IDENTIFICAO DE BACTRIAS

Importncia: - Diagnstico de microrganismos patognicos - Estudos ecolgicos - Desenvolvimento de produtos biotecnolgicos.

Diferentes espcies podem apresentar morfologia e metabolismo idnticos. Assim, a identificao requer a observao de um conjunto complexo de caractersticas: 1. Morfologia celular: dimenses, forma, arranjos, comportamento tintorial, estruturas e mobilidade. 2. Caractersticas culturais: formas de crescimento das colnias em diferentes meios (meio em placas, meio inclinado, meio lquido, gelatina), odor. 3. Ecologia: hbitat, provenincia, condies ambientais, patogenicidade, hospedeiros, resistncia. 4. Gentica: seqncia de genes especficos, variaes transitrias e permanentes. 5. Fisiologia: exigncias nutritivas, fontes de carbono e nitrognio, fatores de crescimento.

As informaes devem ser associadas umas s outras e comparadas com as informaes do Manual de Bergey obra referncia oficial da taxonomia de bactrias.

Procedimentos para observar expresses fenotpicas:

1. Meio lquido: observar o aspecto das culturas antes de utilizar nas demais inoculaes. 2. Preparar lmina a fresco: observar motilidade. 3. Preparar lmina corada: observar reao de Gram, forma, arranjos e estruturas. 4. Inocular placas com gar-nutriente em estrias cruzadas: observar morfologia das colnias 5. Inocular meio com gar-amido: observar a hidrlise do amido com algumas gotas de soluo de iodo 6. Inocular meio inclinado em linha reta: observar formas de crescimento 7. Inocular meio com gelatina: verificar atividade proteoltica

Culture

Reaction

Description

Culture

Reaction

Description

Escherichia coli

Esta bactria forma colnias de tamanho mdio com margens regulares e elevao convexa

Klebsiella pneumoniae

Esta bactria forma colnias ligeiramente midas e viscosas, circulares. convexas, com margens lisas.

Serratia marcescens

Colnias so vermelhar e circulares coom margem inteira

Pseudomonas fluorescens

Colnias circulares, convexas e com margens lisas.

Chromobacterium violaceum

Colnias circulares, convexas com margem inteira, e apresentam-se roxas na maioria dos meios

Micrococcus luteus

Colnias puntiformes, convexas com margens lisas, com cor amarelada na maioria dos meios.

Enterococcus faecalis

Colnias puntiformes, convexas, com margens lisas. O tamanho muito reduzido devido Lactobacillus ao metabolismo plantarum ineficiente dessa bactria. Ela pode levar 3-4 dias para alcanar um tamanho aprecivel.

Colnias puntiformes, convexas, com margens lisas. . O tamanho reduzido devido ao metabolismo ineficiente, que pode levar 3-4 dias para atingir um tamanho aprecivel.

Bacillus subtilis

Colnias so largas, porm menos que as de B. cereus. As margens so Bacillus cereus onduladas, com forma circular e uma elevao achatada.

Colnias, largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.

Bacillus polymyxa

Colnias largas, irregulares e Staphyloccocus achatadas com epidermidis margens onduladas.

Colnias, largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.

Exemplos de vrios tipos de morfologia das colnias

Descries das diferentes formas das colnias em placas

- Uma das placas ou tubos poder ser utilizada para fazer a reao da catalase.

Culture

Reaction

Description

Culture

Reaction

Description

Escherichia coli

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Klebsiella pneumoniae

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Serratia marcescens

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Pseudomonas fluorescens

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Chromobacterium violaceum

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Micrococcus luteus

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Enterococcus faecalis

Observe a ausncia de bolhas. Esta bactria usa peroxidase para eliminar H2O2, uma enzima que no libera oxignio.

Lactobacillus plantarum

Observe a ausncia de bolhas. Esta bactria usa peroxidase para eliminar H2O2, uma enzima que no libera oxignio.

Bacillus subtilis

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Bacillus cereus

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Bacillus polymxya

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Staphylococcus epidermidis

Observe a formao de bolhas. Catalase positiva

Teste para presena de catalase

Caractersticas fisiolgicas Provas bioqumicas

Os microrganismos realizam variadas atividades bioqumicas utilizando nutrientes do ambiente que os rodeia Essas reaes que ocorrem dentro ou fora das clulas so catalisadas por enzimas. Geralmente, o metabolismo origina produtos finais cuja deteco pode auxiliar na identificao.

Utilizao de fontes de carbono:

Provas fermentativas (Glicose, lactose, sacarose, manose, xilose, sorbitol etc.)

Um determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o que depende do microrganismo envolvido. Isso pode gerar gs (que pode ser detectado pela presena de bolhas no tubo de Durham) e cidos orgnicos (que pode ser detectado pela mudana de cor do indicador).

Mesmo com uma reao negativa, o microrganismo pode ter utilizado outros nutrientes do meio de cultura do teste, como a peptona. As leituras devem ser feitas em no mximo 24 h, pois podem ocorrer reaes alcalinas sobre outros substratos. Utilizam-se meios bsicos (pH 7,2) e o indicador Andrade para cidos.

VM (Vermelho de Metila) Teste que avalia se as bactrias fermentam a glicose pela via cida mista, com a produo de vrios cidos (cido frmico, ltico, actico), o que prova o abaixamento do pH a menos 4,4, que o limite de viragem do indicador de pH. Embora todas as enterobactrias fermentem glicose, alguns microrganismos, durante a fase final de incubao, convertem esses cidos a produtos no cidos como o etanol e a acetona, resultando num pH mais elevado (pH 6). O indicador de pH o vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 vermelho e acima de 6 amarelo. Adicionar 4 gotas e rolar gentilmente entre a palma das mos.

VP (Voges Proskauer) H bactrias que utilizam a fermentao butilenogliclica. Fermentam a glicose produzindo acetilmetil-carbinol (acetona), butilenoglicol e pequenas quantidades de cidos. Quando KOH (4 gotas do Barrit II) adicionado, e na presena de O 2 atmosfrico, a acetona oxidada a diacetil. A adio de alfa-naftol (10 gotas do Barrit I) nesta reao catalisa a produo de um anel vermelho tijolo, aps 10-15 minutos. Adicionar primeiro o Barrit I, depois o Barrit II e agitar o tubo para expor ao oxignio.

Hidrlise do amido O amido um polissacardeo de elevado peso molecular. Para ser transportado para o interior da clula e ser utilizado, necessrio, primeiro, que ele seja quebrado em unidades menores. A habilidade para hidrolisar esse polmero depende da produo e secreo de vrias amilases. A quebra do amido detectada utilizando-se culturas em gar amido que so cobertas com uma soluo de iodo (3 a 4 mL por placa). O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro. As colnias que podem hidrolisar o amido apresentaro uma zona clara a seu redor.

Citrato Este teste determina se a bactria capaz de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono para o metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sdio, fosfato de amnia e azul de bromotimol. Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease h a sua utilizao pela citrase, com produo de hidrxido de amnia que eleva o pH, fazendo com que a reao se torne azul. Nesse teste, utilizam-se tubos com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxignio, que necessrio para utilizao do citrato. O CO2 produzido reage com o sdio do citrato formando carbonatos de reao alcalina.

Malonato (teste FM) Essa prova determina a capacidade de uma bactria de utilizar malonato como nica fonte de carbono, alcalinizando o meio. O malonato liga-se competitivamente desidrogenase succnica, impedindo sua ao cataltica sobre o cido succnico com interrupo do Ciclo de Krebs, tirando da

bactria sua principal fonte de energia e impedindo a formao de outros intermedirios necessrios ao metabolismo. Incuba-se a 35-37OC durante 24-48 horas. Indicador azul de bromotimol.

(-)

(+)

Utilizao de fontes de nitrognio:

Fenilalanina - desaminao (teste FM) H bactrias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio, originando o cido fenilpirvico, que reage com o cloreto frrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde. Obs: Como se utiliza o mesmo ensaio para o malonato, necessrio acidificar o meio com HCl, que passa para amarelo, antes de adicionar o cloreto frrico.

Lisina - descarboxilao Algumas bactrias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a poro carboxila dos aminocidos, com formao de aminas, de reao alcalina (por ex. cadaverina), e CO2. A reao ocorre preferencialmente em condies anaerbias e ligeiramente cidas, mas inicialmente ocorre a utilizao da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificao do meio. O meio contm o indicador bromocresol prpura. Nas etapas iniciais de incubao, o tubo torna-se amarelo devido fermentao da glicose. Se o aminocido descarboxilado o meio retorna cor

prpura. A reao se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com leo mineral para agilizar o processo.

Indol O indol produzido pela ao da triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura, ocorrendo, tambm, a produo de cido pirvico e amnia. O indol pode ser detectado pela formao de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, aps a adio de pdimetilaminobenzaldedo (reativo de Erlich).

Produo de H2S (meio SIM) Algumas bactrias so capazes de degradar compostos contendo enxofre (como o tiossulfato de sdio e a cistena das peptonas), atravs da tiossulfato redutase, produzindo H2S que incolor. Este reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). Para que esta reao ocorra necessrio que o meio esteja cido.

Uria

H bactrias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uria presente no meio liberando amnia, CO2 e H2O. A amnia reage formando carbonato de amnia que alcaliniza o meio. O indicador de pH o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a colorao magenta. Uma colorao meio rosa suficiente para considerar a reao positiva.

Reduo de Nitratos Muitas bactrias so capazes de reduzir nitratos a nitritos, ocorrendo mais rapidamente em condies anaerbias (condio em que o nitrato substitui o oxignio como aceptor final de eltrons). Adicionando-se algumas gotas dos reativos de Griess-Ilosva, o nitrito evidenciado atravs da formao de um composto avermelhado.

Motilidade A motilidade observada atravs do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semislido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. Se a motilidade

 positiva o aspecto do meio ser turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento s ser observado na zona da picada. Fica mais fcil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma folha de papel pautado, se conseguir observar as linhas atravs do tubo motilidade negativa.

Escherichia coli

Esta bactria altamente mvel e provocar turbidez Klebsiella pneumoniae no meio.

Esta bactria no mvel e formar somente uma linha de crescimento.

Provas IMViC (Indol, Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato) Esta srie de quatro provas j vistas anteriormente permite diferenciar os principais grupos de Enterobacteriaceae: Grupo I: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella Grupo II: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia Grupo III: Proteus Grupo IV: Yersinia