PRACTICA DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE CIDO INDOLACTICO (AIA) PRODUCIDO IN VITRO INTRODUCCION El abuso de productos fertilizantes para aumentar la productividad

de las pasturas, ha ocasionado un desequilibrio de la microbiota nativa que cumple con funciones importantes provocando bajos rendimientos y aumento en los costos para el agricultor y el ganadero. Una alternativa para promover el crecimiento rpido de races y tallos es el uso de inoculantes microbianos (biofertilizantes) que contribuyen a la recuperacin de las poblaciones existentes en el suelo y con ello a mejorar la fertilidad de los mismos. Entre los microorganismos, las bacterias tienen especial importancia en la relacin suelo-planta y son responsables del incremento o disminucin en el suministro de nutrientes como tambin en la produccin de factores de crecimiento (fitohormonas); las bacterias pertenecientes a los gneros: Azotobacter sp, Azospirillum sp, Pseudomonas sp, Xantomonas sp, Enterobacter sp, Arthrobacter sp, Bacillus subtilis, se destacan por su potencial como biofertilizantes debido a que son capaces de producir sustancias promotoras de crecimiento vegetal, que inciden grandemente en el rendimiento y en la calidad de los cultivos . Los estudios realizados con microorganismos de los gneros Azospirillum sp y Azotobacter sp han demostrado que estas poblaciones adems de fijar nitrgeno en forma asimbitica, tambin segregan sustancias promotoras del crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas), las cuales benefician a la planta de una forma multidimensional . Las hormonas promotoras del crecimiento vegetal, como lo es la auxina: cido Indol Actico (AIA) induce la deformacin y el aumento de pelos radiculares, logrando con esto una mayor captacin de nutrientes y promoviendo en consecuencia el crecimiento y rendimiento de los cultivos . Se ha establecido que las rizobacterias promotoras del desarrollo vegetal (plant-growth promoting rhizobacteria, PGPR), juegan un papel primordial en los cultivos permitiendo disminuir la utilizacin de fertilizantes qumicos, aumentar el rendimiento, acortar ciclos y por consiguiente, reducir la contaminacin ambiental. Las bacterias representan una alternativa para mejorar el aporte nutricional de las plantas; dentro de los efectos benficos se destacan la secrecin de reguladores de crecimiento de plantas como auxinas mejorando los procesos de germinacin de semillas, nutricin, desarrollo de races etc. En este sentido el objetivo del presente trabajo fue evaluar la produccin AIA a partir de aislados de los gneros Azotobacter sp y Azospirillum sp nativos para hallar cepas eficientes en la produccin de la fitohormona, que posteriormente podrn ser utilizados como biofertilizantes para mejorar la productividad de los pastos.

OBJETIVOS evaluar la produccin AIA cuantificar el acido indolacetico producido PROCEDIMIENTO Para la deteccin y cuantificacin de cido indolactico producido in vitro segn la reaccin colorimtrica de Salkowski descrita por Mantilla (2007) y Garca y muoz (2009), cada bacteria nativa ser cultivada en caldo nutritivo por 24 horas, de donde se tomarn 0,6 mL para inocularlos en 5 mL de caldo tripticasa soya suplementado con triptfano (Anexo 2). Despus de la incubacin a 30 C, por 72 horas en agitacin constante (150 rpm), los cultivos sern centrifugados a 3000 rpm, durante 3 minutos. A continuacin, 0,4 mL de cada uno de los sobrenadantes se depositarn en tubos, se agregarn 1,6 mL del reactivo de Salkowski modificado (Anexo 3) en una relacin 1:4, se mezclarn y se dejarn en reposo durante 30 minutos en oscuridad. La positividad a la produccin de cido indolactico estar dada por la aparicin de una coloracin grosella (Figura 3), y se leer la absorbancia en espectrofotmetro de luz visible a 530 nm. Las concentraciones se calcularn en una recta patrn que se obtendr con diluciones sucesivas de una solucin de 100 ppm de cido indolactico.

cepa 0.6ml Incubar a 30C X 72h En agitacion constante 5ml Caldo tripticasa soya suplementado

centrifugar a 3000 rpm, durante 3 minutos

0.4ml de sobrenadante

30minutos en oscuridad

Tubo centrifugado se sacan 0.4ml

0.4ml sobrenadante + reactivo de Salkowski

leer la absorbancia en espectrofotmetro de luz visible a 530 nm

RESULTADOS

Se agrego a un tubo el reactivo para poder con mayor facilidad

REACTIVO

0.4ml de cada uno de los sobrenadantes

0.4+1.6 del reactvio de salkowski

CONCLUSIONES
LECTURA DE ABSORVANCIAS ACIDO INDOL ACETICO (AIA) CONTROL: 0.098 CEPA I: 0.174 CEPA 3: 0.204 CEPA V: 0.174 CEPA VII: 0.238

PRACTICA DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE FSFORO SOLUBILIZADO IN VITRO INTRODUCCION El fsforo despus del nitrgeno, es el nutriente inorgnico ms requerido por plantas y microorganismos y adems, en el suelo es el factor limitante del desarrollo vegetal a pesar de ser abundante tanto en formas inorgnicas como orgnicas (Alexander 1980). Las plantas deben absorberlo del suelo, donde se encuentra en muy baja concentracin, normalmente en niveles que varan entre 5 y 30 mg kg-1. Estos ndices bajos del nutriente se deben a que el fsforo soluble reacciona con iones como el calcio, el hierro o el aluminio que provocan su precipitacin o fijacin, disminuyendo su disponibilidad para los vegetales (Rodrguez & Fraga 1999). Los fosfatos inorgnicos aplicados como fertilizantes qumicos tambin son inmovilizados en el suelo y como consecuencia no son solubles para ser aprovechados por los cultivos (Peix et al. 2001). Por lo tanto se considera, que la solubilizacin de distintas rocas fosfatadas y de otras fuentes de fsforo inorgnico por los microorganismos del suelo es una alternativa fundamental para incrementar la cantidad de nutriente disponible para las plantas (Illmer & Schinner 1992). Se han aislado de distintos suelos bacterias solubilizadoras de fosfato pertenecientes a los gnerosPseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Agrobacterium, Burkholderia, Achr omobacter, Microccocus,Aerobacter, Flavobacterium y Erwinia (Nahas 1996; Kumar et al. 2001). Estos microorganismos crecen en medios con fosfato triclcico, apatita o materiales insolubles similares como nica fuente de fosfato y no solo asimilan el elemento sino que solubilizan una gran proporcin del mismo, liberndolo en cantidades superiores a sus demandas nutricionales. El principal mecanismo microbiolgico por el cual los compuestos fosfatados son movilizados es la disminucin del pH del medio por la liberacin de cidos orgnicos (Alexander 1980). Se han descrito otros posibles mecanismos que incluyen la eliminacin de protones afuera de la clula y su intercambio con cationes unidos al fsforo o la produccin de cidos inorgnicos como el cido sulfhdrico, el cido ntrico o el cido carbnico (Rodrguez & Fraga 1999). Si bien muchos gneros bacterianos presentan esta capacidad para solubilizar fsforo inorgnico, es de particular inters detectar esta habilidad en grupos que tengan otras propiedades de promocin de crecimiento vegetal, como por ejemplo, capacidad para fijar nitrgeno atmosfrico. Se han aislado microorganismos como Azospirillum lipoferum o Azotobacter chroococcum que adems de ser fijadores libres de nitrgeno, son capaces de promover el crecimiento vegetal mediante la solubilizacin de fosfatos inorgnicos (Murty & Ladha 1988; Kundu & Gaur 1980). Adems, distintas especies de los gnerosRhizobium y Bradyrhizobium, bacterias del suelo que fijan nitrgeno en asociasin simbitica con distintas leguminosas, poseen capacidad de solubilizacin de fsforo inorgnico (Halder & Chakrabartty 1993; Surange & Kumar 1993).

Existen diferentes mtodos para seleccionar microorganismos solubilizadores de compuestos de fsforo inorgnico aislados del suelo. Los distintos criterios presentan sus ventajas y desventajas. Si bien se ha demostrado que la seleccin a partir de la formacin del halo de solubilizacin no es una tcnica infalible (Nautiyal 1999), tampoco la concentracin de fsforo detectada en cultivo lquido lo es (Rodrguez & Fraga 1999). Gyaneshwar y col (1998) demostraron que algunos microorganismos que solubilizan fsforo en condiciones de laboratorio no son capaces de hacerlo en vertisoles alcalinos. Esta incapacidad se debe posiblemente al alto poder de resistencia a los cambios de pH de los suelos alcalinos junto con la baja secrecin de cidos orgnicos que producen los microorganismos en esos ambientes. Gyaneshwar y col (2002) determinaron que es mejor adoptar tcnicas de seleccin de cepas a partir de ensayos que reflejen la capacidad amortiguadora de pH del suelo y por lo tanto seran vlidos slo aquellos mtodos que incorporen soluciones tamponadas a los medios de cultivo. De todas maneras, slo los ensayos de campo, establecern si la capacidad solubilizadora de fsforo inorgnico de los organismos seleccionados in vitro realmente tiene efecto sobre plantas de inters comercial. Sobre la base de los antecedentes enunciados se plantea la siguiente hiptesis de trabajo: numerosos gneros bacterianos del suelo, entre ellos el gnero Bradyrhizobium ampliamente estudiado en funcin de su capacidad para fijar nitrgeno, solubilizan compuestos de fsforo inorgnico. Por lo tanto se establecen los siguientes objetivos: 1) estudiar la capacidad fisiolgica de solubilizacin de fosfato inorgnico en diferentes aislamientos bacterianos de suelos cultivados con soja y 2) detectar esa habilidad en bacterias del gneroBradyrhizobium procedentes de los mismos suelos.

OBJETIVOS evaluar la produccin de fosforo cuantificar el fosforo producido

PROCEDIMIENTO Para la deteccin y cuantificacin de fsforo solubilizado in vitro por las bacterias nativas, se utilizar la metodologa descrita por Vzquez et al. (2000). Cada bacteria nativa ser sembrada mediante puntura superficialo por estra en agar para aislamiento de microorganismos solubilizadores de fsforo, Sundara Rao Sinha Medium, SRSM (Anexo 4). Las placas de Petri se incubarn a 30 C, hasta por 96 horas y las colonias solubilizadoras de fsforo sern reconocidas por el cambio de color del indicador al amarillo y formacin de un halo traslcido alrededor de la colonia. Despus, las colonias se cultivarn nuevamente en agar SRSM, para verificar la actividad solubilizadora de fsforo

y se medir el halo de las colonias que conservan su capacidad para solubilizar fsforo. Para la cuantificacin del fsforo solubilizado, se obtendr el inculo de cada bacteria cultivada en 1 mL de caldo SRSM a 30 C, durante 20 horas, en agitacin constante (150 rpm). A continuacin, 0,6 mL de cada uno de los cultivos bacterianos sern inoculados en frascos con 20 mL de caldo SRSM e incubados a 30 C, con agitacin constante (150 rpm), hasta por 96 horas. Al momento de la inoculacin (0 horas) y despus de 72 horas, se tomarn submuestras de 3 mL de caldo SRSM que sern centrifugados y en el sobrenadante se determinar el pH y se cuantificar el fsforo soluble mediante el mtodo colorimtrico del molibdato segn Rodier y Rodi, 2005 (Anexo 4). Los resultados se expresarn como fsforo solubilizado (ppm).

cepa
1ml

Incubar 30C x 24 h en agitacion constante

Clado SRSM

Centrifugar a 3000rpm

4ml de sobrena dante

Sobrenadante + reactivo de fosforo se lleva al espectofotometro

RESULTADOS

REACTIVO

CONCLUSIONES
LECTURA DE ABSORVANCIAS DE FOSFORO CONTROL: 0.540 CEPA I: 1.168 CEPA 3: 1.036 CEPA V: 0.958 CEPA VII: 1.094

PRACTICA DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE NITRGENO FIJADO IN VITRO INTRODUCCION El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es una de las principales hortalizas cultivadas en el mundo y una de las de mayor valor econmico. En el Per, la produccin asciende a 221594 t por ao y en la regin Lambayeque se estima en 5000 t (Ministerio de Agricultura, 2010). El aumento de la productividad es importante para la rentabilidad del cultivo; sin embargo, sta se ve afectada por diversos factores limitantes como la baja fertilidad del suelo, siendo necesario la aplicacin de nitrgeno (N), fsforo (P) y potasio (K), para asegurar el rendimiento adecuado (Loredo et al., 2004). El nitrgeno, presente en los tejidos verdes de las plantas y en semillas, es considerado un macronutriente junto con el fsforo y el potasio. Los suelos tienen cantidades de nitrgeno muy superiores a las requeridas por los cultivos; sin embargo, casi todo este elemento se encuentra en la materia orgnica y anualmente slo se mineralizan 1 a 3 % del nitrgeno total (Ardila, 2007). Debido a esta liberacin lenta, el nitrgeno es el elemento ms limitante para el crecimiento de los cultivos por lo cual es indispensable el uso de productos sintticos para lograr una produccin agrcola aceptable. El fsforo, de vital importancia para el desarrollo de los vegetales, se encuentra en el suelo como formas solubles en muy baja concentracin, con valores comprendidos entre 5 y 30 mg kg-1, debido a que el fsforo soluble reacciona con calcio, hierro o aluminio que provocan su precipitacin, disminuyendo su disponibilidad para las plantas. Los fosfatos inorgnicos aplicados como fertilizantes qumicos tambin son inmovilizados en el suelo, por lo que mayoritariamente no son aprovechados por los cultivos (Fernndez et al., 2005). Los fertilizantes qumicos han sido benficos para el sector agrcola; no obstante, el abuso en su utilizacin genera residuos que producen salinizacin, problemas en el drenaje, compactacin del suelo y disminucin de la actividad microbiana comprometida en la nutricin vegetal. Cada ao se incrementa la cantidad de fertilizantes aplicados debido a la menor eficiencia de adsorcin en el suelo y absorcin por la planta, aumentando los costos de produccin. Asimismo, se genera un problema ambiental debido a la produccin de gases txicos que se desprenden de los fertilizantes como los xidos de nitrgeno que daan la capa de ozono (Lara et al., 2007). Como una alternativa a los fertilizantes qumicos est la posibilidad de utilizar bacterias del suelo, que como parte de su metabolismo incrementan la fertilidad y benefician a las plantas, por lo que se les ha denominado promotoras del crecimiento de las plantas (PGPRs). Entre sus actividades estn la fijacin del nitrgeno, solubilizacin de fosfatos, produccin de hormonas, antibiticos y otros compuestos de importancia para el desarrollo de los cultivos. Estas bacterias y otros microorganismos usados en la fertilizacin de los suelos agrcolas constituyen los biofertilizantes y ya existen algunos que son comercializados; sin embargo, algunas veces no son efectivos debido a que proceden de condiciones edafoclimticas totalmente diferentes,

por lo que se prefiere el uso de microorganismos propios de los suelos donde van a ser utilizados, adaptados a las condiciones ecolgicas y que puedan ser utilizados, compitiendo exitosamente con la biota nativa. Por lo expuesto, se realiz el presente estudio, cuyo objetivos fueron aislar y caracterizar cepas nativas deAzotobacter spp., as como determinar el efecto de cuatro cepas en el desarrollo del cultivo de tomate en invernadero. OBJETIVOS evaluar la fijacion del nitrogeno por parte de las bacterias estimuladoras del crecimeinto vegetal cuantificar el nitrogeno fijado

PROCEDIMIENTO Para la deteccin y cuantificacin de nitrgeno fijado in vitro por las bacterias nativas, se seguir la metodologa descrita por Lara et al. (2007) y Cadena & Martnez (2011). Cada bacteria ser sembrada por puntura en 6 mL de medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (Nfb) semislido (Anexo 3). La incubacin se realizar en aerobiosis a 30 C, hasta por 1 semana y se considerarn como bacterias fijadoras de nitrgeno aquellas donde se observe una pelcula gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficiey el viraje del indicador del verde al azul en el medio de cultivo (Figura 4). Para la cuantificacin del nitrgeno fijado, segn el mtodo colorimtrico del fenolhipoclorito (Anexo 3) cada una de las bacterias nativas cultivadas en agar nutritivo por 24 horas, sern inoculadas en tubos de 15 x 150 mL conteniendo 3 mL de caldo extracto de suelo 10 % (Anexo 4) y se incubarn a 30 C, por 72 horas en agitacin constante (150 rpm). A continuacin, se agregarn 9 mL de KCl 2M, se agitarn a 150 rpm durante 1 hora y se dejarn en reposo por 1 hora adicional, para despus tomar 10 mL del sobrenadante y centrifugarlos (3000 rpm) durante 3 minutos. Luego, los sobrenadantes se vertern en tubos de dilucin y se aadirn 0,4 mL de solucin alcohlica de fenol al 10 %, 0,4 mL de nitroprusiato de sodio al 0,5 % y 1 mL de solucin oxidante. Los tubos se agitarn para mezclar y se dejarn en reposo durante 1 hora adicional.La positividad a la fijacin de nitrgeno estar dada por la aparicin de una coloracin azul (Figura 5) y se leer la absorbancia en espectrofotmetro de luz visible a 632,9 mm. Las concentraciones se calcularn en una recta patrn obtenida con diluciones sucesivas de una solucin de 100 ppm de cloruro de amonio.

Incubar a 30CX72h

cepa

inocular

3ml Extracto de suelo al 10%

Agregar 9ml de KCL al 2M.luego agitar una hora y dejar una hora en reposo

10ml

Centrifugar 10ml del sobrenadante a 3000rpm Vertir el sobrenadante

0,4 mL de solucin alcohlica de fenol al 10 %, 0,4 mL de nitroprusiato de sodio al 0,5 % y 1 mL de solucin oxidante.

Dejar en reposo 1h

Leer en el espectofotomtro a 632nm (positivo color azul)

RESULTADOS
REACTIVOS Pasando el reactivo a tubo de ensayo

Pasando los sobrenadantes a tubo de ensayo

Tubos de ensayo coloreados con 0,4 mL de solucin alcohlica de fenol al 10 %, 0,4 mL de nitroprusiato de sodio al 0,5 % y 1 mL de solucin oxidante listos para ser llevados al espectofotometro para la lectura

CONCLUSIONES
LECTURA DE ABSORVANCIAS DE NITROGENO CONTROL: 0.087 CEPA I: 1.545 CEPA 3: 1.651 CEPA V: 1.311 CEPA VII: 1.607