido lctico a pequea escala por diferentes cepas
homolcticas.
6 (& =/-(* 1=/3-/*>"!0
6 G1,/*4' /*%?&)3-('
M-/)**)6'%-42* (& '.@/') &% =/-(* 1=/3-/*
A 6 B ACB
treptococcus lactis 510 94
Lacto)acillus casei 505 93
Lacto)acillus
517 95
del)ruec,ii
F,&%3&< TATUM, E. L.; PETERSON, W.H. Fermentation method for production of dextrolactic acid. nd. Eng.
Chem. 27, (1935); p. 1493.
Un mtodo industrial para la obtencin de cido lctico a partir de papa fue
descrito por Cordn et al. En este caso se utilizaron amilasas fngicas de
Asper-illus ni-er para degradar el almidn. Tres bacterias diferentes fueron
utilizadas para este tipo de proceso (Tabla 3) [9].
T'71' 3; Produccin de cido lctico a partir de papa.
M-/)**)6'%-42* R&%(-2-&%3* (& =/-(* 1=/3-/*
B'4'(* &%
B'4'(* &%
B'4'(* &%
2'3&)-'1 '.@/')
'.,/')&4 3*3'1&4
O)6=%-/* /*%4,2-(*
Lacto)acillus** 52,9 61,9 76,0
Lacto)acillus pentosus
77,1 91,2 95,2
(124-2)
Lacto)acillus del)ruec,ii
64,5 79,4 93,8
(NRLB-445)
** cepa obtenida por cultivo aerbico a nivel de laboratorio.
F,&%3&< CORDON, T.C. et al. Lactic acid from potatoes. nd. Eng. Chem. 42, 1950, p. 1833 1836.
22
La produccin de cido lctico, as como tambin algunas de sus sales a partir de
suero libre de albmina, con la adicin de nutrientes fue reportada en 1953 por
Cambell [8]. El microorganismo utilizado fue Lacto)acillus )ul-aricus (ATCC9224),
reportando rendimientos que variaron entre 85-90 % basados en el peso de
lactosa.
En 1940 fue reportado un mtodo para acelerar la fermentacin cido lctica de
glucosa o melazas de caa, utilizando malta sin calentar como un nutriente para
Lacto)acillus del)ruec,ii [28]. El incremento en la velocidad de fermentacin se
debi a un factor de crecimiento sensible a la temperatura presente en la malta
(Tabla 4).
T'71' !; Resultados de fermentacin de melaza con malta.
3&24 U%-('(&4 E%4':*
Melaza Libra 120,2
Azcar % P/V 55,9
Malta Libra 14,7
CaCO
3 Libra 33,0
Tiempo H 20
Azcar inicial % P/V 12,6
Azcar final % P/V 1,10
cido lctico % P/V 11,0
Rendimiento azcar fermentado % 95,7
Rendimiento azcar en melaza % 87,3
F,&%3&< STENROOS, S.L; LNKO, Y; y linko, p. Production of L lactic acid with inmmobilized Lactobacillus
delbrueckii. Biotechnol Lett. 4, (1982); p. 159.
Desde hace algunos aos se ha planteado el uso de clulas inmovilizadas para
obtener rendimientos mayores en la produccin de cido lctico. En 1982, se
obtuvo un rendimiento de 97% basado en glucosa, siendo ms del 90% el ismero
L(+) [36].
23
5;5;! A16,%*4 9)*/&(-2-&%3*4 -%(,43)-'1&4; A nivel industrial, la produccin del
cido lctico por fermentacin puede realizarse por diferentes procesos, segn el
sustrato as:
1- A partir de Xylosa de maz, segn la reaccin:
C
5
H
10
O
5
C
2
H
4
O
2
+ C
3
H
6
O
3
Xylosa Acido acetico Acido lctico
La xylosa es fermentada por el microorganismo Lacto)acillus pentoaceticus [15].
Cerca del 85 90 % de la xylosa puede ser transformada en ambos cidos.
Adicionalmente LUO, Jun, et al. Utilizaron el residuo de la mazorca del maz
obtenido de la manufactura de xylosa y lo emplearon como sustrato en el proceso
simultneo de sacarificacin y fermentacin del cido lctico [21]. La composicin
del residuo de maz fue la siguiente: celulosa 62 %, hemicelulosa 19 %, lignina 13
%. El microorganismo utilizado fue el Lacto)acillus del)rium. Adems reportaron
una relacin de conversin de cido lctico del 79 % basada en el consumo de
celulosa.
1- Partiendo de la papa, con microorganismos del tipo Lacto)acillus pentosus o
Lacto)acillus del)ruec,ii, a temperatura de 45 C y pH entre 5 6.
2- De la lactosa del suero, se puede obtener cido lctico por la siguiente
reaccin:
C
12
H
22
O
11
. H
2
O 4 CH
3
CHOHCOOH
Lactosa cido lctico
Para esta fermentacin se puede utilizar el Lacto)acillus )ul-aricus o el
treptococcus lctis. Segn el microorganismo utilizado diferirn las condiciones
requeridas en el proceso.
24
El Streptococcus lctis puede trabajar en un intervalo de temperatura de 30-35 C
y de pH de 5-6; estas condiciones favorecen el crecimiento de otras especies y por
lo tanto se pueden formar otros productos contaminantes, presentndose as una
produccin baja. El Lacto)acillus )ul-aricus trabaja en un intervalo de temperatura
de 41 45 C y de pH de 5-6; estas condiciones no favorecen el crecimiento de
otras especies contaminantes, es homofermentativo y produce mayor cantidad de
cido [15].
La produccin industrial de cido lctico requiere de inculos muy grandes los
cuales tienen que ser cultivados en el laboratorio de acuerdo al microorganismo a
utilizar. Para el Lacto)acillus del)ruec,ii, se requieren las siguientes condiciones
de proceso: pH 5,0 5,8, un agente neutralizante como el carbonato de calcio o la
soda (CaCO
3
, NaOH) (si el nivel de cido lctico libre alcanza 1-2 % del peso
total, las bacterias pueden morirse), temperatura 43C, tiempo de fermentacin 42
h. Segn LMA, et al. [20] realizando esta operacin en tanques construidos en
madera o acero inoxidable con una capacidad de 23 mil litros, se obtuvieron
rendimientos del 85 al 90 % en relacin al azcar consumido.
La temperatura ptima para la cual el Lacto)acilo exhibe una actividad mxima es
de alrededor de 50 C y se recomienda un pH entre 5 y 5,5, este tipo de
fermentacin elimina los problemas de contaminacin y permite trabajar el medio
con solo haber realizado una pasteurizacin, sin necesidad de autoclave o
someter el proceso completo a presin, este procedimiento convierte el cido
lctico en lactato de calcio. El hidrxido de magnesio, cal y otros nutrientes e
ingredientes que pueden haber sido adicionados en el agua, son removidos por
filtracin.
En un proceso industrial, el Lactobacilo es trasladado progresivamente desde el
tubo de ensayo a frascos, y por ltimo, a los fermentadores, donde se mantiene un
nivel de inculo del 10%.
25
Cada traslado se hace despus de 16 20 horas de crecimiento a 43 C, con
control constante. El medio, consiste en 15% de glucosa, 0,4% de malta
germinada, 0,25% de fosfato diamnico y 10% de carbonato de calcio, no se
esteriliza. La industria se basa en la limpieza, la alta temperatura y el bajo pH para
restringir las contaminaciones, en especial por bacterias butricas.
Esta fermentacin requiere 4 a 6 das, cuando la concentracin de azcar se reduce
al 0,1% o menos y el rendimiento alcanza el 90 al 95%. Como la fermentacin es
anaerbica, debe suprimirse cualquier entrada de aire. Es necesario mantener el
medio en continua agitacin para evitar la precipitacin del agente neutralizante
[13].
El efecto del pH en la fermentacin, para el caso de la -galactosidasa fue
estudiado por BURGOS, et al. [7]. Sin control de pH la velocidad de reaccin es
mucho menor y slo cerca del 20 % del sustrato (lactosa) es consumido. A medida
que la concentracin inicial de sustrato incrementa, la densidad celular, la
concentracin de cido lctico y la productividad incrementan. Cuando el cido
lctico se produce, el pH del medio disminuye, con lo que decrece el crecimiento
del microorganismo y reduce la productividad. El pH necesita ser controlado para
optimizar la fermentacin.
En experimentos con control manual de pH a 5 0,2 con baja concentracin inicial
de sustrato, fue observada una correlacin lineal entre la velocidad de crecimiento
especfico y la velocidad de produccin de cido lctico. Por otro lado, en
experimentos con pH controlado en el mismo rango de pH pero con alta
concentracin inicial de sustrato, dos fases en el crecimiento del microorganismo
fueron observadas. En la primera fase, el crecimiento del microorganismo est
directamente asociado con la produccin de cido lctico. En la segunda fase, el
crecimiento del microorganismo es aproximadamente constante.
26
En consecuencia, la produccin de cido lctico fue incrementando como
resultado de un decrecimiento en el consumo de sustrato para el mantenimiento
del microorganismo. Para la produccin de cido lctico, los experimentos a pH
controlados indicaron altas velocidades de reaccin [7].
En la Tabla 5 se presentan algunos microorganismos empleados en la produccin
de cido lctico.
T'71' "; Caractersticas de los microorganismos productores de cido lctico.
M-/)**)6'%-42*4
M*)+*1*6$
' S,743)'3*4
T&29&)'3,)
' /-(*
*93-2'
9)*(,/-(
*
Lacto)acillus
Bacilo
Lactosa, suero
45 50 C Racmico
)ul-aricus
Lacto)acillus
Bacilo Glucosa, melazas 45 50 C L (+)
del)ruec,ii
Lacto)acillus )re*is Bacilo
Pentosas, madera
30 C Racmico
hidrolizada
Lacto)acillus
Bacilo
Pentosas, lejas
sulfticas 30 C Racmico
plantarun
treptococcus lactis Coco Lactosa, suero 35 C L (+)
"+izopus oryzae Moho Glucosa, almidn 30 C L (+)
F,&%3&< Enciclopedia Salvat. Ciencia y tecnologa. Tomo . p. 101-103
5;5;" R&/,9&)'/-0% : 9,)-+-/'/-0%; La recuperacin del cido lctico de los
caldos de fermentacin es dificultosa, debido a la baja tensin del vapor del cido
lctico y su tendencia a formar anhdridos y a experimentar autoesterificacin
cuando se le calienta y concentra por encima del 20 % y tambin a que su
solubilidad es similar a la del agua [13]. Los contaminantes importantes son
protenas, azcares no fermentados, sales inorgnicas y materias coloreadas. La
prctica corriente es coagular las protenas y neutralizar completamente el cido
lctico calentando a 90 C con exceso de cal.
27
El caldo fermentado es calentado a 70C para matar las bacterias y
posteriormente acidificado hasta un pH de 1,8 utilizando cido sulfrico el cual
regenera el cido lctico y precipita el calcio como sulfato de calcio. No obstante,
en la mayora de procesos, el cido lctico es recuperado bajo la forma de sal de
calcio: lactato de calcio.
Las sales y biomasa precipitadas son removidas por filtracin. El filtrado resultante
consiste en una solucin de alrededor del 10 % en cido lctico el cual es
concentrado en un rango del 50 % al 80 % y se purifica por extraccin, intercambio
inico o esterificacin. Se mejora el olor y el sabor con peroxido de hidrgeno y/o
celdas de carbn dependiendo de los requerimientos [20].
El proceso de refinacin incluye un tratamiento con carbn activado que remueve
impurezas orgnicas, seguido de un tratamiento con ferrocianuro que depone los
metales pesados y una filtracin que remueve impurezas que se han coagulado
durante la fermentacin. La solucin es filtrada y pasada dentro de una resina
intercambiadora que remueve las trazas de contaminacin.
5;5;# U3-1-.'/-0% (&1 =/-(* 1=/3-/*; El cido lctico tiene aplicacin en el
tratamiento y teido de pieles, en la tintorera de telas de algodn y seda.
En la industria de alimentos es comnmente usado en esencias, extractos,
jarabes, zumos de fruta, refrescos y otros; adems sustituye los cidos ctricos y
tartrico dando mayor estabilidad y mejor sabor a los productos. En destilera y
fbricas de levaduras se emplea como antisptico contra los hongos perjudiciales.
Tambin es materia prima en la produccin de plsticos acrlicos, que se utilizan
en los recubrimientos metlicos resistentes. En forma de lactato se usa para
productos farmacuticos sustituyendo la glicerina [20].
28
A partir del cido lctico por un proceso de condensacin se obtienen algunos
polmeros, entre los que se encuentra el cido polilactlico; de este ltimo, puede
obtenerse algunas resinas que reaccionan con diferentes aceites, como ricino,
lino, soya, etc. El tratamiento se hace a temperaturas entre 255-280 C y con
catalizadores como xidos de aluminio, cobalto, hierro. Estas resinas, disueltas en
tolueno, acetona y otros derivados del petrleo permiten obtener barnices, tambin
es utilizado como plastificante de materiales a base de cloruro de vinilo, como
acrilatos y metacrilatos que pueden dar lugar a diversas resinas. Los steres
acrlicos y lactamidas se emplean como insecticidas. Las resinas fenlicas,
acrlicas, etc, preparada del cido lctico pueden usarse en la preparacin de
polmeros que reemplazan el vidrio; Tambin se destinan a la elaboracin de
agentes impregnadores de materias textiles y como adherentes [15].
Los derivados del cido lctico como steres y teres se emplean como
disolventes en la preparacin de lacas, barnices y tintas, destacndose entre ellos
lactatos como etlico, metlico y butrico.
Regionalmente lo utilizan empresas como Lucta gran Colombiana Ltda.; Specia
fabrica de productos de caucho Eterna S.A.; ndustrias Zolaeche Ltda.; nstituto
Farmacolgico Colombiano Ltda.; Quibi S.A.; John Simon y Cia Ltda.; Moderpan
de Colombia S.A.; Griffith de Colombia S.A.; Preparaciones de belleza S.A. Prebel;
Yardley of London Colombiana S.A.; Merck Colombia S.A.; ndustrias Philips de
Colombia S.A.
Estas empresas lo importan de pases como Brasil, Espaa, Alemania, Holanda,
Nigeria, USA, Reino Unido, Canad; en diferentes cantidades [15].
La Tabla 6, resume otras aplicaciones industriales del cido lctico y de algunos
de sus derivados [37].
29
T'71' #; Aplicaciones industriales del cido lctico y algunos de sus derivados.
APLICACIONES
COMPUEST
O
INDUSTRIA ALIMENTICIA
Productos de res y pollo
Lactato de sodio potasio y
amonio
Nutricin Lactato de calcio
Ensaladas y aderezos cido lctico
Confitera y dulcera cido lctico
Productos libres de azcar Lactitol
Bebidas-Lcteos y alimentos
Lactato de calcio, Grnulo polvo
horneados
INDUSTRIA QUMICA
Aeroespacial Lactato de metilo y etilo
Cuero cido lctico, lactato de sodio, potasio
Detergentes
Lactato de metilo, etilo y
butil
o,
Ac
.
lcti
co
Metlica
Lactato y steres de metilo, etilo,
butilo
Pintura y tinta cido lctico, lactato y steres
Polmeros biodegradables cido polilctico
Solventes de limpieza Esteres de etilo y butilo
INDUSTRIA COSMTICA
Cuidado de la piel y el cabello
cid
o
lctico
, lactato de sodio y de
potasio
Artculos de tocador y desodorantes
Lactato de sodio y
potasio
Cuidado oral Lactato de calcio, lactato de aluminio
INDUSTRIA FARMACUTICA
Soluciones normales de dilisis Lactato de sodio y de potasio
Preparaciones minerales
Lactato de calcio y
aluminio
mplantes
Ac.
Lctic
o,
gliclido
s, lctidos,
copolimeros, polilactidos.
Tabletas Lactato de calcio
F,&%3&< SURDERP, Chahal. ULLMAN'S Encyclopedia of industrial chemistry: cido lctico. 5 edition. De
Barbara Elvers editors. A15, (1995); p 97-104.
30
1.2 MICROORGANISMO DLACTOBACILLUSE
Las bacterias lcticas como el Lacto)acillus del)ruec,ii son bacilos de longitud
variable y de un grosor de 0,5 0,8 m. Se trata de un grupo de bacterias
fisiolgicamente uniforme, de pared Gram-positiva, que slo utilizan sustratos,
predominantemente azcares, de manera fermentativa con formacin de cido
lctico. Carecen de actividad respiratoria porque les falta una enzima, la
citocromocatalasa, que les permita poner en marcha una cadena "respiratoria con
el oxgeno como aceptor de electrones. A pesar de su metabolismo anaerobio, son
aerotolerantes y en los medios de cultivos slidos forman colonias en presencia de
aire.
La principal caracterstica del Lacto)acillus es ser generalmente de forma
redonda, variando desde el largo y tenue hacia corto y redondo [3]. En la Figura 2
se esquematiza la morfologa del Lacto)acillus del)ruec,ii su) especie )ul-aricus
F-6,)' 2; Morfologa del Lacto)acillus del)ruec,ii su) especie )ul-aricus.
B')< 2
F2
B')< 2
F2
31
F,&%3&< Tomado de <distans.livstek.lth.se:2080/L_bulg.htm>
Las colonias formadas por los Lacto)acillus se caracterizan por presentar un
crecimiento uniforme en medios muy ricos, estas colonias de bacterias lcticas
siempre permanecen relativamente pequeas. El tamao reducido de las colonias
es atribuido principalmente al bajo rendimiento del crecimiento, como
consecuencia de su metabolismo exclusivamente fermentativo. Raramente son
pigmentadas, como resultado de la ausencia de citocromos.
Los Lacto)acillus requieren no slo carbohidratos como energa y fuente de
carbono sino tambin nucletidos, aminocidos y vitaminas. Ninguna bacteria
lctica crece en un medio constituido exclusivamente por sales minerales y
amnicas como nica fuente de nitrgeno. La mayora necesita distintas vitaminas
del grupo B (lactoflavina, tiamina, biotina, cido nicotnico, cido pantotnico, cido
flico) y varios aminocidos. Como su crecimiento disminuye linealmente en
condiciones estndar en funcin de la concentracin del nutriente, se cultivan para
realizar ensayos microbianos especficos y sensibles a la presencia de pequeas
cantidades de vitaminas o aminocidos en los alimentos [17].
En el caso del Lacto)acillus del)ruec,ii se necesitan 14 aminocidos y 4 vitaminas
y es estimulado por otras sustancias. Estos factores de crecimiento pueden ser
proporcionados adicionando pequeas cantidades de malta germinada,
macerados de maz, torta de soya, leche desnaturalizada o extracto de levadura
[13]. Estos requerimientos nutricionales cualitativos y cuantitativos requieren ser
determinados para optimizar el crecimiento y la formacin del producto.
El Lacto)acillus ha sido ofrecido durante mucho tiempo en productos de dieta y en
la mayora de casos entraa el uso en la preparacin de productos fermentados.
En primer trmino el Lacto)acillus del)ruec,ii ha sido utilizado en la preparacin
32
de yogur, el Lacto)acillus cidofilos en la preparacin de leche acidificada y otras
especies estn involucradas en la preparacin de chucrut (leche fermentada con
azcar) y encurtidos. Estos microorganismos han sido usualmente ms resistentes
a las condiciones cidas que otras bacterias lcticas.
Para hacer crecer las clulas se requiere valores de pH de alrededor de 4 y 5. A
causa de esto, se puede llevar a cabo en aislamiento selectivo partiendo de
materiales naturales para usar en medios que contienen carbohidratos y un pH
cido, algunas de estas fuentes pueden ser el jugo de tomate y el agar pectona.
La resistencia cida del Lacto)acillus permite entonces el crecimiento continuo
durante las fermentaciones naturales lcticas; cuando el valor de pH ha cado
hacia un valor bajo en comparacin con otras bacterias lcticas el crecimiento del
Lacto)acillus es todava apreciable para el final de las etapas de muchas de las
fermentaciones cido-lcticas [2].
El Lacto)acillus es raramente o casi nunca patgeno, los dos Lacto)acillus
generalmente ms estudiados son los Lacto)acillus de las especies aerobios o
facultativos aerobios y el clostridium [6].
Los ms importantes productores de cido lctico son los gneros: treptococcus,
/ediococcus, Lacto)acillus y Leuconoctoc, todos pertenecientes a la familia
Lacto)acillaceae.
Muchas especies son homofermentativas pero algunas son heterofermentativas.
Dentro de la va homofermentativa el Lacto)acillus del)ruec,ii, es uno de los que
reporta mejores rendimientos en cido lctico, adems con unas necesidades muy
pequeas de pasteurizacin, debido a los bajos valores de pH en que se produce
esta fermentacin, asociados con los pocos problemas de contaminacin permiten
un control desde el punto de vista microbiolgico adecuado, para que el proceso
33
se pueda llevar bajo condiciones de laboratorio y pueda ser despus extrapolado a
un proceso industrial [17].
Segn su tipo de fermentacin los Lacto)acillus han sido divididos en tres
subgrupos mayores (Tabla 7):
T'71' G; Caractersticas en subgrupos del genero Lacto)acillus.
C')'/3&)$43-/'4 E49&/-&
DNA
A 2*1 CGC
B
H*2*+&)2&%3'3-?'
Mayor produccin de cido lctico (>85% partiendo de
glucosa) No hay formacin de gas partiendo de la
glucosa; hay presencia de aldolasa.
(1) Temperatura optima 45 C y no debe ser menor a L. cidop+ilus
34
37
15 C, Largas cadenas; Glicerol y cido teicico. L. del)ruec,ii
49
51
(2) Temperatura ptima 15 C variable a 45 C, cortas L. casei, y
cadenas de microorganismos y corineformes, hay L. plantarun
45
46
presencia de ribitol, glicerol y cido teicoico; y se puede
producir mucha fermentacin oxidativa como producto del L. cur*atus
42
44
oxgeno presente.
H&3&)*+&)2&%3'3-?'
(3) Produce alrededor del 50% de cido lctico partiendo L. fermentum
52
54
de glucosa; produce etanol y CO
2
; ausencia de aldolasa; L. )re*is, y
fosfoketolasa presente. Largas y pequeas cadenas; L. )uc+neri
44
47
glicerol y cido ticico. L. ,efir
41
42
F,&%3&< BROCK Thomas; MCHAEL T; JOHN M and JACK P., Biology of Microorganisms, 7th edition.
Prentice Hall. p 367-368,794-799.
34
1.3 MEDIO DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que generan las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos [27].
Los microorganismos necesitan carbono, nitrgeno, minerales, a veces factores de
crecimiento, agua y s son aerobios oxgeno, para formar su biomasa y como
fuente de energa para el mantenimiento celular y la biosntesis del producto de su
metabolismo.
La composicin elemental de la mayora de los microorganismos es muy similar y
en consecuencia puede utilizarse como punto de partida para disear un medio de
fermentacin ptimo. Los valores tpicos de los componentes necesarios son:
C = 45 % en peso
H = 7 % en peso
O = 33 % en peso
N = 10 % en peso
S = 2,5 % en peso
Algunos microorganismos crecen en un medio que no necesitan factores de
crecimiento, mientras que otros necesitan medios complejos que contengan
nutrientes especficos como aminocidos, vitaminas o nucletidos; sin embargo
los organismos que no necesitan estos suplementos tienen frecuentemente
velocidades de crecimiento ms elevadas en medios complejos. Prcticamente en
todas las fermentaciones industriales el carbono suministra la energa para el
crecimiento y para la biosntesis. La cantidad de carbono necesaria en condiciones
aerbicas, puede determinarse a partir del coeficiente de rendimiento de biomasa.
35
C')7*I-()'3*4; Los carbohidratos son polihidroxialdehidos, polihidroxicetonas
o sustancias que pueden producir este tipo de compuestos al hidrolizarse.
En una fermentacin los carbohidratos ms utilizados son los azcares simples,
como sacarosa o glucosa, ya que la utilizacin de almidn, celulosa o
lignocelulosa implica la hidrlisis para desdoblarlo en azcares reductores.
La sacarosa: se utiliza en forma cristalina o en forma bruta como zumos o
melazas, subproducto de la manufactura de azcares [27].
La celulosa: presente en la madera, es usualmente combinada con la
hemicelulosa y la lignina en forma de lignocelulosa. La lignina hace a la celulosa
resistente al ataque microbiano y hasta ahora los mtodos qumicos y enzimticos
que convierten la lingnocelulosa en azcares fermentables no son econmicos.
La glucosa: se obtiene usualmente en los medios de fermentacin, a partir de la
conversin enzimtica directa del almidn.
1 Nitrgeno. Las fuentes ms importantes de nitrgeno para la fermentacin
son el amoniaco, los nitratos, la urea y el nitrgeno presente en los cereales,
races y subproductos de estos.
2 A.,+)&; El azufre puede ser suministrado mediante pequeas cantidades
de nutrientes como Na
2
SO
4
, MgSO
4
y H
2
S. Se debe considerar que al agregar
sulfato de magnesio se est adicionando no slo el azufre necesario sino tambin
el magnesio que es un nutriente til en la produccin de cido lctico.
En general los requerimientos de nutrientes que deben estar en la composicin de
un medio de cultivo para brindar el equilibrio entre crecimiento y biosntesis puede
ser suplido por diferentes compuestos segn su elemento esencial [6].
36
Algunos requerimientos nutricionales de los microorganismos son mostradas en la
Tabla 8.
T'71' J; Requerimientos de nutrientes de los microorganismos y formas comunes de
satisfacerlos en cultivos.
N,3)-&%3&
F*)2' K,$2-/' 4,2-%-43)'(' '1 2&(-* (&
/,13-?*
Orgnico: Medios definidos = glucosa, acetato,
piruvato, malato, cientos de otros compuestos.
Carbono Medios complejos = extracto de levadura, extracto
de carne de res, peptona; muchos otros extractos.
norgnico: CO
2
, HCO
3
.
Nitrgeno
Orgnico: Aminocidos, bases nitrogenadas
norgnico: NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
, KNO
3
, N
2
Fsforo KH
2
PO
4
, Na
2
HPO
4
Azufre Na
2
SO
4
, H
2
S
Potasio KCl, K
2
HPO
4
Magnesio MgCl
2
, MgSO
4
Sodio NaCl
Hierro FeCl
3
, Fe(NH
4
)(SO
4
)
2
, quelatos de hierro
Micronutrientes COCl
2
, ZnCl
2
, CuCl
2
, MnSO
4
, Na
2
SeO
4
F,&%3&< BROCK Thomas; MCHAEL T; JOHN M and JACK P., Biology of Microorganisms, 7th edition.
Prentice Hall. p 367-368,794-799.
5;3;5 P)&9')'/-0% (&1 2&(-* (& /,13-?*; En la actualidad la mayora de los
medios de cultivo se encuentran comercializados normalmente bajo la forma de
liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparacin de un medio de
cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y
redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores de crecimiento) siguiendo las
instrucciones del fabricante y esterilizando en autoclave.
37
Antes de su esterilizacin, los medios lquidos en caldo se distribuyen en los
recipientes adecuados (tubos o matraces); en ningn caso la altura del lquido en
el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de ste.
El uso de diversos medios semislidos comerciales que difieren en las fuentes de
carbono y nitrgeno, aporta la identificacin de los componentes propios del medio
que suplen las necesidades qumicas de los microorganismos para llevar a cabo
su crecimiento y desarrollo normal.
La Tabla 9 presenta la composicin de algunos medios de cultivo y las
condiciones necesarias para su manejo.
T'71' ; Medios de Cultivo.
M&(-* (& /,13-?* C*29*4-/-0% C*%(-/-*%&4
Peptona 15 g
CALDO NUTRTVO
Extracto de levadura 3
g pH : 4,5 0,2
Cloruro sdico 6
g Temp. Optima 30 C.
D(+) glucosa 1
g
Maltos
a
tcnic
a
12,7
5
g
,
pH : 4,8 0,2
EXTRACTO DE MALTA dextrin
a
2,75
g,
glicerin
a Temp. Optima 30 C.
2,35 g, peptona 0,78
g
,
Medio Comercial 65 g/L
agar 15 g.
Nitrgeno aminico 3,5
%
pH : 6 - 7
Triptfano 1
2% PEPTONA UNVERSAL Term. Optima 30 C
cenizas de sulfato 15 %.
compuestos fosforados
1%
EXTRACTO DE
Extracto de levadura 5
g, pH : 6,5 0,2
Glucosa 10 g, Temp. Optima 32 C
LEVADURA
agar-agar 20 g Medio comercial 65 g/L
EXTRACTO DE Bacto Peptona Temp. Optima 30 C
PROTENA
F,&%3&< Merck. Manual de medios de cultivo, 1996.
38
1.4 MODELAMIENTO CINTICO
Se define la fermentacin como aquel proceso en el que un sustrato es
transformado en un producto bajo la accin de microorganismos, dicho proceso se
lleva a cabo en condiciones determinadas que favorecen este accionar. Durante la
fermentacin el sustrato se consume, los microorganismos crecen y se multiplican
y el producto se forma. La biocintica de las fermentaciones estudia los procesos
de consumo de sustrato, de formacin de biomasa y de biosntesis de productos.
En la industria la mayora de las fermentaciones son por lotes (cultivo batch) y se
realiza en aparatos generalmente cilndricos, que garantizan las condiciones
ptimas para obtener los ms altos rendimientos de producto. Estos aparatos se
llaman reactores biolgicos o biorreactores, y existen muchas variaciones entre
ellos, todas adaptadas a necesidades prcticas particulares [11].
Los procesos de fermentacin que transcurren dentro de los biorreactores son
bastante complejos, ya que involucran procesos biocinticos, de transferencia de
masa y de calor, y en caso de biorreactores de gran tamao, fenmenos
hidrodinmicos [18].
Para analizar el rgimen de trabajo de los biorreactores y su diseo, es necesario
entonces utilizar modelos matemticos. El modelo matemtico es desarrollado
partiendo de un rgimen ideal de mezclado y a partir de ecuaciones diferenciales
consistentes para la biomasa, el sustrato y el producto.
Una de las principales etapas del modelamiento de un reactor biolgico es la
etapa de elaboracin del modelo biocintico. La ecuacin para la acumulacin de
biomasa esta basada regularmente en el modelo de Monod, el cual describe la
velocidad de crecimiento del microorganismo y la influencia sobre ste de las
condiciones del medio.
39
Los microorganismos toman los nutrientes del medio y lo utilizan para llevar a
cabo todas sus funciones metablicas: mantenimiento, crecimiento, reproduccin y
biosntesis de metabolitos. En muchos casos el producto de las fermentaciones
industriales es la biomasa, pero en la gran mayora de los esquemas de
produccin de sustancias de alto valor agregado por fermentacin, una vez que se
verifica el crecimiento de la biomasa se favorece la biosntesis de un metabolito
como producto.
Los productos comerciales fermentados son clasificados por Scragg
2
en tres
casos [16] :
1) En el primer caso, el microorganismo elabora el producto, el cual permanece
intacto y puede ser un cido orgnico, un alcohol, una enzima u otra protena,
un aminocido, una vitamina o un antibitico.
2) En el segundo caso, el producto es el mismo microorganismo. Por ejemplo la
levadura de panadera y algunas vacunas.
3) En el caso final, el microorganismo convierte durante un proceso de
biotransformacin una sustancia en otra de mayor rentabilidad econmica, tal
es el caso de los esteroides.
5;!;5 M*(&1*4 /-%L3-/*4 (& 9)*/&4*4 4-291&4; El proceso de planteamiento del
modelo matemtico de una fermentacin, usualmente proviene de un esquema
simplificado de la reaccin derivada del conocimiento de la ruta metablica
involucrada. Cada etapa de la reaccin metablica es caracterizada por la
reaccin estequiomtrica en un lado y por el flujo de transferencia, representado
por la velocidad de reaccin, en el otro. sta ltima etapa es generalmente
2 Scragg, A. H. Aerobic batch culture of acc+aromyces cere*isiae using 2% glucose as a carbon source in
Biorreactors in Biotechnology, 1991. Citado por HENSRSAK, Patcharee. "Scale up the use of a microbubble dispersion to
increase oxygen transfer in aerobic fermentation of Baker's yeast". Tesis instituto Politcnico de Virginia. Estados Unidos,
1997.
40
aproximada por el uso de una de las relaciones derivadas de la teora de enzimas
o reacciones qumicas. La Tabla 10 resume las relaciones ms frecuentemente
empleadas para describir la dinmica de un sub-sistema metablico individual.
T'71' 50; Resumen de las relaciones frecuentemente usadas para expresar cinticas
simples en el modelo de simulacin de procesos de fermentacin.
T-9*
R&1'/-0%
F&%02&%
* P')3-/,1')-('(&4 (&1 2*(&1*
/*%3)*1'%3
&
/-%L3-/*
1
r
1
=
S
Relacin lineal entre la velocidad del
Difusin fenmeno y la concentracin del sustrato.
Propio de procesos de eliminacin celular.

Derivado de la obtencin de isotermas de

2
r
2
=
S
Adsorci
n
absorci
n
sob
re
superfici
es slidas.
fsica Caracterstico de la mayora de las
reacciones hidrolticas.

S
Modelo tpico para
proceso
s de
3
r
3
= Quimisorcin fermentacin. Quimisorcin de un sustrato
K
s
+
S
sobre un sitio activo tal como la molcula de
una enzima.
4
r
4 =

S

Quimisorcin
Modificacin del caso previo, donde ms de
un sitio activo est presente por molcula
K
s
+ S biocataltica.
r
5
= [1 exp( S K
s
)]
nterpretacin fsica del movimiento de un
5 Fuerzas
d
e punto de masa a un circunvecino.
disipaci
n ncorporacin de trazas de elementos a la
clula o a la pared celular.
r
6
= exp( S K
s
)
Modificacin del tipo anterior, solucionado a
6
Disipaci
n partir de condiciones de frontera diferentes
fsica en la trayectoria metablica. nhibicin
incierta
.
7
s
Bloque reversi hipottico lo sitio

K o ble de s s
r
7 =
nhibici
n activos por quimisorcin de un sustrato.
K
s
+
S
Retro-alimentacin negativa en el esquema
metablico.
r
8 =

K
s
Variante del tipo r
6
, derivado de la inhibicin
8
nhibici
n
de un gran nmero de sitios activos de
K
s
+ S reaccin. Caracterstico de procesos de
cuello de botella.
F,&%3&< QUNTERO R., Rodolfo. Ambientes computacionales para el diseo, optimizacin e innovacin en
procesos biotecnolgicos, 1997. C-3'(* 9*)< MONTOYA G.,Didier A. Y BERMDEZ S., Mnica Y.
Modelamiento de la transferencia de oxigeno para el cultivo de microorganismos en un biorreactor de
columna de burbujeo. Universidad Nacional de Colombia. Manizales 2003.
41
Donde:

= constante de velocidad mxima de reaccin a concentracin
infinita de reactante [s
-1
].
K
s

= constante del sustrato en [kg / m
3
].
= parmetro cintico estipulado para el proceso.
S = concentracin del sustrato en [kg / m
3
].
La cintica de la mayora de las reacciones enzimticas se representa
razonablemente bien mediante la ecuacin de 0ic+aelis%0enten (tipo 3), la cual no
exhibe las limitantes e imprecisiones de representaciones como las de Eisenthal y
Cornish-Bowden [31].
5;!;2 M*(&1*4 (& /)&/-2-&%3* 2-/)*7-'1; El crecimiento de clulas microbiales
puede ser visto desde varias perspectivas y con diferentes grados de complejidad,
dependiendo si distinguimos entre clulas individuales dentro de un reactor o ya
sea que examinemos la reaccin metablica individual ocurriendo dentro de la
clula. Si bien el modelo ms realista del crecimiento de una poblacin microbial
considera todas las ecuaciones que ocurren al interior de cada clula y las
variaciones de clula a clula en la poblacin, un modelo como este puede
resultar inmanejable. Debemos hacer algunas simplificaciones, la magnitud de
stas depende del propsito del modelo a utilizar.
Se deben hacer las siguientes distinciones en la descripcin de los modelos de
crecimiento celular. Cuando la poblacin esta diferenciada dentro de clulas
individuales que son dismiles una de otra en trminos de alguna caracterstica
distinguible, el modelo es "se-re-ado. Por otro lado, el modelo "no se-re-ado
considera la poblacin como un conglomerado (cmulo) dentro de una "biofase la
cual interacta con el ambiente externo, y puede ser vista como una "especie en
solucin, as la concentracin celular es descrita por una sola variable. Los
modelos no segregados tienen la ventaja que son matemticamente simples.
42
La utilidad de los modelos segregados depende de la habilidad experimental para
distinguir las clulas dentro de una poblacin. Con frecuencia esto es dificultoso.
La consideracin de los detalles de las reacciones que ocurren al interior de la
clula, lleva al concepto de estructura. Los modelos estructurados consideran las
reacciones individuales o grupos de reacciones que ocurren dentro de la clula;
mientras que los modelos no estructurados simplemente analizan la clula como
un ente en solucin el cual interacta con su entorno.
Un nivel adicional de complejidad resulta cuando se considera que los modelos
pueden ser de naturaleza aleatoria o determin1stica. Un modelo aleatorio
considera la distribucin de la clula por caractersticas de inters, por ejemplo, el
tiempo de generacin de una poblacin celular puede originarse de diferentes
muestras de tiempos de generacin de clulas individuales en una poblacin y
calcular una distribucin de tiempos de generacin basados en la muestra.
El modelo aleatorio, sin embargo es solamente til para situaciones en las cuales
el nmero de clulas es muy pequeo y la distribucin de las caractersticas
celulares llegan a ser importantes. Por otro lado, los modelos determinsticos
ofrecen salidas que son completamente determinadas por las variables de entrada
del modelo y en consecuencia, no son consideradas las variaciones aleatorias en
las propiedades del sistema.
Los modelos determinsticos son los ms comunes y tiles y slo se consideraran
modelos semejantes en las siguientes secciones [42].
5;!;3 F'4&4 (&1 /-/1* (& /)&/-2-&%3* &% ,% /,13-?* 9*) 1*3&4; Cuando las
clulas microbiales son inoculadas en un reactor por lotes que contienen un medio
de cultivo fresco y su incremento en la concentracin es monitoreado, se observan
diferentes fases de su crecimiento.
43
Hay una fase de retardo (latencia) inicial, la cual es de duracin variable. Esta es
seguida por la fase de crecimiento e2ponencial, donde el nmero de clulas (en
base seca) incrementa exponencialmente. Esta es tambin conocida como la fase
logartmica, cuyo nombre proviene del mtodo comn de graficacin del logaritmo
del nmero de clulas frente al tiempo.
Posteriormente hay una corta fase de declinamiento en la fase de crecimiento y se
establece la fase estacionaria, en donde el nmero de clulas es el mayor
alcanzado durante el proceso.
Finalmente el nmero de clulas decrece durante la fase de muerte. Estas fases
son ilustradas en la Figura 3.
F-6,)' 3; Curva tpica de crecimiento celular.
fase exponencial
o de crecimiento fase estacionaria
X [ g / L ]
fase de muerte
fase latente
t [ s ]
tla- te2p
t
s
La fase de latencia es el resultado de diversos factores. Cuando las clulas son
sembradas en un medio fresco, cofactores a nivel intracelular, vitaminas
aminocidos y iones ( Mg
2+
, Ca
2+
, etc) son transportados a travs de la membrana
celular con lo que sus concentraciones en el medio pueden decrecer
apreciablemente. Si se requiere intermediarios para las rutas metablicas de la
actividad enzimtica, la dilucin de estos reduce la velocidad a la cual operan
44
dichas rutas. Las clulas deben metabolizar las fuentes de carbono disponibles a
fin de reabastecer su energa intercelular antes de iniciar la divisin celular.
gualmente si el inculo esta creciendo en un medio que contiene una fuente de
carbono diferente a la del nuevo medio, las nuevas enzimas requieren ser
inducidas a catabolizar el nuevo sustrato, lo que tambin contribuye a el retardo en
el crecimiento celular. El punto en el ciclo de crecimiento desde el cual el inculo
es extrado, tambin es importante. Las clulas tomadas de la fase exponencial y
usadas como inculo, generalmente presentan una fase de latencia menor que las
tomadas de fases posteriores. Este inculo extrado de la fase exponencial tiene
concentraciones adecuadas de intermediarios y puede no sufrir el efecto dilucin.
Si un inculo es sembrado en un medio "rico, con un contenido de aminocidos y
fuentes de carbono y nitrgeno complejas, el resultado es una corta fase de
latencia debido a que los intermediarios estn ya provistos en el caldo.
Cuando las clulas son sembradas en un medio que contiene diversas fuentes de
carbono, puede obtenerse diferentes fases de latencia. Esto es conocido como
"crecimiento diauxico. La clulas usan preferiblemente una fuente de carbono
antes de consumir la segunda, debido a la represin catablica que las enzimas
experimentan al metabolizar la segunda fuente de carbono; adems puede
presentarse algn tipo de inhibicin. Sonnleithert y K!ppeli [35] explican en detalle
fenmenos como inhibicin por sustrato, represin catablica, inhibicin por
producto y efecto glucosa basados en el estudio de levaduras.
La divisin celular ocurre en la fase exponencial. La velocidad a la que incrementa
el nmero de clulas (N) es proporcional al nmero de clulas iniciales. Las
clulas incrementan mediante una progresin geomtrica 2
0
, 2
1
, 2
2
...2
m
hasta m
divisiones. Por ejemplo si el numero de clulas iniciales es N
0
, el numero despus
de m generaciones es 2
m
N
0
.
45
En vez del nmero de clulas, con frecuencia es ms conveniente usar el peso de
clulas secas por volumen (X) como una medida de la concentracin celular.
Durante la fase exponencial en un reactor por lotes la variacin de la biomasa se
describe por:
dx
= X
(1.1)
dt
Donde es la velocidad de crecimiento especifico de las clulas.
La ecuacin anterior puede
integrar
se
desd
e el final de la fase
de
latencia
( X=X
0
y t=t
lag
) para cualquier punto en la fase exponencial (X,t).
(t
tlag )
X
= (t tlag ) X = Xo e 0 ln (1.2)
X
o
El tiempo requerido por el nmero de clulas o peso seco para duplicarse,
conocido como tiempo de duplicacin t
d
, esta relacionado con la velocidad de
crecimiento especifico por:
t
d
=
ln 2
(1.3)

Ocasionalmente se da que el tiempo duplicante para el nmero de clulas y las

clulas en peso seco difieren, como resultado de la inconsistencia de la masa
celular por clula. Sin embargo, se puede definir la velocidad del crecimiento
especifico del nmero de clulas ( en h
-1
) separadamente de ( ) como sigue:
v =
1
d
N
=
1
dX (1.4)
N
dt
X
dt
Cuando y son iguales, se dice que se tiene un crecimiento )alanceado. En el
cual existe un adecuado abastecimiento de todos los nutrientes no limitantes del
desarrollo celular, tal que la composicin de la clula permanece constante, an
cuando la concentracin de todos los otros nutrientes (limitantes) decrecen.
46
Por otro lado, cuando el crecimiento no es balanceado, ocurren variaciones en la
composicin de la clula (contenido de protenas, viabilidad, etc). Si bien la
velocidad de crecimiento del nmero de clulas puede ser constante, la velocidad
de crecimiento de la masa celular es variable.
A bajas concentraciones de nutriente, se establece que la velocidad de
crecimiento especfica depende de la concentracin de nutrientes. A altas
concentraciones, la velocidad de crecimiento especfica alcanza valores mximos,
fijados por la cintica intrnseca de las reacciones intracelulares, las cuales estn
relacionadas en la trascripcin y traslacin del DNA. El final de la fase exponencial
se presenta cuando algn nutriente esencial, por ejemplo la fuente de carbono o
nitrgeno es agotado, o cuando un metabolito txico se acumula a un nivel
suficiente como para inhibir el crecimiento.
Aun si son empleadas muy altas concentraciones de nutrientes, la acumulacin de
metabolitos txicos limita la concentracin de las clulas que pueden llegarse a
alcanzar en la fase exponencial. En un biorreactor por lotes esta limitacin puede
superarse reteniendo las clulas por filtracin, tambin manteniendo un flujo
continuo de nutrientes y remocin de los productos.
Concluida la fase exponencial, la velocidad de crecimiento decrece
(declinamiento) lo que es seguido por la fase estacionaria. La duracin de la fase
estacionaria puede variar con el tipo de clula, las condiciones previas al
crecimiento etc. Algunas clulas pueden liberar o producir nutrientes que pueden
ser consumidos por otras clulas y as mantener la poblacin celular.
Finalmente est la fase de muerte, En sta fase las clulas cesan la liberacin de
nutrientes y la poblacin decrece. Los metabolitos intracelulares son barridos por
diferentes sistemas de enzimas dentro de la clula y los metabolitos txicos se
acumulan.
47
La velocidad a la que declina el crecimiento es tambin exponencial y puede
representarse mediante la ecuacin:
dX = K
d
X (1.5)
dt
Los modelos de mayor importancia son los que relacionan la velocidad de
crecimiento especifica ( ) con la concentracin de sustrato y otras variables
externas. La simplificacin de estos no consideran las diversas fases del ciclo de
crecimiento, pero predicen la velocidad de crecimiento en la fase exponencial. Es
posible considerar modelos mas complicados.
5;!;! M*(&1*4 (& /)&/-2-&%3* %* &43),/3,)'(*4; Las relaciones simplificadas
que describen el crecimiento exponencial son modelos no estructurados. Estos
modelos analizan la clula como una simple especie en solucin y describen la
cintica del crecimiento celular basados en los perfiles de concentracin de las
clulas y los nutriente. Los primeros modelos que se desarrollaron para el
crecimiento celular no tienen en cuenta la dependencia de la velocidad de
crecimiento exponencial con la concentracin de nutrientes. Tales modelos tienen
hoy da aplicabilidad cuando el sustrato limitante del crecimiento no esta
identificado. El modelo ms simplificado es el Malthus descrito como:
r
X
= X
(1.6)
Donde r
x
es la velocidad volumtrica de incremento celular en peso seco (el cual
puede abreviarse como DCW) en g DCW / L-h y (h
-1
) es constante. Este modelo
predice un crecimiento ilimitado con el tiempo (crecimiento "Malthusiano).
Segn Blanch y Douglas [5], para proveer de un recurso que limitara el
crecimiento, Verlhulst (1844) y despus Pearl y Reed (1920) propusieron la adicin
de un trmino inhibidor el cual es dependiente de la concentracin celular:
48
r
X
= kX(1 X)
(1.7)
El cual para un sistema por lotes puede escribirse como:
d
X
= r
X y as
X
=
X
o
e
kt
(1.8)
dt
1 X
o
(1
e
kt
)
Donde X=X
0
a t=0. Este resultado es conocido como la ecuacin lo-1stica. La
mxima concentracin celular alcanzada en tiempos largos es 1/ , y la velocidad
inicial de crecimiento es aproximadamente exponencial. El parmetro es por lo
general considerablemente menor que la unidad.
5;!;" E1 2*(&1* (& M*%*(; Uno de los modelos simplificados que incluye el
efecto de la concentracin de nutrientes es el modelo desarrollado por Jacques
Monod, basado en observaciones del crecimiento de !. Coli en varias
concentraciones de glucosa. Este modelo asume que slo un sustrato (el sustrato
limitante de la velocidad del crecimiento, S) es relevante en la determinacin de la
velocidad de proliferacin de la clula. La forma de la ecuacin de Monod es
similar a la cintica enzimtica de Michaelis-Menten; si en realidad el transporte
del sustrato a la clula es limitado por la actividad de una permeasa, el crecimiento
celular puede ser descrito de la forma:
=

max
S
(1.9)
K
s
+
S
As para un crecimiento por lotes a un volumen constante:
dX
=

max
S
X (1.10)
dt
K
s
+
S
Donde
max
es la velocidad especfica mxima de crecimiento de las clulas y K
s

la constante del sustrato, que es el valor de la concentracin de nutriente cuando
la velocidad de crecimiento especfica est a la mitad de su mximo valor.
49
Esta ecuacin presenta dos formas de limitante. A concentraciones altas de
sustrato, S >> K
s
y la ecuacin anterior se reduce a una ecuacin con
dependencia de orden cero en relacin a la concentracin de sustrato. A
concentraciones bajas, S << K
s
lo que resulta en una dependencia de primer
orden.
=
max
para S >> Ks y =

max
S para S << K
s
K
s
Los resultados tpicos de la dependencia de la velocidad especfica de crecimiento
con la concentracin de sustrato son representados en la Figura 4
F-6,)' !; nfluencia de la concentracin de substrato limitante en la velocidad de
crecimiento especfico.
Los valores de
max
varan con el tipo de microorganismo y el valor de K
s
depende de la naturaleza del sustrato. Burgos Rubio et.al .[7], establecieron una
gran variedad de mecanismos en la descripcin y anlisis de las rutas metablicas
para la conversin de diferentes sustratos a cido lctico y clulas. De igual
manera plantearon ecuaciones para diferentes factores de inhibicin. La Tabla 11
resume los valores de y K
s
obtenidos en su trabajo.
50
T'71' 55; Parmetros cinticos en experimentos batch a 42C y pH 5,6 usando L.
)ul-aricus.
S,43)'3*
V&1*/-('( (& R&%(-2-&%3* (& /)&/-2-&%3* T-&29* (&
/)&/-2-&%3*
D6 /&1 > 6 4,43)'3*E
)&4-(&%/-'
&49&/$+-/* DI
M5
E DIE
Lactosa 0,98 0,097 7,5
Glucosa 0,96 0,093 8,0
galactosa 0,76 0,081 9,5
F,&%3&< BURGOS-RUBO, Concepcin N.; OKOS, Martn R.; WANKAT, Phillip C. "Kinetic study of the
Conversion of Different Substrates to Lactic Acid Using Lacto)acillus )ul-aricus3. Biotechnol. Prog.
2000, 16, p 305 314.
Los valores de K
s
son generalmente bastante pequeos, lo que implica que la
velocidad especfica de crecimiento permanece cerca de su mximo valor durante
gran parte del periodo de crecimiento por lotes. Esta aparente dependencia de
orden cero con la concentracin de sustrato justifica el termino "crecimiento
exponencial.
Con el propsito de lograr la representacin de los datos experimentales con un
mayor grado de ajuste, diferentes investigadores han propuesto otros modelos
como alternativa a la ecuacin de Monod. Entre ellos se encuentran el modelo de
Moser; modelo de Contois y Fijomoto; modelo de Teissier; modelo de Konak;
modelo de Kargi y Shuler; modelo de Meyrath [4, 12].
5;!;# O3)*4 2*(&1*4 /*%43-3,3-?*4 (&1 /)&/-2-&%3* /&1,1');
Modelo cintico del consumo de sustrato. Las clulas consumen sustrato
del medio ambiente y lo canalizan en diferentes rutas metablicas. Parte del
sustrato puede utilizarse directamente en el crecimiento y en la sntesis de
producto, mientras que otra parte se utiliza para generar la energa necesaria
para las actividades de mantenimiento. El sustrato requerido para el
mantenimiento vara considerablemente dependiendo del organismo y del medio
de cultivo.
51
De este modo, una estimacin completa del consumo de sustrato debe incluir un
componente de mantenimiento. La velocidad especfica de consumo de sustrato
para actividades de mantenimiento se conoce como el coeficiente de
mantenimiento, m
s
.
Tanto para cultivos en los que no existe formacin de producto extracelular (por
ejemplo en la fabricacin de levadura de panadera y de protenas de origen
unicelular), donde se supondr que todo el sustrato que entra a la clula se utiliza
para el crecimiento y funciones de mantenimiento, como para modelos en los que
el producto est asociado con el crecimiento microbiano, las velocidades de
consumo de sustrato, crecimiento celular y mantenimiento se relacionan de la
siguiente manera:
r
S
=
dS
=

1
d
X
+ m
s
X
(1.11)
Y
X S
dt dt
En cultivos con formacin de producto no asociada con el crecimiento microbiano,
la relacin entre las velocidades (consumo de sustrato, crecimiento celular,
formacin de producto y mantenimiento) es:
d
S
1
d
X r
P (1.12)
r
S
=
=
+
+
m X
d
t
Y
X S
dt
Y
P /
S
Donde r
P
y Y
P/S
, velocidad de formacin de producto y rendimiento de sustrato en
producto respectivamente, son tratados posteriormente.
En la ecuacin (1.12), Y
X/S
es el rendimiento de sustrato en biomasa, el cual
provee una medida de la eficiencia del nutriente para soportar biosntesis. Su valor
elevado favorece la productividad del proceso y disminuye el costo de remocin de
calor. Este coeficiente economtrico da la idea de cunta biomasa se puede
formar por cada unidad de masa del sustrato.
52
Generalmente, cuando el sustrato es el factor limitante del crecimiento, la cantidad
de biomasa producida es proporcional a la cantidad de fuente de carbono
consumida y su rendimiento en sustrato puede definirse de la siguiente manera:
Y
X / S
=

X
=
X
X
o (1.13)

S
S
S
o
Siendo X
o
y S
o
las concentraciones iniciales de biomasa y sustrato,
respectivamente.
1 Modelo cintico de la formacin de producto. De acuerdo con la relacin
cuantitativa entre la cantidad de producto y el crecimiento de biomasa puede
darse el caso que la formacin de producto est directamente asociada con el
crecimiento, que no haya una relacin entre el crecimiento y la formacin de
producto o que exista una relacin parcial entre el crecimiento y la formacin de
producto[12].
2 ormacin de producto asociada al crecimiento micro!iano. Algunas
de las ecuaciones que describen la formacin de producto son:
r =
d
P =
Y
d
X
(1.14)
d
t P
P / X
dt
r
P
=
Y
P
/ S
d
S
d
t (1.15)
Donde Y
P/S
es el rendimiento de sustrato en producto y Y
P/X
es el rendimiento de
biomasa en producto, los cuales se definen como:
Y
P / S
=

P
=
P
P
o (1.16)

S
S
o

S
5
3
Y
P / X
=

P
=
P
P
o
(1.17)

X
X
X
o
Siendo Po la concentracin inicial del producto.
ormacin de producto no asociada al crecimiento micro!iano.
Generalmente, esta cuantificacin es una tarea difcil. En algunos casos se ajusta
a los datos obtenidos experimentalmente.
La expresin se da como:
r
P
= X K
P (1.18)
Donde:
r
P
= velocidad de formacin de producto
K
P
= constante de velocidad para formacin de producto [g
producto
/ (g
clulas
. h)]
ormacin de producto parcialmente asociada al crecimiento. El modelo
propuesto por Luedeking y Piret es una combinacin de las ecuaciones. (1.18) y
(1.14) .
r
P
=
dP
= Y
P
X
d
X + X K
P (1.19)
dt
d
t
54
2. DISENO METODOLGICO
LUGARES DE TRABAJO
"rocedimientos micro!iolgicos; Reconstitucin y activacin del
microorganismo Laboratorios de bacteriologa de la Universidad Catlica.
#eterminacin del crecimiento celular. Laboratorio Anlisis de Aguas y
Alimentos.
$tapa e%perimental &fermentacin'. Laboratorios de Procesos Productivos de la
Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales.
2.1 MATERIALES Y EQUIPOS
T'71' 52; Materiales empleados en el procedimiento experimental para la obtencin de
cido lctico a partir de jarabe de glucosa..
R&'/3-?*4 C'4' /*2&)/-'1
Glucosa Carlo Erba al 99,9%
cido lctico Galactic (Anexo B)
Jarabe de glucosa
ndustrias del Maz
(Maizena).
Extracto de protena (Bacto

pectona) Difco
Extracto de levadura Difco
Extracto de malta Oxoid
Carbonato de calcio Grado reactivo
Hidrxido de sodio Carlo Erba grado reactivo
Fosfato de potasio Grado reactivo
Fosfato amonico Grado reactivo
cido Dinitro Saliclico ( DNS) Carlo Erba grado reactivo
Tartrato de sodio y potasio Mol Labs grado reactivo
Bisulfito de sodio Carlo Erba grado reactivo
cido sulfrico Grado reactivo (puro)
Caldo MRS Merck
Agar MRS Merck
Glicerol al 10% Grado reactivo
55
En la Tabla 13 se presenta la composicin del caldo y agar de MAN ROGOSA
SHARPE (MRS) para el enriquecimiento del cultivo y aislamiento de todas las
especies Lacto)acillus [23].
T'71' 53; Composicin del caldo y agar MRS
CALDO DE
COMPOSICIN A 6 >L B
PREPARACIN
CULTIVO
Peptona universal 10,0
Disolver 50 g/L,
esterilizado en
Extracto de carne 5,0
Caldo MRS
autoclave (15 minutos
a
Hidrogeno fosfato
dipotasico
2,0
121-124C), con un pH
de 6,5,
Tween 80 1,0
Hidrogencitrato diamnico
2,0 Disolver 62 g/L,
Acetato sdico 5,0 esterilizado en
Agar MRS
Sulfato de magnesio 0,1
autoclave (15 minutos
a
Agar-agar 12,0 (ausente en
el 121-124C), con un pH
calo MRS). de 5,5,
F,&%3&< Merck. Manual de medios de cultivo, 1996.
C&9' ,3-1-.'('. La cepa utilizada fue Lacto)acillus del)ruec,ii su)especie
4)ul-aricus5, suministrada por el Departamento de Agricultura de los Estados
Unidos. En el Anexo C se suministra la informacin sobre los contactos
respectivos de ste laboratorio.
2;5;5 EK,-9*4 (& '%=1-4-4;
1 Espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 20 (Rango 200-1100 nm)
2 pH-metro Schoot Handy Lab 1 (Precisin 0,1 unidades de pH)
56
1 Refractmetro Extrech, escala 0 32 Brix
2 Cmara de neubauer
2;5;2 EK,-9*4 (& 9)*/&4*;
1 Biofermentador P 100 / P 140 / P 310
2 Balanza Analtica Kern (Precisin 0,1 mg)
3 Bao termostatado Eterna con control PD (Rango 0-200C y precisin 0,1C)
4 ncubadora
5 Autoclave
6 Cmara de anaerobiosis
7 Nevera casa
2.2 MTODOS
2;2;5 ML3*(*4 A%'1$3-/*4; Se utilizaron procedimientos analticos para la
caracterizacin del jarabe de glucosa, determinacin de azcares reductores y
cido lctico.
Caracteri(acin del )ara!e de glucosa. La Tabla 14 lista los mtodos
empleados para la caracterizacin del jarabe de glucosa comercial utilizado como
fuente de carbono para la fermentacin.
T'71' 5!; Mtodos empleados para la caracterizacin del jarabe de glucosa.
P')=2&3)*4 ML3*(*
Brix Refractometra
pH Potenciometra
Densidad [g/mL] Picnometra
Azcares Reductores (en 100 g de muestra) Espectrofotometra
57
En la Tabla 15 se registran los parmetros de la caracterizacin del jarabe de
glucosa suministrada por la empresa Super de Alimentos S.A.
T'71' 5"; Caracterizacin del jarabe de glucosa.
P')=2&3)* R&4,13'(*
Grados Brix (20 C) 82,8 83,9
Grados Baume 43 43,5
Contenido sulfitos (SO
2
) 100 250 ppm
Dextrosa Equivalente DE 38 42
pH 4,8 5,2
Viscosidad (cP) 2610
Recuento total de
microorganism
os
[UFC/g] 500 mx
Mesfilos aerobios
Recuento total levaduras y hongos [UFC/g] 250 Mx
E, Coli y Salmonella Negativo
Bacterias coliformes [NMP/g] Menor de 3
F,&%3&< ndustrias del Maz (Maizena). Cali - Colombia.
1 #eterminacin de a(*cares reductores. La curva patrn de azcares
reductores fue determinada por el mtodo colorimtrico modificado DNS (cido
dinitrosalicilico) y lectura de absorbancia en un espectrofotmetro a 540 nm, como
se seala en el (Anexo A) [26].
2 #eterminacin de +cido l+ctico. La curva patrn de cido lctico se
determin por el mtodo colorimtrico del cloruro frrico (FeCl
3
) y lectura de
absorbancia en un espectrofotmetro a 440 nm (Anexo B) [15].
58
Crecimiento celular. Se utiliz el mtodo de recuento de clulas por cmara
de Neubauer que permite determinar el nmero de unidades infectivas por unidad
de peso o volumen, como se describe en el Anexo F [39].
2;2;2 P)*/&(-2-&%3* 6&%&)'1; Con el propsito de evidenciar la obtencin de
cido lctico por fermentacin de glucosa y establecer los parmetros cinticos
involucrados en el proceso, el presente estudio fue dividido en tres fases:
1) En base a los datos reportados en la bibliografa se hizo un diseo
experimental que consisti en combinar las concentraciones de los
nutrientes del caldo de fermentacin, a fin de establecer el caldo de cultivo
que favoreciera el rendimiento en cido lctico y en consumo de glucosa.
2) Una vez determinado el mejor caldo de cultivo, se realiz en ste la
fermentacin durante un periodo de 68 h, tomando muestras cada 4 horas.
Con los datos obtenidos experimentalmente se determinaron los perfiles de
crecimiento celular, consumo de sustrato y aparicin de producto.
3) A partir de los datos experimentales se obtuvieron los parmetros cinticos
requeridos por el modelo matemtico para la simulacin del sistema de
ecuaciones diferenciales ordinarias que describen el comportamiento
terico del proceso fermentativo por lotes.
La Figura 5 presenta el diseo esquemtico global del desarrollo de la
fermentacin de jarabe de glucosa para la obtencin de cido lctico.
59
F-6,)' "; Diseo esquemtico global del desarrollo de la fermentacin
Acondicionamiento de la cepa lctica
Estudio sobre la seleccin de medios de cultivo
Mantenimiento de la cepa lctica
en medios de cultivo
ETAPA DE MANTENMENTO
Estudio
so
br
e
co
ndi
cio
ne
s
de
fer
m
e
n
t
a
c
i

n
ETAPA
DE
PRODU
CCN
Seleccin de la composicin del
medio de cultivo
Estudio
cintico
Nivel banco
Modelamiento matemtico
F,&%3&<
S
NC
H
E
Z
G
.,
V
al
e
nt
in
a;
AGUDELO M., Mara
A. Obtencin de cido
itacnico por
fermentacin con
Aspergillus Terreus.
Universidad Nacional
de Colombia.
Manizales, 1999.
La lnea punteada
indica que la etapa
de llegada
depende
directamente de
los resultados que
sean obtenidos
du
ra
nt
e
la
et
ap
a
d
e
s
al
id
a
.
Las etapas involucradas
en la Figura 5 son
detalladas a
continuacin.
60
2.3 PREPARACIN DE LA CEPA DE LACTOBACILLUS #$LB,U$C-II N,,L
B./01
Se realiz una bsqueda bibliogrfica con el fin de determinar las instituciones que
posean cepas de la bacteria Lacto)acillus del)ruec,ii especialmente seleccionada
para la produccin de cido lctico a partir de glucosa. La cepa que se obtuvo
finalmente es la de Lacto)acillus del)ruec,ii (NRRL B-763), donada por el
ministerio de Agricultura de los Estados Unidos.
Debido a que la cepa fue enviada en estado liofilizado, sta se encuentra en
estado latente e inactiva, ya que debido a la ausencia de humedad y nutrientes no
puede desarrollar su metabolismo normal. En ste estado, la bacteria puede
conservarse durante periodos prolongados de tiempo.
Para poder llevar la cepa de su estado latente a un estado donde se pueda
desarrollar y reproducir se hace necesaria la activacin de la cepa, adaptarla para
su mantenimiento en medio semislido y lquido y conservarla para su utilizacin
durante todo el estudio.
Ya que el microorganismo es incapaz de exhibir sus capacidades biosintticas
inmediatamente despus de su activacin e inclusive puede morir o modificarse,
debe realizarse una etapa de mantenimiento de la cepa con el fin de disponer de
material de siembra fresco y listo para la etapa de fermentacin.
La conservacin de la cepa es un procedimiento muy importante que permite
disponer en todo momento de la cepa original en estado latente.
La Figura 6 exhibe el diagrama de flujo para la preparacin de la cepa
Lacto)acillus del)ruec,ii, que puede ser generalizado empleando cualquier tipo de
cepa.
61
F-6,)' #; Diagrama de flujo para la preparacin de la cepa.
ACTIVACION DE LA CEPA
CEPA LIOFILIZADA
Hidratacin con agua estril
PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO
Caldo y agar MRS
ESTERILIZACIN
Se autoclava a 121 C, 15 minutos a 15 psi
INOCULACIN
Repique del material vivo al caldo
INCUBACIN
39 43 C en 48 h
CONSERVACIN
Se conserva el material a 4 C
La ejecucin global de todos los procedimientos para la preparacin de la cepa
incluye cuatro fases, las cuales se llevan a cabo en forma secuencial [41].
$sterili(acin. Una vez preparado el medio o caldo de cultivo se efecta la
esterilizacin, la cual se lleva a cabo en volmenes pequeos repartiendo el total
del volumen a esterilizar, o hasta donde sea posible en los recipientes en los que
posteriormente se realizar la inoculacin.
62
La esterilizacin se realiza en autoclave a 121C, durante 15 min a 15 psi de
presin. Considerando un tiempo global que incluya el periodo de calentamiento y
enfriamiento, se llev a cabo el proceso durante unos 30 min.
Inoculacin. Esta etapa consisti en la siembra del material vivo en el medio
de cultivo donde se va a desarrollar el crecimiento, bajo condiciones de asepsia
para evitar la contaminacin del cultivo. El procedimiento y las precauciones que
se deben tomar para dicho procedimiento se tiene en cuenta a continuacin.
1! Se desinfect previamente el mesn de trabajo con medios desinfectantes
como alcohol o hipoclorito de sodio.
2! Luego se rode el sitio con mecheros de gas, preferiblemente encendidos
con anterioridad para la desinfeccin.
3! La inoculacin se llev a cabo con aguja curva esterilizada a la flama.
4! Normas de seguridad uso de tapabocas y guantes previamente
desinfectados.
El procedimiento de inoculacin se detalla en el Anexo D.
Incu!acin. Posterior a la inoculacin, el sistema se someti a incubacin a
43 C en periodos de tiempo que dependen del rendimiento en el crecimiento de
la cepa.
P)&4&)?'/-0% del 4-43&2': Las condiciones de conservacin se garantizaron
con la exposicin del sistema a enfriamiento a 4 C inhibiendo de esta manera el
crecimiento bacteriano y la actividad enzimtica.
A continuacin se describe el procedimiento metodolgico para la preparacin de
la cepa Lacto)acillus del)ruec,ii que incluye las tres etapas que se citaron
anteriormente: activacin, mantenimiento y conservacin.
63
2;3;5 A/3-?'/-0% (& 1' /&9'. El cultivo del Lacto)acillus del)ruec,ii, se desarrollo
a partir de un liofilizado (NRRL B-763), fue activado y sembrado haciendo repiques
del material liofilizado en medio de cultivo agar y caldo MRS (De Man, Rogosa y
Sharpe; 1960). Fue incubado en cmara de anaerobiosis a 39
C por 48 h con pH entre 5,0 6,0, en el Laboratorio de Microbiologa de la
Universidad Catlica. Las colonias fueron obtenidas en agar MRS (cajas de petri)
por el mtodo de agotamiento con el objeto de purificarlas y poder tener buen
material de trabajo.
Las colonias obtenidas fueron sembradas en forma masiva en tubos con caldo
MRS para ser conservadas en nevera (4 6 C) por un tiempo de dos meses bajo
la forma de cepas madre.
En la Tabla 13 de la pgina 56 se presenta la composicin de los medios de
cultivo empleados en la activacin de la cepa.
La cepa liofilizada $""L B%&'( fue enviada dentro de una ampolleta de vidrio,
extrayendo su contenido en medio de condiciones de asepsia e incorporndolo
dentro de tubos de ensayo tapa rosca que contenan el caldo de cultivo MRS
preparado y esterilizado con anterioridad, y el cual se encontraba a temperatura
ambiente.
2;3;2 M'%3&%-2-&%3* (& 1' /&9' : 4&1&//-0% (&1 2&(-* (& 2'%3&%-2-&%3*; El
objetivo de esta etapa es la seleccin de los medios adecuados que garanticen un
material de siembra fresco y listo para la etapa de fermentacin y que brinde los
requerimientos nutricionales de la cepa lctica, en su etapa de crecimiento,
evitando la prdida de las propiedades del microorganismo ante el agotamiento de
los nutrientes.
64
Con base en las referencias bibliogrficas y en las especificaciones de la Tabla 13
pgina 56, se efectu la seleccin del medio de cultivo de Caldo MRS que
garantiza el crecimiento y el normal desarrollo del lactobacilo en su etapa de
mantenimiento.
Despus de elegido el mejor medio, se prepar diluyendo la cantidad necesaria
especificada en la Tabla 13, en un erlenmeyer con agua destilada agitando
frecuentemente para disolver por completo el reactivo (caldo MRS). A continuacin
se taparon los erlenmeyer con gasa y algodn (con el fin de evitar la
contaminacin despus de ser esterilizados) y se llevaron al autoclave a 121 C
durante 15 minutos hasta una presin de 15 psi. Cuando el erlenmeyer estuvo a
temperatura ambiente se dispusieron en tubos tapa rosca con 10 ml cada uno, se
usaron los necesarios para la inoculacin y el resto de los tubos se refrigeraron a 4
6 C para mantenerlos frescos a la hora de una prxima siembra.
El medio preparado anteriormente fue dispuesto en tubos los cuales se sembraron
con la cepa de lactobacilo, posteriormente se llevaron a incubacin a las
temperaturas recomendadas de 39 a 43 C durante 48 horas.
2;3;3 C*%4&)?'/-0% (& 1' /&9'; La conservacin de la cepa se realiz con el fin
de mantener las caractersticas fsico-qumicas de la especie, ya que ante
continuos repiques, se puede ir perdiendo o contaminarse. Adems es necesario
preservar pura la especie para posteriores trabajos.
Para la preservacin de la cepa, se prepararon tubos con medio inclinado (los que
tambin fueron esterilizados), que se sembraron e incubaron de igual manera que
la anterior. Despus de cumplido el tiempo de incubacin, los tubos de ensayo se
llenaron con glicerol estril al 10 % y se llevaron a la nevera a 4 C con el fin de
mantener la cepa viva durante todo el desarrollo del trabajo.
65
El mtodo ptimo de preservacin debe ser seleccionado para cada proceso y
cepa en particular (Anexo E).
2.4 DETERMINACIN DEL MEDIO PTIMO DE FERMENTACIN
La determinacin del medio ptimo de fermentacin se realiz utilizando un
volumen de trabajo de 100 mL en un erlenmeyer de 250 mL, con el objeto de
conservar una cabeza de aire sobre el caldo y reducir, as, la oxigenacin del
medio [29]. A partir de los resultados obtenidos en estos ensayos se establecieron
las condiciones tanto de composicin del medio como de operacin para el
montaje que se realiz en la etapa de fermentacin a nivel banco en un biorreactor
de 3 L.
Se requiere obtener la combinacin entre los nutrientes del medio de cultivo que
proporcione mayor rendimiento en la produccin de cido lctico y consumo de
jarabe de glucosa.
La seleccin de la composicin de nutrientes en el medio y la determinacin de los
factores a considerar en los ensayos experimentales, se basa en los datos de
rendimientos obtenidos en estudios anteriores, donde se demuestra que tanto la
formacin de cido lctico y la formacin de biomasa dependen directamente de la
fuente de carbono y nitrgeno y del tiempo de fermentacin.
Cuando la cepa pasa del medio de mantenimiento en el que se encuentran los
requerimientos nutricionales para su desarrollo a un estado de generacin del
producto deseado en el medio de produccin, es necesario realizar una etapa de
adaptacin donde la cepa absorba sus nutrientes y desarrolle su crecimiento.
2;!;5 E3'9' (& '('93'/-0%; En esta etapa se realiz la adecuacin de la bacteria
lctica proveniente de un medio de mantenimiento (caldo MRS) a unas
66
nuevas condiciones en un cultivo iniciador (prefermentador) que a su vez sirve de
inculo para la fermentacin.
Se prepararon cada uno de los 8 medios lquidos, con todos los nutrientes
requeridos para la fermentacin. Para la puesta en marcha de la cepa fue utilizado
una parte del volumen de cada medio (20 mL). Luego de ajustar el pH entre 5,4 y
6,0, se procedi a esterilizar los medios. En el momento en que los erlenmeyer
alcanzaron la temperatura ambiente se inocularon con 10 mL de cepa activada.
Para nuestro caso se estim un tiempo de adaptacin de 24 horas a 39 43 C en
un bao termostatado con agitacin constante con el objetivo de obtener una
elevada concentracin de microorganismos. Luego del cultivo que resulta de esta
etapa se realiza la inoculacin en los medios (volumen restante) considerados
dentro del diseo experimental, en este punto la cepa ya ha desarrollado su
estructura y se encuentra en condiciones para producir cido lctico.
2;!;2 E3'9' (& 9)*(,//-0%; En la ejecucin de esta etapa se determin la
cantidad de cido lctico producido por cada uno de los 8 tratamientos, y a partir
de esto se determin la composicin ptima de los nutrientes del medio de
fermentacin. Con este fin se us un diseo experimental de dos niveles y tres
factores [24] donde se tom el nivel alto y bajo de los valores reportados en la
literatura [40]. La aplicacin de este diseo experimental permiti determinar la
combinacin ptima de nutrientes en el medio lquido de cultivo.
Cuando los medios estuvieron dispuestos como se muestra en la Figura 7 se
llevaron al bao termostatado, con agitacin constante de 150 rpm para evitar la
sedimentacin del carbonato de calcio, se control el pH y se mantuvo la
temperatura entre 39 43C durante 48 h, el cual se estima tiempo suficiente para
el desarrollo del lactobacillo. Los medios base utilizados fueron los mismos
empleados en la etapa de adaptacin.
67
F-6,)' G; Fermentacin de los medios de cultivo.
El procedimiento para preparar las muestras y poder aplicar los mtodos para
anlisis de cido lctico y glucosa fue el siguiente.
1. El caldo fermentado fue calentado hasta 70 C por 15 minutos con el fin de
inactivar las bacterias.
2. Se acidific con cido sulfrico para precipitar las sales formadas.
3. Las sales precipitadas (sulfato de calcio) y la biomasa se removieron por
filtracin, y el licor activado fue usado para los anlisis.
Este mismo procedimiento se aplic para la rplica.
2.5 DISENO EOPERIMENTAL PARA EL MEJOR MEDIO DE CULTIVO
Para estudiar el efecto de los diferentes factores sobre la produccin de cido
lctico se realiz un modelo factorial 2
k
, que consisti en combinar las
concentraciones de los nutrientes del caldo de fermentacin, a fin de establecer el
caldo de cultivo que favoreciera el rendimiento en cido lctico y en consumo de
68
glucosa. Los factores involucrados en el proceso de fermentacin de cido lctico
se sealan en la Tabla 16.
T'71' 5#; Definicin de los parmetros del proceso fermentativo.
PARMETRO TIPO RANGO R&+;
Temperatura
noculacin
Constant
e 43 C
Anexo
C
Fermentacin
Constant
e 39- 43 C [5]
pH
Constant
e 5,3 [5]
Tiempo
noculacin
Constant
e 48 h
Anexo
C
Fermentacin
Constant
e 48 h [5]
Extracto de
Levadura Variable
A
determinar
Medio de Cultivo Extracto de Malta Variable
A
determinar
Extracto de Protena Variable
A
determinar
Concentracin de Sustrato inicial
Constant
e 15 % P/V [5]
El plan de experiencia factorial maneja dos niveles de diseo (2
k
), los cuales
pueden ser denotados como (+) para el nivel superior y (-) para el nivel inferior. La
Tabla 17 ofrece las variables del medio de cultivo y su convencin en el texto.
T'71' 5G; Variables del plan de experiencia factorial.
VARIABLE
CONVENCI
N
NIVEL
BAJ
O
ALT
O
Extracto de
levadura A - +
M&(-* (& /,13-?* Extracto de malta B - +
Extracto de
Protena C - +
Para el diseo factorial 2
K
se asume que hay linealidad entre sus niveles extremos
(alto y bajo) debido a esto se toman un rango de valores que cubre el reportado
por la literatura (valor medio).
69
La matriz de ensayos que indica los niveles en los cuales se deben realizar las
experiencias se construye con las tres variables as:
T'71' 5J; Matriz del diseo factorial 2
3
.
C*27-%'/-*%&
4
C*))-(' A B C (&
3)'3'2-&%3*4
5 - - - (1)
2 + - - a
3 - + - b
! + + - ab
" - - + c
# + - + ac
G - + + bc
J + + + abc
Este modelo dar el valor adecuado de las concentraciones de los nutrientes
(extractos de levadura, malta y protena) del medio de cultivo, con el cual se
pretende realizar la fermentacin que ser monitoreada a fin de obtener los
perfiles de concentracin de biomasa, sustrato y producto.
2.6 BIOSNTESIS DE CIDO LCTICO
El objetivo de esta etapa es el de determinar las curvas biocinticas de consumo
de sustrato, crecimiento de biomasa y sntesis de cido lctico. Esta parte de la
investigacin se puede realizar nicamente despus de tener los resultados
obtenidos en la determinacin del medio ptimo de fermentacin (Seccin 2.5) .
La realizacin de esta etapa se desarroll a nivel banco en un biorreactor Applikon
de 3 L de capacidad y agitacin controlada. En el Anexo G se dan las
especificaciones del equipo.
70
De acuerdo con lo descrito en el numeral 2.4 se inici con la preparacin de los
medios de cultivo para inocular los microorganismos. Se prepar la proporcin
adecuada del caldo de adaptacin (caldo MRS) que corresponde segn las
condiciones preestablecidas al 10% del volumen total de caldo de produccin
(150 mL de caldo) y se esteriliz en autoclave. Cuando el erlenmeyer estuvo a
temperatura ambiente se inocul con la cepa que tena 48 horas de sembrada, y
se dej en incubadora por 48 horas a una temperatura de 39 - 43 C.
Para la etapa de produccin se emplearon 1,35 litros de medio lquido que inclua
las concentraciones ptimas de nutrientes (extractos de levadura, malta y
protena), la fuente de nitrgeno (fosfato diamnico) y la fuente de carbono (jarabe
de glucosa). De este lquido se tom una muestra inicial para determinar la
cantidad de azcares reductores.
Simultneamente a la esterilizacin del volumen de fermentacin, se esteriliz el
microfermentador (incluyendo todos sus accesorios, por 90 minutos, con vapor de
caldera del Laboratorio de Plantas Piloto de la Universidad Nacional de Colombia
Sede Manizales). Luego de tener todo el equipo esterilizado, en condiciones
aspticas se incorpor al microfermentador Applikon el lquido de fermentacin
previamente esterilizado.
Con el propsito de determinar la cantidad de biomasa inicial se tom una muestra del
inculo antes de tambin ser adicionado al microfermentador en forma asptica.
Se estabilizaron las condiciones de operacin y se puso en marcha la
fermentacin. El proceso se inici con una velocidad de agitacin de 150 rpm a fin
de evitar la sedimentacin del carbonato de calcio utilizado como agente
neutralizante, para lograr un contacto permanente microorganismo sustrato y
para evitar gradientes de concentracin del producto final. El pH de la
fermentacin as como la temperatura fueron monitoreados.
71
Se mantuvo una temperatura entre 37 y 43 C durante los das de fermentacin, y
se tomaron muestras cada cuatro horas durante 3 das para determinar el perfil de
concentracin de biomasa, sustrato y producto.
En la Tabla 19 se presentan los parmetros determinantes en el proceso, la base
utilizada, variables a determinar y de respuesta.
T'71' 5; Parmetros fsico-qumicos de control, variables a determinar y de respuesta *.
T-9* (& ?')-'71& V'1*) U%-('(&4
VARIABLES FIJAS
Volumen total 1,5 L
Temperatura 39 - 43 C
Porcentaje de inculo 10 %
Tiempo de fermentacin 48 h
pH inicial 5 6
Glucosa 15 % P/V
Fosfato diamnico 0,25 % P/V
Carbonato de calcio 10 %
Agua 74,73 %
VARIABLES A DETERMINAR
Extracto de levadura g/L
Extracto de malta g/L
Extracto de protena g/L
VARIABLES DE RESPUESTA
Concentracin de cido lctico g/L
Concentracin de glucosa g/L
Concentracin de biomasa g/L
* El medio base utilizado es el descrito por nskeep, Breitze y Taylor (1956)
72
La fermentacin es anaerobia y por lo tanto la contaminacin con aire o la
respiracin debe suprimirse, el CO
2
generado durante la fermentacin ayuda a
crear el ambiente anaerobio requerido. En la Figura 8 se muestra el diagrama de
bloques para la produccin de cido lctico en la fermentacin.
F-6,)' J; Diagrama de bloques para la produccin de cido lctico va fermentativa.
Glucosa Agua Nutrientes Vapor Microorganismo
PREPARACIN
PREPARACIN DE
DEL CALDO DE ESTERILIZACIN
INOCULO
CULTIVO
NaOH CaCO
3
FERMENTACIN
CO
2
LICOR DE
FERMENTACIN
2;#;5 R&/,9&)'/-0% (& =/-(* 1=/3-/*; Las muestras se efectuaron empleando
una pera como medio de succin que se colocaba en la pipeta de salida cada vez
que se realizaba una toma para evitar que se contaminara. El volumen de muestra
por toma fu de 5 mL, los cuales se dispusieron en un tubo de ensayo tapa rosca
que se llev a 70 C a bao mara por 15 minutos y fue inmediatamente
refrigerado para detener el crecimiento microbiolgico. Finalmente, la muestra se
acidific con cido sulfrico, precipitando las sales (sulfato de calcio) y la biomasa
las cuales se removieron por filtracin.
73
En la Figura 9 se muestra el diagrama de bloques para la produccin de cido
lctico y su recuperacin.
F-6,)' ; Diagrama de bloques-Produccin de cido lctico-Recuperacin.
70 C
5 mL 15 min H
2
SO
4
Licor de
fermentacin TOMA TRATAMIENTO
DE
TRMICO
ACIDULACIN
MUESTRA
cido FILTRACIN
lctico
Sulfato de calcio
Biomasa
2;#;2 D&3&)2-%'/-0% (& 1'4 /,)?'4 7-*/-%L3-/'4; Para la construccin de las
curvas experimentales que establecen la biocintica de la fermentacin del cido
lctico empleando jarabe de glucosa, se midi peridicamente el consumo de
sustrato, crecimiento celular y produccin de cido lctico, realizando pruebas
especificas para la determinacin de estas variables durante el transcurso de la
fermentacin. Los datos obtenidos se utilizaron para determinar los parmetros de
las ecuaciones que permiten modelar el proceso.
Concentracin de sustrato &S'. Se refiere al consumo de azcares reductores
totales presentes en el jarabe de glucosa que se encuentra en el medio, sta se
determina por el mtodo sealado en el Anexo A. Esta variable se mide en g/L.
74
1 Concentracin de !iomasa &2'. Es la cantidad de masa celular presente
en el medio por unidad de volumen. Esta variable se mide en g/L, su
determinacin se realiza por el mtodo descrito en el Anexo F.
2 Concentracin de producto &"'. Con esta variable se obtiene la
produccin de cido lctico en g/L. Su determinacin se realiz con el mtodo
descrito en el Anexo B.
2;#;3 M*(&1'2-&%3* (& 1' /-%L3-/' (& 1' +&)2&%3'/-0%; Para desarrollar el
modelo biocintico se llevaron a cabo los siguientes pasos:
1. P1'%3&'2-&%3* (&1 2*(&1*; Se escogieron las ecuaciones que de acuerdo a
la literatura y a determinados criterios basados en su mayora en el tipo de curva
que present el crecimiento celular, modelaran con mayor precisin las curvas
biocinticas.
2. D&3&)2-%'/-0% (& 9')=2&3)*4; En esta parte se establecieron los
parmetros de las ecuaciones escogidas anteriormente.
3. S*1,/-0% (&1 2*(&1*. Luego de tener las ecuaciones con los parmetros
definidos se procedi a solucionar el modelo numricamente por el mtodo de
Runge-Kutta de segundo y tercer orden (herramienta utilizada "ode23 del paquete
matemtico Matlab ).
4. V&)-+-/'/-0% (&1 2*(&1*. Una vez obtenidos los perfiles de las
concentraciones de biomasa, sustrato y producto en funcin del tiempo
proporcionados en la solucin del modelo matemtico, se compararon
grficamente con los puntos experimentales a fin de corroborar y dar validez al
modelo planteado.
75
3. RESULTADOS Y ANLISIS
3.1 MTODOS ANALTICOS
3;5;5 C')'/3&)-.'/-0% (&1 8')'7& (& 61,/*4'; Con el propsito de corroborar las
caractersticas del jarabe de glucosa que se utiliz en la fermentacin, se siguieron
los mtodos enunciados en la Tabla 14 de la pgina 57, obteniendo los
resultados presentados en la Tabla 20.
T'71' 20; Resultados de la caracterizacin del jarabe de glucosa comercial.
P')=2&3)*4 R&4,13'(*
Grados Brix (20 C) 83,2
pH 5,1
Densidad 1,4134 g/mL
Azcares Reductores (en 1,0 g de muestra) 0,4395 g
3;5;2 P)&9')'/-0% (& 1' /,)?' 9'3)0% (& '.@/')&4 )&(,/3*)&4; Esta curva se
realiz preparando varios patrones de glucosa disueltos en agua destilada por el
mtodo del cido dinitrosaliclico (DNS) detallado en el Anexo A. Las lecturas de
absorbancia que se obtuvieron en el espectrofotmetro Perkin Elmer L20 se
presentan en la Tabla 21.
T'71' 25; Datos para la obtencin de la curva patrn de Azcares reductores (DNS).
L*%6-3,( (& O%(' A%2B C*%/&%3)'/-0% A26>LB A74*)7'%/-'
540 50 0,005
540 100 0,02
540 150 0,042
540 200 0,069
540 250 0,098
540 300 0,122
540 350 0,137
76
La Figura 10 expone la relacin lineal entre la concentracin de glucosa y
absorbancia con un coeficiente de correlacin de 0,9925.
F-6,)' 50; Curva patrn de azcares reductores.
C,)?' (& A.@/')&4 R&(,/3*)&4
0,1
6
DM&3*(* DNSE
0,1
4
A74*)
7'%/-'
0,1
2
0,1
0,0
8
: P 0Q000"R M
0Q0233
0,0
6 R
2
P 0Q2"
0,0
4
0,0
2
0
50 100 150 200 250 300
35
0
C*%/&%3)'/-*% (& G1,/*4'
26>L
"Datos
experimentales" Lnea de tendencia
3;5;3 C,)?' 9'3)0% (& =/-(* 1=/3-/*; Esta curva se realiz preparando varios
patrones de cido lctico disueltos en agua destilada por el mtodo colorimtrico del
Cloruro Frrico (Anexo B). Los resultados se exponen en la Tabla 22 y Figura 11.
T'71' 22; Datos para la obtencin de la curva patrn de cido Lctico.
L*%6-3,( (& *%(' A %2 B C*%/&%3)'/-0% A 26>L B
A74*)7'%/-
'
440 0,0202 0,0317
440 0,0268 0,0390
440 0,0344 0,0480
440 0,0398 0,0533
440 0,0434 0,0598
440 0,0498 0,0695
440 0,0532 0,0722
440 0,0600 0,0869
440 0,0678 0,0901
440 0,0704 0,0970
440 0,0764 0,1026
440 0,0816 0,1091
440 0,0950 0,1278
77
F-6,)' 55; Curva patrn de cido lctico.
CURVA DE CIDO LCTICO
0,1
4
DE49&/3)*2&3)$' ' !!0 %2E
A
7
4
*
)
7
'
%
/
-
'
0,1
2
0,1
0,0
8 : P 5Q2R S
0Q00!5 0,0
6
R
2
P 0Q"J 0,0
4
0,0
2
0
0,02 0,04 0,06 0,08
0,
1
C*%/&%3)'/-*% D26 A/; L'/3-/*>LE
"Datos experimentales" Lnea de tendencia
3.2 PREPARACIN DE LA CEPA
3.2.1 S&1&//-0% (&1 2&(-* (& '/3-?'/-0% (& 1' /&9'; Con la siembra de la cepa
hidratada en agar MRS el crecimiento se demor casi 3 das y se evidenci muy
poco desarrollo bacteriano; mientras que con la siembra en caldo MRS la bacteria
present buen crecimiento celular en un lapso de 24 a 48 h, corroborando las
recomendaciones del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos
(Anexo C) donador de la cepa. Teniendo en cuenta lo anterior, se decidi que la
activacin de la cepa se realizara utilizando el caldo MRS y como medida
preventiva el crecimiento en agar se mantendra refrigerado (4 - 6 C) como
material de reserva en caso de prdida de la cepa original.
3.2.2 C*%4&)?'/-0% (& 1' /&9'; La preservacin de cepas productivas por
largos periodos de tiempo, es un requerimiento bsico para las fermentaciones
prcticas. La simple sobrevivencia de las cepas no es el principal objetivo, los
microorganismos pueden permanecer viables a travs de transferencias
78
peridicas, pero su capacidad productiva es la que se debe preservar. Por tal
razn se inocularon varias cajas de petri y tubos de medio lquido con la bacteria
Lacto)acillus del)ruec,ii, las cuales fueron conservadas de la forma descrita en el
numeral 2.3.3.
3.3 DISENO EOPERIMENTAL PARA EL MEJOR MEDIO DE CULTIVO
De acuerdo a la metodologa reseada en la seccin 2.5 se defini el rango para
las concentraciones de los nutrientes del medio de cultivo, as:
1. Extracto de levadura entre 0,1 - 10 g/L
2. Extracto de malta entre 0,1 - 10 g/L
3. Extracto de protena entre 5 - 15 g/L
A partir de los rangos anteriores, la Tabla 23 cuantifica los niveles mximos y
mnimos de las variables del sistema factorial que se presentaron en la Tabla 16.
T'71' 23; Cuantificacin de los niveles mximos(+) y mnimos ().
VARIABLE
CONVENCI
N
NIVEL
BAJO
D M E
ALTO
D S E
Extracto de
levadura A 0,1 g/L 10 g/L
M&(-* (&
/,13-?* Extracto de malta B 0,1 g/L 10 g/L
Extracto de
Protena C 5 g/L 15 g/L
La matriz que sustituye la combinacin de tratamientos indicados en la Tabla 17
que determina las concentraciones de los nutrientes de los diferentes medios de
cultivo, es relacionada en la Tabla 24.
79
T'71' 2!; Matriz de combinacin de tratamientos para el plan de diseo factorial 2
3
.
C*))-(' A B C C*27-%'/-0% (&1 3)'3'2-&%3*
1 0,1 0,1 5 (1)
2 10 0,1 5 a
3 0,1 10 5 b
4 10 10 5 ab
5 0,1 0,1 15 c
6 10 0,1 15 ac
7 0,1 10 15 bc
8 10 10 15 abc
Esta matriz indica cmo se combinan los niveles de las variables dentro de cada
experiencia. As en la corrida nmero 1 se trabaj con las variables A, B, C, en el
nivel inferior, esto quiere decir que la variable A (Extracto de levadura) toma el
valor de 0,1 g/L, la variable B (Extracto de malta) toma el valor de 0,1 g/L y la
variable C (Extracto de protena) toma el valor de 5 g/L.
Con las combinaciones de los tratamientos descritos en la Tabla 24, se obtuvieron
los valores para el rendimiento en cido lctico y en consumo de jarabe de
glucosa para cada uno de los medios y por duplicado. En la Tabla 25 se
proporcionan los resultados obtenidos.
T'71' 2"; Respuestas obtenidas del diseo factorial (pruebas por duplicado).
ER9&)-&%/-'
J')'7& (& 61,/*4' A6>LB /-(* 1=/3-/* A6>LB
RL91-/' 5 RL91-/' 2 RL91-/' 5 RL91-/' 2
1 (1) 108,123 113,903 18,356 17,610
2 a 112,052 142,678 18,367 17,793
3 b 126,487 122,255 17,446 18,263
4 ab 121,319 107,993 17,626 18,334
5 c 108,782 109,898 16,065 16,420
6 ac 125,431 123,857 17,649 18,111
7 bc 115,236 129,394 17,339 18,751
8 abc 117,562 110,062 18,062 18,142
80
De la tabla anterior se calculan los parmetros , A, B, AB, C, AC, BC y ABC, los
cuales de acuerdo a Montgomery [24] permiten maximizar las variables y obtener los
valores ptimos. Los valores de estos parmetros se presentan en la Tabla 26.
T'71' 2#; Parmetros estadsticos para cido lctico.
D&4?-'/-0%
D&4?-'/-0
%
V'1*) 3$9-/' C*%/1,4-0%
R&49&/3* ' I DCE
DSE
I 35,542 0 78,952
A 0,4790 1,3476 0,9177
(+) 10 g/L de extracto
levadura
B 0,4490 1,2632 0,8063
(+) 10 g/L de extracto de
malta
AB - 0,3880 - 1,0916 0,6021
C - 0,4072 - 1,1458 0,6633
(-) 5 g/L de extracto de
protena
AC 0,3682 1,0360 0,5424
BC 0,5632 1,5847 1,2689
ABC - 0,4022 - 1,1317 0,6471
En la tabla anterior representa el promedio de la suma de los valores para ambas
rplicas reportados en la Tabla 25 de cido lctico. Debido a que el valor de A
(extracto de levadura) es positivo, el valor de B (extracto de malta) es positivo y el
valor de C (extracto de protena) es negativo, los niveles correspondientes para
cada uno de las convenciones es alto (+), alto(+) y bajo(-) respectivamente, lo que
nos indica que se favorece la combinacin correspondiente a la corrida nmero
cuatro (4).
gualmente los datos de la cuarta columna indican una desviacin poco
significante entre los datos reportados, es decir, la homogeneidad de los mismos
hace que sus fluctuaciones no sean representativas para el diseo. El valor
negativo de ABC demuestra que no se presenta interaccin entre los factores.
La Tabla 27 presenta los valores , A, B, AB, C, AC, BC y ABC que permiten
analizar el efecto del consumo de jarabe de glucosa en las diferentes
81
composiciones de los medios cultivo. Los datos all utilizados son los que se
reportaron en la Tabla 25 para ambas rplicas de jarabe de glucosa.
T'71' 2G; Parmetros estadsticos para jarabe de glucosa.
P')=2&3)* V'1*)
D&4?-'/-0%
D&4?-'/-
0
R&49&/3* ' % 3$9-/' C*%/1,4-0%
I DCE DSE
I 236.878 0 876,737
A 3,3603 1,4 45,1651
(+) 10 g/L de extracto
levadura
B 0,6972 0,294 1,9446
(+) 10 g/L de extracto de
malta
AB -12,4692 -5,2639 13,3116
C -1,8243 -0,770 62,1928
(-) 5 g/L de extracto de
protena
AC 0,0403 0,0170 0,0065
BC 0,3742 0,1579 0,5603
ABC 0,5657 0,2388 1,2803
En la Tabla 27 se observa que los valores para las convenciones A, B y C
corresponden a los niveles alto (+), alto(+) y bajo(-) respectivamente.
Nuevamente se favorece la combinacin de tratamientos correspondiente a la
corrida nmero cuatro (Tabla 28), pese a que en ste caso la desviacin entre los
datos es significativa, es decir, no hay homogeneidad entre los valores analizados.
Las interacciones entre los factores tambin tienen relevancia para el diseo, sin
embargo, debido a sus valores tan bajos en comparacin con cada una de las
convenciones, pueden despreciarse sus efectos.
De los resultados obtenidos en el anlisis de las Tablas 26 y 27 se concluye que la
combinacin de tratamientos que mejor favorece la produccin de cido lctico y
al mismo tiempo el consumo de jarabe de glucosa es la correspondiente a la
corrida nmero cuatro (4). As, la concentracin de los nutrientes que se deben
82
suministrar al caldo de cultivo para la fermentacin que se monitorear, queda
completamente especificada.
A partir de los valores fijados, se puede cuantificar la Tabla 15 que define los
parmetros involucrados en el diseo experimental, tal como se muestra en la
Tabla 28.
T'71' 2J; Cuantificacin de los factores del diseo experimental.
PARMETRO TIPO RANGO R&+;
Temperatura
noculacin Constante 43 C Anexo C
Fermentacin Constante 39- 43 C [5]
PH Constante 5,3 [5]
Tiempo
noculacin Constante 48 h Anexo C
Fermentacin Constante 48 h [5]
ER3)'/3* (& L&?'(,)' Variable 10 g/L [39]
Medio de Cultivo ER3)'/3* (& M'13' Variable 10 g/L [39]
ER3)'/3* (& P)*3&$%' Variable 5 g/L [39]
Concentracin de Sustrato inicial Constante 15 % P/V [5]
3.4 BIOSNTESIS DEL CIDO LCTICO
3;!;5 D&3&)2-%'/-0% (& 1'4 /,)?'4 7-*/-%L3-/'4; Siguiendo la metodologa
descrita en la seccin 2.6 se obtuvieron los datos listados en la Tabla 29, los
cuales describen los perfiles de comportamiento del crecimiento celular, el
agotamiento del sustrato (jarabe de glucosa) y la aparicin de producto (cido
lctico) en funcin del tiempo de fermentacin.
Los puntos que no aparecen en la tabla corresponden a muestras que no pudieron
ser evaluadas adecuadamente.
83
T'71' 2; Datos experimentales del desarrollo de la fermentacin.
T-&29*
AIB
B-*2'4'
A6>LB
S,43)'3*
A6>LB
P)*(,/3*
A6>LB
0 0,4392 150,0000 0,0000
4 0,4720 145,7143 0,0218
8 0,5210 141,8231 0,4341
12 --------- 140,6853 0,8982
16 0,9120 136,9096 0,9146
20 1,6800 132,9362 0,9969
24 1,2464 130,7457 5,7256
28 2,0000 130,3178 9,4570
32 2,8000 127,6315
15,789
0
36 3,9300 124,6645
25,146
0
40 -------- 121,3952
32,457
8
44 4,8340 117,8013
41,458
1
48 5,3420 115,8627
48,798
6
52 115,5599
49,695
6
56 6,3123 110,8786
50,132
6
60 6,3521 108,8073
53,289
5
64 6,4000 104,3435
54,126
3
68 6,5320 98,4919
59,123
5
72 ---------- 84,2711
59,294
3
3;!;2 M*(&1'2-&%3* (& 1' /-%L3-/' (& 1' +&)2&%3'/-0%;
Para desarrollar
el
modelo biocintico se llevaron a cabo los siguientes pasos:
5; P1'%3&'2-&%3* (&1 2*(&1*; El sistema de ecuaciones diferenciales que se
utiliz para la simulacin del proceso fermentativo, es un sistema acoplado que
involucra la ecuacin logstica para el crecimiento celular, con el consumo de
sustrato y la aparicin de producto. El "set de ecuaciones es presentado en la
Tabla 30.
84
T'71' 30; Sistema de ecuaciones para la simulacin del proceso.
V')-'71&4 (& E/,'/-0% N,2&)'1
)&49,&43' (&1 2*(&1*
Crecimiento celular
r
X
= kX(1 X)
(1.7)
Consumo de sustrato
r
S
=

1
d
X
+ m
s
X (1.11)
Y
X
S
dt
Aparicin de producto
r
P
=

Y
P / S
d
S
(1.15)
dt
2; D&3&)2-%'/-0% (& 1*4 9')=2&3)*4 /-%L3-/*4; Con base en los resultados de la
Tabla 29, se determinaron las constantes Y
X/S
, Y
P/S
, , k, m
s
(Tabla 31).
T'71' 35; Parmetros cinticos del sistema de ecuaciones.
V'1*) U%-('(&4 C=1/,1*4
YX/S 0,0927 [ g biomasa / g sustrato ] Ecuacin (1.13)
YP/S 0,9021 [ g producto / g sustrato ] Ecuacin (1.16)
- 0,1207 [ g biomasa
-1
]
Regresin lineal Ecuacin
(1.7)
k 0,8231 [ h
-1
] (Figura 12)
m
s 0,14
[ g sustrato/(g
biomasa.h) ] Referencia bibliogrfica [7]
Para hallar el valor de los coeficientes k y de la ecuacin logstica se emple el
procedimiento utilizado por Klasson et. al. [19], k y se toman como el trmino
independiente y la pendiente respectivamente de la lnea recta resultante de la
linearizacin de la ecuacin (1.7); para obtener los valores de esta recta fue
necesario hallar los incrementos de biomasa (dX) a un incremento de tiempo
constante (dt) utilizando la curva ajustada de los datos experimentales de biomasa
(X) y el programa Excel. La recta obtenida al graficar (1/X) (dX/dt) Vs. X es
mostrada en la Figura 12.
85
F-6,)' 52; Parmetros cinticos de la ecuacin logstica.
D&3&)2-%'/-0% (& 1*4 9')=2&3)*4 (& 1' &/,'/-0% 1*6$43-/'
0,
9
0,
8
0,
7
y = -0,1207x + 0,8231
(
3
E
0,
6
R
2
=
0,9425
>
(
O
0,
5
E
T
D 0,
4
5
>
O
0,
3
D
0,
2
0,
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
24 A6>LB
3. S*1,/-0% : ?&)-+-/'/-0% (&1 2*(&1*; De acuerdo a la metodologa sealada
en la seccin 2.6.2, la solucin numrica del modelo matemtico se grafica en la
Figura 13 para la ecuacin (1.7) del crecimiento microbial, en la Figura 14 para la
ecuacin (1.11) de consumo de sustrato y en la Figura 15 para la ecuacin (1.15)
de aparicin de producto. Todas las curvas simuladas son cotejadas con los
puntos experimentales de la Tabla 29.
1 Crecimiento micro!ial. Para la simulacin del crecimiento celular se
escogi la ecuacin logstica que reproduce con mayor precisin el desarrollo
microbial tanto en la fase exponencial como en la estacionaria.
De la Figura 13 se pueden distinguir con facilidad tres fases del crecimiento celular:
una etapa de adaptacin del microorganismo al medio, en donde su concentracin
permanece prcticamente igual a la del momento de la inoculacin (X
o
= 0,4392 g/L),
con un tiempo de duracin entre 0 y 12 horas aproximadamente.
86
F-6,)' 53; Perfil del crecimiento de biomasa en funcin del tiempo.
C,)?' (& /)&/-2-&%3* (& 7-*2'4'
7
6
A6
>L
B
5
4
B
-*
2
'
4
'
3
2
1
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
3-&29* AIB
Datos simulados
Datos
experimentales
Entre 12 y 60 horas aproximadamente se presenta la segunda etapa que
corresponde a una fase exponencial "alargada. Despus de esta fase aparece la
fase estacionaria, en donde no se identifica un aumento significativo en la
densidad celular.
La dilatacin de la fase exponencial, justifica razonablemente el tiempo terico
requerido para la fermentacin cido lctica, el cual es relativamente superior al
requerido en otro tipo de fermentaciones (alcohlicas).
Consumo de sustrato. En la Figura 14 esquematiza el agotamiento sucesivo
de la fuente de carbono durante el transcurso de la fermentacin.
El lnguido deceso del sustrato da buena fe de la fase exponencial "alargada que
present el microorganismo en la Figura 13. Pese a esto su cada ms vertiginosa
se presenta justo en la etapa estacionaria del microorganismo.
87
F-6,)' 5!; Perfil del consumo de sustrato en funcin del tiempo.
C,)?' (& /*%4,2* (& 4,43)'3*
16
0
15
0
14
0
A6>
LB
13
0
S,
43)
'3
*
12
0
11
0
10
0
90
80
0 10 20 30 40 50 60 70 80
3-&29* AIB
Datos simulados
Datos
experimentales
Como se evidencia en la Figura 14 el consumo de sustrato en el tiempo final de
fermentacin no ha alcanzado ni el 50 % de su valor inicial (glucosa 15 % P/V).
Aparicin del producto. La Figura 15 reproduce la formacin de cido lctico
durante el proceso fermentativo. Si bien su perfil de comportamiento es muy
similar al de crecimiento celular, presenta una fase de desarrollo ms vigorosa y
tiende a estabilizarse en un tiempo menor que ste ltimo.
Segn los datos experimentales durante las primeras 20 horas de fermentacin no
se verifica un aumento significativo en la produccin de cido lctico, tiempo que
aproximadamente tarda el microorganismo en emprender su desarrollo
exponencial. Adicionalmente en este mismo tiempo el consumo de sustrato no se
altera en forma considerable.
88
F-6,)' 5"; Perfil de la aparicin de producto en funcin del tiempo.
C,)?' (& +*)2'/-0% (& 9)*(,/3*
7
0
6
0
A
6
>
L
B
5
0
1
=
/
3
-
/
*
4
0
3
0

/
-
(
*
2
0
1
0
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
3-&29* AIB
Datos simulados Datos experimentales
En las figuras 13, 14 y 15, la nube de puntos experimental se distribuye con la
misma tendencia o perfil de comportamiento otorgado por la simulacin para cada
una de las variables de respuesta del sistema.
El modelo cintico planteado para la fermentacin y obtencin de cido lctico se
ajusto adecuadamente a los datos experimentales, obteniendose un rendimiento
de 90.21 %, expresado como gramos de ac.lctico producido / gramos de sustrato
consumido.
Demostrandose asi que por ejemplo con el estudio de Pan, Peterson y Jhonson,
1940, que es posible obtener un rendimiento real muy similar o mas alto utilizando
glucosa como sustrato (90.21 %) complementada con malta (87.3%).
89
En la tabla siguiente se resumen los diferentes reportes de produccion de cido
lctico teniendo en cuenta los resultados del presente estudio por diferentes
microorganismos y sustratos.
T'3,2 : P&3&)4*%
Steptococcus Lactis 94.0
Lactobacillus casei
glucosa
93.0
D53"E L. delbruekcii 95.0
P&3&)4*%Q P'% : L. delbruekcii
J*I%4*% D5!0E melaza 87.3
C*)(*% &3 '1
Lactobacillus**
61.9
L. pentosus 124-2 Almidn de
91.2
D5"0E L. delbruekcii papa
79.4
NRLB-445
C'297&11 D5"3E L. bulgaricus Lactosa
85 95
(ATCC9224)
RI*%& P*,1&%/ L. kleicmannii
------------
77.0
S;A 5G5
J,% L,* &3 '1 SSLF Glucosa a partir 79
D5GE L. delbrium de celulosa Basado en
consumo
G),9* L. plantarum
Lactosa 48-50
B-*9)*/&4*4 I;Q; L. casei
(& U;A;
S U*)*I*(*,
Glucosa
D2000E ---------------- 89
B,)6*4 L. Bulgaricusa
Lactosa
Glucosa
D2000E (NRRL B-548) 90
Galactosa
O)*./* P'3)-/-' :
L. delbruekcii
S*1')3& J,'% Glucosa 90.21
(NRRL B-763)
D2003E
90
4. CONCLUSIONES
2" En esta etapa inicial se pudo comprobar que el Caldo MRS de (Man Rogosa
Sharpe) es un medio que ofrece los nutrientes necesarios para la activacin y
crecimiento del Lactobacillus Delbrueckii. De igual manera se pudo evidenciar que
las condiciones a las que mejor se desarrolla es a una temperatura de 43 C
respectivamente, en un tiempo de 48 horas.
3" De acuerdo con los resultados obtenidos en la experimentacin, se concluye
que los parmetros ms adecuados para la produccin de cido lctico a partir de
jarabe de glucosa y utilizando el Lacto)acillus Del)ruec,ii son Temperatura de 43
C y un pH de 5,3.
4" El parmetro que ms afecta la produccin de cido lctico es el pH, por lo
tanto es necesario mantenerlo constante y as garantizar una buena produccin y
alcanzar estabilidad en un tiempo ms corto.
5" De los resultados obtenidos en el anlisis estadstico para la obtencin del
mejor medio de cultivo se concluye que la combinacin de tratamientos que mejor
favorece la produccin de cido lctico y al mismo tiempo el consumo de jarabe de
glucosa corresponde a las siguientes composiciones 10 g/L de extracto de
levadura, 10 g/L de extracto de malta y 5 g/L de extracto de protena.
6" El modelo cintico planteado para la fermentacin y obtencin de cido lctico
se ajusta adecuadamente a los datos experimentales, aunque no se descarta que
con un mayor nmero de datos, el empleo de modelos cinticos ms complejos y
un estudio detallado de las vas metablicas se pueda lograr un ajuste mayor.
91
1" Se obtuvo un rendimiento 90.21 %, expresado como gramos de ac.lctico
producido / gramos de sustrato consumido.
2" Los valores de rendimiento fueron similares y en algunos casos superiores a
los de otros estudios realizados
92
5. RECOMENDACIONES
2" Realizar un mejoramiento en las condiciones de control en las mediciones de
pH y biomasa, as como en el manejo el microorganismo, ya que son parmetros
fundamentales en el desarrollo de la fermentacin.
3" Empleando los resultados de la simulacin, es posible realizar un escalado del
proceso de fermentacion estudiado (en un volumen e 1.5 L), a nivel de planta
piloto con miras a su inplementacion industrial.
4" El mayor nmero de datos podra mejorar el ajuste del modelo, aumentando su
complejidad, pero tambin su representatividad de los procesos metablicos.
5" Valdra la pena evaluar el incremento en productividad que se podra obtener al
realizar la fermentacin continua, metodologa ventajosa ya que permite eliminar
continuamente el cido producido, el cual al estar libre en el medio es txico para
los microorganismos.
6" gualmente, se debe tener en cuenta la inmovilizacin de clulas, proceso que
ha mostrado ser mucho ms productivo que la fermentacin por lotes, pero en el
cual el control de proceso es mucho ms riguroso.
7" Hacer el seguimiento del crecimiento microbiano en forma cuantitativa por un
mtodo confiable y rpido por la importancia que tiene estos en el proceso de
fermentacin.
8" Evaluar con otro tipo de sustratos obtenidos a partir de especies locales, u otro
tipo de procedimientos similares que permitan comparar su rendimiento.
93
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Bi)lio-raf1
a
A%&R* A
ML3*(* (&1 DNS 9')' (&3&)2-%'/-0% (& '.@/')&4 )&(,/3*)&4
El cido dinitrosaliclico, es un reactivo desarrollado por Sumner y se utiliza para la
determinacin de azcares reductores, est compuesto de cido dinitrosaliclico,
tartrato de sodio y potasio, fenol, bisulfito de sodio e hidrxido de sodio.
El tartrato de sodio y potasio es introducido para prevenir que el reactivo disuelva
oxgeno, el fenol incrementa el color producido; el bisulfito estabiliza el color
obtenido en presencia del fenol. La alcalinidad es requerida para producir la
reduccin de la glucosa y de esta forma tener un mayor efecto del cido
dinitrosaliclico.
La qumica en la prueba del DNS, es la reduccin que sufre este por la glucosa; el
cido 3,5 dinitrosaliclico es reducido al compuesto 3-amino-5-nitrosaliclico a
causa del grupo aldehdo que se oxida a su vez a grupo carboxilo.
P)&9')'/-0% (&1 )&'/3-?*<
1" Solucin A: Hidrxido de sodio 13,5 g en 300 mL de agua destilada
2" Solucin B: Se disuelven 8,8 g de DNS, con 32,5 g de tartrato de sodio y
potasio tetrahidratado en 800 mL de agua destilada.
3" Solucin C: Mezcla de las soluciones A y B
4" Solucin D: Se pesa 2,2 g de NaOH, con 10 mg de fenol en cristales en
100 mL de agua destilada.
Ane2o A
1" Solucin de bisulfito de sodio: Se disuelve 5 g de NaHSO
3
en 25 mL de agua
destilada.
2" El reactivo DNS es preparado adicionando a la solucin C 69 mL de la solucin
D y 23,2 mL de solucin de bisulfito de sodio
P)&9')'/-0% (& 1' /,)?'
3
<
Se prepara una curva patrn de glucosa entre 0 y 250 mg/mL. Por ejemplo para el
primer patrn se toman 0.5 mL de la solucin de glucosa y se adiciona 1.5 mL de
reactivo DNS y se lleva a un bao en ebullicin por 5 minutos para que genere la
reaccin de color, inmediatamente despus la muestra se lleva a un bao de agua
hielo por otros 5 minutos. Despus se adicionan 9.5 mL de agua deionizada y 0.5
mL; se espera 30 minutos con el fin de que haya estabilizacin de la reaccin.
Una vez transcurrido este tiempo, se lleva a la lectura del espectrofotmetro a 540
nm.
3
Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar, Gail Miller Analitical Chemistry Vol 31 No 3
Marzo de 1959.
Ane2o
A
A%&R* B
ML3*(* (& /1*),)* +L))-/* 9')' 1' (&3&)2-%'/-0% (& =/-(* 1=/3-/*
La cuantificacin de cido lctico se puede realizar por diferentes mtodos. En el
trabajo se utiliz el siguiente mtodo colorimtrico: se toman 10 mL de muestra a
la que se le adicionan 5 mL e solucin de FeCl
3
y se completa a 50 mL con agua
destilada. Se prepara un blanco con agua para calibrar el equipo y se lee la
absorbancia e la muestra a =440 nm [15].
El cloruro frrico (FeCl
3
) se prepara pesando 0,5 g de FeCl
3
, adicionando 1 mL de
HCl 0,1 N y completando a 50 mL con agua destilada.
La lectura debe ser inmediata debido a que este reactivo se descompone
rpidamente con la luz.
T'71' B5; Datos para la obtencin de la curva patrn de cido lctico *.
L*%6-3,( (& O%('
C*%/&%3)'/-0%
A 6>L
A74*)7'%/-'
D%2E B
440 0,0202 0,0317
440 0,0268 0,0390
440 0,0344 0,0480
440 0,0398 0,0533
440 0,0498 0,0598
440 0,0532 0,0695
440 0,0600 0,0722
440 0,0678 0,0869
440 0,0704 0,0901
440 0,0764 0,0970
440 0,0816 0,1026
440 0,0950 0,1278
* cido lctico producido por laboratorios "Galactic.
Ane2o B
1 mL
------------10
3

mm
3
X---------------
0,1
mm
3
A%&R* G
B-*))&'/3*) A991-V*%
Este biorreactor es un micro fermentador esterilizable, enchaquetado y con
agitacin. El recipiente est construido en vidrio, y la tapa con todos sus
accesorios en acero inoxidable 316 [1].
D&4/)-9/-0%<
La tapa tiene orificios especiales para cada uno de los accesorios, los cuales son:
1 Un orificio central para ensamblar el agitador, el cual se acopla
directamente al motor, esta operacin es libre de contaminacin. Este debe
ser desensamblado, limpiado y lubricado dos veces al ao.
2 Un orificio de 6,75 in para el censor de oxigeno.
3 Trece orificios de diferentes dimensiones para otro tipo de sensores: pH,
nivel, temperatura, etc., y accesorios como pipetas y mangueras.
4 Un orificio roscado especial para conectar el condensador por el cual son
eliminados los gases producidos, para as evitar la contaminacin del medio
y sobrepresionamiento del equipo.
5 Otro orificio roscado mas pequeo para ensamblar el tubo toma muestras
por el cual se puede extraer la muestra libre de clulas.
Ane2o 6
1 Seis orificios especiales para los tornillos de ensamble entre la tapa y el
recipiente de vidrio.
2 Un pozo que tiene contacto directo con el medio al cual se le agrega un
liquido con buena transferencia de calor para introducir el termmetro y
hacer las lecturas a la temperatura interna.
E49&/-+-/'/-*%&4:
Capacidad:
1 Volumen total 3,2 L
2 Volumen optimo de trabajo 2,7 L
3 Volumen mnimo de trabajo 0,47 mL
4 Volumen interno de la chaqueta 1,3 L
5 La chaqueta puede ser usada para calentamiento o enfriamiento y gracias a
esta el control de la temperatura puede ser ms exacto.
6 La esterilizacin debe hacerse en autoclave a 121 C durante 30 minutos, y
este solo puede abrirse cuando la temperatura sea menor de 90 C, para
evitar cambios bruscos de presin que puedan daar el equipo.
7 La limpieza del equipo debe hacerse con etanol al 70% u otro limpiador
sustituto, no utilizar material abrasivo.
P)*/&(-2-&%3* (& &43&)-1-.'/-0%<
Llenar el nivel con el medio de cultivo, este no debe exceder el volumen total 3 L
que es especificado, siendo este volumen suficiente para las adiciones
Ane2o 6
posteriores a la esterilizacin (inoculacin, separacin de nutrientes, etc.). Cerrar
con la mano seis de las tuercas en forma cruzada.
Verifique que se encuentre en su lugar todos los soportes de los niples y dems
auxiliares. Se debe hacer antes de llevar a cabo esta operacin, las conexiones
adicionales entre el aire y el liquido y salida de condensados con mangueras de
silicona u otro material esterilizable. Debe de utilizarse en la salida y entrada de la
corriente de aire, filtros apropiados y se debe evitar que durante la esterilizacin
penetre agua a los filtros. Con tal fin se debe usar una abrazadera entre la
manguera que comunica la entrada y salida de gases del intercambio y los filtros.
Se debe cerrar todas las conexiones, excepto la salida de aire evitando as el
sobrepresionamiento del equipo.
P)*/&(-2-&%3* 9')' 1' 3*2' (& 2,&43)'4<
Se debe adecuar el biorreactor con una lnea de toma de muestras, la cual puede
ser una manguera esterilizable de dimetro interno pequeo, crendose vaci con
una jeringa estril para succionar la muestra. Es recomendable tomar siempre un
volumen constante de muestra para crear homogeneidad en los datos.
Esta operacin debe hacerse con guantes, tapa bocas y mecheros encendidos
alrededor, para garantizar condiciones aspticas y as evitar contaminaciones en
el caldo de cultivo.
Ane2o
6
A%&R* H
L-43' (& 4$27*1*4
S$27*1*
D&4/)-9/-
0% U%-('(&4
N nmero de clulas
N
0 Numero de clulas iniciales
constante de velocidad mxima de
[h
-1
]
reaccin a
concentraci
n
infinita de reactante
constante de velocidad para
formacin
[g producto / (g clulas. h)]
KP
de
producto
[kg
sustrato
/ m
3
]. K
s constante del sustrato
-K
d Constante de velocidad
[h
-1
]

mxima concentracin celular

[g producto / (g clulas. h)]
alcanzada en tiempos largos
m
s
Coeficiente de
mantenimiento [g sustrato / (g clulas. h)]

parmetro cintico estipulado para el proceso

rP velocidad de formacin de producto
r
x
velocida
d
volumtric
a de incremento
[g DCW / L.h]
celular en peso seco
Rr Rendimiento real
[ Kg cido / Kg sustrato
]
S concentracin del sustrato [kg
sustrato
/ m
3
]
S0 Concentracin inicial de sustrato [kg
sustrato
/ m
3
]
t tiempo [h]
tla- tiempo de latencia [h]
t
d tiempo de duplicacin [h]
te2p tiempo de la fase exponencial [h]
velocidad de crecimiento especifico [h
-1
]
max
Velocida
d
especfi
ca mxima de [h
-1
]
crecimiento de las clulas
velocidad del crecimiento especifico del [h
-1
]
nmero de clulas
P Concentracin de producto [kg
producto
/ m
3
]
X = DCW Concentracin de biomasa [kg
biomasa
/ m
3
]
Xo
concentraciones iniciales de
biomasa [kg
biomasa
/ m
3
]
YP/S
Rendimiento de sustrato en
producto [kg producto / Kg sustrato]
YP/X
es el rendimiento de biomasa
e
n
[kg producto / Kg celulas]
producto
YX/S
rendimiento de biomasa por
sustrato [kg biomasa / Kg sustrato]
A7)&?-'3,)'4<
t
1/2
: Vida media
L: Microlitro
m: Micrmetro
U: Unidades internacionales
UV: Ultra violeta visible
mL: Mililitro
Nm: Nanmetro
DNS: cido Dinitro Saliclico
Batch: Reactor por lotes.
C: Grado Centgrado
MRS: Man Rogosa Sharpe