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Captulo 1 Bases Moleculares de la vida Consuelo Gmez Garca1, D. Guillermo Prez Ishiwara1 y Esther Orozco Orozco2.
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Programa Institucional de Biomedicina Molecular, Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada

y Tecnologa Avanzada del IPN (CICATA-IPN), Mxico,D.F.

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Departamento de Patologa Experimental, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del

IPN (CINVESTAV-IPN), Mxico, D.F.

Email: consuelogg22@hotmail.com PALABRAS CLAVE: genes, replicacin, reparacin, transcripcin, ciclo celular, enfermedades genticas.

NDICE 1. Introduccin 2. Objetivos del Captulo 3. Organizacin del material gentico 4. Replicacin del DNA 5. Reparacin del material gentico 6. Transcripcin 6.1 Regulacin de la transcripcin 7. Modificaciones postranscripcionales 8. Traduccin de la informacin gentica 9. Ciclo celular 9.1 Alteraciones del ciclo celular 9.2 Enfermedades genticas

10. Avances recientes en la investigacin biomdica 10.1 Clonacin

10.1.1Clulas madre 10.2 10.3 10.4 Terapia gnica Genoma humano La secuenciacin del genoma humano

11. Conclusiones Agradecimientos Abreviaturas Bibliografa

1. INTRODUCCIN

El universo biolgico aparece ampliamente diverso desde rboles con gruesos troncos hasta finas y delicadas plantas como los helechos, o bien desde una relativamente simple bacteria y protozoarios visibles solamente bajo la luz de un microscopio, a animales multicelulares de todos los tipos. Sin embargo, an y cuando hay una gran variedad de organismos los cuales han sido agrupados en diferentes reinos, o bien ubicados en diversas ramas de la escala evolutiva, existe una poderosa uniformidad, todos los sistemas biolgicos estn compuestos de molculas qumicas y emplean principios similares de organizacin a nivel molecular y celular. Los tipos bsicos de molculas biolgicas han sido conservados durante millones de aos de evolucin; sin

embargo, la manera en que se organizan para formar clulas y tejidos funcionales ha tenido considerables cambios, lo que le ha dado la identidad a cada organismo. En la vida de una clula ocurren una multitud de transformaciones qumicas especficas que proveen a la clula de la energa y de las molculas necesarias para formar su estructura y coordinar sus actividades. De aqu surge la primera pregunta, en dnde se encuentra toda la informacin que le permite a un organismo nacer, crecer y dividirse?, pues bien toda esta informacin se encuentra en el cido desoxirribonucleico (DNA), llamada molcula de la vida. De manera que todas las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de un organismo dependen por tanto, de su constitucin gentica y de su interrelacin con el ambiente en el que se desarrolla. Dentro de todos los programas genticos que los sistemas vivos han desarrollado, quiz una de las propiedades ms extraordinarias es su capacidad para perpetuar su especie, mediante la transmisin del material gentico, que contiene toda la informacin necesaria para la formacin de un nuevo ser, con caractersticas que lo definen como miembro de la misma especie, pero con propiedades fenotpicas que lo definen como individuo. La clave de la vida se encuentra por tanto en la composicin, funcin e interrelacin con el ambiente de una estructura biolgica denominada gen. En la primera parte de este captulo revisaremos con cierto detalle, cmo est organizado el material gentico, cul es su funcin y los mecanismos

celulares y moleculares que regulan su permanencia, integridad y expresin dentro de las clulas.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

Los objetivos de este captulo son: 1) Introducir al lector en el conocimiento de las molculas y de los mecanismos moleculares bsicos que toda clula requiere para su sobrevivencia y 2) Dar una perspectiva sobre la aplicacin del conocimiento bsico de la biologa molecular en los avances de la investigacin biomdica, as como en la secuenciacin del genoma humano

3. ORGANIZACIN DEL MATERIAL GENTICO.

El material gentico est constituido por cido desoxirribonucleico (DNA) y est contenido en mltiples cromosomas, cada uno de los cuales contiene una larga molcula lineal de DNA. El nmero y tamao de los cromosomas vara dependiendo de la especie, pero en todos los casos, los organismos eucariticos poseen una organizacin estructural bsica comn. En eucariotes, el DNA se observa dentro del ncleo como una masa llamada cromatina, la cual representa la asociacin del DNA con pequeas protenas que se conocen como histonas y tienen como funcin primordial, permitir el empacamiento ordenado del DNA dentro del ncleo celular. La subunidad fundamental de la cromatina consiste en una estructura denominada

nucleosoma, que contiene 200 pb de DNA enrollados alrededor de un octmero proteico formado por dmeros de las histonas H2A, H2B, H3 y H4. Estudios bioqumicos ms finos han permitido establecer que la unidad central del nucleosoma consta de 146 pares de bases de DNA enrollados 1.75 veces alrededor del octmero (Arents y Moudrianakis, 1993). La histona H1 se posiciona en el sitio en donde el DNA entra y sale del nucleosoma, manteniendo as la integridad del mismo. El empaquetamiento del DNA mediado por las histonas, da origen a una fibra de aproximadamente 10 nm de dimetro, que consta de nucleosomas separados por segmentos de DNA que funcionan como eslabones. Posteriormente, los nucleosomas se organizan en fibras helicoidales o solenoides de 30 nm de dimetro que contienen 6 nucleosomas por vuelta y que compactan la longitud del DNA 40 veces. Otras protenas diferentes a las histonas, llamadas protenas no histonas, son las responsables de la organizacin de la fibra de 30 nm en cromatina y cromosomas (Fig. 1) (Graciano y col., 1994). El grado de condensacin de la cromatina vara a lo largo del ciclo celular. Durante la interfase la mayor parte de la cromatina permanece relativamente extendida constituyendo la eucromatina, la cual est formada por solenoides que a su vez se organizan en bucles que contienen de 50 a 100 kilopares de bases (kpb) de DNA. Durante la mitosis, la cromatina alcanza su grado mximo de condensacin para formar los cromosomas mitticos que sern repartidos en las clulas hijas. A nivel de secuencia, existen ciertas caractersticas en los genomas eucariotes que los hacen diferentes de los genomas procariotes. Por ejemplo, en

eucariotes existen secuencias (intrones) que interrumpen las secuencias codificantes (exones) de un gen. Los intrones se eliminan del RNA antes de que ste sea exportado al citoplasma por un mecanismo de corte y empalme que se conoce como splicing (por su nombre en ingls), (Fig. 2). La longitud de los intrones vara, desde secuencias muy cortas de menos de 500 pares de bases a 100 o ms kpb, lo que hace que el tamao de un gen est determinado principalmente por la cantidad y el tamao de los intrones. Algunos genes son expresados por patrones de splicing alternativo, es decir, que una secuencia en particular es eliminada como si fuera intrn en ciertas situaciones, pero es retenida como exn en otras. Algunas veces este splicing alternativo afecta la regulacin de la expresin del gen, pero no modifica la protena codificada. Sin embargo, otras veces la sustitucin o eliminacin de un exn puede cambiar la secuencia proteica. Asimismo, existen mltiples e idnticas copias de secuencias particulares y existen grandes regiones de DNA que no codifican para protena alguna, cuya funcin, si es que la tienen, se desconoce. Sin embargo, en los organismos eucariticos adems de contener DNA en el ncleo, tambin presentan DNA en algunos organelos, como mitocondrias y cloroplastos.

4. REPLICACIN DEL DNA

Como hemos mencionado anteriormente, uno de los principales atributos de los sistemas biolgicos es su capacidad de reproducirse. sta puede ser por una

simple duplicacin (fisin) como en bacterias, o tan compleja como la reproduccin sexual en los organismos superiores. En todos los casos, la reproduccin implica la transmisin precisa de la informacin gentica de clula a clula o de padres a hijos, para lo cual, la clula que va a dividirse tiene que copiar (replicar) de manera precisa su material gentico. El proceso de replicacin involucra por tanto el copiado semiconservativo del DNA, usando la secuencia de cada una de las dos cadenas del DNA como una gua templado. El primer paso en el proceso de replicacin consiste en el desenrollamiento y separacin de las cadenas de DNA de la doble hlice, para que estas puedan servir como templado para la sntesis de una nueva cadena. Cuatro diferentes tipos de protenas participan en esta fase: las girasas, que permiten el desenrollamiento del DNA, las helicasas que rompen los puentes de hidrgeno, algunas endonucleasas que cortan la cadena del DNA en puntos especficos separando los enlaces azcar-fosfato y las protenas SSB, que impiden que las dos cadenas ya separadas se unan nuevamente (Lewin, 2000). El resultado es la formacin de la estructura denominada burbuja de replicacin, la cual subsecuentemente se extiende como una Y formando la llamada horquilla de replicacin (Fig. 3). As mismo, se requiere de la participacin de las protenas desestabilizadoras de la doble hlice (Lewin, B. 2000). El copiado de DNA inicia con el reclutamiento de la maquinaria de inicio de la replicacin en el origen de replicacin, llamado complejo ORC (por sus siglas en ingls Origin Recognition Complex). Este complejo est formado en eucariotes por al menos seis protenas. Una vez unido este complejo proteico se

unen los factores Cdc6 Cdc8 y MCM, este ltimo tiene actividad de helicasa (Fig.3). La unin de estas protenas provoca una distorsin del DNA en este punto, as como una estabilizacin en la separacin de las cadenas. Se une entonces la ciclina Cdc7-Dbf4 para fosforilar a la helicasa MCM y activarla. Finalmente, se une Cdc45 a MCM, de tal manera que ORC estabiliza un complejo que mantiene separadas a las cadenas de DNA. En el ltimo paso, una vez abierta la doble hlice se recluta a la DNA polimerasa (DNA pol) y entonces una horquilla de replicacin es formada (Fig. 3). Se postula que tanto Cdc45 como MCM se desplazan junto con la horquilla de replicacin. Una vez formada la horquilla de replicacin, puede iniciarse la sntesis del DNA. Debido a que la DNA pol slo puede incorporar los nucletidos en direccin 5 3, y a que la doble hlice tiene cadenas antiparalelas, durante la replicacin del DNA podemos detectar la sntesis continua de una de las cadenas y la sntesis discontinua (porque se da por fragmentos) de la llamada cadena retardada (Lewin, 2000). La sntesis de la cadena retardada requiere primero de la sntesis de los iniciadores de RNA por las primasas en diferentes puntos del DNA, los cuales son complementarios a la cadena templado con polaridad 3 5. De tal manera que los iniciadores tienen en su extremo 3 un grupo OH libre al cual la DNA pol puede unir los nucletidos complementarios en sentido 5 3 y sintetizar los fragmentos de DNA, llamados fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos son sintetizados hasta encontrar otro iniciador de RNA. Posteriormente, la DNA pol I, la cual tiene actividad de exonucleasa en sentido 5 3, es la encargada de eliminar los iniciadores de RNA y de

incorporar los nucleotidos correspondientes a la regin del iniciador. Finalmente, una DNA ligasa une ambos fragmentos de DNA, mediante la formacin de un enlace fosfodister (Fig. 3).

5. REPARACIN DEL MATERIAL GENTICO

Como hemos visto, los cromosomas no son estructuras inertes y estables que almacenan la informacin gentica de modo esttico, ya que se encuentran en una conformacin dinmica y constantemente experimentan cambios diversos. Algunas de estas modificaciones son accidentales y se reparan con facilidad; por ejemplo, durante la replicacin del DNA pueden producirse rupturas ocasionales en una de sus hebras, cuando el DNA dplex se separa y se desenrolla. Estas rupturas son reparadas por la accin de la DNA polimerasa I y de la DNA ligasa. Sin embargo, cuando el DNA es daado por un agente mutagnico, sea este qumico o fsico, o por un error inherente a los propios mecanismos celulares, se activa un elaborado sistema de mecanismos de reparacin con la finalidad de reparar el dao (Modrich y Lahue, 1996). La importancia biolgica de dichos mecanismos se refleja en el hecho de que an la simple sustitucin de una base en un gen, puede modificar la funcin de la protena correspondiente causando alteraciones que pueden ser incluso letales. Las repercusiones fenotpicas y genotpicas de las modificaciones que ocurren en el DNA, dependern de qu tan efectivos sean los sistemas de reparacin. Si el dao en el DNA es muy severo y la actividad de los sistemas de reparacin no es capaz de mantener la

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integridad del DNA, la clula muere. Si la lesin generada no es detectada por los sistemas de reparacin, o es consecuencia de fallas durante la reparacin del dao, se mantiene la alteracin generando una mutacin celular. Si la mutacin confiere un mayor grado de adecuacin al organismo, dicha mutacin ser fijada en la poblacin y conducir a un proceso de evolucin celular. Sin embargo, el proceso que ms comnmente ocurre debido a la alta fidelidad de los sistemas de reparacin es que el dao sea reparado y se obtenga nuevamente la clula original. Los sistemas de reparacin principalmente reconocen aductos (formacin de dmeros) entre nucletidos adyacentes. Uno de los sistemas ms sencillos es el de la fotoreactivacin, en el cual una enzima denominada DNA fotoliasa reconoce el aducto rompiendo el enlace covalente formado entre las dos pirimidinas, empleando la energa fotnica de la luz visible (300 a 500 nm). La enzima contiene dos cromgenos, el FADH2 y la Pterina, que son los que aceptan los fotones para excitar al electrn que llevar acabo el rompimiento del anillo del ciclobutano y por tanto la monomerizacin del dmero (Fig. 4). Este sistema de reparacin est ampliamente distribuido en la naturaleza y ha sido descrito tanto en eucariontes como en procariontes, aunque parece ser especialmente importante en plantas. Existe otro tipo de mecanismo de reparacin que per se, no es capaz de romper el anillo de ciclobutano del aducto, si no que su reparacin se basa en el hecho de que la informacin gentica est en ambas cadenas del DNA. Se han

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determinado dos variaciones del mecanismo: i) correccin por escisin de base y ii) correccin por escisin de oligonucletido. El mecanismo de reparacin por escisin de bases requiere de la participacin de DNA glicosilasas, que actan hidrolizando el enlace glicosdico que une a la base anormal con el azcar, en consecuencia se elimina la base daada (ya sea purina o pirimidina) y se genera un sitio absico en el DNA denominado sitio AP (sitio apurnico-apirimdico). Los sitios AP son en s mismos, un tipo de lesin de gran importancia ya que se generan espontneamente en el DNA (Prakash, 1993). De esta manera, los sitios AP son susceptibles a la hidrlisis del enlace azcar-fosfato por las AP-endonucleasas. Posteriormente, una desoxirribosa fosfato hidrolasa elimina este azcar-fosfato absico, dejando un extremo 5' tpico de la estructura de Watson y Crick que se llena por la accin de la DNA polimerasa I, empleando como molde la cadena complementaria no daada y finalmente la DNA ligasa forma el enlace fosfodister que sella los extremos de la cadena afectada (Fig. 5). El sistema de correccin de nucletido se efecta por la accin de un complejo proteico denominado ABC escinucleasa, que acta sobre aductos generados por varios agentes qumicos como la mitomicina C, la cisplatina y el psoralen. En el hombre, la ausencia de este sistema de correccin produce la enfermedad conocida como Xeroderma pigmentosum. Este complejo enzimtico rompe los enlaces fosfodister, haciendo dos incisiones a ambos lados de la zona daada (por ejemplo de un dmero de timinas), liberando un oligonucletido de 12 a 13 bases de longitud en el cual se encuentra la lesin. Posteriormente,

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al igual que en el mecanismo anterior, los nucletidos faltantes se introducen por accin de la DNA polimerasa I, empleando como molde la cadena complementaria y, finalmente, la cadena se sella por accin de la DNA ligasa. (Fig. 5). Finalmente, existe otro mecanismo de reparacin denominado posreplicativo en el que una protena denominada RecA es capaz de reconocer DNA de cadena sencilla que contenga al sitio del dao e intercambiar el fragmento de DNA con la secuencia homloga, para evitar que la replicacin del DNA se detenga y dar tiempo a que, posteriormente, el dao sea reparado por los sistemas de reparacin de nucletido. Aunque los mecanismos de reparacin son extraordinariamente efectivos, es inevitable que se conserven algunos errores producidos durante la replicacin, o bien que ciertas lesiones del DNA producidas por cambios fsicos o qumicos no sean reparadas, lo que da lugar a cambios que, de no ser letales para la clula, pueden perpetuarse de modo heredable en el genoma de los organismos. En las secciones anteriores hemos abordado de manera general la manera en que la informacin gentica est organizada, dnde se localiza, los mecanismos moleculares esenciales que controlan la replicacin de la informacin y la manera en que los sistemas biolgicos han desarrollado mecanismos muy complejos que mantienen la integridad de la molcula de la vida (el DNA). En las siguientes secciones abordaremos cmo la informacin

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gentica es descifrada y expresada de manera diferencial en cada una de las clulas de un organismo para conferir un fenotipo en particular.

6. TRANSCRIPCIN

Para que una protena sea generada, el gen que especfica su composicin debe ser transcrito en una cadena de RNA mensajero, que posteriormente servir como templado para la traduccin de la protena por los ribosomas. Los eucariotes tienen tres tipos de RNA pol, cada una de ellas es responsable de la transcripcin de las diferentes clases de genes. La RNA pol I se encuentra en el nuclelo y es la encargada de transcribir los genes que codifican los RNA ribosomales (RNAr). La RNA pol II est en el nucleoplasma y es la responsable de transcribir los RNA mensajeros (RNAm) y algunos RNAs nucleares pequeos (RNAsn), y la RNA pol III, localizada en el nucleoplasma, es la responsable de transcribir los genes que codifican los RNAt, RNAr 5S y algunas especies de RNAsn. Las RNA pol I, II y III son ms complejas que la RNA pol bacteriana, todas tienen altos pesos moleculares (>500 000 Da) y estn constituidas tpicamente por 8 a 14 subunidades. Una de las subunidades se une al DNA, otra une los nucletidos y la tercera participa en el ensamble de la enzima. El resto de las subunidades son comunes para todas las RNA pol. La subunidad mayor de la pol II tiene dos caractersticas importantes: i) un segmento altamente bsico de 30 aminocidos, localizado aproximadamente a 350 residuos del extremo amino

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terminal. Esta regin participa en la afinidad de la RNA pol II al DNA. ii) Un dominio carboxilo terminal (CTD, del ingls: carboxi terminal domain), conformado de mltiples repetidos de un heptapptido (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-ProSer). El nmero de repetidos es importante para la funcin, ya que el remover ms de la mitad de los repetidos resulta letal para la clula (Nikolov y Burley, 1997). El heptapptido parece funcionar como un removedor de nucleosomas durante la sntesis del RNAm, alternativamente puede interactuar con los factores basales de transcripcin o con protenas reguladoras y de esta manera jugar un papel directo en la regulacin transcripcional. Tambin se ha demostrado que el CTD puede ser altamente fosforilado en los residuos de serina o treonina, lo cual regula la capacidad de polimerizacin de la enzima. Los promotores de la RNA pol I son los que regulan la transcripcin de los RNAr, poseen un ncleo que consta de alrededor de 65 pb de longitud y est situado entre las posiciones -45 y +20. Su eficiencia se ve incrementada por la presencia de la regin control ro arriba, la cual se localiza generalmente entre las bases -180 a la -107, aunque vara entre las diferentes especies. El mecanismo de inicio de la transcripcin por la RNA pol I es ms simple que los realizados por las RNA pol II y III. Requiere de dos factores auxiliares: UBF1, que se une de manera especfica a secuencias ricas en GC en el ncleo del promotor y SL1, que est constituido por la TBP y tres protenas accesorias; este factor slo puede unirse cooperativamente al DNA una vez que UBF1 est unido. Ya que ambos factores se encuentran unidos al promotor, la RNA pol I interacciona con ellos e inicia la transcripcin.

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Los promotores para la RNA pol II contienen ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin, mltiples sitios de unin para activadores y represores que son reconocidos por protenas nucleares y que permiten al gen responder a diversos estmulos y ser apagado o encendido por interacciones con protenas especficas denominadas factores de transcripcin (Fig. 6). El nmero de factores que actan en colaboracin con la RNA pol II es grande y se dividen en dos grupos: i) factores basales, que se requieren para el inicio de la transcripcin de todos los promotores y su funcin es precisar el sitio de inicio de la transcripcin, as como darle estabilidad a la RNA pol, y ii) factores especficos o reguladores (activadores o represores), los cuales se unen a las secuencias consenso del promotor y son los responsables de la transcripcin en tiempo y espacio. Este tipo de promotores poseen adems una caja TATA que se localiza en la posicin -30 a -25 del sitio de inicio de la transcripcin, cuya funcin es unir a la protena de unin a la caja TATA (TBP) y determinar el sitio de inicio de la transcripcin (Nikolov y Burley, 1997) (Fig. 6). El complejo de iniciacin que se requiere para la transcripcin por la RNA pol II requiere del ensamblaje ordenado y especfico de varios factores de transcripcin. Primero se une la TBP a la caja TATA que, junto con otras protenas constituyen el complejo TFIID. Una vez unido TFIID, se le asocia el factor TFIIA, el cual contribuye al reclutamiento de factores basales. Posteriormente se asocia el factor TFIIB, cuya funcin es "medir" la distancia de la caja TATA al sitio de inicio de la transcripcin, la cual est restringida a 25-30 pb en los promotores de mamferos y a 50-100 pb en los promotores de S.

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cerevisiae. La asociacin de TFIIB con el complejo TFIID-promotor crea un complejo de preiniciacin capaz de reclutar a la RNA pol II. Los factores TFIIE y TFIIF se asocian a la RNA pol II en ausencia del templado y otros factores, y su incorporacin en el complejo de inicio de la transcripcin es necesaria no solamente para posicionar y darle estabilidad a la RNA pol II, si no tambin para causar un cambio conformacional en el DNA cercano al sitio de inicio. De esta manera, un gran complejo de preiniciacin mayor de 900 kDa conformado por TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIF, TFIIE y la RNA pol II, se ensambla en el ncleo del promotor, protegiendo la regin de -45 a +30 bases antes de que la transcripcin inicie. Dos factores ms, el TFIIH y TFIIJ se unen al complejo. Estos factores no cambian el patrn de unin al DNA. TFIIH tiene una actividad de cinasa, que fosforila el dominio CTD de la RNA pol II, provocando una transicin de RNA pol IIa a RNA pol IIo, para liberar la RNA pol II de los factores basales de transcripcin, de tal manera que puede dejar el promotor e iniciar la elongacin. El factor TFIIF y otros factores como el TFIIS se asocian a la RNA pol II y se cree que funcionan como factores de elongacin, los cuales pueden ayudar al complejo de transcripcin en su paso a travs de los nucleosomas. Finalmente, las protenas reconocen una posible secuencia de paro, presente ro abajo de la regin codificante, generalmente localizada 35 nucletidos ro abajo de la seal de poliadenilacin (AAUAAA), lo que causa la terminacin de la transcripcin (Greenblatt, 1991). En el caso de los promotores que carecen de una caja TATA, son necesarios los mismos factores de transcripcin basal incluyendo el TFIID. En este caso, el elemento Inr permite el posicionamiento del complejo de

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preinicio de la transcripcin a travs de la interaccin de protenas intermediarias como la protena YY1 y OCT, entre otras que an no han sido identificadas. Los promotores de la RNA pol III son los que regulan la transcripcin de los RNAt, RNAr 5S y algunas especies de RNAsn. En Xenopus laevis los genes que codifican para el RNAr 5S y para los RNAt tienen sus regiones de control localizadas dentro de las regiones que son transcritas, mientras que el gen U6 que participa en la edicin del RNA tiene sus regiones regulatorias ro arriba y ms recientemente, se encontr una combinacin de elementos regulatorios tanto dentro de la regin transcrita como ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin. La transcripcin por la RNA pol III requiere de tres factores:TFIIIA, TFIIIB y TFIIIC. Estos tres factores basales de transcripcin se unen en un orden definido. En el caso del promotor del gen que codifica para el RNA 5S, primero se une especficamente el factor TFIIIA a la caja C. Una vez que TFIIIA se ha unido, TFIIIC reconoce al promotor dndole estabilidad al complejo. El gen 5S no tiene caja TATA y por lo tanto, las interacciones secuencia-especficas entre TBP y el DNA no ocurren. Sin embargo, las interacciones de los TAFs con TFIIIA y TFIIIC probablemente posicionan a TBP en el complejo de transcripcin. Los promotores de los genes que codifican para los RNAt, tienen las cajas A y B. En este caso, el primer factor que se une es el TFIIIC a travs de la caja B, el cual al unirse, es capaz de interaccionar tambin con la caja A. La unin de TFIIIC permite que TFIIIB se una al promotor cerca del sitio de inicio,

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permitiendo el reclutamiento de la RNA pol III al complejo de inicio de la transcripcin. En los promotores extragnicos se encuentran elementos reguladores similares a los de los promotores clase II. Sin embargo, en estos promotores, la caja TATA, la secuencia PSE y el elemento DSE le confieren la especificidad por la RNA pol III. En este caso, el primer factor que se une es TFIIIB, el cual a travs de TBP reconoce la caja TATA; se propone que existen otros factores adicionales an no identificados que interacionan con este factor para reclutar a la RNA pol III. En los promotores mixtos se presenta un efecto sinergstico entre los elementos que se unen ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin y la caja B intragnica. Para que se lleve acabo la transcripcin se unen al mismo tiempo el factor TFIIIB a la caja TATA y el factor TFIIIC a la caja B; una vez unidos, la RNA pol III puede incorporarse al complejo de preinicio de la transcripcin.

6.1 Regulacin de la transcripcin

En eucariotes superiores las diferencias estructurales y funcionales entre los diversos tipos celulares de un organismo se deben a la expresin especfica en tiempo y espacio de los genes transcritos por la RNA pol II. El principal punto de control en la transcripcin de un gen es el momento del inicio de la transcripcin, cuando la RNA polimerasa interacciona con el promotor.

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El incremento en la tasa de transcripcin se da cuando ciertos factores se unen a las secuencias potenciadoras, a los elementos de respuesta, a otras secuencias consenso y a los componentes de la maquinaria general de transcripcin. En ausencia de los activadores transcripcionales, los genes se transcriben pobremente, a un nivel denominado basal (Sauer y Tijan, 1997). Por ejemplo, si una clula del hgado es expuesta a hormonas como glucocorticoides, la produccin de varias protenas especficas del metabolismo energtico se incrementan. Cuando la hormona no est presente en grandes cantidades, la produccin de esas protenas vuelve a su nivel normal. Cuando se analiza la secuencia de los promotores de estos y muchos otros genes cuya transcripcin se induce bajo ciertos estmulos especficos, se observa que en su promotor existen pequeas secuencias conservadas que son reconocidas por factores de transcripcin. Los elementos que responden a estos factores se llaman elementos de respuesta y son secuencias de DNA que reversiblemente activan, aumentan o reprimen la transcripcin en respuesta a seales moleculares. La presencia de un nico elemento es suficiente para conferir la respuesta regulatoria. Entre los elementos de respuesta se encuentran los que responden a metales, a choque trmico, a glucocorticoides y al suero entre otros. Debido a que tanto las concentraciones de metales, hormonas y suero, as como la temperatura cambian en respuesta a la dieta, hbitat o ambiente, los organismos presentan constantemente diferentes respuestas fisiolgicas. El gen que es regulado por un elemento de respuesta es reconocido por una protena especfica, sintetizada o activada en tiempos y en tejidos especficos.

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Los factores de transcripcin eucariticos estn conformados por dos dominios funcionales: un dominio de unin al DNA y un dominio de activacin. El dominio de unin al DNA es el responsable de dirigir al factor de transcripcin a la cercana del promotor y de conferirle especificidad por una secuencia localizada en el promotor a travs de la unin DNA-protena o por interacciones protena-protena con otros factores de transcripcin. La unin se lleva a cabo por puentes de hidrgeno e interacciones de van der Waals. Por su tipo de interaccin con el DNA, los dominios de unin de los factores de transcripcin han sido agrupados en diferentes clases denominadas: dedos de zinc, cierre de leucina, hlice-burbuja-hlice, hlice-vuelta-hlice y beta-plegada (Nelson, 1995). El dominio de activacin facilita el ensamble de los complejos de preiniciacin por interacciones directas o indirectas. stas se dan va una o ms protenas mediadoras llamadas adaptadores, coactivadores o protenas accesorias, con componentes del complejo de preiniciacin a travs de un puente de unin entre el activador y la maquinaria basal de transcripcin. Por la composicin de aminocidos del dominio de activacin, los factores de transcripcin han sido agrupados en varias clases: acdicos, ricos en glutamina, ricos en prolina o serina y ricos en treonina. La presencia de estos dominios en los factores activadores les permite tener un intercambio dinmico y complejo de interacciones con diferentes protenas, que en conjunto son capaces de llevar a cabo la activacin transcripcional (Triezenberg, 1995). Aunque la mayora de los factores de transcripcin actan de una manera positiva, hay ejemplos de factores negativos, que inhiben la transcripcin, al neutralizar la accin de

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factores positivos, ya que previenen las interacciones DNA-protena o protenaprotena a travs de sus propios dominios de unin y activacin.

7. MODIFICACIONES POSTRANSCRIPCIONALES

El RNAm es una molcula intermediaria que acarrea la informacin gentica contenida en el DNA para producir en los ribosomas las molculas efectoras del mensaje gentico (las protenas). Es importante recalcar que a diferencia de los procariotes, en eucariotes la transcripcin ocurre en el ncleo y el RNA debe pasar por procesos de maduracin antes de salir del mismo y traducirse en el citoplasma. Dicha maduracin implica la modificacin en sus extremos 5 y 3, y si el gen es interrumpido, entonces el RNA tambin tiene que ser procesado. Adems, algunas veces existe cambio en la informacin a nivel de RNAm (edicin) antes de que el RNA pueda ser traducido. En el extremo 5 los RNAm son modificados por la adicin de una guanina metilada unida a la primera base del transcrito. Esta modificacin, denominada cap, es necesaria para el procesamiento y transporte de los RNAs y para que se lleve a cabo el inicio de la traduccin. En el extremo 3 la mayora de RNAm de eucariontes contiene una secuencia de poli adeninas que no est codificada por el DNA sino que se aade postranscripcionalmente. Una vez que la RNA polimerasa II termina la transcripcin, se realiza un corte endonucleotdico y se agrega la cola de poli(A) al extremo 3. En eucariotes superiores, la secuencia AAUAAA, localizada

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11 a 30 bases ro arriba del sitio de poliadenilacin es necesaria para que se realicen las dos reacciones. La adicin de poli(A) proporciona estabilidad a los RNAm y probablemente tenga un papel importante en el inicio de la traduccin, ya que su eliminacin inhibe este evento. Como hemos mencionado al inicio de este captulo, muchos genes de eucariotes contienen secuencias intrnicas intercaladas entre las secuencias codificantes. Para tener un RNAm maduro, los intrones son eliminados y los exones se unen mediante un mecanismo llamado corte y empalme (Kramer, A 1996).

8. TRADUCCIN DE LA INFORMACIN GENTICA

La traduccin es el proceso por el cual la secuencia de nucletidos del RNAm finalmente es convertida a una secuencia de aminocidos. La secuencia codificante del RNAm se lee en direccin 5 a 3, en tripletes que corresponden a la secuencia de aminocidos que conforman la protena. Existen 64 posibles combinaciones de tripletes, de los cuales 61 codifican para aminocidos y 3 son seales de paro de la traduccin. Dado que solo existen 20 aminocidos, casi todos ellos estn representados en ms de un codn, por lo que se dice que el cdigo gentico es degenerado. En eucariotes la traduccin comienza por el reconocimiento del cap del RNAm por la subunidad 40S del ribosoma; posteriormente se eliminan las estructuras secundarias del mensajero, se une la subunidad 60S (Fig. 7). La

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sntesis de todas la protenas inicia con el residuo metionina, por lo que la seal de inicio de la traduccin la proporciona el codn AUG, aunque en bacterias tambin pueden ser usados los codones GUG y UUG. Existen dos tipos de RNAt que acarrean a la metionina, uno es usado en el inicio de la traduccin, mientras que el otro es utilizado durante el alargamiento. En bacterias y en organelos eucariticos, la primera metionina es modificada a N-formil-metionina. Cuando la subunidad mayor se une al complejo de iniciacin, el RNAt iniciador se localiza en el sitio P del ribosoma y el sitio A se encuentra disponible para la entrada del aminoacil-RNAt complementario al segundo codn. Una vez que se ha formado el complejo de inicio, se realizan ciclos de incorporacin de los aminoacil-RNAt al sitio A del ribosoma, mientras que el sitio P es ocupado por un peptidil-RNAt (Fig. 7). La unin peptdica se lleva a cabo por la transferencia del polipptido del peptidil-RNAt del sitio P, al aminoacilRNAt localizado en el sitio A. Esta reaccin se realiza por una actividad de peptidil transferasa llevada a cabo por la subunidad mayor del ribosoma. Posteriormente, el ribosoma avanza tres nucletidos en el RNAm, lo que ocasiona que se libere el RNAt no cargado del sitio P, que ste sea ocupado por el peptidil-RNAt y que el sitio A est libre para la entrada del siguiente aminoacilRNAt correspondiente al siguiente codn. Esta translocacin requiere GTP y el factor de alargamiento eEF-2. Una vez que el ribosoma llega a un codn de paro (UAG, UAA o UGA), se termina la sntesis de la protena. Ninguno de los tres codones de terminacin tiene un correspondiente RNAt, sino que son reconocidos por factores de terminacin. Los factores actan a nivel del sitio A

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del ribosoma y requieren la presencia del peptidil-RNAt en el sitio P. La terminacin implica la liberacin del polipptido sintetizado del ltimo RNAt, la cual se lleva a cabo por una reaccin similar a la transferencia de aminocidos. Para que una protena sea funcional, sta debe de adquirir una conformacin tridimensional especfica. Algunas protenas son capaces de adquirir su conformacin de manera espontnea. Sin embargo, muchas protenas requieren de la asistencia de otras protenas llamadas chaperonas para tener un plegamiento correcto y llegar a su conformacin madura. Las chaperonas median el correcto ensamblaje de las protenas al unirse a la superficie de sus centros reactivos, evitando que estas superficies interaccionen con otras regiones de la protena que presenten una conformacin incorrecta. A lo largo de este captulo hemos revisado la estructura y organizacin del DNA, as como los procesos moleculares que mantienen su integridad y aquellos que originan las molculas que llevan la informacin gentica para que los ribosomas produzcan las molculas efectoras de los sistemas vivos (las protenas). En la ltima parte del captulo analizaremos como las clulas sincronizan cada uno de estos eventos en tiempo y espacios definidos.

9. CICLO CELULAR

La mayora de las clulas eucariticas viven de acuerdo a un reloj interno. Esto es, ellas proceden a travs de una secuencia de fases llamado ciclo celular, el cual es un conjunto ordenado de eventos que culmina con el crecimiento de la

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clula y su divisin en dos clulas hijas. Los detalles de cada ciclo celular eucariote varan entre los organismos; sin embargo, los puntos esenciales son comunes. En un ciclo celular general, para producir dos clulas hijas idnticas, el DNA se duplica (por el mecanismo que hemos descrito anteriormente), se segrega y finalmente la clula original se divide para dar lugar a dos clulas hijas idnticas independientes, cada una con una dotacin gentica idntica a la de su hermana (Fig. 8). Sin embargo, las clulas no slo duplican su material gentico, si no que tambin dividen su masa y sus organelos. Por lo tanto, el ciclo celular es una compleja combinacin de procesos citoplsmicos y nucleares muy bien coordinados entre s (Mercer, 1998). El ciclo bsicamente est dividido en cuatro fases, denominadas G1, S, G2 y M, las cuales se encuentran ilustradas en la figura 10. La fase G1 es el periodo comprendido entre la mitosis y la iniciacin de la replicacin del DNA, en organismos vertebrados las clulas en fase G1 tienen un nmero diploide de cromosomas (2n), uno heredado de cada padre. Esta fase se caracteriza porque es realmente la nica parte del ciclo que est regulada principalmente por estmulos extracelulares (mitgenos, nutrientes, hormonas, etc.). La fase G1 es por tanto uno de los principales puntos de control del ciclo celular, ya que es precisamente en donde la clula decide iniciar o no el ciclo, por lo que tambin es llamada INICIO. Asimismo, es la fase que ocupa la mayor parte del ciclo, variando de 6 h en las clulas que tienen un crecimiento relativamente rpido, a 12 h en las clulas que tienen un crecimiento ms lento (Mercer, 1998; Tansey, 1999).

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Una vez que la clula inicia el ciclo, sta se prepara para entrar en la fase S, esto es, se activan los factores de transcripcin que permiten la expresin de enzimas requeridas para la sntesis del DNA y de los genes que codifican para los complejos de protenas-cinasas heterodimricas llamadas ciclinas. Las subunidades catalticas de las ciclinas son llamadas cinasas dependientes de ciclinas (Cdks), porque ellas no tienen actividad de cinasa hasta que no se asocian con una ciclina. Cada Cdk puede asociarse con diferentes ciclinas y a su vez cada complejo Cdk-ciclina determinar qu protenas sern fosforiladas (Maity y col., 1997). En esta fase, las Cdks fosforilan a las protenas que forman los complejos de pre-replicacin, los cuales son ensamblados en los orgenes de replicacin (ORI), permitiendo de esta manera la iniciacin de la sntesis del DNA (Fig. 9). Una vez replicado completamente el DNA del organismo, la clula ahora tiene dos genomas completos, lo cual parece ser la seal para que la clula entre en la siguiente fase llamada G2, que tiene un tiempo de duracin de aproximadamente 4.5 h. En este punto, la clula adquiere energa, crece y sintetiza protenas suficientes para dos clulas. Una vez completado este evento, la clula entra a la fase final del ciclo celular llamada M (mitosis). En esta fase, la divisin citoplsmica (citocinesis) y nuclear (separacin de los cromosomas) ocurre y la clula utiliza la energa adquirida durante la fase G2 para dividirse en dos clulas hijas, en donde cada una contendr una copia completa del DNA. Una vez completado el ciclo, las clulas tienen dos opciones: i) comenzar nuevamente el ciclo entrando entonces a la fase G1, o bien ii) entrar

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a la fase G0 en donde se mantendr en un estado quiasente (Mercer, 1998; Nez, 2001). El ciclo celular de los procariotes es simple y rpido. La replicacin de un nico cromosoma comienza en el ORI, en donde, en condiciones ideales de crecimiento, el ciclo de una bacteria es repetido cada 30 minutos, mientras que la mayora de la clulas de las plantas y de los animales completan un ciclo celular cada 10-20 horas y en algunos, la duplicacin es an mucho mas lenta. Muchas clulas en los animales adultos, tales como las clulas nerviosas y las del msculo estriado, no son capaces de dividirse, ya que pierden dicha capacidad una vez que maduran. Estas clulas se salen temporalmente del ciclo celular despus de la mitosis y entran a un estado de pausa o quiasente (G0) (Fig. 9). Algunas otras clulas como las del hgado, normalmente no se dividen; stas slo lo hacen si parte del hgado se encuentra daado o es removido, en cuyo caso, las clulas entrarn en divisin hasta que el hgado alcance su tamao normal. El progreso del ciclo es controlado en varios puntos, llamados puntos de chequeo, los cuales monitorean el estatus de una clula, por ejemplo, la cantidad de DNA o la presencia de nutrientes extracelulares (Mercer, 1998). Diferentes eventos se van produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada una de las fases hace falta que se complete la anterior. Cuando existen las condiciones ptimas para la realizacin de una fase del ciclo, entonces la clula procede al siguiente punto de chequeo.

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9.1 Alteraciones del ciclo celular

Los organismos multicelulares requieren de la funcin normal y de la comunicacin armoniosa de todos los tejidos y rganos del cuerpo. Sin embargo, el crecimiento celular descontrolado en una parte del cuerpo puede interferir en el desarrollo de otras clulas o tejidos, por lo que las funciones normales del individuo pueden ser seriamente daadas. Durante el ciclo celular existen diferentes tipos de protenas que regulan y controlan el ciclo de una clula. Estas molculas son las que le indican cuando es el tiempo apropiado para crecer y dividirse, y cuando ellas deben detener su crecimiento. Sin embargo, alteraciones en estas protenas provocan una desregulacin del ciclo celular, generando un crecimiento y proliferacin descontrolada de la clula que conlleva a la generacin de tumores y al desarrollo de enfermedades como el cncer. Una clula normal puede convertirse en una cancerosa por una simple mutacin en la secuencia de algn gen que controle el ciclo celular. Por ejemplo, un cambio de una guanina por una citosina en el oncogen ras, que est localizado en el cromosoma humano 11, resulta en una sustitucin en el aminocido 12 de una glicina por una valina, que frecuentemente se asocia con el cncer de vejiga. Este simple cambio provoca a su vez un cambio dramtico en la funcin de la protena G codificada por este gen, ya que la mutacin no permite la liberacin del GTP de la protena, de forma tal que la protena siempre se mantiene activa enviando la seal al interior de la clula para mantener un

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crecimiento y una divisin contnuos. Este crecimiento desmedido permite entonces el desarrollo del cncer de vejiga. Otro ejemplo son las deleciones de un dominio de unin a ligando del oncogen EGFR (del ingls epidermal growth factor receptor), localizado en el cromosoma 7, que resulta en una transduccin de seales contnua generada por el receptor del factor de crecimiento epidermal. La deleccin de la protena puede formar un dmero an en ausencia del factor de crecimiento epidermal. La dimerizacin permite una actividad contnua de la tirosina-cinasa y por lo tanto una activacin descontrolada de la va de seales de transduccin asociada con esta protena. Por tanto, alteraciones en el ciclo celular de los organismos pueden conllevar al desarrollo de enfermedades tan severas como el cncer.

9.2 Enfermedades genticas

An cuando cambios tan pequeos en genes que codifican para protenas clave en la regulacin del ciclo celular, originan eventos tan dramticos como la transformacin maligna de las clulas, las enfermedades cancerosas no son las nicas que son el producto de alteraciones de los genes. Existen diferentes enfermedades genticas causadas por mutaciones, deleciones, duplicaciones, amplificaciones, cambios en los patrones de expresin de algunos de los genes, los cuales se traducen en defectos fsicos con diferentes grados de severidad. Por ejemplo, existen ms de 6,000 enfermedades genticas conocidas, aunque

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algunas de esas enfermedades son llamadas raras, y actualmente afectan, por citar un dato, al 4% de recin nacidos en Italia, es decir ms de 20,000 individuos en un ao. Una de las enfermedades ms comunes es la anemia mediterrnea (la cual en algunas reas es encontrada con una incidencia de 1 por cada 300 nios recin nacidos). Muchas enfermedades hereditarias tales como la enfermedad Coeliac no tienen sntomas fsicos y el paciente frecuentemente no est enterado de que tiene la enfermedad (Pecsi, 2000). Asimismo existen aproximadamente 50 transportadores ABC en el humano y hay actualmente 13 enfermedades genticas asociadas con defectos en 14 de esos transportadores. Las enfermedades genticas mas comunes incluyen la fibrosis qustica, la enfermedad de Stargardt, la degeneracin macular relacionada con la edad y la adrenol eucodistrofia entre otras. Estas enfermedades son transmitidas va DNA, de generacin en generacin y con frecuencia afectan a varios miembros de la misma familia.

10. AVANCES RECIENTES EN LA INVESTIGACIN BIOMDICA

En la actualidad, la investigacin biomdica ha realizado significativos avances en el campo de las enfermedades genticas. El gran avance en el desarrollo de nuevas tecnologas ha permitido a los cientficos estudiar mas profundamente el genoma humano, de tal forma que se han logrado identificar y aislar numerosos genes responsables de las enfermedades genticas. Esto ha producido tambin importantes avances en el desarrollo en el campo de la medicina preventiva.

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Miembros de una familia donde una enfermedad gentica ha sido identificada, ahora pueden realizarse pruebas especficas, las cuales les revelen si son portadores o si ellos estn perfectamente saludables y no corren el riesgo de transmitir dicha enfermedad a sus hijos. Gracias a la identificacin de esos genes, se puede pensar en encontrar una terapia especfica que incremente la calidad de vida de los individuos y dar esperanza a las personas que sufren de una enfermedad gentica. A continuacin revisaremos algunas de las tecnologas que mayor impacto han tenido en el desarrollo de algunos proyectos que estn tratando de dar solucin a diferentes enfermedades genticas.

10.1 Clonacin

La clonacin es la obtencin de un individuo genticamente idntico a otro. Aunque ya se haban realizado experimentos para clonar a otros organismos no fue hasta 1997 en que fue clonado el primer animal mamfero (la oveja Dolly), a partir de clulas tomadas de otro individuo adulto. Sin embargo, la clonacin no necesariamente termina en la produccin de un individuo, sino que puede estar limitada a crear decenas o cientos de clulas idnticas a las del donador. Esto, con sus problemas y controversias ticas, puede ser extremadamente til en la produccin de rganos y tejidos para transplante, ya que las clulas pueden ser clonadas de un mismo receptor del tejido u rgano, evitando as los posibles problemas debidos al rechazo inmunolgico del rgano donado (Fig. 10). La clonacin constituye por tanto, una tecnologa que puede traer muchos

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beneficios para el hombre. La posibilidad de manipular genes de manera precisa permitira crear animales con mejor produccin de leche, carne o lana. Luego, esos animales podran clonarse para tener rebaos de buenos productores comprobados. Gracias a la manipulacin gentica, la leche de cabras y vacas podra producir protenas para el tratamiento de enfermedades humanas. De hecho, un equipo de cientficos trabaja actualmente para lograr una oveja que produzca leche con protenas humanas para el tratamiento de la fibrosis qustica, un mal de origen gentico.

10.1.1 Clulas madre

Las clulas madre son las clulas progenitoras a partir de las cuales los diferentes tipos celulares de cada tejido se generan. Las clulas madre embrionales pueden transformarse por ellas mismas en casi todos los tipos de tejidos, mientras que en los adultos pueden solamente ser transformadas en ciertos tipos de tejidos. El gran inters mostrado en estas clulas viene del hecho de que si son correctamente estimuladas, ellas podran ser capaces de regenerar tejidos daados y en teora podran ser usadas en la creacin de rganos de repuesto.

10.2 Pruebas genticas

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Algunas pruebas genticas son capaces de revelar si una persona es un portador de un gen alterado el cual puede causar una enfermedad. Este tipo de pruebas tambin pueden ser utilizadas en el diagnstico prenatal de algunas enfermedades genticas. Sin embargo, al momento no es posible establecer que el recin nacido puede ser absolutamente saludable, solamente, si este puede ser un portador de una o ms alteraciones genticas. La importancia de las pruebas genticas puede diferir dependiendo de la enfermedad y del tipo de alteracin gentica. Es por esta razn que estas pruebas deben ser llevadas a cabo en centros especializados y bajo la gua de un genetista, ya que la misma anomala gentica puede tener diferentes efectos en distintos individuos. Entre las pruebas genticas mas utilizadas en la actualidad se encuentran las que utilizan sondas de DNA a travs de las cuales se identifican los genes. Una de estas son los ensayos de fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLP). El uso moderno de pruebas de DNA y de anlisis de RFLP ahora permiten detectar condiciones genticas causadas por mutaciones an producidas por un solo cambio en una base.

10.3 Terapia gnica

La terapia gnica es la transferencia de material gentico con el propsito de tratar, prevenir o curar una enfermedad. Este proceso constituye una novedosa tecnologa que en la actualidad se encuentra en fase experimental. sta puede ser blanco de clulas somticas o germinales. En la primera, el genoma receptor

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es cambiado, pero el cambio no se mantiene o pasa a la siguiente generacin. En la terapia germinal las clulas parentales (vulo y espermatozoide) son cambiadas con el propsito de pasar los cambios a la progenie. En el caso de las enfermedades genticas, donde un gen es el defectuoso o ausente, la terapia gnica consiste en transferir la versin funcional y normal del gen dentro del husped para corregir el defecto. La primera prueba de la terapia gnica fue llevada a cabo en 1990 en un beb con severa inmunodeficiencia combinada (SCID), una seria inmunodeficiencia hereditaria, la cual afecta alrededor de 40 nios en todo el mundo cada ao. Aunque han estado en discusin los xitos en este campo, solamente unos pocos experimentos han sido exitosamente realizados en humanos, por lo que an se requiere realizar mucho trabajo para que esta tcnica se convierta en una herramienta til para los mdicos. Hay alrededor de 400 protocolos experimentales sobre terapia gnica en humanos en el mundo, y casi todos se encuentran en sus fases iniciales (Meyer y col., 2001). Entre estos se encuentran la produccin de al menos cinco diferentes potentes factores de crecimiento angiognico para tratar la enfermedad perifrica arterial o la enfermedad isqumica del corazn (Morishita y col., 2001). Las protenas humanas tienen una gran demanda para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Algunas pueden ser purificadas de la sangre, lo cual es caro y se corre el riesgo de contaminacin por SIDA o hepatitis C. Las protenas tambin pueden ser producidas en cultivos de clulas humanas, pero el costo es muy alto y el rendimiento muy bajo. Cantidades mas grandes pueden

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ser obtenidas en bacterias o levaduras, pero las protenas producidas pueden ser difcilmente purificadas, adems de que ellas carecen de las modificaciones pos-traduccionales apropiadas, necesarias para su eficacia in vivo. Por lo que se han tratado de buscar mtodos alternativos en los que las protenas humanas que tienen las modificaciones pos-traduccionales apropiadas puedan ser producidas en la leche de ovejas, cabras o vacas transgnicas, obteniendo hasta 40 g por litro de leche a un costo relativamente bajo (Fischer, 2001).

10.4 La secuenciacin del genoma humano

Cada organismo tiene un conjunto de cromosomas que contienen toda su informacin gentica. El genoma humano por ejemplo es un conjunto de informacin codificada en 46 cromosomas localizados en el ncleo de cada clula. Los cromosomas estn organizados en 23 pares, un cromosoma para cada par es heredado de la madre y otro del padre. Un par de cromosomas X y Y determinan el sexo, los otros 22 pares son llamados autosomas. De tal forma que se piensa que el genoma humano est hecho de largas molculas de DNA, una correspondiente a cada cromosoma y que existen alrededor de 60,000 genes (Makalowski, 2001). El objeto del proyecto del genoma humano (PGH) es determinar la secuencia entera de nucletidos de cada uno de los 23 cromosomas, as como la localizacin e identidad de cada gen humano. Este proyecto que fue concebido a mitad de los aos 80s, y es un esfuerzo de la investigacin internacional para caracterizar y construir el mapa

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fsico y gentico del genoma humano y de otros organismos seleccionados, a travs de un mapeo completo y de la secuenciacin de su DNA. Dos instituciones, una pblica conformada por 20 laboratorios y cientos de cientficos de todo el mundo, y una privada, la compaa Celera Genomic estn llevando a cabo la secuenciacin del genoma humano. En febrero del ao 2001 publicaron parte de la secuencia del genoma obtenida por cada uno (IHGSC, 2001; Venter, y col., 2001). Con el descubrimiento del genoma humano, el cual ha sido secuenciado en un 90%, se pretenden desarrollar tecnologas para el anlisis genmico, que permitan realizar estudios biolgicos que se apliquen en la salud humana. Sin embargo, aun la secuencia no es totamente precisa, ni completa. Se estima que el 2% del genoma completo corresponde a regiones codificantes, el 20% del genoma corresponde a regiones no codificantes y mas del 50% del genoma corresponde a secuencias repetidas. Asimismo, este genoma cuenta con regiones ricas en G-C llamadas islas CpG (aproximadamente 50,267) (Hofmann, 2001). Los productos cientficos del PGH comprendern una fuente de informacin acerca de la estructura, organizacin y funcin del DNA humano, informacin que constituye la serie de instrucciones bsicas para el desarrollo y funcionamiento del ser humano. Asimismo conllevar al desarrollo de una variedad de nuevas tecnologas que facilitarn y mejorarn el diagnstico, prevencin y tratamiento de diferentes enfermedades hereditarias. El atlas del genoma humano podra revolucionar la prctica mdica y la investigacin biolgica en el siglo XXI. Todos los genes humanos podran

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eventualmente ser encontrados, y por lo tanto, diagnsticos precisos podran ser desarrollados para la mayora de la enfermedades hereditarias. Adems, los modelos animales para enfermedades humanas podran desarrollarse mas fcilmente, lo que permitira entender la participacin de genes especficos involucrados en el binomio salud-enfermedad. Ya que actualmente se conoce que existen 923 genes relacionados con alguna enfermedad (Jimnez-Snchez y col., 2001). Por otra parte, ya se han identificado genes nicos asociados con un nmero importante de enfermedades, tales como la fibrosis qustica, la distrofia muscular de Duchenne, la distrofia miotnica, la neurofibromatosis, retinoblastoma, etc. Conforme la investigacin progrese, se podrn identificar tambin los mecanismos de las enfermedades causadas por alteraciones en diferentes genes o por un gen interactuando con factores ambientales. Finalmente, la susceptibilidad gentica tambin ha sido implicada en muchas de las principales e incapacitantes enfermedades tales como: enfermedades del corazn, diabetes y diferentes tipos de cncer. La identificacin de los genes involucrados y sus protenas puede preparar el terreno para disear terapias y medidas preventivas ms efectivas. Asimismo, el dilucidar la informacin de la secuencia del genoma humano permitir comenzar a entender cmo los humanos se desarrollan en adultos a partir de una clula. 11. CONCLUSIONES 1. La molcula de la vida (DNA) contiene toda la informacin necesaria para que un organismo pueda vivir y perpetuar su especie.

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2.

Los seres vivos llevan a cabo la replicacin de su material gentico y son capaces de reparar daos en l, ocasionados durante este proceso.

3.

Cuando el organismo lo requiere se lleva a cabo la transcripcin de los diferentes genes que le permiten nacer, desarrollarse, dividirse e incluso morirse.

4.

Finalmente el mensaje es traducido a protenas para que esta puedan participar en las diferentes rutas metablicas, de transporte, etc., que requiere la clula.

5.

Cada organismo tiene un ciclo celular, en el cual ocurren diferentes eventos tales como la replicacin y divisin celular.

6.

Alteraciones en el ciclo celular generalmente pueden conllevar al desarrollo de enfermedades como el cncer, e incluso algunas de ellas pueden ser heredadas.

7.

La revelacin del genoma humano en conjunto con el desarrollo de tecnologas tales como la clonacin y la terapia gnica permitirn en un futuro cercano generar nuevas tcnicas de diagnstico y tratamiento para enfermedades tanto hereditarias como de tipo canceroso entre otras

AGRADECIMIENTOS Al tcnico Alfredo Padilla Barberi por su apoyo en el diseo y elaboracin de las figuras de este captulo.

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ABREVIATURAS DNA ORC Sitio AP CTD Cdks Acido desoxirribonucleico Origin recognition complex Sitio apurnico-apirimdico Carboxi-terminal domain Cinasas dependientes de ciclinas

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PIES DE FIGURA

Fig. 1. Representacin esquemtica de los distintos ordenes de compactacin del DNA.

Fig. 2. Un gen interrumpido consta de secuencias codificantes (exones) y secuencias no codificantes (intrones). Despus de la transcripcin, los intrones son eliminados y los exones son unidos por un mecanismo de corte y empalme llamado splicing.

Fig. 3. Representacin esquemtica del proceso de la replicacin del DNA en eucariotes.

Fig. 4. Mecanismo de reparacin por excisin de base. Los sitios apurinicos o apirimidinicos se pueden originar espontneamente o por la accin de glicosilasas que actan en el mecanismo de reparacin. El azcar fosfato absico se reemplaza por el nucletido complementario a la base de la cadena

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no daada por la accin sucesiva de cuatro enzimas, la AP endonucleasa, la Desoxiribosa fosfato hidrolasa, la DNA polimerasa y finalmente la DNA ligasa.

Fig. 5. Mecanismo de reparacin por excisin de nucletido. En el sitio de dao (formacin de un dmero de timina) se une el complejo UvrABC, que produce dos incisiones a varias bases de distancia del sitio daado. Con la participacin de la DNA Helicasa se libera el oligonucletido. Finalmente la DNA polimerasa y la DNA ligasa reparan el dao.

Fig. 6. Esquema representativo de un promotor eucarintico. (A) Se localizan las secuencias consenso para diferentes factores de transcripcin. La flecha indica el sitio de inicio de la transcripcin. (B) Hacia el ncleo del promotor son reclutados los factores basales (por ej. TFIIDF, TFIIA, etc) y la RNA polimerasa. (C) Las interacciones de los diferentes factores de transcripcin con el promotor, pueden generar su plegamiento y permitir as, el acercamiento e interaccin de los factores para promover o reprimir la expresin de un gen.

Fig. 7. Traduccin de la informacin gentica. El RNAm tiene que ser transportado al citoplasma donde es reconocido por el ribosoma. Durante el alargamiento, la cadena polipeptidica unida a un peptidil-tRNA en el sitio P, se transfiere al aminoacil-tRNA del sitio A. Posteriormente, el sitio P es ocupado por el nuevo peptidil-tRNA y el sitio A queda libre para la unin del siguiente aminoacil-tRNA.

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Fig. 8. Esquema del ciclo celular mostrando los principales eventos que suceden durante el ciclo.

Fig. 9. Organizacin del ciclo celular. Se muestran las diferentes fases que suceden durante el ciclo. El punto de restriccin indica el momento en el que la clula puede entrar a la fase GO o bien continuar con el ciclo.

Fig. 10. Esquema que muestra la tcnica de transferencia nuclear, con la cual se pueden crear copias idnticas de animales.

Captulo 2 Bases tericas de los mtodos experimentales ms comunes en Biologa y Gentica Molecular Mario Alberto Rodrguez1, Rima Gharaibeh2, Laurence Marchat2 y Csar Lpez Camarillo2.
1

Departamento de Patologa Experimental, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del IPN (CINVESTAV-IPN), Mxico, D.F.

Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa Avanzada del IPN (CICATA-IPN), Mxico, D.F.

Email: marodri@enigma.red.cinvestav.mx PALABRAS CLAVE:DNA, RNA, protenas, mtodos, complejos DNA-protenas, Southern, Northern, Western, expresin.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivo del captulo. 3. Estado actual del arte. 4. Aislamiento y anlisis del DNA. 4.1 Aislamiento del DNA. 4.1.1 Lisis de la pared celular y de las membranas. 4.1.2 Disociacin de los complejos DNA-protenas. 4.1.3 Separacin del DNA de otras macromolculas. 4.2 Anlisis del DNA. 4.2.1. Manipulacin enzimtica del DNA.

4.2.2. Anlisis del DNA por hibridacin (Southern blot e hibridacin en gota). 4.2.3. Secuenciacin. 4.2.4. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). 5. Aislamiento y anlisis del RNA. 5.1 Aislamiento del RNA. 5.1.1. Aislamiento del RNA total. 5.1.2. Aislamiento del RNA mensajero (RNAm). 5.1.3. Evaluacin del RNA aislado. 5.2 Anlisis del RNA. 5.2.1. Anlisis por hibridacin (Northern blot). 5.2.2. Ensayo de proteccin con nucleasa S1. 5.2.3. Anlisis del transcrito naciente (run on). 6. Aislamiento y anlisis de protenas. 6.1 Aislamiento de protenas. 6.2 Purificacin de protenas. 6.3 Anlisis de protenas. 6.3.1. Cuantificacin de protenas. 6.3.2. Anlisis por electroforesis en geles de poliacrilamida. 6.3.3. Inmunoanlisis de protenas. 7. Interacciones DNA-protenas. 8. Aislamiento de genes. 9. Expresin de protenas recombinantes. 10. Conclusiones.

Abreviaturas Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

Los avances de la biologa y de la gentica molecular han permitido conocer la secuencia del genoma humano, entender los fundamentos de la herencia, de la expresin gentica, de la estructura y funcin de las macromolculas que forman las clulas y lograr la clonacin de mamferos. Estos conocimientos se han acrecentado gracias a la posibilidad de manipular y expresar genes especficos, lo cual permite la obtencin y el estudio de molculas de importancia biolgica. Los productos de estos genes tambin pueden ser utilizados en la medicina, la industria, la ganadera o la agricultura. Los mtodos empleados en biologa y gentica molecular han creado una revolucin en el estudio de los seres vivos. Ahora se puede investigar con detalle la estructura y la funcin de las diferentes molculas que constituyen a un organismo. Con la ayuda de estos mtodos se puede, por ejemplo, identificar a las molculas que estn implicadas en la patogenicidad de los parsitos, para posteriormente realizar estrategias de control que eviten su desarrollo o su transmisin. Tambin es posible identificar molculas alteradas responsables de algunas enfermedades humanas, como el cncer. De hecho, estas tcnicas hacen posible el desarrollo de nuevos mtodos de control, como la terapia gnica, donde la introduccin de los genes normales en el organismo afectado puede revertir el efecto patolgico producido por las molculas alteradas.

2. OBJETIVO DEL CAPTULO

El objetivo del presente captulo es el de proporcionar un panorama general de los mtodos experimentales ms comunes que se utilizan en la biologa y en la gentica molecular para el aislamiento y anlisis del DNA, del RNA y de las protenas. En este captulo se darn las bases tericas de las metodologas, mientras que los protocolos pueden consultarse en los manuales antes mencionados.

3. ESTADO ACTUAL DEL ARTE A la fecha se han desarrollado una amplia variedad de tcnicas que permiten el aislamiento y caracterizacin de las diferentes macromolculas que constituyen a un organismo. Tambin estn disponibles las tcnicas para la terapia gnica y la clonacin de mamferos. Estos dos avances sin precedentes en la historia de la medicina se basan en la tecnologa del DNA recombinante. Los mtodos empleados en cada caso dependen de la pregunta que se desea resolver, del organismo que se est estudiando y de las facilidades con las que cuenta el investigador para desarrollar el estudio. Sin embargo, existen tcnicas generales que pueden ser utilizadas para el anlisis de macromolculas, como son la electroforesis, la identificacin de protenas y cidos nuclicos fijados a un filtro, la espectrofotometra, la clonacin de genes, etc. Estas y otras tcnicas estn descritas en diversos manuales de laboratorio que detallan paso a paso los

protocolos a seguir (Harris y Angel, 1989; Sambrook y col., 1989; Watson y col., 1992; Ausubel y col., 1994; Kaufman y col., 1995).

4. AISLAMIENTO Y ANLISIS DEL DNA

El DNA no existe como una molcula libre en las clulas, sino que forma parte de los cromosomas, donde est asociado a protenas que le permiten una organizacin definida. Adems, el DNA se replica y se transcribe por lo que frecuentemente est asociado con RNA y protenas involucradas en la regulacin de la expresin gentica, como la DNA polimerasa, la RNA polimerasa y otros factores especficos de la replicacin y de la transcripcin.

4.1 Aislamiento del DNA

Existen varios protocolos para extraer el DNA celular total, pero todos ellos incluyen las siguientes etapas bsicas: lisis de la clula, disociacin de los complejos DNA-protena, separacin del DNA de otras macromolculas y evaluacin de la cantidad y la calidad del DNA aislado.

4.1.1 Lisis de la pared celular y de las membranas

Para la liberacin del DNA total, se usa una solucin de lisis que destruye las membranas presentes en la clula (membrana plasmtica, membrana nuclear y membranas de diferentes organelos). La lisis de clulas con una pared celular

rgida, como la de las bacterias y las plantas, requiere un tratamiento adicional, el cual generalmente incluye la digestin con enzimas que degradan la pared celular o la congelacin de las clulas y su trituracin. Debido a que las enzimas que degradan los cidos nuclicos (nucleasas), utilizan iones divalentes para su actividad, es muy importante que el amortiguador de lisis contenga el agente quelante EDTA para impedir la degradacin del DNA.

4.1.2. Disociacin de los complejos DNA-protenas

El mtodo ms comn para romper la asociacin DNA-protenas es su extraccin con fenol, un solvente orgnico que desnaturaliza y disuelve a las protenas. En la particin de fases, las protenas desnaturalizadas se disuelven en la fase orgnica (inferior) o precipitan en la interfase, mientras que el DNA y el RNA permanecen en la fase acuosa (superior) (Sambrook y col.,1989).

4.1.3 Separacin del DNA de otras macromolculas

4.1.3.1 Separacin del DNA cromosomal

El DNA genmico se puede separar de las molculas de RNA y de las protenas contaminantes residuales mediante la ultracentrifugacin en un gradiente de cloruro de cesio (CsCl), la cual permite la separacin de las diferentes molculas por su densidad (Sambrook y col., 1989). Alternativamente, el lisado se puede digerir con una RNAsa para eliminar la posible contaminacin con RNA, seguida

de una extraccin con fenol:cloroformo:alcohol isoamlico para desproteinizar al DNA y finalmente, la precipitacin del DNA con etanol o isopropanol, para obtenerlo lo ms puro posible. La separacin del DNA nuclear, mitocondrial o del cloroplasto, se logra generalmente utilizando una lisis celular en condiciones suaves, que permita el rompimiento de las membranas celulares, dejando intactos a los ncleos y los organelos. Estos se pueden separar debido a sus diferencias en tamao, densidad o sensibilidad a diferentes detergentes. Posteriormente, el DNA de estos organelos se aisla siguiendo los mismos protocolos de purificacin de DNA total.

4.1.3.2. Separacin de DNA plasmdico

Los plsmidos son molculas circulares de DNA de doble cadena, las cuales se replican en forma independiente del cromosoma bacteriano (Lewin, 2000). Debido a su conformacin, los plsmidos pueden separarse del DNA cromosomal por varios mtodos, los ms comunes son la lisis alcalina y el gradiente en CsCl (Sambrook y col.,1989). En la purificacin por lisis alcalina, la exposicin del lisado bacteriano a un alto pH, seguido de un rpido cambio a condiciones de renaturalizacin, causa la separacin (desnaturalizacin) de las cadenas de DNA lineal y de los crculos abiertos, pero no de los crculos superenrrollados. Esto causa la formacin de agregados insolubles de cadenas sencillas, las cuales se pueden eliminar por centrifugacin. Los crculos superenrollados presentes en el sobrenadante se purifican eliminando los contaminantes residuales. Este mtodo se usa

generalmente para purificar en forma rpida pequeas cantidades de plsmidos (minipreparaciones). La purificacin de plsmidos por gradientes en CsCl se basa en la diferencia de densidad de las molculas lineales y de las superenrolladas, provocada por la unin de ciertos colorantes como el bromuro de etidio (Sambrook y col.,1989). Una molcula de DNA circular superenrollada puede unir una cantidad limitada del colorante, debido a que el DNA no puede desenrollarse mucho. En contraste, las molculas lineales pueden unir una gran cantidad de colorante, modificando substancialmente su densidad. As, los plsmidos pueden purificarse por su diferencia en densidad mediante la centrifugacin en un gradiente de CsCl. Este protocolo se usa para aislar plsmidos con alta pureza y plsmidos grandes (>15 kb) que son ms susceptibles de sufrir cortes durante la purificacin por lisis alcalina. Adems de los mtodos descritos aqu y en los manuales, existen Kits comerciales para la purificacin rpida de DNA cromosomal o plasmdico, cuya seleccin de reactivos y protocolo de purificacin se basa en los aspectos descritos en los prrafos anteriores.

4.1.3.3 Evaluacin de la cantidad y calidad del DNA

La calidad y la concentracin del DNA se evalan mediante el anlisis del espectro de absorcin en luz UV. Los cidos nucleicos presentan un pico de absorbencia a 260 nm debido a los grupos aromticos que contienen las bases nitrogenadas,

mientras que los posibles contaminantes, como las protenas, el fenol o los carbohidratos, presentan una absorbencia mxima a 280, 270 y 230 nm, respectivamente. El DNA en solucin est considerado puro si la relacin A260
nm/A280 nm est

entre 1.8 y 2. Cuando la preparacin de DNA es pura, existe una

relacin lineal entre la concentracin del DNA y la absorbencia a 260 nm. Una unidad de absorbencia a 260 nm corresponde a 50 g/ml de DNA de doble cadena, y 40 g/ml si es de cadena sencilla. Estas concentraciones son exactas para cidos nucleicos con 50% de contenido de G+C. Por lo tanto, la concentracin real de una preparacin de DNA puede ser un poco diferente de la concentracin as estimada, dependiendo de su contenido en G+C. Otro mtodo para analizar el DNA lo constituye la electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. En un campo elctrico fijo, las molculas de DNA, que tienen una carga elctrica negativa, migran en el gel hacia el nodo y se separan de acuerdo a su tamao y conformacin (Sambrook y col., 1989). El DNA se tie con un colorante fluorescente y se visualiza en luz UV. En un gel, el DNA plasmdico se separa generalmente en tres bandas, que corresponden a los diferentes grados de enrollamiento de las molculas circulares. El DNA genmico migra como una sola banda de alto peso molecular, mientras que un barrido por debajo de esta banda generalmente indica un DNA degradado. Adems, es posible detectar si existe contaminacin por RNA, el cual se visualiza como una banda difusa de bajo tamao molecular. En el caso de las molculas lineales, la migracin es inversamente proporcional al log10 del nmero de bases, en un intervalo dado de tamaos

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moleculares. El tamao de un fragmento de DNA desconocido se estima por comparacin en la migracin con marcadores de DNA de tamaos moleculares conocidos y generalmente adquiridos de casas comerciales, aunque tambin se pueden preparar en el laboratorio.

4.2 Anlisis del DNA

4.2.1. Manipulacin enzimtica del DNA

Muchos de los grandes avances de la tecnologa del DNA recombinante se deben al descubrimiento y utilizacin de las enzimas que modifican al DNA y de las endonucleasas de restriccin (llamadas as, debido a que cuando se descubrieron se encontr que su actividad en bacterias impeda o restringa la proliferacin de bacterifagos). El uso de estas enzimas permite establecer mapas fsicos del DNA, as como obtener fragmentos especficos de DNA para purificarlos o manipularlos posteriormente (Watson y col., 1992).

4.2.1.1. Endonucleasas de restriccin

Estas enzimas, bajo condiciones definidas, reconocen secuencias especficas y cortan los enlaces fosfodister del DNA de doble cadena en sitios internos. Las endonucleasas de restriccin se han purificado de diversas bacterias y se clasifican en tres grupos (I, II y III) (Lewin, 2000), pero la mayora de las que se usan en biologa molecular pertenecen al tipo II. El sitio de corte es generalmente

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una secuencia palindrmica de 4 a 6 nucletidos y las endonucleasas pueden separar las cadenas de DNA en el eje de simetra de la secuencia, lo que genera fragmentos de DNA con extremos romos o parejos, o bien, el corte puede estar desplazado a un lado del eje, produciendo fragmentos de DNA con terminaciones cohesivas, esto es, que contienen secuencias de cadena sencilla hacia los extremos 5 o 3 (Fig. 1) (Watson y col., 1992). Las endonucleasas de restriccin son muy tiles para aislar y estudiar fragmentos de DNA, ya que permiten la unin de DNA de diferentes orgenes, liberar insertos clonados y establecer mapas de corte en el DNA, es decir, localizar los sitios con las secuencias especficas que reconocen y cortan diferentes enzimas en una regin determinada de DNA.

4.2.1.2. Enzimas de modificacin

Estas enzimas representan una herramienta esencial para estudiar los cidos nucleicos, ya que permiten: i) sintetizar nuevas cadenas de DNA (DNA polimerasas) o de RNA (RNA polimerasas), ii) ligar fragmentos (ligasas), lo que permite unir dos fragmentos de DNA de diferente origen, iii) agregar y eliminar grupos fosfato (cinasas y fosfatasas respectivamente), lo cual puede servir para la clonacin de fragmentos de DNA o para marcarlos qumica o radioactivamente, iv) introducir grupos metilo (metilasas) para protegerlos de la digestin por endonucleasas de restriccin, y v) digerir cadenas de DNA (exonucleasas) para producir fragmentos de DNA de diferentes tamaos (Watson y col.,1992).

4.2.2. Anlisis del DNA por hibridacin (Southern blot e hibridacin en gota)

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Esta tcnica se aplica para: i) identificar genes homlogos en diferentes especies de un gnero o en diferentes organismos, ii) analizar la organizacin de los genes, por ejemplo, determinar el nmero de copias de un gen, y iii) detectar deleciones o rearreglos de genes. La tcnica de Southern blot consiste bsicamente en cortar el DNA con una o dos endonucleasas de restriccin para producir fragmentos de diferentes tamaos que se separan por electroforesis. Estos fragmentos se transfieren a filtros de nylon o nitrocelulosa, los cuales se convierten en replicas del gel y el DNA en ellos se desnaturaliza, es decir se separa en cadenas sencillas. Los filtros se incuban con sondas especficas que estn marcadas con algn producto qumico o radioactivo y finalmente, la membrana se expone a la reaccin qumica que detecte la hibridacin o a una placa de rayos X para detectar las seales de hibridacin. El ensayo de hibridacin en gota o dot blot es bsicamente idntico al Southern blot con la diferencia de que el DNA no se digiere con endonucleasas ni se separa por electroforesis, sino que se coloca directamente en la membrana. Las ventajas de la hibridacin en gota son la rapidez de la tcnica y que se requiere de menores cantidades de DNA que en el Southern blot (se puede realizar una hibridacin en gota con nanogramos del DNA). La desventaja, es que no se puede determinar el tamao del fragmento que hibrida con la sonda.

4.2.3. Secuenciacin

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La secuenciacin de DNA consiste en la produccin, por mtodos enzimticos o qumicos, de una serie de fragmentos de DNA con diferencia de una sola base. La secuencia se determina por la resolucin en electroforesis de los fragmentos generados (Sambrook y col., 1989). Actualmente, los mtodos de secuenciacin ms usados son: i) el mtodo enzimtico, tambin conocido como terminacin de la cadena por didesoxirribonucletidos o el mtodo de Sanger, y ii) el mtodo que utiliza la degradacin qumica del DNA en sitios especficos de las cuatro bases nitrogenadas, desarrollado por Maxam y Gilbert en 1980. Actualmente existen sistemas de secuenciacin automatizada que permiten secuenciar largos fragmentos de DNA en relativamente corto tiempo. El mtodo qumico de Maxam y Gilbert consiste de las siguientes etapas: i) un fragmento definido de DNA se marca con -[32P] en el extremo 3o 5, ii) el DNA marcado se divide en cuatro muestras, y cada una se trata con un reactivo qumico que modifica especficamente una o dos de las bases del DNA (G, A + G, C + T C), iii) se destruye el enlace entre la base modificada y la ribosa mediante la adicin de una solucin caliente (90C) de piperidina en agua, lo que produce una serie de fragmentos marcados, cuyos tamaos dependen de la distancia entre la base eliminada y el extremo marcado, (iv) se separan los fragmentos grandes por electroforesis y se determina la secuencia del DNA. El mtodo de Sanger utiliza didesoxirribonucletidos (ddNTPs), es decir, nucletidos que carecen del grupo 3-OH en la ribosa y que cuando la DNA polimerasa agrega uno de ellos durante la sntesis de DNA, sta se termina. En

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esta tcnica se realizan cuatro mezclas de sntesis de DNA que contienen: i) la cadena sencilla del DNA molde que ser secuenciada, ii) un oligonucletido iniciador, iii) los 4 desoxirribonucletidos (dNTPs) que forman el DNA (uno de ellos marcado con 35S), iv) una DNA polimerasa, y v) un didesoxirribonucletido particular (ddATP, ddTTP, ddGTP o ddCTP). Los fragmentos sintetizados estarn marcados y tendrn tamaos diferentes dependiendo de la posicin del terminador incorporado en la cadena. Finalmente, los fragmentos se separan por electroforesis y se determina la secuencia del DNA.

4.2.4. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

La tcnica de amplificacin del DNA por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) permite amplificar in vitro secuencias especficas de DNA o de DNA complementario (DNAc). La PCR se realiza mediante: i) el uso de un par de oligonucletidos iniciadores que son complementarios a secuencias que flanquean el fragmento de DNA a amplificar, y ii) varios ciclos de sntesis de nuevas cadenas de DNA por accin de una DNA polimerasa (Sambrook y col., 1989). La PCR no requiere un DNA molde de alta calidad, es suficiente la presencia de por lo menos una cadena completa del DNA con la secuencia de inters con una cantidad mnima de contaminantes (protenas, carbohidratos, lpidos, etc.). El primer paso de la PCR consiste en una etapa de desnaturalizacin del DNA molde, el cual ocurre generalmente a 94C durante 5 min. Este paso permite asegurar la realizacin correcta del primer ciclo de polimerizacin e inactivar las proteasas y nucleasas que pudieran estar presentes en la mezcla de reaccin.

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Posteriormente, cada ciclo de amplificacin se divide en 3 etapas (Fig. 2): i) desnaturalizacin, donde las cadenas de DNA se separan al calentar la muestra a 94C, ii) alineamiento de los oligonucletidos iniciadores, es decir, hibridacin de los iniciadores con las secuencias complementarias que flanquean la regin a amplificar, y iii) extensin de la cadena en la cual la DNA polimerasa sintetiza nuevas cadenas de DNA complementarias a la cadena molde a partir de los iniciadores. Los avances y el desarrollo de la tcnica de PCR se deben principalmente al descubrimiento de la enzima Taq DNA polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus. Esta enzima trabaja a una temperatura ptima de 72C y es estable a temperaturas ms altas, por lo que se adiciona desde el inicio de la reaccin y permanece activa hasta el ltimo ciclo de amplificacin. Los productos de PCR se acumulan de manera exponencial, ya que stos poseen las secuencias complementarias de los iniciadores y por lo tanto, sirven de molde en los ciclos de amplificacin subsecuentes. Despus del primer ciclo, las molculas obtenidas son de varios tamaos, pero, a partir del segundo ciclo, como las nuevas cadenas son utilizadas como molde, la DNA polimerasa sintetiza cadenas cuya longitud se limita a las secuencias complementarias a los iniciadores (Fig. 2). En los ltimos aos, se han desarrollado algunas variantes de la PCR, entre las ms comunes podemos citar: i) la RT-PCR (del ingls, Reverse TranscriptasePCR), que permite analizar la expresin gentica al amplificar el DNAc sintetizado por la transcriptasa reversa a partir de RNA total o RNA mensajero (RNAm), ii) la PCR inversa, donde, al crear in vitro molculas circulares de DNA, se amplifican

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las secuencias desconocidas que flanquean una regin conocida, y iii) el tamizaje diferencial (differential display en ingls), que permite identificar genes que se expresan de manera diferencial sin conocer su secuencia. Esta tcnica utiliza como iniciadores un oligo dT, un oligonucletido arbitrario y como molde el DNAc obtenido a partir de RNAm de clulas crecidas bajo diferentes condiciones.

5. AISLAMIENTO Y ANLISIS DEL RNA

La importancia de estudiar el RNA radica en que todas las funciones celulares son gobernadas en ltima instancia por la expresin gentica (Lewin,2000). La abundancia relativa (o nivel estacionario) de un transcrito de RNA celular puede ser determinada de forma cualitativa o cuantitativa y constituye uno de los parmetros fundamentales a evaluar durante el estudio de la expresin gentica de un organismo.

5.1 Aislamiento del RNA

5.1.1. Aislamiento del RNA total

En general, el aislamiento del RNA requiere mucha destreza tcnica, debido a que las molculas de RNA son mucho ms lbiles que las de DNA. Adems, existe el problema constante de la actividad de las ribonucleasas (RNAsas) celulares y ambientales que pueden degradar el RNA durante el proceso de aislamiento. Por estas razones, para la manipulacin del RNA es importante utilizar guantes

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durante todo el proceso, usar exclusivamente material y reactivos libres de RNAsas, as como agua y soluciones tratadas con inhibidores de RNAsas (Sambrook y col.,1989). El aislamiento de RNA se puede dividir en tres etapas: i) lisis celular, ii) separacin del RNA de las molculas contaminantes, y iii) evaluacin de la cantidad y la calidad del RNA aislado. En la lisis celular, la homogeneizacin de la muestra es mediada por agentes caotrpicos, incluyendo las sales de guanidina, dodecil sulfato de sodio (SDS), sarcosil, urea, fenol y cloroformo (Sambrook y col., 1989). En general, estos agentes rompen la membrana plasmtica y los organelos subcelulares, e inactivan las ribonucleasas. Para la eliminacin de contaminantes del RNA se utiliza la adicin de fenol/cloroformo seguida de centrifugacin, lo que separa la solucin de lisis en una fase orgnica y otra acuosa. Dado que la solucin de lisis no permite la disociacin de los complejos DNA-protenas, el DNA permanece en la fase orgnica junto a las protenas, adems de gran parte de los carbohidratos, lpidos y restos celulares. En la fase acuosa permanece exclusivamente el RNA libre, el cual es recuperado mediante la precipitacin de la fase acuosa con isopropanol o etanol.

5.1.2. Aislamiento del RNA mensajero (RNAm)

Para aislar el RNAm se utiliza la ventaja de que la mayora de stos contienen un tracto de poli-adeninas (colas de poli A+) en su regin 3 no traducida (Lewin, 2000). Bajo las condiciones apropiadas, los RNA poli (A+) pueden purificarse mediante columnas de afinidad utilizando un polmero de oligo (dT) acoplado a

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una matriz (Fig. 3). El RNA poli (A+) puede ser aislado por este mtodo a partir de una muestra de RNA total o bien directamente a partir de un lisado celular (Sambrook y col.,1989).

5.1.3. Evaluacin del RNA aislado

La evaluacin de la cantidad y la calidad del RNA aislado se basa en los mismos principios espectrofotomtricos descritos para el DNA. La pureza de la muestra puede ser determinada por absorbencia a A260/280, el RNA en solucin est considerado puro si la relacin A260/280 es mayor a 2. Otro mtodo para evaluar la cantidad e integridad del RNA lo constituye la electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La calidad del RNA se evala mediante la observacin del patrn de corrimiento electrofortico del RNA despus de teir el gel con bromuro de etidio. En una muestra de RNA total de eucariontes se observar una banda superior correspondiente al RNA ribosomal 28S y una inferior que identifica al RNA ribosomal 18S. En la electroforesis del RNA se utilizan geles que contienen una mezcla de formamida y formaldehdo, o bien glioxal o dimetilsulfxido (Sambrook y col., 1989). Estos compuestos desnaturalizan al RNA, es decir eliminan las estructuras secundarias de asas y horquillas generadas por complementaridad de bases, que pudieran interferir en la migracin correcta de las molculas. El tamao del RNA separado por electroforesis puede obtenerse de la misma manera que para molculas de DNA, utilizando marcadores de tamao conocido.

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5.2 Anlisis del RNA

5.2.1. Anlisis por hibridacin (Northern blot)

El Northern blot es una tcnica de hibridacin, similar al Southern blot, que se utiliza para estimar la abundancia y el tamao de una especie de RNA en particular. En resumen, el RNA se separa por electroforesis bajo condiciones desnaturalizantes y luego se transfiere por capilaridad a una membrana de nitrocelulosa o de nylon. Las molculas de RNA presentes en la membrana son hibridadas con la sonda de inters, que puede ser de RNA en antisentido o de DNA, y finalmente, la membrana se expone a una placa autorradiogrfica con la finalidad de visualizar la seal de hibridacin.

5.2.2. Ensayo de proteccin con nucleasa S1

Esta metodologa es de gran utilidad en la deteccin y cuantificacin de transcritos que se expresan a muy bajo nivel (Sambrook y col.,1989). Tambin es utilizada para conocer las regiones 5 y 3 del RNA que no son traducidas (sitios de inicio de la transcripcin y de poliadenilacin, respectivamente) de un transcrito especfico (Ausbel y col.,1994). Brevemente, el RNA (total o poli A+) se hbrida en solucin con una sonda especfica la cual se encuentra marcada radiactivamente. Posteriormente, las molculas de RNA y de sonda que no forman molculas hbridas, son digeridas por la nucleasa S1, enzima que degrada exclusivamente molculas de cadena sencilla. Los hbridos protegidos de la digestin se resuelven

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mediante una electroforesis en geles de poliacrilamida, en los cuales se estima el tamao y la abundancia del RNA protegido.

5.2.3. Anlisis del transcrito naciente (run on)

El ensayo de transcripcin run on es actualmente el procedimiento ms sensible para medir la tasa de transcripcin especfica de un gen. El ensayo, en conjunto con los datos obtenidos por Northern blot, nos permite determinar si los cambios en los niveles de RNAm celular que ocurren en funcin de algn estadio celular en particular, son el resultado de un cambio en el nivel de transcripcin o bien producto de un evento postranscripcional tal como el cambio en la tasa de degradacin del RNAm. En esta tcnica se aislan los ncleos y se incuban con una mezcla de ribonucleotidos, donde el UTP est marcado radioactivamente con la finalidad de marcar los transcritos que estn siendo sintetizados. El RNA marcado es purificado y se utiliza como sonda para hibridar secuencias de genes conocidos que previamente han sido inmovilizados en membranas de nylon o nitrocelulosa. Dado que todos los transcritos que estn siendo expresados en el momento del ensayo se marcan, la complejidad de la sonda es alta, por lo que la mezcla de transcritos obtenidos puede utilizarse para detectar prcticamente cualquier gen celular que est siendo expresado.

6. AISLAMIENTO Y ANLISIS DE PROTENAS

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Las protenas participan en la inmensa mayora de los procesos celulares, por lo que se han desarrollado muchas tcnicas bioqumicas para estudiarlas. En este captulo nos limitaremos a describir los mtodos ms usados para su aislamiento y anlisis.

6.1. Aislamiento de Protenas

La primer etapa para el anlisis de las protenas es la obtencin de un extracto que contenga las protenas totales o bien la protena de inters, en una forma soluble. El protocolo de preparacin del extracto proteico depende de la localizacin subcelular de las protenas a estudiar, ya que puede tratarse de protenas extracelulares, protenas solubles en el citoplasma, o bien protenas contenidas en un organelo. Adems, pueden ser protenas membranales o que estn embebidas en cuerpos de inclusin (grnulos citoplsmicos en los cuales se concentran generalmente las protenas recombinantes expresadas en E. coli). El rompimiento de la clula produce la liberacin de numerosas proteasas celulares. Por lo tanto, para evitar la degradacin de las protenas, es muy importante adicionar una mezcla de inhibidores de proteasas en las soluciones amortiguadoras utilizadas en la preparacin del extracto proteico. Con este mismo fin, tambin se recomienda trabajar a 4C y con soluciones fras (Ausbel y col.,1994). Existen dos grupos de mtodos para romper la membrana de las clulas y liberar las protenas citoplsmicas (Ausbel y col.,1994; Harris y Angel, 1989): i) las clulas pueden romperse por mtodos fsicos, tales como la homogenizacin

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mecnica, el tratamiento por calor, la aplicacin de alta presin, la congelacindescongelacin, o bien, la ultrasonicacin, y ii) los mtodos no fsicos que incluyen la agitacin con abrasivos, el choque osmtico, las enzimas lticas, la lisis alcalina, o el uso de detergentes y solventes, entre otros. Despus de la lisis se realiza una centrifugacin para eliminar clulas intactas y fracciones no solubles. La preparacin de un extracto de protenas localizadas en un organelo especfico requiere el aislamiento previo de dicho organelo. Una vez obtenidos los organelos deseados, se rompen por mtodos mecnicos o qumicos para liberar las protenas.

6.2 Purificacin de Protenas

El objetivo principal de una purificacin es la obtencin de la protena de inters con 100% de homogeneidad con un rendimiento mximo. Cada protena presenta una combinacin nica de propiedades que se pueden aprovechar para su purificacin (Harris y Angel,1989). Las protenas pueden separarse de acuerdo con su solubilidad, la cual est determinada por la distribucin de los grupos hidroflicos e hidrofbicos en la superficie de las protenas. La interaccin de dichos grupos con los iones en solucin puede ser alterada por cambios de pH o fuerza inica (adicin de sulfato de amonio, por ejemplo), de tal manera que sean favorecidas las interacciones protena-protena, provocando su precipitacin y la recuperacin de los aglomerados por centrifugacin. Es importante analizar tanto la pastilla como el sobrenadante para localizar la protena de inters.

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La cromatografa es una tcnica de separacin diferencial de los componentes de una muestra proteica. Una fase mvil, que puede ser un lquido o bien un gas, transporta los componentes de la muestra a travs de una matriz, que corresponde a la fase estacionaria del sistema (Harris y Angel, 1989). Generalmente, la fase estacionaria, empaquetada en una columna, est constituida de una matriz inerte, modificada qumicamente por la adicin de grupos funcionales, con los cuales van a interaccionar los componentes de la muestra proteica. La separacin se realiza gracias a que los componentes de la muestra, llevados por la fase mvil, son absorbidos o atrapados por la fase estacionaria de manera diferente. El flujo de la muestra a travs de la columna se puede hacer a presin baja (LPLC, Low Pressure Liquid Chromatography), mediana (MPLC, Medium Pressure Liquid Chromatograph) o alta (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography). Existen diferentes tipos de cromatografa que separan a las protenas debido a sus diferencias en tamao (cromatografa de exclusin), carga (cromatografa de intercambio inico), hidrofobicidad (cromatografa en fase reversa) o afinidad por ligandos (cromatografa de afinidad) (Ausbel y col.,1994; Harris y Angel, 1989).

6.3 Analisis de protenas 6.3.1 Cuantificacin de protenas

Los mtodos ms comunes para cuantificar protenas son los mtodos colorimtricos de Lowry y Bradford (Ausbel y col.,1994). El mtodo de Lowry utiliza

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el reactivo Folin y est basado en la reaccin de Biuret. En condiciones alcalinas, los enlaces peptdicos reaccionan con el cobre, produciendo iones Cu2+. Su interaccin con el reactivo Folin provoca la aparicin de un color azul, que depende principalmente de los residuos tirosina y triptofano, y cuya absorbencia se mide a 750 nm. En el mtodo de Bradford se usa el colorante azul de Coomassie R250, cuya forma aninica, unida a las protenas, tiene un mximo de absorcin a 595 nm. En los dos mtodos, la absorbencia es proporcional a la cantidad de protenas en solucin. La concentracin del extracto proteico se determina por comparacin con una curva de absorbencia establecida con una protena estndar, generalmente albmina srica bovina.

6.3.2. Anlisis por electroforesis en geles de poliacrilamida

Las protenas son molculas anfteras, cargadas negativa o positivamente dependiendo del pH del medio donde estn, y por lo tanto, son capaces de migrar en un campo elctrico. Para su separacin por electroforesis, se pueden usar diferentes soportes de migracin, de entre los cuales los geles de poliacrilamida son los ms usados, ya que ofrecen la resolucin ms alta (Ausbel y col., 1994). Las protenas se pueden separar electroforticamente de acuerdo con su peso molecular, carga elctrica, hidrofobicidad, o combinacin de estas tres propiedades. La electroforesis en condiciones no desnaturalizantes, permite analizar las protenas sin perturbar su actividad biolgica o bioqumica. En cambio, su caracterizacin en trminos de peso molecular o nmero de subunidades

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requiere la adicin de agentes desnaturalizantes y reductores para destruir las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias. La electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGESDS) es uno de los mtodos ms usados, ya que permite la resolucin ptima de las protenas de acuerdo a su peso molecular. Las protenas se tratan previamente con calor para romper los enlaces de hidrgeno que estabilizan las estructuras secundarias (desnaturalizacin). Se les adiciona SDS, un detergente aninico que se une a las protenas y les confiere una carga elctrica negativa, lo que permite separarlas por electroforesis de acuerdo a su peso molecular. A la muestra tambin se le agrega 2-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT), compuestos que reducen los enlaces disulfuro a grupos sulfhidrilo, lo que permite el despliegue de las protenas y la separacin de las subunidades. Durante su separacin, las protenas migran a travs del gel en una relacin lineal con el log10 de su peso molecular, por lo que el tamao de un polipptido de inters se puede estimar por comparacin con marcadores de peso molecular conocido. El mtodo de isoelectroenfoque permite separar las protenas de acuerdo a su carga elctrica (Ausbel y col.,1994). El sistema utiliza un gel polimerizado en presencia de una mezcla de diferentes anfolitos transportadores y soluciones de electroforesis constituidas por diferentes anfolitos (H3PO4 como anolito, y NaOH como catolito). La aplicacin de la corriente elctrica causa que los anfolitos transportadores migren de acuerdo a su carga elctrica, formando un gradiente continuo de pH. Entonces, la muestra se aplica en los geles y las protenas migran de acuerdo a su carga hasta que cada protena se estabiliza en la posicin donde tiene una carga elctrica neta nula, que determina su punto isoelctrico (pI).

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La electroforesis en dos dimensiones permite la separacin de protenas con base a una propiedad molecular diferente en cada direccin. Las protenas se separan en la primera dimensin de acuerdo a su carga elctrica mediante el mtodo de isoelectroenfoque, y posteriormente, los polipptidos se separan en la segunda dimensin de acuerdo con su peso molecular, por PAGE- SDS. Generalmente, las protenas se visualizan en el gel por tincin con el colorante azul de Coomassie, que permite detectar bandas que contienen desde 0.5 mg de protenas. La tincin con nitrato de plata (AgNO3) es un mtodo aproximadamente 20 a 200 veces ms sensible que puede detectar desde 0.1 ng de protena por banda.

6.3.3. Inmunoanlisis de protenas

El desarrollo de los mtodos inmunolgicos ha sido de gran utilidad para el anlisis de protenas. Dentro de las principales tcnicas de biologa molecular que utilizan los anticuerpos como herramientas biolgicas, podemos citar los ensayos de inmunoelectrotranferencia o Western blot y ELISA (Ausbel y col., 1994). La inmunoelectrotransferencia es una herramienta para la identificacin de una protena especfica en un extracto proteico complejo. El protocolo implica la separacin de las protenas por PAGE-SDS y su transferencia a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente, la protena de inters, inmovilizada en la membrana, se identifica mediante un anticuerpo primario capaz de reconocerla de manera especfica. Existen varias tcnicas para visualizar la presencia del complejo anticuerpo primario-antgeno, pero la mayora utilizan a la protena A de

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Staphyloccocus aureus o a un anticuerpo secundario conjugados con un istopo radiactivo, con biotina o con un marcador enzimtico. El ensayo de ELISA (del ingls Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay) es la tcnica de eleccin para evaluar la presencia y concentracin de anticuerpos. En el ensayo, el antgeno es inmovilizado en los pozos de una placa de microtitulacin, donde se incuba con una muestra que puede contener los anticuerpos dirigidos contra dicho antgeno. La interaccin antgeno-anticuerpo se identifica mediante la adicin de un anticuerpo secundario acoplado a un marcador enzimtico y de un sustrato cromgeno o fluorgeno especfico para el marcador conjugado, lo que genera un producto cuya cantidad es proporcional a la cantidad de anticuerpos unidos a los antgenos inmovilizados.

7. INTERACCIONES DNA-PROTENAS

La regulacin transcripcional, as como el control de la replicacin del DNA, involucran protenas reguladoras capaces de unirse a secuencias especficas del DNA o del RNA (Lewin, 2000). Existen varios mtodos para estudiar las interacciones DNA-protena o RNA-protena, dentro de los cuales podemos citar los ensayos de retardamiento, de entrecruzamiento con luz UV y de proteccin a la digestin por la DNAsa I (Sambrook y col., 1989). El ensayo de retardamiento de la movilidad electrofortica en geles de poliacrilamida (en ingls Electrophoretic Mobility Shift Assay) es una tcnica simple y sensible para detectar complejos DNA-protena en secuencias especficas. Este mtodo, que utiliza fragmentos de DNA marcados

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radioactivamente, est basado en que la unin de una protena a un fragmento de DNA modifica la movilidad electrofortica de ste en condiciones no desnaturalizantes. Los fragmentos de DNA libres migran ms rpido que los complejos DNA-protena. De la misma manera se puede detectar la unin de protenas al RNAm. La adicin de anticuerpos especficos en estos ensayos, ahora llamados de superretardamientos, permiten identificar la protena presente en el complejo. Si el anticuerpo reconoce la protena involucrada en la formacin del complejo, su adicin a la reaccin puede producir dos efectos: i) se puede formar un complejo DNA-protena-anticuerpo con una movilidad electrofortica menor, lo que produce un superretardamiento del complejo en el gel; o bien ii) el anticuerpo puede inhibir la unin de la protena al DNA, provocando la desaparicin del complejo o una reduccin en su cantidad (Sambrook y col., 1989). El ensayo de entrecruzamiento con luz UV permite estimar el peso molecular de una protena unida a una secuencia nucleotdica especfica (Sambrook y col., 1989; Ausbel y col., 1994). La irradiacin con luz ultravioleta de los complejos DNA-protena induce la formacin de enlaces covalentes entre el DNA y la protena, por lo que, el marcaje radiactivo del DNA queda incorporado a la protena. Entonces, la secuencia de DNA que no form enlaces con la protena se degrada con nucleasas y las protenas que formaron los complejos se identifican mediante PAGE- SDS y autorradiografa. El ensayo de proteccin a la digestin por la DNasa I permite determinar las secuencias exactas del fragmento de DNA que interaccionan con las protenas (Sambrook y col.,1989). Bsicamente, el mtodo consiste en tres etapas (Fig. 4): i)

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la interaccin entre el fragmento de DNA marcado radiactivamente y el extracto proteico, ii) la digestin del DNA con la enzima DNasa I en condiciones tales que la enzima haga en promedio un corte por cadena. En este punto, la secuencia de DNA que une la protena queda protegida de la digestin, y iii) el DNA se analiza por electroforesis en un gel de poliacrilamida. En ausencia de protenas, el perfil de electroforesis presenta todos los fragmentos marcados que resultan de los cortes por la DNasa I. Pero, si una protena o ms se unieron a la sonda, se observar una interrupcin en la escalera que corresponde a la regin de interaccin DNA-protena (Fig. 4). Su secuencia exacta se determina al comparar la regin protegida con una reaccin de secuenciacin corrida en paralelo.

8. AISLAMIENTO DE GENES

El objetivo de construir una genoteca o banco de genes es la de obtener todos los genes de un organismo en una coleccin de clonas recombinantes. En estos bancos, los genes forman parte de una molcula de DNA acarreadora llamada vector. Las genotecas se utilizan para aislar un gen de inters, mediante el escrutinio de las mismas con una sonda especfica. Las genotecas pueden ser de dos tipos: i) bancos de DNA genmico y ii) bancos de DNAc, que representan slo los genes que se expresan como RNAm. Cuando se trata de clulas de mamferos, es preferible trabajar con genotecas de DNAc ya que estos organismos presentan con frecuencia, genes muy grandes con varios intrones, lo que dificulta el anlisis de las secuencias.

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Para construir una genoteca se pueden emplear diferentes vectores como plsmidos, bacterifagos, csmidos (plsmidos de aproximadamente 5 kb, que contienen el sitio cos del bacterifago , lo que permite su empaquetamiento in vitro), fagmidos (hbridos de plsmidos y del fago filamentoso M13) y los YACS (cromosomas artificiales de levaduras) (Sambrook y col., 1989). La clona conteniendo algn gen de inters se identifica por hibridacin con una sonda marcada por mtodos qumicos, enzimticos o radiactivos. La sonda puede ser de DNA, de DNAc o de RNA. En el caso de bancos construidos en vectores que pueden expresar el DNA alojado en ellos (vectores de expresin), el gen de inters tambin se puede aislar utilizando anticuerpos especficos que reconozcan el polipptido recombinante producido por la clona. En este caso, despus de transferir las colonias o las placas de lisis a membranas de nitrocelulosa, se realiza el escrutinio mediante un proceso idntico a la tcnica de inmunoelectrotransferencia. Para el escrutinio de genotecas por medio de sondas de DNA o RNA se utiliza el principio de la hibridacin de cidos nucleicos (Fig. 5). Las colonias bacterianas con el vector recombinante o las placas de lisis de las bacterias infectadas con fagos recombinantes se transfieren a membranas de nylon o nitrocelulosa y el DNA se desnaturaliza y se fija en la membrana in situ. La membrana rplica se incuba con la sonda especfica de DNA o RNA marcada radiactivamente y, despus de los lavados adecuados, se expone a una placa de rayos X para identificar por autorradiografa las colonias (o placas) que contienen

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al vector con el inserto de inters (Fig. 5). Las clonas positivas se recuperan a partir de la caja maestra. Las sondas utilizadas para el escrutinio de genotecas pueden ser obtenidas de diferentes formas: i) si se conoce una secuencia parcial de la protena codificada por el gen de inters, es posible sintetizar un oligonucletido sinttico (de aproximadamente 20 bases) con los codones que pueden codificar la secuencia de los aminocidos conocida. Debido a que la mayora de los aminocidos son codificados por dos o ms codones, se recomienda sintetizar una mezcla de todas las posibles secuencias de DNA (oligonucletidos degenerados), para garantizar la presencia de la secuencia correcta. ii) En el caso de que se conozcan dos o ms secuencias cortas de aminocidos (< 6 aa) de la protena de inters o que se conozca la secuencia de dicha protena en otros organismos, la sonda puede ser un fragmento de DNA amplificado por PCR utilizando como molde DNA del organismo o tejido estudiado y oligonucletidos diseados a partir de las secuencias de aminocidos conocidas o conservadas en la escala evolutiva. iii) En el caso de que se conozca el gen en otro organismo evolutivamente relacionado, ste se puede utilizar como sonda (sonda heterloga).

9. EXPRESIN DE PROTENAS RECOMBINANTES

La expresin de protenas recombinantes es la sntesis in vivo de una protena fornea en clulas huspedes (Sambrook y col., 1989). Este proceso involucra la

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insercin de un gen o un fragmento del mismo en un vector, para que sea transcrito y traducido eficientemente en las clulas huspedes. Las razones para expresar una protena en sistemas heterlogos son mltiples: i) la produccin de protenas funcionales para determinar su actividad biolgica y realizar estudios bioqumicos y biofsicos, entre otros, ii) la produccin de protenas mutantes con el fin de estudiar la relacin estructura-funcin, iii) la generacin de antgenos para realizar estudios inmunolgicos tales como produccin de anticuerpos o mapeo de eptopos, y iv) la aplicacin de las protenas recombinantes como agentes bioteraputicos para pacientes con diferentes padecimientos. Para expresar una protena recombinante se requiere clonar el gen de inters en un vector de expresin, introducir el vector recombinante a la clula husped y expresar e identificar la protena recombinante. Los vectores de expresin son principalmente plsmidos y virus, que contienen un promotor fuerte y regulable, esencial para la obtencin de altos niveles de expresin. En el caso de la expresin de protenas de fusin, el vector debe incluir la regin codificante del extremo amino o carboxilo de una protena acarreadora. El organismo husped utilizado para expresar protenas heterlogas puede ser procarintico o eucarintico. Sin embargo, requiere de tres caractersticas fundamentales: i) tener un ciclo de vida corto, ii) crecer in vitro, y iii) aceptar el vector recombinante. Pptidos menores de 500 aminocidos se expresan fcilmente como protenas de fusin en E. coli, mientras que, protenas de secrecin mayores de 500 aminocidos o receptores de superficie celular se expresan con mayor xito en clulas de mamfero. Por otra parte, si se requiere

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que la protena expresada tenga las modificaciones postraduccionales necesarias para su actividad biolgica o si posee intrones, se requiere de sistemas eucarinticos, que poseen los mecanismos para procesar RNA y protenas. Para expresar las protenas recombinantes, las clulas huspedes conteniendo el vector de expresin se crecen en medio lquido selectivo hasta alta densidad, antes de inducir la expresin de la protena recombinante. Para la induccin de la expresin existen varios promotores regulados que se pueden utilizar en un vector de expresin, como: i) promotores regulados por condiciones ambientales, como el promotor pL del bacterifago , que se regula por temperatura y ii) promotores regulados por algn sustrato, como el promotor plac, que es inducido con isopropil--D-tiogalactopiransido (IPTG), un anlogo no hidrolizable de la lactosa. La deteccin de la expresin de las protenas recombinantes puede ser por diversos mtodos. La manera ms comn es analizar por PAGE-SDS los extractos de clulas inducidas, donde la protena recombinante se observa como una banda abundante del peso molecular esperado, la cual est ausente en las preparaciones de clulas no transformadas o no inducidas. Si se cuenta con el anticuerpo dirigido contra la protena de inters o, en el caso de protenas de fusin, contra el pptido codificado por el vector, la expresin de la protena heterloga se confirma por la tcnica de inmunoelectrotransferencia (Western blot). Dos problemas principales se pueden presentar cuando se expresa una protena recombinante: i) la toxicidad de la protena recombinante para las clulas.

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El grado de toxicidad de una protena recombinante es variable. Si es ligeramente txica, la protena puede producirse en altos niveles reduciendo el tiempo de induccin. Por el contrario, si la protena es extremadamente txica, por ejemplo, que inactive los ribosomas o que destruya la membrana de la clula husped, hay que cambiar a otro sistema de expresin. ii) Protelisis. Las protenas heterlogas pueden ser susceptibles al ataque enzimtico de una gran variedad de proteinasas endgenas. Las causas de la degradacin proteoltica de una protena recombinante pueden ser su plegamiento errneo o que la clula husped la reconozca como extraa. El problema de la protelisis puede controlarse bajando la temperatura a la cual se realiza la expresin de la protena, lo cual reduce la actividad proteoltica. Alternativamente, la protena se puede fusionar a polipptidos que le confieran mayor resistencia a la degradacin proteoltica. Por ejemplo, la fusin a los pptidos LacZ y TrpE de E. coli o a polpptidos conteniendo una secuencia de seis histidinas, permite la obtencin de cuerpos de inclusin insolubles que son muy resistentes a la protelisis. Con el fin de mejorar el nivel de expresin y facilitar su purificacin, la protena recombinante puede fusionarse en marco de lectura a una etiqueta o tag. Esta secuencia codifica desde un aminocido hasta una protena completa con afinidad por algn ligando especfico que permite la purificacin de protenas hbridas o quimeras mediante cromatografa de afinidad.

10. CONCLUSIONES

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El aislamiento y caracterizacin de macromolculas es parte fundamental en el estudio de las funciones vitales de los organismos. Al intentar aislar y caracterizar una molcula, el investigador debe considerar la relacin entre pureza y actividad, es decir, obtener la molcula suficientemente pura sin perder significativamente su actividad, para poder dar respuesta a la pregunta planteada sobre la funcin de la molcula en estudio. Por otra parte, aunque existen diferentes tcnicas para aislar las diversas molculas que componen a los organismos, la mejor metodologa para la purificacin de una molcula en particular depende del ingenio del investigador y de la infraestructura disponible.

ABREVIATURAS

ddNTPs dNTPs HPLC LPLC MPLC PCR

Didesoxirribonucletidos trifosfatados. Desoxirribonucletidos trifosfatados. High performance liquid chromatography. Low pressure liquid chromatography. Medium pressure liquid chromatography. Reaccin en cadena de la polimerasa.

PAGE-SDS Electroforesis en gel de poliacrilamida conteniendo SDS RNAsas RT-PCR Ribonucleasas. Transcripcin reversa acoplada a PCR.

BIBLIOGRAFA

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Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Smith, J.A., Seidman, J.G. and Struhl, K. 1994. Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, New York. Harris, E.L.V, and Angel, S. 1989. Protein purification methods, a practical approach. IRL Press, Oxford. Kaufman, P.B., Wu, W., Kim, D. and Cseke, L. 1995. Hanbook of molecular and cellular methods in biology and medicine. CRC Press, Boca Raton. Lewin, B. 2000. Genes VII. Oxford University Press, Oxford. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Watson, J.D., Witkowski. J., Gilman, M. and Zoller, M. 1992. Recombinant DNA. Scientific American Books, New York.

PIES DE FIGURAS

Figura 1. Diferentes extremos producidos por las endonucleasas de restriccin de tipo II.

Figura 2. Esquema general de la PCR.

Figura 3. Aislamiento de RNA poli (A+) utilizando columnas de oligo (dT) acoplado a una matriz de celulosa. RNAt, RNA de transferencia; RNAr, RNA ribosomal.

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Figura 4. Esquema general del ensayo de proteccin a digestin por DNasa I. Carriles A,C,G,T: reaccin de secuenciacin.

Figura 5. Esquema general del escrutinio de una genoteca construida en el fago , utilizando una sonda de DNA marcada radiactivamente.

Captulo 3 Conceptos bsicos de gentica Juan Pedro Luna Arias 1 and Esther Orozco2
1

Departamento de Biomedicina Molecular, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional (CINVESTAV-IPN), Mxico, D.F.

Departamento de Patologa Experimental, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional (CINVESTAV-IPN), Mxico, D.F.

Email: jpluna@mail.cinvestav.mx PALABRAS CLAVE: Leyes de Mendel, extensiones mendelianas, teora cromosmica, herencia, ligamiento, recombinacin, gen-una enzima, estructura del DNA, proyecto genoma humano, clonacin de organismos multicelulares.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivos del captulo. 3. Estado actual del arte. 4. Leyes de Mendel. 5. Extensiones Medelianas. 5.1 Dominancia incompleta y codominancia. 5.2 Alelos mltiples o serie allica. 5.3 Genes letales. 5.4 Epistasis. 5.5 Otro tipo de interacciones. 6. Teora cromosmica de la herencia. 6.1 Evidencias citolgicas. 6.2 Evidencias gentica. 7. Descubrimiento del DNA como material gentico.

2 8. Los genes estn arreglados linealmente en los cromosomas. (descubrimiento del ligamiento y la recombinacin). 9. Hiptesis de un gen-una enzima (los genes codifican protenas). 10. Colinearidad entre el gen y la protena. 11. Determinacin de la estructura del cido desoxirribonucleico. 12. Fronteras de la gentica contempornea. 12.1 Proyecto genoma humano. 12.2 Clonacin de organismos completos. 13. Conclusiones. Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

La Gentica, definida como la ciencia encargada del estudio de los genes o el estudio de los modos de transmisin de la herencia, ha sido uno de los pilares importantes para el desarrollo actual de la Biologa Molecular y de la Ingeniera Gentica, las cuales se han constituido en lo que se conoce actualmente como Gentica Molecular. El desarrollo en el conocimiento de los procesos moleculares de la clula y el desarrollo de nuevas tecnologas como los mtodos de secuenciacin automatizada, han permitido llevar a cabo grandes proyectos como el de la secuenciacin completa de los genomas de varios organismos, entre los que destacan Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pilori, Caernorhabditis elegans y Drosophila melanogaster, entre otros, y finalmente, el gran proyecto conocido como Proyecto del Genoma Humano, el cual

3 recientemente se public su terminacin, y que ser la clave para conocer los genes que participan en las mltiples enfermedades, y evidentemente, favorecer los mtodos de diagnstico y el establecimiento de terapias especficas para cada individuo. Adicionalmente, con el desarrollo de la hibridacin en biochips, ha sido posible determinar los encendidos y apagados de todos los genes contenidos en genomas completos como el de S. cerevisiae, a travs del ciclo celular, o estudiar el efecto de mutaciones en genes especficos, sobre la expresin del resto de los genes celulares. Esto permitir establecer los patrones de expresin en la diferenciacin celular, y conocer cules genes son controlados por microorganismos patgenos o por virus.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

En el presente captulo, se pretende dar un panorama general de los sucesos ms importantes en la gentica. Para ello, se describirn los experimentos que condujeron al descubrimiento de: i) las leyes que gobiernan la transferencia de la informacin gentica (Leyes de Mendel), ii) que los genes son las unidades que contienen esta informacin, iii) que los genes estn localizados en los cromosomas y arreglados de manera lineal, iv) que los genes estn constitudos de DNA y v) que los genes codifican protenas. Finalmente, abordaremos de manera breve, los ltimos acontecimientos relativos al proyecto del genoma humano.

4 3. ESTADO ACTUAL DEL ARTE

La gentica es parte importante de nuestra vida porque est involucrada en muchas de las cosas que utilizamos. Por ejemplo, el algodn procede de plantas que han sido modificadas genticamente mediante el uso de tcnicas de gentica clsica (cruzas para formar hbridos, etc). Muchas de las semillas que se utilizan en los cultivos de arroz, sorgo y maz por ejemplo, tambin han sido modificadas genticamente por mtodos tradicionales, lo que ha permitido producir plantas resistentes a sus patgenos. Esto ltimo ha generado lo que se conoce como la revolucin verde, porque entre otras cosas ha permitido obtener grandes volmenes de cosechas a nivel mundial. Tambin estn la levadura, ampliamente utilizada para la produccin de bebidas alcohlicas como la cerveza o en la elaboracin del pan, la cual ha sido modificada para sobreproducir alcohol, as como los microorganismos superproductores de antibiticos como la penicilina y estreptomicina. Desde los descubrimientos de Mendel, la gentica ha pasado por una revolucin acelerada, debido a las tecnologas desarrolladas en paralelo por la ingeniera gentica y la citogentica. Gracias al descubrimiento del ligamiento de genes, se han podido establecer los mapas de ligamiento para cromosomas de organismos como D. melanogaster, S. cerevisiae y el humano. Con el avance de la citogentica, tambin ha sido posible la identificacin precisa de los alelos que conforman un par cromosmico y el establecimiento de correlaciones ms exactas entre las anormalidades cromosmicas y los cuadros clnicos que se derivan de estas alteraciones. Tambin ha sido posible la localizacin de genes en los cromosomas, entre los que podemos destacar la de los oncogenes involucrados en las transformaciones neoplsicas.

5 Adicionalmente, el descubrimiento del papel que juegan algunos genes en las enfermedades ha permitido desarrollar tcnicas de diagnstico moleculares, que son mucho ms precisas y rpidas como por ejemplo, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o la transcripcin reversa acoplada a PCR (RTPCR), por mencionar slo algunas. Por ltimo, estn los avances logrados en la clonacin de mamferos como la oveja Dolly, y que en la actualidad, se dirigen a la produccin de clulas madre (stem), las cuales podran reemplazar las clulas daadas de un tejido, mediante su transplante. Estos desarrollos biotecnolgicos parece que harn posible los sueos reflejados en las historias de ciencia ficcin. Sin duda, el presente siglo nos depara un sinnmero de descubrimientos excitantes e increbles, que cambiarn para siempre, la situacin actual de la biologa y de nuestra vida.

4. LEYES DE MENDEL

Antes de la llegada de Mendel, la herencia se explicaba con la teora de la mezcla de los caracteres, que afirmaba que los rasgos de los hijos resultaban de la mezcla de las caractersticas de los padres. Sin embargo, esta teora era incapaz de explicar el hecho de en algunas ocasiones, los hijos se parecen ms al padre, mientras que en otras ocasiones a la madre. El conocimiento de los patrones hereditarios se revolucion con Gregor Mendel, un monje agustino considerado el padre de la gentica, quien realiz sus estudios con el guisante Pisum sativum. Como todos sabemos, la antera es el rgano masculino de las flores y contiene el polen, mientras que el ovario, cuya parte superior se denomina estigma, es el rgano femenino que contiene los vulos. El vulo es

6 fecundado cuando el polen, localizado en el estigma, emite un tubo germinativo. El guisante tiene como ventajas la autopolinizacin (que consiste en la fecundacin de los vulos de una flor con su mismo polen) y la polinizacin cruzada (fecundacin de los vulos de una flor con polen proveniente de otra flor). Mendel realiz sus experimentos con lneas puras, es decir, con plantas cuya descendencia siempre presentaba la misma caracterstica, independientemente de si realizaba autopolinizacin o fertilizacin cruzada. En uno de sus primeros experimentos, Mendel poliniz una planta de flores prpuras con polen de una planta de flores blancas y obtuvo en la primera generacin filial F1 slo plantas con flores prpuras. Este mismo resultado lo obtuvo en la cruza recproca, es decir, en la polinizacin de una planta de flores blancas con polen de una planta de flores prpuras. Cuando autopoliniz las plantas F1 obtuvo en la generacin F2, una relacin 3:1 de plantas de flores prpuras a plantas de flores blancas (Fig. 1). Lo que Mendel interpret del hecho de que en F1, uno de los fenotipos desapareca, pero que en un cuarto de la generacin F2 volva a aparecer, era que aunque todas las plantas F1 tenan el fenotipo dominante (color prpura), un porcentaje de la poblacin tena el potencial de producir progenie con el fenotipo recesivo (color blanco). Estas mismas proporciones las obtuvo al realizar sus experimentos con otros seis pares de caractersticas del guisante que tena perfectamente estudiadas (Griffiths y col., 1996). En otros experimentos, al cruzar plantas de semillas verdes con plantas de semillas amarillas, Mendel obtuvo en F1, slo plantas de semillas amarillas. Cuando autocruz plantas F1, encontr que 3/4 de las plantas F2 tenan

7 semillas amarillas y 1/4 semillas verdes. Al autocruzar plantas F2 de semillas amarillas encontr una mezcla de plantas genticamente diferentes: 1/3 producan semillas amarillas y 2/3 semillas amarillas y verdes, mientras que la autocruza de plantas F2 de semillas verdes slo produjeron semillas verdes. En otras palabras, las plantas F2 produjeron una relacin fenotpica de 1:2:1. Con estas observaciones, Mendel propuso un modelo que postulaba que: i) existen determinantes hereditarios (que ahora los conocemos como genes) que son de naturaleza particulada. ii) Cada planta posee dos tipos de genes: uno dominante y el otro recesivo. iii) Los miembros de un par gnico se segregan con la misma probabilidad en los gametos. iv) Cada gameto contiene slo un miembro del par gnico. v) Los gametos se unen al azar sin importar su constitucin gentica. Como sucede con cualquier modelo, Mendel procedi a determinar si era correcto. Para ello, realiz cruzas de prueba, esto es, la cruza de un organismo F1 con un organismo que siempre produce un fenotipo recesivo. En todos los casos que analiz, encontr una relacin fenotpica de 1:1 (dominante a recesivo), la cual era la relacin esperada si es que su modelo era el correcto (Griffiths y col., 1996). Todas las observaciones realizadas por Mendel se han constituido en lo que se conocen como las Leyes de Mendel. La Primera Ley establece que los miembros de un par gnico se segregan o separan en los gametos, de tal suerte que una mitad de los gametos contiene un miembro del par gnico, mientras que la otra mitad contiene el segundo miembro del par. As, Mendel identific dos formas alternativas o alelos para las caractersticas estudiadas (fenotipos): Y, alelo dominante, y, alelo recesivo. Por consiguiente, pueden existir tres genotipos: YY, Yy o yy. Aquellos individuos que presentan un slo

8 tipo de alelo se denominan homocigotos (YY, yy), en tanto que los que contienen ambos alelos son heterocigotos (Yy). A nivel molecular, estas formas del mismo gen son muy semejantes en su secuencia, pero difieren slo en unos cuantos nucletidos. Pero, qu sucede cundo se analiza ms de una caracterstica? Para averiguarlo, Mendel realiz cruzas de plantas con diferentes pares de fenotipos, por ejemplo el color de las semillas (amarilla o verde) y la apariencia de la superificie de las mismas (lisa o rugosa). Encontr que las autocruzas de un doble heterocigoto del tipo F1 generaron una relacin fenotpica 9:3:3:1 (Fig. 2). Pero al analizar cada uno de los fenotipos por separado, encontr nuevamente la relacin 3:1. Estas observaciones fueron validadas mediante un cruza de prueba entre una planta F1 (Rr Yy) y un doble homocigoto recesivo (rr yy). En este caso obtuvo una relacin fenotpica 1:1:1:1. Estas observaciones se conocen como La Segunda Ley de Mendel o Ley de la segregacin independiente que establece que la segregacin de los alelos de un gen es independiente de la segregacin de los alelos de otro gen, durante la formacin de los gametos (Griffiths y col., 1996). Sin embargo, los hallazgos de Mendel no recibieron ninguna atencin por parte de la comunidad cientfica, hasta que en 1900, sus leyes fueron redescubiertas por Hugo de Vries en Holanda, Erich von Tschermack en Austria y por Carl Correns en Alemania, cada uno de ellos trabajando de manera independiente.

5. EXTENSIONES MENDELIANAS

9 Hasta el momento, se han descrito condiciones de dominancia y recesividad para un par de alelos. Pero no son las nicas formas de interaccin gentica en los organismos. Estas interacciones traen como consecuencia que las relaciones mendelianas se alteren. A continuacin, se describirn otros tipos de interacciones genticas que en conjunto se conocen como extensiones Mendelianas.

5.1 Dominancia incompleta y codominancia

Los fenotipos estudiados por Mendel, slo presentaban caractersticas de dominancia y recesividad. Sin embargo, los dos alelos presentes en los organismos diploides se pueden estar expresando a la vez, ya sea en cantidades variables (dominancia incompleta), o en cantidades equivalentes (codominancia). El sistema del tipo sanguneo en humanos descubierto por Landsteiner y Levine, en el cual los posibles genotipos son LMLM, LMLN y LNLN, que corresponden a los fenotipos M, MN y N, respectivamente, presenta codominancia. En este caso, los dos alelos presentes se expresan en la misma proporcin, y por tanto, son detectables ambos antgenos con anticuerpos especficos. Otro ejemplo corresponde a la hemoglobina. La hemoglobina normal viene codificada por el alelo HbA, en tanto que el HbS puede producir lo que se conoce como anemia falciforme. Si un individuo tiene genotipo HbAHbA su hemoglobina ser normal; si es HbSHbS, se producir una anemia severa y fatal, mientras que para el caso del heterocigoto HbAHbS, el individuo no presentar anemia, pero los eritrocitos se vuelven falciformes por la accin de la hemoglobina anormal, en bajas tensiones de oxgeno (Griffiths y col., 1996).

10

5.2 Alelos mltiples o serie allica En una poblacin, se presentan con frecuencia para un mismo locus, ms de dos alelos. Estos alelos constituyen lo que se conoce como serie allica, pero hay que recordar que slo dos alelos estarn presentes en cada individuo. Esto se debe a la aparicin de mutaciones en el gen, que originan las formas alternativas del mismo. En este caso, se presentan relaciones de dominancia y recesividad en forma jerquica. Generalmente, el alelo dominante sobre los dems miembros de la serie se representa con letra mayscula, y la letra minscula se asigna al alelo que es recesivo a todos los dems. Los alelos intermedios se designan con letra minscula y algn superndice adecuado. Un ejemplo de serie allica es el sistema de tipificacin sangunea AB0 de los humanos, que tambin presenta codominancia. En este ejemplo, los genotipos IA IA e IA i, corresponden al grupo sanguneo A; IB IB e IB i, corresponden al grupo sanguneo B; el genotipo IA IB produce el grupo sanguneo AB, mientras que el i i, est asociado al grupo sanguneo 0 (o carencia de antgenos). El alelo IA codifica para el antgeno A, IB codifica para el antgeno B e i no produce antgeno. IA e IB son totalmente dominates sobre i, y la jerarqua de las relaciones de dominancia se representa como (IA = IB ) > i (Griffiths y col., 1996). Un segundo ejemplo de serie allica lo constituye el color del pelo de los conejos. C permite la produccin completa del color gris tpico de los conejos; cch es responsable, en condicin homocigtica, de la remocin del color amarillo, produciendo un color gris plata llamado chinchilla; ch, tambin en condicin homocigtica, produce un conejo con las extremidades de color

11 negro llamado Himalaya; por ltimo, c no produce color, causando que el conejo sea albino en condicin homocigtica. De esta manera, la serie allica mostrada en orden de dominancia descendente es C > cch > ch > c. Por tanto, los genotipos posibles que causan coloracin completa son: CC, Ccch, Cch, Cc. Los conejos color chinchilla son de genotipo cchcch; los conejos de color gris claro son cchch, cchc; los conejos de color Himalaya son chch, chc; en tanto que los que no producen color (albinos) son cc. Otro ejemplo de serie allica lo constituyen los alelos correspondientes a los antgenos de histocompatibilidad de clase I (HLA I) o de clase II (HLA II) en el humano. Con base en estas y otras series allicas, el nmero de genotipos posibles para organismos diploides es [n(n+1)]/2, donde n es el nmero de alelos presentes en la serie. As, para el sistema AB0 existen tres alelos y el nmero de genotipos posibles es seis; para el color del pelo de los conejos, el nmero de alelos es cuatro, y por consiguiente, el nmero de genotipos es diez.

5.3 Genes letales

Se definen como aquellos genes que al expresarse, impiden que el organismo subsista. Si el efecto de un gen letal es dominante, causa que el individuo muera inmediatamente, perdindose el gen de la poblacin. Sin embargo, en algunas ocasiones el fenotipo es retardado y el individuo que lo presenta vive durante algn tiempo. Si el fenotipo es recesivo, este alelo no se expresa en condicin heterocigota y se transmite a la descendencia. El conjunto de alelos letales que tienen los individuos se conoce como carga gentica.

12 El ejemplo clsico de gen letal es el gen AY en ratones. El gen silvestre produce ratones con pelo oscuro, mientras que el alelo mutante AY es dominante y produce un color amarillo en condicin heterocigtica. Si existe en homocigosis, los ratones mueren. Por tanto, el efecto de la expresin de este alelo se dice que es pleiotrpico porque produce ms de un fenotipo: color amarillo en heterocigosis y letalidad en homocigosis. Un ejemplo en humanos es la fibrosis qustica, que para el caso del alelo F508 es recesivo y en homocigosis se expresa en la niez, muriendo los infantes en edades tempranas .

5.4 Epistasis

Como hemos mencionado, los productos gnicos (las protenas) llamados enzimas intervienen como catalizadores en una serie de reacciones qumicas que en conjunto constituyen una ruta bioqumica, y en la que un precursor es transformado en un producto final, generndose entre stos, una serie de intermediarios que van sufriendo una serie de transformaciones qumicas. Cada estapa es llevada a cabo por un producto gnico especfico. Por esta razn, se dice que los genes que estn involucrados en una va bioqumica determinada interactan. Supongamos que tenemos una va en la que el precursor A es transformado secuencialmente en los subproductos B, C, D y el producto final E. La transformacin de A en B es catalizada por la enzima , la de B en C por , la de C en D por , y finalmente, la transformacin de D en E por . Si existiera una mutacin en el gen que codifica para , entonces se acumulara el precursor, pero el organismo podra crecer si se le suministrara

13 cualquiera de los intermediarios B, C, D o el producto final E. Por consiguiente, la mutacin del gen que codifica para , estara enmascarando la accin de los genes restantes involucrados en la va, produciendo lo que se conoce como epistasis. Si el gen episttico acta slo en homocigosis, entonces se trata de epistasis recesiva, si lo hace en heterocigosis, se trata de una epistasis dominante. Si los alelos recesivos de dos genes diferentes, producen en homocigosis el mismo fenotipo, entonces estamos hablando de genes duplicados (Griffiths y col., 1996).

5.5 Otro tipo de interacciones

Tambin pueden producirse interacciones no epistticas si los productos finales de dos vas metablicas diferentes interactan para producir el mismo rasgo, como sucede por ejemplo con el color rojo fuerte caracterstico del ojo de las moscas silvestres, el cual resulta de la mezcla de dos pigmentos que se producen en vas metablicas diferentes. Pero tambin se pueden presentar interacciones con el medio ambiente, que puede determinar el fenotipo de cada individuo. El ejemplo clsico de este tipo se da en los gatos siameses que expresan el alelo termosensibles ch. Este alelo produce una reduccin drstica o la falta de sntesis de la melanina en la piel que cubre regiones calientes del cuerpo, mientras que en las extremidades, puntas de las orejas o cara, donde la temperatura es ms fra, se presenta la sntesis del pigmento. Otro ejemplo es el de los individuos heterocigotos HbAHbS, que se seal anteriormente (Griffiths y col., 1996).

14 6. TEORA CROMOSMICA DE LA HERENCIA

Mendel haba establecido que los alelos de un gen son de naturaleza particulada, pero dentro de la clula, en qu tipo de estructuras se encuentran? En 1902, Walter S. Sutton en los Estados Unidos y Theodor Boveri en Alemania, encontraron independientemente que las partculas de Mendel durante la gametognesis del chcharo tenan un comportamiento muy similar al de los cromosomas en la meiosis. Esto les permiti proponer lo que se conoci como la Teora cromosmica de la Herencia que estableca: i) los genes se encuentran localizados en los cromosomas, ii) los alelos de un gen se segregan de manera similar a como lo hacen los miembros de un par de cromosomas homlogos y, iii) genes diferentes actan independientemente, en forma parecida a como lo hacen los pares de cromosomas diferentes (Fig. 3). Sin embargo, los cromosomas no podan detectarse en la interfase, lo que cuestionaba su integridad, adems de que en ciertas especies, los pares cromosmicos tienen un aspecto similar.

6.1 Evidencias citolgicas

Las evidencias que demostraron claramente que los genes se encuentran localizados en los cromosomas vienen del descubrimiento de la herencia ligada al sexo. En un principio fueron de carcter citolgico y empezaron con el descrubrimiento por H. Henking (1891) de que los machos de varias especies de hempteros (chinches verdaderas) contenan once pares de cromosomas ms un elemento no apareado que se mova a uno de los polos

15 durante la meiosis y al que denomin cuerpo X. Posteriormente, Edmond Wilson (1905) encontr que las hembras de Protenor (otro hemptero) contenan siete pares de cromosomas, de los cuales un par era XX, en tanto que los machos posean seis pares ms un cromosoma X no apareado. Nettie Stevens (1905) determin que las hembras del escarabajo Tenebrio contenan un par XX, mientras que los machos posean un par heteromrfico constituido por un cromosoma X y otro, al que llam Y, que nunca se encontraba en las hembras. Ella tambin encontr en Drosophila una situacin anloga: cuatro pares de cromosomas, donde las hembras poseen un par XX mientras que los machos poseen el par heteromrfico XY. Elinor Carothers en 1913, determin que en los testculos de ciertas especies de saltamontes existan un par heteromrfico y otro cromosoma que careca de contraparte con el cual aparearse. De igual manera, Alfred Blakeslee (1922) encontr 12 cepas diferentes de plantas de Datura stramonium, las cuales contenan 12 pares de cromosomas ms un cromosoma extra diferente en cada cepa, al cual se asociaba el fenotipo diferente observado en cada cepa (Griffiths y col., 1996).

6.2 Evidencias genticas

L. Doncaster y G.H. Raynor (1906) realizaron con la polilla Abraxas, la cruza entre una hembra de alas claras y un macho de alas obscuras, obteniendo en la progenie F1 slo individuos con alas obscuras; cuando realizaron la cruza recproca entre una hembra de alas obscuras y un macho de alas claras encontraron que la hembras tenan alas claras, mientras que los machos posean alas obscuras. Estos resultados contradecan lo encontrado por

16 Mendel, quien haba establecido que en cruzas recprocas el fenotipo de la progenie siempre debe ser el mismo. De forma anloga, William Bateson obtuvo resultados similares con pollos. Los resultados de ambos grupos sealaron que el fenotipo de la progenie corresponde al fenotipo del parental de sexo opuesto, slo cuando el macho lleva el alelo recesivo. Thomas Hunt Morgan (1909), realizando cruzas con Drosophila melanogaster, fue quien pudo explicar claramente estas observaciones. En una primera cruza entre hembras de ojos rojos con machos de ojos blancos, obtuvo toda la progenie F1 con ojos rojos. Cuando realiz la cruza entre dos individuos F1, ambos con ojos rojos, encontr una relacin de individuos de ojos rojos a blancos de 3:1. Sin embargo, de los individuos con ojos rojos de esta cruza, 2/3 eran hembras y 1/3 eran machos, es decir, la relacin hembras a machos era de 2:1! Al realizar la cruza entre una hembra F1 de ojos rojos de la primera cruza con un macho tambin de ojos rojos encontr una relacin fenotpica de 1:1:1:1 para machos y hembras de ojos rojos y machos y hembras de ojos blancos, la cual s es una relacin mendeliana. Pero cuando realiz la cruza recproca de la cruza 1, es decir, la cruza de una hembra de ojos blancos con un macho de ojos rojos, encontr una relacin de hembras de ojos rojos a machos de ojos blancos de 1:1. Morgan encontr entonces que el fenotipo de la progenie era el de los parentales de sexo opuesto, slo si la hembra parental contena el alelo recesivo, observacin contraria a la de Doncaster-Raynor y Bateson. Para explicar estos hallazgos, Morgan, basndose en los resultados de Nettie Stevens seal que: i) los cromosomas X y Y determinan el sexo, de tal suerte que las hembras son XX, mientras que los machos son XY, y ii) los

17 alelos responsables del color de los ojos (W, color rojo, dominante; w, color blanco, recesivo) estn localizados en el cromosoma X, sin que haya contraparte en el Y. As, habra dos tipos de cromosomas X: XW y Xw. Morgan concluy que el gen del color de los ojos est ligado al sexo, es decir, al cromosoma X. Esta explicacin no fue til para entender los resultados con la polilla y los pollos. Sin embargo, Richard Goldchmidt usando la idea general, a sugerencia de Morgan, supuso que los machos seran ZZ y las hembras WZ, localizando los alelos estudiados en el cromosoma Z. La prueba definitiva de que los genes estn en los cromosomas vino de Calvin Bridges en 1916, un estudiante de Morgan, quien al realizar un anlisis poblacional mayor en la progenie resultante de la cruza de Drosophila entre una hembra de ojos blancos (Xw Xw) y un macho de ojos rojos (Xw+ Y), donde los alelos silvestres tienen el signo +, encontr una progenie excepcional primaria que consista de hembras de ojos blancos o machos de ojos rojos en una proporcin de 1/2,000 (o 0.05%). Estos machos siempre fueron estriles. Cuando cruz la hembra de ojos blancos de la progenie excepcional primaria, con un macho normal de ojos rojos, es decir, un macho frtil con ojos rojos, obtuvo un 4% de progenie excepcional secundaria, pero ahora los machos fueron frtiles. Para explicar la progenie excepcional primaria, Bridges propuso una no-disyuncin de los cromosomas X, la cual consista en la no separacin de los cromosomas Xw Xw durante la meiosis. Bridges propuso que los individuos Xw Xw Xw+ y Y0 moran, los Xw Xw Y eran hembras frtiles y los Xw+ 0 eran machos estriles. En otras palabras, si no est presente el cromosoma X, los individuos mueren, al igual que si estn ms de dos cromosomas X, mientras que el cromosoma Y est asociado con la fertilidad. Para explicar la

18 progenie excepcional secundaria, los individuos Xw Xw Xw+ y YY mueren, mientras que el resto son frtiles (la mitad son machos Xw+ Y y la otra mitad son hembras Xw Xw Y). Bridges asumi que los alelos w y w+, como lo haba sugerido Morgan, estaban en el cromosoma X y que se produca una no-disyuncin. Posteriormente, las predicciones de individuos Xw Xw Y, Xw+ 0, Xw Xw+ Y y Xw YY se comprobaron citolgicamente, quedando completamente demostrado que los genes estn en los cromosomas.

7. DESCUBRIMIENTO DEL DNA COMO EL MATERIAL GENTICO

Hasta aqu hemos revisado que los genes son las unidades particuladas que se transmiten sin cambios, de los padres a su descendencia, y estn localizados en los cromosomas. Pero, de qu material estn constituidos los genes?. Los primeros experimentos que permitieron establecer que el material gentico es el cido desoxirribonucleico (DNA) fueron publicados por Frederick Griffith en 1928, quien trabajaba con Pneumococcus. l tena dos cepas, una que produca colonias rugosas (R), la cual era avirulenta, y una que produca colonias lisas (S) y que produca la enfermedad. La virulencia del Pneumococcus est dada por la presencia del polisacrido de la cpsula, el cual vara de cepa a cepa (as, existen cepas de tipo I, II y III). Cuando no se produce este polisacrido, la colonia se vuelve rugosa (R). Las bacterias de la cepa R, que eran derivadas del tipo II, cuando fueron inoculadas en ratones no produjeron la enfermedad, a diferencia de las bacterias de la cepa S, la cual era de tipo III, que s la ocasionaron. Al inocular en ratones bacterias de la cepa

19 S, previamente muertas por calor a 65C, tampoco eran capaces de producir la enfermedad. Sin embargo, cuando inocularon conjuntamente bacterias vivas R y bacterias inactivadas por calor del tipo S, observaron que se produca la enfermedad y que las bacterias que se aislaban del animal muerto eran S, del tipo III. Esto lo llev a concluir que las bacterias muertas por calor podan transformar a la cepa IIR y convertirlas en S tipo III (IIIS) (Griffith, 1928). El material responsable de esta transformacin se denomin principio transformante, el cual fue aislado posteriormente por Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty en 1944, quienes determinaron que se trataba de DNA (Fig. 4). Esto lo realizaron al aadir DNA purificado a partir de la cepa IIIS, a un cultivo de bacterias IIR aglutinadas por antisuero, observando que las clulas IIR eran capaces de producir el polisacrido IIIS. Sin embargo, no se atrevieron a afirmar que el DNA era el material gentico (Avery y col., 1944). La prueba definitiva de que el DNA es el material gentico la realizaron Alfred D. Hershey y Martha Chase en 1952 (Fig. 5). Ellos infectaron bacterias con bacterifagos T2, marcados previamente con 35S (en sus protenas) o con
32

P (en el DNA). Despus de un periodo de infeccin, las bacterias fueron

agitadas en una mezcladora y se separaron dos fracciones por centrifugacin: un sobrenadante que contena las cpsides de los fagos y el precipitado que contena las bacterias infectadas. Las cpsides slo contenan 35S, es decir, slo protenas. Las bacterias infectadas contenan la mayor parte del 32P. La progenie de los fagos contena alrededor del 30% del 32P original, mientras que slo menos del 1% de 35S estaba presente. Por consiguiente, con estos experimentos ellos demostraron que el DNA del fago entraba directamente en

20 las bacterias y que era parte de la progenie de los fagos, y por tanto, que el DNA era el material gentico (Hershey y Chase, 1952).

8. LOS GENES ESTN ARREGLADOS LINEALMENTE EN LOS CROMOSOMAS (DESCUBRIMIENTO DEL LIGAMIENTO Y LA RECOMBINACIN)

Hasta el momento hemos descrito i) las relaciones de Mendel, ii) que los genes son DNA y iii) que estn localizados en los cromosomas. Pero, cmo estn arreglados estos genes? Los experimentos con el guisante, realizados por Bateson y Punnett en los primeros aos del siglo XX, quienes analizaban la herencia del gen que afecta el color de las flores (P, flores prpuras; p, flores rojas) y del que influye en la forma del grano de polen (L, granos de polen alargados; l, granos de polen redondos), pusieron de manifiesto la alteracin de la proporcin fenotpica Mendeliana 9:3:3:1 (PL:Pl:pL:pl) a 13.5:1:1:2.6. La explicacin dada por estos investigadores fue que se produjeron ms gametos P L que aquellos con genotipo p l, sugiriendo la existencia de algn tipo de acoplamiento entre los alelos P y L, y p y l. Thomas Morgan, estudiando los genes que afectan al color de los ojos (pr+, ojos rojos; pr, ojos prpura) y a la longitud de las alas (vg+, tamao normal; vg, vestigios de alas) en Drosophila, encontr tambin una desviacin de las proporciones Mendelianas. Primero realiz la cruza pr+ pr+ vg+ vg+ X pr pr vg vg resultando la progenie F1 con genotipo pr+ pr vg+ vg. Las hembras F1 fueron entonces sometidas a una cruza de prueba con un macho homocigoto recesivo y encontr los siguientes fenotipos: pr+ vg+ (1339), pr vg (1195), pr+ vg (151) y

21 pr vg+ (154). La relacin Mendeliana esperada era 1:1:1:1, pero no la encontr (se observ la relacin 8.9:7.9:1:1). Lo notado por Morgan fue un acoplamiento entre los dos alelos silvestres (pr+ y vg+) y los dos mutantes (pr y vg). Sin embargo, al realizar la cruza pr+ pr+ vg vg X pr pr vg+ vg+, y someter a las hembras F1 (con genotipo pr+ pr vg+ vg) a una cruza de prueba con machos doble homocigotos recesivos, obtuvo las siguientes proporciones fenotpicas en la progenie: pr+ vg+ (157), pr vg (146), pr+ vg (965) y pr vg+ (1067). Ahora, parece que existe una repulsin entre pr+ y vg+ y, pr y vg, ya que stas fueron las clases minoritarias en la progenie. Para explicar el acoplamiento, Morgan propuso que los alelos pr+ y vg+ estn localizados en un cromosoma, mientras que los alelos pr y vg estn en el otro cromosoma homlogo. La aparicin de los individuos con fenotipos pr+ vg y pr vg+, Morgan la explic sugiriendo que los cromosomas homlogos al aparearse durante la meiosis, intercambian ocasionalmente segmentos de DNA. A este proceso se le llam entrecruzamiento, recombinacin o crossing-over en ingls. Las evidencias citolgicas que apoyan la hiptesis de Morgan son los denominados quiasmas. El descubrimiento del ligamiento entre alelos de diferentes loci, fue clave porque permiti establecer que los genes estn arreglados de manera lineal en los cromosomas, y por consiguiente, es factible establecer el orden de los mismos. Alfred Sturtevant, otro estudiante de Morgan, estableci el mtodo para determinar las distancias de mapa entre alelos. Para ello, propuso utilizar la frecuencia de recombinacin como una medida cuantitativa de la distancia lineal entre dos loci, sealando que a mayor distancia entre dos genes ligados, aumenta la posibilidad de que ocurran entrecruzamientos en la regin

22 comprendida entre ellos. As, una unidad de mapa (um) o centiMorgan (cM) se define como la distancia entre genes que genera el 1% de recombinantes. Por consiguiente, con las frecuencias de recombinacin es factible construir mapas de ligamiento. Una de las consecuencias ms importantes de los estudios de Bateson y Punnett , Morgan y Sturtevant fue que los genes estn arreglados en forma lineal. As, ha sido posible mapear cromosomas enteros como los de Drosophila y el X del humano. En la actualidad sabemos que para el humano, alrededor de un milln de bases es el valor aproximado de un cM.

9. HIPTESIS DE UN GEN-UNA ENZIMA (LOS GENES CODIFICAN PROTENAS)

Las primeras evidencias sobre la funcin de los genes derivan de los estudios realizados con humanos por Archibald Garrod en 1902. l not que varios defectos humanos de carcter hereditario son producidos por mutaciones recesivas, las cuales se traducen en defectos metablicos que afectan la qumica bsica del organismo y que se conocen como errores innatos del metabolismo. Un ejemplo clsico lo constituye la fenilcetonuria, la cual es causada por un alelo autosmico recesivo que afecta a la enzima fenilalanina hidroxilasa, que impide que la fenilalanina sea metabolizada a tirosina, con la consecuente acumulacin de fenilalanina, la cual es transformada a cido fenilpirvico, un compuesto altamente txico. Pero fue hasta los aos 1940s que George W. Beadle y Edward L. Tatum, lograron establecer una correlacin directa entre un gen y su funcin. Ellos irradiaron con rayos X esporas del hongo haploide Neurospora crassa

23 para generar mutantes, y determinaron el defecto que causaban en el requerimiento de nutrientes (Fig. 6A). Estas mutantes se conocen como auxtrofas porque requieren de algn compuesto exgeno (aadido externamente al caldo de cultivo) para que puedan crecer. Cuando cruzaron sus mutantes con la cepa silvestre (conocida como prottrofa) produjeron una progenie haploide con una relacin fenotpica de segregacin silvestre a mutante de 1:1. Un juego de mutantes requeran de arginina para crecer en medio mnimo, el cual se define como un medio de cultivo de composicin conocida y que contiene un azcar, algunas sales y cidos inorgnicos, una fuente de nitrgeno (generalmente una sal de amonio) y biotina. Las mutaciones que ellos encontraron mapeaban en diferentes sitios de tres cromosomas, y fueron designadas como arg-1, arg-2 y arg-3. Tambin encontraron que estas mutantes tenan diferente respuesta a ornitina y citrulina, compuestos muy relacionados a la arginina. As la mutante arg-1 creca en medio mnimo suplementado con arginina, ornitina o citrulina; la mutante arg-2 creca en medio mnimo suplementado con arginina o citrulina, pero no con ornitina, mientras que la mutante arg-3 creca solamente en medio mnimo suplementado con arginina (Fig. 6B). En esa poca, ya se saba que las enzimas podan interconvertir compuestos relacionados como los mencionados anteriormente. Con estas observaciones, ellos propusieron el modelo de la Fig. 6C, donde la mutante arg-1 est afectada en la enzima X, de tal suerte que un precursor hipottico no puede ser transformado en ornitina, pero las enzimas Y y Z s son funcionales, por lo que si se sumplementa el medio mnimo con

24 ornitina, citrulina o arginina, puede crecer. De igual manera, la mutante arg-2, estara afectada en la enzima Y, lo que significa que requerira citrulina o arginina para su crecimiento. Por ltimo, la mutante arg-3 estara afectada en la enzima Z, y por lo tanto, slo podra crecer en presencia de arginina. Beadle y Tatum supusieron entonces que una mutacin en un gen determinado afecta la produccin de un tipo de molcula enzimtica, alterando por consiguiente una ruta biosinttica determinada, y este bloqueo puede evitarse mediante el suplemento de un compuesto que generalmente se utiliza despus del sitio del bloqueo en la ruta biosinttica. El modelo propuesto por estos investigadores fue conocido como la teora de un gen una enzima (Beadle y Tatum, 1941).

10. COLINEARIDAD ENTRE EL GEN Y LA PROTENA

Del trabajo de Beadle y Tatum se deriva con firmeza que un gen codifica una enzima. Pero, cul es la naturaleza de la relacin entre un gen y una protena especfica? La respuesta parcial a esta pregunta se consigui gracias a los trabajos de Vernom M. Ingram en 1957, quien compar la hemoglobina normal A (HbA) con la hemoglobina S (HbS), cuya presencia causa la anemia falciforme. Ingram encontr que la huella cromatogrfica en dos dimensiones de la HbS (que consiste en una cromatografa bidimensional en capa fina de un hidrolizado con una enzima proteoltica de la protena en cuestin), difiere de la huella de la HbA en una sola mancha (Fig. 7). La secuenciacin de esta mancha de la HbS y la equivalente de la HbA, mostr que este pptido difera slo en un aminocido: la hemoglobina normal contena cido glutmico, mientras que la hemoglobina alterada tena substituido este aminocido por

25 valina. Por consiguiente, se concluy que los genes deben especificar de alguna forma la secuencia de aminocidos de las protenas. La prueba de esta hiptesis viene de los trabajos realizados por Charles Yanofsky y col. (1964), quienes determinaron una relacin directa de la secuencia del DNA y la secuencia de una protena. Utilizaron la enzima triptfano sintetasa de E. coli, la cual realiza la conversin del indol-glicerol fosfato en triptfano. Esta enzima est codificada por los genes trpA y trpB, que codifican para los polipptidos A y B, respectivamente. Yanofsky y col. (1964) analizaron las mutaciones en el gen trpA, las cuales produjeron alteraciones en la subunidad A de la triptfano sintetasa, determinando una estrecha correlacin entre los sitios mutados en el mapa del gen trpA y la ubicacin de los aminocidos alterados en este polipptido (Fig. 8). A mayor distancia entre dos sitios mutados en el mapa gentico de trpA, mayor distancia en las substituciones de los aminocidos correspondientes en el polipptido A (Yanofsky y col., 1964). Esto demostr una colinearidad entre la secuencia de un gen y la de un polipptido.

11. DETERMINACIN DE LA ESTRUCTURA DEL CIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

Otro hito importante en la biologa moderna lo marc el descubrimiento de la estructura del DNA realizada por James Watson y Francis Crick (1953a). Estos investigadores se basaron en los datos generados por dos investigadores, E. Chargaff y Rosalind Franklin. Chargaff haba encontrado que exista una relacin de las bases nitrogenadas Adenina (A) y Timina (T) de 1:1, y de

26 Guanaina (G) a Citosina (C) tambin de 1:1, en los DNA aislados de varios organismos. Estas relaciones se conocen como las Reglas de Chargaff. Por otra parte, Rosalind Franklin, quien trabajaba en el laboratorio de Maurice Wilkins, obtuvo los patrones de difraccin de rayos X para el DNA. Watson y Crick, utilizando estos datos propusieron el modelo de la doble hlice, que consista en que el DNA est formado por dos cadenas antiparalelas, una que corre en la direccin 5-3, mientras que la otra lo hace en la direccin opuesta (3-5). Estas cadenas tienen una estructura de -hlice y se hayan unidas por dos y tres puentes de hidrgeno entre las bases A-T y G-C, respectivamente, mientras que hacia la parte externa de la cadena, se localizan las desoxirribosas unidas por los enlaces fosfodister, formando una especie de barandal o pasamanos de una escalera. La determinacin de la estructura del DNA trajo como consecuencia inmediata el establecimiento del modelo de replicacin semiconservativa de esta macromolcula (Watson y Crick, 1953b) y que fue posteriormente comprobada por Matthew Meselson y Franklin Stahl en 1958 en su clsico experimento de centrifugacin en gradientes de CsCl, marcando el DNA primeramente con 15N, y posteriormente con 14N. Con el paso de los aos, se han ido desentraando los secretos de las clulas relacionados con los procesos de transmisin de la informacin codificada en el DNA a los RNAs mensajeros (proceso conocido como transcripcin), y de stos a las protenas mediante el proceso de traduccin. Las maquinarias involucradas en estos procesos se conocen con bastante profundidad. Tambin se han decifrado en parte, los mecanismos involucrados en la modificacin postraduccional de las protenas, las vas de transporte intracelulares, los mecanismos de transduccin de seales que permiten a la

27 clulas responder adecuadamente a las seales extracelulares, y muchos otros procesos celulares.

12. FRONTERAS DE LA GENTICA CONTEMPORNEA

A continuacin se describirn con brevedad, dos fronteras de la biologa con alto impacto en la vida humana.

12.1 Proyecto genoma humano

El proyecto Genoma Humano es un proyecto financiado en un principio por el Departament of Energy y el National Institute of Health (NIH), ambos de los Estados Unidos, con 3 mil millones de dlares, y en el que participan actualmente 18 pases, entre los que destacan, adems de Estados Unidos, el Reino Unido, Alemania, Francia, Japn y China (recientemente). El proyecto que inici en 1990, tiene como objetivo conocer la secuencia exacta del DNA del ser humano, que se ha estimado en tres mil millones de pares de bases, para identificar los aproximadamente 30,000 a 40,000 genes que codifican. La secuencia del genoma humano no es el de una persona en particular, sino que varias personas annimas (10-20) han donado su DNA para formar la genoteca que se est utilizando para la secuenciacin, y que se emplear como referencia para cualquier tipo de estudios. Esta informacin ser aplicable a cualquier persona porque todos los humanos comparten el mismo juego de genes as como sus regiones regulatorias que controlan el desarrollo y mantenimiento de sus estructuras y procesos biolgicos. Los hombres

28 donaron esperma y las mujeres sangre, para aislar el DNA, fraccionarlos y clonarlos en vectores para su amplificacin y secuenciacin. Tambin la compaa Celera Genomics emprendi la tarea de secuenciar el genoma del humano. El 6 de abril del ao 2001 anunci la secuenciacin completa del genoma, invirtiendo tan slo 7 meses para conseguirlo. La estrategia que utilizaron fue la tcnica denominada en ings shotgun approach, que involucra el fraccionamiento del DNA en fragmentos pequeos y su secuenciacin al azar, para el posterior ensamble del rompecabezas. El reto siguiente ser determinar cul es la funcin de cada uno de los genes, tanto en el funcionamiento normal del organismo como en los diferentes estados patolgicos. Sin duda, un gran nmero de enfermedades de carcter gentico que an no se les determina los genes involucrados en la patologa, estarn perfectamente definidas en el prximo siglo.

12.2 Clonacin de organismos completos

La gentica ha avanzado tan aceleradamente, que en la actualidad es posible modificar a organismos completos como ratones y crear lo que se conoce como animales transgnicos, mediante la microinyeccin de una construccin gentica conteniendo el gen de inters en un nmero grande de huevos fertilizados, aunque este proceso es poco eficiente. Sin embargo, el mayor avance se ha dado a partir de 1995, cuando se obtuvieron dos copias genticas o clonas, llamadas Megan y Morag, a partir de clulas cultivadas derivadas de un embrin de nueve das, en el Instituto Roslin en Escocia.

29 Desde entonces, el hombre ha sido capaz de obtener clonas de chivos, vacas y otros animales, a partir de clulas de embriones en estadios tempranos de desarrollo. Posteriormente, se procedi a clonar animales a partir de animales adultos. As, a partir de una oveja hembra adulta se produjo a Dolly en febrero de 1997 (Wilmut y col., 1997), tambin en el Instituto Roslin. La tcnica empleada fue la transferencia nuclear (Fig. 9). Esta tcnica consiste en lo siguiente: se tienen dos tipos de clulas, la clula donadora y la clula receptora. Generalmente se utiliza como clula receptora un huevo no fertilizado que se aisla del animal, una vez ocurrida la ovulacin. Con la ayuda de un microscopio, se sujeta el huevo con una pipeta fina y se extrae el ncleo con los cromosomas mediante la succin con una micropipeta extremadamente fina. Posteriormente, la clula donadora (en este caso clulas de la ubre), que ser la clula a copiar, con su ncleo intacto, se fusiona con la clula receptora mediante una corriente elctrica. Algunas clulas fusionadas comienzan a desarrollarse como si se trataran de un embrin normal y son capaces de desarrollar un organismo completo si se implantan en el tero de una madre postiza. Tambin se han utilizado fibroblastos para generar clonas de animales adultos. En otros laboratorios ha sido posible clonar vacas y ratones. Con esta tcnica, slo del 1 al 2% de los embriones sobrevive, y algunas clonas que logran nacer, mueren tiempo despus, sin que se conozca la causa. Esto debe ser un reflejo de la extrema complejidad en la reprogramacin gentica. Posteriormente, se ha aplicado esta tcnica de transferencia nuclear para la generacin de animales transgnicos como Polly, una chiva que secreta

30 en la leche el factor IX humano, un factor de coagulacin utilizado en el tratamiento de la hemofilia B. En este caso, la clula donadora contiene una construccin de DNA conteniendo el gen que codifica para el factor IX humano, previa seleccin con neomicina, ya que el vector usado en la construccin contiene el gen de resistencia a este antibitico. Cules pueden ser las posibles aplicaciones de los animales clonados? Como ejemplos tenemos las siguientes: i) La obtencin de rganos animales modificados para realizar transplantes de rganos, como por ejemplo los de cerdo, que tengan modificada la enzima -galactosil transferasa. Esta enzima modifica las protenas en las clulas porcinas, lo que podra originar una reaccin inmune hiperaguda si un rgano normal porcino se transplanta a un humano. La afectacin de esta actividad podra ser til para la realizacin de transplantes de rganos del cerdo. ii) Puede ser la produccin de animales que tengan defectos genticos que produzcan enfermedades parecidas a la del humano, como por ejemplo la fibrosis qustica, con el objeto de estudiar la evolucin de la misma y las posibles terapias. iii) La obtencin de clulas pluripotenciales (stem cells) utilizando la tcnica de transferencia nuclear, a partir de individuos afectados en algn tejido u rgano, para su posterior transplante con el objeto de adquirir las funciones normales del tejido, sin que se presenten los problemas de rechazo inmunolgico. Seguramente, nuevas aplicaciones se desarrollarn en el futuro.

13. CONCLUSIONES

31 Durante el siglo XX, el desarrollo de la gentica mendeliana permiti establecer los patrones involucrados en la transmisin gentica de los padres a los hijos, as como mejorar con fines econmicos, un gran nmero de organismos. Tambin se han generado colecciones de mutantes relacionadas con un proceso biolgico determinado, como la secrecin, la glicosilacin, el ciclo celular, etc., que han sido fundamentales para conocer paso a paso, cmo se llevan a cabo. Con el desarrollo de nuevos procesos tecnolgicos de carcter multidisciplinario en la biologa molecular, biologa celular y gentica molecular, el siglo XXI depara una revolucin biotecnolgica como nunca antes vista en la historia de la humanidad, que harn que muchas de las historias de ciencia ficcin se vuelvan una realidad. Sin embargo, a partir de este momento, es fundamental que todos, gobernantes, cientficos y sociedad en general, pongamos especial atencin y cuidado en los nuevos desarrollos para evitar que se atente contra la naturaleza, y se pretenda utilizar el conocimiento del genoma humano, como una mercanca.

AGRADECIMIENTOS

Este manuscrito fue realizado gracias a un apoyo del CONACyT, Mxico. Tambin se agradece la colaboracin de la secretaria Claudia Montiel Tovar en la elaboracin de este manuscrito, as como de Alfredo Padilla Barberi en el diseo de las figuras.

ABREVIATURAS PCR Reaccin en cadena de la polimerasa.

32 HbA HbS Homoglobina normal. Hemoglobina S.

BIBLIOGRAFA

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PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Cruzas recprocas donde Mendel determina la presencia de un alelo dominante (prpura) y uno recesivo (blanco) para el color de las flores del guisante. En A se esquematiza la polinizacin de una flor con ptalos de color prpura, con polen proveniente de una flor con ptalos blancos. Toda la progenie obtenida fue prpura. La autocruza de la progenie F1 arroj una proporcin 3:1 de flores prpuras a blancas. En B Mendel hizo la cruza recproca, obteniendo el mismo resultado que en A.

Fig. 2. Ley de la segregacin independiente. A. Cruza entre una planta que produce semillas amarillas y lisas, con una que produce semillas verdes y rugosas; toda la progenie produce semillas amarillas y lisas. B. Autocruza de la progenie obtenida en A. En el cuadro de Punnett de la izquierda se presentan los 4 gametos posibles producidos por cada parental F1. En el cuadro de Punnett de la derecha, se muestran los 16 posibles genotipos obtenidos en la autocruza de F1. C. Fenotipos de la progenie obtenida de la autocruza de F1 donde se observa la relacin Mendeliana 9:3:3:1. Si se analizan los fenotipos por separado, se obtiene la relacin mendeliana 3:1 predicha por la primera Ley de Mendel.

Fig. 3. Teora cromosmica de la herencia. Sutton y Boveri propusieron que los genes estn localizados en los cromosomas, quienes se basaron en los hallazgos de las partculas de Mendel. Para detalles, ver el texto.

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Fig. 4. Experimentos de Avery, MacLeod and MacCarty, quienes sugirieron que el DNA podra ser el principio transformante. Con el DNA aislado de la cepa S de Pneumococcus, estos investigadores transformaron la cepa R, obteniendo la cepa S. Esto les permiti sugerir que el DNA podra ser el material gentico.

Fig. 5. El DNA es el material gentico. A. Cuando se infectaban bacterias con partculas virales que tenan marcadas sus protenas radiactivamente con 35S, slo menos del 1% de la radiactividad inicial se encontraba en la progenie viral. B: Por el contrario, cuando el DNA de los fagos estaba marcado con 32P, alrededor del 30% de este istopo estaba contenido en la progenie. Por lo tanto, el Hershey y Chase propusieron que el DNA era el material gentico.

Fig. 6. Hiptesis de un gen una enzima, propuesta por Beadle y Tatum. A. Estrategia experimental utilizada para la obtencin de las mutantes con alguna auxotrofa. Las clulas mutantes podrn crecer en medio rico, pero no en medio mnimo porque tienen alguna deficiencia metablica. B. Tres tipos de mutantes con auxotrofa a arginina, las cuales estn afectadas de manera diferente entre s. C. Modelo propuesto para la sntesis de la arginina, donde se esquematiza que cada mutante est afectada en una enzima diferente.

Fig. 7. Los genes deben especificar de alguna manera la secuencia de los aminocidos. El anlisis de los pptidos obtenidos mediante la hidrisis enzimtica de la hemoglobina normal y de la hemoglobina de la anemia

37 falciforme, en una cromatografa bidimensional en capa fina, mostr una sola diferencia (sealada en la figura). Posteriormente se determin que estos dos pptidos slo difereran en un aminocido.

Fig. 8. Colinearidad entre un gen y la protena que codifica. Yanofsky y col. encontraron que a mayor distancia entre dos sitios mutados en el mapa gentico de trpA, haba una mayor distancia en las substituciones de los aminocidos correspondientes en el polipptido A. um, unidades de mapa. El gen trpA codifica para la subunidad A de la triptfano sintetasa.

Fig. 9. Mtodo de la transferencia nuclear para la clonacin de individuos. Para mayor descripcin, vase el texto.

Captulo 4 Tuberculosis Blanca Rivera1 y Francisco Solis2.

1

Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Autnoma de Chihuahua, Chihuahia, Chih. Facultad de Medicina. Universidad Autnoma de Chihuahua, Chihuahia, Chih.

Email: bchavira@uach.mx y fsolis@uach.mx

PALABRAS CLAVE: Mycobacterium tuberculosis, Multirresistencia, Biologa Celular y molecular, Diagnstico.

NDICE 1. Introduccin. 1.1 Tuberculosis: una enfermedad reemergente. 1.2 Asociacin entre VIH y tuberculosis. 1.3 Multirresistencia de Mycobacterium tuberculosis. 2. Objetivos del captulo. 3. Panorama actual de la tuberculosis en Mxico. 4. Clasificacin de las micobacterias. 4.1 Biologa celular de las micobacterias. 4.2 Biologa molecular de Mycobacterium tuberculosis. 4.3 Caractersticas clnicas de las micobacterias y su interaccin con el sistema inmunolgico. 4.4 Factores de virulencia en las micobacterias. 5. Deteccin e identificacin de micobacterias. 5.1 Microscopa directa. 5.2 Cultivo.

5.3 Sistema de deteccin radiomtrica. 5.4 Identificacin bioqumica. 5.5 Tcnicas qumicas. 5.6 Tcnicas inmunolgicas. 5.7 Deteccin usando sondas de cidos nucleicos. 5.8 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). 5.9 Amplificacin de polimorfismos genticos (RFLP). 6. Tratamiento. 7. Estado actual de la investigacin en Mycobacterium tuberculosis. 8. Conclusiones. Abreviaturas Bibliografa

1. INTRODUCCIN

1.1 Tuberculosis: una enfermedad reemergente

La tuberculosis, es la principal causa de muerte en el mundo por un solo agente infeccioso: Mycobacterium tuberculosis (Riley y col., 1984 ). Se ha estimado que un tercio de la poblacin del mundo est infectada con esta bacteria, causando ocho millones de casos nuevos y tres millones de muertes anualmente (Sudre y Kochi, 1992). En trminos generales, puede afirmarse que la tuberculosis es la causa del 6.7% de todas las muertes en pases en vas de desarrollo, del 18.5% de las muertes producidas en jvenes de 15 a 19 aos y del 26% de muertes en

adultos (Murray y Thompson, 1992). Hasta hace algunos aos, la incidencia de la tuberculosis era baja. Sin embargo, en la actualidad se ha visto un aumento en los ndices de dicho padecimiento. Dicho aumento puede tener muchas causas. i) la infeccin con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), ii) la reactivacin de infecciones latentes por condiciones socioeconmicas bajas (personas sin hogar, falta de acceso a las unidades de salud, hospedaje temporal en asilos) y iii) el desmantelamiento de la infraestructura de salud pblica, que inclua programas de control de la tuberculosis, cuando dicha enfermedad haba disminuido notablemente (Neil y col., 1994). Los factores que contribuyen a la aparicin de brotes de tuberculosis incluyen: tardanza de diagnstico y en la deteccin de la resistencia a drogas, con la resultante terapia prolongada e inefectiva; la falta de ventilacin adecuada en los cuartos de aislamiento recomendadas y la falta de ventilacin adecuada en los cuartos de aislamiento (Parra y col., 1991). Por otra parte, los programas de terapia preventiva han sido inefectivos debido al pobre cumplimiento del paciente con su tratamiento y a la factibilidad de diseminacin nosocomial (Doodley y col., 1992).

1.2 Asociacin entre VIH y tuberculosis

La evolucin de la tuberculosis en individuos infectados con el VIH es completamente diferente a la del resto de la poblacin (Barnes y col., 1991). Se ha estimado que a nivel mundial existen 4.4 millones de personas coinfectadas con

VIH y M. tuberculosis, de los cuales medio milln padecen tuberculosis activa. La sinergia entre ambos virus es ms mortfera de lo que se supona, ya que un individuo infectado con tuberculosis que tiene contacto con el VIH puede desarrollar la enfermedad generalmente de curso lento. Sin embargo, individuos infectados con VIH que tienen contacto con bacilos tuberculosos sufren una enfermedad aguda, con diseminacin miliar, falleciendo en menos de seis meses (Fox, 1992). El riesgo de desarrollar la enfermedad de individuos positivos a la prueba de la tuberculina es de 8% anual (Di Perry y col., 1989). Estas personas presentan con ms frecuencia tuberculosis extrapulmonar, la cual coexiste con la infeccin pulmonar. Un estudio realizado en 20 ciudades de Estados Unidos revel que una media de 10.4% (intervalo de 0 a 61%) de los pacientes con tuberculosis eran VIH-seropositivos (Ellner y col., 1993). En estos pacientes el diagnstico es difcil y se logra tardamente, porque su reactividad frente al PPD (por sus siglas en ingls purified protein derivative) puede verse afectada debido a la sinergia entre los virus y el diagnstico radiolgico puede mostrar solamente patrones de infiltracin difusos (Kramer y col., 1990), fcilmente confundibles con neumona por Pneumocystis carinii (Ellner y col., 1993). Sin embargo, con el tratamiento adecuado, la tasa de curacin parece ser tan alta para los infectados con el VIH, como para los pacientes que son seronegativos a este virus (Small y Van Embden, 1991).

1.3 Multirresistencia de Mycobacterium tuberculosis

El incremento en el nmero de casos de tuberculosis se ha acompaado de un

aumento en el nmero de individuos infectados por M. tuberculosis resistentes a los medicamentos tradicionalmente utilizados (antifmicos). La tasa de mortalidad producida por estos microorganismos multirresistentes podra oscilar entre el 40 y 60%, y en individuos VIH positivos podra alcanzar hasta el 80% (Bloom y McKinney, 1999).

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

En este trabajo nos proponemos como objetivo actualizar al lector sobre la importancia del estudio de M. tuberculosis, as como la revisin de algunos aspectos relacionados con la biologa del microorganismo, el diagnstico y el tratamiento de la tuberculosis.

3. PANORAMA ACTUAL DE LA TUBERCULOSIS EN MXICO

En Mxico, de acuerdo con la reforma del Sector Salud en 1995, la situacin epidemiolgica de la tuberculosis es un problema prioritario que debe enfrentarse con un programa nacional con carcter de urgente, de acuerdo con los lineamientos a nivel mundial de la Organizacin Mundial de la Salud. En 1998 los casos notificados hasta la semana 50 fueron 17,184 de los cuales, el 83% eran de localizacin pulmonar, el 0.8% menngea y el 16% de otras formas. Las entidades con mayor tasa de morbilidad de tuberculosis pulmonar fueron Guerrero, Tamaulipas y Nuevo Len, y 17 estados presentaron tasas mayores al promedio nacional que es de 15.1 por 100,000 habitantes. Tomando

como base estos datos, se puede considerar que a pesar de conocer el agente causal de la tuberculosis desde 1882 y disponer de frmacos antituberculosos altamente eficaces y de un programa de control de la tuberculosis, este padecimiento constituye un problema de salud pblica serio (Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiolgica, 1999).

4. CLASIFICACIN DE LAS MICOBACTERIAS

La clasificacin actual de las micobacterias incluye las caractersticas patognicas del microorganismo y del cuadro clnico que produce, as como las relaciones genticas entre las micobacterias, agrupando a estos microorganismos en grupos y complejos: i) Grupo de las micobacterias no cultivables o muy difcilmente cultivables, productoras de lesiones drmicas y nerviosas (M. leprae y M. lepraemurium). ii) Complejo M. tuberculosis, formado por los bacilos productores de la tuberculosis humana y animal (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum y M. microti). iii) Grupo MOTT ( del ingls mycobacteria other than tuberculosis), constituido por micobacterias diferentes a la de la tuberculosis y en la literatura aparecen frecuentemente denominadas como atpicas, annimas o inclasificadas. Comprende una amplia variedad de microorganismos, algunos de ellos subagrupados en complejos, e incluye patgenos saprfitos y patgenos oportunistas. Dentro de este grupo destaca el

complejo M. avium-intracellulare-scrofulaceum, responsable de infecciones diseminadas en personas y animales. El complejo tuberculosis incluye 5 especies: M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG (Bacilo Calmette-Gurin), M. microti y M. africanum, productoras de la tuberculosis de los mamferos. Esta divisin en especies sigue un criterio epidemiolgico, ya que los componentes de este grupo de microorganismos pueden considerarse variantes de M. tuberculosis. Es probable que puedan encontrarse ms tipos que hayan evolucionado en determinadas reas geogrficas o en hospederos particulares (Collins y Grange, 1983). Todos los miembros del complejo M. tuberculosis forman una especie nica, ya que comparten una homologa de su DNA entre el 85 y el 100% (Grosskinsky y col., 1989) y presentan varias regiones de su genoma totalmente conservadas (Frothinham y col., 1994). La separacin en especies ha sido cuestionada por varios investigadores basndose, adems de la homologa del DNA (Baess, 1979), en la taxonoma numrica utilizando 88 caractersticas diferentes (David y col., 1978) y en la inmunodifusin (Stanford y Grange, 1974). La tipificacin de DNA (o en ingls fingerprinting) mediante anlisis de restriccin enzimtica e hibridacin con sondas, capaz de diferenciar entre cepas, no permite discriminar entre M. tuberculosis y M. bovis (Van Soolingen y col., 1994). La amplificacin mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) del fragmento del gen mtp40 (Parra y col., 1991), supuestamente especfico de M. tuberculosis, ha sido descrita para la diferenciacin de esta especie del resto de los componentes del complejo (Sinclair y col., 1995). Sin embargo, este fragmento se ha detectado tambin en M. africanum y en las micobacterias pertenecientes a este complejo

aisladas de pinnpedos (Libana y col., 1996).

4.1 Biologa celular de las micobacterias

Las micobacterias son bacilos aerobios que no se tien fcilmente con los colorantes de Gram. Estos microorganismos son bacilos cido alcohol resistentes, y son los nicos organismos, junto con Nocardia asteroides, en poseer esta caracterstica. Este comportamiento tintorial se debe a la capacidad de estos microorganismos en retener la carbolfuchina aun bajo tratamientos tan drsticos como el uso de una solucin de etanol-HCl. La capacidad retentiva del colorante se debe a la alta concentracin de lpidos (60%) en la pared celular del bacilo, aunado a la presencia del cido miclico tambin en su pared celular (Fig. 1). M. tuberculosis es un aerobio obligado. Su pared celular contiene varios lpidos complejos: los cidos miclicos, que son cidos grasos de cadenas largas (de 78 a 90 tomos de carbono), los fosftidos y la llamada cera D. Esta ltima, combinada con ciertas protenas, tiene una alta antigenicidad que es utilizada para la prueba drmica del PPD (Protein Purified Derivative). M. tuberculosis es ligeramente resistente a cidos y bases, as como a la deshidratacin. Estas caractersticas son sumamente importantes en la propagacin de este pernicioso patgeno.

4.2 Biologa molecular de Mycobacterium tuberculosis

La secuencia completa del genoma de M. tuberculosis (cepa H37Rv), recientemente publicada, ha hecho posible el entendimiento de su estructura y organizacin (Cole y col., 1998). Su genoma comprende 4,411,529 pares de bases y tiene un contenido de G+C del 65.6% (Clifton y Schroeder, 2000). Se sabe que el genoma de esta bacteria tiene 3924 marcos de lectura abiertos (ORFs) que codifican para protenas. Se le han atribuido funciones precisas a aproximadamente el 40% de las protenas predichas, y se encontr alguna informacin o similitud para otro 44%. El 16% restante corresponde a protenas no conocidas y puede ser que tengan relacin con funciones micobacteriales especficas. El complejo M. tuberculosis carece de variabilidad gentica entre cepas y los cambios de nucletidos son muy raros (Sreevatsan y col., 1997 ) por lo que se piensa que es inusualmente inerte o que es relativamente joven en trminos evolutivos. Se encontraron 50 genes que codifican para molculas de RNA funcional, las cuales son producidas por un opern nico para RNA ribosomal (opern rrn). El RNA 10S est involucrado en la degradacin de protenas codificadas por RNAs mensajeros anormales, el RNA componente de la RNAsa P, y en los 45 RNAs de transferencia (tRNAs) (Cole y col., 1998). Adems, se detectaron 16 copias de la secuencia de insercin IS6110 y 6 copias del elemento IS1081 (Phillipp y col., 1996). Tambin se detectaron 32 diferentes secuencias de insercin no descritas anteriormente. La mayora de las secuencias de insercin en M. tuberculosis H37Rv estn localizadas en regiones no codificantes o intergnicas, a menudo cerca de genes de tRNA. Se ha sugerido la existencia de puntos calientes para insercin.

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Tambin se han detectado dos profagos en la secuencia del genoma, lo cual explica el que esta bacteria muestre persistentes niveles bajos de lisis en cultivo (Cole y col., 1998). Se sabe que este patgeno tiene amplias capacidades metablicas, y contiene genes importantes tanto para el crecimiento aerobio como anaerobio. Una significativa proporcin del genoma est dedicado al metabolismo de lpidos de la pared celular (Kaplan y col., 1998). Adems, se han identificado 13 factores sigma que regulan la expresin gentica a nivel de inicio de la transcripcin y se han predicho ms de 100 protenas regulatorias. M. tuberculosis presenta resistencia natural a muchos antibiticos, la cual es debida, principalmente, a la envoltura celular altamente hidrofbica. Adems, muchos determinantes de resistencia estn codificados en el genoma, por lo que la resistencia tambin puede deberse a la adquisicin de mutaciones, ya sea en el sitio blanco de la droga, en genes involucrados en la toma de sta o en genes que regulan el metabolismo del medicamento por la micobacteria.

4.3 Caractersticas clnicas de las micobacterias y su interaccin con el sistema inmunolgico

La lesin primaria se establece tras la interaccin entre el patgeno y el husped. Una nica partcula de aerosol de menos de 5 m, conteniendo de uno a tres bacilos, puede ser suficiente para iniciar el desarrollo de la lesin primaria (OGrady y Riley, 1963). El microorganismo alcanza los alvolos pulmonares,

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donde es ingerido por un macrfago alveolar en cuyo citoplasma se multiplica lentamente. En la primera exposicin al microorganismo, la resistencia a la destruccin tras la fagocitosis permite la multiplicacin intra y extracelular (Quinn y col., 1994). Una inflamacin granulomatosa similar se inicia tambin por hongos, parsitos y partculas inertes como asbestos y slica, componentes que los lisosomas de los macrfagos no pueden degradar. El macrfago muere y los bacilos liberados son ingeridos por otros macrfagos. Los monocitos sanguneos son tambin atrados al punto de infeccin (Kaufmann, 1990) e ingieren, pero no eliminan al agente etiolgico. Ms monocitos sanguneos acuden a la lesin, se transforman en macrfagos y refagocitan los restos. Segn contina este proceso, la lesin aumenta. Los tubrculos comienzan como pequeos agregados de macrfagos y neutrfilos (Cheville, 1988) y son visibles a los ocho das (Blood y Radostits, 1989). Los microorganismos escapan y las clulas infectadas del hospedero, que alcanzan los ganglios linfticos, continan una proliferacin similar. Esta lesin primaria, junto con la lesin en el ganglio linftico regional se denomina complejo primario de Ranke o de Ghon-Ranke (Biberstein y Zee, 1990). La apariencia de los macrfagos se modifica al acumular el agente causal y los restos del tejido, transformndose en las clulas epiteloides (Cheville, 1988). stas tienen un gran ncleo vesicular ovalado y citoplasma (Biberstein y Zee, 1990). El estmulo de la fusin y de estas transformaciones son las citocinas liberadas por los linfocitos que migran a los granulomas (Cheville, 1988) y a los lpidos (Jubb y Kennedy, 1980). Aunque las bacterias no son destruidas, el granuloma es un medio efectivo para localizar la infeccin y permitir el desarrollo de otros mecanismos

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inmunolgicos e inflamatorios para destruir al bacilo (Cheville, 1988). Despus de la primera a la cuarta semana, la respuesta inmune se modifica por el establecimiento de la inmunidad mediada por clulas, por una reaccin ante un cuerpo extrao, a la formacin de un granuloma especfico (Biberstein y Zee, 1990). Los macrfagos activados con un mayor nmero de fagosomas, lisosomas y mitocondrias, adquieren la capacidad de destruir las bacterias (Quinn y col., 1994). La activacin de los macrfagos est mediada por las linfocinas IL-2 e IFN liberadas por los linfocitos T, tambin responsables de la necrosis caseosa (Christopher y col., 1997) debida a la liberacin de enzimas lisosomales y al factor de necrosis tisular (Saliers y Whitt, 1994). A medida que los granulomas se expanden por la llegada de monocitos inmunes, se hacen ms complejos. Estas clulas fagocitan macrfagos muertos y bacterias viables y son a su vez destruidas. El centro de los tubrculos jvenes est formado por una mezcla de clulas epiteloides gigantes, rodeado de una zona de linfocitos, clulas plasmticas y monocitos. En la periferia de la lesin aparecen fibroblastos para desarrollar una cpsula fibrosa perifrica que finalmente rodea la lesin. Conforme la lesin progresa, la zona central se necrosa por efecto de la reaccin de hipersensibilidad. La apariencia de estas lesiones es la de ndulos blancos o amarillentos, de consistencia firme. Una vez establecida la inmunidad mediada por clulas (IMC) la infeccin sigue un curso diferente. Los linfocitos T especficos y los macrfagos activados previenen la diseminacin de la tuberculosis; sin embargo, su actuacin causa

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una extensa destruccin tisular, caracterstica de la tuberculosis progresiva. Aunque la diseminacin linftica est limitada, la propagacin de la infeccin ocurre por expansin en las zonas contiguas o a travs de la erosin de los bronquios o de vasos sanguneos (Quinn y col., 1994). La licuefaccin y la formacin de cavernas se debe a la accin de enzimas lticas sobre protenas y lpidos (Thoen y Himes, 1986). El proceso de licuefaccin permite a los bacilos presentes en pequeo nmero en la masa caseosa, multiplicarse hasta alcanzar cantidades exuberantes. Esta lesin es mucho ms contagiosa que el estado de necrosis caseosa (Saliers y Whitt, 1994). La calcificacin es caracterstica de algunas especies animales: en otras se observa rara vez y, cuando ocurre, suele ser en lesiones situadas en el tejido linfocitario (Jubb y Kennedy, 1980). Esta inmunidad, aunque protectora, no consigue eliminar todos los microorganismos de los tejidos. Algunas lesiones, rodeadas de tejido conectivo bien organizado, pueden contener bacilos viables durante aos, por lo que es posible la reactivacin de la infeccin (Thoen y Himes, 1986).

4.4 Factores de virulencia en las micobacterias

Algunos de los constituyentes de los microorganismos del complejo M. tuberculosis pueden ser capaces de alterar las funciones de los macrfagos, reduciendo su capacidad efectora, por medio de estrategias diferentes (Krahenbuhl, 1995): i) modificacin de la fagocitosis, ii) inhibicin de la fusin fagosoma-lisosoma, iii) neutralizacin de la acidificacin del fagosoma, iv) resistencia al contenido lisosomal, v) tolerancia de la produccin de reactivos

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intermediarios del oxgeno y reactivos intermediarios del nitrgeno, vi) modificacin de la secrecin de citocinas (principalmente TNF) y vii) activacin a un estado micobactericida. Los factores de virulencia de las micobacterias que actan a nivel de los macrfagos inducen cambios que favorecen la supervivencia intracelular del patgeno, alterando la capacidad microbicida de los macrfagos o su colaboracin con el resto del sistema inmune en la IMC. A pesar de que M. tuberculosis no produce ni exotoxinas ni endotoxinas, provoca lesiones tisulares. Su envoltura celular contiene una alta proporcin de lpidos, responsables de la hidrofobicidad, de su lento crecimiento y de la resistencia a los cidos y a los desinfectantes, de los cuales algunos han sido aislados, caracterizados y evaluados para determinar su importancia en la patogenicidad. Varios de los componentes de la pared celular de M. tuberculosis estn implicados en la respuesta del hospedero: i) los lpidos, dentro de los cuales se encuentran principalmente los triacilglicridos y algunas ceras llamadas dimicocerosatos de tiocerol, ii) las tuberculoprotenas, como las glicotransferasas y transpeptidasas, y las involucradas en el transporte de nutrientes a la clula y eliminacin de desechos celulares (Jubb y Kennedy, 1980), iii) sulftidos, principalmente el SL-1 metilo (Goren, 1976). El factor cuerda (o cord factor) (Bloch, 1950) es el responsable del crecimiento, formando agregados de las micobacterias del complejo M. tuberculosis, con aspecto de cuerda o serpentina (Middlebrook y col., 1977). Est formado por 6,6 dimicolato de trealosa (TDM) (Noll y col., 1956). La

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lipoarabinomanana (LAM), la cual es el miembro ms antignico de la familia de lipopolisacridos fosforilados (LPS) (Hunter y Breanan, 1990), los cuales son productos formados por dimicoceratos de tiocerol constitudos por varias cadenas de cido micocersico multimetilados y que estn esterificados a largas cadenas de tioceroles (Noll y col., 1956). De acuerdo al tipo de glicosilacin que presentan, hay cuatro clases: A, B, C y D, que se han aislado de diferentes especies de Mycobacterium (Anderson, 1941).

5. DETECCIN E IDENTIFICACIN DE MICOBACTERIAS

5.1 Microscopa directa

La microscopa directa es el mtodo ms rpido, sencillo y econmico para la deteccin presuntiva de bacilos cido-alcohol resistentes en las muestras clnicas (Hubner y col., 1993). Puede realizarse por tincin del frotis de la muestra por el mtodo de Ziehl-Neelsen, o con un fluorocromo como la auramina (Truant y col., 1962) o la naranja de acridina. Las posibilidades de encontrar bacilos en los frotis aumenta conforme lo hace su concentracin en la muestra. Para que puedan ser detectadas es necesario que haya ms de 104 micobacterias en cada mililitro de muestra (Yeager y col., 1976). El nmero de micobacterias en las muestras depende de varios factores: la especie involucrada, el estadio de la enfermedad y del husped. Empleando la tincin de Ziehl-Neelsen, los bacilos aparecen como bastoncillos ligeramente curvados, de color rosa sobre un fondo azul. Cuando deben leerse muchos exmenes resulta ms conveniente la microscopa

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fluorescente, utilizando auramina fenicada como colorante. Esto permite examinar un nmero de campos 15 veces mayor que la tincin de Ziehl-Neelsen. La forma como se reporta la baciloscopa vara en diferentes pases. Sin embargo, hay tendencia a seguir las recomendaciones de la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS), que informa las baciloscopas en cruces de acuerdo con la cantidad de bacilos presentes. La baciloscopa ha sido adoptada por la mayora de los pases en desarrollo como el procedimiento diagnstico de eleccin en los enfermos sintomticos, porque indudablemente es el mtodo ms simple, rpido, especfico y barato. Sin embargo, su sensibilidad es muy baja (70%), ya que como regla deben existir entre 5,000 a 10,000 bacilos por ml de expectoracin para que tengan un 50% de posibilidades de ser detectados al microscopio. Slo cuando el nmero de bacilos alcanza a ms de 100,000 por ml de expectoracin, podemos esperar que las baciloscopas sean consistentemente positivas (Farga, 1992).

5.2 Cultivo

El nico diagnstico seguro de tuberculosis depende de la demostracin del bacilo de Koch en cultivo. El cultivo es una tcnica que tiene mayor sensibilidad (90%), ya que basta que existan ms de 10 bacilos/ml en muestras digeridas y concentradas, para que ste sea positivo. El cultivo de micobacterias puede realizarse a partir de diversas muestras; aspirados de cavidades, biopsias, esputos, orina, leche, etc. La licuefaccin con cloruro de benzalconio y la digestin por homogenizacin del moco o el tejido, liberan las micobacterias y facilita la

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accin de las sustancias descontaminantes que eliminan microorganismos de crecimiento rpido, que pueden enmascarar el crecimiento de las micobacterias (Farga, 1992). Debido a que las micobacterias estn presentes en bajo nmero en las muestras, stas deben ser concentradas por centrifugacin para facilitar su deteccin. Los medios de cultivo utilizados pueden tener base de agar, como los de Middlebrook (Cohn y col., 1986) y el B83 (Cousins y col., 1989) o de huevo, como Stonebrink (Stonebrink, 1958), Lwestein-Jensen (Lwestein, 1931; Jensen, 1932) y Coletsos (Coletsos,1960). Estos ltimos contienen verde de malaquita (aproximadamente 0.025 g/100 ml) como agente selectivo, as mismo algunos medios incorporan antibiticos (lincomicina, cicloheximida y cido nalidxico) para hacerlos ms selectivos. Algunas micobacterias como M. tuberculosis y M. avium requieren glicerol para su crecimiento. Sin embargo, este compuesto inhibe el crecimiento de M. bovis, lo cual se ve estimulado por un 0.4% de piruvato sdico. Las temperaturas ptimas de crecimiento estn generalmente comprendidas entre 30 y 40C y es necesaria una atmsfera del 5 al 10% de CO2 . Su crecimiento es muy lento, con tiempos de generacin de 24 horas (David, 1973), por lo que las colonias necesitan hasta 8 semanas para ser visibles. En los medios de cultivo slidos, como el Lowestein-Jensen, que es uno de los ms usados en la clnica, las colonias aparecen como rugosas, no pigmentadas, formando cordones.

5.3 Sistema de deteccin radiomtrica

El cultivo radiomtrico BACTEC (Becton Dickinson) utiliza un medio de cultivo lquido (7H12) que contiene cido palmtico marcado con 14C (Middlebrook y col.,

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1977). Este cido graso es metabolizado por las micobacterias y convertido en [14C]CO2. La conversin est calibrada para medir el ndice de crecimiento de M. tuberculosis (Cummings y col., 1995). El medio puede incluir PANTA (polimixina B, anfotericina B, cido nalidxico, trimetoprim y azocilina) para controlar la contaminacin (Siddiqui y Hawangho, 1986). Estos cultivos pueden emplearse para la identificacin preliminar de micobacterias, obteniendo el diagnstico en una media de 17 das (Stager y col., 1991), y para el estudio de la sensibilidad a los antibiticos. Este sistema detecta la presencia de micobacterias en una muestra clnica, reduciendo la obtencin del cultivo de 7-16 das (Anagyros y col., 1990) y de 14-24 das las muestras que aparecieron negativas en la tincin, aproximadamente en la mitad de tiempo que los medios slidos. En general, las tasas de cultivo en BACTEC son superiores (Kirihara y col., 1985). Sin embargo, el riesgo de contaminacin es mayor (5-10%) que con los medios convencionales (1-4%) (Anagyros y col., 1990). Sus principales inconvenientes son el costo elevado y la utilizacin de un istopo radioactivo de vida media larga.

5.4 Identificacin bioqumica

Aunque las micobacterias comparten rutas metablicas comunes a otros miembros bacterianos, para su identificacin bioqumica se emplean pruebas bioqumicas desarrolladas especficamente para los miembros de este gnero, adaptadas a su lento metabolismo. Las pruebas ms frecuentemente utilizadas

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son: i) el crecimiento a distintas temperaturas (25, 30, 33, 37, 42 y 45C), ii) pigmentacin por la produccin de niacina (Runyon y col., 1959), iii) reduccin de nitratos (Virtanen, 1960), iv) tolerancia del NaCl al 5% (Kubica, 1973), v) desaminacin de la pirazinamida (Wayne y col., 1976), vi) produccin de ureasa, vii) crecimiento en agar MacConkey sin cristal violeta, viii) inhibicin por la hidracida del cido tiofeno-2-carboxlico (o TCH) 2 g/ml (Vestal y Kubica, 1967), ix) inhibicin por el cido paraminobenzoico (500 mg/ml), x) utilizacin de la arilsulfatasa (Kubica y Vestal, 1961), xi) hidrlisis de Tween 80 (Wayne y col., 1964) y xii) produccin de catalasa.

5.5 Tcnicas qumicas

Las micobacterias son microorganismos muy complejos, capaces de sintetizar substancias qumicas altamente especficas. Entre estos compuestos destacan una serie de cidos grasos como los cidos miclicos y derivados estericos, algunos de los cuales slo se encuentran en micobacterias en la naturaleza.

Debido a que la tcnica de cromatografa de lquidos de alta resolucin o HPLC (del ingls High Performance Liquid Cromatography), es capaz de detectar cantidades infinitesimales de determinadas sustancias qumicas en los lquidos orgnicos, es uno de los mtodos que se utilizan en el diagnstico de la tuberculosis (Farga, 1992).

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5.6 Tcnicas inmunolgicas

En la tuberculosis se pueden identificar y cuantificar en el suero del enfermo, los anticuerpos dirigidos contra antgenos (Ags) especficos de las micobacterias. Tambin existen ensayos para la deteccin directa de los Ags micobacterianos en el suero o en las secreciones de los pacientes, con el empleo de Acs cada vez ms especficos (Farga, 1992).

5.7 Deteccin usando sondas de cidos nucleicos

Este mtodo se basa en la reasociacin de DNA heterlogo u homlogo desnaturalizado. Las sondas comerciales para micobacterias, Accuprobe System (Gen-Probe Inc. San Diego, CA) utilizan oligonucletidos sintticos monocatenarios marcados con un producto quimioluminiscente y complementarios al RNA ribosomal presente en aproximadamente 104 copias en cada clula. Las sondas actuales utilizan un ster de acridino (quimioluminiscente) que produce luz en presencia de perxido y un pH elevado (Goto y col., 1991). Hay sondas disponibles para M. tuberculosis y M. avium-intracellulare. Este mtodo se aplica para la identificacin de cultivos obteniendo una sensibilidad entre 95.2% (Lebrun y col., 1992) y 98% (Musial y col., 1987), ahorrando entre tres y ocho semanas del tiempo de diagnstico en los cultivos normales. Sin embargo, carece de la sensibilidad necesaria para la deteccin directa de micobacterias a partir de muestras clnicas, ya que requiere la presencia de 3 x 107 bacilos en cada

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prueba (Pao y col., 1988).

5.8 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (por sus siglas en ingls polymerase chain reaction) (Saiki y col., 1985; Mullis y Faloona, 1987) permite la amplificacin de secuencias especficas de DNA, generando millones de copias a partir de una sola molcula de DNA. Es un mtodo simple que provee alta sensibilidad en la deteccin, al menos semejante a la del cultivo, combinada con la especificidad de las sondas. La PCR puede aplicarse en una amplia variedad de muestras (cultivos puros, tejidos, lquidos biolgicos) para el diagnstico de la tuberculosis. La utilizacin de la PCR asociada al anlisis de restriccin enzimtica, permite la separacin de micobacterias (Lungu y col., 1994), as como la identificacin de especies mediante la diferenciacin de los patrones generados por restriccin enzimtica con Hae III y BstEII, de los fragmentos amplificados del gen que codifica la protena de choque trmico de 65 kDa. Esta tcnica ha sido aplicada a micobacterias de lento (Vaneechoutte y col., 1993) y rpido crecimiento (Steingrube y col.,1995). La PCR se ha utilizado para el diagnstico rpido de patgenos de crecimiento lento, as como para la identificacin de cultivos y deteccin de microorganismos del complejo M. tuberculosis a partir de muestras humanas (Buck y col., 1992).

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5.9 Anlisis de polimorfismos genticos (RFLP)

El anlisis del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) del DNA de M. tuberculosis con la secuencia de insercin IS6110, ha permitido definir mejor la epidemiologa de la tuberculosis y el seguimiento de su ruta de transmisin, los factores de riesgo para desarrollar la enfermedad progresiva rpida, la contaminacin intralaboratorio, as como el resultado del curso del tratamiento (Van Embden y col., 1993). El anlisis por RFLP del DNA genmico, tambin llamado REA (por sus siglas en ingls restriction endonuclease analysis), ha sido utilizado con xito para tipificar aislados del complejo M. tuberculosis. Con esta tcnica se pueden diferenciar un gran nmero de tipos de M. tuberculosis y los patrones de restriccin generados son lo suficientemente estables en el tiempo y pueden relacionarse con reas geogrficas determinadas (Collins y col., 1988), lo cual permite su aplicacin en epidemiologa. En las cepas pertenecientes al complejo M. tuberculosis se han identificado cinco diferentes elementos genticos que contribuyen a la diferenciacin entre cepas y que pueden ser tiles en estudios epidemiolgicos. Dos de estos son las secuencias de insercin IS6110 o IS1081 y los otros tres son secuencias cortas repetitivas de DNA que se encuentran intercaladas en el genoma. La funcin precisa de todas estas secuencias repetitivas es an desconocida. Debido al nmero variable de copias, las cepas epidemiolgicamente no relacionadas muestran un alto grado de polimorfismos en los fragmentos de restriccin que contienen esta secuencia (Mendiola y col., 1992). Las cepas de M. tuberculosis

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generalmente presentan hasta 19 copias del elemento de insercin IS6110 en diferentes regiones de su genoma y se ha comprobado que este elemento es un excelente marcador para la diferenciacin entre las cepas de M. tuberculosis (Van Embden y col., 1992). Sin embargo, las cepas de M. tuberculosis de Asia y frica slo suelen llevar una copia de IS6110 y generalmente en un mismo lugar de su genoma (en un fragmento de restriccin de 1.9 kb obtenido por PvuII), lo cual limita su uso en la diferenciacin de las mismas. Ha sido comunicada la existencia de cepas de la India carentes de este elemento (Libana y col., 1996).

6. TRATAMIENTO

El tratamiento depende de cada microorganismo, pero en general son terapias muy largas y los antibiticos encuentran dificultades en alcanzar su objetivo, ya que estas bacterias suelen ser parsitos intracelulares y las lesiones estn encapsuladas. Las micobacterias son relativamente resistentes a la mayora de antibiticos de amplio espectro, con la excepcin de la estreptomicina y la rifampicina. El tratamiento de la tuberculosis humana implica la utilizacin de una combinacin de diferentes antibiticos dependiendo de si el paciente ha estado solamente expuesto o ha desarrollado la enfermedad y la aparicin de resistencias (Greene, 1984). La quimioprofilaxis con isoniazida durante 6 meses a 1 ao es aconsejable en caso de exposicin a la infeccin, y cuando una inmunosupresin aumenta la posibilidad de desarrollar la enfermedad activa. En los tratamientos combinados iniciados en los aos 50 se comprob que con el uso conjunto de isoniazida con

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estreptomicina y cido p-amino-saliclico, se obtena una tasa de curacin superior al 90%; sin embargo, requera un tratamiento de 24 meses. En los 60s, se observ que los pacientes que reciban quimioterapia no constituan un riesgo de contagio, el etambutol reemplaz al cido p-aminosaliclico y la duracin se redujo a 18 meses. En los 70s se utiliz la terapia de 9 meses, combinando rifampicina, isoniazida, estreptomicina y etambutol durante los dos primeros meses. Posteriormente, se comprob que la adicin de pirazinamida a la combinacin de isoniazida y rifampicina, administrada durante un periodo de 6 meses (quimioterapia de curso corto) tena una tasa de curacin superior al 90%. En los ltimos aos, la Secretara de Salud cambi el esquema de tratamiento de larga duracin al de 6 meses, con el uso de tres frmacos en presentacin integrada. Estas medidas favorecieron el ingreso al tratamiento de un nmero creciente de enfermos, pero no todos lo terminaban, lo que dio origen a tasas de curacin inferiores al 80% y, como consecuencia, presencia de casos resistentes a los frmacos primarios. Por ello, y con base en la evaluacin Nacional Interinstitucional y de organismos externos (OPS/OMS), se fij como estrategia central el tratamiento acortado estrictamente supervisado (TAES) para curar pacientes, reducir el sufrimiento, cortar la transmisin y evitar el nmero de muertes. Con esta iniciativa, se logr el ingreso al tratamiento del 100% de los casos diagnosticados, la tasa de abandono se redujo de 14% a 4% y la de curacin se increment de 65% a 86%. Este esquema de tratamiento tiene dos fases: la primera consiste en eliminar la mayor cantidad de bacilos en los fluidos. En esta etapa se administran isoniacida, rifampicina y pirazinamida durante dos meses. La segunda etapa consiste en eliminar los bacilos intracelulares

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administrando isoniacida y rifampicina por cuatro meses. En aquellos casos en los que se presenta resistencia a las drogas de primera eleccin, se utilizan drogas de segunda lnea, las cuales presentan el inconveniente de ser menos eficaces, ms txicas y costosas. La mayor parte de los quimioteraputicos utilizados para tratar infecciones por M. tuberculosis y M. bovis (isoniazida, etambutol, pirazinamida, cido paminosaliclico) son bastantes especficos para estos microorganismos y muestran escasa accin inhibitoria frente a otras especies de micobacterias. Algunas infecciones no responden al tratamiento y deben ser eliminadas quirrgicamente (Mangura y Reichman, 1994).

7. ESTADO ACTUAL DE LA INVESTIGACIN EN Mycobacterium tuberculosis

Uno de los principales objetivos en el combate a los microorganismos patgenos ha sido el desarrollo de vacunas eficaces que ayuden a la proteccin del ser humano. Desde la introduccin de la BCG (Bacilo Calmette Gurin) en la dcada de los 50s, que protegi contra la tuberculosis con mucho xito, ha sido escaso el desarrollo de nuevas investigaciones para la obtencin de una vacuna ms eficaz. La BCG es efectiva contra las formas ms severas de tuberculosis durante la niez y en tuberculosis extrapulmonar en adultos. Sin embargo, su efecto protector depende de otros factores, incluyendo algunos del husped y los propios del microorganismo. En la actualidad se han utilizado como antgenos, algunos productos de secrecin micobacterianos, algunas protenas o el DNA del

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microorganismo. En las primeras se han encontrado una gran cantidad de modificaciones postraduccionales, que hablan de la complejidad del microorganismo y de su singularidad entre las bacterias. Tambin se ha mencionado a las protenas de choque trmico de Mycobacterium como inmungenos. Sin embargo, la susceptibilidad del husped juega un papel muy importante ya que, aparte de la desnutricin, los polimorfismos asociados al gen Nram-1, el cual es un receptor de la vitamina D, se han relacionado con la susceptibilidad diferencial a este microorganismo. As mismo, los lpidos micobacterianos han sido estudiados como posibles inmungenos. Aunado a los mtodos de deteccin antes mencionados, el desarrollo de los microarreglos de DNA o de protenas llamados microchips permitir, en un futuro cercano, el desarrollo de nuevas drogas antifmicas y nuevos mtodos de deteccin, que permitirn un avance real en el combate a este microorganismo (Barry y Schroeder, 2000).

8. CONCLUSIONES

La tuberculosis es una enfermedad cuya incidencia haba sido abatida. Sin embargo, por diversas circunstancias, sta empieza a repuntar de nuevo, convirtindose en un problema de salud pblica mundial. Se han realizado muchos esfuerzos, tanto para conocer la biologa del microorganismo, como para tratar de combatirlo, que han sido insuficientes para tener xito en ambas iniciativas, por lo que es necesaria la inversin de mayor nmero de recursos humanos y materiales para evitar un problema mayor.

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ABREVIATURAS

BACTEC BCG IL IFN IMC LAM LPS PCR PPD RFLP PANTA TAES TNF VIH

Cultivo radiomtrico Becton Dickinson. Bacilo calmette-Gurin. Interleucina. Interfern. Inmunidad mediada por clulas. Lipoarabinomanana. Lipopolisacridos fosforilados. Reaccin en cadena de la polimerasa. Purified protein derivative. Fragmentos de restriccin del cido. Polimixina B, anfotericina B, cido nalidxico, trimetoprim y azolicina. Tratamiento acortado estrictamente supervisado. Factor de necrosis tumoral. Virus de la inmunodeficiencia humana

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PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Composicin de la pared celular de las micobacterias. EL 60% de la pared est formada por lpidos, de los cuales, el ms importante es el cido miclico, por su relacina con la patogenicidad y las propiedades tintoriales especiales de estos microorganismos.

Fig. 2. Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) de cepas de M. tuberculosis, utilizando el elemento de insercin IS6110. (Tomado de Heersman y col., 1998).

Captulo 5 Es posible obtener una vacuna contra la amibiasis humana? Esther Orozco1, Guillermina Garca-Rivera1, Mario A. Rodrguez1, Francisco Sols2, Carolina Martnez3, Ramn Ocadiz3 y Juan Pedro Luna Arias4
1

Departamento de Patologa Experimental, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del

Instituto Politcnico Nacional (CINVESTAV-IPN). Mxico, D.F.

2

Facultad de Medicina, Universidad Autnoma de Chihuahua. Chihuahua, Chih. Programa de Biomedicina Molecular, Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa

Avanzadas del Instituto Politcnico Nacional (CICATA-IPN). Mxico, D.F.

4

Departamento de Biomedicina Molecular, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del

Instituto Politcnico Nacional (CINVESTAV-IPN). Mxico, D.F.

Email: esther@mail.cinvestav.mx PALABRAS CLAVE: Entamoeba histolytica, vacunas, adhesina de 112 kDa, EhADH112,
EhCP112, mutantes en adhesin.

NDICE 1. Introduccin 1.1 La amibiasis humana y su epidemiologa 2. Objetivos del captulo 3. El quiste: la fase infectiva de Entamoeba histolytica 4. El trofozoto es la fase invasiva de E. histolytica 5. Las fases del mecanismo de agresin de los trofozotos de E. histoltyica 5.1 La adhesin de la amiba a la clula blanco

2 5.2 La participacin de toxinas y proteasas en el mecanismo de agresin de la amiba 5.3 Papel de la fagocitosis en el mecanismo de agresin de la amiba 5.4 La digestin de las clulas fagocitadas por la amiba 6. Estrategias en el diseo de vacunas contra la amiba 6.1 Generacin de mutantes de E. histolytica deficientes en adhesin y en virulencia 6.2 Genes y polipptidos que forman la adhesina de 112 kDa 7. CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA

1. INTRODUCCIN

1.1 La amibiasis humana y su epidemiologa

La amibiasis es la infeccin del ser humano causada por Entamoeba histolytica, un protozoario capaz de invadir prcticamente cualquier tejido del organismo. Aunque se encuentra con mayor frecuencia en los pases pobres, E. histolytica es cosmopolita y se ha detectado en todo el mundo. Infecta 500 millones de personas (Walsh, 1986). Aproximadamente el 10% de los individuos infectados presenta disentera y el 10% de stos desarrollan absceso heptico amibiano. Tiene el segundo lugar en el mundo como causa de mortalidad debida a enfermedades parasitarias, slo la malaria produce un mayor nmero de muertes (WHO, 1997). Cada ao mueren alrededor de 100,000 personas por causa de la amibiasis. Las

3 enfermedades infecciosas producidas por protozoarios, al igual que la mayora de las producidas por bacterias y virus, son enfermedades propias de la pobreza. Un gran nmero de ellas han sido prcticamente erradicadas de los pases con niveles de vida ms altos, pero persisten en pases como el nuestro, en los que, las condiciones sanitarias no son las ms adecuadas. Entre estas enfermedades se encuentran, adems de la amibiasis y la malaria, la tuberculosis, el clera, la tifoidea, entre otras. El sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se presenta cada vez ms en los pases pobres, con menor nivel de educacin y desarrollo. Para evitar estas infecciones y erradicarlas en forma definitiva, es necesario establecer medidas de prevencin, las cuales radican en hbitos de higiene aparentemente simples, como lavarse las manos despus de ir al bao y antes de tocar los alimentos, lavar las frutas y verduras con agua limpia y evitar comer alimentos que pudieran estar contaminados. Un aspecto fundamental en la lucha contra las enfermedades parasitarias es lograr una educacin en salud que les permita a todos los habitantes de un pas conocer la forma de evitar adquirir y propagar las infecciones. Desafortunadamente existen grandes ncleos de poblacin que carecen de agua potable y de drenaje y su nivel de educacin es muy bajo, lo que dificulta la prctica de estos hbitos de salud. Es suficiente que unos cuantos individuos sean portadores de los parsito para que las infecciones se diseminen, convirtindose en enfermedades endmicas, con eventuales brotes epidmicos. Mxico se encuentra entre los pases que tiene un menor gasto de salud por habitante en Amrica Latina. Por otra parte, las campaas de educacin para la salud han sido hasta ahora pocas y poco efectivas. El nivel de educacin de la poblacin apenas excede los seis aos y existen ncleos de poblacin con

4 analfabetismo hasta del 7%. Enfermedades como la malaria y la amibiasis siguen siendo problemas de salud en Mxico. La investigacin sobre los protozoarios ha sido fundamental para entender la biologa de estos microorganismos y desarrollar formas efectivas para combatirlos. Sin embargo, a pesar de los millones de dlares invertidos en el mundo para desarrollar vacunas en contra de protozoarios, no existe todava ninguna que haya mostrado utilidad real. Los protozoarios son microorganismos que todava guardan muchos secretos sobre su biologa y eso ha complicado el diseo de vacunas eficientes contra ellos. La malaria es uno de los ejemplos ms dramticos. Existen decenas de laboratorios en el mundo estudiando a las distintas especies de Plasmodium, el agente causal de la malaria, y haciendo esfuerzos muy serios para obtener una vacuna contra este protozoario. Los resultados han proporcionado una gran cantidad de conocimiento sobre el microorganismo, pero la vacuna no se ve cerca todava. La amiba, como otros protozoarios, presenta gran variabilidad fenotpica y genotpica. Los factores y mecanismos que determinan esta variabilidad han sido muy poco estudiados. Al no conocerse a fondo la biologa del parsito, ni saber los mecanismos que participan en la virulencia de los trofozotos, ni tener claro cmo es que los trofozotos cambian su fenotipo e incluso su genotipo, es difcil bloquear su accin por medio de la elaboracin de una vacuna eficiente contra esta parasitosis. Por tanto, el control de la amibiasis se realiza todava por medio del tratamiento con diferentes frmacos. Esto conlleva la amenaza del surgimiento de lneas de E. histolytica resistentes a las drogas, las cuales, como ha sido demostrado, presentan el fenotipo de multirresistencia a drogas (MDR por sus siglas en ingls: multidrug

5 resistance). Algunos grupos de investigacin propusieron hace algunos aos, que E. histolytica estaba compuesta por dos especies, una patgena y otra no patgena a la que han llamado Entamoeba dispar. Sin embargo, cada da hay evidencias nuevas que demuestran que E. histolytica es un organismo que puede expresar su virulencia o aparecer inocuo dependiendo de las condiciones del medio en que se encuentre. Todava no se ha descubierto la forma de manipular reproduciblemente la expresin de la virulencia de la amiba, aunque, al pasarla por hgado de hmsteres se recuperan trofozotos altamente virulentos que van perdiendo su agresividad a travs del tiempo de cultivo in vitro. Es por estas razones y por otras algunas otras que no discutimos en este captulo por falta de espacio, que es indispensable seguir estudiando al parsito para conocerlo a fondo y poderlo combatir eficientemente.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

Este captulo tiene como objetivo, mostrar y discutir los esfuerzos que nuestro grupo ha realizado para disear el camino hacia una vacuna contra la amibiasis. Con la advertencia de que ste es un camino largo y para llegar a la meta se requiere todava de mucho trabajo, y recursos humanos y materiales.

3. EL QUISTE: LA FASE INFECTIVA DE Entamoeba histolytica

E. histolytica debe su nombre a su gran capacidad para destruir tejidos. Este protozoario presenta dos fases principales en su ciclo de vida: el quiste y el trofozoto (Fig. 1). El quiste es una clula esfrica de 10-15 m de dimetro, con

6 cuatro ncleos y una gruesa cubierta de quitina, que lo protege de los cambios ambientales. No se adhiere al epitelio intestinal, por lo que sale con las heces fecales. Debido principalmente a su cubierta protectora, puede vivir fuera del hospedero en el medio ambiente, a veces por meses, dependiendo de las condiciones de temperatura y humedad en que encuentre. Es resistente a altas concentraciones de cloro, pero puede eliminarse por filtracin y destruirse por ebullicin, por contacto con iodo (200 ppm) y cido actico (5-10%). Cuando los quistes han salido con las heces fecales, contaminan las manos, el agua, las verduras, las frutas y los alimentos en general, hasta encontrar otro al cual infecta, por lo que es importante eliminar los quistes tanto del agua y de los alimentos contaminados, as como del intestino de los portadores y diseminadores de la enfermedad. El quiste es la fase infectiva de E. histolytica.

4. EL TROFOZOTO ES LA FASE INVASIVA DE E. histolytica

Una vez que el quiste se ingiere, la cubierta de quitina se reblandece y en el intestino delgado salen cuatro clulas que se dividen inmediatamente para producir ocho trofozotos uninucleados. Son altamente mviles y pleomrficos, miden entre 10 y 40 m y son muy fagocticos, comen bacterias, glbulos rojos, clulas epiteliales. Tienen una gran cantidad de enzimas que digieren la matriz extracelular y ayudan a abrir el camino durante la invasin del epitelio intestinal por el parsito. Poseen las molculas que participan directamente en la invasin de la amiba y la destruccin de las clulas del por el parsito. El trofozoto est ms estudiado que el quiste y el

7 reto fundamental es bloquear su accin patgena contra las clulas. El trofozoto es la fase invasiva de E. histolytica.

5. LAS FASES DEL MECANISMO DE AGRESIN DE LOS TROFOZOTOS DE E. histoltyica.

El trofozoto, clula que produce la amibiasis intestinal y extraintestinal, se aproxima a las clulas blanco y se adhiere a ellas por medio de sus molculas de superficie, las cuales encuentran otras molculas en la clula blanco con las que llevan a cabo interacciones qumicas. Posteriormente, un nmero desconocido de toxinas y de proteasas son secretadas por los trofozotos sobre las clulas blanco. Estas molculas producen dao en la clula y se inicia su proceso de destruccin. Los trofozotos emiten seudpodos para fagocitar fragmentos de las clulas daadas e inclusive clulas completas. Los fragmentos celulares son llevados al citoplasma de la amiba en vesculas denominadas fagosomas, las cuales se fusionan con los lisosomas para que las enzimas digestivas de la amiba lleven a cabo su accin sobre las clulas blanco y liberen los nutrientes que el parsito necesita. Algunos de las protenas de superficie de la amiba que formaron parte del fagosoma, son recicladas hacia la superficie del parsito.

5.1 La adhesin de la amiba a la clula blanco

Para evitar la expulsin del trofozoto del intestino humano con las heces fecales es necesario que se adhiera al epitelio intestinal. Este proceso es especfico y tiene la

8 fuerza suficiente para que el movimiento peristltico no lo desprenda y lo arrastre hacia afuera. Dado que el trofozoto es una clula muy sensible a los cambios de temperatura, humedad y presin osmtica, si este sale con las heces, muere inmediatamente en el medio ambiente. Sin embargo, si el trofozoto resiste la fuerza del flujo intestinal, podr dividirse y colonizar el intestino, para despus invadir la mucosa y en algunos casos, penetrar el epitelio. En el proceso de adhesin del trofozoto a la clula blanco, las molculas de superficie de la amiba juegan un papel fundamental. Entre los cientos de molculas que conforman la membrana plasmtica, hay unas cuantas que participan especficamente en la adhesin de los trofozotos. Estas molculas se conocen con el nombre genrico de adhesinas. Identificar y caracterizar a las adhesinas permitir estudiar uno de los primeros pasos en la citopatogenicidad de la amiba. Pero no slo eso, sino que al conocer su estructura se podrn bloquear y por tanto, evitar la adhesin a la clula blanco, lo que traer como consecuencia la inhibicin de la destruccin celular por parte de la amiba. Una adhesina celular debe tener varias caractersticas: i) En primer lugar, debe de estar en la superficie para poder contactar a la clula blanco. ii) Adems, debe ser capaz de unirse a molculas de la superficie de la clula blanco. iii) Los anticuerpos dirigidos en contra de ella debern inhibir la adhesin del trofozoto a la clula blanco; si estos anticuerpos son monoclonales, la inhibicin de la funcin de la adhesina ser ms especfica. Sin embargo, puede suceder que el anticuerpo reconozca molculas en la vecindad de la supuesta adhesina e interfiera con ella por razones de tamao. En este caso, los resultados de la inhibicin de la adhesin por los anticuerpos en contra de la supuesta adhesina, nos estarn dando pistas

9 equivocadas. iv) La adhesina purificada deber pegarse a la clula blanco, evitando su contacto con el trofozoto, lo que traer como consecuencia la inhibicin de la adhesin. iv) Las mutantes amibianas incapaces de adherirse a la clula blanco debern presentar alteraciones en la adhesina, o en ocasiones podrn mostrar ausencia de la molcula. v) Al revertir la alteracin en las mutantes, la adhesina ser funcional y por tanto, se deber reestablecer la adhesin. La tecnologa del DNA recombinante permite probar la funcin de la molcula candidato a ser adhesina, la cual puede ser sintetizada por organismos heterlogos, como bacterias y levaduras. Tambin pueden sintetizarse adhesinas con una serie de alteraciones en su secuencia de nucletidos, lo que dar lugar a molculas no funcionales. Por su funcin, las adhesinas participan en uno de los primeros eventos de la agresin de la amiba, por tanto, son molculas que deben tomarse en cuenta en el diseo de vacunas.

5.2 La participacin de toxinas y proteasas en el mecanismo de agresin de la amiba

Durante el proceso de invasin, los trofozotos se abren paso por los tejidos. Esto lo realizan daando a las clulas y digiriendo la matriz extracelular. Se han detectado varias molculas que pudieran participar en el dao producido a la clula. La que llama ms la atencin es una protena amibiana, pequea, llamada amebaporo, que se inserta en la membrana de la clula blanco y le produce agujeros (Lynch y col., 1982). Han sido propuestas otras molculas de la amiba con actividades txicas para la clula blanco, pero no se han identificado ms all de su actividad

10 (Lundbland y col., 1985; Udezulu y Leitch, 1987). Para pasar a travs de la matriz extracelular, la amiba se vale de colagenasas (Moz y col., 1982) y otras proteasas. Entre estas ltimas, las ms importantes son las llamadas cistena proteinasas, que se caracterizan porque el grupo sulfhidrilo de la cistena est involucrado en su actividad cataltica. En la amiba se han descubierto ya siete diferentes cistena-proteasas (Bruchhaus y Tanich, 1996; Garca-Rivera y col, 1999). Estas enzimas participan en procesos celulares importantes, se encuentran en todas las clulas y por tanto, pudieran no estar relacionados con la virulencia del parsito. Sin embargo, si son secretadas, son potentes disolventes de la matriz extracelular y producen dao a las clulas con las cuales entran en contacto.

5.3 Papel de la fagocitosis en el mecanismo de agresin de la amiba

La fagocitosis es un proceso eminentemente nutricional por parte de la amiba. Sin embargo, es tambin uno de los eventos importantes en el mecanismo de agresin de este parsito. En la fagocitosis de clulas epiteliales y de glbulos rojos participan molculas especficas de la amiba: las llamadas adhesinas. Tambin estn involucradas molculas de la clula blanco: los receptores. Ambos tipos de molculas hacen contacto ntimo antes de la ingestin de la clula por la amiba. Se ha observado en mltiples casos que la amiba ingiere principalmente clulas que previamente han sufrido algn dao, presentan una gran burbuja en su membrana y alteraciones en el citoplasma, debidas probablemente a cambios de osmolaridad por el dao en la membrana. Una vez que el trofozoto se une a la clula blanco, emite prolongaciones citoplsmicas llamadas seudpodos, por medio de las cuales

11 introduce la clula a su citoplasma. En este proceso intervienen activamente el citoesqueleto, la actina que se polimeriza y forma microfilamentos por debajo de la membrana y alrededor de todo canal fagoctico (Bailey y col., 1985). Estn presentes tambin la miosina (Voigt y col, 1999) y otras molculas citoplsmicas y de la parte interna de la membrana plasmtica (Vargas y col., 1996; Ghosh y Samuelson, 1997).

5.4 La digestin de las clulas fagocitadas por la amiba

La clula blanco o fragmentos de ella ingeridas por la amiba, se encuentran en vacuolas llamadas fagocticas. Estas vacuolas llevan en su interior las adhesinas por medio de las cuales el trofozoto hizo el primer contacto con la clula blanco. Las vacuolas fagocticas se fusionan en el citoplasma con los lisosomas que estn cargados de enzimas que actan sobre el material ingerido para digerirlo. Cuando la digestin se concluye, las vacuolas, las mismas u otras derivadas de las fagocticas (no se sabe), regresan a la membrana plasmtica, se fusionan con ella y dan salida (exocitan) a los productos que no utiliza la amiba despus de la digestin. Las vacuolas exocticas al fusionarse con la membrana plasmtica, dejan hacia el exterior las adhesinas, reciclando as las molculas de superficie. Poco se sabe del proceso de digestin y de las moleculas amibianas que participan en este proceso.

6. ESTRATEGIAS EN EL DISEO DE VACUNAS CONTRA LA AMIBA

Hemos hecho una brevsima descripcin del mecanismo de agresin de la amiba. Para disear una vacuna en contra de ella se necesita provocar una respuesta

12 inmune adecuada del hospedero en contra del parsito. Por adecuada queremos decir una respuesta capaz de neutralizar al parsito. Desde el descubrimiento de las vacunas por Jenner y despus confirmado por Pasteur, quienes lograron inmunizar contra la viruela y la rabia inoculando al microorganismo completo pero inactivado, se ha repetido el esquema de vacunacin para varios microorganismos. Para obtener una vacuna contra amibas se ha intentado utilizar tambin al parsito completo o partes del mismo para inmunizar animales. Sin embargo, esta tcnica eficiente en algunas bacterias, ya prob ser poco eficaz en la amiba (para revisin ver Meerovitch y Chadee, 1988). Por tanto requerimos conocer con la mayor profundidad posible, los mecanismos de agresin del parsito y las molculas que participan en l. Esto permitir bloquear especficamente alguna de las molculas importantes en la virulencia y detener el dao causado por la amiba. Para garantizar el xito hay que tener en cuenta la reaccin del hospedero ante el parsito. Sin embargo, se sabe muy poco sobre cmo responde el ser humano ante el ataque de los trofozotos amibianos. Se requieren por tanto, ms estudios inmunolgicos, celulares y moleculares. Aunado a lo anterior, existe otra traba difcil de superar: no hay un hospedero animal que sirva como modelo de estudio para reproducir el ciclo de E. histolytica y la infeccin por este parsito, gran limitante en los avances para obtener una vacuna. Lo que se ha hecho hasta ahora es utilizar animales de experimentacin en los cuales se provoca el absceso heptico amibiano por medio de la inoculacin de los trofozotos (Jarumilinta, 1966; Chadee y Meerovitch, 1984). Tambin se ha logrado producir lesiones en los intestinos de algunos animales (Chadee y Meerovitch, 1984). Sin embargo, no se ha logrado producir, en forma

13 reproducible, la infeccin amibiana en un animal, dndole de comer los quistes y logrando que el animal presente diarrea y absceso heptico. Dos molculas de superficie e involucradas en el contacto del trofozoto con la clula blanco han sido usadas para intentar obtener una vacuna: una lectina con afinidad por los azcares galactosa y N-acetil-galactosamina, y una molcula de superficie rica en serinas (Soong y col., 1995; Zhang y col., 1994). Hay resultados alentadores con ambas, pero la vacuna no se vislumbra todava. Por otra parte, el papel especfico de estas molculas en el mecanismo de agresin de las amibas virulentas todava guarda muchos secretos. Sin embargo, dado que la adhesin especfica del trofozoto a la clula blanco es un paso indispensable, aunque no es suficiente, para que se produzca el mecanismo de agresin de la amiba; las adhesinas son buenos candidatos vacunales. Si la adhesin se bloquea, se inhibe la virulencia. Con base en esta premisa, desde hace ms de diez aos nuestro grupo inici la bsqueda de adhesinas amibianas bona fide, como candidatos para vacunas.

6.1 Generacin de mutantes de E. histolytica deficientes en adhesin y en virulencia

Una estrategia muy utilizada y tambin exitosa en la bsqueda de molculas relacionadas con funciones celulares especficas es la construccin de mutantes. De hecho, el inicio del estudio de la gentica de Escherichia coli se realiz usando como estrategia la generacin de mutantes de esta bacteria. La metodologa usada en bacterias puede aplicarse con xito tambin a los protozoarios. Las mutantes son

14 clulas hijas, muy parecidas a la clula que les dio origen, a la cual se le llama silvestre. Las mutantes difieren de la clulas silvestres en que son deficientes precisamente en la funcin que nos interesa estudiar. Nosotros utilizamos la estrategia de generar mutantes de E. histolytica, deficientes en adhesin y en virulencia para identificar y clonar las molculas involucradas en estas funciones. Hace ms de diez aos, mutagenizamos con etil metano sulfonato (una sustancia que produce alteraciones al azar en el DNA) a los trofozotos de la clona A, proveniente de la cepa HM1:IMSS, para generar trofozotos deficientes en adhesin. Dado que este agente alquilante produce, como se dijo, mutaciones al azar en el DNA, fue necesario disear un mtodo de seleccin que nos permitiera separar y cultivar a los trofozotos que tuvieran deficiencias para adherirse y destruir a las clulas blanco (Rodrguez y Orozco, 1986). De hecho, el proceso de seleccin en la mutagnesis qumica es la parte ms difcil de los experimentos. Equivale a encontrar entre millones de amibas mutagenizadas, las que tengan la alteracin en la funcin de adhesin. Esto es parecido a buscar una aguja en un pajar. As pues, para separar a las clulas mutagenizadas en la funcin que nos interesa, es necesario tener un imn que las atraiga. El imn es, precisamente, el mtodo de seleccin. Para construir este imn partimos del conocimiento de que la adhesin precede a la fagocitosis. Por tanto, si matamos a todas las amibas fagocticas, nos quedaremos con aquellas que no pueden fagocitar. Entre las clulas incapaces de fagocitar habr algunas que tengan alterado el citoesqueleto, otras, que sean incapaces de fusionar sus membranas y otras ms con alteraciones en protenas que participan en la fagocitosis. De stas, unas cuantas no fagocitarn porque tienen alteradas molculas de superficie que les

15 permiten adherirse a la clula blanco. Esas son las que necesitamos para nuestros estudios. Para matar a las amibas fagocticas elegimos un veneno con tres caractersticas: i) tena que ser particulado para que los trofozotos lo fagocitaran, ii) tena que ser digerible por los trofozotos para que hiciera su efecto de matarlos y iii) no debera ser soluble para evitar que se envenenaran los trofozotos que no lo fagocitaron. Elegimos bacterias crecidas en presencia de bromo-desoxiuridina, la cual se inserta en el DNA en el lugar de la timidina y lo vuelve altamente sensible a la luz ultravioleta. Los trofozotos se incubaron con estas bacterias y al digerirlas incorporaron la bromo-desoxiuridina en su propio DNA. rradiamos a los trofozotos con luz ultravioleta y los que comieron muchas bacterias sufrieron muchas rupturas en su DNA, y por tanto, murieron (Rodrguez y Orozco, 1986). Los otros trofozotos que quedaron vivos, resultaron ser deficientes en fagocitosis y algunos de ellos en adhesin. Todos fueron deficientes en destruir clulas epiteliales, es decir, en virulencia. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales, comparamos las molculas de la superficie de la cepa silvestre con las mutantes deficientes en adhesin obtenidas con la tcnica descrita. Encontramos que las mutantes carecan de una protena de superficie de 112 kDa presente en los trofozotos que s se adheran a la clula blanco y s eran virulentos (Arroyo y Orozco, 1987) (Fig. 2). La protena de 112 kDa cumple con los requisitos que debe tener una adhesina: i) est en la superficie de los trofozotos, ii) se pega a la clula blanco, iii) est alterada en mutantes deficientes en adhesin y iii) anticuerpos contra esta molcula inhiben la adhesin, la fagocitosis y la virulencia (Arroyo y Orozco, 1987; Rodrguez y col, 1989)

16 6.2 Genes y polipptidos que forman la adhesina de 112 kDa

Detectar las molculas que participan en alguna de las fases del mecanismo de agresin del trofozoto a la clula blanco, es un gran paso en el estudio de las funciones de virulencia de la amiba y desde luego, en el desarrollo de una vacuna. Para que los trofozotos permanezcan en el intestino y lo invadan, es necesario que se adhieran fuertemente a las clulas epiteliales. Si se logra evitar la adhesin, los trofozotos sern arrojados del intestino y morirn inmediatamente. Usando las mutantes y los anticuerpos monoclonales detectamos la adhesina de 112 kDa. Los anticuerpos contra ella inhiben la adhesin, la fagocitosis y la destruccin de monocapas celulares en cultivo (Fig. 3). Sin embargo, para poder realizar estudios de proteccin en un nmero grande de animales, es necesario producir la adhesina de 112 kDa en grandes cantidades. Una forma eficiente es clonar el gen en un vector adecuado. Esto es, aislarlo y pegarlo a un fragmento de DNA con un origen de replicacin, para que, en condiciones adecuadas, produzca miles de copias del gen de la adhesina. Se introduce a una bacteria que proporcione esas condiciones e idealmente exprese la protena de 112 kDa en grandes cantidades. Logramos clonar el gen y al estudiarlo descubrimos que la adhesina de 112 kDa est formada por dos protenas, codificadas por dos genes adyacentes en el DNA (Garca-Rivera y col, 1999) (Fig. 4). Una de las protenas tiene actividad de proteasa, le llamamos EhCP112. Muy probablemente, EhCP112 le sirve a la amiba para digerir los epitelios y abrirse paso en los tejidos, durante el proceso de invasin. La otra protena, llamada EhADH112, tiene capacidad de unirse a eritrocitos y a clulas epiteliales. As, la amiba pudiera

17 adherirse a la clula que va a atacar por medio de EhADH112 y llevar a cabo el proceso destructivo por medio de EhCP112. Si incubamos a la clula blanco con el polipptido recombinante EhADH112 (el que hizo la bacteria, a partir de los genes de la amiba), ste se pegar a la membrana de aquella, ocupando los sitios que el trofozoto necesita para adherirse y evitando as que la amiba se una y las destruya (Fig. 5). El otro polipptido recombinante, EhCP112, es capaz de digerir protenas (Fig. 5) (Garca-Rivera y col, 1999). Actualmente, estamos probando el efecto protector de estas molculas en animales de experimentacin.

7. CONCLUSIONES

Si los animales inmunizados con EhCP112 EhADH112 no presentaran amibiasis despus de infectarlos con amibas, tendramos buenas expectativas de candidatos para vacuna en contra de la amibiasis. Despus de esto, quedara todava mucho camino que recorrer para llegar a una vacuna para uso humano. Sin embargo, el camino estara trazado con mayor detalle y por tanto, la posibilidad de xito, sera ms alta.

BIBLIOGRAFA

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18 162:546-558. Bruchhaus, I., Jacobs, T., Leippe, M. and Tannich, E. 1996. Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar: differences in numbers and expression of cysteine proteinases genes. Mol. Microbiol. 22: 255-263. Chadee, K. and Meerovitch, E. 1984. The Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) as experimental host for Entamoeba histolytica. Am. J. Trop. Med. Hyg. 33:4754. Garca-Rivera, G., Rodrguez, M.A., Ocdiz, R., Martnez-Lpez, M.C., Arroyo, R., Gonzlez-Robles, A. and Orozco, E. 1999. Entamoeba histolytica: a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol. Microbiol. 33: 556-568. Ghosh, S.K. and Samuelson, J. 1997. Involvement of p21racA, phophoinositide 3 -kinase, and vacuolar ATPase in phagocytosis of bacteria and erythrocytes by Entamoeba histolytica: suggestive evidence for coincidental evolution of amebic invasiveness. Infect. Immun. 65:4243 -4249. Jarumilinta, R. 1966. A simple method of inducing amoebic liver abscess in hamsters. Ann. Trop. Med. Parasitol. 60:139-145. Lundbland, G., Huldt, G., Elander, M., Lind, J. and Slettergreen, K. 1981. N -acetylglucosaminidase from Entamoeba histolytica. Comp. Biochem. Physiol. 68:71-76. Lynch, E.C., Rosenberg, M.I. and Gitler, C. 1982. An ion-channel forming protein produced by Entamoeba histolytica. EMBO J. 1:801-804. Meervitch, E. and Chadee, K. 1988. In vivo models of immunity in amebiasis. En:

19 Amebiasis. Human Infection by Entamoeba histolytica. Ravdin, J.I. (ed). John Wiley & Sons, New York. Pg. 425-437. Muoz, M.L., Calderon, J., Rojkind, M. 1982. The collagenase of Entamoeba histolytica. J. Exp. Med. 155:42-51. Rodrguez, M.A. and Orozco, E. 1986. Isolation and characterization of phagocytosis and virulence deficient mutants of Entamoeba histolytica. J. Infect. Dis. 154: 27-32. Rodrguez, M.A., Hernndez, F., Santos, L., Valdez, A. and Orozco, E. 1989. Entamoeba histolytica: molecules involved in the target cell-parasite relationship. Mol. Biochem. Parasitol. 37: 87-99. Soong, C.G., Kain, K.C., Abd-Alla, M., Jackson, T.F.G.H. and Ravdin, J.I. 1995. A recombinant cysteine-rich section of the Entamoeba histolytica galactoseinhibitable lectin is efficacious as a subunit vaccine in the gerbil model of amebic liver abscess. J. Infect. Dis. 171:645-651. Udezulu, I.A. and Leitch, G.J.1987. A membrane-associated neuraminidase in Entamoeba histolytica trophozoites. Infect. Immun. 55:181-186. Vargas, M.A., Sansonetti, P. and Guillen, N. 1996. Identification and cellular localization of the actin-binding protein ABP-120 from Entamoeba histolytica. Mol. Microbiol. 22:849-857. Voigt, H,, Olivo, J.C., Sansonetti, P. and Guillen, N. 1999. Myosin IB from Entamoeba histolytica is involved in phagocytosis of human erythrocytes. J. Cell Sci. 112:1191-1201. Walsh, J.A. 1986. Problems in recognition and diagnosis of amebiasis: estimation of the global magnitude of morbidity and mortality. Rev. Infect. Dis. 8:228-238.

20 WHO. 1997. Amoebiasis. WHO Weekly Epidemiol. Record 72: 97-100. Zhang, T., Cieslak, P.R. and Stanley, S.L. 1994. Protection of gerbils from amebic liver abscess by immunization with a recombinant Entamoeba histolytica antigen. Infect. Immun. 62:1166-1170.

PIES DE FIGURAS

Fig. 1. El quiste entra al ser humano por la boca con los alimentos o agua contaminada por heces fecales de individuos con amibiasis. En el intestino, el quiste se deshace de su cubierta protectora y da origen a 8 trofozotos, muy mviles, capaces de adherirse al epitelio intestinal, por medio de molculas de superficie. Puede traspasar el epitelio e invadir el hgado y otros tejidos.

Fig. 2. Las mutantes amibianas deficientes en adhesin presentan alteracin en una protena de superficie involucrada en la adhesin a su clula blanco ( ). Las protenas de las amibas silvestres (A) y mutantes (23) se separaron por electroforesis (1), se transfirieron a papel de nitrocelulosa y mediante el uso de anticuerpos monoclonales (2) se determin que esta protena con funcin de adhesina tiene un peso molecular de 112 kDa.

Fig. 3. La adhesina se 112 kDa juega un papel fundamental en la adhesin. Anticuerpos contra la adhesina de 112 kDa ( de 24 kDa se pusieron ( ) o contra una protena de superficie

) en contacto con los trofozotos y despus se analiz su

21 efecto sobre diversas actividades. Solamente los anticuerpos contra la adhesina de 112 kDa inhibieron significativamente la adhesin (Adh), la fagocitosis (Fag) y la destruccin de monocapas celulares en cultivo por los trofozotos vivos (CP) o por sus extractos (CT). La adhesin, la fagocitosis y la destruccin de clulas en ausencia de anticuerpos se tom como 100%.

Fig. 4. La adhesina de 112 kDa est codificada por dos genes adyacentes separados por una regin de DNA no codificante de 188 pares de bases. El primer gen codifica para una cistena proteasa (EhCP112) y el segundo codifica para una protena que se adhiere a la clula blanco (EhADH112).

Fig. 5. Las protenas recombinantes EhADH112 y EHCP112 presentan actividades de adhesina y de proteasa, respectivamente. Los genes de la adhesina de 112 kDa fueron clonados y expresados en bacterias Escherichia coli (A). La protena recombinante EhADH112 se puso en contacto con eritrocitos y al unirse a estos inhibi la adhesin ( amibianos. ( , ) y la fagocitosis ( ) por los trofozotos

) Controles utilizando eritrocitos que estuvieron en contacto con

albmina. (B) La protena recombinante EhCP112 se someti a electroforesis en geles de sustrato y despus de activarla, la protena fue capaz de degradar la gelatina presente en los geles. Carril 1, protenas de bacterias sin la protena recombinante, carril 2, protenas de bacterias con la protena recombinante. La flecha indica la zona de degradacin de la gelatina que corresponde al tamao de la protena recombinante.

Captulo 6 Mecanismos de patognesis de la Trichomonosis: La enfermedad de transmisin sexual no viral nmero uno causada por Trichomonas vaginalis John F. Alderete1, Marie-Laure Crouch1 y Rossana Arroyo2
1

Department of Microbiology, University of Texas Health Science Center (UTHSC) San Antonio Texas,

EUA.
2

Departamento de Patologa Experimental, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto

Politcnico Nacional (CINVESTAV-IPN), Mxico, D. F.

PALABRAS CLAVE: Trichomonas vaginalis, trichomonosis, mecanismos de patognesis, hierro, cistena proteinasas, variacin fenotpica, relacin huspedparsito, adhesinas. NDICE 1. Introduccin. 1.1 El parasitismo exitoso de la mucosa vaginal por Trichomonas vaginalis. 1.2 La enfermedad: Clnica y problemtica de la trichomonosis. 2. Objetivos del captulo. 3. El parsito: Trichomonas vaginalis. 3.1.1. Adquisicin de nutrientes. 3.1.2. Evasin de la respuesta inmune del husped. 3.1.3. Patologa del husped, adherencia y citotoxicidad dependiente de contacto. 3.1.4. Regulacin de la actividad de las cistena proteinasas.

4. El virus de RNA de doble cadena (dsRNA) en la relacin husped-parsito. 5. La unin de T. vaginalis a las macromolculas del husped, a las clulas y a las membranas basales, contribuyen a una infeccin crnica exitosa. 6. Conclusiones. Agradecimientos. Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

1.1 El parasitismo exitoso de la mucosa vaginal por Trichomonas vaginalis

Trichomonas vaginalis es el protozoario responsable de la trichomonosis (anteriormente trichomoniasis), la enfermedad de transmisin sexual (ETS) no viral nmero uno a nivel mundial (CDC, 1996). La capacidad de T. vaginalis para sobrevivir en el ambiente adverso del husped en constante cambio, ilustra la naturaleza altamente evolucionada y sofisticada de este microorganismo patgeno de las mucosas urogenitales del humano. Por mucho tiempo se consider a esta infeccin de transmisin sexual no tena consecuencias graves para la salud femenina. Sin embargo, actualmente se han encontrado repercusiones serias en la salud de las mujeres. La infeccin en la mujer no es auto-limitada, por lo que se requiere de un diagnstico y tratamiento adecuados para eliminarla. Los hallazgos de la ltima dcada muestran la maravillosa complejidad de la relacin husped-parsito en la trichomonosis. Lo cual se evidencia por los

mecanismos que T. vaginalis utiliza para sobreponerse a las barreras naturales de defensa del husped. Estos parsitos son capaces de contrarrestar la fuerza del flujo vaginal y evitar ser arrastrados por este, mediante su unin a la mucina. Sus mecanismos de citoadherencia y las interacciones del parsito con las superficies de los tejidos del husped, apenas se empiezan a comprender. La adquisicin de nutrientes es indispensable para la sobrevivencia de este protozoario que carece de algunas vas biosintticas para molculas esenciales como cidos grasos, colesterol y cidos nuclicos. Adems, la respuesta inmune del husped es neutralizada por numerosas enzimas proteolticas y por la variacin fenotpica que poseen las tricomonas infectadas por el virus de RNA de doble cadena (dsRNA) (Alderete y col., 1986a, Khoshnan y Alderete, 1994; Provenzano y Alderete, 1995). Este virus regula la expresin de la protena de superficie de 270 kDa (p270), un antgeno muy inmunognico, ya que la mayora de los pacientes con trichomonosis se han encontrado anticuerpos anti-p270. Sin embargo, los parsitos que se obtienen de dichos pacientes no expresan este antgeno en su superficie. Lo que sugiere que el parsito usa este mecanismo para evadir la respuesta inmune del husped. Igualmente fascinante es la capacidad de la tricomona para responder a factores ambientales como la concentracin de hierro o zinc en el medio, o como el pH y el potencial redox en que se encuentra. Dependiendo de los factores mencionados, el parsito expresa algunas de las molculas que participan en su virulencia.

1.2 La enfermedad: Clnicas y problemtica de la trichomonosis

En Estados Unidos la vaginitis causada por T. vaginalis (trichomonosis) se ha reportado hasta en un 75% en mujeres sexo-servidoras, en un 50% en prisioneras y en el 25% en mujeres que atienden a la consulta ginecolgica, familiar o a las clnicas de ETS (Wolner-Hanssen y col., 1989; Shuter y col., 1998; Klausner y col., 1999). Entre mujeres embarazadas el porcentaje de portadoras asintomticas es del 10 al 15% (Wolner-Hanssen y col., 1989). Una evaluacin conservadora indica que en este ao, ms de cinco millones de mujeres se diagnosticarn con trichomonosis este ao tan slo en los Estados Unidos (Cates, 1999). En Mxico, la incidencia de trichomonosis aument de 102,807 casos en 1996, a 170,376 en 1999 (Fig. 1). En el 2000 se observ una reduccin ligera en el nmero de casos de trichomonosis reportados en el pas (a 162,530 casos), siendo Veracruz (23,664 casos), el Estado de Mxico (11,345), Puebla (10,606), Chiapas (8,983) y Michoacn (8,140 casos) los estados que ocuparon los cinco primeros lugares. Al igual que en otros pases, la trichomonosis ocupa el primer lugar entre las ETS en Mxico (SSA, 1997-2000). Curiosamente, cuatro de los cinco lugares con mayor incidencia de trichomonosis presentan el mayor nmero de casos de cncer crvico-uterino en el pas. A nivel mundial, el nmero de casos de trichomonosis por ao se aproxima a los 300 millones (CDC, 1996). La presencia de trichomonosis provoca la disminucin o la eliminacin de Lactobacilli, un microorganismo que forma parte de la flora normal bacteriana de la vagina (Klebanoff y col., 1991), y es el responsable de mantener el pH cido vaginal. Estas bacterias pueden producir perxido de hidrgeno, el cual tiene un efecto protector contra algunas ETS. Se considera que existe un gran nmero de trichomonosis no diagnosticados, ya que se carece de un mtodo de diagnstico

rpido, sensible y seguro de uso generalizado, acoplado con la confiabilidad del cultivo para la deteccin del organismo en la poblacin. Los datos aqu presentados muestran que el grado de morbilidad entre las mujeres de todos los niveles sociales es alto. Adase a esto una complicacin mayor, el aumento en el nmero de casos de trichomonosis resistentes al tratamiento (Sobel y col., 1999). Los factores que predisponen a la infeccin por T. vaginalis incluyen la edad del inicio de las relaciones sexuales, el nmero de parejas sexuales, la historia de infecciones gonocccicas y el hbito de fumar (Coth y col., 1991; 1998). El humo del tabaco es un txico del tracto reproductor que puede desencadenar cambios en el tracto urogenital de la mujer predisponindola a la infeccin por T. vaginalis, ya que podra alterar las condiciones reductoras de la vagina. Estudios epidemiolgicos realizados en EU han mostrado una mayor predisposicin a la trichomonosis en mujeres afroamericanas, por lo que en algn momento se propuso que este grupo pudiera presentar una predisposicin mayor a esta enfermedad que el grupo caucsico. Las mujeres afroamericanas al parecer no estn ms predispuestas a la trichomonosis, sino que su mayor incidencia puede deberse al comportamiento sexual particular, lo cual explicara el aumento en la incidencia de esta enfermedad y de otras ETS en este grupo (Aral, 1999; Laumann y Youm, 1999). Las consecuencias de la infeccin por T. vaginalis en la salud de las pacientes con trichomonosis pueden ser graves por las siguientes razones: i) Las mujeres infectadas presentan un mayor riesgo para la infeccin por VIH (Wasserheit, 1992; Laga y col., 1993). Aunque se desconocen las causas, es posible que la respuesta inflamatoria a T. vaginalis reclute a las clulas inmunes en las secreciones vaginales, predisponiendo a la mujer a la infeccin durante el contacto con el semen que contiene

el VIH. ii) Mujeres embarazadas con trichomonosis pueden tener problemas al trmino del embarazo, los cuales se pueden manifestar por la ruptura prematura de las membranas, el parto prematuro, y el nacimiento de infantes de bajo peso (Cotch y col., 1997; Sutton y col., 1999). iii) Adems, se ha establecido una relacin entre la infeccin por T. vaginalis y el cncer crvico-uterino (Zhang y Begg, 1994; Zhang y col., 1995; Zhang, 1996). El epitelio vaginal es el sitio principal de la infeccin. Las trichomonas se adhieren primeramente a la mucina y despus disuelven el moco (Lehker y Sweeney, 1999), lo cual hace posible que los parsitos puedan penetrar el tapn del moco cervical hacia el tracto urogenital superior. Esto podra explicar el dolor abdominal agudo y el posible desarrollo de linfoadenopatas y salpingitis entre algunas mujeres que sufren la infeccin (Krieger, 1981). Hay una gran variabilidad en la sintomatologa de las mujeres infectadas con T. vaginalis. Algunas mujeres, aunque presenten cambios en la fisiologa del tracto genitourinario, no los consideran graves como para buscar ayuda mdica, debido en parte, a la falta de informacin adecuada respecto a la biologa del aparato reproductor femenino. Otras mujeres presentan sntomas exacerbados, como descargas vaginales malolientes, dolor abdominal agudo, irritacin y malestar (Wolner-Hanssen, 1989). Adems, la erosin del epitelio cervical que rodea al canal vaginal por la inflamacin, puede originar a la colpitis macularis o crvix de fresa, un signo tpico de la trichomonosis (Krieger, 1981). La sintomatologa por la trichomonosis es distinta a la de las vaginitis ocasionadas por infecciones por levaduras o bacterias. Los hombres tambin se pueden infectar durante el contacto sexual con una pareja con trichomonosis (Gardner y col., 1986; Krieger, 1995; Joyner y col., 1999). A

pesar de que en general, la trichomonosis en el hombre es una infeccin auto-limitada, reportes recientes muestran la existencia de un nmero importante de uretritis no gonocccica y no clamidial, causada por T. vaginalis (Weston y Nicol, 1963; Gardner y col., 1986; Krieger y col., 1992; 1993a; 1993b; Krieger, 1995). Los hombres que son VIH-positivos y presentan sntomas de trichomonosis, tienen un mayor nmero de partculas virales de VIH en el semen (Hobbs y col., 1999). Esto desde luego, constituye un factor de riesgo en la transmisin del VIH (adems de la de T. vaginalis) para las parejas durante el contacto sexual.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

i) Conocer los mecanismos de patognesis de la trichomonosis, una enfermedad de transmisin sexual. ii) Conocer diversos factores de virulencia de T. vaginalis que participan en la relacin husped-parsito.

3. EL PARSITO: Trichomonas vaginalis

Trichomonas vaginalis es un protozoario flagelado, eucarionte primitivo responsable de la trichomonosis. En el humano se han detectado varias especies de Trichomonas (T. vaginalis, T. tenax, Pentatrichomonas hominis, Trichomitus fecalis), de las cuales T. vaginalis es la nica patgena. T. tenax se encuentra en la cavidad oral, generalmente como comensal y slo en caso de compromiso inmunolgico, se puede asociar con

Streptococcus mutants y causar gingivitis. P. hominis y T. fecalis son comensales del intestino. Por microscopa electrnica de barrido se observa que el parsito es pleomrfico, presenta una forma ovoide o de pera en las secreciones o medios de cultivo lquido, pero tiene la capacidad de cambiar de forma, a ameboide (Fig. 2), cuando entra en contacto con ciertos tipos celulares o medios semislidos. La forma ameboide se observa en las biopsias de vaginas infectadas. Este microorganismo primitivo presenta organelos citoplsmicos particulares, como una membrana ondulante y cuatro flagelos. Tiene tambin una serie de especializaciones del citoesqueleto formadas por microtbulos que lo distinguen de otros protozoarios: la costa, la pelta, el axostilo. Este ltimo atraviesa el parsito longitudinalmente y termina en una espcula, como si fuera la columna vertebral del microorganismo. A su lado se asocian los grnulos paraxostilares, entre los que se encuentran los hidrogenosomas. Por microscopa electrnica de transmisin (Fig. 3) se puede observar un ncleo ovoide nico, un aparato de Golgi bien diferenciado, en contraste con Entamoeba o con Giardia, a las cuales no se les ha encontrado dicha estructura citoplsmica; un retculo endoplsmico liso y rugoso, los ribosomas, la acumulacin de grnulos de glucgeno, algunas vesculas pinocticas y vacuolas alimenticias. Sin embargo, las tricomonas carecen de mitocondrias. Este microorganismo presenta a su vez, un organelo propio de este gnero, los hidrogenosomas (Fig. 3), que substituyen a las mitocondrias, aunque son menos eficientes para la produccin de energa y que genera, entre los productos de desecho, hidrgeno molecular, al cual deben su nombre. Este protozoario fagocita bacterias,

eritrocitos y fragmentos celulares, los cuales pueden ser observados en las vacuolas fagocticas o pinocticas (Rendcn-Maldonado y col., 1998). La tricomona se caracteriza adems, por tener una alta dependencia de hierro para un metabolismo adecuado. Mientras las bacterias requieren de 0.2 M, las trichomonas necesitan hasta 250 M (Gorrell, 1985). El microorganismo tiene un buen sistema de captura de hierro, utiliza como fuentes de hierro molculas receptoras o de almacn de hierro presentes en las secreciones vaginales como el citocromo c, la ferritina, la lactoferrina, la hemoglobina, e incluso eritrocitos y clulas HeLa. Cuando se elimina el hierro del medio del cultivo, el parsito no crece o lo hace muy lentamente.

3.1 Sobrevivencia del parsito y el papel de las cistena proteinasas

3.1.1. Adquisicin de nutrientes

A pesar de ser uno de los protistas ms primitivos, carente de enzimas de las vas biosintticas involucradas en la sntesis de macromolculas esenciales, T. vaginalis ha desarrollado mecanismos mediados por receptores para unir protenas del husped (Peterson y Alderete, 1982; 1983), algunas de las cuales le son relevantes para la adquisicin de nutrientes. En estos mecanismos, las cistena proteinasas juegan un papel importante como veremos posteriormente. Estas proteinasas participan tambin en la virulencia del parsito y en su mecanismo de evasin de la respuesta inmune del husped. T. vaginalis es capaz de crecer y reproducirse en uno de los sitios ms cambiantes del cuerpo humano, la regin urogenital/vaginal de la mujer. Este hecho sugiere la idea de la adaptacin coevolutiva entre el parsito y el humano.

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T. vaginalis obtiene los lpidos, como el colesterol y los cidos grasos, por medio de la unin de la apoprotena C3 al receptor para lipoprotenas (Peterson y Alderete, 1984b) y a travs de la hemaglutinacin, seguida por la hemlisis de los eritrocitos por las cistena proteinasas de T. vaginalis (Dailey y col., 1990; Lehker y col., 1990). El parsito incorpora los lpidos obtenidos de estas fuentes directamente en sus membranas (Lehker y col., 1990; Peterson y Alderete, 1984c). Este proceso de acumulacin de lpidos es especfico, dado que los lpidos de la membrana de las clulas hospederas no son utilizados ni para el crecimiento ni para la multiplicacin de las trichomonas (Peterson y Alderete, 1984c). Entre otras molculas que ocasionan dao a la clula husped, las cistena proteinasas del parsito participan en la obtencin de nuclesidos, nucletidos, glucgeno y otras fuentes de carbono y energa, as como diversas molculas que contienen o unen hierro. Las cistena proteinasas degradan las clulas y la matriz extracelular para que el parsito pueda obtener sus nutrientes, indispensables para su mantenimiento en el microambiente del tracto urogenital de la mujer, el cual es escaso en nutrientes (Muller, 1990). Los aislados del T. vaginalis crecidos in vitro requieren de muy altas concentraciones de hierro (250 M) para un crecimiento y multiplicacin ptimos. En estas condiciones, el tiempo de generacin es entre 4 y 6 horas (Gorrel, 1985). Sin embargo, estudios sobre el crecimiento del parsito en cultivo continuo, usando un quimiostato, han demostrado que los parsitos pueden sobrevivir a tiempos de generacin de hasta 150 horas, bajo condiciones controladas de pH, temperatura y nutrientes (Lehker y Alderete, 1990). El parsito posee receptores para protenas unidoras de hierro (lactoferrina y ferritina) y para protenas que contienen hierro (citocromos y hemoglobina) (Peterson y

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Alderete, 1984a; Lehker y Alderete, 1990). La adquisicin de hierro a partir de la lactoferrina es la ms estudiada y hay evidencias convincentes de que esta protena es una fuente de hierro in vivo (Peterson y Alderete, 1984a; Lehker y Alderete, 1990). Este sistema de adquisicin de nutrientes de T. vaginalis ilustra, de manera elegante, cmo el microorganismo se sobrepone a la inmunidad impuesta por el microambiente limitado en nutrientes de la vagina. 3.1.2. Evasin de la respuesta inmune del husped.

A pesar de que se han detectado anticuerpos en el suero de la mayora de los pacientes con trichomonosis en contra de numerosos inmungenos del parsito (Alderete y col., 1987; 1991a; 1991b; Bozner y col., 1992), slo en algunas pacientes se encontraron anticuerpos en lavados vaginales (Alderete y col., 1991a). En los lavados vaginales se han encontrado numerosas cistena proteinasas y anticuerpos en contra de algunas de ellas (Alderete y col., 1991c; Bozner y col., 1992). Dichos anticuerpos son degradados rpidamente por las proteinasas presentes en las secreciones vaginales (Provenzano y Alderete, 1995). Debido a estos hallazgos, es importante estudiar la naturaleza de la respuesta humoral vaginal mediada por anticuerpos en contra de T. vaginalis. Hay qu indicar adems, que las proteinasas per se son capaces de causar dao a las clulas del husped (epiteliales y posiblemente tambin a las clulas inmunes) ya que participan en la citotoxicidad (Alderete y Peralman, 1984; Krieger y col., 1985; Arroyo y Alderete, 1989; Alvarez-Snchez y col., 2000). De ah que la eliminacin de las clulas inmunes presentes en la vagina por las proteinasas de T. vaginalis, podra resultar en una prdida de proteccin a la infeccin y en un aumento en la capacidad de reinfeccin de los individuos, sin importar que en

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infecciones previas se hubieran producido anticuerpos trichomonicidas, por ejemplo. Un hecho intrigante es que a pesar de que las trichomonas son rpidamente destruidas por la va alterna del complemento (Demes y col., 1988), las proteinasas sintetizadas cuando los parsitos crecen en presencia de altas concentraciones de hierro (durante la menstruacin, a travs del hierro unido a hemo o proveniente de la lactoferrina), favorecen la aparicin de parsitos resistentes al complemento (Alderete y col., 1995b). Probablemente esto explique por qu stas son capaces de degradar el componente C3 del complemento depositado en la superficie del parsito.

3.1.3. Patologa del husped, adherencia y citotoxicidad dependiente de contacto

La actividad proteoltica de las proteinasas de las tricomonas sobre muchos sustratos, sugiere su participacin en la citopatologa de los tejidos en contacto con el parsito. Por ejemplo, la erosin del epitelio cervical que bordea el canal vaginal podra resultar de la accin de las proteinasas presentes en las secreciones que baan este sitio (Alderete y col., 1991c). Como se dijo anteriormente, la remocin de la capa de clulas del epitelio crvico-vaginal, acompaada por la inflamacin durante la trichomonosis, ocasiona la colpitis macularis o crvix de fresa. La inflamacin provocada por la trichomonosis podra predisponer a las mujeres a la infeccin por el VIH (Sutton y col., 1999). Se sabe que un factor que contribuye a la infeccin por VIH, es la degradacin del inhibidor de proteasas secretado por los leucocitos (SLPI) por las proteinasas de tricomonas. Este inhibidor de proteasas es un factor que inhibe tambin la transmisin del VIH (Draper y col., 1998). Se han detectado numerosas cistena proteinasas en los lavados vaginales. Algunas de stas degradan rpidamente a la mayora de los

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componentes de las membranas basales y de la matriz extracelular (Becerril-Garca, 1998; Alvarez-Snchez y col., 2000; Mendoza-Lpez y col., 2000). Por tanto, es muy probable que las cistena proteinasas de la tricomona sean mediadoras del dao tisular. En el caso de las mujeres embarazadas infectadas con T. vaginalis, las cistena proteinasas del parsito pudieran participar en la ruptura temprana de las membranas de la placenta durante el embarazo. Esto explicara el alto nmero de partos prematuros en estas mujeres. Recientemente se identificaron dos cistena proteinasas de T. vaginalis que se unen a la superficie de clulas HeLa y del epitelio vaginal. Estas molculas de 30 y 65 kDa (CP30 y CP65, respectivamente) (Arroyo y Alderete, 1995) se relacionaron con la citoadherencia (CP30) y la citotoxicidad (CP65) del parsito a la clula hospedera. Experimentos recientes demostraron la participacin de la CP30 en la adhesin (Mendoza-Lpez y col., 2000) y de la CP65 en la citotoxicidad (Alvarez-Snchez y col., 2000). Ambas proteinasas se localizan en la superficie del parsito y se secretan tanto in vitro como in vivo. Durante la infeccin son inmunognicas en el mbito local y sistmico. En los sueros y los lavados vaginales de pacientes con trichomonosis (confirmada por cultivo) y por diagnstico clnico, se encontraron anticuerpos anti-CP30 y anti-CP65 en el suero de todas las personas infectadas con T. vaginalis. Sin embargo, slo dos de los pacientes con diagnstico clnico de trichomonosis presentaron anticuerpos contra las cistena proteinasas. Slo algunos de los lavados vaginales provenientes de pacientes infectados con T. vaginalis tuvieron anticuerpos anti-CP30 y anti-CP65, a pesar de que en todos ellos se detect la presencia de proteinasas (Fig. 4). Ambas proteinasas son capaces de degradar componentes de la matriz extracelular, fibronectina y colgena IV presentes en las membranas basales de

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los epitelios. La CP30 degrada a su vez, hemoglobina (Fig. 5) (Becerril-Garca, 1998; Alvarez-Snchez y col., 2000; Mendoza-Lpez y col., 2000). Ambas proteinasas se encuentran en las secreciones vaginales y son capaces de degradar colgena IV, uno de los componentes principales del tapn cervical durante el embarazo. Por tanto, se postula que estas dos proteinasas pudieran participar en el parto prematuro de mujeres embarazadas con trichomonosis, al contribuir en la degradacin del tapn cervical (Alvarez-Snchez y col., 2000; Mendoza-Lpez y col., 2000).

3.1.4. Regulacin de la actividad de las cistena proteinasas

Como se mencion previamente, T. vaginalis sintetiza y secreta numerosas cistena proteinasas al microambiente de la vagina durante la infeccin (Alderete y col., 1991c). Es evidente que la sntesis y la actividad de las proteinasas de la tricomona deben ser controladas por factores ambientales (hierro, zinc, pH, capacidad de xido-reduccin, etc). De otra manera, la sntesis no controlada y la activacin de tantas proteinasas podra causar un dao extenso en los tejidos. El hierro regula negativamente la sntesis y la disposicin en la superficie del parsito de las proteinasas que se unen a las clulas HeLa, y participan en la adhesin y en la citotoxicidad del parsito en el epitelio vaginal (Fattel-Facenda, 1999; Alvarez-Snchez y col., 2000; Fattel-Facenda y col., 2001). El hierro tambin modula positivamente la sntesis de las proteinasas que confieren la resistencia a la lisis por complemento (Alderete y col., 1995b). Recientemente se encontr que los agentes reductores en las secreciones vaginales modulan la actividad de las cistena proteinasas. En los experimentos de laboratorio, se usa rutinariamente 1 mM de ditiotreitol para la activacin de las cistena

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proteinasas del parsito. En cambio, in vivo, los niveles reductores se encontraron en el rango de 10 M a 40 M, concentracin que produce una activacin diferencial de algunas proteinasas. Igualmente relevante es el perxido de hidrgeno producido por la flora normal de la vagina (Lactobacilli), el cual neutraliza a las cistena proteinasas de T. vaginalis, confiriendo un efecto protector (Alderete y Provenzano, 1997). Sin embargo, la flora normal es rpidamente desplazada durante la infeccin por T. vaginalis, posiblemente por internalizacin y destruccin de la bacteria (RendnMaldonado y col., 1998). Cabe mencionar que los cambios en el pH de la vagina durante la colonizacin y desarrollo de la enfermedad, tambin pueden contribuir a la expresin y a la actividad de algunas proteinasas durante la infeccin. La CP30 slo es capaz de degradar colgena IV y fibronectina a pH entre 4.5 y 5.0 (Mendoza-Lpez y col., 2000), a diferencia de la CP65 que degrada ambos sustratos en un rango de pH que va desde 4.5 hasta 7.0 (Fig. 6) (Alvarez-Snchez y col., 2000). La activacin a diferentes pHs sugiere que dichas proteinasas participan en diferentes tiempos de la infeccin. Por ejemplo, la CP30 podra actuar en las etapas tempranas de la infeccin y la CP65 en etapas ms avanzadas, ya que el parsito ha logrado modificar el microambiente de la vagina al elevar el pH desde 4.5 hasta 7.0. Por otro lado, es interesante recalcar que la actividad de la CP65 es modulada negativamente por concentraciones de zinc similares a las encontradas en las secreciones prostticas ( 1.6 mM) de pacientes masculinos con prostatitis crnica. Los cambios en la actividad de la proteinasa afectan directamente la virulencia T. vaginalis (Alvarez-Snchez y Arroyo., 2001) al disminuir los niveles de citotoxicidad de las tricomonas (Fig. 7). Estos datos podran ayudar a entender las diferencias

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encontradas en el desarrollo y la sintomatologa de la trichomonosis entre hombres y mujeres. Por otro lado, las evidencias indican que los niveles de agentes reductores en el tracto urogenital pueden tener un efecto dramtico en esta infeccin tanto en hombres como en mujeres. Como se seal en una revisin reciente (Alderete, 1999b) al considerar varias preguntas que requieren de atencin: i) Cmo es el microambiente reductor de la vagina durante el curso del ciclo menstrual?Existe un tiempo durante el ciclo menstrual que sea ms favorable para la activacin de las proteinasas que promueven la infeccin por T. vaginalis? ii) Hay diferencias en los niveles reductores de la vagina entre grupos tnicos o entre poblaciones de ciertas regiones del pas o del mundo? iii) El hbito de fumar, podra alterar las condiciones reductoras de la vagina, favoreciendo la activacin de las cistena proteinasas del parsito, ya que el tabaco es considerado un txico del tracto genitourinario que correlaciona con un aumento en la trichomonosis (Cotch y col., 1991; 1998)? iv) Se pueden relacionar los sntomas de la trichomonosis con las cantidades y niveles de activacin de las proteinasas del parsito, influenciadas por el microambiente reductor de la vagina? v) Est la naturaleza auto-limitada de la infeccin en hombres, relacionada con la carencia de un microambiente reductor en el tracto urogenital masculino?

4. EL VIRUS DE RNA DE DOBLE CADENA (dsRNA) EN LA RELACIN HUSPEDPARSITO

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Un virus de dsRNA infecta alrededor de la mitad de los aislados de T. vaginalis. Existen datos controversiales respecto a si este virus contiene un genoma multisegmentado, formado por tres fragmentos (tripartita), o si estos mltiples segmentos de dsRNA representan diferentes virus con genomas no segmentados, de distintos tamaos. En nuestro laboratorio hemos demostrado la existencia de tres segmentos de dsRNA que no hibridan entre s. Estos experimentos se realizaron con virus purificados de numerosos aislados de T. vaginalis, frescos y crecidos en cultivo por largo tiempo, incluyendo el aislado original del cual se descubri el virus de dsRNA. Clonas individuales obtenidas en agar, derivadas de un aislado de trichomonas produjeron virus con el genoma tripartita (Khoshnan y Alderete, 1993). Otros investigadores han mostrado la presencia de uno o dos segmentos de dsRNA viral dentro de los aislados mantenidos por largo tiempo en cultivo (Tai y col., 1993; Tai e Ip, 1995). A partir de un aislado de T. vaginalis y utilizando gradientes de CsCl y centrifugaciones mltiples, se obtuvieron recientemente, dos fracciones distintas de virus de dsRNA, una pesada (1.39 g/ml) y otra ligera (1.33 g/ml) (Bessarab y col., 2000). Lo interesante es que los dsRNAs satlites asociados con trichomonas infectadas por virus (Khoshnan y Alderete, 1995), se encontraron exclusivamente en la fraccin pesada (Tai y col., 1996). La interpretacin de estos resultados sugiere la existencia de mltiples infecciones virales en las trichomonas portadoras del virus (Tai y col., 1993). Faltan todava muchos aspectos por conocer sobre la naturaleza, el ciclo y las posibles mutaciones de los virus de T. vaginalis. Sin embargo, mientras se aclaran estas discrepancias, podemos decir que las diferencias en las condiciones de cultivo y el largo tiempo en que se mantienen en reproduccin en el laboratorio, pueden producir

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alteraciones en el virus que infecta al parsito. Por otra parte, el hecho de que los segmentos de dsRNA no hibriden entre s, an en condiciones suaves (Koshnan y Alderete, 1993) es problemtico, dado que estos virus en teora, poseen protenas de la cpside y polimerasas muy semejantes. Por lo tanto, se esperara que sus secuencias nucleotdicas tuvieran regiones idnticas, las cuales daran reactividad cruzada en los ensayos de hibridacin. Por otro lado, aislados de T. vaginalis infectados por el virus dsRNA (llamados arbitrariamente aislados Tipo II) (Alderete y col., 1987) presentan variacin fenotpica (Alderete y col., 1986a). Esta propiedad se manifiesta como la expresin alternada en la membrana o en el citoplasma de un repertorio de inmungenos, incluyendo a la protena llamada p270. Los aislados Tipo I son aquellos que carecen del virus dsRNA y no sufren una variacin fenotpica. Como dato interesante podemos mencionar que la progenie obtenida a partir de una aislado parental de trichomonas infectadas con virus, perdi la capacidad de presentar variacin fenotpica al perder el virus (Alderete y col., 1987; Wang y col., 1987; Khoshnan y Alderete, 1994). Posteriormente, se ha encontrado que el hierro modula la variacin fenotpica y la fosforilacin de la p270 entre las trichomonas infectadas con virus (Alderete, 1999a). Los parsitos crecidos en condiciones de bajo hierro expresan en su superficie la p270, mientras que aquellos crecidos en concentraciones elevadas de hierro expresan la p270 en el citoplasma, la cual se encuentra fosforilada. Esto podra explicarse porque los aislados de T. vaginalis Tipo II estn constituidos por poblaciones heterogneas, las cuales pueden o no expresar la p270. La relacin entre estas poblaciones vara dependiendo de las condiciones de cultivo y de la fase de crecimiento del parsito (Alderete y col., 1986). Curiosamente, in vivo, 10% de los parsitos de Tipo II expresan en su superficie a la

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p270, lo cual puede deberse a que en el sitio de la infeccin son pocos los organismos que poseen en su interior bajas concentraciones de hierro, la mayora de ellos son ricos en hierro. Anticuerpos contra la p270 son trichomonicidas de manera independiente del complemento (Alderete y col., 1986b). Dado que todos los pacientes con trichomonosis poseen anticuerpos anti-p270 en su suero (Alderete y col., 1987), la ausencia de la p270 en la superficie del parsito le confiere una ventaja, ya que le permite evadir la respuesta inmune humoral del husped. Por otro lado, si el virus de dsRNA es no segmentado y est constituido por un solo segmento como se ha sugerido (Tai y col., 1993; Tai e Ip, 1995), pudiera ser que las protenas codificadas por el virus influyeran en la transcripcin del gen de la p270 (Khoshnan y Alderete, 1994). Si as fuera, los dsRNA satlites, participaran directamente en funciones de regulacin celular ms de lo que se ha considerado. Sin embargo, se necesitaran ms experimentos para probar esta hiptesis. Finalmente, el anlisis comparativo entre los microorganismos de aislados infectados con virus, en comparacin con los que no lo poseen, revel la presencia de hasta 40 protenas en los parsitos infectados, las cuales no fueron detectadas en los no infectados. Por el contrario, la prdida del virus de los organismos infectados mostr la expresin de un gran nmero de protenas que no se haban observado en las trichomonas infectadas con el virus (Provenzano y col., 1997). Tales alteraciones mayores en la composicin global de protenas de T. vaginalis, provocada por la presencia o ausencia del virus dsRNA, podra tener consecuencias para la expresin de factores de virulencia del parsito.

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5. LA UNIN DE T. vaginalis A LAS MACROMOLCULAS DEL HUSPED, A LAS CLULAS Y A LAS MEMBRANAS BASALES, CONTRIBUYEN A UNA INFECCIN CRNICA EXITOSA

T. vaginalis ha evolucionado de tal manera que aprovecha el reconocimiento de macromolculas, clulas y tejidos del husped para unirse a ellas y lograr un parasitismo exitoso. Este proceso complejo involucra muchos pasos, los cuales se inician con la interaccin especfica entre la superficie del parsito y la mucina del moco vaginal (Lehker y Sweeney, 1999). La unin de las trichomonas a una molcula particular del moco posiblemente representa el paso clave inicial durante la colonizacin. Despus de degradar el moco, el parsito se abre camino hacia el epitelio vaginal para adherirse a las clulas epiteliales de la vagina o VECs (por sus siglas en ingls, vaginal epitelial cells) (Alderete y Garza, 1985; Alderete y col., 1988; Arroyo y col., 1992). T. vaginalis utiliza cuatro distintas protenas de superficie (denominadas adhesinas AP65, AP51, AP33 y AP23) para adherirse a las VECs (Lehker y col., 1991; Arroyo y col., 1992). Los genes de las adhesinas AP65, AP51 y AP33 estn codificados por familias multignicas (Alderete y col., 1995a; 1998; Arroyo y col., 1995; Engbring y Alderete, 1998a; 1998b; Engbring y col., 1996; OBrien y col., 1996) y en casi todos, su expresin es regulada por hierro a nivel de transcripcin, a excepcin de uno de los miembros de la familia gnica ap51 (Alderete y col., 1998). Aislados de T. vaginalis crecidos en el laboratorio por ms de tres semanas con pases diarios y parsitos crecidos por largo tiempo en cultivo in vitro, pierden la capacidad de responder al hierro para modular la expresin de las adhesinas (Lehker y col., 1991). Por el contrario, parsitos obtenidos directamente de los exudados vaginales de pacientes infectados,

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se adhieren inmediatamente a monocapas de clulas HeLa y muchos de ellos se adhieren a clulas descamadas del epitelio vaginal (Alderete y col., 1988). Esto es consistente con los hallazgos de que la mayora de los parsitos in vivo tienen hierro acumulado en su citoplasma, proveniente de la vagina. Un rea de investigacin; relativamente nueva, ha surgido del estudio de la interaccin entre T. vaginalis y su husped. Los resultados encontrados hasta ahora, sugieren que la investigacin en este campo producir datos relevantes para entender la virulencia y la patognesis de T. vaginalis. Debido al constante recambio de las VECs maduras, as como a la erosin del epitelio observada en la colpitis macularis, las descargas vaginales podran eliminar rpidamente a los parsitos durante la infeccin. Sin embargo, la capacidad de las tricomonas de perder la capacidad adhesiva temporalmente, debido posiblemente a los bajos niveles de hierro en la vagina, le permite desplazarse hacia las clulas de las capas inferiores y permanecer en la vagina. T. vaginalis interacciona con y degrada a las glicoprotenas de la membrana basal (Lehker y col., 1990; Becerril-Garca, 1998; Crouch y Alderete, 1999; AlvarezSnchez y col., 2000). Existe una asociacin especfica mediada por receptor de las trichomonas con laminina (LM) y fibronectina (FN) (Silva Filho y col., 1988; 1998; Crouch y Alderete, 1999). Un ejemplo de la capacidad de T. vaginalis para interaccionar con superficies cubiertas con FN se ilustra en la Fig. 8, la cual muestra a los parsitos de T. vaginalis sobre cubreobjetos recubiertos con FN teidos con anticuerpos fluorescentes dirigidos contra un primer anticuerpo contra FN. Es interesante notar los pseudpodos y las extensiones de microfilamentos de los parsitos inmediatamente despus de la unin a FN. Patrones similares se observan

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en trichomonas unidas a LM (no mostrado). Estos cambios morfolgicos son semejantes a los que se han descrito para T. vaginalis cuando se encuentra adherida a VECs (Arroyo y col., 1993). An cuando slo el 40 y 50% de los parsitos se unen a LM y FN respectivamente, todos los parsitos expresan receptores de superficie para la unin a LM y FN (Crouch y Alderete, 1999). Esto se demostr usando anticuepos antiFN y anti-LM. La expresin de estos receptores es constitutiva (Fig. 9), a diferencia de la regulacin por hierro de las adhesinas del parsito (Lehker y col., 1991). Es importante notar, sin embargo, que mientras los niveles de unin a las superficies cubiertas no se alteraron a las diferentes concentraciones de hierro utilizadas para crecer a las trichomonas, datos preliminares (observaciones no publicadas) indican una participacin del hierro en la regulacin de la cantidad de este elemento unido a la superficie del parsito. Adems, de que el antisuero contra las cuatro adhesinas no inhibe la unin de las trichomonas a la LM y FN (Crouch y Alderete, 1999). Estos datos muestran que las molculas y los mecanismos que el parsito utiliza para interaccionar con la mucina y en la citoadherencia, son distintos a los involucrados en el reconocimiento y unin de T. vaginalis a LM y FN. Sin embargo, resultados preliminares sugieren que la concentracin de hierro en el medio influye sobre el nmero de receptores y la afinidad de los parsitos por la FN. El posible receptor para la LM parece ser una glicoprotena, mientras que el propuesto para la FN es una protena no glicosilada (Crouch y Alderete, 1999). La diseccin a nivel molecular de las molculas y los mecanismos que participan en las asociaciones del parsito a la FN y a la LM contribuirn a mejorar el conocimiento de la infeccin por T. vaginalis.

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6. CONCLUSIONES

T. vaginalis ha evolucionado hasta el punto de ser capaz de sobrevivir en el ambiente en constante cambio de la mucosa vaginal, aprovechando al mximo procesos mltiples, como lo mencionado en este captulo, que le permitan un parasitismo exitoso del husped. Las trichomonas son capaces de unir protenas del husped en su superficie a travs de los receptores correspondientes. Dichas asociaciones son importantes para complementar los requerimientos nutricionales del microorganismo, el cual es deficiente en la sntesis de macromolculas esenciales para vivir. Las numerosas cistena proteinasas, algunas de las cuales son sintetizadas bajo condiciones ambientales precisas, participan en la adquisicin de nutrientes, en la citoadherencia, en la evasin de la respuesta inmune del husped y en la citotoxicidad. La relacin husped-parsito se complica an ms por el hecho de que un virus de dsRNA, acompaado de dsRNA satlites de tamao pequeo, infectan aproximadamente a la mitad de los aislados de T. vaginalis. La infeccin por este virus le confiere al parsito la propiedad de variacin fenotpica del antgeno de alto peso molecular llamado p270 y posiblemente de un grupo de inmungenos de alto peso molecular. La capacidad de colonizar al husped se ilustra por el proceso complejo que involucra la unin a la mucina, el reconocimiento, la citoadherencia y la unin y degradacin de componentes de la membrana basal de los epitelios. Las molculas y los mecanismos involucrados en estos eventos claves, esenciales para el parasitismo del husped, por ejemplo, la unin a mucina, la citoadherencia y las asociaciones con FN y LM, son distintos. Por ltimo, la capacidad de este protozoario para responder a seales ambientales, principalmente al hierro el cual regula la expresin de genes de

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virulencia, representa una caracterstica propia de microorganismos patgenos de mucosas muy sofisticada.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a los numerosos estudiantes y auxiliares de investigacin de ambos laboratorios, quienes contribuyeron en gran parte al conocimiento de las bases de la virulencia y los mecanismos de patognesis de este microorganismo de transmisin sexual. El trabajo de John F. Alderete estuvo apoyado por numerosos donativos otorgados por el Servicio de Salud Pblica (PHS) de EUA a lo largo de 20 aos y actualmente, por los donativos AI 43940 y AI 45429. Los miembros del laboratorio estuvieron apoyados en parte por el donativo de enseanza de la PHS AI 22380. Rossana Arroyo estuvo apoyada por los donativos del CONACYT 0579P-N y 25572-N; y de la CEGEPI del IPN 980366, mientras que sus estudiantes estuvieron apoyados por becas-crdito del CONACYT y por becas institucionales del IPN.

ABREVIATURAS

ETS VECs LM FN

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PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Incidencia de la trichomonosis en Mxico. En esta grfica se presenta el nmero de casos de trichomonosis totales reportados anualmente en el Boletn del Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiolgica de la Secretara de Salud de Mxico (SSA), de 1996 a 1999.

Fig. 2. Microscopa electrnica de barrido de los cambios en la morfologa de T. vaginalis. (A) T. vaginalis de morfologa piriforme, se observan los flagelos (f), la membrana ondulante (mo) y el axostilo (ax). (B) T. vaginalis de morfologa ameboide adherida a clulas vaginales (v): se observan varios pseudpodos (ps) y filopodios (fp), los flagelos (f) y la membrana ondulante (mo).

Fig. 3. Microscopa electrnica de transmisin de T. vaginalis. A. El citoplasma de T. vaginalis se encuentra formado por una matriz fibrogranular en la cual se observan un ncleo prominente (N), hidrogenosomas (H), porciones de retculo endoplsmico rugosos (RER), costa (C) y cisternas del sistema de Golgi (G). B. Porcin del axostilo el cual se aprecia libre de organelos. Microtbulos (MT), hidrogenosomas (H). (Ilustracin proporcionada por Dr. Arturo Gonzlez Robles, CINVESTAV-IPN).

Fig. 4. Relevancia in vivo de las cistena proteinasas de T. vaginalis involucradas en la virulencia del parsito. Deteccin de anticuerpos especficos contra las proteinasas de 30 y 65 kDa (CP30 y CP65, respectivamente), involucradas en la

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virulencia, por ensayos de inmunoprecipitacin (Ipp) y electroforesis en geles de sustrato (gelatina al 0.2%) SDS-PAGE al 10%, de: A, sueros y C, lavados vaginales de pacientes con trichomonosis. B. La presencia de proteinasas en los lavados vaginales se analiz en geles de sustrato. A. Se analizaron 24 sueros de mujeres en edad frtil que acudieron a la Clnica de Displasias del Hospital General de Mxico: [carriles 1-7, cultivo (+) de T. vaginalis]; [carriles 8-18, (clnico), de diagnstico clnico positivo pero cultivo de T. vaginalis (-)]; [carriles 19-21, (otros), de personas con otras enfermedades: cncer crvico-uterino invasivo (carriles 19-20) y Gardnerella (carril 21)]; [carriles 22-24, (N), de personas normales]. Controles: [carril 26, (L-P), patrn de proteinasas con afinidad a la superficie de las clulas HeLa]; [carril 27 (HeLa), sobrenadante de clulas HeLa fijadas]; [carril 27 (Staph), Staphylococcus aureus fijado, fuente de protena A]. B. Se analizaron 27 lavados vaginales: carriles 1-7, cultivo (+);carriles 8-10 (clnicos) slo se muestra el patrn de 3 de14 lavados vaginales representativos: carriles 11 y 12 (N) 2 de 6 lavados vaginales representativos; carril 13 (L-P) control. C. Zimograma de la inmunoprecipitacin de los mismos lavados vaginales descritos en la parte B.

Fig. 5. Degradacin de diferentes sustratos relevantes in vivo por proteinasas involucradas en la virulencia de T. vaginalis. Zimogramas de la actividad proteoltica de las protenas de T. vaginalis con afinidad a la superficie de clulas HeLa obtenidas por ensayo de ligandos (Arroyo y Alderete, 1995), en geles de poliacrilamida al 10% copolimerizados con diferentes protenas como sustrato: 1) gelatina (Gel) al 0.2%, 2)

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colgena IV (Coll IV) 400 g, 3) fibronectina (Fn) 400 g, 4) laminina-1 (Lam-1) 400 g y hemoglobina (Hb) al 0.2% (Alvarez y col., 2000; Mendoza y col., 2000).

Fig. 6. Efecto del pH sobre la actividad de las cistena proteinasas de T. aginalis con afinidad a clulas HeLa en geles de sustrato copolimerizados con colgena IV. Zimograma de la actividad de las proteinasas de T. vaginalis con afinidad a la superficie de clulas HeLa por SDS-PAGE en geles de sustrato al 10%, copolimerizados con 400 g de colgena IV activados a 37C y diferentes pHs: carriles 1) pH 3.6, 2) pH 4.5, 3) pH 5.0, 4) pH 5.5, 5) pH 6.0, 6) pH 6.5, 7) pH 7.0 y 8) pH 7.5.

Fig. 7. Efecto del zinc en la actividad de la CP65 y su impacto en la citotoxicidad de T. vaginalis. Zimograma y niveles de citotoxicidad (%TOX) de: carril 1) parsitos crecidos en medio TYM conteniendo 10% de suero de caballo, sin adicionarle ningn suplemento, (utilizado como control) en donde los niveles de citotoxicidad se tomaron como el 100%; carril 2) parsitos crecidos en presencia de 0.25 mM de Zn2+; carril 3) de 0.8 mM de Zn2+; carril 4) de 1.0 mM Zn2+; y carril 5) de 1.6 mM de Zn2+. Por encima de estas concentraciones, el Zn2+ es trichomonicida. Los zimogramas de la actividad de las cistena proteinasas con afinidad a la superficie de las clulas HeLa, se realizaron en geles de poliacrilamida-SDS al 10% copolimerizados con gelatina al 0.2%. Los niveles de citotoxicidad de las tricomonas se obtuvieron por un ensayo colorimtrico sobre monocapas de clulas HeLa.

Fig. 8. Inmunofluorescencia indirecta de la superficie de parsitos unidos a cubreobjetos con fibronectina. El ensayo de unin a cubreobjetos cubiertos con FN

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se realiz como se describi recientemente (Crouch y Alderete, 1999). Las trichomonas adheridas se fijaron a los cubreobjetos, se bloquearon con albmina bovina y se incubaron con el antisuero anti-trichomonas. Como control negativo se utiliz el suero de conejo preinmune, que no reaccion por inmunofluorescencia indirecta bajo las mismas condiciones experimentales utilizadas (datos no mostrados).

Fig. 9. El hierro no se necesita para la unin del parsito a componentes de membrana basal como laminina (LM) y fibronectina (FN). Los parsitos se crecieron en presencia de 50 M del agente quelante de hierro, el 2,2 dipirilo (L, bajo hierro), o en medio suplementado con 250 M de sulfato ferroso amonical (H, alto hierro). A. El perfil de protenas de trichomonas en un gel de poliacrilamida teido con azul de Coomassie confirma el estado del hierro de las trichomonas. El asterisco indica el rea donde las protenas que se regulan en alto y bajo hierro se visualizan (Lehker y Alderete, 1992). B. Porcentaje de unin de las trichomonas a las superficies recubiertas con FN. C. Porcentaje de unin de las trichomonas a la superficies recubiertas con LM.

Captulo 7 VIH/SIDA Carmen Soler Claudn 1,2.

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Unidad de Investigacin en Retrovirus Humanos. Instituto de Investigaciones Biomdicas, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Mxico, D.F.

Subsecretaria de Prevencin y Control de Enfermedades, SSA. Mxico, D.F.

Email: csoler@servidor.unam.mx PALABRAS CLAVE: VIH, SIDA

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivos del captulo. 3. Transmisin y riesgo de infeccin. 4. Infeccin primaria o aguda. 5. Respuesta del hospedero a la infeccin . 6. Diversidad viral. 7. Caractersticas del VIH. 8. Variabilidad gentica en los VIH. 9. Protenas virales. 10. Ciclo de replicacin viral. 11. Actividad de algunas protenas reguladoras virales. 12. Regulacin de expresin viral por factores celulares. 13. Conclusiones. Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

Han pasado 17 aos desde que se identific al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), como agente responsable del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En este tiempo se ha aprendido mucho sobre la magnitud y la distribucin de la epidemia, as como de los factores de riesgo para la transmisin del virus. Los avances en ciencias bsicas, clnicas y sociales en relacin con esta infeccin y su impacto en los individuos y en la sociedad en su conjunto, no tienen paralelo en la historia. Por primera vez, se consider necesario establecer un programa de las Naciones Unidas para coordinar los esfuerzos en contra de una pandemia. Los datos presentados peridicamente por ONUSIDA y la OMS son preocupantes. Por ejemplo, en frica sub-sahariana el SIDA es la primera causa de muerte, representando el 20.6% del total. Globalmente, el VIH/SIDA se encuentra ya como la cuarta causa de mortalidad con un 4.8% del total de muertes (UNAIDS. AIDS epidemic update, 2000). El SIDA es la manifestacin clnica de una infeccin viral ocurrida con muchos aos de anterioridad. La enfermedad se desarrolla por la incapacidad del sistema inmune para controlar la replicacin del virus. La epidemia de VIH consiste de una multitud de epidemias menores, cada una con su propio patrn de vas de transmisin y su propia dinmica. Todava no se entiende por qu algunas son explosivas y otras estn relativamente limitadas.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

Analizar distintos aspectos moleculares que definen las caractersticas de la epidemia de VIH/SIDA.

3. TRANSMISIN Y RIESGO DE INFECCIN

La transmisin del VIH puede ser sangunea, sexual o perinatal. El riesgo de transmisin aumenta cuando hay una mayor cantidad de virus en los fluidos biolgicos y un mayor nmero de contactos de un individuo con esos fluidos. Aunque el fenmeno de transmisin es multifactorial, en la literatura se reporta que el riesgo de transmisin del VIH es de: 1:4 para la transmisin perinatal, 1:150 en el uso de drogas intravenosas y 1:300 en el caso de punciones ocupacionales. Por va sexual, los riesgos son de 1:300 a 1:1000 en las relaciones anales, 1:500 a 1:1000 en relaciones heterosexuales, cuando el hombre es el infectado, y de 1:1000 a 1:3000 cuando la mujer es la portadora del virus (Royce y col., 1997). Por va sexual la mayor fuente de transmisin son las clulas infectadas. En las relaciones sexuales el riesgo cambia, entre otras cosas, por la presencia de otras infecciones de transmisin sexual (ITS), como por ejemplo si el individuo est o no circuncidado. Tambin aumenta el riesgo de infeccin a medida que la cantidad de virus en el plasma del individuo infectado es mayor (Levy, 1998).

4. INFECCIN PRIMARIA O AGUDA

En la infeccin aguda, entre el 50 y el 90% de los individuos presentan una enfermedad con sntomas parecidos a los de la influenza. Como puede observarse en la Fig. 1, los linfocitos T CD4+ disminuyen y los CD8+ se elevan. En corto tiempo los CD4 regresan a valores casi normales; sin embargo, no as los CD8 (Constantine y col., 1992). El SIDA se define como la reduccin del nmero de clulas CD4+, lo que causa la aparicin de infecciones oportunistas y de cnceres. Esta enfermedad se desarrolla a lo largo de los aos, a medida que el sistema inmune se deprime. La duracin del perodo libre de sntomas en cada individuo es muy variable y est determinada por mltiples factores de la interaccin virus-hospedero. La produccin viral durante el primer ao de la infeccin, despus de que se detectan los anticuerpos contra el virus en el suero del individuo (seroconversin) es un factor que permite pronosticar la progresin de la infeccin. El VIH-1 es un virus politrpico que puede infectar muchos tipos de clulas. Los virus se reproducen en mayor cantidad en los linfocitos T CD4+. Los macrfagos infectados pueden ser reservorios, producindose en ellas virus en una menor cantidad pero continuamente. Los macrfagos diferenciados que se encuentran en tejidos linfoides pueden ser el primer sitio de replicacin viral; de ah, el virus puede pasar a los linfocitos CD4 activados. Despus de que un individuo presenta seroconversin, hay una eliminacin inicial del VIH por el sistema inmune, seguido por varios aos de una produccin viral a niveles bajos estables. Durante este periodo hay una evolucin viral

continua. Cada ronda de replicacin produce una mezcla compleja de cepas virales que se pueden diferenciar tanto fenotpica como genotpicamente (cuasi especies) (Zhu y col., 1996). En la seroconversin, las mujeres presentan un menor ttulo de virus; sin embargo, progresan hacia la enfermedad ms o menos a la misma velocidad que los hombres, pero siempre con menor cantidad de virus (Ray y Quinn, 2000).

5. RESPUESTA DEL HOSPEDERO A LA INFECCIN

La respuesta inmune humoral produce anticuerpos contra el virus entre uno a tres meses despus de la infeccin, pero en casos raros, la produccin de anticuerpos tarda varios meses o hasta aos. Estos anticuerpos se pueden detectar en plasma, orina y saliva, predominando los de la clase IgG1. Poco tiempo despus de la presencia de anticuerpos antivirales, se inducen anticuerpos neutralizantes efectivos contra la cepa viral especfica que ocasion la infeccin, aunque tambin se han demostrado anticuerpos ayudadores de la infeccin (Fig. 2). No se ha encontrado correlacin entre la presencia de anticuerpos con el estado clnico del paciente. Se ha demostrado que las mutaciones en el virus lo hacen resistente a la neutralizacin y sensibles a los anticuerpos ayudadores de la infeccin. Se ha demostrado tambin que el complemento puede jugar un papel en la respuesta antiviral (Levy, 1998). El VIH se asocia a una variedad de desrdenes auto-inmunes como resultado de la proliferacin de clulas B y del mimetismo molecular de algunas protenas virales con protenas celulares del husped. En los pacientes infectados

se ha encontrado reduccin de plaquetas y de neutrfilos, as como neuropata perifrica (Levy, 1998). La respuesta celular es la primera reaccin inmunolgica a la infeccin por VIH. Las clulas llamadas natural killers (NK) destruyen a clulas infectadas que no son reconocidas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las clulas T CD4+ producen citocinas y pueden matar clulas infectadas por secrecin de perforinas o por induccin de apoptosis. Las clulas CD8+ citotxicas son las que juegan un papel ms importante. Sin embargo, se presenta evasin de la respuesta citotxica por cambios en los epitopos de las protenas virales por anergia de las clulas CD8+, por encubrimiento de un epitopo o por regulacin de la expresin del MHC. Tambin algunos autores han encontrado que las clulas CD8+ son capaces de secretar un factor al que se ha denominado celular antiviral factor (CAF), que parece jugar un papel importante en los individuos en las que se ha podido demostrar su presencia (Johnson y col., 1998). La infeccin por VIH se asocia con la supresin de la hematopoyesis, lo que se refleja en cambios de los subgrupos y fenotipos de los linfocitos, en la presencia de un mayor nmero de clulas activadas, un menor nmero de clulas CD4 y un menor nmero de linfocitos que an no han sido primados por ningn antgeno (naive). Asimismo, en la infeccin por VIH, se producen anormalidades en las clulas B, como su activacin policlonal y la prdida de respuesta a nuevos antgenos, y en la funcin de los macrfagos, clulas NK y clulas dendrticas, la cual se refleja en la produccin de citocinas y en la fagocitosis y citotoxicidad reducida. Otros fenmenos observados han sido una capacidad de presentacin de antgenos por las distintas clulas encargadas de ello y la disrupcin de la

arquitectura y la funcin del tejido linfoide, con destruccin de los centros germinales (Kurizkes, 2000).

6. DIVERSIDAD VIRAL

Los virus deben infectar las clulas de su hospedero para replicar su genoma y producir la progenie viral que infectar nuevas clulas blanco. Los virus dependen de factores especficos del hospedero para reconocer a las clulas blanco y para incluir algunos factores celulares en sus partculas. La poblacin viral en un punto del tiempo es una mezcla compleja de cepas que difieren en sus propiedades antignicas y fenotpicas y compiten entre ellas. Subsecuentemente, se da un sobrecrecimiento de una cierta cepa viral de acuerdo con su adaptacin en el hospedero. Se ha demostrado que la poblacin del VIH en individuos recin infectados es bastante homognea, lo cual sugiere que pudiera haber una seleccin viral durante la transmisin. Los factores que pueden participar en la seleccin de una poblacin viral homognea incluyen: i) que el inculo original sea pequeo y por lo tanto, slo represente una muestra de la poblacin viral presente en el donador, ii) que exista compartamentalizacin viral, es decir, que en el fluido transmisor, por ejemplo el semen o las secreciones vaginales, solamente se encuentre una poblacin determinada de la total presente en el individuo donador del virus, iii) que se presente un crecimiento inicial de una poblacin viral especfica relacionada con la va de entrada y iv) a que haya diferencias en la transmisibilidad de las distintas cepas virales (Poss y col., 1995).

En la transmisin heterosexual, se encuentran ms variantes virales en las mujeres, lo cual puede establecer un reservorio viral latente ms diverso que incluya virus con diferentes tropismos. Tambin se ha demostrado un mayor riesgo de transmisin en las mujeres. Algunas de las posibles razones para sto, as como para la presencia de una mayor cantidad de variantes virales, pueden ser: i) la susceptibilidad de la mucosa vaginal, ii) mayor rea de exposicin, iii) mayor trauma en las mucosas vaginales, iv) la presencia de otras infecciones, v) menor uso del condn, vi) mayor exposicin a secreciones, vii) diferencias inmunolgicas, viii) divergencia de la cepa original, ix) diversidad de las cuasi especies (Levy, 1998).

7. CARACTERSTICAS DEL VIH

El VIH, que se descubri en 1983, es un lentivirus de la familia Retroviridae (BarreSinoussi y col., 1983). Hay dos tipos de VIH: el VIH1 y VIH2, los cuales se distinguen por las glicoprotenas de la envoltura. Los VIH se pueden clasificar por sus caractersticas biolgicas, inmunolgicas y moleculares (como tropismo celular, cintica de replicacin, niveles de produccin de nuevas partculas, capacidad de modulacin del receptor CD4, citopaticidad, latencia, estructura gentica y sensibilidad a anticuerpos). Tambin podemos clasificar al VIH por su fenotipo o por su genotipo. Fenotpicamente hay tres sistemas de clasificacin que se sobrelapan, pero no son equivalentes. El primero se basa en sus caractersticas de crecimiento y divide a los virus en dos grandes grupos: los rpidos/altos y los lentos/bajos (Fenyo y

col., 1988). El segundo se basa en el tropismo celular y tambin hay dos grupos, los M-trpicos y los T-trpicos, dependiendo de si son capaces de infectar clulas monocticas o linfocticas, respectivamente. El tropismo viral se ha relacionado con la conformacin de la membrana viral. El macro o linfo tropismo se define por diferencias muy pequeas, de 2 3 aminocidos en la regin conocida como V3, la cual se encuentra en la glicoprotena externa gp120. V3 es un determinante mayor de la infeccin (VonBriesen y col., 1990). El tercer sistema clasifica a los VIH de acuerdo con su capacidad citoptica y los divide en virus inductores de sincicios (SI) o virus no inductores de sincicios (NSI). El fenotipo SI est asociado a la presencia de amino cidos cargados positivamente en las posiciones 306 y 320 de la regin V3 de la glicoprotena externa gp120 (Tersmette y col., 1989). Otro sistema de clasificacin, aadido despus, es el uso preferencial de receptores secundarios, dividindose los virus en aquellos que utilizan el receptor CCR5 el CXCR4 (Berger y col., 1998). Generalmente los virus rpidos/altos son T-trpicos y SI, mientras que los virus lentos/bajos son M-trpicos y NSI. Se ha demostrado que aunque la transmisin es de una poblacin fenotpicamente mezclada, en las etapas tempranas de la infeccin se encuentran virus M-trpicos y NSI, pudindose aislar en etapas ms avanzadas los virus T-trpicos y SI.

8. VARIABILIDAD GENTICA EN LOS VIH

El genoma del VIH tiene aproximadamente 9700 pb. (Fig. 3). En la replicacin de su genoma llevada a cabo por la transcriptasa reversa viral, se introduce un error

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en cada 2,000-5,000 bases replicadas, debido a que esta enzima carece de factor de correcin, lo que significa entre dos y cinco errores cada vez que el genoma se copia. El VIH tiene una vida media en la sangre de aproximadamente dos horas y las clulas infectadas producen aproximadamente 1010 viriones al da. Esto significa que en cada individuo infectado, el VIH sufre un proceso evolutivo continuo, ya que se replica a velocidades enormes. La evolucin del VIH es un milln de veces ms rpida que la del genoma humano (Perelson y col., 1996). Esta variacin no se distribuye por igual a lo largo de todo el genoma, sino que existen regiones, como los genes env y nef, que acumulan la mayora de las mutaciones. Sin embargo, en estos genes hay regiones que codifican para partes estructurales o funcionales de las protenas que no son muy conservadas, como son las cistenas presentes en la glicoprotena gp120 que se mantienen en todos los aislados reportados hasta ahora. Cada aislado realizado de un paciente est formado por un gran nmero de clonas. Tomando como parmetros los sitios de corte por enzimas de restriccin, las cepas de un individuo varan entre s de un 3 a un 28% (variabilidad intraindividuo). Cuando comparamos la variacin en los sitios de corte entre aislados de distintos individuos, sta llega hasta 70% (variabilidad inter-individuos). A este fenmeno se le ha denominado microheterogeneidad intracepa. La variabilidad entre aislados tiene impacto sobre algunas propiedades muy importantes de los VIH como i) la especificidad que el virus muestra por ciertos tejidos y clulas blanco y ii) la patogenicidad. Por lo tanto, esta variacin afecta el espectro de sndromes clnicos. Sin embargo, todava no hay claridad repecto a la relacin entre la variacin biolgica de los aislados de VIH y la variacin en la

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sintomatologa encontrada en los individuos infectados (Kuritzes, 2000). Tambin se ha observado que la distribucin temporal y geogrfica de los VIH es variable. Se sabe que los aislados obtenidos de pacientes en frica son ms divergentes entre s, que los encontrados en ciudades de los Estados Unidos o Europa (Delwart y col., 1994). Tal vez uno de los impactos ms importantes de esta variabilidad sea en la antigenicidad de las cepas de VIH, puesto que se produce una deriva gentica. Estas variaciones se reflejan a veces en los dominios de neutralizacin y de induccin de la respuesta T citotxica, complicando el posible desarrollo de vacunas efectivas. En 1987 se identific que en la regin V3 de la glicoprotena externa gp120 del virus, se encontraba el dominio principal de neutralizacin de los VIH. Este fragmento de 35 amino cidos, flanqueados por dos cistenas que le proporcionan una estructura secundaria en forma de asa, confiere la propiedad de que los anticuerpos formados en su contra sean especficos de cepa, es decir, que slo neutralicen al aislado que les dio origen o a algunos aislados similares en esa regin. Tambin en este segmento de la protena gp120 se encuentra el epitopo inductor de linfocitos T citotxicos especficos (CTL). La variacin en esta regin, aunque muy amplia, es ms limitada en algunos amino cidos y as se ha encontrado que 80% de los individuos infectados en Europa tienen reactividad a dos aislados (Parren y col., 1999). Genotpicamente los VIH-1 se agrupan consistentemente en 3 grupos llamados M,N y O. El grupo M es el que incluye los virus que dominan la epidemia de SIDA en el mundo y ha sido subdividido en subtipos. La definicin de un subtipo se realiza por medio de anlisis filogenticos y de distancias genticas. Un

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nuevo subtipo debe estar equidistante, a lo largo de todo el genoma, de los subtipos previamente caracterizados. Recientemente se ha revisado el sistema de clasificacin y nomenclatura de los VIH-1 y se sugiere introducir dos nuevas categoras: la de sub-subtipo y la de formas recombinantes circulantes (CRF). Los sub-subtipos son virus muy cercanos a un subtipo particular, pero con un linaje claramente distintivo. De hecho, si aplicramos el nuevo sistema de clasificacin, varios de los subtipos actuales (Fig. 4), se trataran en realidad de sub-subtipos; sin embargo, para evitar confusiones se ha decidido mantener la nomenclatura en virus previamente reportados (Robertson, 1999). Actualmente, existen ya mltiples reportes de la aparicin de virus quimricos o recombinantes que estn ocasionando epidemias emergentes en diversas regiones; as, la categora de CRF sirve para describir esos linajes recombinantes que estn jugando un papel importante en la epidemia. Como se muestra en la figura 5, los miembros de un CRF deben compartir una estructura de mosaico idntica, es decir, deben provenir de los mismos eventos de recombinacin.

9. PROTENAS VIRALES

Los genomas de todos los retrovirus tienen en comn tres genes que codifican protenas estructurales: gag, pol y env. Su estructura es anloga a la de los RNA mensajeros de las clulas eucarinticas. Siempre se encuentran en el virin dos copias idnticas unidas no covalentemente, lo cual asemeja a un genoma diploide, permitiendo la formacin de heterozigotes y la recombinacin gentica. En los extremos del genoma se encuentran secuencias reguladoras que durante la

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transcripcin reversa se duplican y forman dos unidades terminales idnticas en el virus integrado o provirus denominadas regin larga repetida (LTR). El VIH contiene informacin para nueve protenas estructurales (Fig. 6). En los ribosomas libres se sintetizan dos poliprotenas, Pr55gag y Pr160gag-pol, en una relacin 20:1. Estas poliprotenas son transportadas a la cara citoplasmtica de la membrana de la clula husped y dirigen la formacin y liberacin de las partculas virales. El procesamiento proteoltico de estos precursores se lleva a cabo por la proteasa viral y ocurre simultneamente con la separacin de la partcula viral de la clula infectada, produciendo la partcula viral madura. El Pr55 produce las tres protenas que forman la cpside: p17 (MA, matriz), p24 (CA, cpside) y p15. Esta ltima, es cortada en dos polipptidos de menor peso molecular, p7 (NC,nucleocpside) y p6. La protena P17 se encuentra miristilada en su extremo amino terminal, lo que le permite la unin a la membrana. Del Pr160 se obtienen las tres protenas virales que tienen actividad enzimtica: la proteasa viral (PR), la transcriptasa reversa (RT) y la integrasa (IN). Las protenas externas del virin se sintetizan en el retculo endoplsmico de la clula infectada, producindose el precursor gPr160env, el cual est altamente glicosilado. En el aparato de Golgi, una proteasa celular corta esta poliprotena en dos, la glicoprotena transmembranal gp41 (TM) y la glicoprotena de superficie gp120 (SU). TM dirige la formacin de complejos oligomricos con la gp120, los cuales son transportados por la va secretoria hasta la superficie celular (Garnier y col., 1998; Levy, 1998).

10. CICLO DE REPLICACIN VIRAL

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El receptor celular principal para el VIH es la molcula CD4, la cual interacciona a travs de su regin D1 con la glicoprotena de superficie del virus. El punto de interaccin del virus con CD4 se encuentra cerca del carboxilo terminal de la gp120 en la regin llamada C4. Se sabe que la conformacin de la glicoprotena es importante para esta unin, ya que otras regiones, no contiguas, tambin participan en la interaccin con CD4. Esta interaccin con la molcula CD4 produce un desplazamiento de la gp120, lo cual descubre regiones de la glicoprotena viral transmembranal gp41, que son necesarias para que se lleve a cabo la fusin entre las membranas viral y celular. Sin embargo, en varios estudios se demostr que la interaccin del virus con CD4 no es suficiente ni es el nico mecanismo de entrada del virus. Esto llev al descubrimiento de que algunos receptores de quimiocinas actan como co-receptores del VIH. As, se encontr que la molcula CXCR-4 es el co-receptor de cepas virales T-trpicas y CCR-5 permite la infeccin de cepas macrotrpicas. Posteriormente se han identificado una serie de molculas, pertenecientes a la familia de los receptores de quimiocinas, que pueden funcionar tambin como co-receptores del VIH. El mecanismo de fusin de las membranas y de entrada del virus no se conoce con detalle. Se cree que la gp41 tiene un importante papel en la fusin y que algunas protenas celulares, como la ciclofilina A, que es incorporada en las partculas virales, es clave para desestabilizar la cpside viral despus de su liberacin al citoplasma celular. Un fenmeno que se observa en las clulas infectadas es el control de la expresin de la protena CD4 en la membrana, la cual se reprime dependiendo de la produccin de virus y del tipo de virus. Se ha reportado que la glicoprotena viral

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gp120 se une a CD4 en el retculo endoplsmico antes de ser translocada a la membrana y que dos protenas reguladoras, Vpu y Nef, tambin afectan el trnsito intracelular de CD4. El VIH puede infectar una clula como partcula viral infecciosa libre, pero tambin la infeccin puede llevarse a cabo a travs de un proceso de transferencia del virus clula-clula. Este proceso se ha estimado que es 100 veces ms eficiente que la infeccin por virus libre y tiene gran importancia en la transmisin sexual y perinatal del VIH. Una vez que el virus ha entrado como una ribonucleocpside, el RNA viral localizado en el interior, es liberado en la clula con la ayuda de p24 y la ciclofilina, y es transcrito usando las actividades de DNA polimerasa dependiente de RNA y de RNAsa que tiene la transcriptasa reversa viral. Posteriormente, se forma un cDNA viral de doble cadena. Este cDNA, junto con las protenas p24, Vpr e integrasa, forman un complejo de pre-integracin que es transportado al ncleo donde posteriormente es integrado en cualquier punto del genoma de la clula husped (Fig. 7). El DNA proviral de las clulas infectadas se transcribe en una primera etapa a un RNAm de 2kb, el cual tiene un doble procesamiento y codifica los genes virales reguladores ms importantes: tat, rev y nef. El producto de estos genes que se encuentra en mayor cantidad determinar si la infeccin es productiva o latente. Tat activa la produccin viral, Rev regula la expresin de protenas estructurales, facilitando la produccin de RNAm no procesados, y Nef tiene una funcin pleiotrpica, induciendo un estado de latencia en algunas clulas. En la etapa tarda se sintetizan adems otras dos especies de RNAm, uno

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de todo el genoma (9kb) y otro subgenmico de 4.5 kb. Los tres tipos de RNAm formados (9, 4.5 y 2 kb) comparten los extremos 5 y 3 entre s y junto con el RNA genmico. Al ser transportados al citoplasma, los transcritos de largo completo (9 kb) se usan como RNA genmico, o para ser traducidos a las poliprotenas de Gag y Pol mencionadas anteriormente, y los transcritos de 4.5 kb se traducen en el retculo endoplsmico, formando el precursor de las glicoprotenas virales (gp160). Una vez sintetizadas todas las protenas y el RNA genmico, el virus es ensamblado en un proceso dependiente de las protenas Gag para finalmente ser liberado por gemacin. En este momento se cortan proteolticamente los precursores de las protenas Gag y Pol, permitiendo la maduracin de la partcula viral (Michael y col., 1999; Wyatt y col., 1998; Levy, 1998).

11. ACTIVIDAD DE ALGUNAS PROTENAS REGULADORAS VIRALES

La protena Tat tiene tres regiones o dominios funcionales: el extremo amino terminal, constituido por amino cidos acdicos, una regin rica en cistenas y una regin cargada positivamente rica en lisinas. Esta ltima regin bsica constituye la seal que permite que Tat sea transportada al ncleo o nucleolo de la clula. Para ejercer su accin, interacciona con una regin de control de la transcripcin en el genoma viral, denominada elemento de respuesta a la trans-activacin (TAR), la cual tiene una estructura secundaria clave para estabilizar los complejos de iniciacin y elongacin transcripcional y que est localizada en el segmento R del LTR. La regin RU5 (Fig. 8) se transcribe y se incorpora como una secuencia lder de RNA en todos los tipos de transcritos de RNAm. La funcin de TAR es

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dependiente de la posicin y la orientacin, y su mayor actividad se presenta cuando est localizada en el extremo 5 de los transcritos de RNA (Gmez y Soler, 2000). La transactivacin es un proceso complejo, no muy claramente entendido. Se reporta que Tat tiene una accin bimodal, actuando tanto a nivel postranscripcional como a nivel de traduccin. Hay evidencias de que la protena interacciona establemente con varias protenas celulares, adems de con TAR. Se ha sugerido que tambin juega un papel como modulador de la activacin de los linfocitos, segn el cual, esta protena se comportara como un factor de crecimiento o citocina. Se cree que la protena Rev es la mediadora de la exportacin, desde el ncleo al citoplasma, de los transcritos virales de RNAm estructurales. En este proceso participa el nucleolo de una manera que an no se entiende. Rev es una fosfoprotena nuclear de 19 kDa. Su fosforilacin ocurre en el ncleo, en los residuos de serina del extremo carboxilo terminal, y al igual que Tat, se localiza casi exclusivamente en ste, con acumulacin en el nucleolo. La accin de Rev est relacionada con una regin reguladora llamada Rev responsive element o RRE, que se encuentra presente entre los nucletidos 7300 y 7539 en el genoma y que acta en cis. Rev ejerce su accin a nivel postranscripcional como mediador de la exportacin de RNAm y aumentando su estabilidad para evitar su procesamiento. As tenemos que, en ausencia de Tat, casi no se forma RNA de largo completo, la velocidad de iniciacin de la infeccin es muy baja y los RNAs presentes son pequeos. En cambio, su presencia temprana en el proceso de

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infeccin permite la induccin de la expresin de las protenas reguladoras y por lo tanto, de la accin de Rev. Sin Rev, el RNA transcrito es procesado rpidamente en especies menores, permitiendo slo la sntesis de protenas reguladoras e inhibindose la sntesis de protenas estructurales virales. As, al estar presentes estos dos reguladores positivos, la replicacin viral se ve altamente estimulada. Nef es una protena de 27 kDa, miristoilada en su extremo amino terminal, que se localiza cercana a la membrana plasmtica. Su mecanismo de accin no est claramente definido, pero su presencia tiene una accin inhibitoria de la expresin viral en algunos aislados, asocindose a la latencia (Emerman y col., 1998; Cullen, 1998; Cullen, 1999 ).

12. REGULACIN DE LA EXPRESIN VIRAL POR FACTORES CELULARES

La regulacin de la expresin viral por factores celulares ha sido uno de los retos mayores para los investigadores que trabajan con retrovirus. Hay muchas teoras que tratan de explicar la forma en que un retrovirus puede interaccionar con su clula hospedera. Por ejemplo, el virus puede inducir la sntesis de algunas protenas celulares que funcionen como moduladoras de la expresin de los genes virales, como es el caso de la gp120, que altera la concentracin de calcio intracelular y estimula las seales especficas de transduccin. Una estrategia diferente sera que el virus, despus de integrar su genoma, espere a que la clula exprese protenas que regulan la sntesis viral. La regin LTR (Fig. 8) funciona como un sitio de control y regulacin de la transcripcin viral. Aunque ambos LTR son idnticos en secuencia, el 5LTR est involucrado en los procesos de inicio y

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regulacin de la transcripcin viral, mientras que el 3LTR funciona en procesos post-transcripcionales, tales como la poliadenilacin y la edicin de transcritos virales. Un ejemplo es la protena NF-B, que es un factor de transcripcin inducible y que estimula la transcripcin viral despus de la activacin celular (Gmez y col., 2000). Tambin el virus puede inducir la sntesis de protenas celulares que no afectan su expresin, pero que ejercen un efecto patognico en la propia clula hospedera o en clulas blanco. Esta hiptesis se ha relacionado con la presencia del Sarcoma de Kaposi, en que se encuentran estimulados una serie de factores de crecimiento. Finalmente, la clula hospedera puede servir de transmisor de seales de un tipo de virus a otro, activando as la replicacin viral. Por ejemplo herpesvirus, citomegalovirus, adenovirus que activan la replicacin y/o la expresin gnica del VIH.

13. CONCLUSIONES

Los estudios biolgicos y moleculares de los VIH estn permitiendo entender las propiedades importantes, en trminos de patogenia, evasin de respuesta inmune, latencia, etc. En algn momento cercano del futuro, la informacin ser suficiente para sentar las bases del desarrollo de medicamentos antivirales o de vacunas que sean eficientes para combatir esta epidemia.

ABREVIATURAS

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CRF LTR MHC NK NSI SI SIDA VIH

Formas recombinantes circulantes. Regin larga repetida. Complejo mayor de histocompatibilidad. clulas natural killers. Virus no inductores de sincicios. Virus inductores de sincicios. Sndrome de inmunodeficiencia adquirida. Virus de la inmunodeficiencia humana.

BIBLIOGRAFA

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PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Variacin poblacional de las clulas T en diferentes fases de la infeccin por VIH.

Fig. 2. Respuesta inmune del hospedero a la infeccin por VIH.

Fig. 3. Mapa del genoma del virus VIH.

Fig. 4. rbol filogentico que muestra la relacin entre los subtipos del virus del VIH.

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Fig. 5. Subtipos del virus VIH y sus variaciones mostradas dentro del genoma viral.

Fig. 6. Estructura del virus del VIH. Se muestran los genes, sus productos y su localizacin en la partcula viral.

Fig. 7. Ciclo de replicacin del virus VIH dentro de la clula.

Fig. 8. Regin regulatoria de la transcripcin del virus del VIH. Se muestran algunas secuencias de unin para varios factores de transcripcin.

Captulo 8 Apoptosis y Cncer Humano

Patricio Gariglio1 y Luz Ma. Rangel R1.
1

Departamento de Gentica y Biologa Molecular, Centro de Investigacin y de Estudios

Avanzados del I.P.N. (CINVESTAV-IPN), Mxico, D.F.

Email: vidal@lambda.gene.cinvestav.mx PALABRAS CLAVE: Cncer, oncogenes, apoptosis, antioncogenes, HPV.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivos del captulo. 3. Estado actual del arte. 4. Apoptosis y cncer humano. 3.1 Protooncogenes, oncogenes y apoptosis. 3.2 Apoptosis y genes supresores de tumores. 3.3 Mecanismos de apoptosis. 3.4 Carcinognesis en etapas mltiples e inhibicin de la apoptosis. 3.5 HPV, apoptosis y cncer. 3.6 Sistema inmune, apoptosis y neoplasia. 4. Conclusiones. Agradecimientos. Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

Un cncer se origina cuando clonas de clulas mutadas sobreviven y proliferan en forma inapropiada, rompindose el balance entre la proliferacin celular y la apoptosis o muerte celular programada y genticamente controlada. En los ltimos 5 aos, la investigacin en cncer ha producido avances notables en el conocimiento de la biologa y la gentica de la clula cancerosa. Entre los logros ms importantes est el tomar conciencia de que la apoptosis y los genes que la controlan juegan un papel fundamental en el desarrollo de un tumor maligno. Algunos oncogenes inhiben vas apoptticas y favorecen la progresin de una neoplasia. Otros oncogenes incrementan los procesos apoptticos, lo cual establece una presin selectiva para que en una clula se introduzca una segunda mutacin y escape a la apoptosis durante la carcinognesis. Frecuentemente, el cncer es inducido por agentes ambientales que causan mutaciones en oncogenes, genes supresores de tumor llamados antioncogenes, o incluso en genes involucrados en la reparacin del dao al DNA. En etapas sucesivas se alteran y/o se desregulan transcripcionalmente genes relacionados con el ciclo celular, la inmortalizacin, la estabilidad genmica, la apoptosis, la invasin, la angiognesis y la metstasis. En otras palabras, el cncer tiene un origen gentico y en su desarrollo participan varios genes que van llevando a la invasin gradual de uno o varios tejidos del paciente. Adems, en algunas neoplasias intervienen oncogenes virales, como por ejemplo los oncogenes de los papilomavirus humanos (HPV) de alto riesgo en cncer crvico uterino (CaCu). Hay evidencias indicando que la mayora de los compuestos citotxicos empleados en la clnica para combatir el cncer son inductores de la

apoptosis, lo cual lleva a pensar que una falla en el tratamiento quimioteraputico se puede deber a un defecto en alguna va apopttica. En este momento, el conocimiento de las bases moleculares del cncer es enorme y esto hace posible el diseo de nuevas estrategias preventivas, de diagnstico y de terapia molecular. La mayora de estas estrategias considera la induccin de la apoptosis de las clulas malignas como un evento fundamental.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

En este captulo pretendemos estimular el acercamiento del personal del rea mdica a las investigaciones recientes en biologa molecular, especficamente en oncologa molecular. Este acercamiento ayudar a que en un futuro prximo, el mdico sepa qu se debe diagnosticar a nivel molecular, con el fin de aplicar estrategias modernas de terapia molecular, incluyendo la terapia gnica. En pases desarrollados, la literatura mdica ha sufrido un cambio notable para poder abarcar los conocimientos moleculares de ms impacto, que se generan cada da en los distintos laboratorios o centros de investigacin biomdica. La Oncologa Molecular avanza a gran velocidad; slo en relacin con algunos genes que participan en cncer, se han publicado en los ltimos aos, ms de 60,000 artculos (Tabla 1). El objetivo central de este captulo es que el pblico en general y el personal del rea mdica en particular, adquieran conocimientos bsicos que les permitan iniciar el entendimiento del origen gentico del cncer, los agentes que lo provocan, lo heterogneo de la enfermedad y la resistencia de la clula

tumoral, tanto a la radioterapia como a la quimioterapia.

3. ESTADO ACTUAL DEL ARTE

El cncer o neoplasia es una enfermedad que se caracteriza por una proliferacin celular descontrolada, durante la cual se abaten, entre otros, los mecanismos que conducen a la apoptosis. Las clulas cancerosas forman tumores malignos que invaden tejidos vecinos y pueden colonizar tejidos distantes, mediante el proceso de metstasis; esto lleva a la destruccin de tejidos y rganos vitales. En los pases en desarrollo como Mxico, se est observando una transicin epidemiolgica curiosa; aumentan rpidamente las enfermedades frecuentes de los pases desarrollados, como el cncer, pero no disminuyen con igual rapidez las enfermedades caractersticas del subdesarrollo. El estilo de vida de las personas aumenta el riesgo a ciertos tipos de cncer. Por ejemplo, los fumadores aumentan el riesgo a varias formas de cncer: de pulmn, boca, trquea, esfago, vejiga, crvico uterino, etc. Actualmente se ha llegado a establecer que en el inicio y desarrollo de una neoplasia intervienen bsicamente dos clases de genes: los oncogenes y los genes supresores de tumores (o antioncogenes). Las versiones normales de los oncogenes (o protooncogenes) regulan positivamente el crecimiento y la divisin de las clulas, en tanto que los antioncogenes inhiben estos procesos. Hace muy poco tiempo se descubri que tanto los oncogenes (por ejemplo cmyc, ras, bcl-2) como los antioncogenes ms estudiados (rb, p53) participan activamente en apoptosis. Para que un tumor maligno se desarrolle se deben mutar 4 o 5 genes que controlan el crecimiento celular.

Los cnceres en general no son congnitos y son iniciados por agentes ambientales (compuestos qumicos, radiaciones, virus), los cuales provocan una mutacin en algn oncogn o antioncogn que permite a la clula ciertas ventajas en su crecimiento. En divisiones sucesivas de las clulas mutadas se puede introducir una segunda y, posteriormente, otras mutaciones en los mencionados genes, favorecindose cada vez ms el crecimiento descontrolado de los nuevos tipos celulares. Despus de varios aos de la primera mutacin, se llega a una clula altamente maligna, capaz de dividirse rpidamente y muy resistente a la apoptosis inducida por agentes qumicos o fsicos. En algunas neoplasias, ciertos virus pueden ser los agentes iniciadores de la transformacin maligna, favoreciendo la inestabilidad genmica de la clula infectada. En una pequea fraccin de los cnceres se ha detectado un componente hereditario que puede transmitirse de padres a hijos y constituir el evento mutacional primario mencionado con anterioridad; sera necesario sealar que debido a su carcter dominante los oncogenes no se heredan, pero por el contrario, los antioncogenes pueden transmitirse a la descendencia. En este caso, un padre aparentemente normal puede presentar un alelo mutado y transmitirlo a alguno de sus hijos, el cual en algn tejido puede mutar su alelo normal y quedarse sin ninguna copia del antioncogn. El estado actual de los estudios y descubrimientos en oncologa molecular es fascinante y de gran importancia mdica. En particular, en los ltimos 5 aos se ha determinado que la inhibicin de los mecanismos apoptticos puede representar una clave importante para entender el crecimiento tumoral y para desarrollar estrategias de terapia molecular. Debido a que las mutaciones que inhiben la apoptosis durante el desarrollo de una neoplasia tambin reducen el xito de los

tratamientos clnicos, es posible en este momento relacionar la terapia con la gentica del cncer y en particular, con los genes que regulan la apoptosis. Por este motivo se est haciendo en muchos laboratorios un enorme esfuerzo para entender en detalle los mecanismos apoptticos en las clulas cancerosas. El entendimiento del cncer a nivel molecular es un requisito importante no slo para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnstico y para el diseo de mtodos teraputicos ms efectivos, sino tambin en el establecimiento de medidas preventivas con slidos fundamentos cientficos.

4. APOPTOSIS Y CNCER HUMANO

Una caracterstica muy importante de la clula cancerosa se refiere a su capacidad para proliferar continuamente, ya sea en ausencia de factores de crecimiento o incluso en presencia de seales inhibidoras del crecimiento (Bishop y Weinberg, 1996). Adems, las clulas tumorales son capaces de escapar a la muerte celular observada en cultivos de clulas normales. En este caso se habla de un cultivo celular establecido o de lneas celulares inmortalizadas. Las clulas inmortales se consideran preneoplsicas ya que contienen alteraciones en su cariotipo y presentan actividad aumentada de la enzima telomerasa (Harley y Villeponteau, 1995). Cabe mencionar que todas las clulas tienen el gen que codifica para telomerasa, pero dicho gen est reprimido y no se expresa. La transformacin maligna puede observarse cuando fibroblastos primarios o lneas celulares inmortalizadas son tratadas con ciertos virus tumorales o con carcingenos qumicos o fsicos. Dichas clulas transformadas se caracterizan por un crecimiento autnomo y por

proliferar sin adherirse necesariamente a una matriz extracelular. Recientemente se determin que cuando se rompe el balance entre la proliferacin celular y la apoptosis, se puede facilitar el inicio y el desarrollo de una neoplasia (Guo y Hay, 1999). Las mutaciones que bloquean la muerte celular asociada con una proliferacin inadecuada, promueven el desarrollo del cncer (Evan y Littlewood, 1998; Lowe y Lin, 2000). Otra caracterstica importante de las clulas cancerosas es su inestabilidad genmica y su heterogeneidad cromosmica dentro de un tumor. Las clulas tumorales frecuentemente se apartan del cariotipo diploide normal o euploide, transformndose en anormal o aneuploide por prdida de cromosomas, deleciones o translocaciones recprocas de fragmentos cromosmicos, etc. Adems, un segmento de DNA se puede amplificar selectivamente dentro de algn cromosoma, o bien replicar en forma independiente del cromosoma. La amplificacin de segmentos de DNA de algn cromosoma puede aumentar el nmero de copias de protooncogenes o de otros genes de inters teraputico, tales como el de resistencia a mltiples drogas o mdr (del ingls multidrug resistance), localizado en estos segmentos; las translocaciones cromosmicas pueden activar protooncogenes y la prdida de regiones cromosmicas o de todo un cromosoma puede eliminar antioncogenes. Un defecto en las enzimas que participan en la replicacin del DNA, en la reparacin del dao al DNA (Koshland, 1994) o en las protenas del aparato mittico encargadas de la distribucin correcta de los cromosomas en las clulas hijas, as como un defecto en los puntos de control del ciclo celular, los cuales aseguran normalmente que la divisin celular no ocurra hasta que termine la replicacin del DNA y se repare cualquier regin daada, llevara a la

inestabilidad cromosmica y gentica observada en las clulas cancerosas (Sancar, 1994). El crecimiento de las clulas normales est regulado por factores de crecimiento o citocinas. No todos los factores de crecimiento estimulan la proliferacin celular. Por ejemplo, el factor de crecimiento tumoral de tipo (TGF-) inhibe el crecimiento de las clulas epiteliales. Un factor de crecimiento interesante es el vsculo endotelial (VEGF), que estimula la angiognesis (induccin y penetracin del tumor por capilares y vasos sanguneos mayores). La angiognesis mediada por el VEGF est asociada con inhibicin de la apoptosis y con el aumento de la expresin del gen bcl-2 (Nr y col., 1999). Los factores de crecimiento peptdicos interaccionan con receptores proteicos ubicados en la membrana celular. Los receptores de factores de crecimiento generalmente son protenas que atraviesan la membrana citoplasmtica; contienen un dominio extracelular al cual se une el factor de crecimiento y un dominio citoplasmtico que puede activarse y transmitir seales bioqumicas hacia el interior de la clula. El proceso por el cual la unin de un factor de crecimiento (o ligando) lleva a la activacin de una va intracelular, se conoce como transduccin de seales. Las clulas cancerosas pueden presentar alteraciones en la transduccin de seales, entre las que podemos citar la produccin de factores de crecimiento por las mismas clulas cancerosas o mutaciones en el receptor que permiten el crecimiento sin dichos factores. Por ejemplo, la secrecin de factores de crecimiento de fibroblastos y el factor de crecimiento vsculo endotelial por las clulas tumorales induce la proliferacin de clulas endoteliales y la angiognesis en el tumor (Folkman y Shing, 1992). Al ser la angiognesis una

etapa crtica para el crecimiento del tumor, varios grupos de investigacin estn trabajando para abatirla y lograr as importantes mtodos de terapia en cncer. Otras alteraciones en las vas de transduccin de seales presentadas por las clulas cancerosas provienen de mutaciones de los componentes citoplasmticos o nucleares que intervienen en dichas vas, incluyendo a los factores de transcripcin. La clula cancerosa difiere notablemente de una clula normal en los mecanismos involucrados tanto en apoptosis como en el avance del ciclo celular (Murray y Hunt, 1993), es decir, en la serie de eventos coordinados que involucran periodos sucesivos de replicacin del DNA y de divisin celular. En el ciclo celular podemos distinguir la fase G1, entre la mitosis (fase M) y la replicacin del DNA (fase S); despus de la fase de sntesis de DNA, tenemos la fase G2 y finalmente la fase M. En la fase G1 aumenta la masa y el volumen celular y se establecen los puntos de bloqueo o control negativo del ciclo celular. Es generalmente en la fase G1 cuando las clulas detienen su proliferacin y se retiran del ciclo celular; estas clulas, ahora en fase G0 pueden iniciar el proceso de diferenciacin celular; lo anterior puede inducirse en clulas normales al depletarlas de factores de crecimiento. Por el contrario, las clulas transformadas no entran a la fase G0 cuando se depletan de factores de crecimiento. Dos tipos de protenas son de gran importancia en la regulacin del ciclo celular: las ciclinas, que varan en concentracin durante el ciclo y las cinasas dependientes de ciclinas. Los factores de crecimiento activan la expresin de ciclinas necesarias para la transicin entre G1 y S (Sherr y Roberts, 1995). Algunas ciclinas pueden estar sobreexpresadas o alteradas estructuralmente en ciertas neoplasias (Hunter y Pines, 1994). Adems,

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algunos genes que codifican para inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas pueden estar alterados en cnceres humanos (Hunter y Pines, 1994; Grana y Reddy, 1995). Si el DNA celular sufre algn dao por un compuesto cancergeno, el ciclo celular se detiene hasta que se repara el dao; si el dao al DNA es muy grande y no se puede reparar, la clula sufre apoptosis (Thompson, 1995). La falta de apoptosis observada en ciertos tipos de clulas tumorales parece ser uno de los factores que se relaciona con su inestabilidad gentica, con su resistencia a frmacos quimioteraputicos y en parte, con el crecimiento del tumor. La transformacin celular bloquea con frecuencia la diferenciacin, con lo cual se inhiben ciertos grupos de genes al mismo tiempo que se activan otros. Las anormalidades en el proceso de diferenciacin que se observan en los tumores malignos pueden deberse tanto a las mutaciones que inducen el crecimiento celular, por ejemplo en oncogenes y en antioncogenes, como a mutaciones de algunos genes que en forma normal participan en los procesos de diferenciacin. En conclusin, el crecimiento de un tumor maligno es un proceso en el que una sucesin de cambios genticos dentro de la poblacin de clulas tumorales, lleva a la aparicin y evolucin de clulas cada vez ms malignas, las cuales crecen sin control y son resistentes a la apoptosis.

4.1 Protooncogenes, oncogenes y apoptosis

El descubrimiento de los protooncogenes (genes normales) y de los oncogenes (versiones alteradas de los protooncogenes) ha permitido explicar el cncer a

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nivel molecular. Los protooncogenes desempean funciones importantes para el crecimiento celular. Codifican para factores de crecimiento, receptores para dichos factores, transductores de seales y protenas nucleares que actan como factores de replicacin o de transcripcin, activando genes importantes en el crecimiento normal de la clula. Por ejemplo, las protenas de la familia Ras se localizan en la membrana citoplasmtica y participan en la transduccin de seales mitognicas. Por otro lado, la protena protooncognica Myc se localiza en el ncleo y participa en la regulacin de la transcripcin de muchos genes. Debido a que los oncogenes representan formas mutadas de genes celulares normales, ellos ofrecen una indicacin clara de los blancos genticos que se alteran por agentes cancergenos. Cuando los protooncogenes se alteran a nivel molecular, se transforman en oncogenes activados. Existen alrededor de 100 protooncogenes y sera difcil mencionar las caractersticas de cada uno de ellos en este captulo. Sin embargo, por su importancia en apoptosis se mencionarn algunas propiedades de c-myc, ras y bcl-2. Los oncogenes c-myc y ras cooperan en la transformacin celular y estn frecuentemente alterados en cncer. Tambin el gen bcl-2 coopera con c-myc y est implicado en algunas neoplasias. i) Gen c-myc. La expresin del gen c-myc depende de factores de crecimiento y aumenta con la entrada de las clulas al ciclo celular, sugiriendo que la expresin de este gen puede ser un componente de la proliferacin celular normal. La protena Myc interacciona con varias protenas (tales como Max) para controlar la transcripcin de algunos genes. Se ha determinado que una sobreexpresin de Myc lleva al cambio de los homodmeros Max-Max a

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heterodmeros Myc-Max, cambiando una represin gnica en una activacin (Dang y Lee, 1995). La protena c-Myc puede tambin inhibir la expresin de varios genes y se ha sugerido que esta actividad es importante para su funcin (Prendergast, 1999; Claassen y Hann, 1999; Pelengaris y col., 2000 ). Adems de participar en la transcripcin de genes que controlan el crecimiento celular, recientemente se ha determinado que c-myc induce apoptosis en fibroblastos crecidos sin suero o en otras clulas que estn bloqueadas en proliferacin por agentes qumicos o por citocinas antiproliferativas. Para que la protena Myc induzca apoptosis, requiere de la interaccin con la protena Max. Es posible que Myc tenga efectos proapoptticos directos, independientes de su funcin como factor transcripcional. Un estudio reciente demostr que Myc favorece la disociacin del citocromo c de la mitocondria (Juin y col., 1999). El balance entre proliferacin y apoptosis en la carcinognesis inducida por myc reviste gran importancia bsica (Prendergast, 1999; Claassen y Hann, 1999; Pelengaris y col., 2000; Juin y col.,1999; Jamerson y col., 2000) y clnica, ya que este gen se encuentra alterado en varios cnceres humanos (Dang y Lee, 1995). ii) Gen ras. Otro oncogn muy importante en el desarrollo del cncer humano es ras. Desde hace varios aos se sabe que la protena Ras acta como transductora de seales del exterior al interior de la clula. La activacin de receptores con actividad de tirosina cinasa, tales como aquellos para el factor de crecimiento epidermal (EGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), la insulina o el factor de crecimiento neuronal (NGF), transforma el complejo inactivo de GDP-Ras en el complejo activo GTP-Ras. Esta activacin es precedida de la autofosforilacin del receptor y de la

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asociacin del receptor fosforilado con protenas del citoplasma (protena adaptadora Grb 2 y el factor de intercambio de nucletidos Sos). Otras protenas regulatorias, adems de Sos, que favorecen el reemplazo del GDP unido a Ras por GTP, son las activadoras de GTPasas que estimulan la hidrlisis del GTP unido a Ras, transformndolo en GDP-Ras. Las seales transmitidas por Ras-GTP aumentan la actividad de molculas efectoras de Ras, tales como la cinasa Raf especfica de serinas y treoninas (Fig. 1). Esta a su vez activa las cinasas MEK1 y 2, las cuales hacen lo mismo con las cinasas ERK1 y 2 (estas son tambin conocidas como MAPKs). Las ERKs fosforilan blancos citoplasmticos que se translocan al ncleo y finalmente llevan a una estimulacin de varios factores de transcripcin. La activacin de Ras y de la va Raf-MAPK puede tener efectos positivos o negativos sobre la apoptosis, dependiendo del grado de activacin (Frame y Balmain, 2000; Perez y Rebollo, 1999; Rebollo y Martinez, 1999). Una estimulacin de la va PI3K/PKB (del ingls phosphatidyl inositol 3 kinase/protein kinase B) inhibe consistentemente la apoptosis de diversos tipos celulares (Fig. 1). Se ha demostrado que PKB puede inhibir la apoptosis de clulas epiteliales (Khwaja y col., 1997) y tambin la inducida en fibroblastos por la sobreexpresin del gen c-myc (Kauffmann y col., 1997). Es posible que Bad (Del Peso y col., 1997) y el factor nuclear kB (NF-B) sean los sustratos de PKB que median este efecto. De gran inters es la observacin que indica que PKB se asocia, fosforila e inactiva a IKK (un represor de NF-B). Esto lleva a que se active el factor transcripcional antiapopttico NF-B y se transloque al ncleo celular (Ozes y col.,1999). Adicionalmente, la forma activa de PI3K, o

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incluso PKB, pueden fosforilar y activar a NF-kB (Sizemore y col., 1999). Estos datos definen una va por la cual actan diversas cinasas a travs de Ras para controlar el crecimiento y la diferenciacin celular, as como la apoptosis y su conocimiento estn permitiendo el desarrollo de formas ms efectivas de terapias contra el cncer. iii) Gen bcl-2. La familia de protenas Bcl-2, que est formada por miembros antiapoptticos (como Bcl-2 y Bcl-XL) y proapoptticos (como Bax), determina la vida o la muerte de una clula al controlar la liberacin de factores apoptognicos de la mitocondria (Rsujimoto y Shimizu, 2000), tales como citocromo c y el factor inductor de la apoptosis o AIF (del ingls, apoptosisinducing factor). Estos factores activan una serie de proteasas llamadas caspasas, las cuales son molculas efectoras claves en apoptosis y existen como precursoras inactivos en nuestras clulas. La activacin de las caspasas puede ser regulada por molculas tales como los miembros de la familia Bcl-2, FADD, APAF-1, FLIP e IAPs (Ekert y col., 1999). Con relacin a la liberacin del citocromo c de la mitocondria, se han propuesto varios modelos que incluyen la ruptura de la membrana mitocondrial externa o la formacin de un canal especfico. Una sobreexpresin del gen bcl-2, que codifica la protena citoplasmtica Bcl-2 de 26 kDa, confiere resistencia a la apoptosis en diversos tipos celulares. El mecanismo relacionado con dicha resistencia incluye, al parecer, un cambio en el potencial redox de la clula hacia un estado ms reducido. Este mecanismo est de acuerdo con los estudios que relacionan las etapas iniciales de la apoptosis con la exposicin de las clulas a especies reactivas de oxgeno. Las observaciones anteriores pueden tener gran utilidad en terapia, usando precursores de drogas citotxicas que requieren

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condiciones reductoras para activarse (Cortazzo y Schor, 1996). La expresin del gen bcl-2 es abundante en diversos tumores, contribuyendo a la oncognesis al extender la viabilidad de las clulas malignas, lo cual favorece la inestabilidad genmica. Esta sobreexpresin del gen bcl-2 puede deberse a alteraciones en p53, ya que normalmente bcl-2 se encuentra reprimido por dicha protena antioncognica. Como vimos antes, la protena c-Myc induce apoptosis bajo ciertas condiciones, pero sta puede ser suprimida por un exceso de Bcl-2. Al parecer, el efecto oncognico cooperador de Bcl-2 sobre cMyc se debe a la actividad antiapopttica de Bcl-2. Aqu no debemos olvidar que Myc favorece la liberacin del citocromo c de la mitocondria (Juin y col., 1999) y que Bcl-2 hace lo contrario (Reed, 1998). Bcl-2 puede tambin suprimir la apoptosis inducida por protenas supresoras de tumor, tales como p53. Lo anterior sugiere que Bcl-2 puede contribuir a la oncognesis al suprimir la apoptosis inducida por oncogenes o por antioncogenes. Tambin es posible que Bcl-2 tenga una doble funcin: facilitar la proliferacin celular y suprimir la apoptosis. La familia de protenas relacionadas estructuralmente, que regula la respuesta apopttica frente a diversos estmulos en diferentes tipos celulares, se localiza en el citoplasma; sus miembros tienen una secuencia de aminocidos similar y funcionan como agonistas o antagonistas de la apoptosis. Por ejemplo, una sobreexpresin de Bax lleva a la apoptosis de ciertas clulas, mientras que Bcl-2 o Bcl-XL tienden a inhibirla. Estas protenas forman homodmeros o heterodmeros con miembros de la misma familia, y la decisin celular para presentar apoptosis depende de la proporcin entre protenas con distinta actividad. En este sentido, ha sido interesante observar

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que la protena p53 activa la expresin del gen bax al unirse a su regin promotora, con lo cual se favorece la apoptosis dependiente de p53.

4.2 Apoptosis y genes supresores de tumores

La fusin entre clulas normales y tumorales indica la existencia de genes que regulan negativamente el crecimiento celular. La clula hbrida pierde el carcter tumoral, sugiriendo que a la clula neoplsica le falta un gen regulador del crecimiento y que es posible recuperar dicho control al fusionarla con una clula normal. Estos genes de regulacin negativa del crecimiento se llaman genes supresores de tumores o antioncogenes y los ms estudiados en este momento son los genes retinoblastoma (rb) y p53. Adems de la reconocida importancia de las protenas codificadas por estos antioncogenes en el control negativo del ciclo celular, en los ltimos aos se ha reportado que ambas protenas participan activamente en apoptosis. i) Gen rb. El producto del gen rb es una fosfoprotena nuclear de 105110 kDa (pRb) que controla negativamente el ciclo celular al unirse e inactivar factores de transcripcin, tales como E2F, los cuales controlan la expresin de numerosos genes involucrados en proliferacin celular y en apoptosis. La actividad de pRb es inhibida por fosforilacin inducida por cinasas dependientes de ciclinas (cdks). A su vez, las cdks son reguladas por inhibidores que se comportan como reguladores negativos de la proliferacin celular. Adems de controlar el ciclo celular, pRb favorece la diferenciacin de las clulas en tejidos del adulto y durante el desarrollo embrionario. Tambin, se ha observado que pRb puede aumentar la inmunogenicidad de las

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clulas tumorales, disminuir la angiognesis y suprimir la invasividad del tumor. Sin embargo, contrario a lo que se espera del producto de un antioncogn, pRb es una protena antiapopttica, en parte debido al bloqueo de E2F-1 (DeGregori y col., 1997). La prdida de funcin del gen rb se ha relacionado con la progresin de varios cnceres humanos comunes, tales como el de vejiga, pulmn, prstata y mamario. Sin embargo, si se reemplaza el gen rb defectuoso en clulas tumorales obtenidas de distintos tipos de neoplasias, por el gen rb normal, estas clulas suprimen su actividad tumorignica en ratones desnudos (inmunosuprimidos). Esta observacin, junto con reportes recientes que indican la posibilidad de revertir el fenotipo maligno mediante la correccin de defectos en un antioncogn en tumores que presentan mltiples alteraciones genticas, representa una esperanza en el campo de la terapia gnica del cncer (Li y col., 1996). Adicionalmente, se ha reportado que una forma de pRb que carece del extremo N-terminal (112 aminocidos ausentes), llamada pRb, presenta una velocidad de recambio bastante menor que pRb silvestre y la tendencia a permanecer en su forma hipofosforilada en las clulas tumorales, es decir, en su forma activa. Lo interesante es que esta protena ejerce una actividad supresora de tumor ms potente comparada con pRb de largo normal (110 kDa) (Xu, y col., 1996) y por lo tanto, representa un buen candidato para los protocolos de terapia gnica del cncer. Sera importante la obtencin de mutantes de pRb que posean una actividad antiapopttica reducida, sin cambiar sus propiedades supresoras de tumor. Hace poco se determin que tanto pRb como E2F-1 tienen propiedades adicionales a las mencionadas. En particular pRb posee funciones

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independientes de E2F, que se basan en la capacidad de pRb para inducir diferenciacin celular (Lipinski y Jacks, 1999). Las vas controladas por p53 y por pRb estn conectadas (Guo y Hay, 1999; Yap y col., 1999;Cordon, 1995) y E2F-1 es el nico miembro de la familia de factores E2F que puede inducir apoptosis y proliferacin celular (Guo y Hay, 1999; DeGregori y col.,1997). Es decir, puede actuar como antioncogn y como oncogn, respectivamente. Por la importancia de la va pRb-E2F en el control del crecimiento y de la apoptosis, varios laboratorios la han tomado en cuenta en el diseo de protocolos de terapia gnica del cncer. ii) Gen p53. El antioncogn p53 est localizado en el brazo corto del cromosoma 17 y contiene 11 exones que codifican para 393 aminocidos. Se le ha clasificado como supresor de tumores, ya que detiene o revierte el crecimiento descontrolado de una clula transformada y adems, favorece la apoptosis de dichas clulas. La protena p53 es una fosfoprotena nuclear capaz de reconocer una secuencia especfica de DNA y actuar como factor de transcripcin. Una propiedad importante de esta protena antioncognica es su afinidad por protenas virales oncognicas como: el antgeno T grande codificado por el virus SV40, la oncoprotena E1B de adenovirus y la protena E6 de los papilomavirus humanos (HPV) de alto riesgo (Tommasino y Crawford, 1995). La protena p53 participa en la respuesta celular al dao gentico, al menos de dos formas diferentes: i) deteniendo el ciclo celular en la fase G1, lo cual permite que se repare el DNA antes de que se replique y ii) induciendo la apoptosis cuando el dao gentico ha sido muy importante y ya no se puede reparar (Fig. 2). En este caso la concentracin de p53 se mantiene elevada por

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bastante tiempo. Adems, la protena p53 participa directamente en el mantenimiento de la estabilidad genmica; su funcin como "guardin del genoma" es inhibida o destruida por deleciones, inserciones y mutaciones puntuales, en el gen que la codifica as como por la formacin de complejos inactivos con protenas endgenas o con oncoprotenas virales. As, con p53 mutado se inhiben ciertas formas de apoptosis y se permite la proliferacin de clulas defectuosas que favorecen la aparicin de una neoplasia. Por ejemplo, ratones "knock-out" que carecen de p53 son muy susceptibles al desarrollo de diversos tumores espontneos; asimismo, pacientes que presentan el sndrome de LiFraumeni al heredar un alelo mutado de p53, estn predispuestos al desarrollo de algn tipo de cncer. Ms del 50% de todos los tumores malignos humanos presentan mutaciones en p53, que se concentran en cuatro regiones de la protena y coinciden con las cuatro regiones ms conservadas entre las especies. Cuando algn agente genotxico daa al DNA, aumenta la concentracin intracelular de p53, lo cual induce detencin del ciclo celular y ya sea reparacin del DNA o apoptosis (Fig. 2) (Cox y Lane, 1995). En general, este efecto inhibitorio del ciclo celular se debe a la actuacin de p53 como regulador transcripcional de un nmero importante de genes (Levine y col.,1991). Por ejemplo, p53 induce la expresin de genes relacionados con el control negativo del crecimiento celular, como el gen p21 waf1/cip1 que codifica un inhibidor de las cdks de 21 kDa. Existe otro punto de inhibicin del ciclo celular entre la fase G2 y M que es tambin controlado por p53. Se ha observado que p53 reconoce sitios en los que el DNA est daado y forma complejos con ellos, con lo cual probablemente se aumente la

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afinidad de dichos sitios por las protenas involucradas en la reparacin del DNA (Lee y col., 1995; Jayaraman y Prives, 1995). La interaccin de p53 con el DNA daado parece que de alguna forma activa la transcripcin de genes tales como gadd45, mdm2 o p21 waf1/cip1, importantes en reparacin del DNA o como vimos anteriormente, en la inhibicin del ciclo celular. En conclusin, p53 es un factor transcripcional muy importante tanto para la regulacin del ciclo y proliferacin celular como para la regulacin de los mecanismos de apoptosis (Wang, 1999; Arrowsmith, 1999; May y May, 1999). Su ausencia o funcionamiento deficiente favorece el desarrollo del cncer. La posibilidad de disear mtodos exitosos de terapia gnica empleando antioncogenes tales como rb o p53 es de enorme importancia en medicina.

4.3 Mecanismos de apoptosis

Existen varias vas que pueden conducir a la apoptosis y en cada una de ellas se han estudiado protenas tanto comunes como especficas. La va apopttica ms estudiada es la que involucra a los "receptores de muerte" e incluye al receptor del factor de necrosis tumoral o TNFR (del ingls tumor necrosis factor receptor) y a Fas/CD95 (Ashkenazi y Dixit, 1998). Despus de unirse con el ligando TNF- (tumor necrosis alpha factor), el TNFR se trimeriza, formndose un complejo con molculas tales como TRADD, que favorecen la transduccin de seales. A su vez TRADD favorece la unin de FADD, lo que lleva a apoptosis al activarse la proteasa caspasa-8 (Ashkenazi y Dixit, 1998). La caspasa-8 activada inicia una cascada proteoltica que incrementa la apoptosis. Tambin TRADD puede asociarse con RIP y con TRAF-2, lo que

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lleva a la activacin de NF-B y a inhibicin de la apoptosis (Takeuchi y col., 1996). Por otro lado, el receptor Fas/CD95, miembro de la familia del TNFR, induce apoptosis en distintos tipos celulares, incluyendo a los queratinocitos humanos (Scaffidi y col., 1998). Al unirse CD95 a su ligando (CD95L), se favorece la interaccin con FADD y a su vez con la procaspasa-8, con lo cual se inicia una cascada proteoltica que lleva a la apoptosis (Muzio y col., 1998). En algunas ocasiones esta va favorece la liberacin de citocromo c de la mitocondria (Scaffidi y col., 1998). El citocromo c citoslico puede interaccionar con Apaf-1 y con la procaspasa-9 para iniciar una cascada de proteasas similar a la mencionada anteriormente (Srinivasula y col., 1998). Dado que la protena oncognica Bcl-2 inhibe la liberacin del citocromo c de la mitocondria, una sobreexpresin del gen bcl-2 (observada en diversas neoplasias) inhibe apoptosis y favorece el desarrollo del cncer. Es importante mencionar que la protena antioncognica proapopttica p53 activa la transcripcin de Fas/CD95 (Fig. 2) (Owen-Schaub y col., 1995; Muller y col., 1998). Adems, p53 promueve el transporte de CD95 del citoplasma a la superficie celular (Bennett y col.,1998). La induccin de la apoptosis por c-Myc puede deberse en parte a la activacin que esta protena oncognica ejerce sobre la expresin de p53 (Reisman y col., 1993; Yu y col., 1997). En todo caso, se ha demostrado que la induccin de la apoptosis por c-Myc requiere de la va Fas/CD95 (Hueber y col., 1997). Aqu es importante sealar que la protena p19Arf regula un punto de control, dependiente de p53, que protege a las clulas de seales oncognicas hiperproliferativas (en este caso c-Myc activada), induciendo la apoptosis (Fig. 3) (Zindy y col., 1998).

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Por ltimo, es interesante mencionar que la va que activa la oncoprotena Ras y la cascada de cinasas que involucra a la PI3K y a la cinasa PKB/Akt (Fig. 1) lleva a la inactivacin por fosforilacin de molculas proapoptticas, tales como Bad y caspasa-9 (Cardone y col., 1998), con lo cual se abate la apoptosis. De gran inters ha sido encontrar que Bad inhibe Bcl-2 (Fig. 1) y que cuando se inactiva Bad por fosforilacin se aumenta la actividad de la protena antiapopttica Bcl-2, favorecindose el desarrollo del cncer (Chao y Korsmeyer, 1998). Estas vas apoptticas, aunque parecen algo complicadas en este momento, ofrecern alternativas muy interesantes para el diseo de estrategias teraputicas.

4.4 Carcinognesis en etapas mltiples e inhibicin de la apoptosis

Como hemos visto, el desarrollo de una neoplasia en humanos es un proceso complejo de etapas mltiples, que convierte en forma gradual una clula normal en una maligna, la cual presenta defectos tanto en los mecanismos de apoptosis como en sus propiedades de crecimiento. Se acepta cada vez ms que el cncer se desarrolla en un proceso evolutivo que est conducido por mutaciones de genes celulares seguido de seleccin clonal de la progenie variante, presentando propiedades de crecimiento cada vez ms agresivas y que responde menos a los diversos esquemas teraputicos. Como se mencion anteriormente, estas mutaciones afectan a protooncogenes y a genes supresores de tumor. La epidemiologa ha ofrecido evidencias importantes sobre el desarrollo del cncer en etapas, ya que cada etapa histopatolgica en el desarrollo de un

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carcinoma requiere de varios aos y el proceso total entre la lesin inicial y la aparicin del tumor puede tomar largo tiempo, aumentando con la edad el riesgo para contraer la mayora de las neoplasias (Pike y Forman, 1991). Una de las primeras observaciones que llev al concepto del desarrollo del cncer en etapas mltiples se logr con virus oncognicos (Rassoulzadegan y col., 1982) y un buen ejemplo de esto lo encontramos en el caso de los HPV, que poseen los oncogenes E6 y E7 (May y May, 1999). Cada oncogn se especializa para inducir una parte de los fenotipos requeridos en la transformacin maligna total. Este concepto fue luego extendido a un buen nmero de los oncogenes de origen celular. En tumores de piel inducidos experimentalmente en ratones tratados por agentes iniciadores (mutgenos como el benzopireno o el DMBA) y agentes promotores (como el TPA u otros steres de forbol) (Brown y Balmain, 1995) se ha sugerido que varias alteraciones genticas son necesarias para convertir queratinocitos normales en clulas capaces de formar carcinomas epiteliales escamosos. Una demostracin ms directa de la importancia de las mutaciones en mltiples genes en carcinognesis ha sido obtenida usando oncogenes clonados. De suma importancia han sido los experimentos que revelaron que ciertos pares de oncogenes (tales como ras y myc) podan colaborar eficientemente en la transformacin celular (Land y col., 1983). En estos experimentos, ni el oncogn ras ni myc por separado, son capaces de inducir una transformacin completa. Como hemos mencionado, la protena c-Myc favorece proliferacin y apoptosis y la protena Ras se encargara de inhibir dicha apoptosis, favoreciendo la transformacin maligna. Esto sugiere que ciertos pasos en

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tumorignesis pueden representar mutaciones sucesivas de algunos protooncogenes. En modelos transgnicos de carcinognesis, tambin se ha observado la cooperacin entre oncogenes; por ejemplo, ratones transgnicos para c-myc bajo el control del promotor del virus de tumor mamario de ratn o MMTV (del ingls mouse mammary tumor virus) produjeron algunos tumores mamarios que pudieron ser detectados cuando los ratones tenan ms de 3-4 meses de edad (Sinn y col., 1987). Estos tumores aparecieron slo en regiones bien especficas del tejido mamario, a pesar de que el gen c-myc se expres abundantemente en todas las clulas del epitelio mamario, produciendo incluso frecuentes regiones hiperplsicas. No hay duda que el gen c-myc, a pesar de predisponer este tejido al desarrollo de neoplasia, no puede por s solo causar cncer mamario. Adems, no debemos olvidar que la protena c-Myc favorece la apoptosis y as difcilmente se puede originar un tumor maligno. Cuando ratones transgnicos para MMTV-myc se cruzan con ratones transgnicos para MMTV-ras, los descendientes presentaron formacin de tumores a mayor velocidad y frecuencia, comparado con los padres (Sinn y col., 1987). Este experimento sugiere nuevamente que las actividades complementarias de dos oncogenes diferentes cooperan para crear clulas tumorignicas. Es posible que uno de los genes cooperadores active el ciclo celular y el otro inhiba los procesos apoptticos. El descubrimiento de la colaboracin entre oncogenes ayuda a entender el mecanismo de la carcinognesis en etapas mltiples. Basndonos en dicha colaboracin, debemos pensar que cada paso en el proceso de tumorignesis refleja una mutacin que lleva a la activacin de uno u otro oncogn celular, o a la inactivacin de genes supresores de tumor. Estos

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genes supresores de tumor tambin juegan un importante papel en el desarrollo, en etapas mltiples, de un carcinoma. Por ejemplo, ratones "knock out" para p53 (o sea que ambos alelos del gen p53 son defectuosos) presentan diversos tipos de tumores a edad temprana. Existen varias explicaciones para la cooperacin entre oncogenes; por ejemplo, oncogenes como ras inducen transformacin morfolgica e independencia de anclaje, pero no afectan el proceso de inmortalizacin celular. Por el contrario, oncogenes como c-myc no inducen independencia de anclaje pero llevan a inmortalizacin. Los genes que funcionan como ras (colaborando con myc) codifican para protenas citoplasmticas, en tanto que aquellos que funcionan como myc (colaborando con ras) codifican para protenas nucleares. Esto sugiere que una parte del desarrollo del proceso maligno tiene que ver con fenmenos que ocurren en el citoplasma y otra parte con eventos nucleares. Otro modelo fisiolgico alternativo de colaboracin entre oncogenes se relaciona con apoptosis (Harrington y col., 1994); por ejemplo, se ha determinado que varios oncogenes, incluyendo c-myc, el oncogen E7 de HPV y E1A, favorecen la apoptosis, lo cual implicara un efecto contrario al crecimiento tumoral. Sin embargo, en presencia de un segundo oncogn (como ras o como el oncogn E6 de HPV) se revierte la tendencia hacia apoptosis (Lin y col., 1995). Es decir, la cooperacin entre oncogenes llevara tanto a un aumento en proliferacin como a una disminucin en apoptosis. Evidencia a favor del modelo de carcinognesis en etapas mltiples ha sido obtenida en humanos, mediante anlisis gentico de poblaciones celulares premalignas y malignas en cncer de colon (Vogelstein y Kinsler, 1993). En el

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desarrollo de este carcinoma, y probablemente en cualquier neoplasia, participan varios oncogenes y antioncogenes. Una disminucin de la apoptosis o la inmortalizacin celular podran ser tan importantes para la progresin tumoral como lo es la inactivacin de genes relacionados con la estabilidad genmica. Ms del 90% de las clulas cancerosas estudiadas hasta ahora logran la inmortalizacin mediante la induccin de la telomerasa, enzima capaz de mantener el largo de los telmeros que normalmente se acortan durante la replicacin del DNA (Harley y Villeponteau, 1995; Blasco y col., 1995). En presencia de la telomerasa, las clulas cancerosas son capaces de mantener el largo de los telmeros, asegurando la integridad de los cromosomas, evitando la crisis y la muerte celular (o sea, alcanzando un fenotipo inmortal). Al parecer, la represin del gen de la telomerasa en clulas normales y su activacin durante las etapas tardas de la tumorignesis, podra representar un paso importante en la carcinognesis. Apoyando esta idea, se ha encontrado que una sobreexpresin de la subunidad cataltica de la telomerasa (hTERT) y de H-ras, junto con el antgeno T grande de SV40, lleva a la conversin tumorignica, tanto de fibroblastos como de clulas epiteliales humanas (Hahn y col., 1999a). Estos resultados indican que un aumento en la actividad de ras y de la telomerasa, en conjunto con la inhibicin de p53 y pRb causada por el antgeno T de SV40, son suficientes para crear una clula cancerosa humana (Hahn y col., 1999a). Dado que en la mayora de las neoplasias se expresa la telomerasa, con lo cual se estabiliza el largo de los telmeros, se ha observado que la inhibicin de esta enzima limita el crecimiento tumoral, lo cual puede ser otra magnfica estrategia en la terapia del cncer humano (Hahn y col., 1999b). Como vimos

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antes, la angiognesis mediada por VEGF se asocia con la inhibicin de la apoptosis y tambin juega un papel crucial durante el crecimiento tumoral en etapas mltiples. Las clulas malignas secretan factores angiognicos que activan a las clulas endoteliales de los tejidos vecinos e inducen la formacin de nuevos capilares dentro del tejido tumoral (Rak y col., 1995). Es posible que la anoxia sea el estmulo que causa la liberacin de los factores angiognicos; una alta densidad de vascularizacin est relacionada con un nmero reducido de regiones necrticas y posiblemente con una tendencia a desarrollar metstasis. Tanto invasin como metstasis son dos procesos muy complejos que involucran la actividad de varios genes; por ejemplo p53 induce la expresin de genes que codifican para protenas antiangiognicas potentes (Dameron y col., 1994). Las mutaciones frecuentes encontradas en p53 evidentemente favorecen la angiognesis; mutaciones que activan al gen ras inducen la expresin del VEGF (Grugel y col., 1995). Con respecto a la metstasis, existen genes tales como nm23-H1, cuyo producto controla negativamente este proceso durante la carcinognesis en etapas mltiples (Steeg y col., 1988).

4.5 HPV, apoptosis y cncer

Algunos virus pueden contribuir al desarrollo de tumores humanos usando diferentes mecanismos que van desde la estimulacin de la proliferacin celular e inhibicin de la apoptosis, hasta la inmunosupresin. Sin embargo, la infeccin con estos virus no es suficiente para inducir neoplasias. Los largos perodos de latencia (varias dcadas) entre la infeccin y el desarrollo de un

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carcinoma, el bajo porcentaje del total de individuos infectados que desarrollan cncer, as como diversos datos experimentales, sugieren que se necesitan otros factores para que se origine un tumor maligno despus de la infeccin viral. Por ejemplo, algunos tipos de HPV son considerados como factores de riesgo en cncer genital, pero se necesita la alteracin de oncogenes celulares, de antioncogenes y de otros genes para que se desarrolle un cncer genital francamente invasor (Zur Hausen, 1991; Gariglio y Rangel, 1992). La regin temprana de los HPVs de alto riesgo codifica para las protenas oncognicas E6 y E7, para protenas que se necesitan en la replicacin del genoma viral y para una protena (E2) que acta como represor de la transcripcin de los oncogenes virales (E6, E7) (Guido y col., 1992). Las oncoprotenas virales E6 y E7 interactan y destruyen la actividad de las protenas antioncognicas p53 y pRb, respectivamente (Zur Hausen, 1991; Gariglio y Rangel, 1992). La inhibicin de p53 abate la apoptosis (Wang, 1999; Arrowsmith, 1999; May y May, 1999), altera la estructura superior de la cromatina (Aranda y col., 1999) y causa inestabilidad genmica (Wani y col. 2000; Agarwal y col., 1998; Hidalgo y col., 2000), la cual conducira a la alteracin de diversos genes implicados en cncer.

4.6 Sistema inmune, apoptosis y neoplasia

Considerando la diversidad antignica de las neoplasias, es explicable que los componentes humoral y celular de la respuesta inmune, jueguen diferentes papeles en la destruccin de clulas malignas originadas en distintos tejidos del organismo. Tradicionalmente se ha considerado a la inmunidad celular como la

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responsable de vigilar el desarrollo tumoral; sin embargo, debe ser la armnica funcin de las diferentes poblaciones de linfocitos, macrfagos, clulas presentadoras de antgenos, las numerosas citocinas producidas tanto por las clulas tumorales como por las clulas del sistema inmune y el adecuado reconocimiento de las molculas antignicas tumorales, las que en conjunto hacen eficiente a la respuesta inmune. Una respuesta inmune eficiente est basada en parte en los mecanismos que controlan la proliferacin, activacin y apoptosis de las clulas efectoras del sistema inmune. El control negativo del crecimiento de los tumores por el sistema inmune parece ser primariamente mediado por clulas efectoras, principalmente linfocitos T citotxicos o LTC CD8+; tambin los linfocitos T cooperadores (Th) CD4+, en conjunto con macrfagos y otras clulas, son efectores importantes que amplifican la respuesta de los LTC. El crecimiento progresivo de los tumores en presencia de la respuesta inmune sugiere que frecuentemente el tumor escapa al reconocimiento por los LTC o que la actividad de estos ltimos es incapaz de controlar dicho crecimiento. Existen varios mecanismos por los que el tumor evade el control inmunolgico. Por ejemplo, se ha reportado la secrecin de molculas por la clula neoplsica, que reprimen la inmunidad celular antitumoral y que incluso pueden inducir la apoptosis en linfocitos T citotxicos (O'Connell y col., 1998; Bennett y col., 1998; Marincola y col., 2000). Diversas observaciones sugieren que hay diferencias clnicas tiles entre clulas normales y malignas que pueden ser detectadas por el sistema inmune, llevando incluso a la remisin espontnea de cnceres humanos. El estudio de los mecanismos que controlan la apoptosis de las clulas efectoras del sistema

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inmune en relacin con el cncer es extenso y en este momento est siendo abordado por muchos onclogos e inmunlogos moleculares. El diseo y aplicacin frecuente de estrategias de inmunoterapia del cncer, indica un futuro muy prometedor en este campo de la Oncologa Molecular.

5. CONCLUSIONES

En el cncer humano intervienen y cooperan muchos genes que regulan la proliferacin, la diferenciacin y la apoptosis de las clulas neoplsicas. En los ltimos aos se ha logrado un gran avance que permite entender las bases moleculares de esta enfermedad y el funcionamiento de dichos genes. El descubrimiento de los protooncogenes, oncogenes y antioncogenes, as como el hallazgo de que ellos participan en la apoptosis, est llevando al diseo de mejores mtodos de prevencin, diagnstico y terapia del cncer. En este momento, la mayora de los protocolos de terapia gnica del cncer humano deben tomar en cuenta las bases moleculares de la apoptosis. Dado que en general la maquinaria celular que controla las distintas vas apoptticas se encuentra intacta, los onclogos moleculares estn diseando estrategias que permitan la utilizacin ptima o el desbloqueo de dichas vas para inducir la apoptosis de las clulas tumorales.

AGRADECIMIENTOS

Quisiera agradecer el apoyo y valiosa colaboracin de Rodolfo Ocadiz (Wilox) , Enrique Garca y Alberto Marroqun.

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ABREVIATURAS

Cacu Cncer crvico uterino. EGF HPV LTC Factor de crecimiento epidermal. Oncogenes de los papilomavirus humanos. Linfocitos T citotxicos.

MMTV Virus de tumor mamario de ratn. NGF Factor de crecimiento neuronal. PDGF Factor de crecimiento derivado de plaquetas. TGF Factor de crecimiento tumoral.

VEGF Vsculo endotelial.

BIBLIOGRAFA

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PIE DE FIGURAS Y TABLA

Fig. 1. Regulacin de la apoptosis por la protena oncognica Ras. Frecuentemente la activacin de Ras conduce a una inactivacin de las caspasas y a la inhibicin de la apoptosis en clulas susceptibles. Se

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esquematizan las vas antiapoptticas ms estudiadas: PI3K/PKB; Raf/ERK y la va NF-B. En algunas clulas y bajo ciertas condiciones, ERK puede estimular la apoptosis. La protena Bad es inactivada por fosforilacin; en su forma activa (desfosforilada) es un potente inhibidor de la oncoprotena antiapopttica Bcl-2.

Fig 2. La protena antioncognica p53 favorece la apoptosis. La protena p53 juega un papel central en la induccin de la apoptosis cuando una clula presenta intenso dao genmico que no puede ser reparado. Actuando como factor transcripcional, p53 activa la expresin de varias protenas que participan en bloqueo del ciclo celular (p21), reparacin del dao genmico (GADD45) o induccin de la apoptosis (Bax, FasL, Fas/CD95). Adems, p53 inhibe normalmente la expresin de la protena antiapopttica Bcl-2 y favorece el transporte de CD95/Fas del citoplasma a la membrana celular, lo cual favorece la apoptosis. Mutaciones en p53 (o inactivacin de p53 por protenas oncognicas celulares o virales, como Mdm2 o E6, respectivamente) alteran las respuestas indicadas, llevando a reduccin de la apoptosis y a la inestabilidad genmica, lo cual favorece el desarrollo de una neoplasia.

Fig. 3. La protena p19arf es inducida por oncogenes y estabiliza a p53. La decisin celular entre proliferacin y apoptosis est controlada por protenas tales como p19Arf (equivalente a p14Arf en humanos). Esta protena secuestra a Mdm2 que normalmente facilita la destruccin de p53; es decir, p19Arf aumenta la vida media y la actividad de p53. A su vez, la expresin de p19Arf es inducida por oncogenes como myc, ras o incluso e2F. As, una oncoprotena como c-Myc favorece la apoptosis en clulas que tienen p53 silvestre, pero

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transforma clulas que poseen mutaciones en p53. Se indica adems el efecto inhibitorio de E6 sobre p53 y de E7 sobre Mdm2 y sobre pRb.

Tabla 1. Nmero de artculos y genes frecuentemente estudiados en Oncologa Molecular 1990 myc ras bcl-2 p53 rb 788 998 61 226 375 1999 902 1,918 1,564 3,385 615 Total 11,320 17,770 6,348 17,605 9,320 > 60,000 HPV 480 826 8,036

Nmero de artculos relacionados con el gen (o el virus HPV) que indica, en el ao sealado, el total de publicaciones hasta mayo del 2000. Puede apreciarse que en los prximos das, ras dejar de ser el gen sobre el cual se ha publicado ms en el campo de la Oncologa Molecular.

Captulo 9 Vacunas contra virus de papiloma humano Alejandro Garca Carranc 1,2.
1

Departamento de Biologa Molecular, Instituto de Investigaciones Biomdicas, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Mxico, D.F.

Divisin de Investigacin, Instituto Nacional de Cancerologa, Mxico, D.F.

Email: carranca@servidor.unam.mx PALABRAS CLAVE: virus, papiloma humano, vacunas, VLP's y E2.

NDICE 1. El cncer crvico uterino y los virus de papiloma humano. 1.1 Generalidades. 1.2 Diversidad de los HPV. 1.3 Organizacin general del genoma viral. 1.4 Los genes L1 y L2 y las protenas de la cpside. 1.5 Los oncogenes E6 y E7. 1.6 El regulador transcripcional E2. 2. Objetivos del captulo 3. Vacunas contra virus de papiloma humano. 3.1 Vacunas profilcticas. 3.1.1 Las partculas pseudo-virales (VLPs). 3.1.2 Las partculas pseudo-virales quimricas (cVLPs). 3.2 Vacunas teraputicas. 3.2.1 Modulacin de la respuesta inmune. 3.2.2 Inhibicin de oncogenes virales e induccin de apoptosis.

3.3 Las vacunas de ADN. 4. Perspectivas. Abreviaturas. Bibliografa.

1. EL CNCER CRVICO UTERINO Y LOS VIRUS DE PAPILOMA HUMANO

1.1 Generalidades

El Cncer Crvico-Uterino (CaCU) representa an la primera causa de muerte por tumores malignos en las mujeres mexicanas. A partir de la dcada de los 90, las neoplasias constituyen en Mxico la segunda causa de muerte en la poblacin general y la primera entre las mujeres mayores de 25 aos. A pesar de que el CaCU es una enfermedad que puede ser prevenida mediante el examen regular del exudado crvico vaginal, conocido como prueba de Papanicolaou, este padecimiento representa an la neoplasia ms frecuente entre las mujeres de muchos pases en vas de desarrollo. En la actualidad, la etiologa del CaCU est muy bien definida ya que numerosos estudios epidemiolgicos, clnicos y moleculares han permitido establecer que el factor de riesgo ms importante para desarrollar esta enfermedad lo constituyen las infecciones persistentes por algunos tipos de virus de papiloma humano (HPV). Hoy en da se consideran a las infecciones por estos virus como una causa necesaria para la aparicin de lesiones precursoras que

muchos aos despus podrn producir un tumor maligno, el cual, si no es detectado de manera temprana, terminar posiblemente con la vida de la mujer.

Los HPV constituyen un grupo diverso de virus que infecta los epitelios de la piel y las mucosas de los humanos. Pertenecen a la familia de los virus de Papiloma o Papiloma virus (PV), cuyos miembros afectan e inducen la proliferacin especfica de diversos tipos de lesiones en los epitelios de muchos animales, desde peces y aves hasta mamferos, incluyendo adems de los humanos, a los bovinos, venados, alces, orcas, delfines, monos, conejos y perros, entre otros.

1.2 Diversidad de los HPV

Los HPV pueden ser divididos de manera general en dos grandes grupos: aquellos que infectan la piel y aquellos que infectan las mucosas orales y genitales. De los aproximadamente 100 tipos distintos de HPV identificados a la fecha, cerca de 80 ya han sido clasificados. Slo alrededor de una tercera parte de ellos se asocia con lesiones de las mucosas anales y genitales (zur Hausen, 1996). De todos los HPV identificados hasta ahora, slo algunos de ellos se encuentran presentes de manera consistente en los tumores malignos y las lesiones precursoras de stos. En particular, los tipos virales 16, 18, 31, 33, 35, 45 y 58 se han encontrado en la mayora de los tumores analizados a la fecha (Bosch y col., 1995). Estos virus y todos aquellos que se encuentran con cierta frecuencia

en tumores malignos, han sido clasificados en un grupo denominado de "alto riesgo". Algunos otros tipos, como el 6 y el 11, se encuentran de manera especfica slo en las lesiones benignas y por ello han sido clasificados en un grupo denominado de "bajo riesgo" (zur Hausen, 1996). Recientemente, se ha mostrado la existencia de un gran nmero de distintos aislados virales de los tipos 16, 18 y 45, principalmente, que representan variantes moleculares de los tipos de referencia aislados originalmente. Diversos estudios han comparado de manera extensa la secuencia nucleotdica de un nmero importante de los aislados virales provenientes de diversas regiones del mundo. Lo anterior ha llevado no slo a establecer rboles filogenticos que reflejan las relaciones entre estos virus y sus huspedes, sino que, tambin ha permitido revelar la existencia de linajes o variantes de los tipos virales conocidos. En estos aislados, las variaciones en la secuencia nucleotdica no son mayores al 2% en las regiones del genoma viral que codifican para protenas y al 5% en las que no codifican (Bernard y col., 1994). Tambin, estos estudios han permitido establecer el origen y la diseminacin de estos virus. Los datos obtenidos de diversas regiones geogrficas del mundo han permitido establecer por ejemplo, que el HPV tipo 16 evolucion a lo largo de 5 ramas principalmente, dos de ellas presentes en el continente Africano, dos en Asia y una en Europa e India (Ho y col., 1993). Estos estudios han revelado que la colonizacin de Amrica se refleja en la composicin de las variantes que presentan sus habitantes, asiticoamericanas, europeas y africanas.

1.3 Organizacin general del genoma viral

Todos los virus de papiloma presentan caractersticas estructurales y de organizacin del genoma muy similares. Los viriones estn formados por una cpside proteica constituida por las protenas tardas L1 y L2 y contienen una molcula de ADN circular y cerrada de doble cadena con alrededor de 8,000 pares de bases (pb). El genoma viral ha sido dividido en tres regiones principales: la denominada E que contiene los genes tempranos (por la inicial del ingls early), aquella que contiene los genes de expresin tarda y denominada L (por la inicial del ingls late) y una regin reguladora denominada LCR o URR (por sus siglas en ingls Long Control Region o Upstream Regulatory Region). La regin E de los HPV contiene genes cuyos productos participan en la regulacin de la replicacin y la transcripcin del genoma viral y el control del ciclo celular. Los genes E6 y E7 son oncogenes que tienen la capacidad de inmortalizar diversos tipos de clulas, mediante su interaccin con los productos de dos genes supresores muy conocidos (p53 y pRb) y cuya funcin es crtica para el control correcto de las transiciones del ciclo celular y el mantenimiento de la integridad del genoma (zur Hausen, 1996). La regin LCR contiene adems del origen de replicacin viral, el promotor de los oncogenes E6 y E7 y un aumentador (enhancer) de la transcripcin viral especfico de clulas epiteliales (Boullaga y col., 2000).

1.4 Los genes L1 y L2 y las protenas de la cpside

Los genes virales tardos L1 y L2 se encuentran altamente conservados y codifican las dos protenas que constituyen la cpside. Despus de su sntesis en el retculo endoplasmtico de la clula huesped, estas protenas son transportadas al ncleo, donde se lleva a cabo el ensamblaje de las partculas virales (Zhou y col., 1991). La produccin de las protenas L1 y L2 slo ocurre en los queratinocitos diferenciados infectados con HPV y productores de virus. El producto del gen E4, a pesar de estar localizado en la regin temprana del genoma viral, codifica una protena tarda que parece ser necesaria para la maduracin y la liberacin de las partculas virales.

1.5 Los oncogenes E6 y E7

Los genes virales E6 y E7 estn localizados en el extremo 5' de la regin temprana y codifican protenas multifuncionales las cuales interfieren con los controles normales del crecimiento y la proliferacin de la clula husped. Ambos genes se expresan a partir de un mismo promotor que genera transcritos policistrnicos. Mltiples estudios han mostrado que las protenas E6 y E7 son capaces de transformar e inmortalizar diversos tipos de clulas. Si bien los productos de estos genes son capaces de transformar de manera eficiente clulas de roedor, sabemos que se necesita la cooperacin de algunos oncogenes celulares, en particular los de la familia ras, para la transformacin completa de las clulas de cultivos primarios. Adems, las protenas E6 y E7 son capaces de alterar la

actividad de diversos promotores, tanto de genes celulares como virales (Desaintes y col., 1996). Como resultado de la presencia contina de las protenas E6 y E7, las clulas presentan una inestabilidad genmica que las lleva eventualmente a adquirir un fenotipo transformado. Sabemos bien que la protena E6 de los HPV de "alto riesgo" es capaz de interaccionar con la protena celular p53 e inducir su degradacin. De manera similar, la protena viral E7 es capaz de interaccionar con el producto del gen celular de retinoblastoma e inducir tambin su degradacin. Las protenas E6 y E7 de los HPV de "alto riesgo" y no de los de "bajo riesgo" son capaces de producir estas alteraciones y con ello contribuir a la transformacin de diversas clulas (zur Hausen, 1996).

1.6 El regulador transcripcional E2

El producto del gen viral E2 es un regulador importante de la transcripcin y replicacin del genoma viral. En el caso de los HPV que infectan los genitales, el producto del gen E2 modula de manera negativa la expresin de los oncogenes E6 y E7 (Thierry y Yaniv, 1987). Cuando se pierde este gen como resultado de la integracin frecuente del genoma viral al genoma de la clula husped, lo que precede en las formas, o se pierde su expresin por otros mecanismos, se produce una mayor expresin de los oncogenes virales E6 y E7. El producto del gen E2 es una protena que presenta algunas regiones de aminocidos altamente conservados entre distintos PV. Presenta de manera general tres dominios distintos: el extremo amino contiene regiones de activacin transcripcional y el

extremo carboxilo, regiones clsicas de unin al ADN las cuales incluyen, un dominio bsico y un zipper (cremallera) de leucinas. Entre ellos se encuentra tambin una regin variable que ha sido denominada como bisagra.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

En este captulo se revisan algunos aspectos de la Biologa Molecular de los virus de papiloma humano y se hace un recuento de los avances ms recientes en el desarrollo de vacunas contra ellos. El desarrollo de vacunas profilcticas eficientes contra los HPV, representa un enorme reto para la Salud Pblica en los prximos aos, ya que su desarrollo exitoso podra anticipar la reduccin dramtica del cncer crvico uterino en los pases en desarrollo, pocos aos despus de su introduccin al mercado. En especial, el desarrollo de alternativas de bajo precio constituir un elemento clave para el desarrollo de polticas que permitan esto. Sin embargo, a pesar del desarrollo exitoso de las vacunas profilcticas, an se esperan muchos aos de alta incidencia de estos tumores y por ello el desarrollo de vacunas teraputicas representa tambin un reto importante para las ciencias biomdicas.

3. VACUNAS CONTRA VIRUS DE PAPILOMA HUMANO

En el caso de los HPV, se han desarrollado hasta ahora bsicamente dos tipos distintos de vacunas: i) las tradicionales, que pretenden impedir las infecciones virales mediante la neutralizacin de las partculas virales y ii) las llamadas

vacunas teraputicas, que pretenden disminuir el crecimiento de los tumores al mandar una respuesta inmune eficiente que permita eliminar el crecimiento tumoral. Adems, se ha propuesto el uso del gen E2 para reprimir la transcripcin de los oncogenes virales E6 y E7, y as inducir el paro del ciclo celular y apoptosis. La presencia de mltiples variantes moleculares del HPV16 ha llevado a algunos investigadores a cuestionar si en realidad se trata de un mismo serotipo, es decir, que los genotipos y serotipos de las variantes sean equivalentes o acaso existen varios sero-subtipos dentro de un mismo genotipo?. La respuesta parecera indicar de manera clara que no existen sero-subtipos del HPV16, por lo cual una vacuna dirigida contra el tipo 16 de referencia parecera despertar una respuesta inmune equivalente contra las variantes conocidas. Adems, los ttulos de los anticuerpos contra estos virus no difieren por ms de una dilucin entre ellos.

3.1 Vacunas profilcticas

En el caso de los HPV, no es posible pensar en la preparacin de vacunas tradicionales, ya que hasta ahora no existe un sistema eficiente para la produccin de partculas virales. El tropismo tan especfico de los HPV por los epitelios queratinizantes y las mucosas humanas ha constituido un impedimento importante para el desarrollo de sistemas para estudiar las relaciones virus-husped en condiciones naturales. El campo propicio para la produccin de las partculas virales lo constituyen los epitelios en diferenciacin, tanto estratificados como simples. Estos sistemas son poco eficientes para la produccin de partculas

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virales e incluso en las infecciones naturales se presenta una escasa produccin de estas. En los ltimos aos, se han realizado esfuerzos importantes para el desarrollo de sistemas para propagar los HPV. Entre ellos los ms utilizados son los sistemas de cultivo de queratinocitos en interfase aire-lquido y el trasplante de tejidos infectados a la cpsula suprarenal de ratones inmunodeficientes.

3.1.1 Las partculas pseudo-virales (VLPs)

Se han diseado alternativas para contender con el problema de la baja produccin de las partculas virales en sistemas convencionales. Uno de ellos, el ms utilizado, se basa en la observacin realizada originalmente por Yang Zhou (1991) quien se percat de que la protena L1, sola, o en combinacin con L2, llevaba a la generacin de estructuras similares a las que presentan los viriones, las cuales han sido denominadas partculas pseudo-virales, o VLP's (por sus siglas en ingls virus-like particles). Las propiedades antignicas de las partculas virales y, en particular, las de las VLP, las hacen candidatos muy atractivos para el desarrollo de vacunas profilcticas. La eficiencia protectora de las VLP ha sido probada en animales. Las infecciones naturales por distintos tipos de virus de papiloma animal, como el del conejo cola de algodn (CRPV), distintos tipos de papilomavirus bovinos como el (BPV-1, -2, -4) y el PV oral canino llamado COPV han podido ser prevenidas mediante la utilizacin de esquemas eficientes de vacunacin con las VLPs de cada tipo de virus.

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En el caso de la vacuna contra el HPV11, los estudios recientes han permitido confirmar los conceptos establecidos, mediante la utilizacin de ensayos de neutralizacin. Para realizar estos experimentos se eligieron individuos negativos para el HPV11 por ensayos de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), citologa cervical y anticuerpos. Los individuos inmunizados desarrollaron anticuerpos neutralizantes, los cuales fueron capaces de prevenir la infeccin de xeno-trasplantes de prepucio humano por el HPV tipo 11, en ratones inmunodeficientes. En este caso, ninguno de los sujetos que recibieron placebo desarroll anticuerpos contra el virus. Esto se evalu mediante radioinmunoensayo (RIA). En el estudio se incluyeron ciento cuarenta sujetos, los cuales recibieron distintas dosis de VLP del HPV11 y presentaron respuesta de anticuerpos variable. Mientras que el 52% de aquellos que recibieron 10 g de VLPs desarrollaron una respuesta positiva, el 91% de los que recibieron 50 g la presentaron y el 100% de los sujetos que recibieron 100 g como dosis reaccionaron positivamente. En estos experimentos se observ que los ensayos de RIA muestran una correlacin adecuada con los de neutralizacin. En el caso del HPV tipo 16, recientemente se ha mostrado que la respuesta inmune sistmica, ms que la respuesta local de IgA, se correlaciona con la desaparicin de la infeccin viral en mujeres con neoplasias intraepiteliales cervicales (NIC) (Bontkes y col., 1999).

3.1.2 Las partculas pseudo-virales quimricas (cVLPs)

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Recientemente, se ha propuesto la utilizacin de partculas pseudo-virales quimricas, las cuales llevan un fragmento de otra protena viral, en algunos casos especficos de la protena temprana E7. Se ha observado que la respuesta de anticuerpos contra la protena quimrica es buena, lo cual permite anticipar el posible uso de estas protenas para vacunas en ensayos clnicos. Se espera que la vacunacin en este caso, permita inducir una respuesta contra las protenas tempranas y eventualmente estimular al sistema inmune para controlar el crecimiento tumoral y adems, para desencadenar la produccin de anticuerpos contra las protenas de la cpside que permitan impedir las infecciones recurrentes (Nieland y col., 1999).

3.2 Vacunas teraputicas

Los esfuerzos que ofrecen alternativas para la teraputica del CaCU han llevado a diversos grupos a proponer y desarrollar estrategias para controlar el crecimiento de los tumores. Estas alternativas se han basado hasta ahora en dos propuestas o concepciones distintas. Por un lado, en tratar de modular la respuesta inmune del husped, de manera local principalmente, y por el otro, en controlar la expresin de los oncogenes E6 y E7, responsables del crecimiento anormal de las clulas tumorales.

3.2.1 Modulacin de la respuesta inmune

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El hecho de que los tumores del cuello uterino expresen dos protenas de origen viral (las oncoprotenas E6 y E7) aunado al conocimiento de la respuesta inmune del huesped, ha permitido disear estrategias para tratar de inducir la regresin de los tumores mediante el uso de pptidos derivados de estas dos molculas. En principio, se ha pretendido identificar a los epitopos virales que son presentados por las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I. En uno de los primeros ensayos clnicos que se realizaron, se utiliz como vector viral al virus de la vaccinia y a los oncogenes E6 y E7 de los HPV tipo 16 y 18 de manera simultnea. En este trabajo, la vacuna se inocul en un grupo de 8 mujeres con cncer crvico uterino en estadios avanzados. Las pacientes fueron inoculadas con una sola dosis de la vaccinia recombinante. Mientras que todas las mujeres desarrollaron anticuerpos contra antgenos de la vaccinia, solo tres de ellas desarrollaron anticuerpos contra las protenas de HPV. Slo en una de las pacientes se pudieron detectar linfocitos T citotxicos especficos contra las protenas del HPV, que pudieran ser de utilidad terapetica (Borysiewics y col., 1996). En otras estrategias se ha pretendido inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, la cual se logra mediante la administracin a los pacientes de anticuerpos o de antgenos tumorales solubles, ya sea en forma de protenas, pptidos, e incluso, de los genes que codifiquen estos pptidos y que han sido llamados por algunos autores minigenes.

3.2.2 Inhibicin de oncogenes virales e induccin de apoptosis

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Dos cuestiones incontrovertidas en el caso del cncer del cuello uterino lo constituye el hecho de que la enorme mayora de los tumores del cuello uterino retienen y expresan los oncogenes virales E6 y E7, y en la mayora de estas neoplasias no se expresa el producto del gen E2. Como se mencion anteriormente, el producto del gen E2 es un regulador de la transcripcin viral, que en el caso de los HPV que infectan a los genitales, provoca la represin del promotor temprano, el cual dirige la sntesis de los oncogenes virales. Por lo anterior, se ha propuesto que el gen E2 podra ser utilizado para inhibir la expresin de los oncogenes virales y as detener el crecimiento de las clulas tumorales. La presencia de la protena E2 en clulas HeLa provoca la detencin del ciclo celular e induce apoptosis (Desaintes y col., 1997). En base a esta y a otras observaciones pensamos que podra ser til evaluar el efecto del gen E2 sobre el crecimiento de tumores del cuello uterino. Los ensayos preclnicos han mostrado la inhibicin significativa de la expresin de estos genes sobre el crecimiento tumoral. Dado que sabemos que la inhibicin de la expresin de los oncogenes E6 y E7 lleva a la inhibicin del crecimiento de las clulas tumorales las expectativas de esta estrategia son promisorias en este sentido.

3.3 Las vacunas de ADN

Las vacunas de ADN representan una alternativa novedosa para expresar antgenos in vivo y con ello generar una respuesta inmune, tanto humoral como celular. Estas vacunas, que han sido denominadas por algunos autores como de

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tercera generacin, han mostrado su eficacia en diversos ensayos, pues han sido capaces de inducir una respuesta inmune protectora en un nmero de modelos preclnicos de la enfermedad. Las vacunas de ADN llevan diversos genes que codifican para protenas antignicas de patgenos o de tumores, en lugar de usar las propias protenas. En general, estas vacunas consisten en plsmidos bacterianos que llevan un promotor fuerte para inducir la expresin del gen de inters, adems de una seal para la poliadenilacin de los transcritos de ARN y seales de terminacin de la transcripcin. Los plsmidos se crecen generalmente en bacterias, se purifican por mtodos convencionales y se disuelven en solucin salina o fisiolgica, para despus ser inyectados en el husped. El ADN inyectado es "tomado" por las clulas del organismo en el cual se inyecta y se produce la protena de inters. Generalmente, los plsmidos slo llevan un origen de replicacin que es funcional en bacterias, por lo cual no existe la posibilidad de que ste se amplifique y/o replique en las clulas inyectadas, as como tampoco existe, por lo general, el riesgo de que se integren al genoma celular. Las observaciones iniciales en este campo mostraron la eficacia de una "vacuna" de ADN para proteger animales contra un reto de virus de la influenza. Los animales fueron inmunizados con el gen que codifica para una protena interna y muy conservada del virus de la influenza A; la nucleoprotena (NP). Los animales desarrollaron anticuerpos especficos contra la NP, as como una respuesta citotxica de clase tipo I. Este hecho mostr el enorme potencial de esta tecnologa para inducir una respuesta CTL restringida para las molculas MHC

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clase I, de manera simple, permitiendo la generacin de protenas completas y dando as la posibilidad de que exista una seleccin de epitopos en el husped. En el laboratorio, hemos desarrollado una estrategia alternativa para la generacin de anticuerpos neutralizantes contra la protena L1 del HPV tipo 16. Para ello, hemos aprovechado el hecho ya mencionado, de que la inyeccin de ADN "desnudo" provoca la aparicin de anticuerpos neutralizantes y una respuesta citotxica adecuada. Los ensayos muestran la presencia de anticuerpos especficos contra la protena L1 del HPV16 en los animales, an despus de un ao de haber sido inmunizados (Rocha-Zavaleta y col., 2001).

4. PERSPECTIVAS

El cncer crvico uterino es una de las neoplasias que puede ser curada totalmente si es detectada de manera temprana. Adems, es una neoplasia que podra ser eliminada completamente si las infecciones por ciertos HPV de alto riesgo que colonizan las mucosas genitales pudieran ser eliminadas. En la actualidad se estn realizando esfuerzos enormes a nivel mundial por desarrollar vacunas contra HVP. Estas son bsicamente de dos tipos, las que pretenden impedir las infecciones virales mediante el desarrollo de una inmunidad humoral y celular (vacunas profilcticas) y aquellas que pretenden detener e inducir la regresin de lesiones preexistentes e incluso de tumores (vacunas teraputicas). Las estrategias modernas para el desarrollo de vacunas en contra de HPV contemplan principalmente la utilizacin de las llamadas VLPs (por las siglas en ingls virus-like-particles), las cuales en realidad estn formadas por cpsides

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vacas, generadas mediante la expresin de los genes L1 y L2 en diversos sistemas heterlogos. Para que las vacunas de HPV puedan prevenir las infecciones de las mucosas genitales, necesitarn ser capaces de generar la produccin de anticuerpos neutralizantes contra las protenas de la cpside, en las superficies de las mucosas, que son afectadas por estos virus. El reto para los inmunlogos es grande; lograr que se desarrolle el tipo correcto de respuesta inmune, en el sitio correcto, por un periodo suficiente que impida las infecciones y con ello, pueda ser de utilidad clnica. Este es un reto bastante complejo. Los esfuerzos en el campo del desarrollo de vacunas contra HPV son muy promisorios; sin embargo, en opinin de algunos expertos, sern necesarios cerca de 20 aos para que podamos contar con vacunas profilcticas contra HPV, probadas y eficientes para ser usada en humanos. Vacunas que permitan con un grado de certitud elevado anticipar que las mujeres inmunizadas estarn protegidas contra las infecciones de los tipos de alto riesgo y por ende, no desarrollarn lesiones premalignas en su vida adulta, ni cncer crvico uterino. Esto ltimo debido a que si bien el desarrollo tecnolgico de estas vacunas se encuentra muy avanzado y stas ya han sido probadas en mujeres voluntarias e incluso, ya se han iniciado estudios en los que se pretende vacunar a cerca de 20,000 mujeres (en Guanacaste, Costa Rica). Los ensayos no sern concluyentes hasta haber mostrado que en efecto, la inmunizacin de las personas lleva a una proteccin total, no slo de infecciones clnicas, sino de aquellas subclnicas, que finalmente conducen al desarrollo de la gran mayora de los tumores del cuello uterino.

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Por otro lado, el desarrollo de las vacunas teraputicas probablemente experimente un auge importante en los prximos aos, pues se cuenta con distintas estrategias para tratar de inducir por un lado una respuesta celular que ayude a controlar el crecimiento tumoral y por el otro, tratar de reducir la expresin de los oncogenes virales e inducir apoptosis en las clulas infectadas. Sin embargo, en opinin de algunos, estos desarrollos difcilmente podrn ayudar a mejorar las expectativas de mujeres que acuden a los centros hospitalarios con tumores en estados muy avanzados. Es pues de suma importancia que se privilegie el uso de tecnologas recientes que permiten detectar ADN viral de manera especfica y sensible, para coadyuvar a los programas actuales en la deteccin oportuna de cncer crvico uterino y que estos, de manera significativa, mejoren tanto en su cobertura, como en su eficacia.

AGRADECIMIENTOS

El autor desea agradecer el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) y del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigacin y Tecnologa de la UNAM (PAPIIT IN217398) por el apoyo brindado a sus investigaciones.

ABREVIATURAS CaCU HPV Cncer crvico uterino. Virus de papiloma humano.

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LCR VLPs PCR RIA NP

Regin reguladora. Partculas pseudo-virales. Reaccin en cadena de la polimerasa. Radioinmuno-ensayo. Nucleoprotena.

BIBLIOGRAFA

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Captulo 10 Diagnstico molecular de las enfermedades hereditarias Lorena Orozco 1, Miguel Angel Alcntara 1,2 y Ariadna Gonzlez-del Angel 1.
1

Laboratorio de Biologa Molecular, Departamento de Investigacin en Gentica Humana, Instituto Nacional de Pediatra, S.S., Mxico, D.F.

Programa Doctorado en Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Mxico, D.F.

Email: lorozco@mailer.main.conacyt.mx PALABRAS CLAVE: Diagnstico molecular, enfermedades mendelianas, patologa hereditaria.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivo del captulo. 3. Concepto de herencia mendeliana. 3.1 Herencia autosmica dominante. 3.2 Herencia autosmica recesiva. 3.3 Herencia recesiva ligada al cromosoma X. 3.4 Herencia dominante ligada al cromosoma X. 4. Mutaciones responsables de las enfermedades hereditarias. 4.1 Principales clases de mutaciones. 4.2 Localizacin de la mutacin. 4.3 Mutaciones frecuentes causantes de la enfermedad (aleatorias, puntos calientes, mutaciones fundadoras). 4.4 Efecto de las mutaciones sobre la funcin. 4.5 Modificacin epigentica.

5. Diagnstico molecular. 5.1 Anlisis de DNA. 5.1.1 Diagnstico molecular directo (DD). 5.1.2 Diagnstico molecular indirecto (DI). 5.2 Anlisis de RNA y producto gnico. 6. Ventajas y desventajas del diagnstico molecular. 6.1 Ventajas. 6.2 Desventajas. 7. Terapia gnica. 8. Conclusiones. Abreviaturas. Bibliografa Informacin complementaria en internet (links).

1. INTRODUCCIN

En la sptima dcada del siglo XX la unificacin de la gentica, la bioqumica y la biologa celular trajo como consecuencia el surgimiento de una avalancha de tcnicas novedosas dando lugar a la Biologa Molecular. El desarrollo del Proyecto del Genoma Humano (PGH), que ha permitido conocer la secuencia del DNA del Homo sapiens, ha dado lugar a la medicina genmica, adems de conocer la composicin gentica del ser humano. El principal objetivo del PGH es determinar el papel de varios genes en la salud y en la enfermedad. Actualmente, se sabe que casi todas las enfermedades tienen un componente

gentico ya sea heredado o expresado como respuesta del organismo al estrs ambiental. El PGH ha producido un vasto rango de mapas, clonas, secuencias, datos de expresin y fenotipos del DNA humano, lo que ha hecho posible que la secuencia de todos los genes est accesible en una base de datos. Es evidente que el aislamiento y la caracterizacin de los genes involucrados en las enfermedades hereditarias o de ndole multifactorial e incluso, de genes que predisponen a padecer ciertas enfermedades, ha conducido al entendimiento de la fisiopatologa, al diagnstico de certeza y al desarrollo potencial de una terapia gnica para estas enfermedades.

2. OBJETIVO DEL CAPTULO

Este captulo tiene como objetivo explicar los conceptos bsicos del diagnstico molecular de los padecimientos hereditarios, especialmente de aquellos que siguen un patrn de herencia mendeliano o monognico.

3. CONCEPTO DE HERENCIA MENDELIANA

La primera descripcin de la herencia mendeliana o monognica fue hecha por Gregor Mendel en 1865. A partir de estos hallazgos se ha establecido que el genotipo es la constitucin gentica de un individuo, mientras que el fenotipo es la expresin del genotipo, el cual puede ser normal o patolgico. La patologa gentica se clasifica en cuatro grandes grupos: cromosmica, multifactorial,

con herencia no tradicional o no mendeliana y con herencia mendeliana (Mueller y Cook, 1996). Esta ltima ser explicada en este apartado. Hasta la fecha se conocen ms de 5,000 padecimientos genticos con patrn de herencia mendeliano cuya frecuencia es de 11.5 a 23 por cada 1,000 individuos. El genoma humano est contenido en 46 cromosomas: 22 pares denominados autosomas y un par de cromosomas sexuales. El varn tiene un complemento cromosmico normal 46, XY, por lo que presenta la mitad de la dosis de los genes localizados en el cromosoma X (hemicigoto), en tanto que la mujer, con complemento normal 46, XX, puede ser heterocigota u homocigota para los alelos localizados en el cromosoma X. Por otro lado, cada gen tiene diferentes variantes o formas alternativas denominadas alelos que pueden ser dominantes o recesivos. El trmino de dominancia se refiere a la propiedad que tiene un alelo en particular de ser expresado en estado heterocigoto (alelos diferentes en un par de cromosomas homlogos); mientras que el alelo recesivo slo se expresa fenotpicamente cuando se encuentra en estado homocigoto (alelos idnticos en un par de cromosomas homlogos) o hemicigoto. Dado que los genes pueden estar localizados en los autosomas (herencia autosmica) o en los sexocromosomas (herencia ligada al sexo), la herencia mendeliana en el humano se clasifica en: Autosmica: Dominante y Recesiva Ligada al cromosoma X: Dominante y Recesiva.

3.1 Herencia autosmica dominante

Alrededor del 50% de los padecimientos monognicos tienen un patrn de herencia autosmico dominante (Mueller y Cook, 1996). Las caractersticas de este tipo de herencia son: i) La transmisin del padecimiento es vertical, ya que se hereda de una generacin a otra. ii) Un individuo afectado tiene un 50% de riesgo de transmitir la enfermedad a su descendencia. iii) iv) Existe transmisin de varn a varn. Afecta a ambos sexos por igual. Existen algunos fenmenos que pueden alterar el patrn de la herencia autosmica dominante como son: Penetrancia: Se define como la expresin de un genotipo mutado y equivale al porcentaje de individuos que presentan la mutacin y manifiestan la enfermedad. As por ejemplo, el retinoblastoma hereditario (Rb hereditario) tiene una penetrancia del 90%, es decir 90 de cada 100 individuos con una mutacin en el gen RB1 desarrollan el tumor; sin embargo, los individuos heterocigotos con no penetrancia, tienen el mismo riesgo de transmitir el gen mutado a su descendencia que los pacientes que manifiestan la enfermedad. Expresividad variable: Este trmino se refiere a que varias enfermedades se manifiestan clnicamente en un rango de leve a grave en una poblacin con el mismo genotipo. Por ejemplo, la neurofibromatosis tipo 1 (NF1), an dentro de la misma familia, puede manifestarse con neurofibromas subcutneos y manchas caf con leche, o presentarse con un cuadro clnico ms grave con neurofibromas plexiformes con degeneracin maligna, feocromocitoma y retraso mental.

Fenmeno de anticipacin: En este caso, en generaciones subsecuentes, el inicio de las manifestaciones clnicas ocurre en edades ms tempranas y con mayor gravedad. Este fenmeno es distintivo de enfermedades ocasionadas por expansin de trinucletidos; por ejemplo en un paciente con enfermedad de Huntington, sta se puede manifestar de los 35-42 aos, en tanto que en su descendencia se puede manifestar antes de los 20 aos de edad (formas juveniles). Pleiotropismo: Fenmeno por el cual un gen condiciona diferentes signos y sntomas en diferentes rganos y sistemas. Cada uno de estos signos y sntomas puede tener expresividad variable. As, en la esclerosis tuberosa la alteracin del gen de la tuberina, un gen supresor de tumor, puede manifestarse en varios niveles tisulares de acuerdo con su expresin en condiciones normales: sistema nervioso central (calcificaciones intracraneanas), retina (facomas retinianos), msculo (rabdomiomas cardiacos), rin (angiomiolipomas), piel (manchas hipocrmicas lanceoladas y angiofibromas), etc. El gen responsable de la enfermedad de Huntington es un ejemplo de genes con poco pleiotropismo. Heterogeneidad gentica: Es el fenmeno por el cual fenotipos clnicos similares son originados por diferentes genotipos. A su vez ste se divide en heterogeneidad allica o no allica (o de locus). La heterogeneidad allica es aquella en la que diferentes mutaciones en un gen pueden generar variaciones fenotpicas, que incluso, pueden ser consideradas clnicamente como enfermedades distintas (Sndromes de Hurler-Scheie; acondroplasiahipocondroplasia, sorderas neurosensoriales pre-linguales no sindromticas, etc.). La heterogeneidad de locus ocurre cuando diferentes loci mutados

pueden producir fenotipos similares, incluso con diferente patrn de herencia. Una de las condiciones ms tpicas de la heterogeneidad de locus es el sndrome de Alport que se caracteriza por sordera neurosensorial e insuficiencia renal crnica. Existen diversas formas de herencia en este sndrome: autosmica dominante (mutaciones en COL4(1) o (2), 13q34), autosmica recesiva (mutaciones en COL4 (3) o (4), 2q36-q37) o dominante ligada al cromosoma X asociada o no a leiomiomatosis (mutaciones en COL4 (5) o (6)) (Tryggvason y col., 1993). Mosaicismo germinal: En este caso, en la descendencia de progenitores clnicamente sanos se observa ms de un individuo afectado con un padecimiento autosmico dominante. Lo anterior se debe a que un progenitor presenta una lnea celular normal y otra con el gen mutado en clulas germinales (ejemplo: osteognesis imperfecta, acondroplasia, esclerosis tuberosa). El riesgo de recurrencia se incrementa conforme aumenta el nmero de clulas germinales mutadas. Mosaicismo somtico: Se origina por una mutacin nueva que ocurre en etapa post-cigtica y origina que un individuo presente tanto clulas somticas normales como mutadas. Se ha observado una correlacin entre la proporcin de clulas afectadas y la gravedad del padecimiento. Un ejemplo clsico es la NF-1 segmentaria con afeccin slo de aquellos rganos donde se observa la mutacin. El riesgo de recurrencia generalmente es igual al de la poblacin en general.

3.2 Herencia autosmica recesiva

Este tipo de herencia es responsable de aproximadamente un 30% de los fenotipos monognicos reconocidos hasta la fecha y sus caractersticas son (Mueller y Cook, 1996): i) Transmisin horizontal, generalmente slo hay afeccin de una generacin. Los individuos portadores siempre sern ms frecuentes que los afectados (principio de Hardy-Weinberg). ii) El riesgo para una pareja de heterocigotos de tener hijos afectados es del 25%, 50% de hijos portadores y 25% de hijos sanos. iii) Los padecimientos autosmicos recesivos se presentan con mayor frecuencia en las poblaciones con un alto ndice de endogamia, consanguinidad o deriva gnica. iv) Se encuentran afectados ambos sexos. Se calcula que cada ser humano es portador de 4 a 5 genes recesivos letales. Generalmente, la base molecular de la herencia autosmica recesiva es la prdida de la funcin del producto del gen responsable por mutaciones en ambos alelos. El individuo afectado siempre es homocigoto, sin embargo, cuando la mutacin en cada uno de los alelos es diferente se le denomina heterocigoto compuesto. Los individuos portadores en general son clnicamente sanos, pero en algunos padecimientos puede haber manifestaciones clnicas, como en los heterocigotos de fibrosis qustica con atresia bilateral de vasos deferentes, o bien, mostrar alteraciones en algunos estudios de laboratorio o gabinete como en la hemocromatosis hereditaria. En una pequea proporcin de los padecimientos con herencia autosmica recesiva, el individuo heterocigoto tiene un mayor ndice de morbimortalidad como en la cistinuria tipo 2; mientras que en otras existen evidencias de ventaja en la seleccin

natural que explican la alta prevalencia de portadores para algunas enfermedades como fibrosis qustica (Welsh y col., 1995) y hemocromatosis hereditaria.

3.3 Herencia recesiva ligada al cromosoma X

Las caractersticas de este tipo de herencia son (Mueller y Cook, 1996): i) Generalmente slo los varones se ven afectados, dado su carcter hemicigoto para los genes localizados en el cromosoma X. ii) Las mujeres slo presentan el padecimiento si el gen mutado esta en estado homocigoto, si existe inactivacin preferencial del cromosoma X normal o si ocurren alteraciones estructurales (translocacin X; autosoma) o numricas (monosoma 45,X) del cromosoma X. iii) iv) v) Todas las hijas de un varn afectado sern portadoras. No existe transmisin de varn a varn. La transmisin de la enfermedad ocurre a travs de una mujer portadora, en la cual el riesgo en cada gestacin de tener hijos varones afectados es de 25%, hijas o hijos sanos de un 50% e hijas portadoras de un 25%. En este tipo de herencia se han descrito mutaciones de novo (hemofilia A, distrofia muscular de Duchenne: DMD), mosaicismo germinal (DMD) y mosaicismo somtico (DMD). Algunos de estos mecanismos impiden brindar un asesoramiento gentico de certeza cuando slo hay un individuo afectado en la familia y no se cuenta con estudios moleculares (Alcntara y col., 1998).

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3.4 Herencia dominante ligada al cromosoma X

Este tipo de herencia es poco frecuente, se manifiesta tanto en los varones como en las mujeres. Generalmente, el fenotipo es menos severo en las mujeres que en los varones (raquitismo hipofosfatmico resistente a vitamina D, sndrome de Alport), a menos que las mujeres sean homocigotas. Las caractersticas de la HDLCX son (Mueller y Cook, 1996): i) ii) iii) Todas las hijas de varones afectados heredarn el padecimiento. No existe transmisin de varn a varn. Las mujeres afectadas transmiten el padecimiento al 50% de su descendencia independiente del sexo. iv) Frecuentemente en una familia existen ms mujeres enfermas vivas que hombres afectados, ya que en estos ltimos la gravedad del padecimiento condiciona su fallecimiento. v) Habitualmente existe el antecedente de mltiples abortos en mujeres afectadas debido a que en algunos padecimientos la mutacin en los varones es letal in utero, tal como ocurre en incontinentia pigmenti y en el sndrome de Goltz.

4. MUTACIONES RESPONSABLES DE LAS ENFERMEDADES HEREDITARIAS

La patologa monognica resulta del efecto de una mutacin sobre el fenotipo. En la mayora de las enfermedades donde se ha identificado el gen responsable se conocen las mutaciones que los afectan. Sin embargo, en

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muchas de ellas es necesario conocer el tipo o clase de mutacin, su localizacin, su efecto sobre la funcin de la protena y las modificaciones epigenticas que pueden alterar la funcin de un gen, como la metilacin (Cooper y col., 1995).

4.1 Principales clases de mutaciones

i)

Deleciones: son prdidas de segmentos de DNA que van desde 1 pb hasta megabases.

ii)

Inserciones y duplicaciones: se refiere a la introduccin de material gentico dentro de la molcula de DNA.

iii)

Mutaciones puntuales: son el cambio de una sola base por otra. Estas mutaciones se pueden clasificar en: - Mutaciones con sentido errneo: reemplazan un aminocido por otro en el producto gnico. - Mutaciones sin sentido: reemplazan cualquiera de los codones por un codn de terminacin. - Mutaciones en sitios de splicing (corte de algunas secuencias y ensamble de los fragmentos de DNA) crean o destruyen sitios para el splicing de los exones.

iv)

Cambio del marco de lectura: pueden ser producidas por deleciones, inserciones o errores en el splicing que condicionan un corrimiento en el marco de lectura.

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v)

Mutaciones dinmicas o expansin de tripletes: son ocasionadas en secuencias repetidas en tandem que habitualmente aumentan en nmero durante su transmisin a la descendencia.

4.2 Localizacin de la mutacin

Las mutaciones en un locus gnico pueden ocurrir en tres sitios: en secuencias codificadoras del gen, en secuencias intrnicas y en secuencias regulatorias. La mayora de las veces las mutaciones se localizan en las secuencias codificadoras, mientras que del 10 al 15% se presentan en secuencias que permiten una expresin correcta del gen, como son los dinucletidos GT y AG altamente conservados en los extremos de los intrones y que son necesarios para un splicing adecuado. Las mutaciones en sitios de regulacin ocurren generalmente en secuencias localizadas corriente arriba del primer exn (promotores), aunque tambin se pueden localizar en elementos regulatorios ms distantes (Cooper y col., 1995).

4.3 Mutaciones frecuentes causantes de la enfermedad (aleatorias, puntos calientes, mutaciones fundadoras)

En algunas enfermedades, la mayora de los individuos afectados tienen la misma mutacin o existe un pequeo nmero de mutaciones con una frecuencia elevada. Este es el caso de mutaciones que ocurren cuando la enfermedad depende de un mecanismo molecular especfico como la expansin del trinucletido CGG que se presenta en el 95% de los pacientes

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con sndrome de X frgil (De Vries y col., 1998); cuando la naturaleza del gen es tal que un tipo de mutacin particular ocurre repetidamente, como en la distrofia muscular de Duchenne (DMD) donde el gran tamao del gen y la frecuencia de recombinacin condicionan la alta frecuencia de deleciones en dos puntos calientes del gen DMD; o cuando los individuos afectados llevan la misma mutacin ancestral como en el caso de la fibrosis qustica donde existe una mutacin altamente prevalente conocida como F508 que fue generada en las primeras poblaciones noreuropeas (mutacin fundadora). Esta mutacin esta presente en el 70% de los cromosomas de pacientes caucsicos con fibrosis qustica y en alrededor del 40% de los cromosomas de los pacientes mexicanos (Orozco y col., 1993).

5.4 Efecto de las mutaciones sobre la funcin

Los efectos principales que pueden tener las mutaciones son la prdida o ganancia de la funcin. En este sentido, el producto puede presentar una reduccin (hipomorfo) o la prdida total (amorfo) de la funcin, pero tambin puede ganar alguna funcin por el incremento en su cantidad o en su actividad (hipermorfo), adquirir una funcin nueva (neomorfo) o antagonizar la actividad del producto normal (antimorfo). Mientras que las mutaciones que ganan funcin usualmente causan fenotipos dominantes, las mutaciones que la pierden generalmente conducen a fenotipos recesivos, como en la mayora de los errores innatos del metabolismo (Glick y col., 1998). Cuando un fenotipo clnico es causado por prdida de la funcin de un gen, cualquier tipo de mutacin que inactive el producto gnico conduce al

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mismo fenotipo clnico. As por ejemplo, la distrofia muscular de Duchenne se origina por mutaciones en el gen DMD que pueden ser desde mutaciones puntuales hasta deleciones de la secuencia completa del gen. En las enfermedades provocadas por mutaciones con ganancia de funcin el espectro de mutaciones suele ser ms restringido. El ejemplo tpico es la acondroplasia la cual es causada por slo dos mutaciones en el gen que codifica para el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3). Ambas mutaciones producen el cambio de una glicina por una arginina en el aminocido 380 (G380R) de la protena, sin embargo otro tipo de mutaciones descritas en el mismo gen conducen a otros fenotipos (Rousseau y col., 1995).

4.5 Modificacin epigentica

Cualquier cambio hereditario en el fenotipo de una clula o de un individuo pero que no afecta la secuencia del DNA se denomina epigentico. Este puede afectar la expresin de un gen o las propiedades de su producto. Los mecanismos epigenticos ms importantes son (Cooper y col., 1995): i) Metilacin del DNA. La inactivacin de la funcin de un gen por la metilacin de secuencias control adyacentes es un proceso normal durante el desarrollo y la diferenciacin, as como en la inactivacin del cromosoma X. Sin embargo, ocasionalmente la metilacin puede abolir la expresin de un gen y causar patologa gentica. En muchos tumores la funcin del gen supresor CDKV2A es inactivada por metilacin de sus secuencias promotoras sin la presencia de mutaciones. Un ejemplo

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donde ocurre metilacin conjuntamente con la presencia de mutaciones es el sndrome de X frgil. La transcripcin del gen FMR1 se impide por metilacin de la isla CpG localizada en la regin 5 adyacente al gen. Esta metilacin se induce aparentemente por la expansin del trinuclotido CGG localizado en el exn 1 en la regin no codificadora (De Vries y col., 1998). ii) Cambios en la configuracin de la cromatina. En general los genes transcripcionalmente activos se localizan en la eucromatina, la cual presenta una estructura relativamente descondensada. Por ejemplo, en las clulas eritroides la cromatina est descondensada en el sitio donde se localizan los 5 genes de la globina lo que permite la expresin de estos. Sin embargo, sta se encuentra altamente compactada en clulas no eritroides en donde dichos genes no se expresan. iii) Imprinting. Es el mecanismo a travs del cual la expresin de ciertos genes difiere dependiendo de su origen parental. Lo anterior es controlado por el patrn de metilacin presente en las regiones promotoras de los genes. Existen varias enfermedades que son causadas por genes que sufren imprinting, el mejor ejemplo es el de los sndromes de Prader-Willi y Angelman, ambos causados por un imprinting diferencial en genes localizados en 15q11-q13 (Austin y Hall, 1992). El sndrome de Prader-Willi se caracteriza por retraso mental, hipotona, obesidad e hipogenitalismo y es causado por la prdida de la funcin del gen SNPRN por delecin del cromosoma 15 paterno (normalmente este gen se expresa slo en el cromosoma paterno: imprinting materno); mientras que el sndrome de Angelman se

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caracteriza por retraso mental y del crecimiento, hiperactividad y risa espontnea constante y es debido a la prdida de la funcin del gen UBE3A, que en condiciones normales slo se expresa en el cromosoma 15 materno (imprinting paterno). La disoma uniparental (DUP) tambin es causa frecuente de estos sndromes y se refiere a que el individuo hereda los dos cromosomas 15 de slo uno de sus padres (DUP materna en Prader-Willi y DUP paterna en Angelman). Existen otros factores no epigenticos que causan estos sndromes como deleciones o mutaciones puntuales.

5. DIAGNSTICO MOLECULAR

Prcticamente todas las tcnicas que manipulan cidos nucleicos y protenas, son empleadas en el diagnstico molecular de las enfermedades hereditarias (Tabla 1). Una vez que se conocen los tipos de mutaciones es posible determinar la metodologa de eleccin para el estudio de una u otra enfermedad. Las muestras para el estudio molecular pueden ser obtenidas a partir de diversas fuentes como sangre, raspados bucales, biopsias de vellosidades corinicas, tejidos embebidos en parafina, laminillas histopatolgicas, cabello, semen, dientes deciduales, manchas de sangre en superficies secas, etc. Estas fuentes son tambin utilizadas en los estudios forenses y en los estudios de patologa, infectologa, oncologa, hematologa, etc.

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El diagnstico molecular puede dar informacin dependiendo del estado de conocimiento acerca de los genes involucrados, pero en principio ste se puede realizar esencialmente por las siguientes vas (Strachan y Read, 1999):

5.1 Anlisis de DNA

5.1.1 Diagnstico molecular directo (DD)

Generalmente lo que se busca es la presencia o ausencia de una mutacin o un genotipo conocido. Esta es la va diagnstica molecular ptima, sin embargo no siempre es posible ya que es indispensable conocer cul es el gen a analizar y la secuencia normal de ste. El DD otorga informacin exclusivamente del individuo analizado y frecuentemente se realiza por las tcnicas de PCR o Southern blot. Este ltimo es utilizado cuando existen rearreglos mayores como deleciones, duplicaciones e inserciones en el gen, como por ejemplo en X frgil y distrofia muscular de Duchenne. La presencia de deleciones, duplicaciones e inserciones tambin pueden ser analizadas por PCR mltiple (Fig. 1). Las mutaciones pequeas se concentran en su mayora en regiones codificantes y en las uniones exn-intrn y pueden ser caracterizadas por metodologa como anlisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP), anlisis de heterodplex (AS) y secuenciacin (Tabla 1). Ejemplo de enfermedades con este tipo de mutaciones son el retinoblastoma (RB1), la neurofibromatosis (NF-1) y la fibrosis qustica (FQ) (Welsh y col., 1995), entre otras. Las deleciones y duplicaciones en portadores de entidades autosmicas (anemia de Fanconi y talasemias), as como mujeres portadoras de mutaciones

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en genes ligados al cromosoma X (distrofia muscular de Duchenne, deficiencia de la sulfatasa de esteroides, sndrome de Lesh-Nyhan), se pueden detectar mediante la evaluacin de dosis gnica, utilizando mtodos cuantitativos, principalmente Southern blot, PCR cuantitativo (Fig. 2) y FISH (Strachan y Read, 1999). En algunas enfermedades el tamizaje gentico involucra el anlisis de mutaciones especficas, pero la estrategia para el diagnstico molecular puede variar dependiendo de la heterogeneidad allica. Por ejemplo, en la fibrosis qustica (FQ) se han descrito cerca de 950 mutaciones diferentes que difcilmente podran ser caracterizadas en una muestra de pacientes. Sin embargo, la mutacin F508 se presenta en el 70% de los cromosomas FQ, por lo que el abordaje diagnstico inicial de este padecimiento no se centra en la identificacin de mutaciones en todo el gen, sino en la bsqueda intencionada de esta mutacin (Fig. 3). As el diagnstico molecular de la fibrosis qustica se divide en dos fases: Primero se buscan dirigidamente las mutaciones ms frecuentes que incluyen un nmero limitado, entre ellas la F508 y si no estn presentes al menos en uno de los cromosomas, entonces se buscan mutaciones desconocidas por la tcnica de SSCP (Fig. 4), heterodplex y secuenciacin (Welsh y cols., 1995). Buscar la presencia o ausencia de mutaciones conocidas es ms sencillo que buscar mutaciones desconocidas. La bsqueda de mutaciones conocidas generalmente se realiza en enfermedades con una limitada heterogeneidad allica o en el diagnstico familiar, despus de caracterizar la mutacin en el caso ndice. En la Tabla 1 se describen las diferentes metodologas utilizadas para la identificacin de mutaciones especficas.

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5.1.2 Diagnstico molecular indirecto (DI)

Se realiza en estudios familiares utilizando marcadores polimrficos que permiten definir si la persona estudiada hered el cromosoma o locus de riesgo. La prueba da informacin sobre la segregacin del cromosoma afectado en la descendencia y permite la deteccin de portadores y el diagnstico presintomtico o prenatal (Fig. 5). Su aplicacin es principalmente en el diagnstico molecular de entidades hereditarias cuyo gen responsable no ha sido identificado, no presenta puntos calientes, o las mutaciones que lo afectan son sumamente heterogneas. Los marcadores polimrficos que se utilizan son marcadores aledaos al gen de inters y se requiere un alto ndice de informatividad (heterocigotos).

5.2 Anlisis de RNA y producto gnico

El diagnstico molecular a travs del anlisis del RNA puede tener ventajas sobre el que utiliza DNA, en el sentido de que facilita el estudio de genes de gran tamao, sin embargo el RNA es ms difcil de obtener y trabajar, debido a que se degrada con facilidad. Las muestras de RNA deben ser manipuladas con cuidados extremos y ser procesadas rpidamente para evitar la degradacin, adems se requiere que el gen de inters sea expresado en los tejidos accesibles. Por otro lado, muchas mutaciones conducen a la inestabilidad del RNA, por lo que en una persona heterocigota pudiera detectarse slo el alelo normal (Strachan y Read, 1999).

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En entidades hereditarias tales como el sndrome de Lowe (sndrome culo-cerebro-renal recesivo ligado al cromosoma X), el anlisis del RNA mensajero puede ser la primera opcin para la deteccin de las mutaciones responsables, ya que el marco de lectura es de slo 2.9 kb, en comparacin a las 58 kb que comprende el gen OCRL-1. Otras entidades estudiadas por estas tcnicas pueden ser las leucemias. La enfermedad mnima residual en la leucemia granuloctica crnica con cromosoma Filadelfia positivo, puede ser monitoreada mediante RT-PCR con un alto grado de sensibilidad. Existen otras enfermedades hereditarias que se deben a una disminucin en la expresin del transcrito por mutaciones en elementos cis o promotores (- y - talasemias, hemofilia B tipo Leyden), stas pueden demostrarse mediante la cuantificacin de la expresin a travs de RT-PCR o Northern blot cuantitativo (Strachan y Read, 1999). Otras pruebas genticas son el anlisis bioqumico de los productos gnicos como enzimas y otras protenas. En ocasiones, el estudio directo en la protena responsable genera resultados concluyentes ms rpidos que el estudio del gen; como ejemplos de esto tenemos las variantes electroforticas anormales de las hemoglobinas que condicionan las beta-talasemias o la anemia de clulas falciformes por HbS, y el estudio de la distrofina en la distrofia muscular tipo Duchenne/Becker, que puede documentar el diagnstico como tal por Western blot o inmunohistoqumica, an sin contar con una mutacin caracterizada en el gen DMD.

6. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL DIAGNSTICO MOLECULAR

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6.1 Ventajas

El diagnstico molecular tiene aplicaciones importantes que permiten otorgar un asesoramiento gentico de certeza y mejorar el manejo integral de los pacientes con enfermedades hereditarias. Las aplicaciones del diagnstico molecular son: i) confirmacin del diagnstico en los pacientes, ii) deteccin de portadores mediante la identificacin de individuos sanos pero con una copia mutada de un gen recesivo o dominante con no penetrancia, iii) diagnstico prenatal, iv) tamizaje de enfermedades en el recin nacido, v) diagnstico presintomtico de enfermedades que se manifiestan en la edad adulta como la enfermedad de Huntington, Alzheimer y cncer de colon, vi) pruebas de identidad gentica, vii) medicina forense y viii) identificacin de familias con un alto riesgo a padecer enfermedades complejas o multifactoriales que pueden prevenirse o controlarse como diabetes, hipertensin o artritis reumatoide.

6.2 Desventajas

La aplicacin de los estudios moleculares en muchas de las enfermedades que se manifiestan en la edad adulta como el Alzheimer, la enfermedad de Huntington y algunos cnceres, an permanece en duda. La razn fundamental es que estos estn dirigidos al diagnstico presintomtico en individuos sanos considerados de alto riesgo por poseer una historia familiar mdica del padecimiento. Sin embargo, algunos individuos portadores de mutaciones asociadas a ciertas enfermedades nunca desarrollan la enfermedad, lo cual dificulta establecer un pronstico al no existir una correlacin entre el genotipo

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y el fenotipo. Por otra parte, en ocasiones el material biolgico no se encuentra disponible para el estudio molecular o no se cuenta con una muestra adecuada de DNA. Una limitacin de todos estos estudios es la dificultad para interpretar un resultado positivo o la posibilidad de errores en el laboratorio. La carencia actual de opciones mdicas para un tratamiento definitivo en estas enfermedades, la potencial ansiedad provocada por el diagnstico, el riesgo a la discriminacin y estigmatizacin social, tambin pueden limitar los beneficios del diagnstico molecular. Actualmente el estudio molecular esta disponible para varias enfermedades hereditarias. Algunas de ellas se enuncian a continuacin (Strachan y Read, 1999). Las enfermedades en donde se realizan estudios de susceptibilidad estn marcadas con un asterisco y proveen slo una estimacin del riesgo a desarrollarla: Anemia de Fanconi, grupo C (pancitopenia y defecto del eje radial con predisposicin al cncer). Ataxia espinocerebelosa tipo 1 (movimientos involuntarios, afeccin en los reflejos y lenguaje explosivo). Ataxia telangiectasia (desrden cerebral progresivo, prdida de coordinacin muscular y predisposicin al cncer). Cncer hereditario de colon no polipsico (tumor de colon y de otros rganos). Cncer hereditario de mama y ovario (tumores de mama y ovario). Deficiencia de 1-antitripsina (enfisema y afeccin heptica). Deficiencia del Factor V-Leiden (defecto en la coagulacin). Distrofia miotnica (debilidad muscular progresiva).

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Distrofia muscular de Duchenne/Becker (degeneracin muscular progresiva, prdida de la deambulacin, cor pulmonale en etapas finales).

Enfermedad de Alzheimer* (inicio tardo, demencia senil). Enfermedad de clulas falciformes (alteracin en los eritrocitos, dolor crnico e infecciones).

Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (neuropata progresiva con prdida de sensibilidad en extremidades).

Enfermedad de Gaucher (hepato y esplenomegalia, degeneracin sea). Enfermedad de Huntington (inicio tardo; degeneracin neurolgica progresiva y letal).

Enfermedad de Tay-Sachs (enfermedad neurolgica letal de inicio temprano, convulsiones y parlisis).

Fenilcetonuria (retraso mental progresivo; corregible con la dieta si se realiza un diagnstico temprano).

Fibrosis Qustica (secreciones mucosas viscosas, infecciones y obstruccin pulmonar, insuficiencia pancretica).

Hemofilia A y B (alteraciones de la coagulacin). Hiperplasia adrenal congnita (deficiencia hormonal y ambigedad de genitales).

Neurofibromatosis tipo 1 (manchas caf con leche, neurofibromas que pueden afectar rganos vitales y degenerar en cncer).

Rin poliqustico del adulto (falla renal y afeccin heptica). Sndrome de X Frgil (retraso mental hereditario). Sndromes de Prader-Willi/Angelman (prdida de habilidades motoras y cognitivas)

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Talasemias (anemia).

7. TERAPIA GNICA

La terapia gnica es una nueva estrategia para el tratamiento o prevencin de las enfermedades genticas. sta se basa en el uso de genes normales para reemplazar o suplementar genes mutados o para otorgar inmunidad al organismo como defensa contra algunas enfermedades. La terapia gnica puede ser dirigida a clulas somticas o germinales. En la primera, el genoma del paciente es cambiado exclusivamente en el rgano afectado, por lo que ste no se transmite a su descendencia; mientras que en la segunda se afecta al vulo o al espermatozoide, por lo que el gen teraputico es heredado a las siguientes generaciones. Actualmente, dadas las dificultades tcnicas y ticas, la terapia gnica es principalmente somtica (Shuchman y Desnick, 1996). Las enfermedades monognicas son el blanco ms fcil para desarrollar nuevas terapias, a pesar de que su frecuencia es baja con relacin a los padecimientos multifactoriales (Smith, 1999). La dificultad para desarrollar una terapia gnica en estas ltimas se debe a que en su etiologa existe la participacin de varios genes y del ambiente. Por ejemplo, en individuos que han heredado la predisposicin a padecer cncer, no necesariamente lo desarrollan. Factores ambientales como la dieta, el tabaquismo y otros contribuyen tambin en el desarrollo de la enfermedad. La terapia gnica est en sus inicios y actualmente est en etapa experimental en la mayora de los protocolos clnicos. A la fecha, an existen muchas limitantes para el desarrollo de la terapia gnica en humanos. La

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primera limitante es la introduccin eficiente del gen teraputico a la clula blanco. sta se realiza con vectores que liberan los genes teraputicos dentro de las clulas de los pacientes, los ms comunes son los virus en los cuales se manipula su genoma para eliminar genes patolgicos y en su lugar insertar genes teraputicos. Sin embargo, el uso de los virus como vectores ha representado serios problemas en la transferencia de genes debido a sus efectos como toxicidad, respuesta inmune en contra de elementos virales, procesos inflamatorios y ausencia de control de la expresin gentica en el tejido blanco. Se han considerado otras alternativas a los virus como los liposomas (DNA, lpidos y protenas) o la transfeccin con DNA desnudo; sin embargo, la transferencia mediante estos mtodos ha mostrado una eficiencia baja y el gen teraputico tiene una expresin ms transitoria que cuando se utilizan vectores virales (Prince, 1998). Otra de las limitaciones es que de los menos de 50,000 genes que se han estimado presenta el genoma humano slo se conoce la funcin de un pequeo nmero de ellos. El alto costo asociado con el desarrollo de esta nueva tecnologa, regulaciones asociadas en la experimentacin en humanos y las consideraciones ticas, tambin son limitaciones para la terapia gnica.

8. CONCLUSIONES

A lo largo de este captulo se ha mostrado el extraordinario desarrollo que ha tenido la Gentica Humana a partir del surgimiento de la Biologa Molecular. Estos avances han permitido el diagnstico de certeza y la deteccin de portadores de padecimientos autosmico recesivos o ligados al cromosoma X; siendo uno de los principales objetivos de la deteccin de portadores el

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identificar a los familiares con riesgo de tener descendencia afectada. As tambin, el conocimiento de las mutaciones que afectan un gen particular ha conducido al entendimiento de la fisiopatologa de las enfermedades mediante la correlacin del genotipo con el fenotipo de los pacientes, an cuando este ltimo se presente como una forma atpica o no clsica de la enfermedad, como en el caso de los pacientes con ausencia congnita de vasos deferentes provocado por mutaciones especficas en el gen de la fibrosis qustica. Otro de los grandes logros de la Biologa Molecular es sin duda la posibilidad del diagnstico presintomtico en algunos padecimientos como la enfermedad de Huntington, la hemocromatosis, el cncer o la enfermedad de rin poliqustico del adulto. Este diagnstico actualmente es posible realizarlo a travs de diversas tcnicas moleculares que permiten establecer si un individuo hered una mutacin gnica antes de presentar sintomatologa clnica. Este tipo de diagnstico conlleva a tomar decisiones reproductivas acertadas y en algunos casos permite mejorar la supervisin mdica de los individuos afectados. Por ejemplo, en las mujeres donde se detectan genes alterados que condicionan una predisposicin a desarrollar cncer de mama (BRCA1 y BRCA2), se sugiere la realizacin de mamografas a edades ms tempranas que la poblacin general, con el fin de detectar el desarrollo de la neoplasia en estadios tempranos y otorgar un tratamiento oportuno. Es necesario hacer nfasis en que el tamizaje presintomtico de las enfermedades genticas tiene implicaciones sociales y psicolgicas. En todos los casos se debe valorar el costo y la estigmatizacin o discriminacin social que se condiciona ante un resultado positivo contra la utilidad y necesidad de una deteccin presintomtica. Otros parmetros que deben tomarse en cuenta son

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el derecho que tiene cada individuo para decidir si desea o no ser analizado y la potencial invasin a la privacidad del ser humano. Los aspectos sociales, psicolgicos y ticos del tamizaje gentico sern ms complejos a medida que nuevas metodologas sean accesibles para este tipo de diagnstico. Por ejemplo, an cuando el diagnstico presintomtico es posible en la enfermedad de Huntington, nicamente alrededor del 20% de las personas con riesgo de presentarla solicitan este tipo de diagnstico, lo cual se debe principalmente al hecho de que a la fecha no se cuenta con un tratamiento efectivo. Una de las aplicaciones de la Biologa Molecular que cada da toma ms importancia es el diagnstico prenatal. Con el conocimiento de los genes responsables de algunas patologas desde hace varios aos es posible realizar el diagnstico en etapa prenatal de estos padecimientos y ms an, actualmente es posible realizar el diagnstico preimplantacin, que se basa en el anlisis de una clula en etapa de blastocisto o bien del cuerpo polar y tiene como objetivo implantar en el tero slo embriones sanos, evitando as la interrupcin de un embarazo en etapas avanzadas de la gestacin. La meta de esta avalancha de conocimientos es sin duda la terapia gnica, en la cual aunque existen resultados prometedores an se requiere un mayor esfuerzo para lograr tratamientos efectivos y seguros. Estos conocimientos adquieren mayor relevancia si se considera que patologas complejas y altamente frecuentes en la poblacin como la diabetes, hipertensin, cncer y las enfermedades autoinmunes tienen un componente gentico y aunque los estudios moleculares para definir los factores genticos en este grupo de enfermedades tienen mayores limitaciones que en las enfermedades monognicas. Evidentemente, en un futuro los conocimientos

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adquiridos permitirn lograr un diagnstico ms certero en este tipo de patologa y mejores estrategias de prevencin y manejo.

ABREVIATURAS

PGH HDLCX DMD DUP DD DI SSCP AS FQ

Proyecto de genoma humano. Herencia dominante ligada al cromosoma X. Distrofia muscular de Duchenne. Disoma uniparental Diagnstico molecular directo. Diagnstico molecular indirecto. Anlisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla. Anlisis de heterodplex. Fibrosis qustica.

BIBLIOGRAFA

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INFORMACION COMPLEMENTARIA EN INTERNET (LINKS) http://www.geneclinics.org/profiles/all.htlm Acceso a una pgina de la Universidad de Washington de Seatle, EUA. Contiene un resumen de las enfermedades hereditarias monognicas ms frecuentes, abordando los aspectos epidemiolgicos, genticos, diagnsticos, moleculares y terapeticos. Tambin incluye accesos a laboratorios que realizan el diagnstico molecular, as como Asociaciones y Fundaciones del padecimiento. http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/index.htlm Pgina elaborada por el U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health y el National Cancer Institute. Provee informacin detallada sobre las ventajas, limitaciones, desventajas del diagnstico gentico y molecular en enfermedades hereditarias. http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/

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Pgina elaborada por el Crown Human Genome Center & Bioinformatics Unit, del Weizmann Institute of Science. Es un banco muy completo de datos sobre genes humanos, sus productos y las enfermedades hereditarias que condicionan. Provee informacin concisa sobre las secuencias gnicas humanas hasta ahora descritas, las secuencias de los mRNA, cDNA, polimorfismos, enfermedad relacionada, posicin en el mapa citogentico, fsico y gentico. Menciona las mutaciones ms frecuentes en las enfermedades descritas. http://bisance.citi2.fr/GENATLAS/ Sitio creado por diversas instituciones francesas, como el INSERM. En esta pgina se encontrarn las caractersticas principales de ms de 20,000 marcadores hasta ahora descritos, as como 9,396 genes y 1970 padecimientos hereditarios actualizados mensualmente. http://www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/searchgenes.pl http://www.esquilax.com/nifty/ Pginas web que contienen informacin sobre ms de 10,300 genes, incluyendo marcadores asociados. http://www.cephb.fr/bio/ceph-genethon-map.htlm Pgina auspiciada por el CEPH-Gnthon de Francia. Contiene informacin sobre genes y marcadores en el humano. http://www.ocml.gov/hgmis/project/info.htlm Pgina oficial del Proyecto del Genoma Humano. En ella se encuentra toda la informacin obtenida da a da. Incluye la historia, los objetivos, logros y consideraciones ticas del PGH.

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Tabla 1. Mtodos utilizados para la deteccin de mutaciones especficas

Mtodo Observaciones Digestin con endonucleasas de Solamente cuando la mutacin crea o elimina productos de un sitio de restriccin. PCR Hibridacin alelo especifica con Mtodo general para mutaciones puntuales. oligonucletidos (ASO) Southern blot Grandes deleciones, inserciones, mutaciones en sitios de restriccin, mutaciones completas en expansin de tripletas. Polimorfismos conformacionales en Pequeas mutaciones, tamizaje de mutaciones cadenas sencillas de DNA (SSCP), desconocidas heterodplex RT-PCR Anlisis de RNA, mutaciones que afectan sitios de splicing. Anlisis de protenas truncadas (PTT) Mutaciones que producen codones de terminacin prematuros Hibridacin in situ con sondas Rearreglos cromosmicos: translocaciones, fluorescentes (FISH) deleciones, cromosomas marcadores, etc.

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PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Ensayo de PCR mltiple en distrofias musculares de Duchenne/Becker (DMD/DMB). Las deleciones parciales intragnicas frecuentes en el gen DMD se demuestran rpida y fcilmente por esta tcnica. Aqu se muestran los resultados de 9 pacientes con DMD/DMB, ntese que existen diversas deleciones en los carriles 1 al 7, asimismo puede evidenciarse la eliminacin del exn 16 al 49 en el paciente del carril 8; ste ltimo posteriormente se corrobor que tena una delecin completa del gen (una delecin de +/- 2.3 Mb). El control sano (CS) muestra la integridad de todos lo exones al igual que el paciente del carril 9, el cual no tiene delecin en el gen DMD, por lo que posiblemente tenga una mutacin de tipo puntual o una duplicacin, ambas no evidenciables por esta tcnica. MPM, marcadores de tamao molecular.

Fig. 2. Evaluacin de dosis gnica en una familia con distrofia muscular de Duchenne mediante PCR mltiple cuantitativo. A) Pedigree; B) reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en los miembros de la familia y en dos controles sanos; CF: control femenino; CM: control masculino; C) evaluacin de la dosis gnica en cada uno de los individuos estudiados. Se muestra que la madre (I-1) y las hijas II-2, II-3, comparadas con el control femenino sano (CF) tienen una reduccin del 50% de la dosis para los exones 12 y 17 y una dosis gnica normal para el exn 50, por lo que son portadoras del padecimiento. El hermano sano muestra la integridad de la dosis gnica de hemicigoto para los tres exones al igual que el control masculino sano (CM). Las hermanas II-5 y II-

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6 muestran una dosis gnica similar a la del CF por lo que no son portadoras del padecimiento. Este estudio bajo condiciones experimentales cuidadosamente controladas brinda un 100% de certeza en el diagnstico de portadoras de deleciones en el gen DMD y es aplicable a otros padecimientos que cursen con deleciones o duplicaciones gnicas. MP, marcadores de tamao molecular.

Fig. 3. En la fibrosis qustica (autosmico recesiva), se busca inicialmente y en forma dirigida la mutacin fundadora denominada F508. Esta mutacin se localiza en el exn 10 y se identifica mediante la amplificacin por PCR, mutagnesis dirigida y ensayo de restriccin. El estudio permite identificar a individuos afectados homocigotos (II-1, II-2), a portadores sanos (I1, I-2, II-3, II-4) y a individuos feno y genotpicamente sanos (II-5). MPM, marcadores de tamao molecular.

Fig. 4. Autorradiografa de anlisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP) para el exn 12 del gen FQ. Dada la amplia variedad de mutaciones puntuales u otras mutaciones pequeas en este gen, las metodologas de tamizaje son de suma utilidad para la identificacin rpida de dichas mutaciones. Ntese que las muestras del carril 1 y 3 muestran una migracin anmala con respecto a la muestra control del carril 5, lo que sugiere la presencia de una mutacin que debe ser caracterizada mediante secuenciacin. Las muestras de los carriles 2 y 4 no parecen tener una mutacin en este exn.

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Fig. 5. Esquema del empleo de marcadores intragnicos en padecimientos hereditarios monognicos y con gran heterogeneidad en el tipo de mutaciones. En la neurofibromatosis tipo I, la amplia variedad de mutaciones que ocasionan el cuadro clnico, as como el gran tamao del gen, no permite con facilidad ni rapidez la caracterizacin de dichas mutaciones, por lo que se prefiere el empleo de marcadores intragnicos altamente polimrficos y con riesgo muy bajo de recombinacin. Ello permite brindar un asesoramiento gentico de certeza y la posibilidad de realizar diagnstico prenatal, ya que un ensayo como el que se muestra puede concluirse en menos de una semana. El esquema de marcadores tipo microsatlite muestra que el producto (caso ndice) porta el alelo C que cosegrega con la neurofibromatosis tipo I de origen paterno.

Captulo 11 La Gentica de las enfermedades complejas Vicente Baca 1 y Lorena Orozco2

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Departamento de Reumatologa e Inmunologa, Hospital de Pediatra, Centro Mdico Nacional Siglo XXI, Mxico, D.F.

Laboratorio de Biologa Molecular, Departamento de Investigacin en Gentica Humana, Instituto Nacional de Pediatra, S. S, Mxico, D.F.

Email: v_baca_ruiz@ncifcrf.gov PALABRAS CLAVE: Enfermedades complejas, herencia multifactorial, SNPs, asociacin, ligamiento, prueba de TDT.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivos del captulo. 3. Herencia multifactorial. 4 Estudios que evidencian la participacin de los factores genticos en las enfermedades complejas. 4.1 Estudios en familias. 4.2 Estudios en gemelos. 4.3 Estudios en individuos dados en adopcin. 5. Mapeo gentico de enfermedades complejas. 5.1 Anlisis de ligamiento. 5.2 Estudios de asociacin. 5.2.1 Causas de asociacin. i) Efecto directo del marcador allico en estudio.

ii) Desequilibrio de ligamiento. iii) Estratificacin de la poblacin. 5.2.2 Uso de SNPs en los estudios de asociacin. 5.3 Prueba de TDT. 5.4 Modelos animales. 6. Conclusiones. Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

La gentica mdica comprende el estudio de las bases genticas de las enfermedades del ser humano. Tradicionalmente, los genetistas se han dedicado al estudio de trastornos relativamente poco comunes causados por alteraciones cromosmicas o defectos en un solo gen. Este hecho ha conducido a importantes avances en el mapeo y caracterizacin de los genes responsables de un gran nmero de enfermedades monognicas o mendelianas. Sin embargo, las enfermedades mendelianas constituyen slo una pequea parte del total de las enfermedades genticas en el ser humano. La mayora de las malformaciones congnitas y enfermedades comunes como la diabetes, el asma, el cncer y las enfermedades cardiovasculares, son el resultado de la compleja interaccin entre factores ambientales y mltiples genes. Ocasionalmente, algunos de estos genes pueden tener un efecto importante sobre la enfermedad, como es el caso del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA) en un gran nmero de

enfermedades autoinmunes; no obstante, la gran mayora de ellos slo ejercen un efecto modesto en el riesgo a desarrollar la enfermedad. Estos genes tienen poca contribucin en la recurrencia de las enfermedades complejas en las familias; por lo tanto, las estrategias analticas que han sido exitosas en el mapeo de genes responsables de las enfermedades mendelianas, han sido poco efectivas en la identificacin de genes involucrados en las enfermedades complejas. Los recientes avances en la secuenciacin del genoma humano, la construccin del mapa que contiene las variantes polimrficas de una sola base (SNPs) y el gran desarrollo de la tecnologa molecular e informtica, proveen un nuevo punto de partida para el entendimiento de las bases genticas de las enfermedades complejas.

2. OBJETIVO DEL CAPTULO

En este captulo se proporcionan algunos fundamentos para el entendimiento de la herencia multifactorial y se discuten las estrategias que pueden ser utilizadas en el mapeo de genes que predisponen al desarrollo de las enfermedades comunes.

3. HERENCIA MULTIFACTORIAL

Las enfermedades o fenotipos causados por la interaccin aditiva de mltiples genes se denominan polignicas, pero cuando adems intervienen factores ambientales, stas se definen como multifactoriales o complejas. Se piensa que

los factores genticos y ambientales son capaces de causar enfermedad cuando en combinacin, alcanzan el umbral de susceptibilidad (Fig. 1).

4. ESTUDIOS QUE EVIDENCIAN LA PARTICIPACIN DE LOS FACTORES GENTICOS EN LAS ENFERMEDADES COMPLEJAS

La evidencia de que los factores genticos juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedades complejas viene principalmente de estudios epidemiolgicos que comparan la frecuencia de una enfermedad en individuos genticamente relacionados, con la de la poblacin general. A continuacin se describen varios de los mtodos que han sido utilizados para demostrar la participacin de factores genticos en las enfermedades multifactoriales.

4.1 Estudios en familias

Cuando cierta enfermedad se presenta con mayor frecuencia entre parientes de primer grado que en la poblacin general (agregacin familiar), se sugiere la participacin de factores genticos. Los estudios familiares definen el riesgo que existe a desarrollar cierta enfermedad entre los parientes de los casos afectados. Este riesgo es proporcional al grado de parentesco que se tenga con el paciente. Sin embargo, debe de tomarse en cuenta que los miembros de una familia, adems de compartir sus genes, tambin comparten un ambiente comn, por lo que no todo lo que se presenta como familiar es necesariamente gentico, y

aunque pocas entidades son influenciados slo por los genes o por el ambiente, en la mayora participan ambos. Este tipo de estudios pueden proporcionar alguna informacin acerca de la participacin gentica en diferentes enfermedades, aunque no permiten discriminar con certeza la influencia de los factores genticos y ambientales. Determinar la influencia de los factores genticos y/o ambientales en el desarrollo de las enfermedades permite entender mejor su etiologa y as, establecer medidas preventivas. Por ejemplo, en enfermedades en las cuales la influencia gentica es relativamente baja como en el cncer de pulmn, se pueden establecer medidas preventivas eficaces, como evitar el tabaquismo.

4.2 Estudios en gemelos

Los gemelos monocigticos (MC o idnticos) se originan cuando el embrin en desarrollo se divide y se separa para formar dos embriones que comparten el 100% de sus genes. Estos son un ejemplo de clonas que ocurren naturalmente. Los gemelos dicigticos (DC) resultan de una doble ovulacin seguida por la fertilizacin independiente de cada vulo (por espermatozoides diferentes). As los gemelos DC, al igual que cualquier par de hermanos, comparten aproximadamente el 50% de sus genes. Varios autores han utilizado estudios en gemelos para diferenciar la influencia cuantitativa de los factores genticos y ambientales en el desarrollo de la enfermedad. Estos tipos de estudios comparan la frecuencia con la que se presenta una enfermedad en ambos gemelos MC (concordancia) con la de

gemelos DC. Por ejemplo, en las enfermedades donde existe una gran influencia de los factores genticos, se espera que la concordancia entre gemelos MC sea mayor que en gemelos DC; sin embargo, en las enfermedades multifactoriales la interpretacin de estos resultados puede ser poco confiable. Por otro lado, los valores absolutos de concordancia son dependientes de la prevalencia de la enfermedad en la poblacin, es decir, la concordancia entre gemelos aumenta conforme la prevalencia de la enfermedad se incrementa, independientemente de la contribucin gentica. Por lo tanto, los datos aislados de la concordancia entre gemelos slo proporcionan una estimacin limitada de la contribucin gentica en el desarrollo de la enfermedad. Por ejemplo, se ha observado que en la artritis reumatoide (AR) la concordancia entre gemelos MC es aproximadamente del 15%. Esta observacin parecera indicar que la contribucin gentica en el desarrollo de AR es baja, sin embargo, el anlisis de heredabilidad demuestra que los factores genticos tienen una contribucin de aproximadamente el 60% en el desarrollo de la AR. Heredabilidad es un concepto estadstico que se refiere a la proporcin de la varianza total que es causada genticamente en una enfermedad y es una forma ms confiable de medir la contribucin relativa de los factores genticos y ambientales en el desarrollo de las enfermedades multifactoriales.

4.3 Estudios en individuos dados en adopcin

Este tipo de estudios tambin son utilizados para estimar la contribucin de los factores genticos en las enfermedades complejas. Para este anlisis se incluyen nios nacidos de padres que padecen alguna enfermedad y que son adoptados

por padres que no la padecen. La frecuencia con la que estos nios desarrollan la enfermedad se compara con la de nios dados en adopcin nacidos de padres sin la enfermedad. Es importante hacer nfasis de que los nios adoptados que presentan la enfermedad no comparten el mismo ambiente que sus padres biolgicos. La aplicacin ms comn de este mtodo ha sido en algunos padecimientos psiquitricos como la esquizofrenia. Por ejemplo, entre el 8 y el 10% de los nios nacidos de padres con esta enfermedad y que son dados en adopcin, desarrollan el padecimiento, mientras que ste slo se presenta en el 1% de los nios adoptados nacidos de padres sin esquizofrenia. As, estos datos sugieren que existen factores genticos involucrados en el desarrollo de esta patologa.

5. MAPEO GENTICO DE ENFERMEDADES COMPLEJAS

Actualmente se encuentran disponibles una gran variedad de estrategias para identificar los factores genticos involucrados en las enfermedades mendelianas y complejas. El anlisis de ligamiento o linkage, y los estudios de asociacin son dos mtodos analticos complementarios utilizados para detectar tanto regiones genticas especficas, como genes que estn involucrados en el desarrollo de la enfermedad.

5.1 Anlisis de ligamiento

El ligamiento se refiere a las posiciones de los loci en el mismo cromosoma y se habla de ligamiento cuando los alelos de dos loci son transmitidos juntos en la siguiente generacin, debido a su estrecha proximidad. Los estudios de ligamiento se realizan en individuos relacionados, ya sea en hermanos (sib pair analysis) o en pedigrees extensos. Los estudios de ligamiento permiten determinar si un marcador gentico y el gen que predispone a la enfermedad se encuentran fsicamente ligados mediante el anlisis de la cosegregacin del marcador y el fenotipo de la enfermedad. En este tipo de estudios, la cosegregacin de un alelo especfico del marcador (por ejemplo alelo A) y el locus de la enfermedad se observa dentro de una misma familia; sin embargo, en familias no relacionadas, otros alelos diferentes del marcador pueden cosegregar con la enfermedad (ejemplo alelo B) (Fig. 3). Es decir, el ligamiento crea asociaciones dentro de las familias pero no necesariamente entre familias. Si se estudia una nmero extenso de familias y se encuentra que no existe una asociacin preferencial entre el gen de la enfermedad y un alelo especfico de un locus marcador, se dice que ambos loci se encuentran en equilibrio de ligamiento. Por ejemplo, si existen dos loci estrechamente ligados con dos alelos cada uno (A,a en el locus 1 y B,b en el locus 2), entonces existen 4 posibles haplotipos (combinaciones de dos o ms alelos en el mismo cromosoma): AB, Ab, aB y ab. Estos haplotipos se transmitirn al azar dentro de las familias. No obstante, algunas veces se observa que la cosegregacin de estos alelos es mayor a la frecuencia esperada y entonces se dice que existe desequilibrio de ligamiento. A partir del uso de los marcadores genticos en los estudios de ligamiento, la Gentica Mdica ha mostrado un dramtico progreso. El descubrimiento de los

fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLPs) y posteriormente, de los microsatlites o repetidos cortos en tandem (STRs), condujeron al mapeo de un gran nmero de genes responsables de las enfermedades mendelianas. Los RFLPs son cambios o variaciones en la molcula de DNA que eliminan o crean un sitio de restriccin para una endonucleasa especfica; mientras que los microsatlites son regiones de DNA constituidas por aproximadamente 10 a 50 copias de pequeas secuencias, de 1 a 6 pares de bases de longitud, repetidas en tandem. Estas secuencias repetidas se distribuyen al azar dentro del genoma humano. En la prctica, se prueban alrededor de 350 marcadores altamente polimrficos (locus que tiene mltiples alelos diferentes en la poblacin) que se encuentran distribuidos en forma ms o menos uniforme en el genoma, cada uno separado por aproximadamente 10 millones de pares de bases. Con esta estrategia es posible que uno de estos marcadores se encuentre lo suficientemente cercano al locus de la enfermedad, de manera que uno de sus alelos pudiera estar ligado a l. Esta estrategia es conocida como anlisis extenso del genoma (genome-wide screen) y ha sido particularmente til en el mapeo de enfermedades mendelianas tales como la enfermedad de Huntigton y tambin, en algunos casos de enfermedades complejas que muestran una herencia mendeliana simple, como la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano. La evidencia estadstica de ligamiento es medida convencionalmente como el LOD score, que es el logaritmo de base 10 del cociente de dos probabilidades: la probabilidad de que dos loci se encuentran ligados entre la probabilidad de que no haya ligamiento. Es por ello que los LOD scores positivos estn a favor de

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ligamiento, mientras que valores negativos indican que el ligamiento es poco probable. Convencionalmente se ha considerado que un LOD score mayor a tres es una evidencia de ligamiento entre dos loci especficos. En las enfermedades complejas es difcil obtener grandes pedigrees multigeneracionales debido a la participacin de mltiples genes y a la fuerte influencia de los factores ambientales en su desarrollo. Por lo tanto, el anlisis tradicional de ligamiento resulta ser imprctico para el estudio de estas enfermedades. As pues, el anlisis de pares de hermanos afectados (affected sibpair analysis) ha sido el mtodo mas comnmente utilizado en las enfermedades complejas. La lgica de esta estrategia es simple: cuando un par de hermanos padecen la misma enfermedad gentica se espera un incremento en la proporcin de hermanos que comparten un marcador allico si ste se encuentra aledao al gen responsable de la enfermedad. Es decir, dado que los hermanos comparten la mitad de sus genes, es de esperarse que el 50% de los pares de hermanos compartan el mismo alelo cuando ste no se encuentre ligado al locus de la enfermedad. Sin embargo, cuando un marcador es compartido en ms de la mitad de los pares de hermanos afectados (por ejemplo 75%) esto podra ser una evidencia de que el marcador se encuentra ligado al locus de la enfermedad. Por ejemplo, si escogemos cualquier segmento cromosmico al azar y asumimos que podemos definir cuatro alelos parentales, se espera que cualquier par de hermanos compartan 2, 1 o 0 alelos en una proporcin del 25, 50 y 25% respectivamente (Fig. 4). Si analizamos pares de hermanos afectados con la misma enfermedad y observamos un incremento en la proporcin de hermanos que comparten uno o los dos alelos, se sugiere la presencia de ligamiento del

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marcador con el locus de la enfermedad. Esta estrategia fue utilizada para demostrar que la regin de HLA contribuye a la susceptibilidad para desarrollar diabetes tipo I.

5.2 Estudios de asociacin

La aplicacin de los estudios de ligamiento en el mapeo de los genes responsables de las enfermedades mendelianas, ha tenido un poder limitado en la deteccin de genes con un efecto modesto, como en la diabetes, hipertensin, asma, cncer, artritris reumatoide, padecimientos psiquitricos, etc., donde los estudios de asociacin han mostrado mejores resultados. Los conceptos de asociacin y ligamiento son frecuentemente confundidos. A diferencia de los estudios de ligamiento, donde se analiza la cosegregacin de un marcador con la enfermedad entre los miembros de una familia, los estudios de asociacin comparan las frecuencias de este marcador entre casos no relacionados y controles, e investigan su ocurrencia simultnea con la enfermedad a nivel de la poblacin (Fig. 5). Es decir, el trmino asociacin se entiende como la confirmacin estadstica que define la co-ocurrencia de alelos o fenotipos en la poblacin general. Una significativa asociacin del marcador con la enfermedad sugiere un gen candidato en la etiologa de la enfermedad. Por otro lado, los estudios de ligamiento siempre conducen a asociacin, pero en la mayor parte de los casos esta asociacin es solamente intrafamiliar, es decir, no existe asociacin a nivel de la poblacin; en cambio, la asociacin puede o no ser debida a ligamiento.

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5.2.1 Causas de asociacin

i) Efecto directo del marcador allico en estudio. En algunas ocasiones el marcador utilizado es un polimorfismo intragnico que altera la secuencia de aminocidos o afecta la transcripcin, por lo que los diferentes alelos pueden mostrar diferencias en la cantidad o calidad del producto gnico y tener un efecto directo en la susceptibilidad a desarrollar la enfermedad. En estos casos, se espera que en cualquier poblacin estudiada se encuentre la misma asociacin (a menos que las causas de la enfermedad varen de una poblacin a otra). ii) Desequilibrio de ligamiento. Si la causa de asociacin es debida a desequilibrio de ligamiento, esto significa que el gen portador de la mutacin se encuentra en estrecha proximidad al marcador polimrfico. Debido a que el desequilibrio de ligamiento depende del efecto fundador ejercido sobre la poblacin, una enfermedad puede mostrar asociacin con alelos diferentes de un marcador en las diferentes poblaciones; por ejemplo, el alelo A puede encontrarse asociado con la enfermedad en una poblacin, mientras que en otra poblacin el alelo observado puede ser el B, e incluso en poblaciones muy mezcladas podra no existir asociacin con ninguno de estos alelos. iii) Estratificacin de la poblacin. Si en una poblacin existen subgrupos que no tienden a mezclarse, esto puede condicionar a que tanto la enfermedad como algunos marcadores allicos podran ser ms comunes entre los individuos de un subgrupo. En estos casos, los estudios de asociacin pueden dar resultados falsos positivos (Fig. 6). Para evitar falsas asociaciones secundarias a la

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estratificacin de la poblacin, los controles debern ser pareados con los casos por factores relevantes como etnicidad y origen geogrfico.

5.2.2 Uso de SNPs en los estudios de asociacin

En los estudios de asociacin se ha considerado que los marcadores genticos de eleccin para el mapeo de genes son los polimorfismos denominados SNPs. Estos marcadores son la fuente ms comn de variacin gentica en el ser humano y se estima que en promedio existe un SNP cada 1,000 a 2,000 nucletidos. Por lo tanto, si el genoma humano contiene 3.2 billones de nucletidos, entonces se puede deducir que existen de 1.6 a 3.2 millones de SNPs. Reconociendo el potencial de los SNPs en el mapeo gentico de las enfermedades complejas se form un grupo internacional encaminado a la caracterizacin de los mismos. Recientemente, los resultados de este esfuerzo internacional han reportado un mapa conteniendo 1.42 millones de SNPs distribuidos en todo el genoma humano. La mayora de estos marcadores son biallicos, muy estables (tienen una baja tasa de mutacin recurrente) y es posible su genotipificacin a gran escala en aparatos automatizados. En los estudios de asociacin se han propuesto dos estrategias para el mapeo de genes utilizando los SNPs. En la primera de ellas, Risch y Merikangas (1996) sugirieron el estudio de SNPs localizados en las regiones promotoras o codificadoras de los genes por su alta probabilidad de afectar su funcin. Sin embargo, si se toma en cuenta la reciente cifra de genes estimada por el Proyecto del Genoma Humano, en los estudios de asociacin que involucren el genoma

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completo, se requerir el anlisis de 30,000 a 40,000 genes que, aunado a la propuesta de que existen al menos 4 polimorfismos comunes dentro de las regiones reguladoras y codificadoras de los genes, implicara el anlisis de aproximadamente 120,000 a 160,000 SNPs. La segunda estrategia fue propuesta por Collins y col., (1997) quienes sugirieron el estudio extenso de SNPs distribuidos uniformemente a lo largo del genoma humano, tanto en regiones codificadoras como en no codificadoras, de tal manera que existe una alta probabilidad de que cada gen contenga o est flanqueado por al menos uno de estos SNPs, permitiendo as la deteccin indirecta de los loci de susceptibilidad a enfermedades a travs del desequilibrio de ligamiento. No obstante, para esta ltima estrategia, tambin se ha estimado que se requiere el estudio de un gran nmero de SNPs, que asciende cuando menos a 500,000. Actualmente, ambas estrategias presentan limitantes tecnolgicas y serios cuestionamientos acerca de su costo y validez, por lo que en estos momentos la estrategia mas eficaz en el mapeo de genes est enfocada al anlisis de polimorfismos en genes candidatos que codifican para protenas cuya funcin es conocida y que tienen un efecto potencial en el fenotipo de la enfermedad. Los estudios de asociacin se han aplicado con mucho xito en el estudio de la correlacin de las enfermedades autoinmunes con diferentes genes del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA), los cuales estn involucrados en la respuesta inmune. Los estudios de asociacin y de ligamiento en pares de hermanos afectados han demostrado que los genes de la regin HLA estn involucrados en ms de 100 enfermedades. Por ejemplo, el HLA subtipo B27 se encuentra en el

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90% de los pacientes con espondilitis anquilosant, comparada con el 10% de la poblacin general.

5.3 Prueba de TDT

Los estudios de asociacin en familias han llegado a ser muy utilizados en la identificacin de genes involucrados en las enfermedades complejas, ya que a diferencia de los estudios de asociacin en casos y controles, los estudios familiares evitan falsas asociaciones debidas a la estratificacin de la poblacin. Uno de estos mtodos es la prueba de desequilibrio de transmisin (TDT; transmission disequilibrium test), la cual se introdujo originalmente para identificar ligamiento entre una marcador y un gen candidato, en casos donde previamente se haba demostrado asociacin mediante estudios de casos y controles. No obstante, esta prueba es vlida an en aquellos casos donde no existe evidencia previa de asociacin y puede detectar asociacin slo si el marcador allico se encuentra ligado al locus de la enfermedad, es decir esta prueba es considerada tanto de ligamiento como de asociacin. La prueba de TDT compara la frecuencia con la cual los padres heterocigotos transmiten un alelo especfico de un marcador biallico o su forma alterna al hijo afectado. Si el marcador allico se encuentra en desequilibrio de ligamiento con el locus de la enfermedad o ste tiene un efecto directo en la susceptibilidad de la misma, se observar una desviacin significativa de la frecuencia de transmisin esperada para cualquiera de los dos alelos (50%) (prueba de TDT positiva) (Fig. 7).

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5.4 Modelos animales

Los modelos animales constituyen una herramienta invaluable para el estudio gentico de las enfermedades complejas del ser humano, donde el ratn es el animal ms comnmente utilizado. Una de las ventajas de este tipo de estudios es la posibilidad de contar con un gran nmero de descendientes a partir de un solo par de progenitores, que pueden ser cruzados en forma selectiva para el estudio de la posible interaccin entre diferentes genes que contribuyen a la susceptibilidad de la enfermedad. Los genes candidatos de las enfermedades en el humano pueden ser inactivados o manipulados mediante la generacin de ratones knock out o ratones transgnicos. As, los estudios de ligamiento en modelos animales han permitido el mapeo de regiones genticas y la identificacin de genes en varias enfermedades multifactoriales. Por ejemplo, el modelo de ratn de la diabetes tipo I presenta homologa en algunos de sus genes y regiones genticas involucradas con la enfermedad en el humano. Sin embargo, debe de considerarse que la identificacin de genes de susceptibilidad en otras especies de mamferos, no siempre tienen el mismo efecto en el ser humano.

6. CONCLUSIONES

La identificacin de los genes responsables de las enfermedades complejas contina siendo uno de los grandes retos de la gentica mdica. Los anlisis de ligamiento y clonacin posicional que se han aplicado con xito en el estudio de las enfermedades monognicas, han arrojado resultados modestos en el mapeo

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de genes involucrados en las enfermedades complejas en las cuales, los estudios de asociacin han sido considerados una mejor alternativa. La reciente publicacin de la secuencia completa del genoma humano y la ya disponible en otras mltiples especies, abren un nuevo panorama en el estudio gentico de las enfermedades complejas. Sin embargo, con excepcin de los gemelos MC, no existen individuos con secuencias genticas idnticas y an cuando dos genomas tengan aproximadamente un 99.9% de homologa, quedan millones de diferencias entre los 3.2 billones de pares bases que conforman al genoma humano. La gentica mdica simplemente no existira sin el entendimiento de esta variacin, ya que son estas diferencias heredables las que dan lugar a la variacin fenotpica entre los individuos, incluyendo la susceptibilidad a padecer enfermedades y la respuesta al medio ambiente. Simultneamente con la publicacin de la secuencia del genoma humano, tambin se report un mapa de ste conteniendo los polimorfismos denominados SNPs, los cuales constituyen la fuente de variacin mas comn entre los seres humanos. La enorme contribucin del proyecto del Genoma Humano y del Consorcio de SNPs, promete ser una herramienta sin precedente para los estudios de asociacin en las enfermedades complejas. Sin embargo, actualmente el anlisis de los SNPs en este tipo de estudios presenta las siguientes limitaciones: i) Aunque el 82% de los SNPs se han encontrado con una frecuencia mayor al 10% en el ser humano, an es necesario conocer su frecuencia en poblaciones individuales. Es importante sealar que se espera una frecuencia menor de aquellos polimorfismos con un efecto potencial en la

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funcin, como los que se localizan en las secuencia codificadora de los genes; de hecho los SNPs que cambian la secuencia de aminocidos se presentan con una frecuencia menor al 5%. ii) Es importante definir, hasta donde sea posible, el efecto potencial de los SNPs antes de estudiar su papel en las enfermedades. Es decir, cada SNP puede ser clasificado de acuerdo a su localizacin dentro del genoma; aquellos que se localizan en la regin codificadora (cSNP) pueden ser clasificados de acuerdo a su efecto en la secuencia o la estructura de la protena. Mientras que los SNPs que se localizan en las regiones no codificadoras (ncSNPs) pueden ser clasificados de acuerdo a si se localizan o no, en las regiones reguladoras de los genes. Tomando en cuenta la existencia de 120,000 cSNPs (alrededor 4 por gen) en el genoma humano, se ha calculado que el 40% de estos (50,000) generan cambios en la secuencia de aminocidos. Estas variaciones en la secuencia codificadora, aunada a un nmero desconocido de ncSNPs localizados en las regiones reguladoras, conforman el conjunto de variaciones genticas con un potencial efecto en el fenotipo. En el futuro, la genotipificacin de este conjunto de variantes funcionales ser el requerimiento mnimo para los estudios genticos de asociacin en las enfermedades complejas. iii) An es necesario determinar la metodologa ptima para el anlisis cuantitativo del efecto de miles de variaciones genticas en la susceptibilidad a las enfermedades complejas. iv) Los costos para la genotipificacin de miles de SNPs en miles de pacientes y controles, an son muy elevados.

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En un futuro relativamente cercano, esta serie de obstculos tecnolgicos para el estudio gentico de las enfermedades complejas que aquejan a millones de individuos, podrn ser resueltos con la participacin conjunta de genetistas, epidemilogos, clnicos, matemticos y expertos en computacin, sin perder de vista las numerosas influencias de los factores ambientales y su interaccin con el husped.

ABREVIATURAS

HLA SNPs MC DC AR RFLPs STRs TDT

Complejo mayor de histocompatibilidad. Variantes polimrficas de una sola base. Gemelos monocigticos. Gemelos dicigticos. Artritis reumatoide. Fragmentos de restriccin de longitud polimrfica. Microsatlites o repetidos cortos en tandem. Prueba de desequilibrio de transmisin.

BIBLIOGRAFA

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PIES DE FIGURA

Fig. 1. Modelo esquemtico del umbral en enfermedades complejas.

Fig. 2. Modelo esquemtico de la etipopatogenia de las enfermedades complejas. Las enfermedades complejas son el resultado de la compleja interaccin de mltiples genes con el medio ambiente. El mapeo de genes en los estudios de asociacin se basan en la correlacin de un marcador con la enfermedad (1) y dependen tanto de la correlacin entre el marcador y el locus de la enfermedad (A) como de la correlacin fenotipo-genotipo (B).

Fig. 3. Anlisis de ligamiento en familias no relacionadas. En la primera familia la enfermedad cosegrega con el alelo A, mientras que en la segunda, la misma enfermedad cosegrega con el alelo B.

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Fig. 4. Anlisis de ligamiento en pares de hermanos afectados (affected sib pairs). La segregacin al azar de dos alelos muestra que un par de hermanos afectados tienen una misma probabilidad (25%) de compartir ambos o ningn alelo y del 50% de compartir al menos uno. (*) seala los alelos compartidos.

Fig. 5. Estudios de Asociacin. El alelo B se encuentra ms frecuente entre los casos que entre los controles.

Fig. 6. Estratificacin de la poblacin. La enfermedad y el marcador B son poco frecuentes en el Subgrupo A pero ambos son muy comunes en el Subgrupo B. Cuando los casos y controles son muestreados en la poblacin general, la enfermedad parece estar asociada al alelo B.

Fig. 7. Prueba de desequilibrio de transmisin (TDT). En familias no relacionadas se observa el genotipo de un marcador biallico, encontrndose 5 padres heterocigotos (Aa). El alelo (a) es transmitido 4 veces, mientras que el alelo (A) slo una. Cuando un alelo es transmitido con mayor frecuencia que la esperada (50%) en pacientes no relacionados, como es el caso del alelo (a), se puede inferir que ste se encuentra ligado al locus de la enfermedad, o que tiene un efecto directo en la susceptibilidad de la misma.

Captulo 12 Enfermedades Neurodegenerativas: participacin de la neurotransmisin glutamatrgica Roque Galaz-Vega1 y Arturo Ortega1.
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Departamento de Gentica y Biologa Molecular, Centro de Investigacin y de Estudios

Avanzados del IPN (CINVESTAV-IPN), Mxico, D.F.

Email: arortega@mail.cinvestav.mx y tanis@prodigy.net.mx PALABRAS CLAVE: Neurotransmisin, plasticidad sinptica, neurodegeneracin, glutamato.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivos del captulo. 3. Estado actual del campo. 4. Conceptos generales. 5. Memoria. 6. Hipoxia. 7. Neurodegeneracin. 8. Parkinsonismo. 9. Esclerosis lateral amiotrpica. 10. Perspectivas. Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

En 1960 en el Japn de la posguerra se utiliz extensivamente un preparado obtenido a partir del alga Digenea simplex para erradicar la ascariasis. Este efecto antihlmitico era compartido por una serie de compuestos, especialmente al cido domoico y el cido quisqulico. Posteriormente se identific el principio activo obtenido de Digenea y se le llam cido kanico (KA), trmino japons que significa el fantasma del mar. En esa poca se conoca que el glutamato monosdico, aplicado por microinyeccin provocaba la destruccin de las neuronas ganglionares de la retina de embriones de ratn. Investigaciones electrofisiolgicas realizadas en Japn, probaron que los principios activos de las preparaciones antihelmticas provocaban una importante actividad elctrica cuando eran administradas en preparaciones de neuronas corticales, siendo el cido kanico el que presentaba el mayor efecto. Olney y De Gubareff (1978) repitieron el paradigma del Glutamato monosdico utilizando esta vez al cido kanico, demostratrando el fenmeno que ahora conocemos como excitotoxicidad, el cual consiste en la muerte de la neurona secundaria a la sobrexcitacin. Esto llev a inferir la existencia de receptores que mediaran el efecto de estos anlogos, a los cuales llamaron en un principio receptores para aminocidos excitadores (EAARs). Desde 1974 se conoce que el glutamato presenta dos conformaciones diferentes, una plegada y la otra extendida. En consecuencia, al menos existen dos tipos de receptor con diferentes sitios de reconocimiento para el Glu. El uso de diferentes anlogos de Glu y estudios biofsicos corroboraron esta idea, correspondiendo el KA y el cido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-

isoxazolepropinico (AMPA) a la forma plegada y el cido N-metil-D-asprtico (NMDA) la forma extendida. Este grupo de receptores son canales inicos, permeables a Na+ y K+ y en diferente grado a Ca2+. Adems se encuentra otro grupo de receptores, conocidos como metabotrpicos, con siete segmentos transmembranales, acoplados a un sistema de transduccin mediado por protenas G. El desarrollo de herramientas farmacolgicas y recientemente de biologa molecular, ha permitido explorar los diferentes efectos de la neurotransmisin mediada por al Glu y su participacin en diferentes procesos neurodegenerativos.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

Los objetivos de este captulo son destacar la participacin del Glu en algunos neurotransmisores, as como una introduccin a los eventos moleculares que se conocen actualmente en el campo de la neurobiologa cognitiva y su implicacin en el rea de la salud.

3. ESTADO ACTUAL DEL CAMPO

Por ser el neurotransmisor utilizado por casi la mitad de las sinapsis, la relevancia de Glu es enorme, convirtindolo en el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central. Las vas glutamatrgicas cubren desde las regiones asociadas con integracin de estmulos como mdula espinal, hasta zonas que determinan patrones conductuales complejos, como el hipocampo, pasando por

zonas de integracin motora (cerebelo) y sensorial (hipotlamo). Con la utilizacin de potentes herramientas farmacolgicas, como los agonistas y antagonistas selectivos, se ha comenzado a revelar su funcin en procesos patolgicos en una amplia gama que abarca a enfermedades relacionadas con el envejecimiento como la demencia senil, estados agudos de trauma donde existe isquemia, por ejemplo eventos trombticos y trastornos neurodegenerativos como Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrpica (ALS). Una de las reas con mayor relevancia en la ciencia es el estudio de las bases moleculares de las funciones superiores del cerebro, como lo son el aprendizaje y la memoria. Ambos eventos desencadenados por los receptores ha permitido determinar ciertas respuestas a determinados estmulos, esto bsicamente mediado por una fina red de eventos de fosforilacin que lleva la seal desde el receptor hasta el ncleo. En el ncleo, la respuesta es la activacin de la expresin de algunos genes mediada por algunos factores como AP-1, un factor de trascripcin formado por dmeros de la familia fos y jun. Utilizando el modelo de clulas gliales de Bergmann, un tipo de glia radial que no sufre conversin astroctica y rodea a la sinpsis glutamatrgica ms abundante del cerebelo, se determin cmo la protena ligadora para kainato (KBP) aumenta su expresin posterior a un estmulo de receptores de tipo AMPA/KA, en un modelo de retroalimentacin positiva (Fig. 2). Considerada como un receptor no funcional, la KBP es una protena exclusiva de aves que presenta una incgnita en cuanto a su funcin, aunque existen evidencias de su relacin con el aprendizaje, puesto que durante el perodo de impronta de los pollos se ha visto un aumento en su expresin, semejante a otras molculas involucradas en el aprendizaje.

Otra gran rea de investigacin es la referente a la remocin del neurotransmisor de la hendidura sinptica por medio de los transportadores para glutamato, por la relevancia que implica este evento en la neurodegeneracin. Estudios realizados sobre el transportador GLAST han revelado una regulacin a traves de fosforilacin de estas protenas, apuntando a la protena cinasa C (PKC) como responsable de la inhibicin en el transporte. A esto se han aadido evidencias recientes que sugieren que la fosforilacin en residuos de tirosina es la que lleva a cabo la regulacin fina del transportador (Fig. 3). Por ltimo, es necesario conocer con detalle la microanatoma de los complejos de anclaje y estabilizacin de los receptores para comprender los complejos eventos en los que estn involucrados. Para que la neurotransmisin sea normal, stos deben ubicarse en un espacio preciso de la membrana neuronal, en los polos sinpticos, para lo cual deben existir mecanismos proticos que los transporten desde el lugar donde son traducidos y los fijen en la membrana. Estudios recientes utilizando espectofotometra de masas han revelado cmo se encuentra la ultraestructura que ancla al receptor NMDA, destacndose la presencia de PSD-95, una protena con dominios de unin a protenas PDZ que fijan a estos receptores a traves de su extremo carboxilo terminal al citoesqueleto y mantiene ubicadas en el microambiente a cinasas como Fyn, a enzimas como la xido ntrico sintetasa (NOS) y protenas estabilizadoras de la sinapsis como la neuroligina. Respecto al receptor AMPA, se ha descrito a una protena con funcin similar a PSD-95, la cual se ha denominado GRIP, aunque los dems elementos involucrados an no han sido establecidos.

A continuacin revisaremos algunos de los eventos ms relevantes en los que particpan estos receptores.

4. CONCEPTOS GENERALES

Una sinpsis, definida como elemento anatmico, est integrada por una cavidad real (hendidura) cuyas paredes son las membranas celulares de dos neuronas y un nmero variables de clulas gliales (Fig. 1). Funcionalmente, se compone de una membrana presinptica, que es la membrana axonal de la neurona que libera el neurotransmisor, una membrana postsinptica, donde el neurotransmisor interacta con receptores especficos, y un entorno que rodea al espacio compuesto por glia, que sirve como modulador de la neurotransmisin. Al ser compuesta por membranas, su funcin obedece a la fisiologa de stas, bsicamente regulada por su contenido en protenas transmembranales y gradientes inicos. Este diseo es altamente eficiente. Para que la neurotransmisin se efecte, se requiere de factores con un alto grado de regulacin. Primero, es necesario mantener la ubicacin de la sinapsis a travs de protenas del citoesqueleto que anclan la membrana presinptica con la postsinptica, como la neuroligina. En la cara presinptica de la sinapsis, el Glu es liberado por un mecanismo dependiente de Ca2+ y energa a travs de vesculas, en una concentracin que asegura que los receptores sean activados, alcanzando al momento de su liberacin concentraciones txicas para la neurona

(aproximadamente 1mM). Para evitar el efecto citotxico del Glu se requiere de un complejo sistema de transporte, bsicamente mediado por la glia. Este sistema debe mantener la concentracin del neurotransmisor en un nivel que permita su accin sin que sea txico. A nivel postsinptico, los receptores se encuentran anclados a la membrana en agrupamientos localizados y adems presentan diferentes propiedades farmacolgicas de acuerdo a su funcin. Como anteriormente se dijo, los receptores para Glu se clasifican en dos grupos: los metabotrpicos y los canales inicos, tambin llamados ionotrpicos (Tabla 1). Los primeros son receptores transmembranales de siete segmentos y estn acoplados a un sistema de transduccin mediado por protenas G. Estos se subdividen en tres grupos: el grupo I, cuyo agonista preferente es el quisqualato, que estimulan la actividad de la fosfolipasa C formando diacilglicerol e inositol trifosfato; el grupo II o receptores para cido 1-aminociclopentano-trans-1,3dicarboxlico (t-ACPD) y el grupo III, que inhibe la actividad de la adenilato ciclasa. Los receptores ionotrpicos estn integrados por los receptores de tipo N-metil-Dasprtico (NMDA), canales de cintica de activacin lenta y altamente permeables a Ca2+ y los receptores no NMDA, integrados por los receptores AMPA y KA, que son impermeables a Ca2+ excepto cuando en el ensamblaje del canal falta una subunidad protica llamada GluR2 (Tabla 1). Comparando la cintica de activacin de ambos grupos, a estos ltimos se les conoce tambin como canales inicos rpidos para Glu. A nivel molecular, los receptores ionotrpicos son complejos proteicos formados por cinco diferentes subunidades y las propiedades del receptor estn determinadas por el ensamblaje especfico de ests, muchas veces determinado en forma tejido especfica.

5. MEMORIA

El sustrato fisiolgico de la memoria es la modificacin persistente de las conexiones sinpticas. De acuerdo a esta hiptesis, planteada por Ramn y Cajal (1988) y formalizada por Hebb (1962) la neurona debe modificar su maquinaria en respuesta a un estmulo, en particular al aprendizaje, adaptando sus patrones de expresin gentica, recambio proteico y su citoarquitectura. Las primeras evidencias electrofisiolgicas fueron demostradas en hipocampo, un rea que al presentar dao provoca alteraciones cognitivas y conductuales. Anatmicamente, esta sinpsis la componen la colateral de Schaffer, que es el axn de la clula piramidal localizada en CA3 y la fibra musgosa provienente de los cuerpos neuronales localizados en la mdula oblongata. A su vez, las neuronas de CA1 otra rea hipocampal, participan a travs de sus axones que cruzan hasta la zona CA3. En esta regin anatmica se observ que, posterior al estmulo simultneo de la colateral de Schaffer y la fibra musgosa, la respuesta de la neurona granular del rea CA3 incrementa su magnitud, es decir, quedaba sensibilizada al mismo estmulo por un espacio temporal que se prolongaba a veces hasta das. Este fenmeno se nombr potenciacin a largo plazo (LTP) (Fig. 4). Hasta cierto punto, esto correlaciona con los paradigmas clsicos conductivistas de aprendizaje, en los cuales, para que una conducta sea aprendida, debe existir un refuerzo de sta. En 1982, Ito y colaboradores trabajando en cerebelo describieron el fenmeno opuesto. En un circuito sinptico similar al presentado en hipocampo, describieron cmo la respuesta de la clula de Purkinje se vea disminuida posteriormente a la estimulacin conjunta de la fibra paralela y la trepadora, compartiendo el elemento

temporal observado en la LTP. Este paradigma, conocido como depresin a largo plazo (LTD), tiene especial relevancia si se refiere al marco anatmico del cerebelo, donde la principal funcin de acuerdo a las diferentes alteraciones que se han descrito es la regulacin e integracin del movimiento. El poder de integracin de este circuito es impresionante, puesto que permite atenuar y discriminar independientemente la fuerza de 200,000 estmulos en cada una de la fibras paralelas (Fig. 5). El siguiente paso es explicar a nivel molecular lo observado por electrofisiologa. Adaptando las evidencias experimentales, se comenz a buscar una molcula coincidente, que fuese la integradora de los dos estmulos presentes en ambos paradigmas de aprendizaje. Esta molcula debera localizarse en la membrana, y con una gran posibilidad sera un receptor para glutamato, puesto que es el neurotransmisor preferente tanto en la corteza cerebelar, como en el hipocampo. Adems, se conoce que en ausencia de Ca2+, ninguno de los dos paradigmas se presenta. La caracterizacin molecular y farmacolgica del receptor NMDA es la que tiene la mayor concordancia con la idea de la molcula coincidente. En el modelo molecular de LTD, la liberacin primaria del neurotransmisor activa a los receptores inicos rpidos para glutamato (AMPA/KA), alterando las concentraciones de K+ en la neurona, simultneamente con la activacin de los receptores metabotrpicos que lleva, entre mltiples eventos, a la liberacin de Ca2+ de los almacenes intracelulares. Estos cambios en los gradientes provocan la despolarizacin local de la membrana y activan al receptor NMDA, altamente permeable a Ca2+, al retirar el bloqueo por Mg2+ del receptor, que es dependiente

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de voltaje. La depresin en la magnitud de la respuesta de la clula de Purkinje se explica por una fosforilacin y consecuentemente desensibilizacin de los receptores tanto ionotrpicos como metabotrpicos en estas clulas. Alternativamente, se ha propuesto un papel activo de las clulas gliales en este proceso .

6. HIPOXIA

Dentro de los primeros minutos que siguen a un evento vascular agudo en el sistema nervioso central (infarto, derrame) se presenta una liberacin de Glu y paradjicamente una depresin de la actividad sinptica glutamatrgica. La posible explicacin a este fenmeno es que la liberacin de Glu mediada por la hipoxia proviene de los depsitos metablicos y no los vesiculares, utilizados normalmente para la neurotransmisin. Esta acumulacin de Glu proveniente de la reserva metablica parece ser debida a una inversin o prdida de funcin del transportador dependiente de Na+, causada por la inversin en los gradientes inicos y el potencial de membrana de la neurona y la glia que lo contienen. El hecho de que la liberacin de Glu observada en estados hipxicos sea independiente de Ca2+ apoya la idea de una fuente metablica, puesto que la liberacin vesicular es estrictamente dependiente del influjo de este in (Fig. 6). Existe adems evidencia de supresin de la transmisin vesicular en estados hipxicos . Aparentemente, la muerte neuronal observada en los eventos vasculares agudos anterior a inflamacin, est directamente involucrada con el fenmeno de

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excitotoxicidad mediada por la acumulacin de Glu. La adenosina, un neuromodulador ubicuo, parece tener un efecto de proteccin homeosttica en esta muerte neuronal observada en los estados isqumicos. La estimulacin de sus receptores presinpticos, particularmente el subtipo A1, reduce la liberacin de Glu. La concentracin extracelular de adenosina se incrementa en estos eventos. Adems, el uso de antagonistas del receptor A1 generalmente incrementa el dao observado en isquemia, mientras que sus agonistas han demostrado servir como neuroprotectores.

7. NEURODEGENERACIN

La activacin de receptores para aminocidos excitadores, provoca una despolarizacin parcial de la membrana neuronal, liberando el bloqueo dependiente de voltaje por Mg2+ del receptor NMDA. Este permite la entrada de Ca2+, elevando las concentraciones intracelulares. A su vez, la activacin de los receptores intracelulares de Ca2+ liberan este in de sus depsitos, principalmente de retculo endoplsmico. El incremento sostenido de Ca2+ conduce a la activacin de una cascada de eventos perjudiciales para la neurona. Entre ellos se encuentra la produccin de radicales libres (ROS) por parte de la mitocondria y la activacin de la xido ntrico sintetasa (NOS) que produce xido ntrico (NO). Este a su vez reacciona con perxidos produciendo peroxinitrito, un compuesto que destruye a las membranas lipdicas, tiene actividad de proteasa y daa al DNA. Entre 1940 y 1970 se present una epidemia de enfermedades neurodegenerativas en el Pacfico Sur, la cual es conocida como el Complejo

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Neurodegenerativo de Guam. En total, la epidemia fue la responsable del 20% de las muertes en ese periodo. Aunque se desconoce la causa, hay fuerte evidencia de que se debi a una toxina endgena de la planta de Cica, utilizada para la produccin de harina debido a la escasez de trigo durante la segunda guerra mundial. Los pacientes no presentaban una entidad clnica definida, sino que ms bien era un conjunto de signos de diferentes padecimientos neurodegenerativos, se encontraban enfermos que presentaban bradicinesia y tremor, caractersticos de Parkinson junto con dficit de memoria, tpico del Mal de Alzheimer, junto con el cuadro clnico de ALS. Esto sugiere que la causa de los tres padecimientos es un agente comn. En retrospectiva, los tres padecimientos presentan grandes paralelismos en su historia natural: presentan la muerte selectiva de un grupo o grupos neuronales, motoneuronas en ALS, neuronas dopaminrgicas en Parkinson y ncleos colinrgicos en Alzheimer. Este origen comn se ha visto apoyado por estudios clnicos con enfermos de ALS y Alzheimer que superan la media esperada, los cuales presentan las alteraciones motoras del Parkinsonismo. A su vez, en pacientes con Parkinson es frecuente observar las alteraciones de memoria de Alzheimer. Estos datos han sido corroborados por la necropsias, donde las inclusiones de Lewy y la prdida de la sustantia nigra es un hallazgo comn en enfermos de Alzheimer y ALS. Esto ha permitido agrupar a estos padecimientos en una nueva clasificacin molecular, en la cual el origen comn est dado por dos principales causas: la disfuncin mitocondrial, con la subsiguientes produccin de radicales libres y la excitotoxicidad, mediada principalmente por activacin de receptores para Glu permeables a Ca2+ y la disfuncin en el transporte de este neurotransmisor.

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8. PARKINSONISMO

La sobrestimulacin de los receptores para Glu junto con el estrs oxidativo han sido propuestas como la causa del Parkinsonismo. Ambos actuaran de forma sinrgica en la destruccin de las neuronas dopaminrgicas, el hallazgo anatomopatolgico diagnstico de este grupo de enfermedades. En enfermos de Parkinson, en su variante clsica, se han observado defectos en las enzimas mitocondriales de las neuronas de la sustantia nigra. Estos defectos se encuentran presentes tambin en las plaquetas de los enfermos, y al parecer son indicativos de la enfermedad. En ellas se han encontrado niveles elevados de Glu, lo cual contrasta con la disminucin que se presenta en la captura de Glu. La causa posible de estos eventos es la deprivacin energtica, ya que en cultivos de plaquetas en ausencia de glucosa se observa un fenmeno semejante. Otra causa probable sera la conjuncin de diferentes alteraciones en el metabolismo mitocondrial cuya consecuencia sera la prdida de la sntesis de glutamina, dependiente de energa. Ambas hiptesis no son excluyentes, y debido a la complejidad de la enfermedad, bien pueden ser elementos tempranos de una cadena fisiopatolgica, cuyo final sera la perdida de la funcin integradora de coordinacin motora.

9. ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRPICA

La destruccin selectiva de motoneuronas observada en la ALS parece ser debida a un incremento de la concentracin de Ca2+ intracelular por falla de los

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mecanismos homeostticos y la apertura de los canales permeables a este in. En concordancia con esta hiptesis, se ha visto que los ncleos motores corticales con mayor afectacin son aquellos que carecen de mecanismos de amortizacin de Ca2+, como la protena parvoalbmina, por ejemplo el ncleo trigeminal y el facial, mientras que aquellos que expresan esta protena en abundancia prcticamente no presentan lesin. Una posible causa de este incremento en los niveles intracelulares de Ca2+ ha sido sugerida por Rothstein y col. (1995), cuya investigacin ha demostrado que en la corteza motora y mdula espinal de enfermos de ALS se presenta una prdida significativa de los transportadores para Glu, GLT-1, localizado en astroglia y de EAAC1, un transportador neuronal. Esta deficiencia en los transportadores sera la causa subyacente del incremento de Ca2+, ya que al existir un exceso de Glu en la hendidura sinptica, los canales permeables a Ca2+ activados por voltaje permitiran el ingreso de ste a la clula hasta concentraciones en las cuales los mecanismos fisiolgicos perderan su efectividad. Evidencias recientes confieren al receptor NMDA como un factor determinante en la susceptibilidad de las motoneuronas al dao presentado por ALS.

10. PERSPECTIVAS

El establecimiento del papel de la transmisin glutamatrgica en los procesos crnicos y agudos de dao neuronal es de vital importancia para la medicina. En conjunto, ambas patologas representan 2 de cada 10 pacientes tratados en consulta y el tratamiento que se les puede ofrecer rara vez pasa de ser de apoyo.

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Consideradas como de larga evolucin y no curables, el diagnstico representa para el paciente un largo y progresivo deterioro hasta su muerte, agravando el cuadro con la depresin y el impacto econmico que conlleva un tratamiento prolongado que slo puede, en el mejor de los casos, retrasar la progresin de la enfermedad. En la medida en que se puedan establecer la naturaleza de los cambios a corto, mediano y largo plazo que dispara la estimulacin de los receptores glutamatrgicos, se podrn disear nuevas estrategias teraputicas y preventivas para las enfermedades neurodegenerativas.

ABREVIATURAS

NOS KA Glu EAAR NMDA GluR GLAST PKC ROS ALS

xido ntrico sintetasa. cido Kanico. Acido Glutmico. Receptores para aminocidos excitadores. cido N-metil-D-asprtico. Subunidades del receptor AMPA. Transportador de Glutamato Aspartato. Protena cinasa C dependiente de calcio. Radicales libres. Esclerosis Lateral Amiotrpica.

BIBLIOGRAFA

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Bosley, T.M. et al. 1983. Effects of anoxia on the stimulated release of amino acid neurtotransmitters in the cerebellum in vitro. J. Neurochem. 40:189. Crick, F. 1994. The Astonishing Hypothesis. Limpergraf Editors, Barcelona. Fanh, S. and Cohen. G. 1992. Oxidative stress hypothesis in Parkinsons disease: evidence supporting it. Ann. Neurol. 40:119-122. Ito, M. 1983. Evidence of synaptic plasticity in the cerebellar cortex. Acta Morphol. Hung. 31(1-3):213-218. Ito, M. 1983. 1982. Experimental verification of Marr-Albus plasticity assumption for the cerebellum. Acta Biol. 33:189-199. Kandel, E. et al. 1999. Principles of Neural Science 4th edition. McGraw-Hill Plubishers, New York. Neurodegenerative diseases. Plenum Press, New York 1996. OBrien, et al. 1998. Molecular mechanisms of glutamate receptor clustering at excitatory synapses. Curr. Op. Neurobiol. 8:364-369. Olney, J.W. and De Gubareff, T. 1978. Glutamate neurotoxicity and Huntingtons Chorea Nature 271:557-559. Reynolds, I.J. and Hastings, T.G. 1995.Glutamate induces the production of ROS in cultured forebrain neurons following NMDA receptor activation. J. Neurosci. 15:3318-3327. Rothstein, J.D. et al. 1993. Chronic inhibition of glutamate uptake produces a model of slow neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:659-659. Rothstein, J.D., Martn, L.J., Levey, A.I., Dykes-Hoberg, M., Jin, L., Wu, D., Nash N. and RW Kunkl RW. 1994. Localization of neuronal and glial glutamate transporters. Neuron 13:713.

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Rothstein, J.D. et al. 1995. Selective loss of glial glutamate transporter GLT-1 in amyotrophic lateral sclerosis. Ann. Neurol. 38: 73-84. Snchez-Prieto, J. and Gonzlez, P. 1988. Ocurrence of a large Ca2+ independent release of glutamate during anoxia in isolated nerve terminals (synaptosomes). J. Neurochem 50:1322-1322.

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Tabla 1. Caractersticas de los receptores para Glu obtenidos por clonacin heterloga.
Tipo de Receptor

Familia

Subunidades mGluR1 mGluR2 mGluR3

Ensamblaje

Propiedades Funcionales

Lo integra una sola protena mGluR1 y mGluR5 activan PLC mGluR2 hasta mGluR8 inhiben Adenilato aclopada a protenas G ciclasas

Metabotrpicos

Grupo I ,II y III mGluR4 mGluR5 mGluR6 mGluR7 mGluR8 NMDAR1a..h NMDAR2A NMDA NMDAR2B NMDAR2C NMDAR2D NR-1 con NR2 NR-2 Canales activados por NMDA Utilizan glicina como co-agonista Altamente permeables a Calcio Bloqueo por magnesio dependiente de voltaje

NMDA like

GBP Gly TCP-BP

Complejos unidos a una protena desconocida de 36 kDa GluR1-4, la mayora de los GluR2

Utilizan glicina como co-agonista Baja sensibilidad a magnesio Activacin por AMPA y KA

Canales Inicos AMPA (KA)

GluR1 GluR2 GluR3 GluR4

receptores nativos contienen Baja permeabilidad al calcio

GluR5 GluR6 KA GluR7 KA 1 KA 2 Hurfano NMDARL KBP pollo Otros Ligadoras de KA KBP rana Xen U1 Hurfano

GluR5 hasta GluR7 con KA1 2 Activados por Glu o KA Rpida desensibilizacin

Desconocida Subunidades nicas

No es funcional

No funcionales

Desconocida

No funcionales

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PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Micrografa electrnica de una sinapsis. Enmarcada en azul se observa la terminal presinptica, en verde la terminal postsinptica. En azul las prologanciones de clulas gliales que envuelven a esta estructura.

Fig. 2. Activacin del gen chkbp. La activacin de receptores de glutamato en clulas gliales de Bergmann inducen factores de transcripcin que se unen en la regin comprendida entre 435\ -250 desplazando al regulador negativo que se encuentra unido de forma constitutiva al promotor favoreciendo la unin de la maquinaria general de transcripcin.

Fig. 3. Regulacin de GLAST por receptores de tipo tirosina cinasa (RTK). La activacin de RTKs desencadena una cascada de fosforilacin en tirosina que puede modular el transporte de glutamato por su transportador GLAST. En rojo se marcan los inhibidores. PI3-k: Cinasa de Inositol Trifosfato; PKC: Protena cinasa dependiente de calcio; MAP: cinasa activada por mitgenos; GLAST:

transportador de glutamato y aspartato.

Fig. 4. Potenciacin a largo plazo (LTP) en hipocampo. El esquema muestra el circuito del hipocampo que abarca a las regiones CA3 y CA1. Al estimular simultneamente la fibra musgosa y la colateral de Schaffer, la respuesta de la clula piramidal en CA3 se ve potenciada en relacin a un estmulo previo. Este

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evento se mantiene en la escala temporal hasta por das, siendo un correlato de memoria.

Fig. 5. Depresion a largo plazo (LTD) en cerebelo. El esquema muestra el circuito cerebelar con su aferente nico que es el axn de la clula de Purkinje. Al estimular simultneamente la fibra paralela y la fibra trepadora, la respuesta de la clula de Purkinje se ve deprimida en relacin a un estmulo previo. Este evento se mantiene en la escala temporal hasta por das, siendo un correlato de memoria.

Fig. 6. Control de las vesculas por calcio. Las vesculas se encuentran ancladas al citoesqueleto en las terminales nerviosas en un compartimento de almacenamiento y ancladas a la membrana celular en el llamado compartimento para liberacin. La entrada de calcio (verde) provoca la apertura del complejo del poro de fusin permitiendo la liberacin del neurotransmisor (caf) hacia la hendidura sinptica, a la vez que libera a las vesculas del compartimento de almacenaje por medio de la fosforilacin de sinapsinas. Estas vesculas pasan a formar parte del compartimento para liberacin manteniendo la cantidad de neurotransmisor disponible.

Captulo 13 Factores involucrados en la enfermedad autoinmune Kristine M. Garza1, Linh T. Nguyen2, Russell G. Jones2 y Pamela S. Ohashi2.
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Department of Biological Sciences, University of Texas at El Paso, El Paso, Texas, EUA. Departments of Medical Biophysics and Immunology, Ontario Cancer Institute, Toronto, Canad.

Email: kgarza@oci.utoronto.ca PALABRAS CLAVE: respuesta inmune, autoinmunidad, citocinas, clulas T.

NDICE 1 Introduccin. 2 Objetivos del captulo. 3 Papel de las clulas presentadoras de antgeno en la autoinmunidad. 4. Papel de los receptores de muerte cd95 y tnfr1 en la tolerancia perifrica de las clulas T. 5. Papel de las molculas de sobrevivencia en la autoinmunidad. 6. Conclusiones. Abreviaturas Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

El sistema inmune tiene como funcin proteger a los individuos de los patgenos. Para ello, tiene una remarcada capacidad para percibir la presencia de agentes extraos y poder eliminarlos mediante una respuesta especfica

2 contra el agente invasor. Los linfocitos T juegan un papel clave en la respuesta inmune. Reconocen y responden a componentes muy especficos del agente extrao conocidos como antgenos, y ejecutan una serie de funciones que terminan con la eliminacin del agente invasor. Las clulas T tambin pueden reconocer como extraos a los auotantgenos, es decir, componentes de un tejido del propio individuo. En estas condiciones, la activacin de las clulas T resulta en una destruccin progresiva del tejido, la cual se manifiesta como una enfermedad autoinmune clnicamente detectable. Tpicamente, las clulas T que emigran del timo hacia los tejidos en donde se encuentran sus autoantgenos, enfrentan uno de dos destinos: i) Si encuentran concentraciones suficientes de su ligando especfico (en el antgeno), las clulas T autorreactivas son sometidas a tolerancia perifrica. ii) Si no encuentran a su ligando especfico o si no detectan la presencia de los ligandos, los linfocitos T autorreactivos permanecen en el repertorio de la periferia. La autoinmunidad patolgica puede generarse cuando cualquiera de estos dos procesos, o ambos, se ramifican. La autoinmunidad puede ser inducida a travs de la activacin de las clulas T autorreactivas "ignorantes", es decir aquellas clulas T que no se percatan o que ignoran la presencia de sus ligandos, debido a una serie de eventos que son promovidos por la inflamacin. Tales eventos incluyen: i) la elevacin de la concentracin del antgeno estimulante a un nivel umbral o suficiente para su deteccin, ii) la presentacin del antgeno en clulas con habilidades coestimulatorias, iii) la migracin de las clulas T "ignorantes" a las reas de la presentacin de los antgenos, y/o iv) la migracin de clulas presentadoras de antgenos o APC (de sus siglas en ingls Antigen Presenting

3 Cells) cargadas con el antgeno a las reas de las clulas T de los rganos linfoides. Este es un proceso con muchos componentes que requiere de la coordinacin de varios eventos para proveer un ambiente activador. La autoinmunidad tambin puede ser inducida por la inhibicin de la induccin de la tolerancia perifrica de las clulas T, delecin o anergia. El efecto que tiene la prevencin de la delecin de las clulas T autorreactivas est aumentado en los pacientes con el sdrome de linfoproliferacin autoinmune o ALPS (del ingls Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome) (Lenardo y col., 1999). En los pacientes con ALPS, la apoptosis inducida por el receptor de las clulas T o TCR (del ingls T Cell Receptor) es deficiente y est asociada con una linfoproliferacin no maligna y con autoinmunidad. El sndrome de linfoproliferacin autoinmune es un desorden autosmico dominante; sin embargo, no todos aquellos individuos que tienen este alelo lo padecen. La implicacin es que existen tambin otros parmetros que afectan la induccin de esta enfermedad autoinmune. Ya se han identificado varios de los factores que parecen afectar la induccin de las enfermedades autoinmunes. Algunos estudios han demostrado que esta enfermedad es ms comn en personas que poseen cierto tipo de complejos de histocompatibilidad mayor o MHC (del ingls Major Histocompatibility Complex) (Nepom y Erlich, 1991; Wicker, 1997). Se piensa que la asociacin de las enfermedades autoinmunes con ciertos alelos de MHC se debe a la habilidad del complejo de histocompatibilidad de unir y presentar autoantgenos, adems de la habilidad del MHC para seleccionar las clulas T autorreactivas. Sin embargo, no todos los individuos desarrollan la enfermedad, aunque tengan los mencionados alelos MHC de susceptibilidad a la

4 enfermedad. Tambin se ha propuesto que los agentes ambientales influyen en la induccin de la autoinmunidad por medio de un nmero de mecanismos que incluyen: i) el mimetismo molecular (Ohteki y col., 1999; Bachmaier y col., 1999), ii) la induccin del dao al tejido, el cual a su vez origina la liberacin de autoantgenos crpticos de origen peptdico (Gammon y col., 1991; Lehmann y col., 1993), o iii) la regulacin positiva o ectpica de la expresin de molculas coestimulatorias (Von Herrath y col., 1995; Harlan y col., 1994), las cuales han mostrado que originan respuestas inmunes autodirigidas. La induccin de la autoinmunidad tambin se ve altamente influenciada por la presencia de citocinas (Falcone y Sarvetnick 1999; Singh y col., 1999). Tanto las citocinas proinflamatorias como las antiinflamatorias, pueden promover o prevenir la induccin de una enfermedad en general, dependiendo del momento, el nivel y la localizacin de la produccin de las mismas. Por ltimo, los linfocitos reguladores tambin pueden influenciar la induccin de la enfermedad autoinmune. La presencia de linfocitos reguladores se ha demostrado en un nmero de sistemas experimentales en los cuales, el repertorio de clulas T est restringido, lo que resulta en una induccin espontnea de la enfermedad autoinmune. Esto sugiere que la poblacin linfocitaria faltante tiene la responsabilidad de mantener a las clulas T autorreactivas en constante monitoreo (Gleeson y col., 1996; Mason y Powrie, 1998; Seddon y Mason, 2000). As, la prdida de las clulas reguladoras puede promover tambin la autoinmunidad. Sin embargo, no se ha identificado con claridad a ningn factor como el componente clave para la induccin de la autoinmunidad. Lo ms probable es que existe una combinacin de diferentes factores que conducen a la enfermedad.

5 2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

Con el objeto de investigar otros factores que puedan influenciar la induccin de la enfermedad autoinmune, en este captulo describimos los estudios enfocados en los efectos de la activacin o delecin de los linfocitos T CD8+ especficos del virus de la coriomeningitis linfoctica o LCMV (del ingls Lymphocytic Choriomeningitis Virus). Para ello, hemos utilizado ratones transgnicos que expresan la glicoprotena del virus LCMV (LCMV-gp) en las clulas del islote pancretico, bajo el control del promotor del gen de la insulina de rata o RIP-gp (del ingls Rat Insulin Promoter-glycoprotein). Tambin hemos utilizado ratones transgnicos que expresan el receptor de las clulas T, el cual es especfico para la glicoprotena de LCMV (P14) (Ohashi y col., 1991). El ratn doble transgnico RIP-gp/P14 es un modelo nico para el estudio de la diabetes autoinmune experimentalmente inducida, mientras que el ratn transgnico P14 nos proporciona un modelo de estudio de una poblacin de clulas T inductoras de una enfermedad autoinmune.

3. PAPEL DE LAS CLULAS PRESENTADORAS DE ANTGENO EN LA AUTOINMUNIDAD

Varios estudios han demostrado convincentemente que las clulas presentadoras de antgenos o APC pueden modular el efecto de la interaccin del receptor de la clula T con un autoantgeno. Algunos modelos han propuesto que este evento es dependiente de la coestimulacin y la presencia de seales secundarias (Gill y col., 1996). Otros modelos experimentales

6 sugieren que diferentes poblaciones de APC definen el resultado de la interaccin de la clula T con su ligando, donde una poblacin induce tolerancia y otra induce la activacin de las clulas T (Shortman y col., 1997; Fazekas de St. Groth, 1998; Banchereau y Steinman, 1998 ). Estudios recientes han sugerido que el "estado de activacin" de las APC puede incidir en las respuestas de las clulas T. Se ha demostrado que la presentacin de antgenos por las clulas B no activadas, sin que afecten a las clulas T, induce tolerancia de las clulas T (Eynon y Parker, 1992; Fuchs y Matzinger, 1992). En contraste, se ha mostrado que la presentacin de un antgeno en un ambiente proinflamatorio induce inmunidad o autoinmunidad (Rocken y col., 1992; Ehl y col., 1998). Para valorar el papel de las APC en la induccin de autoinmunidad, tratamos por va intravenosa al ratn doble trangnico RIP-gp/P14 con el pptido p33 obtenido del LCMV y con el anticuerpo anti-CD40 que activa a las APC (Schoenberger y col., 1998). En los ratones no tratados, las clulas T CD8+ especficas de la glicoprotenas de LCMV no se vuelven tolerantes, sino que permanecen inmunolgicamente ajenas a la presencia del antgeno, aunque bajo ciertas condiciones son capaces de responder a ste y pueden inducir insulitis y diabetes (Ohashi y col., 1991). Cuando los ratones fueron tratados con el pptido LCMV-gp y con el anticuerpo anti-CD40, todos los ratones transgnicos se volvieron diabticos (Tabla 1) (Garza y col., 2000). Los ratones control que recibieron tanto el pptido como el anticuerpo, no se volvieron diabticos. As, la administracin del pptido y la activacin de las APC in vivo son factores crticos para la induccin de la autoinmunidad.

7 Tambin se investig el estado de la actividad de las clulas T en los bazos de los animales a los que se les administraron el pptido y el anticuerpo control. La actividad de las clulas T se determin mediante el incremento de los marcadores de activacin de las clulas T, la induccin de la funcin efectora, la produccin de interfern gama (IFN) y la infiltracin del pncreas. La induccin de los marcadores de activacin, as como de los de actividad citotxica fue indntica en ambos grupos. El tratamiento silmultneo con el pptido LCMV-gp y el anticuerpo control no indujo la produccin de IFN detectable, pero s una infiltracin pancretica suave (Tabla 1). En contraste, la combinacin del pptido LCMV-gp y el anticuerpo anti-CD40 indujo la produccin de niveles medibles de IFN, as como de una insulitis severa (Tabla 1). El tratamiento con anti-CD40 condujo a la activacin de las APC in vivo, con un aumento en la produccin de IFN estimulada por la expresin del MHC clase I en los islotes pancreticos. Esto puede atribuirse al aumento de la infiltracin de los CTLs al pncreas y al estado de diabetes. La activacin de las APC mediada por el CD40 tambin regula positivamente las molculas coestimulatorias B7-1 y B7-2, y por consiguiente tambin estimula la funcin de las clulas T (Grewal y col., 1996). Con el objeto de determinar si la induccin de la autoinmunidad, va la activacin de las APC, era dependiente del uso de ligandos coestimuladores, los genes codificantes para P14 y RIP-gp se introdujeron en un ratn CD28 deficiente. La inmunizacin de ratones RIP-gp/P14/CD28-negativos con el pptido LCMV-gp y el anticuerpo anti-CD40 indujo diabetes, con la misma incidencia y cintica que se observ con los ratones competentes en CD28 (Tabla 1). As, las

8 interacciones CD28/B7 no fueron cruciales para la induccin de autoinmunidad mediada por CD8 en este modelo. Las infecciones bacterianas o virales promueven inmunidad, pero adems, tambin existen reportes de que pueden inhibir la induccin de la tolerancia perifrica (Rocken y col., 1992; Ehl y col., 1998). Con el objeto de examinar si la activacin de las clulas presentadoras de antgeno podan influir en la tolerancia celular, se realiz el tratamiento de ratones transgnicos P14 TCR con el pptido LCMV-gp por va intravenosa para inducir la eliminacin de las clulas T transgnicas, y con anticuerpos anti-CD40 o el antisuero control del mismo isotipo. Como se muestra en la Tabla 2, el tratamiento con el anticuerpo activante anti-CD40 inhibi dramticamente la eliminacin especfica de las clulas T CD8+V2+ transgnicas especficas del LMCV. As, las APC no slo promueven la induccin de autoinmunidad, sino que pueden prevenir tambin la induccin de la tolerancia. Este estudio aroj evidencias que confirman que las interacciones de las clulas T con pptidos presentados en un ambiente "en descanso" o "sin afectacin" no es suficiente para que se produzca autoinmunidad. Sin embargo, la activacin de las APCs, va anti-CD40, conduce a un aumento en la produccin de citocinas, lo cual contribuye a la formacin de un ambiente proinflamatorio y a la induccin de la diabetes autoinmune. Adems, las APC activadas pueden prevenir la induccin de la tolerancia de las clulas T, Por consiguiente, un factor que conduce o predispone a un individuo a una enfermedad autoinmune puede ser la activacin crnica de las APCs. El reconocimiento del autoantgeno por las clulas T autorreactivas, en la presencia de APCs activadas crnicamente, podra predisponer las

9 interacciones de las clulas T y conducirlas, de un estado "de ignorancia" o de tolerancia, a la inmunidad.

4. PAPEL DE LOS RECEPTORES DE MUERTE CD95 Y TNFR1 EN LA TOLERANCIA PERIFRICA DE LAS CLULAS T

La apoptosis de las clulas T inducida por antgenos juega un papel importante en la eliminacin de las clulas T autorreactivas (Green y Scott, 1994). De los receptores celulares involucrados en la apoptosis de las clulas T, el CD95 es de importancia en particular, la cual ha sido demostrada por la linfoproliferacin en una cepa del ratn mutante lpr (deficiente en CD95), que se caracteriza por la linfoadenopata, esplenomegalia, la acumulacin de las clulas T CD4-CD8B220- y la produccin de varios autoanticuerpos (Watanabe-Fukunaga y col., 1992; Nagata y Suda, 1995). Adems, estudios en los que se emplearon superantgenos, pptidos solubles o autoantgenos con reaccin cruzada en ratones lpr, han demostrado que CD95 participa en la apoptosis de las clulas T perifricas (Russell y col., 1993; Scott y col., 1993; Singer y Abbas, 1993; Kurts y col., 1998). TNFR1 tambin se ha implicado en la apoptosis de las clulas T. La eliminacin de TNFR1 en ratones lpr acelera el inicio del fenotipo lpr (Zhou y col., 1996), y otras evidencias sugieren que TNF est involucrada en la delecin de las clulas T perifricas (Zheng y col., 1995; Sytwu y col., 1996; Speiser y col., 1996). Para determinar la posible cooperacin entre CD95 y TNFR1 en la mediacin de la tolerancia de las clulas T perifricas mediante delecin, se obtuvieron ratones deficientes en estos dos receptores (Nguyen y col., 2000).

10 Estos ratones se cruzaron con los ratones P14, los cuales son ratones transgnicos TCR, especficos para LCMV. La tolerancia perifrica se indujo en los ratones P14 mediante la administracin intraperitoneal de 500 g del pptido LCMV-gp emulsificado en adyuvante incompleto de Freund o IFA (del ingls Incomplete Freund Adjuvant) cada tres das. Este protocolo refleja la exposicin crnica o prolongada a autoantgenos expresados perifricamente. La induccin de la tolerancia est marcada por una expansin transitoria seguida de una rpida delecin de las clulas T LCMV transgnicas. Los ratones P14, deficientes tanto en TNFR1 como en CD95 mostraron cinticas de delecin normales para las clulas T transgnicas despus del tratamiento con el pptido. La induccin de la tolerancia se confirm mediante la incapacidad de proliferacin in vitro, de las clulas del bazo de los animales tratados despus de 17 das del tratamiento inicial con el pptido LCMV-gp. En conclusin, en la ausencia de los receptores TNFR1 y CD95, la delecin de las clulas T transgnicas, despus de la exposicin crnica al antgeno, procede normalmente. Posteriormente, se evalu la delecin de las clulas T mediante la determinacin de cinticas de respuesta citoltica o CTL (del ingls Cytotoxic T Lymphocites), despus de la administracin de LCMV en los ratones. La actividad CTL declin normalmente en los ratones deficientes en CD95/TNFR1. Tambin se determin la cintica de la expansin y delecin de las clulas T especficas para el pptido del LCMV en los ratones receptores de las clulas T P14 infectadas con LCMV. El nmero total de las clulas transgnicas para TCR en el bazo fue similar en la primera y en las sptima semanas despus de

11 la infeccin. Esto es, en la ausencia de TNFR1 y de CD95, y despus del reto viral, la progresin de la delecin se realiz normalmente. Tambin se evalu la tolerancia inducida por el pptido en la ausencia de TNFR1 y de CD95, en los ratones transgnicos sin TCR, los cuales contienen una proporcin ms fisiolgica de clulas T especficas al pptido, en contraste con los ratones P14. El tratamiento de los ratones, heterocigotos para TNFR1 y CD95, con el pptido LCMV-gp emulsificado con IFA indujo una tolerancia de las clulas T especficas al pptido LCMV-gp, como se determin por la carencia de actividad citotxica especfica al pptido en respuesta al reto subsecuente con LCMV. En contraste, la tolerancia no se indujo en los ratones deficientes en TNFR1/CD95 tratados con el pptido. Por consiguiente, estos datos demuestran que TNFR1 y CD95 cooperan para mediar la delecin de las clulas T por altas dosis de pptido en IFA. Todos estos datos sugieren que la delecin de las clulas T puede presentarse, dependiente o independientemente de la presencia de los receptores de muerte celular CD95 y TNFR1. Cuando el antgeno est presente en cantidades limitadas, como sucede cuando un virus ha sido eliminado completamente, la independencia de CD95/TNFR1 es consistente con el modelo que seala que la delecin ocurre cuando se retiran las linfocinas y que no es debido a la presencia de los receptores de muerte celular (Lenardo y col., 1999; Zimmermann y col., 1999; Ehl y col., 1996; Reich y col., 2000). Cuando la exposicin al antgeno es prolongada y ocurre en la presencia de cuentas fisiolgicas de clulas T especficas al antgeno, la delecin de las clulas T es dependiente de CD95 y TNFR1. Esto sugiere que, en la ausencia de este esfuerzo cooperativo, las clulas CD8+ autorreactivas

12 pueden no ser delecionadas apropiadamente, predisponiendo a un individuo a una enfermedad autoinmune.

5. PAPEL DE LAS MOLCULAS DE SOBREVIVENCIA EN LA AUTOINMUNIDAD

Para que una enfermedad autoinmune se manifieste, no solamente las clulas T autorreactivas activadas deben permanecer viables por una lapso de tiempo suficiente para asentarse en el rgano blanco y llevar a cabo sus funciones efectoras, sino que deben existir cantidades suficientes de clulas T autorreactivas para causar dao tisular en cantidad suficiente para detectarse clnicamente. As, otro factor potencial que puede influir en la induccin de autoinmunidad puede ser el tiempo en que las clulas T autorreactivas sobreviven despus del reconocimiento del autoantgeno. La vida de una clula T despus de la unin de TCR con su ligando, es dependiente de un balance entre la sobrevivencia y la apoptosis. La induccin de la apoptosis en clulas T maduras est estrictamente regulada despus del disparo antignico (Lenardo y col., 1999); sin embargo, molculas coestimulatorias, tales como CD28, se consideran que contribuyen a generar seales de sobrevivencia y de respuestas que promueven inmunidad (Boise y col., 1995; Radvanyi y col., 1996; Vella y col., 1997). Estudios recientes han sugerido un papel para la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K), un blanco de TCR localizado en etapas posteriores, y la sealizacin mediada por CD28, en la supresin de la apoptosis (Boise y col., 1995). La protena cinasa B (PKB/Akt), que es una serina/treonina cinasa y un blanco posterior de la actividad de PI3K,

13 se est revelando como una molcula clave en la regulacin de la sobrevivencia en un nmero de modelos (Coffer y col., 1998). Se ha demostrado que la PKB activada juega un papel importante en la sobrevivencia mediada por factores de crecimiento y citocinas, y adems, protege a las clulas de la apoptosis inducida por una variedad de estmulos (Datta y col., 1997). Con el objeto de determinar si PKB era un blanco relevante en la sealizacin de las clulas T, se procedi a investigar si ocurra una activacin de PKB en las clulas T perifricas despus de la unin al TCR (Jones y col., 2000). La activacin de las clulas T perifricas con anti-CD3 o con anti-CD3 ms anti-CD28, condujo a un incremento substancial en la activacin de PKB en relacin con las clulas no tratadas. Adems, el hecho de que estos anticuerpos estimulatorios no tuvieran efecto sobre la activacin de PKB en clulas pretratadas con un inhibidor de PI3K, muestra claramente que la activacin de PKB era dependiente de la actividad de PI3K. Estos resultados establecieron que PKB es un blanco fisiolgico relevante posterior de TCR en las clulas T primarias. Tambin se investig el papel de PKB en la sobrevivencia de las clulas T mediante la generacin de ratones que expresaran constitutivamente una forma de PKB (gag-PKB) solamente en el linaje de las clulas T (Jones y col., 2000). Para ello, se purificaron clulas T de ratones no transgncios y transgnicos para gag-PKB, y se les determin la expresin de las protenas antiapoptticas Bcl-2 y Bcl-XL. La expresin de estas molculas est fuertemente regulada en las clulas T maduras. Bcl-2 se expresa en niveles altos en las clulas T perifricas y permanece as despus de la activacin

14 (Veis y col., 1993), mientras que Bcl-XL est sobreexpresada solamente despus de la activacin, por lo que se ha propuesto que confiere sobrevivencia transitoria a las clulas T activadas (Boise y col., 1995). Los ratones transgnicos mostraron niveles de Bcl-XL endgenos aumentados, en comparacin con los ratones no transgnicos, pero no hubo diferencia en los niveles de expresin de la protena Bcl-2, sugieriendo que PKB no afecta la expresin de Bcl-2 en las clulas T maduras. Estos resultados sugirien que las clulas T de los ratones transgnicos en PKB, pueden tener aumentadas sus capacidades de sobrevivencia. Con el objeto de investigar las consecuencias funcionales de la activacin de PKB como un evento posterior a TCR, los ratones trangnicos en PKB se cruzaron con los ratones transgnicos P14. Las clulas del bazo de los ratones P14 trangnicos en TCR y de los dobles transgnicos P14/gag-PKB se cultivaron en la presencia de clulas presentadoras de antgeno preincubadas con el pptido LCMV-gp y se les determin su proliferacin en funcin del tiempo. Mientras que los niveles de proliferacin permanecieron similares en ambos grupos hasta las 48 horas, las clulas T que expresan el transgn gagPKB mostraron una proliferacin aumentada relativa al control de los linfocitos P14 hasta 120 horas despus de la infeccin (Tabla 3). La proliferacin contra un pptido control irrelevante fue inferior al 4% de la mxima proliferacin para todos los tiempos en los que se midi, sin importar la expresin del trangn gag-PKB. Estos datos sugieren que la actividad de PKB puede alterar la proliferacin de las clulas T especficas para un antgeno. En este momento se estn realizando estudios para determinar si las clulas T de los ratones P14/gag-PKB pueden influir en la induccin de la

15 enfermedad autoinmune mediante la cruza entre stos y los ratones RIP-gp. Un estudio reciente que utiliz ratones heterlogos con una deficiencia en PTEN ha sugerido que las molculas de sobrevivencia pueden promover la autoinmunidad. PTEN es un gen supresor de tumores que codifica para una fosfatasa. Un substrato para PTEN es el fosfatidil-inisitol trifosfato (PIP-3), un segundo mensajero lipdico producido por PI3K. En la ausencia de la actividad PTEN, las concentraciones de PIP-3 se incrementan conduciendo a una fosforilacin aumentada y a la activacin de PKB (Stambolic y col., 1998). Ratones heterocigotos para una mutacin en PTEN, que la inactiva, presentaron un desroden autoinmune (Di Cristofano y col., 1999). Las clulas del bazo de estos ratones estaban marcados por la presencia de la PKB activada constitutivamente y respuestas aumentadas en la proliferacin de las clulas T. La autoinmunidad se atribuy a la incapacidad para delecionar los linfocitos autorreactivos debido al defecto en la muerte mediada por CD95. Las cruzas entre ratones transgnicos sobreexpresando Bcl-2 y ratones lpr han sugerido tambin un papel de las molculas de sobrevivencia en la autoinmunidad, en la cual tambin se observ un incremento en linfoadenopata (Strasser y col., 1995; Reap y col., 1995). As, el efecto de la induccin de una enfermedad autoinmune por molculas de sobrevivencia puede deberse a dos procesos simultneos: i) la inhibicin del proceso de delecin perifrico normal y ii) las respuestas aumentadas en la sobrevivencia y proliferacin despus del reconocimiento del antgeno, que posiblemente conduce a una destruccin aumentada del tejido.

7. CONCLUSIONES

16 Resulta evidente que la induccin de autoinmunidad no es un proceso sencillo, sino que ms bien, es el resultado de una serie de eventos que promueven la sobrevivencia y activacin de las clulas T autorreactivas. En este trabajo hemos identificado algunos factores que pueden inhibir la induccin de la tolerancia y promover la activacin de clulas T autorreactivas como las clulas presentadoras de antgeno activadas, la prdida de los receptores de muerte celular y la adquisicin de molculas de prosobrevivencia. Cada uno, sin embargo, es insuficiente para la induccin de autoinmunidad, por lo que se requiere de la coordinacin de un nmero de eventos para inducir productivamente las respuestas de las clulas T patognicas. Una clave para la investigacin futura de las enfermedades autoinmunes es el discernir los requerimientos para la activacin de las clulas T, la sobrevivencia y la muerte celular, tambin como los requerimientos para el mantenimiento de una respuesta inflamatoria inmune, la cual promueva las respuestas de las clulas T, y cmo estos factores funcionan cooperativamente para promover la autoinmunidad patognica.

ABREVIATURAS

APC Antigen Presenting Cells. ALPS Autoinmune Lymphoproliferative Syndrome. CTL IFA Cytotoxic T lymphocites. Incomplete Freund adjuvant.

LCMV Lymphocytic Choriomeningitis Virus. MHC Major histocompatibility Complex.

17 TCR T Cell Receptor. PTEN gen supresor de tumores que coficia para una fosfatasa

BIBLIOGRAFA

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24 Tabla 1. Induccin de diabetes, insulitis y produccin de INF en ratones RIP-gp/P14 tratados con pptido y anticuerpo anti-CD401.

Grupo

DIABETES2 Incidencia Inicio (%) promedio (da)

INSULITIS3 Incidencia Severidad (%) promedio4

INF5 (pg/ml)

En ratones RIP-gp/14: Pptido LCMV+anti-CD40 Pptido LCMV+anticuerpo control Pptido control+anti-CD40 En ratones RIPgp/P14/CD28: Pptido LCMV+anti-CD40
1

100 (20/20) 0 (0/20)

7 -

83 22

3.0 1.7

250+40 -

0 (0/10) 100 (8/8)

Los ratones fueron tratados con 5 g de pptido por va intravenosa a los das 0 y 2, y con 100 g en el da 2. 2 Los niveles de glucosa en sangre fueron monitoreados; diabetes => 14 mm/l. 3 La infiltracin de las clulas CD8+ en los islotes pancreticos se determin en el da 3. Se analizaron tres secciones no seriadas por ratn y la severidad de la infiltracin (n = 5 animales/grupo, 10-20 islotes/ratn). 4 Severidad promedio de los islotes infiltrados, donde una severidad de 1 = peri-insulitis/insulitis suave, 2 = insulitis partial y 3 = insulitis completa. 5 Los niveles de IFN srico se determinaron en el da 3 por ELISA; lmite de deteccin = 65 pg/ml.

25 Tabla 2. El tratamiento de ratones transgnicos P14 con anti-CD40

previene la tolerancia de las clulas T inducidad por p331.

GRUPO Da 0

NMERO DE CLULAS CD8+/ V2+ (x 106)2 Da 3 Da 6 Da 9 Da 12

p33 + anti-CD40 p33 + anticuerpo control

1

20.1 5.40 19.2 3.60

21.5 0.85 33.6 4.0

43.7 7.30 4.0 0.30

67.5 5.50 2.27 2.30

132.7 24.13 3.14 0.15

Los ratones transgnicos P14 se trataron 3 veces, con intervalos de 3 das, empezando en el da 0, con 5 g de p33 intravenoso. Dos das despus de cada tratamiento, a los ratones se les administraron, despus de cada tratamiento con pptido, 100 g de anticuerpo. 2 El nmero de clulas T transgnicas de bazo se determin en los difetentes grupos de ratones mediante citometra de flujo (n = 2-3 ratones/grupo/determinado tiempo).

26 Tabla 3. PKB aumenta las respuestas proliferativas especficas de

antgeno de las clulas T maduras1.

GRUPO 48 h P14 P14/gag-PKB 100.0 5.30 99.0 1.5

% de la PROLIFERACIN MXIMA2 72 h 96 h 75.0 12.9 96.0 10.0 29.0 9.6 55.0 9.7

120 h

2.0 0.87 12.0 4.3

Las clulas del bazo de los ratones se cultivaron en la presencia de APCs preincubadas con 10 M de 3 p33, y posteriormente se incubaron con [ H]-timidina en los puntos de tiempo sealados. 2 3 Para estandarizar los diferentes experimentos, las cuentas por minuto de [ H] incorporado se normalizaron y se expresaron como un porcentaje de la proliferacin mxima (mx = 100%).

-5

Captulo 14 Fisiopatologa molecular de la cirrosis heptica Terapia Gnica como tratamiento Juan Armendariz Borunda 1.
1

Director del Instituto de Biologa Molecular en Medicina y Terapia Gnica, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara, Guadalajara, Jal.

Email: armendbo@koch.mb.udg.mx PALABRAS CLAVE: cirrosis heptica y terapia gnica.

NDICE 1. Introduccin. 1.1 Mecanismos patomoleculares en la cirrosis heptica. 1.1.1 Heterogeneidad celular en el microambiente heptico. 1.2 Diagnstico de laboratorio. 1.1.2 Diagnstico no invasivo: no siempre el mejor. 1.3 Terapias para la fibrosis heptica. 1.3.1 Inhibicin de biosntesis de colgena. 1.3.2 Induccin de la degradacin del exceso de matriz extracelular. 1.3.3 Antagonismo de citocinas como una ruta de terapia antifibrtica. 2. Objetivos del captulo. 3. Estado actual del arte. 3.1 Terapia gnica en cirrosis heptica. 3.1.1 La sobreexpresin del gen huPA en el hgado induce la reversin de la fibrosis.

3.1.2 La huPA induce una regeneracin vigorosa en clulas de hgados cirrticos. 4. Conclusiones. 4.1 Por qu cirrosis?. Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

La cirrosis del hgado es un padecimiento que lleva necesariamente a la muerte si el paciente no recibe oportunamente un tratamiento adecuado. No obstante, no existe ninguno que sea cien por ciento eficaz, ya que los tratamientos actuales son slo paliativos y de sostn. La cirrosis heptica y otras enfermedades crnicas del hgado se han situado como la cuarta causa de mortalidad hospitalaria en Mxico en individuos en edad productiva (20-60 aos). Aunque la mayor parte de las veces la cirrosis heptica se asocia con el abuso en la ingesta de alcohol, virtualmente todas las enfermedades crnicas progresivas del hgado pueden evolucionar a una etapa final de cirrosis heptica (Franklin, 1995; Rojkind y col., 1979). La cirrosis del hgado es un proceso difuso, caracterizado por fibrosis y una alteracin de la arquitectura del hgado normal en ndulos estructuralmente anormales. Con este proceso se asocian cambios vasculares importantes dentro del hgado que conllevan a una alteracin en el suministro sanguneo y por ende,

en la nutricin del hepatocito. Se entiende entonces que para que se establezca la cirrosis, debe desarrollarse previamente el proceso fibrognico o fibrosis. En la figura 1 se muestra que una de las caractersticas principales de la cirrosis heptica es el depsito excesivo de varias de las protenas de matriz extracelular (MEC), particularmente las de colgenas tipo I, III, IV y, en menor proporcin, de diversas macromolculas no colagnicas, tales como proteoglicanos, fibronectina, cido hialurnico y glicoprotenas. Estas protenas se acumulan en diversos sitios del lbulo heptico (periportal, perisinusoidal y pericentral), lo que a su vez determina los efectos patolgicos en la funcin heptica (Rojkind y col., 1979). Clnicamente, la cirrosis puede desarrollarse sin dar ninguna clase de sntomas. Aproximadamente del 30 al 40 por ciento de los casos es asintomtica; sin embargo, la evolucin clnica de los enfermos con cirrosis avanzada se ve complicada habitualmente por una serie de secuelas importantes que son independientes de la etiologa de la hepatopata subyacente. Estas complicaciones son: la hipertensin portal y sus consecuencias (e.g., vrices gastroesofgicas y esplenomegalia), ictericia, ascitis, encefalopata heptica, peritonitis bacteriana espontnea, sndrome hepatorrenal y carcinoma hepatocelular .

1.1 Mecanismos patomoleculares en la cirrosis heptica

En condiciones normales, el hgado presenta un equilibrio dinmico entre los componentes de la MEC y los factores que los regulan, es decir, existe un balance

entre las protenas colagnicas y no colagnicas, las metaloproteasas de la matriz (MMPs) que son las responsables de la degradacin de estas protenas, los inhibidores tisulares de las MMP (TIMPs) y las citocinas fibrognicas, algunas de stas con actividad mitognica, de sntesis de TIMP, o de inhibicin de las MMPs. Sin embargo, cuando el hgado sufre un dao considerable y la causa del dao primario al tejido persiste, la respuesta inflamatoria se convierte en crnica, perpetuando as el establecimiento de la fibrognesis.

1.1.1 Heterogeneidad celular en el microambiente heptico

En el proceso fibrognico estn involucrados diversos tipos celulares que se encuentran presentes en el parnquima y en los sinusoides hepticos (Friedman, 1993). Ante un insulto o dao primario al tejido heptico, se desarrolla una reaccin inflamatoria en la cual se liberan diversas sustancias de las clulas daadas o muertas. Estas sustancias pueden activar tanto a los macrfagos y a las clulas monocticas circulantes, como a las clulas residentes en el mismo rgano, como es el caso de las clulas de Kupffer (Armendariz y col., 1990; Armendariz y col., 1992; Armendariz y col., 1994). Las clulas de Kupffer activadas liberan diversas citocinas y factores inflamatorios, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) y las interleucinas 1 y 6 (IL-1 y e IL-6), las cuales reclutan a su vez, a ms clulas inflamatorias hacia el entorno local. Tambin se liberan factores de crecimiento para fibroblastos (FGFs) acdicos y bsicos, el factor de crecimiento epidermal (EGF), as como las citocinas fibrognicas ms importantes, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF) y el factor de

crecimiento transformante (TGF-) (Armendariz y col., 1990; Armendariz y col., 1992). Otras clulas tambin contribuyen a la formacin de este depsito de citocinas, entre las que se incluyen plaquetas, linfocitos, fibroblastos y clulas de Ito, tambin llamadas clulas hepticas estelares o HSC (por sus siglas en ingls hepatic star cells) activadas (Fig. 2). De esta forma, las clulas de Kupffer presentes en el sinusoide, desarrollan un papel fundamental en la activacin de las clulas HSC, ya que secretan algunas de las citocinas descritas, e incluso, se contactan directamente con ellas mediante la emisin de prolongaciones a travs de las fenestraciones de las clulas endoteliales del sinusoide (Fig. 3A). Finalmente, la presencia de estas citocinas en el microambiente heptico promueve la activacin de las clulas HSC (Fig. 2). Se ha descrito ampliamente la participacin de las HSC como la principal fuente celular de sntesis de MEC durante la fibrognesis heptica (Franklin, 1995; Friedman, 1993; Armendariz y col., 1994). Las HSC se localizan dentro del espacio subendotelial del hgado, llamado Espacio de Disse (Fig. 3A). Se distinguen por su alto contenido intracelular de gotas de vitamina A y la expresin de desmina, un tipo de filamento intermedio del citoesqueleto, caracterstico de las clulas musculares. Cuando se produce un dao progresivo al rgano y se activan estas clulas, se genera un cambio en su fenotipo. Las clulas adquieren un aspecto semejante a los fibroblastos, perdiendo gran parte de su contenido de vitamina A y expresando la -actina del msculo liso. Este comportamiento ha sido asociado con el incremento en la sntesis de MEC. Varias tcnicas de biologa molecular como la inmunolocalizacin in situ y la hibridacin de RNA mensajeros,

nos han permitido demostrar la participacin de las HSC como la principal fuente de MEC en el hgado daado (Fig. 2). Las molculas de la matriz producidas por estas clulas incluyen al menos cinco tipos de colgena, heparn, dermatn y condroitina sulfato, laminina, fibronectina, tenascina y decorina (Franklin, 1995; Friedman, 1993). Con base en su comportamiento en cultivo e in situ, se ha observado que las HSC se activan primero por: i) iniciacin, caracterizada por eventos tempranos en los cuales las clulas aumentan su tamao y responden a las citocinas proliferativas y fibrognicas, y ii) perpetuacin, la cual refleja la respuesta celular a estas citocinas y resulta en cambios en el medio extracelular que las rodea, los cuales tambin modulan la activacin de las mismas HSC (Friedman, 1993). En el microambiente heptico se presentan diversos cambios ante el exceso de protenas colagnicas en el espacio subendotelial. Entre stos se cuentan la prdida de las vellosidades del hepatocito, la aparicin de una membrana basal y finalmente, la prdida de las fenestraciones de las clulas endoteliales, un proceso conocido tambin como capilarizacin de sinusoides. As, se impide el libre intercambio de nutrientes entre la sangre sinusoidal y el hepatocito. De igual manera se ven impedidas la destoxificacin de diversas sustancias por el hepatocito y la incorporacin de metabolitos producidos por el hgado al torrente sanguneo. Estos fenmenos explican algunas de las caractersticas clnicas de la cirrosis heptica como la hipoalbuminemia, la disminucin en la sangre de algunos factores de coagulacin, como los que dan

como resultado la elevacin de tiempos de protrombina, y la encefalopata heptica, entre otros.

1.2. Diagnstico de laboratorio

En el manejo clnico de la fibrosis heptica, el diagnstico se ha basado en los sntomas clnicos, pruebas de laboratorio, biopsia del hgado, tcnicas histolgicas y de imagen, incluyendo ultrasonido y resonancia magntica nuclear, con los cuales se determina el grado del dao heptico. La fibrosis heptica se desarrolla lentamente, dependiendo de la estimulacin constante por el factor etiolgico, que puede ser: el consumo crnico de alcohol, el virus de la hepatitis C, algunos desrdenes metablicos o incluso, la infeccin por parsitos como Schistosoma mansoni. Las caractersticas clnicas de la fibrosis, como la ictericia, la ascitis, el sangrado gastrointestinal y la encefalopata heptica, se observan en una etapa posterior de la enfermedad, cuando ha ocurrido ya la falla heptica y la hipertensin portal. De particular importancia es reconocer a los pacientes en la fase clnica latente de la enfermedad, o an despus de que la cirrosis se ha desarrollado. Por tanto, se necesitan establecer pruebas vlidas para detectar la fibrosis, para as emitir el diagnstico y estimar la severidad de la enfermedad. Es importante evaluar el pronstico y proponer la terapia ms conveniente, que dicho sea de paso, ningn tratamiento de cirrosis hasta ahora diseado es efectivo. Como se dijo al principio de este captulo, slo son paliativos y de sostn.

Las pruebas convencionales de sangre, tales como la medicin de enzimas sricas y bilirrubina, indican el grado de dao celular y colestasis pero no permiten diagnosticar o predecir a la fibrosis heptica. Por lo tanto, la histopatologa es el estndar de oro para diagnosticar la fibrosis y cirrosis heptica. Las pruebas estndar para la funcin sinttica heptica son la determinacin de protenas plasmticas, tales como la albmina y el tiempo de protrombina.

1.2.1 Diagnstico no invasivo: no siempre el mejor

Para evaluar la actividad fibrognica en las enfermedades fibrticas hepticas y para controlar la potencial terapia antifibrognica, se requiere una prueba diagnstica no invasiva, en concomitancia con las pruebas de diagnstico anteriormente descritas. Basados en el creciente conocimiento de la estructura, funcin y metabolismo de la matriz extracelular, se ha estimado el grado de la fibrosis a travs de diversas pruebas en las que se miden varios compuestos circulantes, productos del metabolismo de la matriz extracelular. La composicin, estructura y localizacin de los componentes del tejido conectivo heptico se han estudiado intensamente para encontrar un parmetro srico no invasivo para el diagnstico de la fibrosis heptica. Las enzimas y los productos metablicos de la colgena y de las glicoprotenas extracelulares se han empleado para cuantificar los cambios en el metabolismo del tejido conectivo. En este contexto, es importante definir claramente de lo que estamos hablando. La fibrosis histomorfolgica es un exceso de tejido conectivo en un determinado tiempo. Basados en los estudios acerca de la biologa de los

componentes de MEC heptica, hoy en da comprendemos que la fibrosis es un proceso dinmico regulado por la sntesis, degradacin y remodelacin de la matriz. En este proceso dinmico, la fibrognesis heptica puede correlacionarse con un incremento en el propptido aminoterminal de procolgena tipo III (PIIINP). Los ensayos en suero para medir los propptidos de colgena tipo IV (PIVNP, PIVCP) y laminina (Lam P1) reflejan el recambio de las membranas basales. La colgena tipo IV y la undulina (Un) se localizan en el intersticio, en donde se asocian con las fibrillas largas de colgena. Los ensayos sricos para la colgena tipo IV y la Un pueden por tanto, ser marcadores tiles para la degradacin de la matriz y la fibrlisis. Los niveles sricos de uno, o una combinacin de estos componentes de la matriz extracelular pueden indicar la actividad de fibrognesis o fibrlisis durante el seguimiento de un paciente. La elevacin persistente de PIIINP correlaciona con la actividad de fibrognesis heptica y predice el desarrollo de la enfermedad heptica crnica activa. PIIINP no es un marcador til de fibrognesis en infantes, debido a que el recambio de procolgena est relacionado con el crecimiento. Los pptidos tanto de colgena tipo IV como de laminina pueden ser usados como marcadores en nios pequeos; adems, auxilian a distinguir entre la hepatitis persistente crnica y la activa. Como marcadores de recambio de la membrana basal y de la capilarizacin de sinusoides, muestran una buena correlacin con la hipertensin portal en la cirrosis, lo cual es de valor clnico prctico. Ms recientemente, se ha propuesto que la colgena tipo IV y la undulina pueden servir como marcadores de degradacin de matriz y deben ser evaluados en estudios clnicos. En trminos clnicos, las correlaciones entre estos parmetros sricos puede ser ms valiosa

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que la medicin estricta del contenido de la matriz, debido a que ofrecen informacin pronstica para algunas formas de la enfermedad heptica. No obstante lo anterior, falta por determinar especficamente cundo la medicin de estos polipptidos circulantes es un reflejo de la sntesis, degradacin y remodelacin de la matriz heptica, y cundo estas pruebas son ciertamente aplicables para diversos tipos de dao heptico. As, las expectativas de encontrar una herramienta confiable no invasiva para diagnosticar la fibrosis/cirrosis heptica, que puedan sustituir a la evaluacin morfolgica, an no son satisfactorias. Sin embargo, en el manejo clnico rutinario de la fibrosis heptica, los niveles sricos de uno o de una combinacin de estos componentes de matriz extracelular pueden indicar la actividad de fibrosis en un paciente.

1.3 Terapias para la fibrosis heptica

Las terapias actuales para la fibrosis heptica incluyen la eliminacin del agente causante del padecimiento, la reduccin de la inflamacin heptica y del dao celular (Franklin, 1995; Friedman, 1993; Kim y col., 1997; Salgado y col., 2000) Sin embargo, en casos extremos se pueden requerir procedimientos quirrgicos, tales como el transplante de hgado. La discontinuacin de los agentes etiolgicos tales como el alcohol y algunas drogas hepatotxicas, previene la progresin de la fibrosis. En la hepatitis viral, la progresin hacia la infeccin crnica siempre precede a la fibrosis, implicando con ello que la depuracin viral eliminar el estmulo de la fibrognesis. Ha habido xito relativo en la eliminacin de los virus de la hepatitis B y C con interfern-alfa (IFN-), pero hasta el momento, no se

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sabe si la reduccin en la inflamacin por el IFN- sin depuracin viral reduce la fibrosis heptica. Los desrdenes metablicos, tales como la hemocromatosis y la enfermedad de Wilson (cirrosis de origen metablico), se controlan por flebotoma y terapia de quelacin cuando se ha realizado un diagnstico temprano. Para la cirrosis biliar primaria no existe evidencia de que la intervencin farmacolgica reduzca el desarrollo de la fibrognesis. Sin embargo, diversos ensayos clnicos siguen realizndose con este fin, utilizando cido ursodesoxiclico y frmacos inmunosupresivos. En la hepatitis autoinmune, las drogas inmunosupresoras como la prednisolona y la azatioprina, pueden reducir la inflamacin y el dao celular, y por tanto, reducir la fibrosis. Para etapas avanzadas de fibrosis heptica, el transplante de un hgado sano es la mejor opcin, hasta ahora. Sin embargo, el elevadsimo costo de este procedimiento, la carencia de donadores, los absurdos problemas jurdico-legales que regulan la Ley de Transplantes en nuestro pas, hacen esta posibilidad, poco menos que imposible para ser llevada a cabo. Las nuevas perspectivas teraputicas en el tratamiento de la fibrosis heptica se desarrollan a partir del creciente conocimiento en la biologa de la regulacin de la matriz extracelular depositada en exceso. De aqu, la intervencin farmacolgica se debe basar en la comprensin de las bases moleculares de la sntesis y degradacin de la matriz (Kim y col., 1999), y an ms, del entendimiento de las citocinas involucradas en la fibrognesis heptica (Friedman, 1993; Armendariz y col., 1990).

1.3.1 Inhibicin de la biosntesis de colgena

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La mayora de las terapias que interfieren con la sntesis de matriz extracelular se han enfocado en inhibir la biosntesis de colgena. Existen diversos agentes que la inhiben a nivel transcripcional, entre los que se incluyen los corticosteroides, el interfern-gamma (IFN-) y los retinoides (Friedman, 1993; Franklin, 1995). Hasta la fecha, los ensayos clnicos usando estos agentes son limitados. El IFN- puede reducir el depsito de matriz en la esquistosomiasis inducida en modelos murinos, pero no se ha examinado en humanos. Por otra parte, el uso de retinoides para prevenir la fibrosis en animales es limitada debido a su potencial toxicidad. En fibroblastos en cultivo se ha reportado la inhibicin por retroalimentacin transcripcional, usando los propptidos de colgena, pero este procedimiento no se ha usado in vivo. Tambin se estn utilizando drogas como los inhibidores de la prolil 4-hidroxilasa, las cuales provocan la desestabilizacin de la estructura de triple hlice de la procolgena, sin afectar los niveles de RNAm de las colgenas I y III, o de la prolil 4-hidroxilasa. En esas condiciones, la procolgena inestable sufre una degradacin intracelular o un procesamiento extracelular incompleto. Actualmente se estn realizando ensayos clnicos utilizando este tipo de terapias; sin embargo, todava no se tienen los datos concernientes a la eficiencia de este tipo de tratamiento. La sntesis de colgena tambin puede ser inhibida en la etapa de entrecruzamiento de las fibrillas mediante inibidores de la lisil oxidasa. La penicilamina bloquea la formacin del aldehdo durante el entrecruzamiento de la colgena. Sin embargo, hasta la fecha no se ha podido demostrar que existe una

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actividad antifibrtica significativa, en estudios clnicos realizados con pacientes con la enfermedad de Wilson (cirrosis de origen metablico).

1.3.2 Induccin de la degradacin del exceso de matriz extracelular

Otras estrategias teraputicas para el futuro incluyen el lograr un aumento de las proteasas extracelulares para la degradacin del tejido conectivo (Siller y col., 2000; Salgado y col., 2000; Garca y col., 2000). Esto pudiera ser til en las enfermedades fibrticas avanzadas del hgado, cuando ya se ha depositado un exceso de tejido conectivo en este rgano. Pocos agentes con efectos potenciales para degradar la matriz se han probado in vivo. La colchicina se ha estudiado desde hace ms de 20 aos con resultados variables. En modelos de clulas en cultivo, las colagenasas de matriz (ahora llamadas MMPs) pueden ser estimuladas por citocinas tales como IL-1, TNF- y PDGF y pueden ser inhibidas por el TGF-. Sin embargo, la regulacin in vivo de la actividad de las MMPs es muy compleja y an no est muy bien entendida. Los esfuerzos encaminados a incrementar la actividad endgena de las MMPs, requieren un mejor conocimiento de la localizacin celular de estas enzimas y de su regulacin por sus inhibidores llamados TIMPs, los cuales pueden interferir con las drogas teraputicas potenciales. Debido a que la sntesis de matriz en la fibrognesis heptica se lleva a cabo principalmente en las HSC activadas, la iniciacin y perpetuacin de la activacin de estas clulas ofrecen vas interesantes para el desarrollo de una

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terapia antifibrtica. Puesto que la activacin de las clulas HSC se acompaa por la proliferacin celular y del incremento de la sntesis de matriz, los anticuerpos dirigidos hacia citocinas como PDGF y TGF- pueden inhibir la fibrognesis. Las estrategias teraputicas futuras incluyen la posibilidad de la terapia de genes en clulas somticas, para lo cual se requiere una mejor comprensin de los elementos regulatorios de la expresin in vivo de los genes que codifican para protenas de la matriz extracelular (Armendariz y col., 1992; Armendariz y col., 1994). Esta alternativa parece haber sido exitosa para algunos desrdenes metablicos como la deficiencia de 1-antitripsina o para la fibrosis qustica, en los cuales ya se ha caracterizado el defecto molecular responsable de su expresin. Adems, en el desarrollo de las futuras terapias in vivo se ha procurado dirigir a los agentes farmacuticos o productos gnicos, especficamente al hgado (Fig. 3B, 4 y 5), para as prevenir las alteraciones en el metabolismo de la colgena o la aparicin de efectos laterales no deseados en otros rganos. En resumen, basados en el creciente conocimiento del metabolismo del tejido conectivo, se han abierto nuevas perspectivas para una posible terapia antifibrtica especfica en la fibrosis heptica. Otras estrategias potenciales para la intervencin teraputica en la fibrosis heptica se basan en la inhibicin de la sntesis de la matriz extracelular, en la induccin del aumento de su degradacin, en la inactivacin de las citocinas por anticuerpos neutralizantes y en la terapia somtica de genes (ver ms adelante). Todava no se ha establecido el diagnstico no invasivo especfico para la fibrosis heptica que pueda sustituir a la evaluacin histomorfolgica. La histologa es el estndar de oro en este sentido.

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Los sntomas clnicos y las pruebas convencionales de sangre indican el estado de la funcin hepatocelular en la fibrosis heptica y a menudo, la disfuncin slo es evidente en etapas avanzadas de la enfermedad. La medicin de los propptidos de tejido conectivo no pueden diagnosticar la fibrosis heptica; sin embargo, podemos obtener algunas conclusiones que nos indiquen cual es la actividad de fibrosis y as poder hacer el pronstico adecuado.

1.3.3 Antagonismo de citocinas como una ruta de terapia antifibrtica

Ya no hay duda de que el TGF- es uno de los mediadores mas importantes de la fibrognesis y que la inhibicin de su actividad es un blanco teraputico vlido. En diversos modelos experimentales se han aplicado anticuerpos contra TGF- por va parenteral, para el tratamiento de diversas lesiones que cursan con procesos fibrognicos. Sin embargo, para el establecimiento de una adecuada terapia por periodos prolongados en pacientes, debe considerarse la aplicacin del antagonista o inhibidor del TGF- por va oral, por medio de la cual se logre el bloqueo de la interaccin del TGF- con su receptor en el hepatocito, o la inhibicin del mecanismo de transduccin de la seal dada por el TGF-. Para llevar a cabo la primera estrategia, se han identificado tres tipos de receptores para el TGF-, pero an no se sabe cul es el receptor que determina la actividad fibrognica. Tambin se desconoce cul de las isoformas del TGF- tiene el papel dominante en esta actividad, o bien, si los tres receptores participan en ella, o si su participacin depende de las circunstancias del entorno local.

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Con respecto a los mecanismos de transduccin de seal que median las acciones biolgicas de la familia de los TGF-, estudios recientes indican que aunque existe poca homologa de secuencias entre los dominios extracelulares de los receptores tipo I y II, sus dominios citoplasmticos comparten secuencias caractersticas al de las serina/treonina cinasas. La confirmacin de la participacin de la actividad de serina/treonina cinasa provocar una bsqueda de inhibidores especficos para estas cinasas, as como para el sistema de receptores del TGF- para el tratamiento de la fibrognesis. Otra estrategia que est siendo explorada en la terapia antifibrtica es la inhibicin de receptores especficos de tirosina cinasas. Los mecanismos de transduccin de seales de PDGF, EGF y TGF-, comprenden la activacin de tirosina cinasas asociadas a receptores especficos, despus de que se produce la dimerizacin de los complejos receptor-ligando. La activacin de receptores de tirosina cinasas inducida por las citocinas es esencial para que se realice la accin mitognica de estas ltimas. Debido a que los receptores especficos de tirosinas cinasas participan en las actividades biolgicas de un amplio rango de citocinas y hormonas, los proyectos de diseo de agentes dirigidos hacia ellos pareceran muy remotas. Sin embargo, a travs de estudios in vitro, se han encontrado compuestos de bajo peso molecular que inhiben preferentemente a las tirosina cinasas asociadas a los receptores del PDGF y del EGF, lo cual puede ser utilizado como una futura herramienta teraputica.

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2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

Los objetivos de este captulo son revisar el conocimiento que existe sobre los mecanismos patomoleculares que se presentan en la cirrosis heptica as como las perspectivas de curar este padecimiento por medio de la terapia gnica.

3. ESTADO ACTUAL DEL ARTE

3.1 Terapia gnica en cirrosis heptica

En el hgado normal existe un equilibrio entre las protenas de colgena y las MMPs, en particular las colagenasas, enzimas intersticiales que degradan de manera especfica las colgenas tipo I, II y III, y que son secretadas por diversos tipos celulares (clulas HSC, hepatocitos, fibroblastos y neutrfilos circulantes). Esta homeostasis se ve alterada por el incremento de colgenas y la disminucin de la actividad de MMPs durante la cirrosis. Por ello, una de las estrategias teraputicas para la eliminacin del exceso de colgena se ha enfocado en: i) la induccin de la sntesis de las MMPs y ii) en el incremento de la actividad de estas proteinasas por las clulas hepticas (Salgado y col. 2000; Siller y col., 2000; Garca y col., 2000). En este sentido, se han efectuado diversos tratamientos con relativo xito; sin embargo, no se ha logrado la reversin total del padecimiento, probablemente debido a que no se ha alcanzado la cantidad suficiente de la enzima en el Espacio de Disse, o bien, porque su actividad ha sido baja en el hgado.

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En nuestro laboratorio hemos optado por inducir en el hgado (Salgado y col., 2000; Siller y col., 2000; Garca y col., 2000), la transduccin de genes especficos que codifican MMPs, o de genes que codifican para protenas que inducen la expresin de MMPs en las clulas hepticas (Fig. 3) mediante la incorporacin de un mayor nmero de copias de dichos genes en el DNA cromosmico celular. Aprovechando el desarrollo de diversas herramientas de la biologa molecular es posible la modificacin transitoria del genotipo de casi cualquier tipo de clula. Esto se realiza mediante la introduccin de DNA exgeno, el cual se introduce en la clula para incrementar o disminuir funciones especficas, e incluso, para desarrollar nuevas funciones en una clula que contenga la maquinaria transcripcional y traduccional requerida para la sntesis de la nueva protena, que har la funcin deseada. Una de las principales lneas de investigacin en nuestro laboratorio es utilizar diversos vectores (virales y no virales) como vehculos para introducir directamente al hgado, in vivo, genes teraputicos para que generen una pequea fbrica de produccin de protenas teraputicas capaces de revertir la fibrosis/cirrosis heptica (Salgado y col., 2000; Siller y col, 2000; Garca y col., 2000). Las MMPs u otras protenas producidas por los genes enviados directamente al hgado se difundiran en el microambiente sinusoidal para realizar all la degradacin de las colgenas depositadas en exceso. Con la eliminacin de las protenas de MEC, se pretende reestablecer la funcionalidad del lbulo heptico. Sin embargo, es muy importante hacer notar que antes de efectuar los ensayos de modificacin gentica en hgados de humanos es necesario realizar

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pruebas exhaustivas en modelos in vitro y en modelos animales que semejen la enfermedad de los cirrticos humanos (Aguilar y col., 2000). As, nosotros hemos desarrollado un protocolo de terapia gnica a nivel preclnico en ratas intoxicadas crnicamente con tetracloruro de carbono (CCl4) para inducirles cirrosis heptica. La posterior aplicacin de este protocolo en humanos depender del envo exitoso y seguro de genes que codifiquen para las protenas teraputicas en hgados con fibrosis extensa, utilizando como principal estrategia para su envo vectores adenovirales deficientes en su replicacin. Hemos realizado un estudio preclnico en ratas cirrticas de la cepa Wistar para determinar la seguridad, la eficiencia de transduccin, la toxicidad y la biodistribucin de un vector adenoviral que lleva como reportero al gen lacZ, el cual codifica para la -galactosidasa. En estos experimentos demostramos que vectores adenovirales pueden usarse con un propsito efectivo para liberar genes exgenos en hgados daados, sin provocar una disfuncin significativa en el hgado. Despus, evaluamos el efecto de genes teraputicos en hgados cirrticos (Garca y col., 2000). Como mencionamos al principio del captulo, la cirrosis heptica se caracteriza por un aumento de fibrosis en donde hay una acumulacin de protenas de la matriz extracelular, particularmente de las colgenas tipo I, IV y III, sintetizadas por clulas estelares hepticas en todo el parnquima heptico, principalmente alrededor de las venas central y portal, en donde forman una barrera que impide el libre intercambio de nutrientes entre el sinusoide y los hepatocitos, lo que conduce al deterioro de su funcin (Fig. 1A y 1B). Por lo tanto,

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nuestra hiptesis de trabajo es que la terapia gnica se puede utilizar para revertir la fibrosis exacerbada, caracterstica cardinal de los hgados cirrticos. A su vez, con la induccin de los genes que promueven la proliferacin de las clulas del hgado se puede favorecer el rpido restablecimiento de la masa funcional heptica. Para esto, hemos usado el cDNA humano del activador de plasmingeno derivado de urokinasa (huPA), modificado y clonado en un vector adenoviral de segunda generacin (Salgado y col., 2000; Siller y col., 2000) para obtener Ad-huPA de grado clnico, el cual fue preparado usando las condiciones descritas como GMP( por sus siglas en ingls Good Manufacturing Practices). El smbolo delta significa que el cDNA silvestre fue modificado genticamente en las regiones que codifican para el amino y el carboxilo terminal de la protena. La huPA promueve una cascada de eventos (Fig. 3B) en donde por un lado, activa a las MMPs latentes en el hgado. Con esta activacin se promueve la degradacin in situ del exceso de ECM en el espacio de Disse o espacio perisinusoidal. El exceso de ECM depositada bloquea el intercambio de nutrientes entre los hepatocitos y la sangre circulante. Concomitantemente, la huPA restablece la masa heptica funcional, al inducir a los hepatocitos remanentes para que entren en replicacin y as repoblar el parnquima heptico (Fig. 3B). La razn para usar este vector adenoviral reside en la ventaja de que la huPA no se secreta significativamente, y por lo tanto, no causa hipocoagulacin ni sangrado espontneo, que constituye la principal desventaja en animales cirrticos.

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3.1.1 La sobreexpresin del gen huPA en el hgado induce la reversin de la fibrosis

Adems de su papel en la activacin del plasmingeno, la huPA est considerada como uno de los principales iniciadores que conducen a la activacin de la cascada de las metaloproteasas asociadas con la degradacin de la matriz extracelular. Despus de que la huPA activa la conversin del plasmingeno en plasmina, se activan tambin las procolagenasas y posiblemente otras metaloproteasas, convirtindolas en su forma activa desde etapas tempranas. Por lo tanto, primero determinamos el grado de fibrosis en los hgados cirrticos teidos con la tincin de Masson. El anlisis morfomtrico asistido con computadora de mltiples campos microscpicos, demostr que las ratas tratadas con Ad-huPA tenan una reduccin dramtica de la fibrosis a los diez das (85%) (Fig. 4B y 4B), comparada con la fibrosis al inicio del tratamiento, as como con la fibrosis presentada por los animales cirrticos inyectados con el vector control AdGFP (Fig. 4A y A) y slo con solucin salina.

3.1.2 La huPA induce una regeneracin vigorosa en clulas de hgados cirrticos

Teniendo resuelta la primera mitad del proceso, procedimos a determinar el nivel de regeneracin heptica necesario para rellenar los espacios vacos, despus de llevarse a cabo la degradacin de la matriz extracelular. La figura 5 representa la

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cintica de la mitosis en los hgados, presumiblemente estimulada por la activacin in situ de HGF (por sus siglas en ingls Hepatocyte Growth Factor) La proliferacin de hepatocitos fue medida como el porcentaje de clulas teidas con un anticuerpo especfico contra el antgeno de proliferacin celular nuclear (PCNA). El nmero de hepatocitos positivos a PCNA fue diez veces ms alto en los hgados de ratas tratadas con Ad-huPA que en los hgados de ratas con AdGFP y los hgados de ratas normales (Fig. 5A). El ndice de marcaje demostr que aproximadamente el 55% de los hepatocitos fueron teidos positivamente con los anticuerpos anti-PCNA (Fig. 5, flecha roja), tanto en las reas periportales (Fig. 5B) como en las centrilobulares (Fig. 5C) a los dos das despus de la inyeccin con Ad-huPA. En la figura 5 se observan numerosas celulas mitticas y hepatocitos binucleados (Fig. 5A, flechas negras y azules). Notablemente, se detectaron ndices de marcaje del 40% an despus de ocho das de administrado el vector adenoviral (Fig. 5B y C). Las clulas positivas detectadas a los diez das indican un reestablecimiento de la masa funcional heptica, lo cual fue confirmado por la clara tendencia de las pruebas funcionales hepticas de la AST (por sus siglas en ingls aspartato amino transferasa) la ALT (por sus siglas en ingls alanino amino transferasa), la bilirrubina y los tiempos de protrombina a normalizarse. De este modo, induciendo dos diferentes cascadas de eventos benficos, la terapia con el gen de la huPA modificado puede ser muy til para el tratamiento de la cirrosis heptica.

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4. CONCLUSIONES

Es importante entender que debemos de coordinar esfuerzos para establecer protocolos de Terapia Gnica en nuestro pas, no slo por el hecho de seguir los pasos de los pases desarrollados o de imitar a nuestros colegas anglosajones en el uso de la Biotecnologa como un mero pasatiempo (Aguilar y col., 2000). Existen enfermedades que afectan de manera preponderante a la poblacin de Mxico, para las cuales no se han desarrollado curas satisfactorias, las cuales pueden ser el blanco de estrategias apoyadas en la Terapia Gnica. As, nuestro grupo de investigacin del Instituto de Biologa Molecular en Medicina y Terapia Gnica del Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS) de la Universidad de Guadalajara, ha desarrollado en los ltimos seis aos protocolos de Terapia Gnica experimental para el tratamiento y reversin de la cirrosis heptica y nos hemos convertido en pioneros a nivel mundial en esta rea. Hemos utilizado modelos experimentales en ratas cirrticas que mimetizan la enfermedad en humanos, inducida por ingesta crnica de alcohol, la infeccin por virus de la hepatitis C, la atresia de vas biliares en nios y la obstruccin de ductos biliares en adultos. Nuestros estudios preclnicos, en los cuales hemos analizado cientos de animales para determinar toxicidad, biodistribucin, seguridad, efectos teratognicos y dosis respuesta de genes teraputicos acarreados por vectores adenovirales de segunda generacin de grado clnico, han sido concluyentes y satisfactorios, de tal manera que estamos en el proceso de estandarizar nuestros protocolos y de certificarlos ante las autoridades de Salud competentes y ante los

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comits de tica de varios hospitales, para iniciar a la brevedad posible, un estudio de fase I en humanos voluntarios, con el objeto de determinar la seguridad y la eficacia de nuestra metodologa.

4.1 Por qu cirrosis?

Las principales razones para aclarar la terapia gnica en pacientes con cirrosis heptica son: i) no existe cura satisfactoria, ii) la cirrosis heptica es la cuarta causa de muerte en edad productiva en Mxico, iii) en el ao de 1999, en nuestro pas fallecieron a consecuencia de esta enfermedad, aproximadamente 23 mil personas, iv) se presentan prdidas por miles de millones de pesos como consecuencia de ausentismo laboral, v) se invierten miles de millones de pesos en nuestro pas por hospitalizacin de pacientes cirrticos y vi) de los 425 protocolos en fase clnica que involucran a mas de tres mil pacientes tratados con Terapia Gnica en el mundo, ninguno est relacionado con cirrosis heptica.

ABREVIATURAS MEC MMPs TIMPs FGFs EGF PGDF HSC Matriz extracelular. Metaloproteasas de la matriz. Inhibidores tisulares de las MMP. Fibroblastos. Factor de crecimiento epidermal. Factor de crecimiento derivado de plaquetas. Clulas hepticas estelares.

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PIIINP

Prpeptido de colgena tipo IV.

BIBLIOGRAFA

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PIES DE FIGURAS

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Fig. 1. Proceso de evolucin de la fibrosis caracterstica en hgados cirrticos.

Fig. 2. Eventos importantes en la activacin de las celulas hepticas estelares y los diferentes factores o mediadores profibrognicos involucrados.

Fig. 3. Terapia gnica experimental. A. La cirrosis heptica se caracteriza por la acumulacin de protenas de matriz extracelular principalmente de colgena tipo I en el hgado. Con el exceso de esta protena se impide el libre intercambio de nutrientes entre el torrente circulatorio y el hgado, as como la destoxificacin de agentes nocivos realizada por este rgano, y que son las principales causas de la fisiopatologa de la enfermedad. Hasta el momento no existe ningn agente teraputico que revierta con efectividad la acumulacin de la colgena heptica. B. En esta figura se muestra cmo enviando de manera eficiente un gen teraputico al hgado como el cDNA del activador de plasmingeno urokinasa de humano (huPA) se activa una cascada de eventos inducidos por el huPA en la cual por un lado, activar metaloproteasas de matriz (MMPs) latentes que degradarn el exceso de matriz extracelular (ECM), liberndose factores de crecimiento embebidos en la ECM induciendo la proliferacin de hepatocitos. Por otro lado, se activa DIRECTAMENTE al Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF), POTENCIANDO an ms la proliferacin de hepatocitos y permite rellenar los espacios vacos dejados por la degradacin de la ECM y en consecuencia lograr la regeneracin del hgado y reversin de la fibrosis.

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Fig. 4. A. Secciones de tejido de hgados de ratas tratadas con CCl4 por 6 semanas obtenidos al da 1, 2, 4 y 6 despus de la inyeccin del vector AdGFP teidas con tincin tricrmica de Masson (50x) y Rojo Sirio (50x). Los ndulos cirrticos en ratas con Ad-GFP estn rodeados por gruesas bandas fibrticas al da 2, observndose un aumento en la fibrosis a los das 4 y 6 de administrado el vector adenoviral. Se muestra, adems, la expresin de la protena verde fluorescente en ratas inyectadas con el vector adenoviral irrelevante (Ad-GFP) en hgados. A. Porcentaje de depsito de colgena en hgados cirrticos despus de la inyeccin con el vector adenoviral irrelevante (Ad-GFP) al da 2, 4 y 6, as como de rata normal y cirrtica tratada slo con solucin salina. La determinacin de tejido fibrtico se realiz en 10 campos al azar con un analizador de imgenes automatizado (Qwin, Leica). B. Secciones de tejido de hgados de ratas tratadas con CCl4 por 6 semanas obtenidos a los das 2, 4, 6, 8 y 10 despus de la inyeccin del vector AdhuPA teidas con tincin tricrmica de Masson (50x) y Rojo Sirio (50x). En contraste con la administracin con Ad-GFP, las ratas inyectadas con Ad-huPA a los 2 das, muestran ndulos fibrticos rodeados por gruesas bandas fibrticas que van disminuyendo a los diferentes das de tratamiento hasta mostrar solamente delgadas bandas fibrticas a los 10 das, que se extiende en las reas portales (flecha verde) y en las venas centrales (flecha amarilla) B. Porcentaje de depsito de colgena en hgados cirrticos despus de la inyeccin con el vector adenoviral Ad-huPA a los das 2, 4, 6, 8 y 10, as como de ratas

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cirrticas tratadas slo con solucin salina y Ad-GFP a los 6 das. La determinacin de tejido fibrtico se realiz en 10 campos al azar con un analizador de imgenes automatizado.

Fig. 5. A. Inmunohistoqumica de secciones de hgados cirrticos de ratas con anticuerpo anti-PCNA para evaluar la proliferacin en los hepatocitos despus de la administracin del vector adenoviral Ad-huPA, Ad-GFP o solucin salina. Los hgados cirrticos con solucin salina o pAd-GFP mostraron pocos hepatocitos con la inmunotincin con PCNA nuclear (flecha roja) (200x) y se muestra, adems, la expresin de la protena verde fluorescente (GFP) como control en el hgado. En comparacin, las ratas cirrticas despus de 2 das de la administracin con Ad-huPA mostraron mayor nmero de hepatocitos positivos para PCNA (flecha roja) en co-existencia con figuras mitticas frecuentes (flecha negra) y clulas binucleadas (flecha azul)(200x). Se observan clulas positivas a los 4, 6, 8 y 10 das. B. Porcentaje de clulas inmunoteidas en la regin periportal con anticuerpo anti-PCNA despus de la administracin del vector adenoviral Ad-huPA, Ad-GFP o tratada con solucin salina. La cuantificacin de clulas positivas y negativas se realizaron en 4 campos al azar con un analizador de imgenes automatizado. Las secciones de hgados de ratas no tratadas y tratadas con Ad-GFP fueron usadas como controles. C. Porcentaje de clulas inmunoteidas en la regin lobular con anticuerpo anti-PCNA despus de la administracin del vector adenoviral Ad-huPA, Ad-GFP o tratada con solucin salina. La cuantificacin de clulas positivas y negativas se

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realiz en 4 campos al azar con un analizador de imgenes automatizado. Las secciones de hgados de ratas no tratadas y tratadas con Ad-GFP fueron usadas como controles.

Captulo 15 Direccionamiento especfico de farmacobiticos a los vasos sanguneos de tumores Rafael Cabeza1 y Eppie D. Rael1.
1

Departamento de Ciencias Biolgicas, Universidad de Texas en El Paso, El Paso, Texas. EUA.

Email: rcabeza@utep.edu y erael@utep.edu PALABRAS CLAVE: Inmunoglobulinas, inmunotoxinas, metaloproteinasas, agentes antitumores, vasos sanguneos.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivos del captulo 3. Estado actual del arte. 4. El uso de toxinas de serpientes. 5. Problemas posibles y conclusiones. Agradecimientos Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

El desarrollo de farmacobiticos efectivos en la terapia contra los tumores es un reto que requiere nuevas estrategias para atacar especficamente a los tumores sin daar al husped. Todava falta identificar muchas de las molculas y vas

fisiolgicas especficas de los tumores que puedan servir como blancos para el desarrollo de nuevas terapias. Los farmacobiticos interactan con estas molculas e interfieren con las vas fisiolgicas particulares de los tumores, afectando su metabolismo. Las protenas o farmacobiticos peptdicos que se pretendan usar contra los tumores, necesitan ser no inmunognicas y tener la capacidad de atravesar los vasos sanguneos que irrigan a los tumores. Un blanco potencial de ataque en contra de los tumores son sus vasos sanguneos (Fig. 1). Los tumores, vistos como injertos extraos, necesitan de un abasto sanguneo para poder mantenerse viables. Si se interfiere con el aporte sanguneo, se producir una deficiencia en el suministro de nutrientes y en el intercambio de gases causando, eventualmente, la muerte del tumor. Algunos posibles farmacobiticos en contra de los tumores incluyen a i) las toxinas no inmunognicas y ii) las protenas que han sido expresadas a partir del DNA que codifica para la regin variable de las inmunoglobulinas (Fv), cuya caracterstica primordial es el reconocimiento de las molculas especficas del tumor. Tambin pueden utilizarse compuestos txicos que estn unidos a una molcula que reconozca y se una a las molculas de los tumores. Las toxinas que destruyen los vasos sanguneos o que forman cogulos, como ciertas metaloproteinasas presentes en los venenos de ciertas vboras pueden ser agentes muy tiles en contra de los tumores si se logra dirigir su actividad especficamente hacia los vasos sanguneos de stos.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

El presente captulo discute posibles mtodos para el tratamiento contra tumores cancerosos, atacando los vasos sanguneos de los mismos en vez de usar terapias no tan especficas. El objetivo de este trabajo es desarrollar anticuerpos que puedan reconocer el abasto capilatorio de tumores y no el normal. Adems, es necesario investigar qu tipos de toxinas se pueden usar y cuales tienen la posibilidad de atacar este abasto mas eficientemente. Ciertas toxinas que se encuentran en el veneno de vboras de cascabel tienen la habilidad de afectar los vasos sanguneos y puede que estos sean buenos candidatos para ligar con agentes que especficamente reconozcan los vasos sanguneos de los tumores.

3. INTRODUCCIN

En los ltimos diez aos se han hecho progresos importantes en el desarrollo de nuevos y efectivos farmacobiticos inmunoteraputicos en contra de los tumores. Los avances realizados comprenden el desarrollo de inmunotoxinas, para las cuales se han empleado protenas de fusin hechas con anticuerpos de origen humano. Estos anticuerpos tienen la ventaja de que presentan poca reaccin inmunolgica en el ser humano por lo que pueden ser utilizados en el combate contra los tumores. Las cadenas nicas del fragmento Fv de los anticuerpos han sido construdas genticamente y producidas como protenas de fusin (Fig. 2). Las inmunotoxinas son agentes citotxicos que consisten de un anticuerpo llamado citocina, dirigido contra antgenos especficos del tumor. Este anticuerpo se utiliza como un agente gua y va unido a una toxina (Theuer y Pastan, 1993; Thrush y col., 1996). Los anticuerpos o agentes guas interactan especficamente

con los antgenos de las clulas tumorales, son internalizados y ya en el citoplasma, la toxina se separa del anticuerpo e interfiere con alguna funcin celular crtica. Los anticuerpos, generalmente monoclonales y generados en ratones, estn dirigidos contra antgenos propios del tumor, es decir, antgenos que normalmente son expresados en baja cantidad en las clulas normales, pero que en las clulas tumorales se sobreexpresan. Las toxinas ms comnmente usadas en la construccin de inmunotoxinas son de origen bacteriano o vegetal y actan bloqueando la sntesis de protenas. Las toxinas de origen bacteriano que con ms frecuencia se utilizan en esta estrategia son la exotoxina de Pseudomonas y la toxina de la difteria. Las de origen vegetal ms empleadas son la ricina y la abrina. La exotoxina de Pseudomonas y la toxina de la difteria inactivan al factor de alargamiento 2 (EF-2), clave en la traduccin de las mRNA para producir las protenas. La ricina y la abrina interfieren con la interaccin entre el factor EF-2 y la subunidad ribosomal 28S. Las citotoxinas que dirigen su accin contra la membrana celular tambin tienen la posibilidad de ser usadas como agentes txicos en la construccin de inmunotoxinas (Gasanov y col., 1995). La produccin de inmunotoxinas recombinantes ha generado un gran inters, ya que algunas de ellas han demostrado tener gran potencial como frmacos en el tratamiento de tumores (Kreitman y Pastan, 1995). Actualmente, se han desarrollado algunas inmunotoxinas recombinantes para ser usadas contra ciertos tipos de cnceres humanos (Reiter y col., 1996; Kuan y Pastan, 1996a; Kuan y Pastan, 1996b; Francisco y col., 1995), mientras que otras se han usado para prevenir el rechazo de los transplantes por el husped (Vallera y col., 1996).

Las toxinas y los anticuerpos utilizados en estas terapias han sido diseados genticamente para obtener polipeptidos recombinantes de un tamao mnimo esencial para mantener la funcin. Se han producido protenas de fusin usando construcciones de DNA en las cuales, el cDNA de la cadena Fv de hibridomas se combina con fragmentos cortos o alterados de los genes de las toxinas (Kreitman y Pastan, 1995; Benhar y Pastan, 1994; Benhar y col., 1994a; Benhar y col., 1994b; Vallera y col., 1996). Tambin se han aadido a estas construcciones, secuencias que codifican para ligadores artificiales, con el fin de estabilizar las cadenas ligera (L) y pesada (H) del anticuerpo y as, asegurar una mejor interaccin entre el antgeno y el anticuerpo (Reiter y col., 1996; Benhar y col., 1995; Pastan y col., 1992; Murphy y col.,1987). Los antgenos especficos de tumores, o los encontrados en cantidades muy abundantes, como el receptor para el factor de crecimiento epidrmico erbB2r, CD40 y el receptor de la interleucina-2, se han usado en este tipo de construcciones (Kuan y Pastan, 1996a; Kuan y Pastan, 1996b; Francisco y col., 1995; Kreitman y col., 1994). Como resultado de estas estrategias, ciertos tipos de cncer, como los mielomas y las leucemias, se han curado usando anticuerpos manufacturados. Un reto ms grande todava para la inmunoterapia contra el cncer es la erradicacin de tumores slidos, especialmente los que invaden a los tejidos vecinos o adyacentes (Molema y col., 1997). En estos casos el estudio de molculas dirigidas contra los tumores empieza a ser promisorio. Un buen blanco de ataque son los vasos sanguneos que los irrigan, ya que tanto stos como los injertos de tejido exgeno y los tejidos normales necesitan de un abasto

sanguneo para poder mantenerse viables. Bloqueando o interfiriendo con el suministro sanguneo se reducir o se eliminar el abasto de substancias nutritivas y el intercambio de gases necesario para el mantenimiento del tumor. La muerte celular del tumor normalmente se inicia en la parte central, en donde el aporte sanguneo es reducido y el desarrollo vascular es pobre. De esta manera, la destruccin de los vasos sanguneos tumorales puede ser un medio para atacar al tumor en s. Como los tumores necesitan un aporte nutricional, estn forzados a generar nuevos vasos sanguneos y stos son establecidos por el proceso de angiognesis, usando los recursos del husped. La angiognesis probablemente se inicia cuando la tensin del oxgeno se ve reducida en el tumor. Esto generalmente ocurre cuando la masa celular tumoral ha llegado a un dimetro de dos milmetros. Estudios recientes han demostrado que el grado de desarrollo de los vasos sanguneos en el tumor est relacionado con la supervivencia del paciente. Asimismo, el grado de vascularizacin del tumor puede servir como un ndice para la recurrencia del tumor (Tanigawa y col., 1997; Heimann y col., 1996). La estructura normal de los vasos sanguneos es compleja y puede ser de varios tipos, como la vascularizacin de los tejidos cardiovasculares que ocurren en varias capas concntricas. El endotelio de los vasos tambin puede ser fenestrado (como los vasos capilares viscerales) o discontinuo (como se encuentra en los vasos del hgado o de tejidos hematopoyticos). Sin embargo, la mayora de vasos sanguneos tienen un endotelio que es continuo y una membrana basal compuesta de colgena, laminina, heparina sulfatada, proteoglicanos, condroitina sulfatada, entactina y sialoglicoprotenas. El tejido

conectivo que forma la tnica adventicia est compuesto de colgena, proteoglicanos, fibronectina y clulas. Pero los vasos sanguneos de los tumores presentan gran desorden y tienen muchas desviaciones. Estos vasos tienen una densidad baja y dimetros irregulares, en contraste con los vasos sanguneos de los tejidos normales (Dewhirst y col., 1989). La formacin de vasos sanguneos en el tumor requiere una interaccin compleja entre clulas normales y clulas tumorales, donde participan molculas solubles y componentes de la matriz extracelular. Numerosos pptidos importantes en la formacin de los vasos sanguneos en los tumores han sido descritos e incluyen, por ejemplo, al factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), al factor de necrosis tumoral alfa (TNF) y al factor de crecimiento tumoral beta (TGF) (Baillie y col., 1995). Las integrinas, que son protenas que median la unin de las clulas con ciertas protenas, tambin participan en la angiognesis. Dadas estas interacciones complejas entre componentes del tumor y los tejidos normales, es razonable pensar que los vasos sanguneos de los tumores, los cuales tienen arreglos desordenados, deben tener molculas (protenas y receptores) que son diferentes a los que poseen los vasos sanguneos de los tejidos normales. El desarrollo de anticuerpos para el tratamiento de tumores es un rea activa de la investigacin y ya se han desarrollado ciertos anticuerpos contra tumores de las clulas endoteliales. Los receptores del factor VEGF son expresados en alta cantidad por clulas endoteliales malignas y pueden ser molculas apropiadas para dirigir toxinas (Brown y col., 1993). Otra molcula prometedora en este aspecto es la CD34, una protena que se encuentra sobre la

superficie celular y que es expresada en clulas progenitoras hematopoyticas humanas, en el endotelio vascular y en muchos tumores mesenquimatosos. Esta molcula se encuentra en concentraciones suficientes en las secciones terminales de los brotes vasculares de los tumores como para ser usada como un blanco contra el tumor (Schlingemann y col., 1990; Poblet y col., 1994). Por estas razones, los anticuerpos contra el receptor de VEGF y contra la protena CD34 son buenos candidatos para dirigir las inmunotoxinas contra los vasos sanguneos de los tumores. Recientemente, un anticuerpo contra la protena CD34 del hibridoma My10 fue sintetizado y usado como el agente gua de las inmunotoxinas (Benedict y col., 1997). Sin embargo, es necesario desarrollar anticuerpos ms especficos, dirigidos contra antgenos propios de las clulas tumorales, para el tratamiento eficaz de los tumores con inmunotoxinas. Un mejor abordaje y ms apropiado es el de dirigir las inmunotoxinas contra pequeos pptidos especficos de los receptores de tumores, como en la integrina v3 y en el receptor de adhesin celular. Este binomio receptor-integrina ha sido identificado como un marcador del tejido vascular angiognico (Brooks y col., 1994), y dado que no se expresa en las clulas normales, se ha usado como un blanco en la terapia contra los tumores (Arap y col., 1998). La mejor forma de administrar los farmacobiticos en la terapia anti-tumor es la intravenosa, pero sta requiere que el frmaco encuentre su blanco de accin dentro del organismo y para hacerlo, el frmaco tiene que penetrar en el tejido del tumor. La penetracin del agente inmunoteraputico es difcil ya que debe cruzar las capas que constituyen los vasos sanguneos (la capa endotelial, la

membrana basal y la matriz extracelular) en el lugar necesario. Las diferencias de presiones sanguneas entre los tejidos del tumor y los vasos pueden afectar la extravacin del frmaco, complicando la situacin (Jain, 1987). Los vasos sanguneos de los tumores tambin son menos permeables, en comparacin con los vasos sanguneos normales y estn localizados en la interfase entre el tumor y husped. Dvorak y col., (1991) usaron anticuerpos monoclonales dirigidos contra tumores. Estos autores encontraron que algunos anticuerpos cruzaron la pared de los vasos sanguneos a nivel de la interfase vascular, entre el tumor y el husped, pero la mayora de los anticuerpos nunca llegaron a estar en contacto con las clulas del tumor. Por lo tanto, los frmacos inmunoteraputicos dirigidos contra tumores slidos tienen pocas posibilidades de interactuar con las clulas del tumor. Las clulas del sistema inmunolgico son activadas por dao a los tejidos, incluyendo dao al tumor, la cual es una consecuencia deseable, y pueden tener dificultad para llegar al sitio daado debido a que los vasos sanguneos tumorales pueden carecer de las molculas de adhesin necesarias para unirse a las clulas inmunolgicas. Por tanto, se requiere del desarrollo de nuevos farmacobiticos para superar los problemas que actualmente presentan los frmacos inmunoteraputicos disponibles. Es necesario desarrollar farmacobiticos que ataquen a los vasos sanguneos de los tumores directamente, por lo que existe un gran inters en esta rea de la investigacin. En un estudio de esta naturaleza se triplic la absorcin de anticuerpos por el tejido tumoral cuando se us un anticuerpo contra fibronectina qumicamente conjugada con IL-2, una citocina con actividad vascular (Epstein y col., 1995).

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Recientemente, en un impresionante estudio, Huang y col., (1997) ocluyeron los vasos sanguneos que irrigaban al tumor, impidiendo su crecimiento y causando su destruccin. En este estudio, los vasos sanguneos de tumores C1300-(Mu), producidos en ratones inmunosuprimidos (desnudos) fueron obstruidos usando un anticuerpo bi-especfico. Un brazo del anticuerpo estaba dirigido contra el transgn I-Ad para guiar el anticuerpo contra el endotelio vascular del tumor, y el otro brazo contena una forma truncada del factor tejido humano (TF) cuyo epitopo no interfiere con su propia actividad. El conjunto de TF en la superficie celular con el factor VII/VIIa gener un complejo funcional de TF:VIIa. Este complejo es capaz, por medio de una protelisis limitada, de activar a la serina proteinasa de los factores IX y X en su forma de zimgeno. Esto produce la formacin de cogulos de trombina en los vasos sanguneos del tumor, capaces de interrumpir el abasto de sangre al tumor de una forma muy eficiente. El tratamiento de ratones inmunosuprimidos con tumores C1300-(Mu) usando est tcnica, result en una regresin de los tumores en el 38% de los animales.

4. EL USO DE TOXINAS DE SERPIENTES

El ataque a los componentes de los vasos sanguneos es otra opcin en la estrategia contra los tumores. Se podran desarrollar farmacobiticos para inmunoterapia usando la estrategia de interferir con la continuidad de los vasos sanguneos del tumor. Las metaloproteinasas del veneno de la vbora de cascabel y las citotoxinas del veneno de la cobra son agentes que pueden atacar

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componentes de los vasos sanguneos (Patel y col., 1997; Baramova y col., 1991; Bjarnason y Fox, 1994), lo que hace a estas toxinas excelentes candidatos para destruir a los vasos sanguneos del tumor. Sin embargo, estas toxinas tambin atacan a los vasos sanguneos normales, por lo que es muy importante que sean dirigidas especficamente a los vasos sanguneos que irrigan el tejido maligno. Por ms de veinte aos se han buscado molculas especficas de los vasos sanguneos con cierto xito. Una tecnologa relativamente nueva ha resultado excelente en la bsqueda de estas molculas y su uso promete ayudar eficientemente a encontrar blancos potenciales (Pasqualini y col., 1997; Arap y col., 1998). En esta tecnologa se incluye el uso de genotecas con secuencias de nucletidos clonadas en fagos, las cuales codifican para polipptidos muy pequeos. Esta tecnologa se ha denominado phage display en ingls, o presentacin de antgenos en fagos, la cual ha sido usada con buenos resultados. El anlisis comparativo de clulas normales y tumorales, usando esta estrategia, demuestra que existen molculas especficas en los vasos sanguneos de los tumores. La tecnologa de phage display es una tecnologa muy poderosa y permite estudiar la interaccin entre los blancos y otras molculas (Fig. 3) (Scott y Smith, 1990; Smith y Scott, 1993). En este sistema, cientos de millones de pptidos al azar son expresados en la superficie del bacterifago, como si se tratara de un banco de protenas de fusin y de ligandos, a partir de la cual se pueden seleccionar aqullas de inters (Fig. 3). Por ejemplo, Pasqualini y col., (1996) crearon una genoteca en el sistema de phage display para aislar secuencias mnimas de receptores que pudieran interactuar con fibronectina y con fragmentos de fibronectina conteniendo el motivo RGD o Arg-Gly-Asp, que es un

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tripptido presente en una variedad de ligandos para la integrina que une fibronectina. Recientemente, una genoteca en el sistema phage display se us para detectar protenas especficas de tumores en las clulas endoteliales de los vasos angiognicos (Folkman, 1995; Hanahan y Folkman, 1996; Folkman, 1997), incluyendo las v integrinas (Max y col., 1997). Estudios in vivo, utilizando genotecas del sistema phage display para identificar las molculas de inters, han demostrado que ciertos pptidos reaccionan selectivamente con los vasos sanguneos de rganos especficos (Pasqualini y Rouslahti, 1996). Usando esta estrategia, Arap y col., (1998) identificaron recientemente pptidos sintticos que interactan selectivamente con las integrinas avb3 y avb5, especficas de los vasos sanguneos. Estos investigadores demostraron que el pptido con la secuencia CDCRGDCFC, el cual tiene el motivo RGD (Arg-Gli-Asp por lo que lo llamaron RGD-4C) puede remover clulas de varios tipos de tumores, incluyendo carcinomas, melanomas y sarcomas. Tambin demostraron que un segundo pptido, CNGRCVSGCAGRC, conteniendo el tripptido NGR (Asn-Gli-Arg), puede reconocer molculas en el carcinoma de mama humano, en las clulas del sarcoma de Kaposi y del melanoma de ratn. Estos pptidos ligados con doxorubicina, un frmaco anticanceroso, fueron capaces de dirigir el frmaco especficamente a clulas humanas de tumores cancerosos producidos en ratn. Esto mejor significativamente la eficacia del frmaco contra los tipos de cnceres estudiados. Aparentemente los ppticos sintticos CDCRGDCFC y CNGRCVSGCAGRC, parecen ser excelentes agentes que pueden ser utilizados como guas de toxinas contra los tumores cancerosos. Toxinas, como las

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metaloproteinasas y las citotoxinas de venenos de vboras, que atacan a los vasos sanguneos de tumores son excelentes candidatos para conjugarlos con los pptidos CDCRGDCFC y CNGRCVSGCAGRC y usarlos para combatir a los tumores . Muchas de las metaloproteinasas conocidas se han aislado de venenos de serpientes y son buenos candidatos para el uso en el ataque contra tumores (Bjarnason y Fox, 1994; Marsh, 1994). Estas proteinasas recibieron originalmente nombres descriptivos basados en su actividad as, algunas de ellas se han llamado toxinas hemorrgicas porque causan hemorragias en los animales que las reciben. A otro grupo se le nombr toxinas fibrinolticas, fibrinogenolticas o fibrinasas por su capacidad de hidrolizar fibrina o fibringeno (Willis y Tu, 1988; Rael y col., 1992; Tu y col., 1996; Chen y Rael, 1997). Sin embargo, las toxinas hemorrgicas tambin hidrolizan a la fibrina y al fibringeno (Willis y Tu, 1988; Rael y col., 1992). Algunas metaloproteinasas de venenos de vbora tambin causan la formacin de cogulos de fibrina, debido a su accin sobre el fibringeno. Otras pueden hidrolisar componentes del sistema del complemento, iniciando as la cascada del complemento (Rael y col., 1997). El mecanismo que genera la hemorragia consiste en la ruptura proteoltica de la membrana basal de los vasos capilares, lo que permite el escape de su contenido hacia los tejidos adyacentes (Ownby, 1978). El mecanismo de accin tambin comprende la digestin de la laminina, un componente de la membrana basal, por la toxina hemorrgica (Baramova y col., 1991). Sin embargo, la activacin del sistema del complemento tambin genera molculas vaso activas (Martinez y col., 1990;

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Molina y col., 1990). Todas estas metaloproteinasas requieren del zinc para su actividad. Estudios de comparacin de sequencias de DNA y de polipptidos han mostrado que las metaloproteinasas de los venenos de vboras tienen una identidad muy alta entre s (Bjarnson y Fox, 1994; Chung y col., 1996; Tu y col., 1996). Por eso se han clasificado como miembros de la subfamilia reprolisina, de la familia M12 de las metaloproteinasas (Bjarnason y Fox, 1994; Hite y col., 1994; Rawlings y Barrett, 1995). La comparacin del tamao y la secuencia de las metaloproteinasas de venenos de vboras ha permitido clasificarlas en cuatro clases de protenas relacionadas estructuralmente: P-I, P-II, P-III y P-IV (Hite y col., 1994). La diferencia entre estas cuatro clases es la presencia de secuencias adicionales en los dominios carboxilo terminales de las metaloproteinasas en las clases P-II, P-III y P-IV. Cada clase tiene una desintegrina, las cuales son inhibidores no enzimticos de las integrinas humanas, o un dominio parecido al de las desintegrinas. Las clases P-III y P-IV tienen un dominio adicional con una cistena y la P-IV contiene adems, otro dominio que interacta con las lectinas. La secuencia nucleotdica de estas protenas estn muy conservadas (Hite y col., 1994). Las metaloproteinasas P-III se relacionan con el grupo ADAM de las protenas integrales de membrana del tipo I, las cuales son metaloproteinasas miembros de la subfamilia de las reprolisinas. Se piensa que las metaloproteinasas se sintetizan en las glndulas venenosas de las vboras como zimgenos que despus son procesados para producir las formas activas de las toxinas (Kini y Evans, 1992; Hite y col., 1994; Paine y col., 1994; Tsai y col., 1994; Bjarnason y Fox, 1995; Shimokawa y col.,

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1996; Kini y col., 1997). Kini y col., (1997) han sugerido un modelo estructural del precursor de las toxinas que consiste en la presencia de regiones ricas en lectinacistena-regin activadora-sitio cataltico de la metaloproteinasa- desintegrinacistena. Adems, tambin han sugerido que este precursor se procesa postraduccionalmente, dando lugar a las diferentes actividades de las metaloproteinasas de venenos de vbora. Esta idea es tambin apoyada por otros estudios (para una revisin del tema, vase Jia y col., 1996). Las diferencias en las conformaciones entre las metaloproteinasas tambin determinan, en forma significativa, su funcin, la cual es tambin influenciada por el tamao de las proteinasas maduras. Las metaloproteinasas hemorrgicas, que contienen dominios ricos en cistena y dominios similares a las desintegrinas, son significativamente ms potentes que las toxinas que solamente contienen el dominio de las metaloproteinasas (Jia y col., 1997). En nuestros estudios hemos encontrado que M4, una metaloproteinasa del tipo P-I que se encuentra en el veneno de C. m. molossus, puede disolver los cogulos de fibrina pero no causa hemorragia ni provoca la inactivacin del sistema del complemento (Rael y col. 1992). Sin embargo, las metaloproteinasas M5, M6 y M7, tambin pertenecientes al grupo P-I, son toxinas hemorrgicas muy potentes (Tabla 1) (Chen y Rael, 1997 y resultados nuestros no publicados). Nuestras investigaciones sobre la secuencia del cDNA y DNA genmico de la toxina de C. m. molossus han demostrado que las secuencias requeridas para la formacin del complejo metaloproteinasas-integrina, tienen el mismo arreglo que el sugerido por otros autores para venenos de otras especies de vboras de cascabel (Kini y Evans, 1992; Hite y col., 1994; Paine y col., 1994; Tsai y col., 1994; Bjarnason y Fox,

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1995; Shimokawa y col., 1996; Kini y col., 1997). Tambin se han producido metaloproteinasas venenosas a partir de DNA recombinante (Loayza y col., 1994; Shimokawa y col., 1996; Jia y col., 1997). Las metaloproteinasas hemorrgicas de los venenos de vboras de cascabel son un grupo de protenas potencialmente muy importante en la estrategia del diseo de frmacos contra los vasos sanguneos de los tumores. Su capacidad de destruir proteolticamente las membranas basales de los capilares, de activar el sistema del complemento y de causar la formacin de cogulos, puede ser usada en el tratamiento de los tumores si las toxinas se ligan a los pptidos RGD o NGR, discutidos previamente en este captulo, para dirigirlas hasta los vasos sanguneos de los tumores. Por tanto, el enfoque que proponemos consiste en ligar las metaloproteinasas de venenos de vboras a los pptidos RGD y NGR e investigar sus actividades contra los tumores cancerosos. Los pptidos sintticos que llevan la secuencia RGD-4C (CDCRGDCFC) y la secuencia NGR (CNGRCVSGCAGRC) (Arap y col. 1998) se pueden usar como agentes guiadores. La actividad de estos compuestos proteicos puede ser probada contra los tumores humanos generados en ratones SCID. Posteriormente se pueden producir toxinas recombinantes y comparar su efecto con el de los complejos toxina-RGD o toxina-NGR.

5. POSIBLES PROBLEMAS Y CONCLUSIONES

Las diferentes metaloproteinasas que se encuentran en los venenos de vboras tienen diferentes actividades, como se describi previamente, a pesar de que

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comparten ciertas similitudes en secuencia y en la organizacin de sus dominios. Cambios pequeos en ciertos aminocidos de posiciones importantes pueden tener un gran impacto sobre su actividad; por lo tanto, es importante caracterizar la estructura de las metaloproteinas para entender la relacin entre sus actividades biolgicas y su estructura. La estructura de algunas metaloproteinasas venenosas se ha dilucidado ya por estudios cristalogrficos con rayos X (Gomis-Rth y col., 1993). Las metaloproteinasas de veneno de vboras son inmunognicas y por lo tanto, pueden causar una reaccin inmunolgica en los humanos. El entender la estructura de estas enzimas permitir tener una mejor idea de cul es la estructura mnima necesaria para generar el efecto deseado pero con un efecto mnimo en el sistema inmunolgico. Una vez que se conozca bien la estructura de estas metaloproteinasas, ser posible comenzar a generar protenas de fusin recombinantes, que no tengan actividad inmunognica capaces de ser dirigidas contra los vasos sanguneos de los tumores y promover la formacin de cogulos en el sistema vascular del tumor o bien, la destruccin de los vasos sanguneos que lo irrigan.

AGRADECIMIENTOS

Queremos reconocer y agradecer la ayuda de Cesar Moreno con las figuras que se encuentran en este captulo. Tambin queremos reconocer el apoyo de los donativos NIH-NGMS 5G12RR08124 y NIH-NGMS SO6GM08012, del National Institute of Health, USA.

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ABREVIATURAS VEGF RGD NGR TF Factor de crecimiento vascular endotelial. Arg-Gli-Asp. Asn-Gli-Arg. Factor tejido humano.

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PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Blancos posibles para el ataque de las metaloproteinasas contra los vasos sanguneos de un tumor.

Fig. 2. La construccin y recombinacin de anticuerpos monoclonales.

Fig. 3. La construccin de una genoteca que expresa pptidos en la superficie de un fago (phage display).

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Tabla 1. Caractersticas de las metaloproteinasas de la vbora de cascabel Crotalus molossus molossus.

Actividad Proteinasa M1 M2 M4 M5 M6 PM (Da) 26,000 26,500 27,000 25,000 26,000 pI 3.6 4.4 9.6 7.0 7.6 Fibrinoltica + + + + + Fibrinogenoltica* Complemento + + + + Hemorrgica + + + +

* son dos de los pptidos del fibringeno. Los pptidos y fueron digeridos por las metaloproteinasas, pero el pptido fue resistente a la hidrlisis por las enzimas.

Captulo 16 Identificacin de individuos mediante el anlisis del DNA Jaime Berumen Campos1, Eligia Jurez Torres1 y Roco Gmez Ortega1.
1

Departamento de Biologa Molecular, Escuela Militar de Graduados de Sanidad/Escuela Mdico Militar, Universidad del Ejrcito y Fuerza Area, Mxico, D.F.

Email: lamili@mail.internet.com.mx PALABRAS CLAVE: DNA recombinante, identificacin de individuos, huella gentica, marcadores.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivos del captulo. 3. Estado actual del arte. 4. Bases genticas para la identificacin de personas con la huella digital del DNA. 5. Estrategia para la identificacin de individuos y mtodos de DNA recombinante. 6. Probabilidad de coincidencia al azar (PCA) en la huella digital de DNA entre dos individuos no relacionados genticamente. 7. Gentica de poblacin de marcadores genticos utilizados en la identificacin de individuos. 8. Ejemplos de casos reales realizados en Mxico. 8.1 Un caso de paternidad resuelto con marcadores minisatlites. 8.2 Un caso de paternidad resuelto con loci de variacin de secuencia, minisatlites y microsatlites. 8.3 La madre no sabe quin es el padre de su hijo en gestacin. 8.4 Violacin resuelta con microsatlites y marcadores para determinar el sexo. 8.5 Asesinato resuelto con marcadores de variacin de secuencia y macrosatlites. 9. Conclusiones.

Agradecimientos. Abreviaturas. Bibliografa.

1. INTRODUCCIN

La utilizacin de la tecnologa del DNA recombinante en la identificacin de individuos en medicina forense y en el parentesco biolgico es una de las aplicaciones ms exitosas y espectaculares de esta tecnologa. Por medio del anlisis del DNA se identifican individuos en forma rutinaria en los pases desarrollados y cada vez ms se hace tambin en los pases en vas de desarrollo. Las pruebas de DNA se utilizan para identificar cadveres, criminales que han modificado su fenotipo por medio de la ciruga plstica, individuos involucrados en delitos de violacin, crmenes y asaltos, as como en personas en casos de disputas de paternidad u otros problemas de consanguinidad, en los que se desea conocer con certeza la relacin biolgica entre dos individuos. La especificidad de esta tecnologa, que en conjunto se le conoce como Huella Digital de DNA (DNA fingerprinting en ingls), ha sido la clave de su xito. Otros factores que han favorecido la aplicacin de la tecnologa del DNA son el hecho de que cualquier tejido puede ser til para el anlisis del material gentico, la posibilidad de usar muestras pequeas, la facilidad de replicar el DNA millones de veces en la mesa del laboratorio y la estabilidad del DNA.

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

i)

Analizar los principios bsicos de gentica en los que se basan las pruebas de DNA para identificar individuos.

ii)

Analizar las tcnicas de DNA recombinante que se utilizan en los estudios de DNA para identificar individuos.

iii)

Analizar la importancia de los estudios de gentica de poblacin para la aplicacin e interpretacin de la huella digital de DNA.

iv)

Analizar algunos casos reales en los que se ha aplicado la huella digital de DNA para identificar individuos en Mxico.

3. ESTADO ACTUAL DEL ARTE

La aplicacin de la tecnologa del DNA recombinante en la identificacin de individuos se basa en los avances de las tcnicas de la biologa molecular, el descubrimiento de marcadores genticos muy variables en las poblaciones humanas y en el desarrollo de sistemas muy sensibles de anlisis del material gentico. Se basa tambin en las diferencias que existen en el DNA de cada ser humano, las que, en conjunto hacen nico a cada individuo. Actualmente existen tres tipos de marcadores genticos que se utilizan para identificar individuos, los marcadores de variacin de secuencia, los minisatlites y los microsatlites. Estos dos ltimos permiten analizar en un gel de electroforesis, o en una placa de rayos X, aspectos de la estructura del DNA de una persona en forma de bandas paralelas, similar a los cdigos de barras que identifican a los productos en los supermercados. Los minisatlites son los fragmentos de DNA ms polimrficos y fueron los primeros que se utilizaron cuando se desarroll esta tecnologa. Sin embargo, son poco tiles en muestras pequeas o muy degradadas y se analizan mediante el mtodo de Southern blot genmico, el

cual es laborioso y poco sensible. Aunque los microsatlites son menos polimrficos, existe una gran cantidad de ellos en el genoma humano y se pueden usar en cantidades pequeas an cuando la muestra est muy degradada, por lo que actualmente se utilizan en la mayora de los casos de identificacin de individuos. Adems, tienen la ventaja de que se pueden amplificar mediante la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), lo que ha permitido que sean de utilidad para la identificacin en muestras pequeas de DNA (Cynthia y col., 1996). Durante los primeros aos del desarrollo de esta tecnologa, en los sistemas de deteccin de DNA se utilizaban marcadores radiactivos, lo que dificult su utilizacin en una forma ms amplia. Actualmente existen mtodos colorimtricos (Lins y col., 1996; Bassam y col., 1991) o fluorescentes (Fregeau y Fourney, 1993; Holgersson y col., 1994) para el marcaje y deteccin de los cidos nucleicos, lo que ha facilitado su utilizacin en laboratorios clnicos y privados. Adems, en los ltimos aos se han desarrollado analizadores automticos de DNA que, en conjunto con los mtodos de deteccin fluorescentes, han permitido acortar el tiempo para el desarrollo de la prueba y la automatizacin de la misma (Kimpton y col., 1994; Schumm y col., 1997). Actualmente, cuando se utiliza un nmero apropiado de marcadores genticos y la prueba de DNA se realiza e interpreta apropiadamente, la probabilidad de error en la identificacin de individuos es extremadamente baja.

4. BASES GENTICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE PERSONAS CON LA HUELLA DIGITAL DEL DNA

Cada ser humano tiene un fenotipo o apariencia fsica caracterstica, porque posee una informacin gentica nica. Los gemelos idnticos son la excepcin a esta regla, los cuales poseen el mismo genotipo o material gentico. Todas las clulas de un individuo, ya sean de la

raz del pelo, leucocitos, espermatozoides, piel, hueso, etc., tienen la misma informacin gentica, incluso la informacin necesaria para codificar potencialmente el cuerpo humano completo. Estos dos principios, el de la individualidad gentica de cada persona y el que todas las clulas de un mismo individuo posean la misma informacin gentica, son la base para los estudios de la huella digital de DNA (Lewin, 2000). La individualidad gentica de un individuo est definida por la informacin gentica que hereda cada individuo de sus padres. El material gentico est contenido en los 46 cromosomas (23 pares homlogos) del ncleo celular y en el DNA mitocondrial. En la fertilizacin, el vulo y el espermatozoide, que contienen slo 23 cromosomas diferentes, se combinan para dar una clula con 23 pares de cromosomas. As, una copia de cada par de cromosomas es derivada del padre y la otra de la madre. Ambas copias de cada par de cromosomas contienen la misma informacin gentica con pequeas variaciones. El DNA mitocondrial, slo es heredado por la madre, por lo que todos los hijos de una misma madre tienen la misma informacin gentica en el DNA mitocondrial. Un cromosoma est constituido por una molcula muy grande de DNA unida a protenas y contiene alrededor de 2000 genes. El DNA est formado por dos largas cadenas de 4 diferentes nucletidos, que pueden ser de adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T), los cuales se repiten una y otra vez en secuencias muy variables a lo largo de las cadenas. Estas dos cadenas de nucletidos estn unidas entre s por uniones dbiles (puentes de hidrgeno) y estn enrolladas en forma de hlice, parecido a una escalera de caracol. Los genes son fragmentos de DNA [1200 pares de bases (pb) en promedio] que se encuentran a lo largo de los cromosomas y la mayora codifican la informacin para las protenas (algunos codifican para la sntesis de RNA ribosomal y de transferencia). Las protenas forman parte de todas las estructuras celulares y controlan las funciones de las clulas y del cuerpo humano en conjunto. El DNA humano est compuesto

de 6 x 109 pares de nucletidos y contiene alrededor de 30,000 genes diferentes. Cada gen se diferencia de los otros por el orden de la secuencia de sus nucletidos (Lewin, 2000). En las clulas eucariticas (clulas con su material gentico protegido por una membrana), slo el 1-5 % del DNA codifica para protenas o constituye los genes, el resto, son secuencias que no codifican. El 30% del genoma humano que no codifica est compuesto por secuencias repetidas de DNA y se divide en DNA repetido disperso, como las secuencias Alu, y DNA repetido en tndem (Lewin, 2000). Este ltimo consiste en repeticiones idnticas, una enseguida de las otras, de secuencias especficas de DNA de tamao variable e incluye al DNA satlite, las secuencias minisatlites y microsatlites. Los minisatlites y los microsatlites se encuentran en la eucromatina y son muy polimrficos en la poblacin. Los minisatlites, tambin conocidos como secuencias repetidas en tndem de nmero variable (VNTRs), se componen de secuencias repetidas de 10 a 30 pb y constituyen segmentos variables de DNA de 0.3 a 50 kilobases. Se ha estimado que existen ms de 5000 loci tipo VNTRs en el genoma humano, de los cuales slo se han caracterizado algunos de ellos (Jeffreys y col., 1985b, 1986, 1991; Wong y col., 1987; Nakamura y col., 1987). Los microsatlites, tambin denominados secuencias cortas de repeticin en tndem (STRs), son secuencias repetidas de 1 a 5 pb y forman fragmentos de alrededor de 100-300 pb (Charlesworth y col., 1994). Los microsatlites son una familia de secuencias de DNA que se encuentra esparcida en todo el genoma en cantidades de 50,000 a 100,000 (Bowcock y col., 1994; Dib y col., 1996; Edwards y col., 1991, 1992). La mayora de los marcadores microsatlites son de la clase dinucleotdica y recientemente se ha descrito un mapa gentico basado en ms de 5,000 microsatlites del tipo (AC/TG)n, con una heterocigocidad del 70% en los 23 pares de cromosomas (Dib y col., 1996). Los microsatlites de la clase tetranucleotdica son ms polimrficos y ms estables que los dinucletidos y estn

presentes cada 300 a 500 kilobases (kb) en el genoma humano (The UTAH Marker Development Group, 1995). Los genes y el DNA repetido estn localizados en posiciones particulares de los cromosomas llamadas locus. Muchos de ellos pueden existir en formas variables, a cada uno de ellos se les llama alelos. Por ejemplo, de un gen X pueden existir en diferentes individuos de una poblacin los alelos X1, X2, X3 y X4. Cada individuo puede tener slo dos de esos alelos, uno en el cromosoma paterno y otro en el materno. Si un individuo posee dos copias idnticas de un alelo particular, por ejemplo X1 y X1, se dice que es homocigoto en ese locus. Mientras que un individuo que tiene alelos diferentes en ese locus por ejemplo X1 y X4, se le llama heterocigoto. La mayora de los genes no varan grandemente en sus secuencias codificantes (exones) entre los individuos de una poblacin, con excepcin de los genes del complejo mayor de histocompatibilidad. Por ejemplo, el gen que codifica para la hormona insulina, no es muy variable ya que su funcin es muy importante en todos los individuos. El anlisis de identificacin a travs de la huella digital del DNA se basa en la caracterizacin de las regiones variables o polimrficas del material gentico de los individuos de una poblacin dada. Estas regiones hipervariables son de tres tipos, i) loci de variacin en la secuencia, ii) microsatlites y iii) minisatlites. En los loci de variacin de secuencia, el polimorfismo se presenta por el cambio de uno o varios nucletidos en la secuencia del DNA, generalmente en los exones y en las regiones de regulacin de la expresin gentica. En los loci minisatlites y microsatlites, el polimorfismo se presenta por la variacin en el nmero de repeticiones en tndem de las secuencias minisatlites o microsatlites (Fig. 1). Los loci de variacin de secuencia son poco polimrficos; en ellos slo vara un nucletido y a lo ms existen 4 alelos diferentes en la poblacin. Un ejemplo sencillo para un locus es el siguiente: alelo 1 (ATGCGTACGG), alelo 2 (ATTCGTACGG), alelo 3 (ATCCGTACGG) y alelo 4

(ATACGTACGG). El nucletido que vara aparece subrayado. En cambio, los loci que varan en el nmero de secuencias repetidas son muy polimrficos. Los loci microsatlites son medianamente polimrficos y pueden tener hasta 30 alelos y los loci tipo VNTRs son los ms polimrficos (Jeffreys y col., 1985a; Wong y col., 1987; Nakamura y col., 1987) y en ocasiones pueden tener hasta 5000 alelos diferentes (Berumen y col., 1994). Por ejemplo, en el locus MS1 la secuencia (GGCTGGGCATATGCTG) puede estar repetida 30 veces en un individuo, 40 veces en otro y 5000 veces en otro. La herencia de los alelos polimrficos se da de acuerdo con las leyes mendelianas de la gentica clsica. Por lo tanto, las frecuencias genotpicas o haplotpicas (conjunto allico de un individuo) pueden ser establecidas y abordadas estadsticamente de acuerdo con la frecuencia allica de una poblacin (Balazs y col., 1989; Chakraborty y Kidd, 1991; Cohen, 1990). Los marcadores genticos tiles en la identificacin de individuos deben tener un gran poder de discriminacin (PD) o capacidad de distinguir entre dos individuos (variacin genotpica). Entre ms alelos tenga un marcador gentico (mayor polimorfismo) y ms uniforme sea su distribucin entre la poblacin (mayor heterocigosidad), mayor ser su PD (Balazs y col., 1989; Chakraborty y Kidd, 1991; Cohen, 1990). Los loci de variacin de secuencia, microsatlites y minisatlites ms comnmente utilizados como marcadores genticos en los estudios de la huella digital del DNA se muestran en la Tabla 1.

5. ESTRATEGIA PARA LA IDENTIFICACIN DE INDIVIDUOS Y MTODOS DE DNA RECOMBINANTE

Las diferencias estructurales de los alelos de los locus polimrficos pueden ser detectadas por las tcnicas del DNA recombinante. El polimorfismo de los loci tipo VNTR puede ser

establecido combinando el uso de endonucleasas que corten el DNA en sitios fijos, por fuera de los VNTRs. Con el mtodo de hibridacin tipo Southern blot, se detecta el polimorfismo como una variacin en el tamao de los fragmentos de restriccin. A estos fragmentos se les llama RFLP (del ingls Restriction Fragment Length Polymorphism). El tamao de las bandas de DNA variar de acuerdo al nmero de copias en tndem de la secuencia minisatlite (Fig. 1 y 2; Wong y col., 1987; Jeffreys y col., 1991; Waye y Fourney, 1990). Sin embargo, algunos minisatlites con alelos pequeos menores de 3000 pb, como los del locus D1S80, se pueden detectar mediante la amplificacin del DNA por el mtodo de la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (del ingls Polymerase Chain Reaction), similar a los microsatlites (ver ms abajo). El polimorfismo de secuencia y de microsatlites puede ser establecido con el uso de la PCR, seguida de la reaccin de secuenciacin del DNA (Higuchi y col. 1988) o la tcnica de hibridacin en punto (Blake y col., 1992; Comey y col., 1993; Peterson y col., 2000). Los microsatlites tambin pueden detectarse en electroforesis en geles de poliacrilamida teidos con plata o usando marcadores fluorescentes (Fig. 1). La utilizacin de marcadores genticos de un tipo u otro depende de la cantidad y grado de conservacin del DNA extrado de las muestras biolgicas y del tipo de problema en estudio. Para el sistema de los minisatlites se requiere cuando menos 1 g de DNA de alto peso molecular, por lo que no se puede utilizar en muestras con poco DNA o con DNA degradado. Los marcadores minisatlites son tiles en casos de identificacin de cadveres recientes, de paternidad y en algunos casos de violaciones en donde sea factible recolectar suficiente muestra biolgica (0.1 g o ms de sangre, semen u otros tejidos) y se encuentre bien conservada. Sin embargo, en los casos donde hay poco material biolgico, como en los casos de crmenes, en los que se cuenta con una gota de sangre o un cabello, o en muestras antiguas mal conservadas, como es el caso de identificacin de cadveres de mucho tiempo de

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antigedad, donde el DNA est degradado, no se puede utilizar el sistema de los minisatlites y se utilizan marcadores microsatlites (Edwards y col., 1991; Alford y col., 1994; Ludes y Clisson, 2000; Schmerer y col., 2000) o de variacin de secuencia como el HLA DQa y el DNA mitocondrial (Comey y col., 1993; Orrego y King, 1990; Klitz y col., 2000; Peterson y col., 2000) (Fig. 1). El anlisis del DNA mitocondrial, en especial el de una regin polimrfica denominada "DLoop", tambin ha sido utilizado en la identificacin de individuos (Higuchi y col., 1988; Orrego y King, 1990). El polimorfismo en esta regin es principalmente de variacin de secuencia. Como es heredado slo por parte de la madre, se utiliza frecuentemente para demostrar el parentesco maternal entre individuos (hermanos, hermanas, primos, primas, tos, tas, etc. emparentadas con la madre (Orrego y King, 1990). Sin embargo, el polimorfismo del DNA mitocondrial es muy bajo, por ejemplo, en poblaciones caucsicas slo se pueden distinguir alrededor de 700 personas usando el DNA mitocondrial (Orrego y King, 1990). En el DNA mitocondrial existe tambin polimorfismo en los RFLP. Sin embargo, ste no es debido a variaciones en repeticiones en tndem de secuencias minisatlites ni microsatlites, sino ms bien a variaciones de secuencia que afectan los sitios de corte de las endonucleasas. Este polimorfismo es utilizado para identificar razas humanas, grupos tnicos y enfermedades genticas. Tambin se utiliza para estudios de evolucin y migracin de poblaciones (Wallace, 1994).

6. PROBABILIDAD DE COINCIDENCIA AL AZAR (PCA) EN LA HUELLA DIGITAL DE DNA ENTRE DOS INDIVIDUOS NO RELACIONADOS GENTICAMENTE

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Una vez que se ha realizado la prueba de la huella digital del DNA, existen tres resultados posibles: Primero, la prueba puede resultar no concluyente, ya sea porque el material fue insuficiente para la prueba o por problemas tcnicos de la metodologa. Segundo, cuando el patrn de la huella digital de DNA de la muestra problema no coincide con la del sospechoso, el resultado es excluyente, o sea que la evidencia biolgica no proviene del individuo sospechoso y puede ser declarada exculpatoria. Para estos dos casos, no se requiere disponer de una base de datos de gentica de poblacin de los marcadores utilizados (Balazs y col., 1989; Chakraborty y Kidd, 1991). El 60 a 65% de los casos de crmenes caen en una de estas dos categoras. La tercera alternativa, cuando coinciden los patrones genticos de la muestra de la evidencia del crimen y del sospechoso, el estudio es concluyente o sea que la evidencia biolgica proviene del individuo sospechoso. Sin embargo, en estos casos el sospechoso puede argumentar que la coincidencia ocurri al azar y que no est ligado a la muestra, o bien, que existen otros individuos con el mismo patrn gentico. Para estos casos se debe conocer la probabilidad de que dos individuos tomados al azar de la misma poblacin del sospechoso tengan el mismo patrn gentico. A esta probabilidad de coincidencia al azar se le llama PCA. Este es el problema principal y el punto de controversia en los casos legales y su resolucin requiere de la aplicacin de los mtodos de la gentica de poblaciones (Cohen, 1990; Chakraborty y Kidd, 1991). El grado de certeza de un mtodo de identificacin de individuos depende de la PCA, a menor PCA mayor ser la certeza. En los casos de crmenes y violaciones, el valor de la PCA para un marcador dado depende de la frecuencia allica de los dos alelos que conforman el genotipo y se mide con la frmula PCA = q2 para genotipos homocigotos y PCA = 2qp para genotipos heterocigotos, donde q y p son las frecuencias de los alelos q y p en la poblacin.

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En los casos para probar la paternidad, el clculo de la PCA incluye slo la frecuencia del alelo que coincide entre el padre supuesto y el hijo en estudio: PCA = c, donde c es la frecuencia del alelo que coincide (Li y Chakraborty, 1985; Gjertson y col., 1988). En los casos de paternidad en los que hay duda tanto de la madre como del padre, como sera el caso de la identificacin de un cadver irreconocible o un nio extraviado en la cuna, el clculo de la PCA incluye la frecuencia de ambos alelos y se utilizan las mismas frmulas que en los casos de crmenes y violaciones. El nmero de alelos de un marcador gentico y la frecuencia de cada uno de ellos se explora realizando un estudio de gentica de poblacin. La frecuencia allica depende del nmero y distribucin de los alelos en la poblacin. Entre menor sea la frecuencia de un alelo en la poblacin menor ser la PCA. La PCA global para un sistema de identificacin depende del nmero de marcadores utilizados y se calcula multiplicando la PCA de cada uno de los marcadores. Entre mayor sea el nmero de marcadores menor ser la PCA. Para un pas de 97 millones de habitantes, una PCA de 1 x 10-8 (0.00000001 o 1 en 100 millones) o menor, podra ser suficiente en los casos de identificacin. El grado de certeza no debe expresarse en forma de porcentaje porque resulta engaoso. Por ejemplo, decir que un sistema de identificacin tiene un 99.9% de certeza, que pareciera que es una certeza prcticamente de 100%, significa que 1 de cada 1000 individuos explorados al azar coinciden y en un pas de 97 millones, habra 97,000 individuos con un genotipo idntico. Por ello, la certeza, ms bien se debe expresar como probabilidad de error, la cual es igual a la PCA. Las pruebas basadas en marcadores con pocos alelos en la poblacin, tienen una PCA muy alta y pueden utilizarse con seguridad slo en los casos de exclusin; tal es el caso de la tipificacin sangunea con el sistema ABO y con los marcadores de DNA poco polimrficos como los incluidos en los sistemas llamados POLIMARKER" (LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y

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GC y HLA-DQalfa; Perkin-Elmer). En los casos de crmenes y violaciones, los casos de exclusin son muy obvios y son aceptados fcilmente, incluso con marcadores poco polimrficos; por ejemplo, si la muestra de sangre de la escena del crimen es tipo sanguneo O y la del sospechoso es AB, la sangre problema no puede ser del sospechoso. En los casos de paternidad es necesario que la exclusin est dada por varios marcadores (cuando menos 2 3, dependiendo de la frecuencia de mutacin), para minimizar los errores (una falsa exclusin) por efecto de la presencia de mutaciones en los loci explorados (Berumen y col., 1994). En el caso de que el tipo sanguneo o los marcadores de DNA mencionados coincidan entre la muestra biolgica de la escena del crimen y la del sospechoso, la inclusin no es obvia porque la variacin de los tipos sanguneos y los loci de DNA en la poblacin es pequea y podran coincidir slo por azar; en este caso es necesario utilizar marcadores minisatlites y/o microsatlites.

7. GENTICA DE POBLACIN DE MARCADORES GENTICOS UTILIZADOS EN LA IDENTIFICACIN DE INDIVIDUOS

Sin el clculo de la PCA, el anlisis del DNA para la identificacin de individuos en casos de inclusin, prcticamente no tiene ninguna validez. Es muy poco probable que las bases de datos de frecuencias allicas y genotpicas, as como los valores de PCA de los marcadores genticos de la huella digital de DNA encontrados en los grupos de poblaciones anglosajonas, sean similares en la poblacin mexicana. En el peor de los casos, se deben considerar las frecuencias allicas encontradas en poblacin hispana de Estados Unidos (Tablas 2 y 3). Aunque esta poblacin hispana, seleccionada por el apellido, incluye mexicanos, espaoles, cubanos, sudamericanos, centroamericanos, etc., la informacin obtenida de ella es la ms

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cercana que podemos utilizar, al menos para individuos mestizos. Para que esta metodologa se pueda interpretar apropiadamente en casos de inclusin en Mxico, es necesario tener informacin de la PCA en diversos grupos de la poblacin mexicana: blancos, mestizos e indgenas. En las poblaciones indgenas del pas, por ejemplo, es comn el matrimonio entre parientes cercanos, incluso entre hermanos y en general entre miembros de la misma comunidad, con poco intercambio con otras comunidades y por lo tanto es comn una frecuencia alta de consanguinidad. En estas poblaciones la diversidad gentica es mucho ms baja y la homocigocidad es mucho ms alta que en grandes poblaciones sin consanguinidad, y es probable que se encuentren pocas variantes genticas en la mayora de las regiones cromosmicas. Para los sistemas de variacin de secuencia (LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC y HLADQalfa) que son poco polimrficos ya que presentan de 2 a 6 alelos cada uno (Tabla 1), as como para el locus D1S80 que contiene 27 alelos (Tablas 1 y 3), la frecuencia allica encontrada en poblacin mestiza de Mxico es muy parecida a la encontrada en grupos hispanos en Estados Unidos (Berumen y col., 2001a). Sin embargo, se observan algunas diferencias, por ejemplo, las frecuencias de los alelos C del locus HBGG y 4 del locus DQA1 son menores en la poblacin mestiza mexicana que en los hispanos de Estados Unidos (p<0.05) (Tabla 2). Estos sistemas son muy utilizados en casos de crmenes, violaciones e identificacin de cadveres; sin embargo, son poco polimrficos y su PCA global no es muy baja. El nmero de genotipos diferentes y por lo tanto individuos genticamente diferentes, que se puede distinguir con un marcador gentico se calcula con la siguiente frmula: GD=[(a2 a)/2 + a], donde GD son los genotipos diferentes y a es el nmero de alelos diferentes en la poblacin. El nmero de genotipos diferentes que se pueden diferenciar con cada uno de los

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marcadores arriba mencionados se presenta en la Tabla 1, y el nmero total de genotipos diferentes que se puede obtener con ambos sistemas se obtiene multiplicando el valor de GD de cada uno de ellos. As, GDT =GDLDLR x GDGYPA x GDHBGG x GDD7S8 x GDGC x GDHLA-DQalfa x GDD1S80 = 8,287,272 genotipos diferentes. Este sistema es medianamente polimrfico, sin embargo no alcanza para diferenciar el nmero de habitantes en Mxico. Si los genotipos estuvieran distribuidos uniformemente en la poblacin, con estos sistemas, dos individuos coincidiran al azar una vez cada 8,287,272 individuos explorados. Sin embargo, algunos genotipos son mucho ms frecuentes que otros y en los casos de identificacin, es necesario considerar las frecuencias de los genotipos encontrados en cada caso. En las poblaciones que permanecen en equilibrio gentico de acuerdo a la ley de Hardy-Weinberg, la frecuencia de los genotipos homocigotos es igual al cuadrado de la frecuencia allica (q2 o p2), y la de los genotipos heterocigotos es igual a 2 veces el producto de la frecuencia de ambos alelos (2qp). Por ejemplo, con el locus D1S80 se pueden distinguir 378 individuos ( Tabla 1); sin embargo, los alelos 18 y 24 son muy frecuentes de 0.28 y 0.3, respectivamente, en la poblacin mestiza (Tabla 3), por lo que el genotipo D1S80 se presenta en el 16.8% de la poblacin (2 x 0.28 x 0.3 = 0.168), lo cual indica que uno de cada 6 individuos explorados tienen este genotipo y coincidiran al azar en lugar de uno cada 378 individuos, si los genotipos estuvieran distribuidos uniformemente en la poblacin. En el otro extremo, la frecuencia del genotipo D1S80 en la poblacin mestiza es slo de 0.00005, por lo que dos individuos coincidiran al azar en 1 de cada 20,000 individuos explorados. Los marcadores minisatlites son los ms polimrficos y presentan ms de 100 alelos diferentes (algunos loci pudieran tener potencialmente hasta 5000 alelos) (Tabla 1), por lo que se pueden distinguir, por ejemplo, con los loci monolocus ms de 5000 genotipos diferentes. Sin embargo, en los geles de electroforesis difcilmente se distinguen ms de 200 bandas

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diferentes, por lo que la asignacin de cada alelo individualmente es difcil. Con los sistemas multilocus, se calcula la frecuencia allica media (q) y la PCA media con la formula PCA = q2(2q) ( Wong y col., 1987). En poblacin anglosajona, la PCA de marcadores genticos minisatlites multilocus es aproximadamente de 1x10-11 (Jeffreys y col., 1991) y la de minisatlites monolocus vara entre 1x10-4 y 1x10-5 (Wong y col., 1987), dependiendo del marcador utilizado. Combinando varios marcadores monolocus, por ejemplo tres de ellos, se puede alcanzar una PCA por abajo de 1x10-11. En un estudio previo realizado en la ciudad de Mxico con 6 sondas monolocus (MS43, g3, MS1, MS31, pH30 y D14S13) en una muestra de poblacin mestiza seleccionada al azar, la PCA de cada uno de los marcadores vari de 1 x 10-4 a 1 x 10-5 (Tabla 4), la PCA global de los primeros tres marcadores fue de 2.5 x 10-11 (Berumen y col., 1994) y de los 6 en conjunto fue de 4.1 x 10-21. La PCA encontrada en este estudio, con los tres marcadores monolocus iniciales, indica que este sistema de identificacin permite distinguir alrededor de 40,000 millones de individuos. En un pas de 97 millones, como es Mxico, la probabilidad de una falsa positividad es prcticamente nula. Los marcadores microsatlites son menos polimrficos que los minisatlites, pero mucho ms polimrficos que los marcadores de variacin de secuencia. Adems, tienen la gran ventaja de encontrarse en pequeos fragmentos de DNA (100-300 pb) y pueden ser amplificados con la tcnica de la PCR, lo que permite que se puedan utilizar para identificar muestras biolgicas pequeas, muy antiguas o degradadas. Los microsatlites tetranucletidos son los ms utilizados para fines forenses y problemas de paternidad. En Mxico hemos explorado la diversidad gentica de mas de 15 microsatlites tetranuceltidos (Berumen y col., 2001b) y 7 dinucletidos del cromosoma X (Berumen y col., 2001c). En la Tabla 5 se muestra la PCA calculada con los datos obtenidos en un estudio de gentica de poblacin en mestizos y mazahuas utilizando 9 microsatlites. La PCA promedio combinada fue de 5.6 x 10-17 en los

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mestizos y 2.1 x 10-15 en la poblacin mazahua. Estos clculos indican que para la mayora de los casos de identificacin es suficiente utilizar 9-10 marcadores microsatlites. Sin embargo, en los casos donde los alelos que coinciden son los ms frecuentes de cada loci, la PCA se eleva considerablemente, hasta 1 x 10-8 en ambas poblaciones. Esto indica que para obtener una PCA mxima, menor a 1 x 10-8 , es necesario utilizar ms marcadores microsatlites. Por otra parte, se observa claramente que la PCA en la poblacin mestiza es dos rdenes de magnitud menor que en la poblacin mazahua, lo cual concuerda con el hecho de que en las poblaciones indgenas existe un menor intrecruzamiento gentico con individuos de otras poblaciones.

8. EJEMPLOS DE CASOS REALES REALIZADOS EN MXICO

8.1 Un caso de paternidad resuelto con marcadores minisatlites

Se recibieron las muestras de sangre del padre (fallecido das antes), de la madre, de dos hijos conocidos de la pareja y de un tercero quien deca ser hijo del padre y reclamaba parte de la herencia. Como control experimental, se incluyeron la sangre del padre, la madre y de un hijo de dos familias conocidas. Se purific el DNA y se efectu el examen de la "huella digital de DNA" con sondas minisatlite, corriendo simultneamente en la electroforesis el DNA de los miembros de la familia 1 (F1), familia 2 (F2) y de los miembros del caso de paternidad, utilizando primero la sonda MS43A, luego la g3 y finalmente la MS1. En la Figura 2 se muestra el patrn de bandeo allico con la sonda g3. En las dos familias conocidas (F1 y F2) se observa claramente que el hijo comparte una banda con el padre y otra con la madre. En el caso de paternidad, los dos hijos conocidos de la familia en cuestin, comparten una banda con la

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madre y otra con el padre, mientras que el sujeto problema no comparti ninguna de las bandas con la madre ni con el padre. Igualmente sucedi con la sonda MS1 y MS43A (datos no mostrados). Con este estudio se excluy la posibilidad de que el sujeto en disputa fuera hijo del padre fallecido. La frecuencia de mutacin de estos loci es de 0.001 y la frecuencia de mutacin de los tres marcadores juntos sera de 1 x 10-9, por lo que sera improbable que fuera una falsa exclusin.

8.2 Un caso de paternidad resuelto con loci de variacin de secuencia, minisatlites y microsatlites

El estudio lo solicit el supuesto padre quien dudaba ser realmente el padre biolgico del nio X, porque no se pareca fsicamente a l. Los datos fenotpicos ms importantes eran que el nio tenia ojos azules y cabello lacio que no correspondan a la mam ni al supuesto padre. Adems, el tipo sanguneo del supuesto padre no corresponda al del nio: el supuesto padre era O, la mam era O y el nio era B. Se inici el estudio con 6 loci de variacin de secuencia (LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC y HLA-DQalfa ) y el D1S80. Como se muestra en la Tabla 6, un alelo de cada uno de los marcadores coincidieron entre el hijo y el supuesto padre; sin embargo, la PCA fue tan slo de 1 en 212 (0.48 x 0.5 x 0.63 x 0.63 x 0.47 x 0.38 x 0.28). Por tal motivo se exploraron 5 locus microsatlite (LPL, wWA, TH01, FESFPS y F13B), encontrndose que ninguno de los alelos coincidi entre el hijo y el supuesto padre, por lo que se excluy la paternidad. Este es un claro ejemplo en donde se demuestra que la utilizacin de los loci de variacin de secuencia (Polimarker de Perkin-Elmer) y el D1S80 no son suficientes para los estudios de paternidad.

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8.3 La madre no sabe quin es el padre de su hijo en gestacin

Una artista muy famosa se fue a Pars con su esposo. Su esposo se regres a Mxico y ella sigui en Pars con su amante. Cuando regres a Mxico, se di cuenta que estaba embarazada y no saba si el hijo que esperaba era del esposo o del amante. La angustia era mayor porque el amante era moreno y el esposo rubio, por lo que solicit se le realizara la prueba de DNA. En un laboratorio especializado se le realiz una amniosentesis al final del tercer mes de embarazo para tomar una pequea muestra de lquido amnitico, en el que se encuentran clulas de descamacin exclusivas del beb en formacin. Se tom una muestra de sangre de ella y de su esposo pero no pudo conseguir la sangre del amante, por lo que no fue incluido en el estudio inicial. Se utilizaron 14 microsatlites y se encontr que su esposo era el padre biolgico del producto en gestacin (datos no mostrados), con una PCA de 1x10-9. Sin embargo, al final de los 7 meses de embarazo el gineclogo le dijo que de acuerdo al ultrasonido el producto tena 2 semanas menos que el calculado con la fecha de la ltima menstruacin. El tiempo de gestacin coincida ms con una fecundacin ocurrida durante sus relaciones sexuales con el amante. Habl al laboratorio cuestionando el resultado de la prueba de DNA, a lo que se le contest que con todo gusto se poda repetir el estudio si persuada al amante para tomarle una muestra de sangre. Una vez que se tom la muestra de sangre se repiti el anlisis del DNA, corriendo al mismo tiempo en la electroforesis los marcadores amplificados del esposo, el producto en formacin, la madre y el amante (Fig. 3). En la figura 3, se observa claramente que las bandas del esposo coinciden con las del producto en gestacin, mientras que ninguna de las bandas de los 5 marcadores utilizados coinciden entre el amante y

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el producto en formacin, lo cual indica que el esposo es el padre biolgico del producto en formacin.

8.4 Violacin resuelta con microsatlites y marcadores para determinar el sexo

Dos individuos fueron acusados y detenidos porque una mujer violada los identific como los presuntos responsables. Sin embargo, los individuos afirmaron categricamente que ellos no fueron los violadores. El abogado de la defensa solicit al juez que se realizara la prueba de DNA para demostrar que los individuos detenidos no son los responsables del delito de violacin. Una vez que el juez acept que se realizara la prueba, se tom una muestra de sangre de cada uno de los individuos detenidos y se tomaron 4 manchas blanquecinoamarillentas de la pantaleta de la mujer violada, que haba permanecido en el juzgado para su custodia. La mujer que fue violada no asisti en tres ocasiones, por lo que no se le pudo tomar una muestra de sangre. Una vez que se extrajo el DNA de las muestras en estudio, se investig el sexo de los individuos a partir del DNA obtenido de las 4 manchas de la pantaleta, utilizando el marcador amelogenina que identifica un fragmento del cromosoma Y (212 pb) y un fragmento del cromosoma X (218 pb) y el marcador SRY que identifica un fragmento del cromosoma Y (409 pb), ambos explorados con la tcnica de la PCR. En tres de las manchas se detect DNA de origen masculino (carriles P1, P2 y P3 en la Fig. 4, panel A) y en una de ellas DNA de origen femenino (carril P4 de la Fig. 4, panel A). Esta ltima muestra muy probablemente contena clulas de la propia mujer violada. Posteriormente, se utilizaron 5 marcadores microsatlites para identificar el patrn gentico y comparar el de las manchas con el de los dos individuos detenidos. Con el primer marcador analizado (TH01) se observa claramente que el patrn

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gentico de los dos individuos no corresponde a ninguna de las tres manchas de origen masculino (Fig. 4, panel B). Con slo este marcador se puede excluir contundentemente a esos dos individuos detenidos. El resto de los marcadores genticos tampoco coincidi entre las manchas y los individuos detenidos. Con los marcadores TPOX, D16S539 y D13S317 se observa claramente que las manchas P1 y P3 provienen de un individuo diferente a la mancha P2, y con el marcador D13S317 se demuestra claramente que el DNA de la mancha 4 es diferente al de las manchas P1, P2 y P3. Con este estudio se demuestra contundentemente que la pantaleta de la mujer violada contiene algn fluido biolgico, probablemente semen, de dos individuos varones, diferentes a los individuos detenidos.

8.5 Asesinato resuelto con marcadores de variacin de secuencia y microsatlites

Se detuvo a un individuo acusado de asesinar a su esposa, lo cual l niega rotundamente y afirma que su esposa se suicid. Ambos individuos proceden de familias muy ricas y al morir la esposa, automticamente el esposo hereda la fortuna de la esposa, lo que lo hace muy sospechoso del asesinato. Parte de las pruebas que ofrece la parte acusadora es la presencia de una blusa del cadver con dos manchas de sangre, una en la parte frontal y otra en la parte posterior. De acuerdo a la posicin de las manchas de sangre, en el peritaje de balstica se concluye que el disparo fue efectuado a una distancia mayor que si la esposa se hubiera suicidado, en cuyo caso la distancia del disparo hubiera sido a una distancia muy cercana al cuerpo de la occisa. La defensa argumenta que la blusa fue sembrada y que no pertenece a la occisa y solicitan se realice una prueba de DNA para comparar el patrn gentico de las manchas de sangre con el de la occisa. Una vez que los abogados realizaron los trmites correspondientes, se recibi en el laboratorio un fragmento de cada una de las manchas de

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sangre (0.25 cm2 aproximadamente) y un fragmento de rin fijado en formol y en estado franco de descomposicin, tomado del cadver una vez que se realiz la exhumacin. Para el anlisis de las muestras se utilizaron 5 marcadores de variacin de secuencia y 2 microsatlites. Uno de los marcadores de variacin de secuencia (LDLH, datos no mostrados) y los dos microsatlites (Fig. 5) no coinciden entre las manchas de sangre y la muestra de rin. El patrn gentico de los 7 marcadores es idntico entre las dos muestras de sangre. Los resultados de estos experimentos indican claramente que la sangre de las dos manchas de la blusa no correspondieron a la occisa.

9. CONCLUSIONES

i)

Actualmente existe la tecnologa de DNA recombinante necesaria para identificar individuos genticamente en casos de violaciones, crmenes, cadveres y casos de paternidad con una exactitud absoluta.

ii)

Existen tres tipos de marcadores genticos para identificar individuos: a) de variacin de secuencia, b) microsatlites y c) minisatlites.

iii)

Para utilizar esta tecnologa en Mxico es necesario conocer la diversidad de los marcadores genticos utilizados para la identificacin de individuos, en las diferentes poblaciones del pas. Estos datos permiten calcular la probabilidad de que dos individuos no relacionados genticamente coincidan al azar (PCA).

iv)

En los casos de inclusin se deben utilizar el nmero suficiente de marcadores genticos para tener una PCA menor a 1 x 10-8 (1 en 100 millones), con los cuales difcilmente en un pas de 97 millones de individuos coincidiran genticamente dos individuos.

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v)

La exclusin, en los casos de violaciones y crmenes, es absoluta con un slo marcador que no coincida entre el individuo sospechoso y la evidencia biolgica. En los casos de paternidad, para excluir al supuesto padre se requiere que cuando menos tres marcadores no coincidan entre l y el hijo en estudio. Como la frecuencia de mutacin de estos marcadores es de aproximadamente 1 x 10-3, la probabilidad de que los tres marcadores que no coinciden sean mutaciones generadas en una misma clula germinal es muy baja (1 x 10-9 ).

vi)

La direccin, diseo e interpretacin de los estudios de identificacin de individuos mediante el anlisis del DNA deben ser llevados a cabo por personal con la formacin acadmica de doctorado y amplia experiencia en el rea de la gentica molecular. La interpretacin de los resultados de la prueba de DNA debe basarse slo en los datos experimentales y los clculos estadsticos obtenidos a partir de las bases de datos de gentica de poblacin.

AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue financiado por la Secretara de la Defensa Nacional y el CONACYT, donativo L0036 - M.

ABREVIATURAS

GD PCA PCR PD

Genotipos diferentes. Probabilidad de coincidencia al azar. Reaccin en cadena de la polimerasa. Poder de discriminacin.

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RFLP STRs VNTRs

Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restriccin. Secuencias cortas de repeticin. Secuencias repetidas en tndem de nmero variable.

BIBLIOGRAFA

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Tabla 1. Marcadores genticos utilizados en la huella digital de DNA. LOCUS TAMAO (pb) VARIACIN DE SECUENCIA: PCR/HIBRIDACIN DQA1 6 239 - 242 LDLR 19 214 GYPA 4 190 HBGG 11 172 D7S8 7 151 GC 4 138 MICROSATLITES: PCR/ELECTROFORESIS LPL 8p22 105 - 133 VWA 12p12-pter 139 - 167 F13A01 1q31-q32.1 169 - 185 TH01 11p15.5 179 - 203 FESFPS 15q25-qter 222 - 250 TPOX 2p23-2pter 224 - 252 HPRTB Xq26 259 - 303 F13B 6P24-25 283 - 331 CSF1PO 5q33.3-34 299 - 323 D3S1358 3p 114 - 142 D5S818 5q22-31 135 -171 D13S317 13q22-q31 165-197 D7S820 7q11.21 -22 215 -247 D16S539 16q24-qter 264 - 304 FGA 4p28 219 - 267 MINISATLITES: SOUTHERN BLOT/PCR D1S80 1p 369 - 801 APOB 2p24-p23 560-1070 YNZ22 17p 13.3 1100-2000 COL2A1 12q13.1 615-800 MS43A 12q24.3qter 3000-25000 G3 7q36-qter 1600-17700 MS1 1p33-p35 1600-45400 MS31 7p22-pter 600-20700 PH30 4q 1900-21900 D14S13 14 4500-22000 CROMOSOMA No. DE ALELOS 6 2 2 3 2 3 7 8 5 7 8 8 12 12 9 7 9 9 9 9 12 27 18 >10 >10 >100 >100 >100 >100 >100 >100 GENOTIPOS DIFERENTES 21 3 3 6 3 6 28 36 15 28 36 36 78 78 45 28 45 45 45 45 78 378 171 >55 >55 >5000 >5000 >5000 >5000 >5000 >5000

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Tabla 2. Frecuencias allicas de los marcadores genticos de variacin de secuencia. LOCUS LDLR ALELOS HISPANOS EN USAa MESTIZOS EN MEXICOb

A 0.48 0.48 B 0.52 0.52 GYPA A 0.61 0.62 B 0.39 0.38 A 0.39 0.36 HBGG B 0.56 0.63 Cc 0.05 0.01 D7S8 A 0.66 0.63 B 0.34 0.37 GC A 0.20 0.23 B 0.36 0.30 C 0.44 0.47 1.1 0.09 0.06 DQA1 1.2 0.09 0.1 1.3 0.04 0.1 2 0.08 0.07 3 0.30 0.38 c 4 0.41 0.31 a. Tomado del manual del kit Amplitype PM/DQA1 de Perkin-Elmer (n=200) b. n = 160 c. p < 0.05, chi cuadrada.

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Tabla 3. Frecuencia allica del marcador D1S80. ALELO HISPANOS DE USAa MESTIZOS EN MEXICOb 14 16 0.013 17 0.005 0.005 18 0.281 0.248 19 0.005 20 0.014 0.013 21 0.033 0.018 22 0.029 0.005 23 0.005 0.023 24 0.300 0.266 25 0.038 0.073 26 0.010 0.009 27 0.010 0.023 28 0.038 0.037 29 0.062 0.055 30 0.071 0.055 31 0.062 0.11 32 0.005 0.032 33 34 0.010 0.005 35 36 0.005 37 0.005 38 0.010 39 40 0.01 41 >41 0.005 a. Tomado del manual del kit Amplitype D1S80 de Perkin-Elmer (n=200) b. n=218.

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Tabla 4. Frecuencias allicas y PCA de marcadores minisatlites en poblacin mestiza mexicana. LOCUS MS43 ALELOSb (pb) FRECUENCIA ALLICA PCAa

10301 0.07 0.00079 8001 0.06 (1 en 1265) 20213 0.05 16888 0.05 14109 0.O4 G3 8602 0.05 0.00044 6557 0.04 (1 en 2272) 5674 0.04 16888 0.03 9849 0.03 MS1 12330 0.02 0.000071 6474 0.02 (1 en 14084) 14109 0.02 11497 0.02 9898 0.02 pH30 6241 0.039 0.00033 8798 0.031 (1 en 3030) 6381 0.023 5881 0.023 4202 0.023 MS31 6799 0.054 0.00064 6677 0.05 (1 en 1562) 8602 0.04 7442 0.035 8296 0.025 D14S13 8296 0.043 0.00079 17142 0.032 265) 8147 0.032 6479 0.032 6402 0.032 a. PCA (Probabilidad de coincidencia al azar) media = q2 (2 - q), donde q es la frecuencia allica media. La PCA global con los 6 marcadores fue de 4.1 x 10-21. b. Se muestran los 5 alelos ms frecuentes en la poblacin mestiza mexicana.

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Tabla 5. Probabilidad de coincidencia al azar (PCA) obtenidos de un estudio de gentica de poblacin con 9 microsatlites en una muestra de poblacin mestiza y mazahua mexicanas. PCA MESTIZOS LOCUS D3S1358 Vwa FGA TH01 TPOX CSF1PO D5S818 D13S317 D7S820 PCAcombinada Mnima 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0025 0.0001 2.3x10-37 Media 0.03 0.03 0.01 0.05 0.03 0.04 0.04 0.03 0.04 5.6x10-17 Mxima 0.24 0.21 0.05 0.19 0.23 0.21 0.25 0.09 0.19 1.3x10-8 Mnima 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0016 0.0001 0.0001 0.0016 0.0009 2.3x10-37 MAZAHUAS Media 0.07 0.05 0.01 0.05 0.05 0.04 0.05 0.03 0.04 2.1x10-15 Mxima 0.34 0.30 0.06 0.30 0.16 0.22 0.20 0.10 0.11 1.8x10-8

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Tabla 6. Genotipos encontrados en un caso de paternidad. LOCUS MADRE HIJO PADRE SUPUESTO

LDLR A,B A,A A,A GYPA A,B A,B A,B HBGG A,A A,B B,B D7S8 A,B A,A A,B GC A,B B,C B,C DQA1 3,4 3,3 3,3 D1S80 31,30 18,31 18,18 LPL 10,13 11,13 10,10 vWA 16,17 15,16 16,19 TH01 7,8 7,11 9,10 FESFPS 10,12 10,10 11,12 F13B 9,10 10,10 8,9 Los alelos que coinciden entre el hijo y el padre supuesto estn en negritas y subrayados.

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PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Esquema de los tipos y mtodos de deteccin de los marcadores genticos para identificar individuos. Para cada mtodo se comparan dos individuos diferentes. Para los minisatlites, se muestra el locus MS1 con 4 alelos diferentes (los cuales varan en el nmero de repeticiones en tndem). Los alelos se detectan con la tcnica de Southern blot utilizando una enzima de restriccin (ER) que corte en sitios fijos por fuera de la regin variable. Para los marcadores de variacin de secuencia se muestra el locus LDLR con 2 alelos (A y B; los cuales varan slo en una base). Los alelos se amplifican primero con el mtodo de PCR utilizando oligonucletidos biotinilados (flechas) y luego se identifican por hibridacin en punto reversa, utilizando la banda amplificada como sonda y oligonucletidos con la secuencia especfica unidos al filtro, como blancos. Para los microsatlites se muestra un locus dinucletido (AT/TA) con 4 alelos (5, 7, 9 y 12; los cuales varan en el nmero de repeticiones del dinucletido AT/TA). Los alelos se amplifican primero con la PCR utilizando oligonucletidos especficos (flechas) y luego se identifican mediante una electroforesis en un gel de poliacrilamida revelado con una tincin de plata.

Fig. 2. Un caso de disputa de paternidad resuelto con marcadores minisatlites. Southern blot con huella digital de DNA con la sonda g3 de los miembros de dos familias conocidas (F1 y F2) y de los de un caso de disputa de paternidad (Paternidad). P = padre, M = madre, H = hijo, H1 y H2 = hijos conocidos de la pareja y ? = individuo problema que reclama la paternidad.

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Fig. 3. Caso 1: la madre no sabe quin es el padre de su hijo en gestacin. Se muestra un experimento con microsatlites (TPOX, vWA, HPRTB y LPL) y el minisatlite D1S80 analizados en un gel de poliacrilamida y teidos con la tcnica de tincin de plata, utilizados en un caso para investigar la paternidad de un producto en gestacin. E = esposo, H = producto en gestacin, M = madre y A = amante.

Fig. 4. Caso 2: violacin resuelta con microsatlites y marcadores para determinar el sexo. Panel A, parte superior. Gel de agarosa teido con bromuro de etidio, usando el marcador SRY para determinar la presencia del cromosoma Y. Panel A, parte inferior. Gel de poliacrilamida teido con plata con el marcador amelogenina que detecta una banda de los cromosomas X y Y. Panel B. Patrn gentico de las muestras exploradas con 5 microsatlites analizados en un gel de poliacrilamida y teidos con plata. Los carriles H1 y H2 corresponden a la sangre obtenida de los dos individuos sospechosos, y los carriles P1, P2, P3 y P4 al material biolgico obtenido de 4 manchas amarillo-blanquecinas de la pantaleta de la mujer violada.

Fig. 5. Caso 3: asesinato resuelto con marcadores de variacin de secuencia y microsatlites. Muestras exploradas con 2 microsatlites analizados en un gel de poliacrilamida y teidos con plata. Los carriles S1 y S2 corresponden a las dos manchas de sangre obtenida de la blusa de la occisa y el carril R a una muestra de rin fijada en formol obtenido de los restos de la occisa despus de la exhumacin.

Captulo 17 Clulas Madre (Stem Cells), la nueva revolucin de la Biomedicina Leonel Barraza Pacheco1 y Guillermo Bojrquez Rangel2.
1

Coordinador del Centro de Estudios Biolgicos de la Universidad Autnoma de Ciudad Jurez (UACJ). Ciudad Jurez, Chih.

2.

Coordinador del Programa de Biomedicina Molecular (PIBIOM) Instituto Politcnico Nacional-UACJ. Ciudad Jurez, Chih.

Email: lbarraza@uacj.mx PALABRAS CLAVE: Clulas madre, stem cells, transplantes.

NDICE 1. Introduccin. 2. Objetivos del captulo. 3. Antecedentes: el hallazgo. 4. Las expectativas tericas. 5. Los avances reales. 6. La naciente industria. 7. Las implicaciones. 7.1 Implicaciones socioeconmicas. 7.2 Implicaciones ticas. 7.3 Implicaciones religiosas. 7.4 Implicaciones legales. 8. Conclusiones. Abreviaturas Bibliografa.

2 1. INTRODUCCIN Una nueva tecnologa de la biomedicina, llena de grandes promesas para tratar muchas enfermedades, ha aparecido en la frontera del conocimiento cientfico. Enfermedades reconocidas hasta hace apenas unos aos como irreversibles o incurables como el cncer, las enfermedades cardiovasculares y renales, la cirrosis heptica, las leucemias, la osteoporosis, la diabetes, la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, y muchas otras ms, presumiblemente pueden ser curadas con esta nueva revolucin biolgica basada en las llamadas Clulas Madre (Stem cells). Estas clulas pueden dividirse y permanecer indiferenciadas indefinidamente, por lo que algunos las califican como clulas eternas, y pueden ser inducidas para diferenciarse y convertirse en casi cualquier tipo de tejido. El desarrollo de la biotecnologa para lograr manipular a estas clulas tena ya varios aos de afanosa dedicacin por varios grupos cientficos del mundo. La idea generalizada entre estos grupos, de obtener clulas lo ms verstiles posibles para el desarrollo de diferentes cultivos celulares, les llev a profundizar en el conocimiento de la manipulacin gentica y mecnica de las clulas pluripotenciales del embrin durante las primeras fases de su desarrollo. Finalmente, la interaccin multidisciplinaria de investigadores coincidentes con la bioingeniera de tejidos produjo, en la ltima dcada, las tcnicas que influyeron grandemente en el hallazgo de estas clulas madre. Con las clulas madre, todo ser vivo construye sus rganos durante su desarrollo o los repara cuando son daados. Se sabe que un buen nmero de

3 estas clulas permanecen viables en las primeras etapas del recin nacido, luego tienden a disminuir en el adulto. Por ello, resulta de gran trascendencia el que ahora se puedan cultivar y mantener indiferenciadas in vitro de manera permanente y que luego puedan ser inducidas a voluntad para reproducir algn tejido especfico. Estas son las clulas madre de mltiples aplicaciones para mltiples males. Las clulas maestras que todo ser vivo posee y usa desde su fase embrionaria hasta su fase adulta, han representado un enigma para los cientficos, pues en ellas reside la capacidad del rejuvenecimiento de los tejidos. Con esta nueva tecnologa de las clulas madre, lo que est por venir en estos albores del nuevo milenio ser muy distinto de lo que hemos conocido; veremos algo verdaderamente revolucionario en la biomedicina del nuevo milenio (Fig.1).

2. OBJETIVOS DEL CAPTULO

La comunidad cientifica mexicana en estos momentos no est teniendo una participacin activa en los debates mundiales que sobre este tema se realizan principalmente en Europa y en los Estados Unidos. As mismo, la sociedad entera no se est preparando para sus propios debates, pues no est recibiendo tal informacin ni informndose de las decisiones que los pases avanzados y descubridores de esta tecnologa estn haciendo para regular el uso de las celulas madre. Mxico no ha establecido mecanismos regulatorios del uso de celulas madre todava, y puede ocurrir que se den usos controversiales y sin legislacin y/o sin criterios adecuados. Hay

4 diferencias de criterio y uso entre los distintos pases y muy pronto Mxico deber estar adoptando su propia postura. Para esto, se requiere que los diferentes grupos y sectores fortalezcan su conocimiento sobres estos aspectos. Los actuales debates mundiales se centran en aspectos ticos y cientficos, y esta tecnologa tarde o temprano influir en muchas de las decisiones teraputicas de nuestros sectores mdicos nos guste o no. Es por ello importante dar a conocer los aspectos ms sobresalientes de estos nuevos descubrimientos a la sociedad y comunidad cientfica de Mxico. El propsito de los autores es contribuir con literatura en espaol sobre este acalorado tema que es hoy, junto con el tema de la clonacion, el ms candente de la biomedicina en la comunidad cientfica mundial.

3. ANTECEDENTES: EL HALLAZGO

Fueron James A. Thomson de la Universidad de Winsconsin en Madison y John Gearhart de la Universidad de John Hopkins en Baltimore, quienes finalmente tuvieron xito al lograr cultivar y mantener indefinidamente las clulas madre, as como lograr con xito sus primeras manipulaciones. Ellos se haban dedicado a la tarea de aplicar el conocimiento de la biologa molecular y celular en bsqueda de soluciones a las enfermedades que daan irremediablemente a los tejidos. En noviembre de 1998, James A. Thomson y col. publicaron en la revista Science sus primeros resultados sobre el aislamiento de clulas madre a partir de un embrin fertilizado de fases tempranas, que ha iniciado su divisin pero que an no se une a las paredes del tero.

5 El logro de Thompson consisti en haber logrado la captura de las clulas en su estado indiferenciado y conservarlas in vitro en cultivos sucesivos (Thomson y col., 1998) (Fig. 2). A partir de ah, el mundo desarrollado de la medicina y la biologa se inici en la carrera por buscar maneras de hacer que estas clulas se convirtieran en tipos especficos que les permitieran una fuente ilimitada de clulas para transplantes, ensayos tisulares y muchos otros aspectos de la medicina y la biologa. Este movimiento biomdico tambin recibi un enorme impulso y expansin cuando en Baltimore en 1998, John D. Gearhart report que las clulas madre podan obtenerse a partir de tejidos de adultos (Gearhart, 1998; Solter y Gearhart, 1999). As, el nuevo milenio llega con un impresionante ejrcito de cientficos en busca del tejido donador universal (Fig. 3).

Desde hace mucho tiempo se sabe que un ser vivo inicia su desarrollo cuando un espermatozoide y un vulo se unen para formar un cigoto. Este cigoto es una clula que tiene la capacidad de generar un organismo completo, y debido a esto se dice que es una clula totipotencial. Durante las primeras etapas de desarrollo, el cigoto entra en una serie de divisiones continuas llamadas segmentacin, que generan nuevas clulas totipotenciales. Es decir, estas clulas al ser separadas generan un organismo completo. Al cabo de ciertas divisiones se formar una estructura llamada blastocisto que finalmente se implanta en el tero. El blastocisto es una estructura formada por una capa de clulas externas que, eventualmente darn lugar a la placenta, y por una masa de clulas internas. Esta masa de clulas depende de la externa para sobrevivir

6 pues, si se quita, las clulas internas no podran sobrevivir en el tero. Entonces se dice que estas clulas son pluripotenciales, lo cual significa que pueden generar muchos tipos de clulas, pero no las necesarias para la sobrevivencia fetal. Estas clulas pluripotenciales posteriormente se dividen y generan clulas capaces de formar tejidos especiales. Por ejemplo, clulas precursoras de la sangre, de la piel y de otros tejidos. Estas ltimas reciben el nombre de clulas multipotenciales. En resumen, las clulas totipotenciales pueden generar un organismo completo, las pluripotenciales pueden formar un nmero considerable de clulas especializadas y por lo tanto, tejidos y rganos, pero no son suficientes para conseguir un desarrollo fetal, mientras que las clulas multipotenciales slo pueden formar un nmero reducido de clulas generalmente relacionadas entre ellas. Cada tipo celular descrito, en su contexto, ha sido denominado clulas madre, progenitoras o troncales, respectivamente, y se caracterizan por ser clulas indiferenciadas que se pueden dividir de manera indefinida y que eventualmente darn lugar a clulas especializadas. Mucho tiempo atrs se saba de la generacin de diferentes clulas sanguneas (leucocitos, eritrocitos y plaquetas) a partir de clulas precursoras o clulas madres multipotenciales. Muy recientemente, algunos grupos de investigadores han logrado obtener clulas madre totipotenciales (obtenidas de embriones en etapas iniciales) y clulas madres pluripotenciales obtenidas de blastocistos. Este hecho ha abierto toda una gama de posibilidades para el tratamiento de mltiples padecimientos humanos con base en la terapia celular con clulas madre (Fig. 4).

7 4. LAS EXPECTATIVAS TERICAS

Aunque todo parece indicar que la reparacin y renovacin de los tejidos y rganos estn a la vuelta de la esquina, a medida que se avanza en este conocimiento, surgen nuevos conceptos, ideas, y cuestionamientos. Desde el descubrimiento de las clulas madre, muchas expectativas cientficas han emergido. En dos aos, desde 1998 en que fueron reportadas por primera vez, hasta mayo del 2000, slo en Internet se encontraron ms de 1,500 referencias cientficas relacionadas con ellas, la mayora referidas a intentos de identificar su comportamiento en animales o bajo diferentes condiciones de laboratorio, con la perspectiva de aplicarlas ms tarde en humanos. De ese acervo bibliogrfico se pueden desprender las siguientes expectativas tericas: i) Se podrn reponer amplias reas de la piel; porque sta, al igual que otros rganos, mantiene clulas madre en el estroma celular que le permite producir progenies que tienden a reproducir una clula destinada a la diferenciacin y otra a permanecer indiferenciada (Slack, 2000). ii) Se podrn reponer mdulas seas completas porque aunque ya se pueden hacer trasplantes de este rgano, an falta diferenciar a las clulas madre de cualquier origen en mdula sea. Hasta hoy, slo las clulas madre perifricas de origen hemtico son usadas rutinariamente en transplantes de mdula sea autloga y alognica (Fontes y Thomson, 1999).

8 iii) Se podrn reponer huesos y cartlagos. Las clulas madre obtenidas a partir de la mdula sea pueden convertirse en clulas seas, cartlagos, tendones, msculos y estromas medulares. Despus de aislar a las clulas se ha logrado ya diferenciarlas en colonias de adipocitos, de cartlago y de hueso (Pittenger, 1999). iv) Se podrn recuperar reas de tejido nervioso disfuncional o daado. En estos momentos ya se est logrando el cultivo de clulas neurales a partir de clulas madre que han sido localizadas en cerebros de ratas (McKay y col., 1998). Cuando estas clulas madre son depositadas en tejido nervioso vivo, se diferencian, migran y forman el tipo apropiado de clulas nerviosas especializadas e integran sus funciones al resto del tejido nervioso (Cromie, 1999). v) Se podrn producir partes especializadas de tejidos de corazn (Klug y col., 1996), pncreas y cartlagos para reparaciones. Se ha observado que estas clulas reaccionan diferencindose segn el medio fisiolgico en que se depositen, ya sea en un tejido vivo o en el medio de cultivo, produciendo tejido que luego puede insertarse en algn rgano vivo (Pedersen, 1999). Tal parece que muy pronto, la diabetes dejar de ser una amenaza de muerte y pasar a la lista de enfermedades comunes que podrn tratarse y curarse rutinariamente. Los transplantes de islotes de pncreas ya son exitosos (Shapiro y col., 2000). Ahora slo resta buscar maneras de hacer que las clulas madre se reproduzcan in vitro como clulas pancreticas productoras de insulina.

9 vi) Existe la posibilidad de hacer crecer rganos completos como hgados, riones, senos e intestinos. Esta es quiz la ms quimrica de las aseveraciones; sin embargo, los adelantos en los polmeros sintticos se acercan cada vez ms a las aplicaciones biolgicas. La idea consiste en hacer la transferencia apropiada de clulas en una matriz tridimensional al sitio deseado, donde la diferenciacin resulte como respuesta bioqumica dentro del individuo y el crecimiento sea dentro del organismo en lugar de dentro de un laboratorio (Mooney y Mikos, 1999).

5. LOS AVANCES REALES

A pesar de lo promisorio de los hallazgos, los cientficos consideran que todava falta el arribo de una joven generacin de expertos mundiales que habrn de dedicar una parte de sus vidas al avance de esta rea de la ciencia. Se estima que hay que esperar entre 8 y 10 aos para ver aplicaciones definitivas y exitosas en grandes sectores de la poblacin. A la fecha, los avances reales son relativos, porque aunque se especula mucho sobre el futuro, las clulas madre an no han salido del laboratorio debido a que no se ha rebasado la etapa de diferenciacin. La siguiente etapa debe ser de funcionalidad total de las clulas a las que se incorporan y de funcionalidad total de los tejidos y rganos que deben reproducirse a partir de ellas mismas. Los avances que mencionamos a continuacin son prcticas mdicas que se han venido experimentando y que lograron consolidarse como tcnicas especializadas con el avance de la gentica molecular. Por ejemplo, el trasplante de clulas madre, bajo la tcnica de hemo-aferesis, ya es rutinariamente utilizado a altas

10 dosis como tratamiento quimioteraputico del cncer. Las tablas 1 y 2 son un resumen de estas tcnicas. Asmismo, a travs de la tcnica teraputica denominada hemo-aferesis o plasma-aferesis, el uso de las clulas madre ya se indican para una serie de desrdenes fisiolgicos y metablicos en el mundo de la clnica mdica. Otra aplicacin donde la bioingeniera y la biologa celular se han enlazado, es la terapia de las clulas encapsuladas, que utiliza pequeos tubitos con poros que permiten el paso de nutrientes para que las clulas liberen los nutrientes o metabolitos deseados en el paciente enfermo y aquellas se mantengan viables por mucho tiempo (Lysaht y Aebischer, 1999).

6. LA NACIENTE INDUSTRIA

La compaa que financi a los equipos de James A. Thomson de la Universidad de Wisconsin en Madison y John Gearhart de la Universidad de John Hopkins en Baltimore, fue Geron Corporation of Menlo Park, California, quien por lo tanto tiene en su poder la licencia para desarrollar la tecnologa. Sin embargo, desde que esta compaa hizo sus registros, varias otras se lanzaron a desarrollar mtodos teraputicos patentables usando clulas madre adultas, es decir tomadas originalmente de individuos adultos. La sorpresa es que estas clulas madre adultas tambin parecen tener la plasticidad de las clulas madre provenientes de embriones, pero an no est claro si podrn equiparar el poder de diferenciacin que muestran las clulas de embrin (Gretchen, 2000). Estos hallazgos han creado una fiebre de oro en

11 la industria mdica. Por una parte, la Universidad de Wisconsin en Madison reclama su derecho a distribuir las clulas con propsitos acadmicos, pero tambin cre una compaa separada y dirigida por el descubridor Thomson (Marshall, 2000). La empresa Geron ha recibido ms de 100 solicitudes de clulas madre para la investigacin, 12 de ellas de compaas privadas. Todas las compaas interesadas debern alinearse cuando se aplique la legislacin que normar el uso de estas clulas (Tabla 3).

7. LAS IMPLICACIONES

El hecho de que estas clulas sean derivadas de un embrin, el cual debe obtenerse y destruirse para poder obtener las clulas madre, lo hace un tema muy sensible porque mientras que la fuente de las clulas madre sea a partir de embriones de animales de laboratorio, el problema es pequeo, pero si la fuente es humana, el problema se agiganta pues muchos grupos provida y similares se han pronunciado en contra. Seguramente veremos un debate mundial que durar varios aos entre los grupos provida, los abortistas y los grupos religiosos, sobre si las investigaciones de estas clulas madre son necesarias o no. Una buena dosis de elementos socioeconmicos, ticos, religiosos y legales se encuentran involucrados con esta nueva tecnologa.

7.1 Implicaciones socioeconmicas

Desde el punto de vista socioeconmico, Daniel Perry (2000) muestra un panorama

12 con cifras abrumadoras que favorecen el avance de estas investigaciones. Un total de 128 millones de personas en los Estados Unidos podran beneficiarse del desarrollo de investigaciones de las clulas madre. El costo en salud de la poblacin en los prximos 20 aos aumentar considerablemente pues se duplicar la poblacin de ms de 65 aos, y se cuadruplicar la de ms de 85 aos. La esperanza es que esta poblacin pudiese mantenerse activa y a bajo costo de salud. La pregunta es si la investigacin biomdica de estas clulas aportara alguna solucin sustantiva a esta carga. El nmero de personas afectadas actualmente por diferentes enfermedades en los Estados Unidos refleja la problemtica de salud que enfrentar la humanidad en las prximas dcadas. Aunque el debate sobre si los fondos federales deben aplicarse o no a esta tecnologa durar un buen tiempo, los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos ya han declarado su decisin de apoyar estas investigaciones. Es de esperarse un aumento significativo en el inters mundial sobre las clulas madre dada la influencia econmica de este pas sobre el resto del mundo. En consecuencia, Mxico tendr el arribo de esta tecnologa tarde o temprano. Por sus estadsticas, se puede apreciar que la situacin no es muy diferente a la de los Estados Unidos, aunque los problemas de salud tambin reclaman atencin en el pas. En la tabla 5 se muestran las principales causas de mortalidad en Mxico y se puede percibir que un gran sector de la poblacin est urgentemente necesitada de algn tipo de intervencin clnica donde esta tecnologa tendra una muy vasta aplicacin.

7.2 Implicaciones ticas

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Desde el punto de vista tico, se cuestiona el origen y el destino de las clulas. Si las clulas provienen de un animal de laboratorio, qu garanta se le ofrece al paciente de complicaciones de largo plazo? qu aspectos deber contener un convenio para tratar al paciente humano que se desea curar? Si las clulas provienen de un humano para ser aplicados en otro ser humano, existen derechos inalienables sobre la propiedad de las clulas que deben ser cuidadosamente regulados, aunque por otro lado, el problema se minimizara si se usan las mismas clulas del paciente en tratamiento. En el mes de noviembre de 1998, el entonces Presidente de los Estados Unidos, Bill Clinton, encarg a la Comisin Nacional Asesora en Biotica (National Bioethics Advisory Commission) la tarea de revisar con cuidado todos los aspectos relacionados con la investigacin de las clulas madre. Solicit balancear todas las consideraciones ticas y mdicas. El encargo fue en respuesta a tres reportes separados que le dieron una visin del gran futuro cientfico de las clulas madre, pero que indicaron serias controversias ticas si se comprometan fondos federales (NBAC, 1999). La comisin pronostic un largo debate nacional sobre los embriones humanos y el uso de material fetal cadavrico. Sin embargo, justific el financiamiento federal dado el mrito cientfico del tema, pero no toc el tema de la destruccin de embriones. Varios cientficos norteamericanos consideran que es inapropiado en estos momentos el uso de fondos federales para estas investigaciones (Young, 2000). En Europa, la situacin se ha tornado ms confusa, pues existe una pluralidad multicultural, multilingustica y multirreligiosa que hace difcil el establecimiento de un estndar del valor tico o moral

14 sobre el embrin, lo cual ha generado que las normas y conceptos ticos varen en cada pas europeo.

7.3 Implicaciones religiosas

15 Desde el punto de vista religioso, las investigaciones de las clulas madre estn encontrando una oposicin considerable. Son los grupos religiosos cristianos (catlicos y protestantes) quienes ms se oponen al uso del embrin humano para obtener las clulas madre. La crtica nace de la apreciacin de que se usa la sofisticacin tecnolgica para seguir cometiendo los mismos crmenes de eras pasadas pues se disputa la viabilidad de la vida y se cuestiona sobre el cmo justificar la destruccin de la vida con el pretexto del avance cientfico segn comenta el Dr. Kevin Fitzgerald, jesuita de la Escuela de Medicina de la Universidad de Loyola. A esto comenta el Dr. Lori Andrews de la Escuela de Leyes del Colegio Chicago-Kent: siempre que tomas una clula de un blastocisto, esa clula puede ser usada para crear un ser humano de manera que algunos grupos piensan que, al hacerla trasplantable, has desviado el rumbo para convertirlo en rin o algn otro tejido. Estas argumentaciones se estn dando no slo en los Estados Unidos sino tambin en Europa (Tucker, 1998). Uno de los problemas que se ven venir es que la tecnologa no sea tan promisoria en obtener clulas madre de fuentes alternas de tejido y la investigacin se centre en el uso de clulas provenientes de fetos abortados en las clnicas legales en busca de histocompatibilidades. Esto lleva a preguntarse si el sesgo que tome la tecnologa de las clulas madre en los prximos aos contribuir a elevar la produccin de abortos, producto de una complicidad moral entre abortistas y biotecnlogos.

7.4 Implicaciones legales

16 El hecho de que se puedan obtener tener clulas madre a partir de tejidos adultos ha suavizado en algo los aspectos ticos y legales. Pero el problema reside en que las clulas adultas tienden a tener ms errores genticos, causados por su normal exposicin a la vida diaria, que las clulas embrionarias y tambin tienden a proliferar menos. Adems, como no se ha logrado la diferenciacin en todos los tipos de tejidos a partir de clulas adultas y como stas se localizan en muy bajas cantidades, sigue existiendo un notable inters cientfico sobre las clulas embrionarias. En 1994 en Estados Unidos se prohibi la produccin de embriones humanos con fines exclusivamente de investigacin. El departamento de Salud y Servicios Humanos interpret errneamente que esta disposicin no se aplicaba a las clulas madre y, desde entonces, la presin social se centr en el debate de que cundo las clulas madre se reproducen normalmente, producen los rganos del infante y que eso debe protegerse. Por ello, la prohibicin se ampli para regular la investigacin de las clulas madre. Sin embargo, el gobierno por otro lado, est financiando algunas investigaciones en las que asume que no financia la destruccin del embrin. Esta doble posicin est llevando a ciertos grupos a plantear el asunto al Congreso de la Unin donde seguramente habr una larga lucha para proteger al infante en todos los estadios de su vida. Otro problema es que las clulas de origen humano pueden alojar fcilmente enfermedades peligrosas para el hombre. Esto ha hecho que la Administracin Federal de drogas de los Estados Unidos (FDA) intervenga con muy

17 muy serias reglamentaciones. La bioingeniera de tejidos a partir de clulas madre ya es una industria que continuamente rebasa estas reglas. Por ejemplo, la demanda para reponer cartlago en la rodilla y la rapidez con que se suceden los adelantos en esta rea ha rebasado a la FDA en su capacidad para dirimir a tiempo si la terapia es buena o no. En estos momentos, la FDA dice que cualquier terapia a partir de clulas humanas deber garantizar ciertas normas de seguridad de acuerdo con su nivel de riesgo de infeccin, adems de probar, cuando sea necesario, su efectividad teraputica.

8. CONCLUSIONES

El avance tecnolgico en esta importante rea no est consolidado, un da se amanece con un hallazgo que promete un nuevo adelanto y otro da se amanece con que hay limitaciones a lo esperado. Entonces, hacer legislaciones definitivas en ste momento es dficil. Los Estados Unidos decidieron dejar el asunto en manos de tres instancias: la Comisin Nacional de Biotica, los Institutos Nacionales de Salud y la Asociacin Americana para el avance de la ciencia. A pesar de que son instituciones de carcter nacional, sus debates dan vuelta al mundo aceleradamente y llegan a muchos pases a conformar normas y polticas, por lo que no es raro ver participaciones de investigadores extranjeros en ellas. Mxico por su parte ha establecido una legislacin que de acuerdo con su cultura nacional, tiende a proteger la vida, y por lo tanto, prohibe la destruccin del embrin. Sin embargo, contempla y regula el uso de componentes sanguneos y clulas progenitoras hematopoyticas (Ley General de Salud, Mxico).

18 Sin duda, la ciencia ha dado grandes beneficios a la humanidad, pero sin filosofa la ciencia puede ser mal usada. Es importante pues, encontrar el terreno filosfico apropiado y comn para todas las partes involucradas en la investigacin, aplicacin, legislacin, etc., para presentar mejor el debate sobre las clulas madre. Adems, todos los valores sociales debern ser ponderados cuidadosamente. Deber darse paso a los resultados escuetos que vayan ms all del perodo de la incertidumbre cientfica y arribar a adelantos definitivos que den resultados de trascendencia. Esta nueva biotecnologa bien usada nos puede llevar a una sociedad ms sana. La revolucin cientfica que influir en la biomedicina en este siglo, ya empez. Es importante entonces reconocer la pluralidad social y buscar el respeto en todos en los debates que se darn, pues finalmente los recursos que se dedicarn a esta naciente tecnologa vendrn de la sociedad, ya sea por la va publica o la privada.

ABREVIATURAS

NBAC FDA

National bioethics Advisory Comission Administracin Federal de drogas de los E.U.

BIBLIOGRAFA

Alliance for Aging Research, 2021 K Street, NW, Suite 305, Washington, D.C. 2000, USA.

19 Cromie, W. J. 1999. Nerve Cell Clones Repair Brain Damage. The Harvard University Gazette. Fontes, P. A. and Thomson, A.W. 1999. Stem Cell Technology, Where Are We Going?. British Medical. 319:1308. Gearhart, J.D. 1998. New Potential for Human Embrionic Stem Cells. Science 282:1061. Gretchen, V. 2000. Can Old Cells Learn New Tricks? Science 287:1418-1419. INEGI, Secretaria de Salubridad y Asistencia / Direccin General de Estadstica, Mxico 1998, modificado. Klug, M. G., Soonpaa, M.H., Kho, G.Y. and Field, L.J. 1996. Genetically Selected Cardiomiocytes From Differetiating Embrionic Stem Cells Form Stable Intracardiac Grafts. Clinical Investigation 98:1216-1224. Ley General de Salud. Organos Tejidos y Clulas. Captulo 2, artculo 324. Mxico. Lysaht, M.J. and Aebischer, P. 1999. Encapsulated Cells as Theraphy. Scientific American 280:52-58. Marshall, E. 2000. The Bussiness of Stem Cells. Science 287:1419-1421. McKay, R., Studer, L. and Tabar, V. 1998. Transplantation of expanded mesencephalic precursors leads to recovery in Parkinsonian rats. Nature Neuroscience 1:290295. Menzo, H., Hoogerbrugge, P., Dinko, V. and Helmut, H.G. 1997. Retroviral Stem Cell Gene Therapy. Journal of Cell Biology On Line. Stem Cells 15:162-179. Mooney, D. J. and Mikos, A. G. 1999. Growing New Organs. Scientific American 280:38-43.

20 NBAC, Executive Summary. 1999. Ethical Issues in Human Stem Cell Research Rockville, M.D. disponible en: http://bioethics.gov/cgi-bin/bioeth-counter.pl. NIH. Stem Cell Information, 2000. Stem Cells, A Primer. USA National Institutes of Health, The Directors Web Page,. Disponible en: http://nccam.nih.gov/nccam/an/message/. Pedersen, R.A. 1999. Embrionic Stem Cells for Medicine. Scientific American 280:4449. Perry, D. 2000. Patients Voices: The Powerful Sound in the Stem Cell Debate.Science 287:1423. Pittenger, M.F. 1999. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science 284:143-147. Shapiro, A.M.J., Lakey, J.R.T., Ryan, E.A., Korbutt, G.S., Toth, E., Warnock, G.L., Kneteman, N.M. and Rajotte, R.V. 2000. Islet Transplantation in Seven Patients with type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-free Immunosuppresive Regimen. Released before its publication date on June 6, 2000 at: http://www.nejm.org/content/shapiro/1.asp, New England J. Med. Slack, J.M. 2000. Stem Cells in Epithelial Tissues. Science 287:1431. Solter, D. and Gearhart, J.D. 1999. Putting Stem Cells to Work. Science 283:14681470. Stem Cell Sciences, Inc . Oncology / Hematology practice of Nicholas Ciobanu and Associates.

21 Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S. and Jones, J.M. 1998. Embrionic Stem Cells Lines Derived From Human Blastocysts. Science 282:1145-1147. Tucker, K. 1998. Scientists isolate embrionic Stem Cells. The World Socialist Web Site, published by The international Committee of the fourth International (ICFI). Disponible en: http://www.wsws.org. Young, F.E. 2000. A Time for Restraint. Science 287:1424.

22 Tabla 1. Tcnicas de transplantes de celulas madre ya consolidadas en la prctica mdica. TIPO DE TRANSPLANTE ENFERMEDAD AUTOLGO ALOGNICO SIMILAR,NOPARENTAL X

Leucemia mielognica aguda en primera X X o subsecuente remisin completa Leucemia mielognica aguda de relapso X X temprano o falla de induccin Leucemia linfoblstica aguda en primera X X X o subsecuente remisin completa Leucemia linfoblstica aguda de relapso X X temprano o falla de induccin Leucemia crnica mielognica X X X Mielodisplasia X X Anemia Aplstica X X Enfermedad de Hodgkins sensible y de X X relapso resistente Enfermedad de Hodgkins en remisin X completa pero con alto riesgo de relapso Linfoma Agresivo sensible y de relapso X X resistente Linfoma Agresivo en completa remisin X pero relapso de alto riesgo Linfoma de bajo grado X X Cncer del seno X Cncer del ovario X Cncer del testculo X Melanoma X Carcinoma celular pulmonar pequeo X Tumor cerebral primario X Fuente: Oncology / Hematology practice of Nicholas Ciobanu and Associates. Stem Cell Sciences, Inc (Disease Indications for Stem Cells Transplantation. 2000. http//:www. Stem-Cell.com/table.html).

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Tabla 2. Tcnicas de hemoaferesis ya consolidadas en la prctica mdica TIPO DE HEMO-AFERESIS Leucoaferesis X X Trombocitoaferesis Plasmaaferesis

ENFERMEDAD Leucemia linfoctica crnica Leucemia mieloctica crnica Trombocitopenia de plaquetas X excesivas Trombocitopenia prpura inmune X Paraproteinemia X Vasculitis X Myastenia gravis Poliomyositis X Dermatomyositis Sndrome de BarrX Guillain Sndrome de Goodpasture X Lupus nefrtico X Glomerulonefritis X Rechazo a trasplante renal X Crioglobulinemia X Hipercolesterolemia X Fuente: Oncology / Hematology practice of Nicholas Ciobanu and Associates. Stem Cell Sciences, Inc (Web Page: Disease Indications for Stem Cells Transplantation. 2000. http//:www. Stem-Cell.com/table.html).

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Tabla 3. Estado de la Industria mundial de las clulas madre hasta el ao 2000. Compaia Aastrom Biosciences Geron Corp. Layton Bioscience NeuralSTEM Neuronyx Inc. Nexell Therapeutics Osiris Therapeutics ReNeuron Stem Cell Sciences Ciudad Ann Arbor, MI Empleados 33 100 25 14 10 120 75 17 --16 Especialidad Clulas hematopoyticas Clulas fetales y embrionarias Clulas neurales fetales Clulas neurales fetales Clulas neurales Clulas hematopoyticas Clulas de mesnquima Clulas neurales Clulas embrionarias Clulas neurales adultas

Menlo Park, CA Atherton, CA Bethesda, MD Malvern, PA Irvine, CA Baltimore, MD London, UK Melbourne, Australia StemCells Inc. Sunnyvale, CA Fuente: Marshall, 2000.

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Tabla 4. Poblacion afectada que requiere investigacion aplicada con clulas madre en EE.UU. Numero de personas afectadas (millones)

Condicin

Enf. Cardiovasculares 58 Enf. Autoinmunes 30 Diabetes 16 Cancer 8.2 Enf. Alzheimers 4 Enf. Parkinson 1.5 Quemaduras severas 0.3 Lesiones de columna 0.25 Defectos de nacimiento 0.015 TOTAL 128.4 Fuente: Patients Voices: The powerful sound in the Stem Cells Debate. Revista Science, Vol 287, No 5457 February 2000, p 1423

26 Tabla 5. Indices de mortalidad por enfermedades que requieren investigacion aplicada con clulas madre en Mxico. Mortalidad por cada 100,000 habitantes

Lugar

Enfermedad

Primera Enfermedades cardacas (Corazn) 71.8 Primera Enfermedades cardacas (Isqumicas) 44.9 Segunda Tumores Malignos 54.1 Tercera Diabetes Mellitus 38.8 Quinta Enfermedades Cerebrovasculares 26.1 Sexta Cirrosis y enferm. Cronicas del higado 24.1 Dcima Nefritis, sindrome nefrtico y nefrosis 10.8 Dieciseisava Anemias 4.1 Fuente: Mxico, INEGI, Secretaria de Salubridad y Asistencia / Direccin General de Estadstica, 1998, modificado.

27 PIES DE FIGURAS

Fig. 1. Proceso de formacin del ser humano.

Fig. 2. Proceso de diferenciacin de las clulas sanguneas a partir de una clula madre pluripotencial.

Fig. 4. Transferencia del ncleo de una clula somtica a un vulo anucleado para la generacin de clulas madre pluripotenciales.

Fig.5. La promesa de la investigacin con clulas madres.