8/01/08 Ttulo de la prctica: Determinacin cuantitativa del hierro Fundamento de la prctica: En primer lugar, el hierro ferrico presente en la muestra

y unido a la transferrina es liberado por la accin de guanidinio. Seguidamente, el hierro ferrico libre es reducido a ferroso por la hidroxilamina. Posteriormente, el hierro ferroso reacciona con la ferrozina para producir un complejo coloreado. inalmente, la intensidad de formacin del complejo coloreado es medida espectrofotometricamente.
Material: tubos de plstico de un solo uso. Un rotulador de vidrio. 2 pipetas graduadas de 1 ml. 1 pipeta automtica capa de dispensar 200 !l. "untas de pipeta automtica. # cubetas de espectro$otometra. Un espectro$ot%metro. &eactivos

&1 Tampon &2 &eductor &# 'olor 1&23 ',+

'itrato p( 2)2 ,cido ascorbico T"T.

*0 mmol/+ 11#)* mmol/+ /)0 mmol/+

"atr%n primario acuoso de (ierro 100 4g/d+ --

&eactivo de traba5o 6&T7: 8isolver el contenido de un vial de & 2 &eductor en un $rasco de & 1 Tamp%n. Tapar 9 me clar suavemente :asta disolver su contenido. ;stabilidad del reactivo de traba5o: 1 mes en nevera 62<8 ='7. &#: +isto para su uso.

"rocedimiento:

;s una t>cnica ?ue se desarrolla en dos pasos

&T 6m+7 "atr%n 64l7 Muestra 64l7

@lanco 1)0 << <

"atron 1)0 2*0 <<

Muestra 1)0 < 2*0

1. Ae vierte en la cubeta un poco de agua destilada 9 se mide su absorbancia 2. Ae prepara la muestra patr%n 9 se mide su absorbancia #. Ae prepara 9 se mide la absorbancia de la muestra problema B. Ae aCade una gota de &# 6T"T.7 a cada tubo) se mide su absorbancia de cada uno. +ongitud de onda: ..........*/* nm 6**0<0007 'ubeta:...............................1 cm paso de lu Temperatura .....................#D=' / #0=' / 2*=' ,5ustar el espectro$ot%metro a cero $rente a agua destilada. "ipetear en una cubeta. &esultados: ,bsorvancias medidas: @lanco 1E Medicion 0)000 2E con T"T. 0)000 6,2< ,17 Muestra 6,2< ,17 "atr%n "atron 0.*1* 0.021 Muestra 0.BDD 0.10*

F 100 6conc. patr%n7 G 4g/dl de Fe en muestra

60)BDD< 0)10*7 Muestra F 100 6conc. patr%n7 G 8#)# 4g/dl de Fe en muestra 60)*1*< 0)0217 "atr%n 1nterpretaci%n de los resultados: H,+2&;A 8; &;F;&;3'1, (ombres: 0* < 1B* 4g/d+ 611)0< #1)# 4mol/+7 Mu5eres: B0 < 1*0 4g/d+ 6D)10 < 20)8* 4mol/+7. ;stos valores son orientativos. ;s recomendable ?ue cada laboratorio estable ca sus propios valores de re$erencia. ;l resultado obtenido :a sido 8#)# 4g/dl de Fe en muestra) este resultado se encuentra dentro de los valores normales

1D/01/08

Ttulo de la prctica: rmula leucocitaria Fundamento de la prctica: +a $ormula leucocitaria o recuento di$erencial leucocitario 6&8+7 consiste en la determinaci%n del porcenta5e ?ue representa cada uno de los tipos de leucocitos con respecto al total de ellos.
Material:

Microscopio. "apel 9 lpi o un registrador automtico de c>lulas. ;ste Iltimo consiste en un aparato ?ue tiene unas teclas. 'ada tecla representa a un tipo de leucocito 9 :ace una anotaci%n cada ve ?ue es presionada. 'uando el nImero de anotaciones llega a 100) suena una alarma. ,ceite de inmersi%n ;Jtensi%n de sangre teCida "apel de %ptica

"rocedimiento: 1. "reparar el microscopio para ?ue tenga el condensador alto 9 el dia$ragma abierto. 2. ;n$ocar la preparaci%n con el ob5etivo de 10 J. #. 'omprobar ?ue la preparaci%n es buena 9 elegir una ona en la ?ue los :emates no est>n superpuestos 9 los leucocitos se encuentren uni$ormemente distribuidos. B. ;n$ocar esa ona de la preparaci%n con el ob5etivo de inmersi%n. *. 2bservar esa ona de la preparaci%n mientras se describe un recorrido en $orma de almenas o de greca. &esultados: +as c>lulas contadas pueden anotarse mediante un registrador automtico de c>lulasK pero esto tambi>n puede :acerse mediante un lpi 9 papel. "ara ello se dibu5an unas columnas ?ue representen cada un tipo de leucocito) 9 se tra a una ra9a en la columna correspondiente cada ve

?ue se ve un leucocito) o tambi>n se puede utili ar el m>todo ?ue se ve en la $igura anterior. 'uanto ma9or es el nImero de leucocitos contados) mas eJacta es la determinaci%n. Ain embargo) en la practica solo se cuentan 100 leucocitos o) como mJimo) 200. Ai se encuentra un ma9or numero de lin$ocitos ?ue de neutr%$ilos 6en el adulto7 o ms de un 10L de eosin%$ilos o ms de un 12L de monocitos) el &8+ se :ace contando 200 leucocitos 9 dividiendo) posteriormente) el resultado obtenido entre 2.

1nterpretaci%n de los resultados: (a9 ?ue tener en cuenta ?ue :asta los B aCos de vida se observa una inversi%n de la $ormula leucocitaria) es decir) normalmente se encuentran en sangre peri$>rica ms lin$ocitos ?ue neutr%$ilos. +as alteraciones cuantitativas de los leucocitos se reseCan en la siguiente tabla:
VALORES obtenidos NEUTROFILOS SE&MENTA'OS NEUTROFILOS EN .A/A'O EOSINOFILOS BASOFILOS MONO.ITOS ) 0-800/mm * 0-200/mm 5
3

VALORES NORMALES 2.000-8.000/mm (*-+* 0-0 1 0-800/mm 0-* 1 0-200/mm 5-2 1

3 3

VALORES ALTOS Ne t!o"i#i$ 'es,i$-ion $ #$ i23 ie!d$ Eosino"i#i$ B$so"i#i$

VALORES BAJOS Ne t!o%eni$ 'es,i$-ion $ #$ de!e-4$ Eosino%eni$ B$so%eni$ Mono-ito%eni$

Lin"o%eni$

2.000-8.000/mm ()

5)0-5.000/mm (

5)0-5.000/mm 6-81
3

Mono-itosis
3

LINFO.ITOS

5.000-*.000/mm
6(1

5.000-*.000/mm
20-(( 1

Lin"o-itosis

En esta imagen se expresa el lugar y la forma de hacer el recuento diferencial B

i!nica. 1D/01/08 inalmente, la hemoglobina "# se cuantifica mediante lectura espectrofotom$trica a %&' nm. (ubos de recogida de sangre )ue contengan heparina o ED(" como anticoagulante. Pipetas Pasteur. Pipetas graduadas de #, ' y &* ml. +na prepipeta o pera de aspiracin. ,icropipetas autom-ticas capaces de dispensar '*, &** y #** .l. Puntas de micropipeta /amarillas0. +n rotulador de vidrio. (ubos de ensayo. +na gradilla. +n espectrofotmetro ajustable a %&' nm. 1ubetas de espectrofotmetro. Papel y un bol2grafo. "gua destilada o desionizada. 3eactivo, tampn biolgico &'mol4l, detergente *,& g4l, p5 6,! ,icrocolumnas 1ontienen una resina de intercambio aninico e)uilibrada. En ella )uedan retenidas las hemoglobinas. "rocedimiento: 1. , partir de la sangre problema se :a de preparar un :emoli ado ?ue contenga la (b libre en soluci%n. ;ste hemolizado se prepara de la siguiente $orma: a7 "ipetear en un tubo de ensa9o *0 !l de sangre 9 200 !l de reactivo. b7 ,gitar bien. ;ste :emoli ado se utili ara en la separaci%n 9 lectura de la (b ,2. 2. , partir del :emoli ado anterior se debe preparar una diluci%n ?ue contenga la (b a una concentraci%n menor. ;sta dilucin del hemolizado se prepara de la siguiente manera: a7 "ipetear en un tubo de ensa9o *0 41 de :emoli ado 9 12 ml de agua destilada. b7 ,gitar bien. ;sta diluci%n del :emoli ado se emplear en la lectura de la (b total. 6"aso /7 #. 8estapar la parte superior de la microcolumna) romper a continuaci%n la lengMeta in$erior 9 ba5ar el disco superior :asta el nivel de la resina) evitando comprimirla) con la a9uda del eJtremo piano de una pipeta. Material:

B. 8e5ar gotear :asta ?ue el l?uido alcance el nivel del disco) desec:ando el eludo. *. ,plicar cuidadosamente sobre el disco superior *0 41 de :emoli ado 9 se desec:a el eludo. 0. 'uando :a9a penetrado todo el :emoli ado aCadir) procurando arrastrar los posibles restos del mismo) 200 !l de reactivo 9 se desec:a el eludo. D. 'olocar la microcolumna sobre un tubo de ensa9o 9 aCadir: #)0 ml de reactivo 9 se recoge el eludo 6$racci%n de (b,27 8. ,gitar bien 9 leer la absorbancia de la $racci%n (b ,2 a B1* nm. $rente a agua destilada 6,(b,27. /. ,gitar bien la diluci%n del :emoli ado) preparada previamente 9 ?ue contiene toda la (b. 10. +eer a B1* nm. 9 $rente a agua destilada) la absorbancia de la (b total 6,(bT7. &esultados: Tubos @lanco (b,2 (bt ,bsorbancia 0)000 0)0D/ 0)08# H (b,2 G # ml. H (bt G 12 ml. Una ve e$ectuadas las medidas de absorbancia) se calcula el porcenta5e ?ue representa) en la muestra) la (b,2 con respecto al resto de las :emoglobinas. "ara ello) se utili a la siguiente $ormula: ,(b,2 J H(b,2 J 100G L (b,2 ,(bt J H(bt 0)0D/ F # J 100G 2)8/ L (b,2 0)08# F 12 1nterpretaci%n de los resultados: +os valores normales de (b ,2 en la sangre peri$>rica estn comprendidos) entre el 1)#L 9 el #)DL del total de la :emoglobina presente en a?uella. Un aumento del porcenta5e normal de la (b,2 detectada en la sangre) ?ue oscila entre el B 9 el 10L) suele darse en la N<talasemia. 'uando se encuentra un porcenta5e de (b ,2 sangunea superior al 10L) es probable ?ue ello se deba a la eJistencia en la sangre de :emoglobinas an%malas 6(b ;) (b ') (b Ooln) etc.7 ?ue tienen un punto 1soelectricoP 6pl7 similar al de la (b ,2 9 ?ue) debido a ello) son eludas 5unto con esta) por lo

?ue $alsean la determinaci%n. +os resultados obtenidos se encuentran dentro de los valores normales por lo tanto no :a9 una N< talasemia. +a N<talasemia es una :emoglobinopatia :ereditaria caracteri ada por una producci%n disminuida de cadenas globnicas N. ;stas cadenas $orman parte de la estructura de la :emoglobina ,7. ;n el rasgo N<talas>mico la concentraci%n de :emoglobina ,2 en sangre se encuentra elevada 9a ?ue se produce un aumento de la sntesis de :emoglobinas no constituidas por cadenas N. ;n el diagn%stico del rasgo N<talas>mico) deben tenerse en cuenta tanto los niveles de :emoglobina ,2 como el :istorial $amiliar 9 los datos de laboratorio) inclu9endo el :ierro en suero 9 la capacidad de $i5aci%n del :ierro) la mor$ologa de los :emates) la :emoglobina) el :ematocrito 9 el volumen corpuscular medio. ;l diagn%stico clnico no debe reali arse teniendo en cuenta el resultado de unQ Inico ensa9o) sino ?ue debe integrar los datos clnicos 9 de laboratorio.

1D/01/08 Ttulo de la prctica: Determinacin del grupo sangu2neo en porta Fundamento de la prctica: 1onsiste en observar la aglutinacin de los hemat2es enfrentados a una serie de antisueros conocidos y de reconocida eficacia, para determinar el grupo "78 del individuo. Material: # portaobjetos o tarjeta visualizadora de fondo blanco. +n rotulador de vidrio. +na pipeta pasteur desechable. D

 Palillos mezcladores. reloj.

Suero anti9". Suero anti97. Suero anti9 "7 Aangre capilar o sangre total anticoagulada) citratada u oJalatada.

"rocedimiento: 1. 'oger dos portaob5etos. Marcar una con la letra ,) otra con letra @ 9 otra con las letras , 9 @ 2. 8epositar una gota de suero anti<, 6a ul7 en la secci%n , del portaob5etos) una gota del suero anti<@ 6amarillo7 en la secci%n @) 9 otra gota de anti<,@ 6transparente7 e3 la secci%n ,@. #. Aituar una pe?ueCa gota de sangre 6aproJimadamente la mitad del volumen usado de antisuero7 5unto a la gota de antisuero. B. Me clar ambas gotas en cada secci%n utili ando un palillo distinto en cada una de ellas 9 $ormando un circulo de 2 a 2)* cm de diametro. *. (acer oscilar suavemente el portaob5etos :acia delante 9 :acia detrs) durante dos minutos. 0. 2bservar la presencia o ausencia de aglutinaci%n. +ectura de resultados: (a9 aglutinaci%n cuando aparecen unos grumos ro5os ?ue $lotan en un li?ui< do claro. ;n el caso contrario) los :emates permanecen en $orma de suspen< si%n :omog>nea de color ro5i o. +a presencia o ausencia de aglutinaci%n puede con$irmarse mediante eJamen microsc%pico de las me clas. ;n general estas pruebas son mu9 e$icaces 9a ?ue la presencia de plasma en la muestra aumenta la velocidad de la reacci%n 9 el tamaCo de los grumos. ;l resultado puede observarse en unos segundos) aun?ue conviene reeJaminar la reacci%n del anti<, al cabo de 2 minutos para comprobar ?ue no se :a pasado por alto ninguna reaccion debil. ;stas suelen ocurrir en menos de un 1 L de las muestras anali adas. 1nterpretaci%n de los resultados: ;l grupo eritrocitario ?ue se le asignara) atendiendo a los resultados obtenidos) se

puede ver en el cuadro siguiente: Hemates y suero anti-A + < R Hemates y suero anti-B Grupo eritrocitario , R @ R ,@ 0 R G presencia de aglutinacion < G ausencia de aglutinacion ;n el caso de ?ue el grupo obtenido sea el ,) los :emates problema debern ser ensa9ados de nuevo con lectina anti<,1K de $orma ?ue si se produce aglutinaci%n) el su5eto pertenecer al subgrupo ,1.

1D/01/08 Ttulo de la prctica: Determinacin celular en tubo Fundamento :os hemat2es problema contienen las sustancias antig$nicas del sistema "78 y se enfrentan a sueros conocidos )ue poseen anticuerpos frente a esos ant2genos. El resultado final es la presencia o no de aglutinacin en los hemat2es reaccionantes. Materiales: Tubos de centri$uga &otulador de vidrio

"ipetas "asteur 'entri$uga Sradillas Auero anti<, Auero anti<@ Auero anti<,@ Aolucion salina $isiologica. Aangre total anticoagulada. "ara esta t>cnica es pre$erible usar una suspensi%n de los :emates problema.

"rocedimiento: 1. ;n primer lugar reali amos el lavado de los :emates problema. "ara ello rotulamos convenientemente un tubo de centri$uga 9 aCadimos 1 ml de la muestra de sangre. 'ompletamos el tubo con soluci%n salina 9 agitamos para suspender los :emates. 'entri$ugamos B minutos a 2000 r.p.m. 9 decantamos el sobrenadante. 2. , los :emates del tubo les aCadimos una cantidad su$iciente de soluci%n salina como para obtener una suspensi%n al 2L. ;sto es aproJimado) aun?ue debemos establecer los limites entre el 2 9 el BL #. &otular tres tubos de ensa9o bien limpios con las letras ,) @ 9 ,@. B. ,Cadir a cada tubo una gota de la suspensi%n de :emates al 2L. *. ,Cadir dos gotas de suero anti<, en el tubo ,) dos gotas de anti<@ en el tubo @) 9 dos gotas de anti<,@ en el tubo ,@. 0. 'entri$ugamos todos los tubos durante 1 minuto a 1.000 r.p.m. o #0 segundos a #.B00 r.p.m 6centri$uga de inmuno:ematologia7. +ectura de resultados 8espu>s de centri$ugar) golpeamos suavemente el $ondo de cada tubo para desprender el sedimento 9 observar macrosc%picamente la presencia o ausencia de aglutinaci%n. &eacci%n negativa: +os :emates se resuspenden :omogeneamente. &eacci%n positiva: Ae observa un bot%n de :emates ?ue permanecen unidos una ve desprendido el sedimento. 1nterpretaci%n clnica:

10

Ae reali a igual ?ue en la t>cnica en porta. ;s importante destacar ?ue los restos de detergente o sustancias eJtraCas en los tubos pueden ocasionar $alsos negativos. Tambi>n pueden darse $alsos positivos) principalmente por dos motivos: ,glutinaci%n no especi$ica: Ae debe a la presencia de acido :ialuronico en la sangre) procedente de la gelatina de T:arton del cord%n umbilical) 9 se elimina aCadiendo una gota de :ialuronidasa a la suspensi%n de :emates. Fenomeno de &ouleauJ: 'onsiste en una agrupaci%n no espec$ica de :emates) ?ue adoptan una imagen de pilas de monedas. +as sustancias ?ue mas $recuentemente originan este $en%meno son: el $ibrin%geno) las gammaglobulinas) el deJtrano 9 la polivinilpirrolidona. ;stos $en%menos pueden evitarse con el lavado previo de los :emates problema.

1D/01/08 Ttulo de la prctica: Determinacin del grupo 3h en porta

11

Fundamento :a t$cnica est- basada en la deteccin del ant2geno D sobre la superficie de los hemat2es problema, empleando como reactivo un suero monoclonal humano )ue contiene anticuerpos anti9D. En el caso de )ue los hemat2es contengan el ant2geno D se producir- una tinacin )ue puede observarse a simple vista. Material: "ortaob5etos "ipetas "asteur. &otulador de vidrio. "alillos agitadores. Auero anti<8. Aangre total anticoagulada. "rocedimiento 1. 8epositar una gota de suero anti<8 sobre el porta 2. Aituar una pe?ueCa gota de sangre 6aproJimadamente la mitad del volumen usado de antisuero7 5unto a la gota de antisuero. #. Me clar ambas gotas utili ando un palillo distinto en cada una de ellas 9 $ormando un crculo de 2 a 2)* cm de diametro. B. (acer oscilar suavemente el portaob5etos :acia delante 9 :acia detrs) durante dos minutos. *. 2bservar la presencia o ausencia de aglutinaci%n. +ectura de resultados: ;speramos dos minutos antes de dar el resultado de la prueba. Aglutinacin positiva: ,parici%n de grumos ro5os sobre un $ondo claro. 3o deben con$undirse con pe?ueCos cogulos de $ibrina presentes en la muestra. Aglutinacin negativa: +a me cla da lugar a una suspensi%n :omog>nea de los :emates. +a me cla de sangre con albImina bovina debe dar siempre aglutinaci%n negativa. ;n caso de no ser as) no podemos in$ormar del resultado de la prueba. 1nterpretaci%n de los resultados 12

+os resultados se interpretan segIn el siguiente cuadro: Agutinacin Interpretacin n < &: negativo R &: positivo R G ,glutinaci%n positiva < G ,glutinaci%n negativa

1D/01/08 Ttulo de la prctica: Determinacin del grupo 3h en tubo

1#

Fundamento: "l igual )ue en la prueba en portaobjetos, intentamos poner de manifiesto la presencia del ant2geno D en la superficie de los hemat2es mediante su enfrentamiento a un suero anti9D. Material necesario
Tubos

de centr$uga. de vidrio.

&otulador Sradilla. "ipetas

"asteur. 'entr$uga. Auero anti<8. ,lbImina bovina al #0L. Aoluci%n salina $isiol%gica 6al 0)/L7 (emates problema preparados en suspensi%n al *L.,ntes de proceder a suspender los :emates debemos lavarlos tres veces en soluci%n salina $isiol%gica. "ara ello tomamos un volumen aproJimado de 0)* ml de la sangre problema 9 la llevamos a un tubo de centr$uga. 'ompletamos el tubo con soluci%n salina 9 agitamos suavemente para resuspender los :emates. 'entri$ugamos durante B minutos a 2.000 r.p.m. "osteriormente retiramos el sobrenadante 9 repetimos el proceso dos veces ms. ;l sedimento :emtico resultante se resuspende en la cantidad de soluci%n salina necesaria para obtener una suspensi%n al *L. "rocedimiento: 1. &otulamos dos tubos limpios con las letras 8 9 ,. 2. ;n el tubo 8 aCadimos una gota de suero anti<8 9 el tubo , ponemos una gota de albImina bovina al #0L. #. , cada tubo le aCadimos una gota de la suspensi%n de :emates al *L. ,gitamos suavemente para me clar el contenido de los tubos. B. 'entri$ugamos durante 1 minuto a 1000 r.p.m. o #0 segundos a #.*00 r.p.m. +ectura de resultados 'on el pulpe5o de los dedos medio 9 anular golpeamos suavemente el $ondo de los tubos para despegar el bot%n :emtico. Ae considera aglutinaci%n positiva si se $orman grumos de color ro5o en un l?uido claro. "or el contrario) si se resuspenden :omog>neamente los :emates) decimos ?ue la aglutinaci%n es negativa.

1B

;l tubo con albImina es un control negativo) 9 debe dar siempre ausencia de aglutinaci%n. ;n caso de no ser as. ;l resultado de la prueba no es vlido. 1nterpretaci%n clnica de los resultados: Ai el tubo 8 presenta aglutinaci%n 9 el tubo , no) decimos ?ue el paciente es &: positivo. Ai no se produce aglutinaci%n en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a #D= ' durante media :ora. "osteriormente centri$ugamos a 1.000 r.p.m. durante un minuto 9 observamos si eJiste o no aglutinaci%n. ;n el caso de persistir la negatividad comprobaremos ?ue el paciente no posee un 8U 68 d>bil7 mediante una prueba de 'oombs indirecta. Ai despu>s de todos estos pasos el resultado es la no aglutinaci%n) in$ormaremos ?ue el paciente es &: negativo.

1*

2B/01/08 Ttulo de la prctica: Determinacin s$rica del grupo "78 Fundamento: El suero de un individuo slo debe contener anticuerpos frente a los ant2genos )ue no est-n presentes en sus propios hemat2es. Por ello, al hacer reaccionar este suero con hemat2es conocidos del grupo " y del grupo 7, slo producir- aglutinacin en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con ant2genos distintos a los de sus propios hemat2es. Esta t$cnica puede realizarse tanto en porta como en tubo, aun)ue se prefiere la determinacin en tubo por)ue la centrifugacin de los hemat2es intensifica el fenmeno de aglutinacin. Material necesario
Tubos

de centr$uga. "ipetas "asteur. @aCo de agua. 'entr$uga &elo5. &otulador de vidrio.

Sradilla. (emates (emates (emates Auero

del grupo , (emates del grupo @. del grupo 0. de la sangre problema

obtenido mediante coagulaci%n de la sangre en baCo de agua a #D =' durante 20 a #0 minutos. "osteriormente centri$ugamos durante 10 minutos a #.000 r.p.m. 9 eJtraemos el sobrenadante con a9uda de una pipeta "asteur. "rocedimiento: 1. "ara evitar $alsos negativos por la presencia de complemento activo en el suero) es aconse5able la inactivaci%n previa de la muestra. ;sto se reali a manteniendo el suero en un baCo de agua a *0 =' durante 10 minutos. 'on esto evitamos los $en%menos de :em%lisis debidos al complemento. 2. +avamos tres veces los :emates propios de la sangre problema con soluci%n salina isot%nica segIn la t>cnica descrita en la prctica FH111. "osteriormente preparamos una suspensi%n de estos :emates al *L en 10

soluci%n salina. #. &otulamos un tubo de centr$uga con la letra ,1) otro @) otro 2 9 otro '. B. ,Cadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado. *. 8epositamos una gota de la suspensi%n de :emates ?ue se corresponda con la letra del tubo rotulado. ;n el tubo ' aCadimos una gota de la sus< pensi%n de los :emates propios de la sangre problema) 9a ?ue nos ser< vir de control negativo. 0. ,gitamos suavemente 9 centri$ugamos a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto. +ectura de resultados Solpeamos suavemente el eJtremo in$erior de los tubos para despegar el sedimento :emtico. Ai aparecen unos grumos ro5os $lotando en un l?uido claro indica ?ue eJiste aglutinaci%n. ;n el caso contrario) los :emates se resuspenden :omog>neamente dando lugar a un l?uido de color ro5i o. 1nterpretaci%n clnica de los resultados: ;l grupo eritrocitario ?ue se asignar) atendiendo a los resultados obtenidos) se puede ver en el siguiente cuadro) aun?ue nosotros solo utili amos un tubo para el grupo , gen>rico: Tu o Al Tu o A! Tu o B Tu o Tu o # Ac presentes Grupo " en el suero eritrocitario R < < ,nti<@ ,$ - o RP < R < < ,nti<@ 9 anti<,1 U ,2 < R R < < ,nti<, @ < < R R R ,nti<, 9 anti<@ 2 < - o RU R < < R < R < < R < < R ,@ 3inguno $ 3inguno o ,nti< ,2 @ ,1 ,utoanticuerpos 1ninterpretable

R G ,glutinaci%n < G 3o aglutinaci%n P G ;ste anti<,l se encuentra s%lo en un 2L de los individios ,2. U G ;ste resultado se observa s%lo en el 2*L de los individuos ,2@. ;s di$cil con$irmar el grupo sanguneo por esta t>cnica en el caso de los reci>n nacidos) 9a ?ue sus anticuerpos no estn bien desarrollados aIn. Tambi>n encontramos di$icultades en los pacientes con agammaglobulinemia) 9a ?ue carecen de anticuerpos) 9 en a?uellos ?ue poseen otros anticuerpos espec$icos o inespec$icos capaces de reaccionar con los antgenos del grupo ,@2.

1D

%iscrepancias entre la prue a celular y la s&rica ;n el caso de no obtener el mismo resultado en ambas pruebas debemos proceder de la siguiente manera: 5. &epetir ambas pruebas. 2. ;n el caso de persistir la discrepancia) se obtendr una nueva muestra de sangre 9 se reali arn ambas pruebas utili ando :emates lavados 9 resus< pendidos correctamente a la concentraci%n %ptima de cada t>cnica. 6. ;$ectuar una prueba de 'oombs directo sobre los :emates para detectar posibles autoanticuerpos. (. &eali ar la prueba s>rica utili ando un panel de screening con :emates ,1) ,2) @) 2. #ausas de la discrepancia entre la prue a celular y s&rica +as causas ms $recuentes obedecen a tres tipos distintos: 1. ;rrores t>cnicos: 1denti$icaci%n incorrecta de las muestras o anotaci%n de los resultados. 3o aCadir todos los reactivos 9 muestras correspondientes. 'ontaminaci%n de los reactivos o :emates del panel de screening. "roporci%n inadecuada de muestra 9 reactivos. Aobrecentri$ugaci%n o centri$ugaci%n insu$iciente. 3o valorar la :em%lisis considerndola como aglutinaci%n negativa. 2. "roblemas con la muestra: "resencia de autoanticuerpos. ,ntgenos , o @ d>biles) cong>nitos o ad?uiridos. ;speci$icidad @ ad?uirida en pacientes ,1.) por una in$ecci%n bacteriana. 1nmunode$iciencias cong>nitas o ad?uiridas.

2//01/08 18

Ttulo de la prctica: Deteccin del car-cter secretor de los ant2genos del grupo sangu2neo "75 de la saliva Fundamento de la prctica: Esta pr-ctica consiste en poner en contacto la saliva de la persona sometida a estudio con sueros )ue contienen anticuerpos dirigidos espec2ficamente contra los ant2genos del sistema "75 )ue se cree )ue pueden ser secretados. Seguidamente, se pone en contacto la mezcla anterior con hemat2es )ue presentan en su superficie el antigeno estudiado. Por ejemplo, si una persona es del grupo ", se pone en contacto con su saliva, en primer lugar con un suero anti9" y, posteriormente, con hemat2es del grupo ". +na persona secretora tiene presentes en su saliva los ant2genos del sistema "75 )ue se encuentran en la superficie de sus hemat2es. Debido a ello, al poner en contacto su saliva con sueros )ue contienen anticuerpos dirigidos espec2ficamente contra estos ant2genos, no se verifica un blo)ueo de estos ;ltimos. Por consiguiente, al a<adir a la mezcla anterior, los hemat2es susceptibles de ser aglutinados, no se producir- una aglutinacin de los mismos. Por el contrario si la persona no es secretora, no tiene presentes en su saliva los ant2genos del sistema "75 )ue se encuentran en la superficie de sus hemat2es. Debido a ello, al poner en contacto su saliva con sueros )ue contienen anticuerpos dirigidos espec2ficamente contra estos ant2genos, no se verifica un blo)ueo de estos ;ltimos. Por consiguiente al a<adir a la mezcla anterior, los hemat2es susceptibles de ser aglutinados se producir-n una aglutinacin de estos ;ltimos. 1omo en esta prueba lo )ue indica positividad /posesin de car-cter secretor0 es la ausencia de aglutinacin y lo )ue indica negatividad /carencia de car-cter secretor0 es la aparicin de aglutinacin se dice )ue es una t$cnica de inhibicin de la hemoaglutinacin. Material necesario: Tubos de ensa9o apropiados para centri$ugaci%n Un rotulador de vidrio "ipetas "asteur Un cron%metro Una centr$uga Un baCo de agua &activos: Auero $isiol%gico +ectina anti<( Auero anti<, Auero anti<@ (emates de tipo , 9 @ adecuadamente lavados 9 suspendidos al #<*L en suero $isiol%gico Aaliva de una persona no secretora) adecuadamente procesada

1/

Muestra: 8e 2 a * ml de saliva) recogida en un recipiente apropiado o) directamente) en un tubo de ensa9o. ;sta saliva debe ser procesada de la siguiente $orma: 'alentar la saliva) poco tiempo despu>s de su recolecci%n) durante 10 minutos) en un baCo de agua previamente a5ustado a temperatura de ebullici%n. 'on esto se pretende la destrucci%n de las en imas salivares. 'entri$ugar durante * minutos) a unas #*00 r.p.m. Tras esto se :a de obtener un sobrenadante claro. &ecoger el sobrenadante 9 trans$erirlo a un tubo de ensa9o limpio) previamente rotulado con las siglas UMAU 6de muestra de saliva7 9 con la $ec:a de procesamiento. 'onservar la muestra de saliva) convenientemente procesada) a 2<8 grados) :asta el da de su anlisis. Tambi>n puede congelarse la muestra) durante perodos largos de tiempo. T>cnica: 1=< &otular un tubo de ensa9o con la letra ' 6de control7 9 otra con la letra T 6de test7 2=< Aituar) en ambos tubos) 1 gota de lectina o del antisuero capa de reaccionar con el antgeno ?ue se pretende detectar 6(), o @7. ;l antisuero o lectina a utili ar depende del grupo ,@2 al ?ue pertenece la persona investigada. #=< ,Cadir una gota de la saliva procedente de una persona no secretora) en el tubo ') 9 una gota de la muestra en el tubo T. B=< ,gitar el contenido de ambos tubos :asta obtener una buena me cla de las substancias *=< 1ncubar ambos tubos) a temperatura ambiente 620<2* grados7) durante 10 minutos 0=< ,gregar a cada tubo una gota de la suspensi%n de :emates ?ue presenta el antgeno sometido a estudio D=< ,gitar el contenido de ambos tubos :asta obtener una buena me cla de todas las sustancias ?ue contienen 8=< 1ncubar los dos tubos) a temperatura ambiente) durante * minutos /=< 1nmediatamente despu>s) centri$ugar el contenido de ambos tubos) a unas #*00 r.p.m.) durante unos 20 segundos 10=< Mediante un suave golpeteo e5ercido con los dedos resuspender el bot%n sedimentario $ormado en el $ondo de cada uno de los tubos +ectura de los resultados: (a9 aglutinaci%n cuando aparecen unos grumos ro5os ?ue $lotan en un l?uido claro. ;n el caso contrario los :emates se resuspenden :omog>neamente) dando lugar a un l?uido de color ro5i o. ;n esta prueba) la presencia de aglutinaci%n es considerada como un resultado negativo 9 la ausencia de aglutinaci%n indica un resultado positivo. Un resultado negativo se produce en personas no secretoras 9 un resultado positivo en personas secretoras

20

Ai los aglutinados $ormados son d>biles) una vigorosa agitaci%n durante la resuspensi%n del bot%n sedimentario) puede dispersarlos 9 dar lugar a una err%nea lectura del resultado. "ueden aparecer $alsos positivos o negativos a consecuencia de una contaminaci%n de los reactivos) un inadecuado almacenamiento de los mismos) una incorrecta incubaci%n o centri$ugaci%n) una omisi%n de alguno de los reactivos 9 en determinados procesos patol%gicos. Aaliva , 6"aula7: no :a9 aglutinaci%n por lo ?ue es una persona secretora. Aaliva @ 6Ftima7: se aprecia aglutinaci%n tras e5ercer un suave golprteo por no ?ue no es secretora. 1nterpretaci%n de los resultados obtenidos: ;l 80L de las personas de ra a caucsica son secretoras. +a detecci%n del carcter secretor de una persona puede tener inter>s en el mbito de la medicina legal. ,s pues) por e5emplo) si se encuentra esperma en el lugar donde se :a cometido un acto delictivo 9 se determina analticamente el carcter no secretor del individuo del ?ue procede este l?uido corporal) posteriormente) se puede descartar la autora del :ec:o criminal por parte de un sospec:oso) en el caso de ?ue) tras el estudio de la saliva de >ste) se estable ca su carcter secretor. ;n el /0L de la poblaci%n) tambi>n se encuentra una gran cantidad de antgenos +eVis 6a o b7) en la saliva. ;n el 10L restante de la poblaci%n) no se encuentran antgenos +eVis en la saliva. ,tendiendo a la presencia o ausencia en la saliva de antgenos de los sistemas ,@( 9 +eVis) se clasi$ica a los individuos en cuatro grupos distintos: 1ndividuos secretores ,@( 9 ?ue tambi>n eJpresan antgenos del sistema +eVis. &epresentan el D0L de la poblaci%n. 1ndividuos no secretores ,@() pero ?ue eJpresan antgenos +eVis 6principalmente el a7. 'onstitu9en el 20L de la poblaci%n. 1ndividuos secretores ,@() pero ?ue no eJpresan antgenos +eVis. &epresentan el /L de la poblaci%n. 1ndividuos no secretores ,@( 9 ?ue tampoco eJpresan antgenos +eVis. 'onstitu9en el 1L de la poblaci%n.

21

20/02/08 Ttulo de la prctica: &ecuento de reticulocitos Fundamento de la prctica: "odemos observar los reticulocitos al microscopio %ptico mediante la tinci%n con colorantes vitales) a ul de metileno o a ul de cresil brillante. ;stos colorantes dan lugar a la precipitaci%n de los restos de ,&3) 9 se observan como $ilamentos de color a ul intenso en el interior de la c>lula. 8ado ?ue el ,&3 del reticulocito desaparece a los pocos das de entran en la sangre) su recuento servir como medida del nImero de c>lulas ?ue libera la m>dula %sea. ;sto es) el nImero de reticulocitos en sangre circulante es) probablemente el me5or 9 ms sencillo indicador de la eritropo9esis. Un aumento puede interpretarse como indicaci%n de una elevada demanda de nuevos eritrocitos 9 un correcto $uncionamiento de la m>dula %sea. "or el contrario cuando la demanda disminu9e o la m>dula %sea $alla en sus $unciones) la ci$ra de reticulocitos ba5a. AegIn el grado de maduraci%n ?ue posea el reticulocito presentar un modelo de reticulocito distinto) de ovillo denso en el caso de los ms inmaduros o de grnulos escasos para los ms maduros. Ae pueden clasi$icar en cuatros grupos distintos. Materiales utili ados: Microscopio %ptico ,ceite de inmersi%n "ipeta "asteur "ortas
Muestra

Un tubo 9a preparado el cual 9a contiene los colorantes 6a ul de cresil brillante7. W sangre anticoagulada con ;8T,. 68ebido a ?ue los reticulocitos tambi>n maduran in vitro) es aconse5able ?ue la sangre utili ada se :a9a eJtrado recientemente) como mJimo 0 :oras antes de su anlisis7. "rocedimiento: 1=< ,Cadir tres gotas de sangre a uno de los tubos 9a preparados ?ue contienen 100 microlitros de colorante estabili ado. 2=< Me clar bien e incubar durante 10<1* minutos a temperatura ambiente. #=< Holver a me clar la suspensi%n B=< 'on la pipeta "asteur aspiramos lo su$iciente para :acer por lo menos con la me cla un par de eJtensiones. 62 ms si sobra7 *=< 8e5ar secar al aire

22

0=< Una ve reali ado todo esto se pasa a observar al microscopio con el ob5etivo de 100J con aceite de inmersi%n. 6+as preparaciones conservan su coloraci%n si se mantienen ale5adas de la lu 7 &esultados 'on una gota de aceite de inmersi%n observamos la eJtensi%n con el ob5etivo de 100 J. +os :emates se :abrn teCido de color verde amarillento 9 los reticulocitos se di$erencian por?ue presentan en su interior unos :ilos $inos de color a ul. Ae deben contar 1.000 :emates en total) 9 el clculo del porcenta5e de reticulocitos es el siguiente: 3= de reticulocitos contados J 100 L reticulocitos G 3= de :emates contados "ara descartar errores en la t>cnica) debemos reali ar dos eJtensiones 9 :acer el recuento en ambas) de manera ?ue la di$erencia entre ellas sea igual o menor a * reticulocitos. ;l resultado $inal es la media de los dos porcenta5es obtenidos. 01 :emates 01 J B G 2BB :emates en 1 campo 1 campo <<<<<< 2BB :emates F campos<<<<<< 1000 :emates FG B)0/ campos &eticulocitos observados en B campos: BRBR#R2 G 1# reticulocitos 1# reticulocitos<<<<< 1000 :emates F reticulocitos <<<<<< 100 :emates FG 1)# L 1nterpretaci%n clnica de los resultados: ;n adultos 9 niCos los valores normales estn entre 0)* 9 1)*L. Ae produce reticulopenia o disminuci%n en la ci$ra de reticulocitos) en casos de aplasia medular) anemia $errop>nica) anemia megaloblstica 9 anemias ?ue cursan con di$icultad en la eritropo9esis. "or el contrario) :a9 reticulocitosis en anemias :emolticas 9 post<:emorrgicas) donde se aumenta el nivel de producci%n de :emates para contrarrestar su p>rdida. +a cantidad de reticulocitos eJpresada en tanto por ciento es un valor relativo re$erido a una ci$ra normal de :emates. "or ello) cuando eJiste una anemia con disminuci%n en la cantidad de :emates se compensa con un aumento en el nImero de reticulocitos 9 debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real. +a correcci%n se :ace en base al valor :ematocrito 6('T7 del paciente) 9 se calcula de la siguiente $orma:

2#

L de reticulocitos corregido '

( reticulocitos

('T. "aciente J ('T. 3ormal

Ai eJiste una anemia mu9 intensa) aparece en sangre peri$>rica un nImero de reticulocitos ma9or del ?ue correspondera por regeneraci%n eritroblstica. ;sto se debe a ?ue el estmulo eritropo9>tico compensador va acompaCado de un perodo de maduraci%n intramedular ms corto 9 una etapa de maduraci%n en sangre peri$>rica ms larga. ;sto se conoce como Udesviaci%n reticulocitariaU 9 se observa en el $rotis por la aparici%n de :emates grandes con un color a ulado 6macrocitos policromticos7. "ara evitar pensar ?ue :a9 una capacidad regenerativa medular intensa se debe :acer una segunda correcci%n del L de reticulocitos en $unci%n de los das ?ue tarda en madurar el reticulocito en sangre peri$>rica) 9 a esto se le llama ndice de produccin reticulocitaria )I*+,Ae obtiene con la siguiente $%rmula: L reticulocitos corregido das de maduraci%n en sangre

I*+ G peri$>rica

+os das ?ue tarda en madurar el reticulocito estn re$le5ados en la tabla 0.FH1<1.) cu9os valores se :an obtenido eJperimentalmente. Hematocrito Tiempo de del paciente maduracin 6L7 )das, ./ $ 0/ $1/ !/ ! $/ !1/ ;l 1"& nos da un valor num>rico de la estimulaci%n :ematopo9>tica por encima de la actividad de la lnea base normal. Un 1"& ma9or de # nos indica un aumento de la actividad eritropo9>tica medular) mientras ?ue un 1"& menor de 2 indica una escasa actividad eritropo9>tica.

1//02/08

2B

Ttulo de la prctica: Determinacin del fenotipo y genotipo del sistema 3h Fundamento de la prctica: Podemos investigar el genotipo del sistema 3h enfrentando los hemat2es problema a distintos antisueros dirigidos contra los ant2genos )ue comprenden el sistema 3h. :a existencia o no de estos ant2genos en la superficie de estos hemat2es se detecta por una reaccin de aglutinacin. :os resultados de estas reacciones se trasladan a una tabla donde podemos ver los posibles genotipos correspondientes. Materiales utili ados: Tubos de centr$uga 'entr$uga &otulador de vidrio "ipetas "asteur desec:ables Sradilla &eactivos: Auero anti<8 Auero anti<; Auero anti<' Auero anti<e Auero anti<c Aoluci%n salina $isiol%gica Auspensi%n de :ematies lavados) al *L en ss$. "rocedimiento: 1=< "rocedemos al lavado de los :emates 9 a preparar su suspensi%n al *L. 2=< &otulamos cinco tubos de centr$uga) cada uno con las letras 8);)')e)c. #=< ;n cada tubo aCadimos una gota del antisuero correspondiente 9 una gota de la suspensi%n de :emates al *L. (omogenei amos suavemente. B=< 'entri$ugamos todos los tubos durante un minuto a 1000 r.p.m. &esultados: Solpeamos suavemente con el pulpe5o de los dedos medio 9 anular en el $ondo de los tubos para despegar el sedimento :emtico. ;l resultado positivo es la presencia de aglutinaci%n) 9 se observa con la presencia de grumos ro5os sobre un l?uido claro. +a ausencia de aglutinaci%n es un resultado negativo) 9 se observa como la suspensi%n :omog>nea de los :emates en un l?uido ro5i o.

2*

Ae :a procedido a reali ar la determinaci%n de una muestra F 9 la aglutinaci%n solo :a apericido en anti<c 9 anti<e) comparando con la tabla signi$ica ?ue el paciente ser dce/dce por consiguiente &:<. 1nterpretaci%n clnica de los resultados: Un resultado positivo indica la presencia del antgeno del sistema &: buscado en ese tubo. ;l resultado negativo indica lo contrario. +os cinco resultados obtenidos eJpresan el $enotipo de la sangre anali ada 9 se comparan con los contenidos en la tabla de $enotipos 9 genotipos del sistema &:. Una ve encontrada la :ilera coincidente) se mira en ella el posible o posibles genotipos correspondientes. ;sto es as por?ue si la sangre anali ada es &: negativa 68<7) se puede determinar su Inico genotipo posible con respecto al sistema &:. Ain embargo) si la sangre es &: positiva 68R7) eJisten varios genotipos posibles ?ue dan lugar al $enotipo previamente detectado.

20

2//01/08 Ttulo de la prctica: +avado 9 suspensi%n de :emates Material: "ipeta "asteur "ipeta de * ml. Tubos de centr$uga Aangre total A.A.F "rocedimiento: 1. ;l tubo ?ue contiene la sangre se centri$uga a #000 r.p.m. durante 10 min. 2. &etiramos el plasma de la sangre total con una pipeta "asteur. #. 'on otra pipeta aCadimos) ms o menos) la misma cantidad de A.A.F. B. 'entri$ugamos a #000 r.p.m. durante 10 min. *. &etiramos el sobrenadante 0. Ae repiten los dos pasos anteriores dos veces ms) :asta ?ue el sobrenadante sea transparente. &esultados: "ara una suspensi%n al *L en un $rasco de 10 ml. Ae :arn los siguientes clculos: 100 ml. Auspensi%n<<<<<<<<<<<< * ml. 8e :emates 10 ml. Auspensi%n<<<<<<<<<<<<<< F FG 0)* ml :emates 9 /)* ml. 8e A.A.F.

2D

08/01/08 Ttulo de la prctica: 'apacidad total de $i5aci%n del :ierro 6'TF(7 Fundamento: :a transferrina s$rica se satura con un exceso de e=> y el exceso no fijado se elimina por precipitacin con carbonato magn$sico, determin-ndose a continuacin la cantidad total de hierro presente. :a diferencia entre la capacidad de fijacin total de hierro hallada /1 (50 y el hierro s$rico inicial /5b0 nos da la capacidad de fijacin de hierro no saturado o residual. Material: 'entr$uga para muestras. ;?uipamiento :abitual de laboratorio Micropipeta Fotocolormetro 'ubetas para $otocolormetro Auero o plasma :eparini ado. +ibre de :em%lisis. Aeparado lo antes posible de los :emates. &;,'T1H2A
&* Aoluci%n Aaturante &0 Magnesio carbonato ,gente "recipitante Aoluci%n de :ierro *00 ug/d+

&;,'T1H2A ,81'123,+;A ;l sobrenadante obtenido se procesa como muestra para la determinaci%n del :ierro: (ierro T"T. manual &e$: 10012B0 (ierro T"T. &e$: 10012B2) 10012B# (ierro 3itro ","A &e$: 10012BB) 10012B* (ierro Ferro.ine &e$: 10012BD) 10012B8 "rocedimiento: 1. "ipetear en los tubos: Muestra 6m+7 0)* & * Aoluci%n saturante 6m+7 1)0 2. Me clar e incubar bien 10 minutos a Tempetarura ambiente 61*<2* E'7 #. ,Cadir a cada tubo: & 0 ,gente precipitante en polvo usando la cuc:ara ?ue viene con el Xit) aproJimadamente D0 mgG 1 dosis. ,Cadir # dosis B. Me clar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente

28

*. 'entri$ugar 1* min. a #000 r.p.m. 0. &ecoger el sobrenadante) cuidadosamente 9 procesar como una muestra para la determinaci%n de :ierros &esultados: Ae calcula segIn lo indicado en las instrucciones de traba5o de la determinaci%n de :ierro. 'FT( G 'oncentraci%n de :ierro en el sobrenadante J # 6Factor de diluci%n7 H,+2&;A 8; &;F;&;3'1, Auero o plasma: 200 Y B00 !g/d+ G #0<D2 umol/+ ;stos valores son orientativos. ;s recomendable ?ue cada laboratorio estable ca sus propios valores de re$erencia. A sorvancias medidas: @lanco 1E Medicion 0)000 2E con T"T. 0)000 6,2< ,17 Muestra 6,2< ,17 "atr%n "atron 0.*1* 0.021 Muestra 0.BDD 0.10*

F 100 6conc. patr%n7 G 4g/dl de Fe en muestra

60)BDD< 0)10*7 Muestra F 100 6conc. patr%n7 G 8#)# 4g/dl de Fe en muestra 60)*1*< 0)0217 "atr%n 'TF(G 8#)# F # G 2B/)/ 4g/dl ;l resultado est dentro de los valores considerados como normales. 1nterpretaci%n de los resultados: ;l :ierro es el constitu9ente de un gran nImero de en imas. +a mioglobina) protena muscular) contiene :ierro) as como el :gado. ;l :ierro es necesario para la producci%n de :emoglobina) mol>cula ?ue transporta el oJgeno en el interior de los gl%bulos ro5os. ;l :ierro se controla) normalmente) 5unto con la capacidad de $i5aci%n total del :ierro 6'FT(7) 9 nos indica la capacidad de uni%n s>rica disponible. ;ncontramos niveles altos de 'FT( en la anemia $errop>nica. 3iveles ba5os en :emocromatosis) cirrosis) :epatitis aguda. ;l diagnostico clnico debe reali arse teniendo en cuenta todos los datos clnicos 9 de laboratorio.

2/

1*/01/08 Ttulo de la prctica: 8eterminaci%n de la Helocidad de Aedimentaci%n Slobular 6HAS7 Fundamento: Para la medicin de la ?S@, se coloca la sangre problema en el interior de un tubo dispuesto verticalmente. En estas condiciones los glbulos rojos de la sangre tienden a ir cayendo, a favor de la fuerza de la gravedad, hacia la parte inferior del tubo. En condiciones normales este proceso es lento, pues la fuerza con la )ue es atra2do cada hemat2e hacia el fondo del tubo es casi compensada por la fuerza ascendente creada por el plasma al desplazarse hacia arriba. :a ?S@ e)uivale a la longitud del recorrido )ue desciende la columna de eritrocitos, desde la parte superior del tubo hacia abajo, en un intervalo de tiempo. Material: Tradicionalmente se :an usado las pipetas 9 la gradilla de Testergreen. &ecientemente se :an incorporado al mercado sistemas semiautomticos ?ue constan de una bomba de succi%n ?ue aspira la sangre :asta enrasar las pipetas a 0. Ain embargo) son ms recomendables otros sistemas ?ue permiten una aspiraci%n sin riesgos de la sangre 9 adems son de $cil reali aci%n 9 ba5o costo. ;l sistema ;ritrosed consta de los siguientes elementos: 7 "ipetas desec:ables de vidrio. 'ada una de ellas tiene un dimetro eJterno de 2)B mm 9 un dimetro interno de 2)1 mm. ;stn graduadas en mm) con marcas blancas) desde el 2 :asta el 1D0. ;n su interior albergan un >mbolo de aspiraci%n de plstico blanco. 7 Sradilla especial) con unas per$oraciones en su base) para situar los tubos me cladores) 9 con otras) en su parte superior 9 media) ?ue permiten soportar verticalmente las pipetas al ser atravesadas por >stas. ,dems) consta de una corredera superior para atrapar las puntas de los >mbolos. Tubos me cladores de polipropileno con tapones de goma per$orable &elo5 avisador. 3eactivos Ae recomienda el uso de citrato s%dico al #)8L como anticoagulante) pero tambi>n se puede utili ar el ;8T,. Ain embargo) no se deben emplear otros anticoagulantes como la :eparina) pues altera el potencial eta de los :emates) ni los oJalatos) pues encogen las c>lulas sanguneas. +o ideal es ?ue el citrato s%dico al #)8L est> contenido en tubos me cladores apropiados. #0

,uestra Ae recomienda el empleo de sangre venosa anticoagulada con citrato s%dico al #)8L en una proporci%n de B a 1 6al 20L7. +o ideal es recoger la sangre en tubos me cladores) ?ue contienen 0)B ml de citrato s%dico al #)8L) 9 al ?ue se aCade sangre venosa problema) :asta el nivel de 2 ml marcado en el tubo me clador. Ai s%lo se dispone de sangre anticoagulada con ;8T,) se puede utili ar una me cla de 2 ml de esta sant con 0)* ml de citrato s%dico al #)8L o con 0)* ml de cloruro s%dico al 0)8*L. ;n cual?uier caso) la muestra siempre :a de estar libre de :em%lisis. "rocedimiento:
1. &eali ar la prueba:

2. #. B.

*. 0. D.

, temperatura ambiente 620<2* ='7) pues a ma9or temperatura asciende la HAS 9 a menor temperata disminu9e la HAS 6debido a ?ue aumenta la viscosidad de la sangre7. ,ntes de las # primeras<:oras transcurridas desde la eJtracci%n de la muestra) pues) tras ese tiempo) los :emates tienden a adoptar una $orma es$>rica 9 desciende la HAS. ;ste tiempo puede prolongarse a 12 :oras si se utili a corno anticoagulante el ;8T, 9 si se conserva la sangre a B ='. Me clar suavemente la sangre 9 el anticoagulante contenidos en el tubo me clador. Aituar el tubo me clador en una de las per$oraciones de la base de la gradilla para HAS. 1ntroducir una pipeta de HAS a trav>s de las per$oraciones superior 9 media de la gradilla ?ue estn locali adas sobre el tubo me clador correspondiente) 9 presionar con la pipeta sobre el tap%n de >ste :asta ?ue su punta lo per$ore 9 alcance el $ondo del tubo. 8espla ar la corredera superior de la gradilla para atrapar la punta del >mbolo de la pipeta) ?ue sobresale. Tomar la gradilla con ambas manos 9 agitarla suavemente para asegurar una correcta me cla de la sangre 9 del anticoagulante. Tirar del >mbolo :asta el $inal de su recorrido 9 romper el mismo por la ona ms d>bil ?ue tiene para este $in. 8e esta $orma se aspira la sangre :asta el enrase 2) de una manera $cil 9 sin $ormaci%n de burbu5as ?ue pueden inter$erir en los resultados de la prueba. ,dems) al usar pipetas desec:ables tambi>n se evita la inter$erencia de la suciedad 9 :umedad ?ue pueden estar presentes en pipetas reutili adas. 8. ,5ustar el relo5 avisador al tiempo de lectura previsto. #1

/. 8e5ar reposar la sangre durante ese tiempo sin ?ue sea a$ectada por vibraciones. ;l diseCo de la gradilla para HAS asegura ?ue) una ve colocada en ella la pipeta de HAS) >sta se :alla dispuesta con una posici%n per$ectamente vertical) es decir) con su e5e longitudinal perpendicular a la base de la gradilla. ;sto es importante) 9a ?ue una inclinaci%n de la pipeta :ace ?ue aumente el resultado de la HAS. &esultados: +a lectura se e$ectIa a la primera :ora 9 a la segunda :ora. 'on el paso del tiempo se delimita una ona de separaci%n entre la columna de eritrocitos 9 el plasma. ,l $inal del tiempo de lectura previsto) se mira en la escala graduada de la pipeta) la marca ?ue coincide con el lmite de separaci%n entre los :emates 9 el plasma. ;l resultado se puede eJpresar de dos maneras: +ongitud en mm del recorrido descendente de la columna de gl%bulos ro5os en una :ora 6HAS de la primera :ora7 9 en dos :oras 6HAS de la segunda :ora7. Zndice de Oat ) ?ue se calcula con la siguiente $%rmula: HAS 2E:. HAS 1E:. R --------Zndice de Oat G -------------2------2 +os valores normales de HAS son los eJpuestos a continuaci%n: HAS la :ora 2a :ora Harones Mu5eres 2<D mm #<10 mm 8<1* mm 12<20 mm

&esultado obtenido #B mm. Ae produ5o un error durante el proceso de medici%n. 1nterpretaci%n clnica de los resultados: +a HAS vara) $isiol%gicamente) en determinadas circunstancias. ,s pues) es ms alta en la mu5er) 9 aumenta en la ve5e 9 a partir del tercer mes del embara o. ;n esta Iltima circunstancia) sus valores vuelven a la normalidad) un mes despu>s del parto. ;l aumento de las protenas plasmticas 6sobre todo el del $ibrin%geno 9 el de las globulinas [2 ) N 9 \7 produce una alteraci%n en las propiedades $sico<?umicas del plasma ?ue conlleva un blo?ueo de las cargas el>ctricas negativas de los :emates. ;ste blo?ueo acarrea un apilamiento de los eritrocitos 9) por tanto) una $ormaci%n de agregados de gl%bulos ro5os. +os agregados :emticos) al ser ms pesados 9 al tener un rea super$icial ms ba5a 6en comparaci%n con su volumen7 ?ue los :emates aislados) descienden ms $cilmente mientras el plasma asciende. 8ebido a lo anterior) la HAS aumenta en alto grado en en$ermedades en las ?ue :a9 una :iperproducci%n de inmunoglobulinas monoclonales 6neoplasias malignas de las c>lulas plasmticas7 9) en menor grado) en en$ermedades ?ue cursan con un aumento inespec$ico de las inmunoglobulinas 6por e5emplo) las en$ermedades autoinmunes7 o con un ascenso de las protenas involucradas en la in$lamaci%n) es decir) de

#2

los reactantes de $ase aguda 6$ibrin%geno) al$a<1 antitripsina) al$a<1 glucoprotena) :aptoglobina 9 ceruloplasmina7. ;ste Iltimo caso es el ms $recuente 9 es propio de las en$ermedades in$ecto<in$lamatorias. "or el contrario) la HAS desciende en las :epatopatas graves ?ue conllevan una :ipoproducci%n de $ibrin%geno. ;l nImero) el tamaCo 9 la $orma de los gl%bulos ro5os tambi>n alteran la HAS. ,s pues: ;n las anemias aumenta la HAS debido a ?ue un nImero pe?ueCo de :emates) englobado en un gran volumen de plasma) sedimenta con ma9or $acilidad. Ain embargo) en las poliglobulias disminu9e la HAS debido a ?ue se incrementan las $uer as de $ricci%n eJistentes entre los eritrocitos. ;n la macrocitosis asciende la HAS debido al ma9or peso 9 a la menor rea super$icial relativa de los :emates. "or ra ones opuestas) en la microcitosis desciende la HAS. ;n las proli$eraciones de $ormas an%malas de los gl%bulos ro5os) la $ormaci%n de apilamientos est di$icultada 9) por consiguiente) disminu9e la HAS. +a alteraci%n de la HAS es un indicador altamente inespec$ico) 9a ?ue s%lo seCala la presencia de una en$ermedad activa) pero no o$rece casi datos acerca del tipo de proceso patol%gico ?ue la origina ni de la gravedad de >ste. A%lo en algunas ocasiones su grado de ascenso es directamente proporcional a la severidad con la ?ue cursa la en$ermedad sub9acente) por lo ?ue puede ser utili ada para controlar la evoluci%n de algunas en$ermedades 6artritis reumatoidea) lupus eritematoso diseminado) endocarditis bacteriana aguda) tuberculosis) etc.7

##

20/02/08 Ttulo de la prctica: 8eterminaci%n de 'oombs directo Fundamento: 1onsiste en enfrentar los hemat2es del paciente al suero de 1oombs espec2fico, para determinar si existen o no autoanticuerpos fijados en la membrana eritrocitaria. Su presencia se manifiesta por la aglutinacin de los hemat2es en el fondo del tubo. En esta t$cnica es importante realizar el control del suero de 1oombs con hemat2es previamente preparados, esto nos permitir- saber en )u$ condiciones se encuentra y si los resultados obtenidos son v-lidos.
Ao hemos utilizado anti 1=91%

Material: Tubos de :em%lisis. 'entr$uga. "ipetas "asteur. @aCo de agua. Sradilla. &otulador de vidrio. 3eactivos Aoluci%n salina $isiol%gica. Auero de 'oombs anti<1gS. Auero anti<8 incompleto 61gS7. (emates normales no sensibili ados. (emates &: 687 positivos. Aangre del grupo 2 sin anticoagulante. ,uestra (emates del paciente preparados de la siguiente manera: 'entri$ugar la sangre para separar el plasma. Tomar un volumen de :emates 9 lavar cuatro veces con soluci%n salina $isiol%gica. "osteriormente resuspenderlos en esta soluci%n al 3<*L. "rocedimiento: &. Preparacin de los hemat2es controlB
(emates normales no sensibili ados: +avar los

:emates cuatro veces con soluci%n salina $isiol%gica 9 resuspenderlos en la misma al 2<*L. (emates sensibili ados con 1gS: +avar los :emates &: positivos cuatro veces en soluci%n salina $isiol%gica 9 resuspenderlos en la misma al *0L. 1ncubamos 0)1 ml de esta suspensi%n con 0)1 ml de suero anti8 incompleto) durante 1 :ora a #D ='. "osteriormente lavar cuatro veces con soluci%n salina 9 resuspender en la misma al 3<*L. 2. ($cnicaB #B

&otulamos tres tubos de :em%lisis con las letras ' 1 ) '2) "1. ;n el tubo '1 aCadimos una gota de los :emates normales no

sensibili ados 9 una gota de suero de 'oombs anti<1gS. ;n el tubo '2 aCadimos una gota de los :emates sensibili ados con 1gS 9 una gota de suero de 'oombs anti<1gS. ;n el tubo "1 aCadimos una gota de los :emates del paciente 9 una gota del suero de 'oombs anti<1gS. 'entri$ugamos todos los tubos a #.000 r.p.m. durante B* segundos. 2bservamos la presencia o la ausencia de aglutinaci%n en los tubos &esultados: 8espu>s de centri$ugar) golpeamos suavemente con el pulpe5o de los dedos anular e ndice para despegar el sedimento :emtico en todos los tubos. +os tubos ?ue presentan aglutinaci%n indican un resultado positivo) es decir) la presencia de anticuerpos sobre la membrana eritrocitaria. ;l tubo '1 es un control negativo) 9 no debe aparecer aglutinaci%n. 8e ser positivo) los resultados no son vlidos. ;l tubo '2 es un controle positivo) 9 siempre deben presentar aglutinaci%n. 8e no ser as) indica ?ue el suero de 'oombs no est en buenas condiciones para su utili aci%n. (a :abido aglutinaci%n en el tubo "1) por lo tanto en la membrana eritrocitaria :a9 anticuerpos 1g<S. 1nterpretaci%n clnica de los resultados: ;n el caso de utili ar tambi>n anti '#<'B si los :emates del paciente presentan aglutinaci%n con el suero de 'oombs anti<1gS 9 no con el suero anti'#<'B) indica ?ue los autoanticuerpos son del tipo 1gS. Ai la aglutinaci%n se produce con el suero anti<'#<'B 9 no con el anti<1gS) indica ?ue eJiste complemento $i5ado a la membrana eritrocitaria por 1gM o 1gS. ;stas inmunoglobulinas no se ponen de mani$iesto con el suero anti<1gS debido a su poca a$inidad por la membrana eritrocitaria 9 se eliminan con el lavado de los :emates. Ai eJiste positividad con ambos antisueros indica ?ue la anemia :emoltica autoinmune es de naturale a miJta.

#*

(a9 ?ue tener en cuenta ?ue eJisten $actores ?ue pueden dar error en esta prueba) tanto $alsos positivos como $alsos negativos) 9 ?ue se resumen a continuaci%n: Falsos positivos: 1.Ae puede producir una sensibili aci%n Uin vitroU de los :emates al mantenerlos durante cierto tiempo a B ='. 2.+avar insu$icientemente los :emates. #.Utili aci%n de un suero de 'oombs ?ue posee anticuerpos capaces de unirse a :emates no sensibili ados. B.'ontaminaci%n bacteriana de la sangre. *.&eticulocitosis elevada en la muestra anali ada. 0.&eacci%n con la slice coloidal de los tubos de cristal Falsos negativos: 1.Tiempo de centri$ugaci%n insu$iciente. 2.Auero de 'oombs en mal estado. #.'uando el autoanticuerpo es de tipo 1g,. B.+avado de los :emates incorrecto. *.;mpleo de sangre caducada. 0.;mpleo de tubos sucios o con restos de 5ab%n.

20/2/08 Ttulo de la prctica:

#0

Test de 'oombs indirecto Fundamento: Cnvestigar la presencia de anticuerpos irregulares o incompletos en el suero del paciente enfrent-ndolos, primeramente, a hemat2es espec2ficos tipados y, posteriormente, a la "@5 para su deteccin. Material: ] Material para el lavado 9 la diluci%n de los :emates. ] "ortaob5etos) cubreob5etos 9 tubo de :em%lisis. ] "ipeta de "asteur 9 visuali ador. ] @aCo termosttico 9 microscopio. &;,'T1H2A ] ,S( 9 AF. ] (emates tipados del grupo 0R. MU;AT&, ] Auero problema. "rocedimiento: "&2';81M1;3T2 1: "&;",&,'1^3 8; +2A (;M,TZ;A T1",82A 0R 1. &eali ar una determinaci%n de grupo celular sobre los :emates tipados 0R para comprobarlo. 2. ;$ectuar un lavado 9 una diluci%n de los :emates tipados 2R al * L #. &eali ar prueba de 'oombs directa sobre los :emates tipados 0R para comprobar ?ue no eJisten anticuerpos irregulares sobre ellos. "&2';81M1;3T2 2: 8;T;&M13,'1^3 8; '22M@A 1381&;'T2 1. ;n un tubo de :em%lisis depositar 2 o # gotas del suero problema. 2. ,Cadir al tubo unas 2 o # gotas de la suspensi%n de :emates tipados 0<) al * L 9 agitar suavemente. #. 1ncubar la me cla en baCo termosttico durante 1*<#0 min. B. +avar la me cla con 1 ml de AF. *. &epetir este lavado 2 veces ms. 0. ,l sedimento obtenido con el Iltimo lavado aCadir 2 o # gotas de ,S(. D. 'entri$ugar a 2.*00 rpm durante 1 min. 8. &esuspender el sedimento obtenido con el Iltimo lavado dando pe?ueCos golpecitos en el $ondo del tuboK si es necesario) aCadir unas gotas de AF. /. 2bservar la presencia o ausencia de aglutinaci%n en el visuali ador) 9 si es necesario) en el microscopio. &esultados:

#D

'omprobaci%n de la aglutinaci%n a nivel microsc%pico: observa en el microscopio con el ob5etivo de B0J: "resencia de aglutinaci%n 6R7: se observan los :emates agrupados en grumos sobre $ondo claro. ,usencia de aglutinaci%n 6<7: se observan los :emates separados 9 distribuidos por todo el campo de $orma :omog>nea. ;s positivo 9a ?ue se observa presencia de aglutinaci%n de los :emates. 1nterpretaci%n clnica de los resultados: ;l eJamen de 'oombs indirecto detecta anticuerpos circulantes contra los gl%bulos ro5os 6S&7. ;l prop%sito principal de este eJamen es determinar si el paciente tiene anticuerpos en el suero capaces de ad:erirse a los gl%bulos ro5os 6aparte de los del sistema principal ,@2 o los de tipo &:7. ;sta prueba se utili a s%lo raras veces para diagnosticar una condici%n m>dica) pero su uso es esencial para laboratorios como los bancos de sangre. ;l eJamen de 'oombs indirecto se utili a en los bancos de sangre para determinar si probablemente :a9a una reacci%n adversa a la sangre ?ue va a ser utili ada para una trans$usi%n sangunea. Marca con __R/<` si eJiste o no aglutinaci%n en el siguiente cuadro 9 valora el resultado: (;M,TZ;A MU;AT&, ,glutinaci%n en tubo ,glutinaci%n Microsc%pic a tiene un resultado negativo) se agregan Ai la prueba de 'oombs :emates control sensibili ados con 1gS ?ue debern dar resultado positivo de aglutinaci%n. ;sto con$irmar ?ue la ,S( no :a reaccionado primeramente con la muestra<problema 9 ?ue) realmente) en ella no eJisten :emates problema ?ue poseen anticuerpos irregulares sobre su membrana. (;M,TZ;A '23T&2+ ,glutinaci%n en tubo ,glutinaci%n microsc%pica ;Jpresa ( prueba reali ada de 'oombs es directo es positiva o es negativa para los :emates problema 9 valora el resultado.

21/02/08 Ttulo de la prctica: "rueba cru ada ma9or Fundamento: 1onsiste en enfrentar el suero del receptor con los hemat2es del donante, primero

#8

en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por ;ltimo frente al suero antiglobulina de 1oombs. 1on este ;ltimo paso detect-remos los anticuerpos )ue se hayan )uedado fijados a la membrana eritrocitaria. Es importante respetar los tiempos de incubacin para evitar posibles errores en la t$cnica. Material: Tubos de :em%lisis. 'entr$uga. @aCo de agua. "ipetas "asteur. Sradilla. &elo5. 3eactivos Aoluci%n salina $isiol%gica.
,lbImina Auero

bovina al #0L.

antiglobulina de 'oombs.

,uestra
Auero del receptor) obtenido de sangre

coagulada 9 libre de :em%lisis. 8ebe ser $resco 6menos de 2B :oras desde la eJtracci%n7 9 conservado a B ='. (emates del donante) previamente lavados tres veces en soluci%n salina $isiol%gica 9 resuspendidos en ella al 2<*L. "rocedimiento: 5.;n un tubo de :em%lisis depositamos una gota de la suspensi%n de :emates del donante 9 2 gotas del suero del receptor. 2.Me clamos suavemente) 9 de5amos a temperatura ambiente durante 2<# minutos. 6.'entri$ugamos a #.*00 r.p.m. durante #0 segundos. (. +eemos el resultado obtenido en medio salino. *.,Cadimos al tubo # gotas de albImina bovina al #0L. ).Me clamos bien e incubamos a #D =' durante #0 minutos. +.'entri$ugamos a #.*00 r.p.m. durante #0 segundos. 8.+eer el resultado obtenido en medio albuminoso. 0.+avamos tres veces los :emates con soluci%n salina para eliminar los anticuerpos ?ue no se :an $i5ado a los eritrocitos. &etirar bien todo el sobrenadante del Iltimo lavado. 50.,Cadimos al tubo una gota de suero antiglobulina :umana de 'oombs. Me clar bien. 55.'entri$ugamos a 1.000 r.p.m durante 2 minutos 6v>ase $igura **.+F1H7. +eemos los resultados.

#/

&esultados: +a lectura de los resultados se reali a resuspendiendo el bot%n :emtico con suavidad despu>s de cada una de las centri$ugaciones. ;n caso de reacciones d>biles positivas) conviene observar al microscopio entre porta 9 cubre con ob5etivo de B0J. 3o se :a producido aglutinaci%n) por tanto son compatibles. 1nterpretaci%n clnica de los resultados: +a ausencia de aglutinaci%n en todos los pasos indica ?ue las sangres son compatibles) 9 por tanto) la trans$usi%n es posible. +a aglutinaci%n en cual?uiera de las $ases de la prueba indica incompatibilidad. Ai se observa :em%lisis en cual?uiera de los pasos) tambi>n es signo de incompatibilidad. ;n ocasiones es conveniente reali ar esta prueba en medio en imtico. 8ado ?ue el empleo de en imas como la @romelina o la "apana re$uer a las reacciones antgeno< anticuerpo) esta prueba se usa para re<eJaminar a los receptores ?ue :an su$rido reacciones trans$usionales.

B0