Tese Luisa Matos

Lusa Maria de Abreu Freire Diogo Matos
Caracterizao Clnica e Bioqumica das Doenas Mitocondriais na Criana

Contribuio para o Estudo Epidemiolgico na Regio Centro de Portugal
Universidade de Coimbra 2009
1 - RESUMO
Neste trabalho analisou-se a clnica, o diagnstico, o prognstico e a epidemiologia das doenas da cadeia respiratria mitocondrial (doena mitocondrial) em crianas na Regio Centro de Portugal, uma dcada aps o incio do diagnstico sistemtico destas doenas no Hospital Peditrico de Coimbra, em colaborao com o Laboratrio de Bioqumica Gentica do Centro de Neurocincias da Universidade de Coimbra. O principal objectivo foi retirar, da nossa e da experincia de outros grupos, os ensinamentos necessrios a uma melhor orientao futura destes doentes. O objecto do estudo o grupo das 200 crianas cuja suspeita de doena mitocondrial foi investigada com recurso anlise de amostras de msculo esqueltico (193 casos), fgado (41) e/ou miocrdio (11), no perodo de 1997 a 2006 (10 anos). As manifestaes clnicas tiveram incio no primeiro ano de vida em 71% dos casos (no perodo neonatal em 35%). Em 153 crianas a apresentao foi neurolgica e/ou muscular. Cento e setenta e cinco doentes evoluram com clnica do sistema nervoso central, 44 dos quais com doena multissistmica. A gravidade clnica traduziu-se em elevada mortalidade (27%), em grande percentagem de casos com agravamento clnico (13%) e em investigao etiolgica alargada na maior parte dos casos. Os doentes foram classificados segundo os critrios clnico-laboratoriais de Bernier para o diagnstico de doena mitocondrial em quatro nveis de probabilidade diagnstica: definida (95 casos), provvel (77), possvel (10) e improvvel (18). O diagnstico de doena mitocondrial foi baseado na presena de uma sndrome (18 casos, oito com sndrome de Leigh), de alteraes do DNA mitocondrial e/ou nuclear (nove), de fibras musculares vermelhas rotas (dois) e sobretudo na identificao de dfice enzimtico major da cadeia respiratria (91). A estes critrios majores, associouse uma grande diversidade de critrios minores clnicos, metablicos, enzimticos, histolgicos e genticos. Os dfices enzimticos dos complexos IV (89 doentes) e I (68) foram os mais frequentes, tal como tem sido referido em outras sries. Em 84 doentes (42%) no se obteve um diagnstico etiolgico. Setenta e oito crianas (39%) tiveram o diagnstico de doena mitocondrial. Em 38 casos (19%) chegou-se a um outro diagnstico etiolgico, destacando-se o grupo das outras doenas metablicas e o das infeces virais. Dezassete destas 38 crianas cumpriam critrios de doena mitocondrial definida, que foi considerada secundria. Confirmou-se a grande variabilidade e a no especificidade clnica das doenas mitocondriais na criana, atravs da semelhana entre os vrios grupos de diagnstico na nossa srie. A incidncia e prevalncia destas patologias so estimadas quase sempre em estudos retrospectivos como este. Variam amplamente com a populao em causa e o modo de seleco dos doentes, a extenso da investigao etiolgica e os critrios de diagnstico
aplicados. A incidncia de doena mitocondrial com manifestao clnica na primeira dcada de vida, na Regio Centro, foi estimada em 1/6500 nado-vivos, valor elevado em comparao com outras sries peditricas. Em 2006, a prevalncia pontual destas doenas nesta Regio era de 1/ 18500 habitantes com menos de 10 anos de idade, o que est de acordo com a sua elevada mortalidade na infncia. A abordagem diagnstica das doenas mitocondriais complexa, no existindo uma prova simples que as confirme ou exclua. O aparente peso excessivo dos dfices enzimticos da cadeia respiratria no diagnstico e a pobreza relativa de alteraes histolgicas nos nossos doentes levou anlise detalhada dos estudos mitocondriais realizados (quer os inespecficos, como os nveis de lactato, quer os especficos como a actividade enzimtica). Assim, reclassificou-se os doentes aplicando a escala de Nijmegen, aps excluso dos dados enzimticos e moleculares. Muito mais casos atingiram deste modo um nvel superior de probabilidade diagnstica, o que atesta a validade dos argumentos da suspeita diagnstica e corrobora os resultados do estudo enzimtico neste grupo de crianas. O diagnstico dos nossos doentes baseou-se na clnica e no estudo bioqumico da cadeia respiratria, como seria de esperar numa populao peditrica, em que a maioria dos casos se deve a alteraes do DNA nuclear. Ao contrrio da investigao do DNA mitocondrial, realizada amplamente nos nossos doentes com uma taxa de diagnstico molecular muito baixa, o estudo do DNA nuclear, efectuado em poucos casos, foi frequentemente positivo. necessrio maior investimento nos estudos moleculares, uma vez que as alteraes mitocondriais, tanto enzimticas como morfolgicas, so muitas vezes secundrias. Elaborou-se um fluxograma diagnstico que correlaciona a clnica, as alteraes enzimticas da cadeia respiratria, os achados histolgicos e as alteraes patognicas do DNA mitocondrial e nuclear. Com base nesta anlise e nos recursos disponveis, prope-se uma escala diagnstica, inspirada na de Nijmegen, a aplicar no Hospital Peditrico. Esta baseia-se numa tabela de dupla entrada com os critrios clnico-laboratoriais gerais de Nijmegen e os resultados do estudo enzimtico da cadeia respiratria (ambos escalonados em improvvel, possvel, provvel e definido). A escala proposta mais restritiva em termos de probabilidade de diagnstico final de doena mitocondrial para o caso individual do que a utilizada neste trabalho, reforando-se a importncia da clnica e dos estudos bioqumicos e histolgicos na orientao da investigao molecular, de acordo com o fluxograma diagnstico referido. Conclui-se pela necessidade do reforo da colaborao entre os grupos que investigam estas doenas, no sentido de estabelecer critrios de diagnstico, definio e
classificao uniformes. S definindo a sua prevalncia e histria natural possvel organizar adequadamente o apoio aos doentes e famlias.
SUMMARY
In this study a review of the clinical presentation, diagnosis, prognosis and epidemiological data of childhood mitochondrial respiratory chain disorders
(mitocondrial disorders) in the Central Region of Portugal is presented. This analysis was carried out one decade after the introduction of this diagnosis in the Paediatric Hospital of Coimbra, in cooperation with the Laboratory of Biochemical Genetics at the Centre for Neurosciences and Cell Biology of the University of Coimbra. The main objective is to improve clinical evaluation and follow-up of patients, based on our experience and that of other groups. For this purpose, we reviewed the clinical files of all 200 children whose investigation for a mitochondrial disorder included the analysis of muscle (193 patients), liver (41) and/or myocardium (11) samples, over a period of 10 years (1997 to 2006). Thirty five percent of the patients presented the disorder in the neonatal period and 71% in the first year of life. At presentation, 153 children had neurologic and/or muscular symptoms. Throughout evolution, central nervous system dysfunction affected 175 children, frequently in the context of multisystemic involvement (44 patients). Clinical severity was revealed by the high mortality (27%) and disease progression (13%) rates and by the extended etiological investigation performed in most cases. Patients were classified, according to Bernier criteria for mitochondrial disease in children, in four diagnostic probability groups: definite (95 cases), probable (77) possible (10) and unlikely (18). Diagnostic classification was based on the
identification of a known mitochondrial syndrome (18 patients, eight with Leigh syndrome), pathogenic mitochondrial DNA and/or nuclear DNA mutations (nine), ragged red fibres (two) and a major respiratory chain enzymatic defect (91). Other minor clinical, metabolic, enzymatic, histopathological and genetic criteria also contributed to the diagnosis of these patients. Respiratory chain enzymatic complexes IV (89 patients) and I (68) were the most frequently affected, as in other series. In 84 patients (42%), an etiological diagnosis was not achieved. A mitocondrial respiratory chain disorder was established in 78 children (39%). A different diagnosis was found in 38 cases, other metabolic disorders and viral infections being the most commonly identified. Seventeen of these patients fulfilled criteria for definite mitochondrial disease and were classified as secondary. We have corroborated the great clinical variability and non-specific features of mitochondrial diseases in children through the similarity among the diverse diagnostic groups in our series. Mitochondrial disease incidence and prevalence are usually estimated through retrospective studies like the present one. Figures vary a lot, depending on the
population under study and patient selection, investigation thoroughness, and diagnostic criteria. Incidence of mitochondrial disease in children under 10 years of age in the Central Region of Portugal was 1/ 6500 newborns, which is high compared to other paediatric series. In 2006 the prevalence in this region was 1/ 18500 children under 10 years of age, which confirms the high mortality caused by these disorders in childhood. The diagnostic approach for mitochondrial disorders is complex, since there is no simple test to confirm or exclude them. The apparent over-representation of respiratory chain enzymatic deficits and the relative paucity of histological
abnormalities in our patients led us to analyse the mitochondrial studies performed. The patients were reclassified using the Nijmegen scale, after exclusion of enzymatic and molecular genetic data. With this new classification (the clinical and laboratory Nijmegen general criteria), a higher level of diagnostic certainty was obtained, confirming the value of diagnostic suspicion and respiratory chain enzymatic evaluation in this group of children. The diagnosis in our patients was mostly based on the clinical and respiratory chain biochemical studies, as would be expected in a paediatric population, in whom most mitochondrial disorders are caused by mutations in the nuclear DNA. These were investigated in only a few patients in our series and frequently yielded positive findings. As expected, pathogenic mutations in mitochondrial DNA, although broadly investigated, were rarely found. Since mitochondrial abnormalities, both enzymatic and morphological, are frequently secondary to other disease states, it is crucial to carry out in depth molecular genetic studies. A diagnostic chart, which emphasises the correlation of clinical, histological and enzymatic data with pathogenic mitochondrial and nuclear abnormalities, is presented in this work. Taking into account the present study and our resources, a new diagnostic scale based on the Nijmegen group classification, to be used in our Hospital, is proposed. It consists of two groups of data (clinical, metabolic/ imaging and histopathology versus respiratory chain enzymatic activity), both classified as definite, probable, possible and unlikely. The combination of general and enzymatic criteria allows a final patient diagnosis to be made. This new classification, being more restrictive than the one we employed in the present study, strengthens the need to use the entire patients data to decide on the appropriate molecular genetic studies, according to the proposed diagnostic chart. We conclude that there is a great need to reinforce collaboration among the groups investigating mitocondrial disorders, in order to establish uniform diagnostic criteria, a definition and classification. Adequate support to patients and families will not be possible unless the prevalence and natural history of these disorders are well defined.
AGRADECIMENTO
minha famlia, pelo amor e apoio incondicional que sempre me tem dado nos projectos pessoais e profissionais. Um agradecimento especial ao Gabriel, meu companheiro de sempre, s minhas filhas, Joo e Bia, aos meus genros, aos meus pais e ao Bernardo, meu pai adoptado. Agradeo tambm aos meus irmos, e especialmente Lvia, pelo incentivo a que no desistisse deste projecto! Aos meus netos, Matilde, Rodrigo e Pedro, dedico em particular este trabalho, para que nunca voltem costas aos desafios. Professora Doutora Catarina Oliveira e ao Professor Doutor Carmona da Mota, meus orientadores nesta tese (embora agora, no oficialmente), meus mestres, sob cuja direco tive o privilgio de trabalhar ao longo de grande parte da minha vida profissional, pelo seu exemplo pessoal e profissional, os seus conselhos sempre pertinentes, a criao da oportunidade e incentivo realizao deste trabalho, a orientao e a reviso crtica do texto. Manuela Grazina e restante equipa do Laboratrio de Bioqumica Gentica do Centro de Neurocincias da Universidade de Coimbra, pela implementao e realizao dos estudos mitocondriais dos nossos doentes, pelo grande esforo profissional e pessoal colocado no avano local das tcnicas de investigao e diagnstico das doenas da cadeia respiratria mitocondrial, pela sua colaborao incondicional e pela sua amizade. Paula Garcia, a quem devo uma boa parte do trabalho clnico aqui apresentado, uma palavra de especial apreo. Tenho podido contar sempre com a sua disponibilidade e esprito de equipa, a sua grande qualidade tcnica e profissional e sagacidade, condies que muito tm feito progredir a Unidade de Doenas Metablicas. Agradeo-lhe a frontalidade e a amizade, que muito prezo. Aos restantes elementos da Unidade de Doenas Metablicas, Ana, Marta e Fidjy, pela sua competncia, apoio e amizade. Fidjy em especial pela reviso das referncias bibliogrficas deste trabalho. Isabel Tavares de Almeida, pela sua colaborao de sempre no estudo laboratorial dos nossos doentes, o empenhamento absoluto no avano da causa metablica, nomeadamente na direco da Sociedade Portuguesa de Doenas Metablicas, o seu exemplo pessoal e profissional e a sua amizade, bem patenteada no apoio e interesse colocados na paciente reviso crtica do texto final desta tese. Laura Vilarinho, responsvel pelo Servio Nacional de Rastreios, pela sua colaborao de sempre no estudo laboratorial dos nossos doentes e em particular pela realizao dos estudos de DNA nuclear dos doentes revistos nesta tese. A todos os funcionrios e a todos os meus colegas do Centro de Desenvolvimento, em especial ao Boavida Fernandes pela disponibilidade em ajudar no Servio de Urgncia sempre que precisei. Guiomar Oliveira pela colaborao especial no estudo dos doentes com autismo e doena mitocondrial. A todos os Neuropediatras (Dr Lus Borges, Isabel Fineza, Conceio Robalo, Olavo Gonalves e Mnica Vasconcelos) com quem que partilhmos o seguimento clnico de muitos dos doentes desta srie. Conceio Robalo e equipa do Laboratrio de Electroencefalografia, em particular, pela ajuda na reviso dos casos com epilepsia. Uma palavra especial para o Dr Lus Borges pelo incentivo e carinho com que sempre me distinguiu. Aos colegas do Servio Gentica do Hospital Peditrico pela colaborao no diagnstico de alguns dos doentes desta srie e especificamente ao Srgio Sousa pela ajuda na reviso do texto sobre os resultados dos estudos citogenticos.
Aos colegas e restante pessoal da Cirurgia, Radiologia e Anestesia pela realizao das bipsias musculares e hepticas dos doentes. A todos os meus colegas e enfermeiros do Hospital Peditrico, nomeadamente da Unidade de Cuidados Intensivos e da Enfermaria de Medicina, incluindo a Unidade de Hepatologia, que seguiram e trataram muitos dos doentes revistos neste estudo e connosco debateram os seus diagnsticos e orientaes teraputicas, bem como aos respectivos mdicos assistentes de outros Servios de Sade, nomeadamente das Maternidades de Coimbra. Maria do Carmo Macrio do Servio de Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra, que segue os doentes adultos com doenas da cadeia respiratria mitocondrial ou sua suspeita, incluindo os desta srie. As suas qualidades pessoais e profissionais e o seu interesse pelas doenas neurometablicas, permitindo partilhar experincias e aprender em equipa, tm sido um factor importante para o avano do conhecimento das doenas mitocondriais entre ns. Ao Miguel Cordeiro e aos Neurorradiologistas do nosso Hospital pela ajuda na reviso dos achados neurorradiolgicos. Ao Miguel em particular pela sistematizao e interpretao dos achados na srie de doentes em estudo Teresa Proena e sua equipa do laboratrio de Neuroqumica dos HUC pela realizao dos estudos redox dos nossos doentes. Olinda Rebelo e ao Dr Antnio Guimares dos Servios de Neuropatologia dos HUC e do Hospital de Santo Antnio do Porto, respectivamente e ao Prof. Juan Cuevas do Servio de Anatomia Patolgica do Hospital Universitrio de Santiago de Compostela pelos estudos anatomopatolgicos do msculo. Aos colegas do Servio de Anatomia Patolgica dos HUC pelos estudos em fgado e miocrdio. Isabel Carreira e sua equipa do Laboratrio de Citogentica da Faculdade de Medicina de Coimbra, pela colaborao nos estudos citogenticos e na cultura de fibroblastos de muitos dos nossos doentes. Margarida Alte da Veiga pela preciosa ajuda na anlise estatstica dos dados deste trabalho. Aos funcionrios dos laboratrios de anlises clnicas do nosso Hospital, do Centro de Patognese Molecular da Faculdade de Farmcia de Lisboa e do Instituto de Gentica Mdica do Porto e a todos os laboratrios nacionais e estrangeiros que connosco colaboraram na realizao de investigao etiolgica dos nossos doentes. Aos funcionrios do Arquivo do nosso Hospital, que foram incansveis no levantamento de todos os processos clnicos para reviso, dando mostra de especial considerao e carinho. D. Catarina Lopes e D. Elvira Rafael (Biblioteca dos Hospitais da Universidade de Coimbra) e D. Edite Garcia (Biblioteca do Hospital Peditrcio de Coimbra) pela sempre pronta e valiosa ajuda na pesquisa bibliogrfica. Aos meus colegas do Servio de Bioqumica da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra pelo apoio e vicarincia nas minhas funes de Assistente, sempre que deles necessitei e tambm D. Rosa Cardoso pela sua disponibilidade e apoio. Por ltimo, mas no menos importante, aos pacientes e suas famlias pela confiana e pela colaborao na procura, tantas vezes frustrada, da causa da doena, quase sempre sem que se vislumbrasse um tratamento especfico. Um bem haja! a todos os que de algum modo colaboraram na concretizao deste projecto.
PUBLICAES
Parte dos resultados apresentados nesta dissertao foi includo nas seguintes publicaes:
Sob a forma de artigo original:
L Diogo, H Drago, A Fernandes, G Carvalho, J Canha, HC Mota, T Proena, C.Oliveira. Avaliao do estado redox plasmtico na criana. Acta Ped Port, 1999; 2 (30): 129133. Oliveira G, Diogo L, Grazina M, Garcia P, Atade A, Marques C, Miguel T, Borges L, Vicente AM, Oliveira CR. Mitochondrial dysfunction in autism spectrum disorders: a population-based study. Dev Med Child Neurol. 2005; 47(3):185-9. Correia C, Coutinho AM, Diogo L, Grazina M, Marques C, Miguel T, Atade A, Almeida J, Borges L, Oliveira C, Oliveira G, Vicente AM. Brief report: High frequency of biochemical markers for mitochondrial dysfunction in autism: no association with the mitochondrial aspartate/glutamate carrier SLC25A12 gene. J Autism Dev Disord. 2006;36:1137-40. Grazina MM, Diogo LM, Garcia PC, Silva ED, Garcia TD, Robalo CB, Oliveira CR. Atypical presentation of Leber's hereditary optic neuropathy associated to mtDNA 11778G>A point mutation - A case report. Eur J Paediatr Neurol. 2007; 11(2):115-8. Diogo L, Grazina M, Garcia P, Rebelo O, Veiga MA, Cuevas J, Vilarinho L, de Almeida IT, Oliveira CR. Pediatric mitochondrial respiratory chain disorders in the Centro region of Portugal. Pediatr Neurol. 2009; 40(5):351-6. Cordeiro M., Scaglia F., Lopes da Silva S., Garcia P., Grazina M., Moura C., Diogo L. The Brain-Heart Connection in Mitochondrial Respiratory Chain Diseases The Neuroradiol J. 2009; 22: 558-563. Diogo L, Cordeiro M, Garcia P, Grazina M, Rito S, Oliveira CR, Veiga MA, Garcia T. Brain Magnetic Resonance Imaging in the Diagnosis of Mitochondrial Respiratory Chain Disorders in Children. Pediatr Neurol. (in press)
Sob a forma de resumo: Diogo L, Grazina MMM, Garcia P, Fernandes A, Oliveira LM, Almeida I, Vilarinho L, Oliveira CR (1998) Extra Neuromuscular Presentation of Mitochondrial Respiratory Chain Disorders - Analysis of Six Portuguese Patients, J Inher Metab Dis, 21 (S2): 84. Grazina M, Diogo L, Fernandes A, Oliveira L M Godinho, A Cabral, O Rebelo, I Fineza, C R Oliveira.(1999). Mitochondrial myopathy and merosin-positive dystrophy. J Inher Metab Dis 22 (S1): 39. Grazina M, Oliveira LM, Diogo L, Fernandes AIP, Godinho M, Carreira IM, Macrio MC, Rebelo O, Santos P, Oliveira CR. (2000). Genotypical and phenotypical variability of mitochondrial DNA deletions: report of six cases. J Inher Metab Dis 23 (S1): 145.
Grazina M, Godinho M, Simes M, Carreira IM, Diogo L, Fernandes A, Oliveira CR. (2001). Biochemical approach to mitochondrial cytopathies in centre Portugal: results of three years. J Inher Metab Dis 24 (S1): 78. Almeida D, Diogo L, Garcia P, Grazina M, Silva E, Tavares Almeida I, Oliveira CR. (2004). From migraine to mitochondrial respiratory chain disease. J Inher Metab Dis 27(S1):114. Garcia P, Duarte C, Grazina M, Oliva M, Robalo C, Oliveira C, Diogo L. (2005). Acute fatty liver of pregnancy and mitochondrial disease in the foetus. J Inher Metab Dis 28(S1): 127 Diogo L, Garcia P, Grazina M, Cabral A, Robalo C, Oliveira CR. (2005). Brain Calcifications and mitochondrial diseaseclinical report. J Inher Metab Dis 28(S1): 130. Estevinho A, Oliveira S, Pratas J, Simes M, Mendes C, Santos MJ, Oliveira M, Diogo L, Macrio C, Oliveira CR, Grazina M. (2008). Mitochondrial cardiomyopathies: biochemical and genetic heterogeneity. J Inherit Metab Dis 31 (S1):52. Silva S, Robalo C, Garcia P, Grazina M, Oliveira CR, Diogo L. (2008). West syndrome and mitochondrial dysfunction. J Inherit Metab Dis 31 (S1):52. Neves N, Garcia P, Proena T, Baldeiras I, Grazina M, Vilarinho L, Oliveira CR, Diogo L. (2008). Oxidative stress in childhood mitochondrial respiratory disease- 20 cases. J Inherit Metab Dis 31 (S1):57. Grazina M, Pratas J, Simes M, Mendes C, Oliveira S, Oliveira M, Macrio C, Diogo L, Garcia P, Oliveira CR. (2008). Ocular involvement in mitochondrial disease: biochemical and genetic diversity outline in central Portugal. J Inherit Metab Dis 31 (S1):59. Castelo R, Garcia P, Vasconcelos M, Rebelo O, Dinis A, Grazina M, Diogo L. (2008). Acute necrotizing encephalopathy a mitochondrial disorder? J Inherit Metab Dis 31 (S1):61.
ABREVIATURAS
ADP ANT1 ATP CK CNC CoQ COX CPEO CRM DCRM DGUOK ENM FAD FD-PCR FMN HP
1
Difosfato de Adenosina Adenine Nucleotide Translocator - translocador de nucletidos de adenina Trifosfato de Adenosina Creatina cinase Centro de Neurocincias e Biologia Celular da Universidade de Coimbra Coenzima Q Citocromo c Oxidoreductase; Citocromo Oxidase Oftalmoplegia externa crnica progressiva Cadeia Respiratria Mitocondrial Doena da Cadeia Respiratria Mitocondrial Desoxiguanosina kinase Extra Neurgico e/ou Muscular Flavina- Adenina Dinucletido PCR de flanqueamento de deleces Flavina Mononucletido Hospital Peditrico de Coimbra Ressonncia Magntica protnica Hospitais da Universidade de Coimbra Sndrome de Kearns-Sayre Leber Hereditary Optic Atrophy PCR de produtos longos Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke-like episodes Mitochondrial Inherited Diabetes and Deafness Maternal Inherited Leigh Syndrome Mitochondrial Recessive Ataxia Syndrome Mitochondrial Myopathy, Lactic Acidosis, Sideroblastic Anemia Mio-Neuro-Gastro-Intestinal Encephalopathy Multiple Symmetric Lipomatosis PCR especfica de mutao cido Desoxirribinucleico mitocondrial Nicotinamida - Adenina Dinucletido Neuropathy, Ataxia, Retinitis Pigmentosa cido Desoxirribinucleico nuclear Neurgico e/ou Muscular Polimerase Chain Reaction
H RMS
HUC KSS LHON L-PCR MELAS MIDD MILS MIRA MLASA MNGIE MSL MS-PCR mtDNA NADH NARP nDNA NM PCR
PCR-AS PCR-RFLP PS RMS RMN RNA ROS RRF SANDO SCAE SDH SNC TAC v.r. XL-PCR
PCR- alelo-especfica PCR com uso de enzimas de restrio (Restrition Fragment Lengh Polymorfism) Sndrome de Pearson Ressonncia Magntica Ressonncia Magntica Nuclear cido Ribonucleico Reactive Oxigen Species Ragged Red Fibres Fibras Vermelhas Rotas Sensori-Ataxic Neuropathy, Disartry, Ophthalmoplegia juvenil Spino-Cerebelar Ataxia Epilepsy Succinato-desidrogenase Sistema Nervoso Central Tomografia Axial Computorizada Valor de referncia PCR de produtos extra-longos
NDICE DE TEXTO
CAPTULO 1 RESUMO....................................................................................... 1 CAPTULO 2 INTRODUO............................................................................... 7 2.1 2.2 Razo de ser deste trabalho ...................................................................... 9 Importncia e actualidade do tema............................................................11 Nota histrica...................................................................................11 Dimenso do problema......................................................................12 Estrutura e funes energtica e termognica das mitocndrias .............13 Dupla regulao gentica da mitocndria.............................................20 Stress oxidativo, apoptose e envelhecimento .......................................24
2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.3
As doenas da cadeia respiratria mitocondrial ...........................................27 Definio e manifestaes clnicas ......................................................27 Diagnstico e classificao. ................................................................41 Fisiopatologia e tratamento................................................................50 Prognstico e aconselhamento gentico...............................................55
2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4
CAPTULO 3 - OBJECTIVOS ............................................................................... 59 CAPTULO 4 - MATERIAL E MTODOS ............................................................... 63 4.1 4.2 Caracterizao da amostra em estudo .......................................................65 Estudos mitocondriais ..............................................................................68 Estudos bioqumicos .........................................................................68 Estudos anatomo-patolgicos.............................................................70 Estudos de gentica molecular ...........................................................71
4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3 4.4 4.5
Critrios de diagnstico utilizados..............................................................73 Incidncia e prevalncia na Regio Centro de Portugal.................................82 Anlise estatstica ...................................................................................82
CAPTULO 5 RESULTADOS ............................................................................. 83 5.1 Caracterizao clnico-laboratorial da amostra ............................................85 A clnica das crianas com suspeita de doena mitocondrial ...................85 Caracterizao laboratorial da amostra..............................................101 Classificao diagnstica dos doentes................................................123 Anlise de alguns aspectos particulares da amostra ............................132
5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.2
Doena mitocondrial na criana na Regio Centro de Portugal.....................141 Incidncia......................................................................................141 Prevalncia ....................................................................................141
5.2.1 5.2.2 5.3 5.4
Anlise da escala diagnstica adoptada ....................................................142 Estudo mitocondrial funcional realizado - perspectiva clnica .......................145
5.4.1 5.4.2 5.4.3
Cetonmia .....................................................................................145 Estudo polarogrfico .......................................................................146 A actividade enzimtica dos complexos da CRM..................................147
CAPTULO 6 DISCUSSO ............................................................................. 157 6.1 Metodologia e resultados........................................................................159 Seleco clnico-laboratorial dos doentes ...........................................159 Abordagem laboratorial da mitocndria .............................................164
6.1.1 6.1.2 6.2
O diagnstico final.................................................................................188 Os critrios de diagnstico adoptados ...............................................188 O grupo dos doentes com doena mitocondrial definida.......................195 Doenas da cadeia respiratria mitocondrial secundrias .....................196 Factores de possvel interferncia no diagnstico ................................199
6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.3
As doenas mitocondriais na Regio Centro de Portugal .............................205
CAPTULO 7 CONCLUSES ........................................................................... 207 7.1 7.2 7.3 Proposta de abordagem diagnstica ........................................................210 Proposta de uma escala de classificao...................................................215 O seguimento dos doentes adopo de um protocolo internacional ...........218
CAPTULO 8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................. 219 CAPTULO 9 ANEXOS ................................................................................... 253 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 Classificao gentica das doenas mitocondriais. .....................................255 Alteraes do DNA mitocondrial investigadas ............................................257 Critrios de Bernier que levaram classificao dos doentes ......................266 Doena Mitocondrial - Escala de Seguimento de Newcastle .........................274 Doena mitocondrial na Regio Centro de Portugal -publicao ...................283
NDICE DE FIGURAS:
Figura 1 - Importncia da mitocndria no metabolismo celular. .............................................13 Figura 2 - Principais vias de produo de energia - papel da mitocndria. .................................14 Figura 3 - Estrutura da mitocndria - compartimentos mitocondriais. ......................................14 Figura 4 - Esquema funcional da cadeia respiratria mitocondrial. ..........................................17 Figura 5 - Dupla regulao gentica da mitocndria ...........................................................21 Figura 6 - Segregao mittica das mitocndrias durante a diviso celular. ...............................23 Figura 7 - Diversidade da apresentao clnica das DCRM. ...................................................30 Figura 8 - Mapa de morbilidade do genoma humano mitocondrial. .........................................33 Figura 9 - Doenas da cadeia respiratria mitocondrial com origem no nDNA no mtDNA . .............35 Figura 10 - Distribuio dos casos investigados por anos do perodo de estudo. .........................85 Figura 11 - Mapa de distribuio dos doentes por distrito.....................................................86 Figura 12 - Idade de incio de manifestaes clnicas nos vrios grupos etrios ..........................87 Figura 13 - Malformaes congnitas na amostra em estudo. ...............................................89 Figura 14 - P convexo num dos doentes da nossa srie. ....................................................89 Figura 15 - Sinais e sintomas de apresentao neurolgica e/ou muscular em 152 doentes. ..........90 Figura 16 - Sinais e sintomas de apresentao ENM em 48 doentes. .......................................91 Figura 17 - Apresentao cardaca observada em 11 doentes. ...............................................91 Figura 18 - Cardiomeglia num doente com miocardiopatia dilatada .......................................91 Figura 19 - Apresentao heptica observada em 10 doentes. ..............................................92 Figura 20 - Evoluo clnica das 191 crianas sobreviventes primeira semana de doena. ...........93 Figura 21 - Evoluo neurolgica em 175 crianas sobreviventes primeira semana de doena. .....93 Figura 22 - Desenvolvimento psicomotor nos sobreviventes primeira semana de doena. ...........94 Figura 23 - Criana com encefalopatia epilptica (sndrome de West). .....................................94 Figura 24 - Sintomatologia atribuvel a alterao dos pares cranianos. .....................................96 Figura 25 - Malnutrio (a); alimentao por gastrostomia (b) em crianas da nossa srie. ............96 Figura 26 - Envolvimento oftalmolgico em trs doentes da nossa srie ...................................97 Figura 27 - Evoluo cardaca observada em 29 doentes. ....................................................98 Figura 28 - Evoluo heptica observada em 31 doentes. ....................................................98 Figura 29 - Evoluo da morbilidade e mortalidade em 197 doentes. ......................................99 Figura 30 - Tipo de colheita de tecidos realizada em 200 doentes.........................................102 Figura 31 - Tecidos estudados por doente. ....................................................................102 Figura 32 - Exames complementares realizados para diagnstico diferencial. ...........................103 Figura 33 - Exames complementares para diagnstico diferencial - estudos moleculares. ............105 Figura 34 - Atrofia corticosubcortical marcada e leucoencefalopatia num doente. ......................107 Figura 35 - Imagens de RMN numa criana de dois anos com sndrome de Leigh. .....................108 Figura 36 - Resultados do estudo histolgico realizado em 191 doentes. ................................109 Figura 37 - Resultados do estudo histolgico do msculo em microscopia ptica em 185 doentes. .109 Figura 38 - Imagens do estudo histolgico do msculo. ....................................................110 Figura 39 - Resultados do estudo histolgico do fgado em microscopia ptica em 38 doentes. .....111
Figura 40 - Lactacidmia em 197 doentes classificados em cinco classes de gravidade. ..............112 Figura 41 - 1H RMS num doente mostrando picos anormais de lactato ...................................113 Figura 42 - Estudo redox realizado nos 200 doentes em estudo. ..........................................116 Figura 43 - Avaliao enzimtica dos complexos I-V da CRM em 198 doentes. .........................117 Figura 44 - Actividade dos complexos enzimticos da CRM em 198 doentes. ...........................117 Figura 45 - Dfices enzimticos da CRM em 130 doentes. ..................................................118 Figura 46 - Dfices enzimticos major da CRM em 91 doentes. ...........................................119 Figura 47 - Actividade da CRM por tecido em 198 doentes. ................................................119 Figura 48 - Rastreio de mutaes e deleces do mtDNA em 200 doentes. .............................120 Figura 49 - Classificao dos 200 doentes segundo os critrios de DCRM de Bernier. .................123 Figura 50 - Diagnstico de DCRM - critrios majores registados em 100 doentes. .....................124 Figura 51 - Diagnstico de DCRM - critrios clnicos minores registados em 182 doentes. ............125 Figura 52 - Diagnstico de DCRM - critrios laboratoriais minores em 200 doentes. ...................126 Figura 53 - Diagnstico de DCRM - critrios laboratoriais em 200 doentes. .............................126 Figura 54 - Diagnstico final dos 200 doentes em estudo. ..................................................127 Figura 55 - Diagnstico final em 200 doentes. ................................................................127 Figura 56 - Idade da colheita de tecidos em 200 doentes...................................................130 Figura 57 - Demora no diagnstico em 200 doentes. ........................................................130 Figura 58 - Evoluo do tipo de doente investigado ao longo do perodo do estudo. ..................131 Figura 59 - Evoluo do diagnstico final ao longo do perodo do estudo. ...............................131 Figura 60 - Anlise de factores clnicos que influenciaram a sobrevida em 200 doentes. ..............132 Figura 61 - Anlise de factores laboratoriais que influenciaram a sobrevida em 200 doentes. .......133 Figura 62 - Sobrevida e diagnstico final.......................................................................133 Figura 63 - Condies de colheita de tecidos e tipo de diagnstico final, primrio ou secundrio. ...135 Figura 64 - Condies da colheita de tecidos e diagnstico final em 200 doentes. .....................135 Figura 65 - Medicao aquando da colheita de tecidos para estudos mitocondriais. ...................136 Figura 66 - Medicao anticonvulsivante aquando do estudo mitocondrial. ..............................136 Figura 67 - Classificao dos doentes segundo os critrios gerais de Nijmegen. ........................142 Figura 68 - Critrios clnico-laboratoriais gerais de Nijmegen preenchidos pelos 200 doentes. .......142 Figura 69 - Critrios clnico-laboratoriais gerais de Nijmegen preenchidos em 200 doentes. .........143 Figura 70 - Classificao diagnstica nos 200 doentes segundo os critrios de Nijmegen. ............143 Figura 71 - Aplicao das escalas geral de Nijmegen e Bernier adaptada amostra. ..................144 Figura 72 - Relao entre a cetonmia e o grau de diagnstico de DCRM. .............................146 Figura 73 - Complexo IV em msculo em funo da expresso da actividade enzimtica. ............148 Figura 74 - Valores normais de actividade enzimtica da CRM nas vrias unidades. ...................149 Figura 75 - Influncia da correco para a citrato sintase no diagnstico final em 198 doentes. ....150 Figura 76 - Correlao entre os segmentos I+III e II+III e os respectivos complexos enzimticos. 152 Figura 77 - Actividade do complexo IV em trs preparaes de msculo de 41 doentes. .............155 Figura 78 - Actividade dos complexos II a IV em linfcitos e no msculo em 90 doentes. ............156 Figura 79 - DCRM na criana - algoritmo diagnstico. .......................................................211
NDICE DE TABELAS:
Tabela 1 - Critrios majores de diagnstico de DRCM aplicados aos 200 doentes. .......................74 Tabela 2 - Critrios clnicos minor de diagnstico de DRCM aplicados aos 200 doentes. ................75 Tabela 3 - Outros critrios minores de diagnstico de DRCM aplicados aos 200 doentes. ..............77 Tabela 4 - Graus de diagnstico final de DRCM segundo a classificao de Bernier. .....................77 Tabela 5 - Critrios gerais de DCRM de Nijmegen. .............................................................78 Tabela 6 - Graus de diagnstico segundo os critrios gerais de DCRM de Nijmegen. ....................81 Tabela 7 - Relao entre a idade e o tipo de apresentao clnica em 200 doentes. .....................87 Tabela 8 - Relao entre a idade de incio dos sintomas e o tipo de clnica na altura do estudo. ......88 Tabela 9 - Apresentao clnica outras alteraes neurolgicas em 14 doentes. .......................90 Tabela 10 - Classificao da epilepsia em 70 doentes investigados por suspeita de DCRM. ............95 Tabela 11 - Mortalidade e tempo de evoluo em 197 doentes. ...........................................100 Tabela 12 - Mortalidade em 53 doentes - idade do bito....................................................100 Tabela 13 - Clnica na apresentao e tipo de doente - agudo ou crnico. ..............................101 Tabela 14 - Circunstncias clnicas no diagnstico. ..........................................................101 Tabela 15 - Suspeita de DRCM e infeco por vrus. .........................................................106 Tabela 16 - Exames de imagem cerebral realizados em 179 doentes. ....................................106 Tabela 17 - Distribuio da atrofia do SNC em 94 doentes. ................................................107 Tabela 18 - Distribuio das alteraes detectadas na RMN e/ou TAC cerebral em 81 doentes. .....108 Tabela 19 - Relao entre os valores do lactato plasma e no lquor em 93 doentes. ..................113 Tabela 20 - Relao entre a lactacidmia e os resultados da RMS em 34 doentes. ....................113 Tabela 21 - Relao entre o lactato no lquor e os resultados da RMS em 17 doentes. ................114 Tabela 22 - Relao entre a alaninmia e a lactacidmia em 39 doentes. ...............................114 Tabela 23 - Relao entre prolinmia e a lactacidmia em 173 doentes. ................................114 Tabela 24 - Relao entre a prolinmia e a alaninmia em 173 doentes. ................................115 Tabela 25 - Relao entre lactato, alanina e prolina no plasma e os resultados da RMS. .............115 Tabela 26 - Correlao gentipo-fentipo nos 23 doentes com alterao molecular. ..................122 Tabela 27 - Critrios clnico-laboratoriais que permitiram o diagnstico final nos 200 casos. .........124 Tabela 28 - Outros diagnsticos etiolgicos em 38 doentes. ...............................................128 Tabela 29 - Outras doenas hereditrias do metabolismo em 12 doentes. ..............................128 Tabela 30 - Grupos diagnsticos versus mortalidade. .......................................................134 Tabela 31 - Anlise de alguns parmetros clnicos nos dois subgrupos de DCRM definida. ...........140 Tabela 32 - Estimativa da incidncia de DCRM na Regio Centro de Portugal. ..........................141 Tabela 33 - Actividade enzimtica do complexo IV expressa de diversos modos. ......................147 Tabela 34 - Unidades de expresso da actividade do complexo IV - mitocndrias de msculo. ......148 Tabela 35 - Unidades de expresso da actividade do complexo IV - homogeneizado de msculo. ..149 Tabela 36 - Influncia da normalizao para a citrato sintase no diagnstico final em 198 doentes. 151 Tabela 37 - Algoritmo diagnstico da DCRM na criana notas ...........................................212 Tabela 38 - Escala diagnstica de DCRM proposta. ..........................................................215 Tabela 39 - Comparao da escala de diagnstico proposta com outras escalas de DCRM. ..........216
Tabela 40 - Alteraes do mtDNA pesquisadas no incio do estudo. ......................................257 Tabela 41 - Deleces pesquisadas at 2004..................................................................257 Tabela 42 - Mutaes pesquisadas at 2004. .................................................................258 Tabela 43 - Deleces do mtDNA pesquisadas a partir de 2005. ..........................................258 Tabela 44 - Mutaes do mtDNA pesquisadas a partir de 2005. ...........................................259 Tabela 45 - Critrios majores em 200 doentes segundo a classificao de Bernier. ....................266 Tabela 46 - Critrios minores em 200 doentes segundo a classificao de Bernier. ....................270 Tabela 47 - Doena Mitocondrial - Escala de Seguimento de Newcastle (0 - 24 M). ...................275 Tabela 48 - Doena Mitocondrial - Escala de Seguimento de Newcastle (2 - 11 A). ...................277 Tabela 49 - Doena Mitocondrial - Escala de Seguimento de Newcastle (12 - 18 A). ..................280
Captulo 1 - Resumo
CAPTULO 1 RESUMO
Captulo 1 - Resumo
Captulo 1 - Resumo
1. RESUMO
Neste trabalho analisou-se a clnica, o diagnstico, o prognstico e a epidemiologia das doenas da cadeia respiratria mitocondrial (doena mitocondrial) em crianas na Regio Centro de Portugal, uma dcada aps o incio do diagnstico sistemtico destas doenas no Hospital Peditrico de Coimbra, em colaborao com o Laboratrio de Bioqumica Gentica do Centro de Neurocincias da Universidade de Coimbra. O principal objectivo foi retirar, da nossa e da experincia de outros grupos, os ensinamentos necessrios a uma melhor orientao futura destes doentes. O objecto do estudo o grupo das 200 crianas cuja suspeita de doena mitocondrial foi investigada com recurso anlise de amostras de msculo esqueltico (193 casos), fgado (41) e/ou miocrdio (11), no perodo de 1997 a 2006 (10 anos). As manifestaes clnicas tiveram incio no primeiro ano de vida em 71% dos casos (no perodo neonatal em 35%). Em 153 crianas a apresentao foi neurolgica e/ou muscular. Cento e setenta e cinco doentes evoluram com clnica do sistema nervoso central, 44 dos quais com doena multissistmica. A gravidade clnica traduziu-se em elevada mortalidade (27%), em grande percentagem de casos com agravamento clnico (13%) e em investigao etiolgica alargada na maior parte dos casos. Os doentes foram classificados segundo os critrios clnico-laboratoriais de Bernier para o diagnstico de doena mitocondrial em quatro nveis de probabilidade diagnstica: definida (95 casos), provvel (77), possvel (10) e improvvel (18). O diagnstico de doena mitocondrial foi baseado na presena de uma sndrome (18 casos, oito com sndrome de Leigh), de alteraes do DNA mitocondrial e/ou nuclear (nove), de fibras musculares vermelhas rotas (dois) e sobretudo na identificao de dfice enzimtico major da cadeia respiratria (91). A estes critrios majores, associouse uma grande diversidade de critrios minores clnicos, metablicos, enzimticos, histolgicos e genticos. Os dfices enzimticos dos complexos IV (89 doentes) e I (68) foram os mais frequentes, tal como tem sido referido em outras sries. Em 84 doentes (42%) no se obteve um diagnstico etiolgico. Setenta e oito crianas (39%) tiveram o diagnstico de doena mitocondrial. Em 38 casos (19%) chegou-se a um outro diagnstico etiolgico, destacando-se o grupo das outras doenas metablicas e o das infeces virais. Dezassete destas 38 crianas cumpriam critrios de doena mitocondrial definida, que foi considerada secundria. Confirmou-se a grande variabilidade e a no especificidade clnica das doenas mitocondriais na criana, atravs da semelhana entre os vrios grupos de diagnstico na nossa srie. A incidncia e prevalncia destas patologias so estimadas quase sempre em estudos retrospectivos como este. Variam amplamente com a populao em causa e o modo de seleco dos doentes, a extenso da investigao etiolgica e os critrios de diagnstico 3
Captulo 1 - Resumo
aplicados. A incidncia de doena mitocondrial com manifestao clnica na primeira dcada de vida, na Regio Centro, foi estimada em 1/6500 nado-vivos, valor elevado em comparao com outras sries peditricas. Em 2006, a prevalncia pontual destas doenas nesta Regio era de 1/ 18500 habitantes com menos de 10 anos de idade, o que est de acordo com a sua elevada mortalidade na infncia. A abordagem diagnstica das doenas mitocondriais complexa, no existindo uma prova simples que as confirme ou exclua. O aparente peso excessivo dos dfices enzimticos da cadeia respiratria no diagnstico e a pobreza relativa de alteraes histolgicas nos nossos doentes levou anlise detalhada dos estudos mitocondriais realizados (quer os inespecficos, como os nveis de lactato, quer os especficos como a actividade enzimtica). Assim, reclassificou-se os doentes aplicando a escala de Nijmegen, aps excluso dos dados enzimticos e moleculares. Muito mais casos atingiram deste modo um nvel superior de probabilidade diagnstica, o que atesta a validade dos argumentos da suspeita diagnstica e corrobora os resultados do estudo enzimtico neste grupo de crianas. O diagnstico dos nossos doentes baseou-se na clnica e no estudo bioqumico da cadeia respiratria, como seria de esperar numa populao peditrica, em que a maioria dos casos se deve a alteraes do DNA nuclear. Ao contrrio da investigao do DNA mitocondrial, realizada amplamente nos nossos doentes com uma taxa de diagnstico molecular muito baixa, o estudo do DNA nuclear, efectuado em poucos casos, foi frequentemente positivo. necessrio maior investimento nos estudos moleculares, uma vez que as alteraes mitocondriais, tanto enzimticas como morfolgicas, so muitas vezes secundrias. Elaborou-se um fluxograma diagnstico que correlaciona a clnica, as alteraes enzimticas da cadeia respiratria, os achados histolgicos e as alteraes patognicas do DNA mitocondrial e nuclear. Com base nesta anlise e nos recursos disponveis, prope-se uma escala diagnstica, inspirada na de Nijmegen, a aplicar no Hospital Peditrico. Esta baseia-se numa tabela de dupla entrada com os critrios clnico-laboratoriais gerais de Nijmegen e os resultados do estudo enzimtico da cadeia respiratria (ambos escalonados em improvvel, possvel, provvel e definido). A escala proposta mais restritiva em termos de probabilidade de diagnstico final de doena mitocondrial para o caso individual do que a utilizada neste trabalho, reforando-se a importncia da clnica e dos estudos bioqumicos e histolgicos na orientao da investigao molecular, de acordo com o fluxograma diagnstico referido. Conclui-se pela necessidade do reforo da colaborao entre os grupos que investigam estas doenas, no sentido de estabelecer critrios de diagnstico, definio e
classificao uniformes. S definindo a sua prevalncia e histria natural possvel organizar adequadamente o apoio aos doentes e famlias. 4
Captulo 1 - Resumo
SUMMARY
In this study a review of the clinical presentation, diagnosis, prognosis and epidemiological data of childhood mitochondrial respiratory chain disorders (mitocondrial disorders) in the Central Region of Portugal is presented. This analysis was carried out one decade after the introduction of this diagnosis in the Paediatric Hospital of Coimbra, in cooperation with the Laboratory of Biochemical Genetics at the Centre for Neurosciences and Cell Biology of the University of Coimbra. The main objective is to improve clinical evaluation and follow-up of patients, based on our experience and that of other groups. For this purpose, we reviewed the clinical files of all 200 children whose investigation for a mitochondrial disorder included the analysis of muscle (193 patients), liver (41) and/or myocardium (11) samples, over a period of 10 years (1997 to 2006). Thirty five percent of the patients presented the disorder in the neonatal period and 71% in the first year of life. At presentation, 153 children had neurologic and/or muscular symptoms. Throughout evolution, central nervous system dysfunction affected 175 children, frequently in the context of multisystemic involvement (44 patients). Clinical severity was revealed by the high mortality (27%) and disease progression (13%) rates and by the extended etiological investigation performed in most cases. Patients were classified, according to Bernier criteria for mitochondrial disease in children, in four diagnostic probability groups: definite (95 cases), probable (77) possible (10) and unlikely (18). Diagnostic classification was based on the identification of a known mitochondrial syndrome (18 patients, eight with Leigh syndrome), pathogenic mitochondrial DNA and/or nuclear DNA mutations (nine), ragged red fibres (two) and a major respiratory chain enzymatic defect (91). Other minor clinical, metabolic,
enzymatic, histopathological and genetic criteria also contributed to the diagnosis of these patients. Respiratory chain enzymatic complexes IV (89 patients) and I (68) were the most frequently affected, as in other series. In 84 patients (42%), an etiological diagnosis was not achieved. A mitocondrial respiratory chain disorder was established in 78 children (39%). A different diagnosis was found in 38 cases, other metabolic disorders and viral infections being the most commonly identified. Seventeen of these patients fulfilled criteria for definite
mitochondrial disease and were classified as secondary. We have corroborated the great clinical variability and non-specific features of mitochondrial diseases in children through the similarity among the diverse diagnostic groups in our series. Mitochondrial disease incidence and prevalence are usually estimated through
retrospective studies like the present one. Figures vary a lot, depending on the population under study and patient selection, investigation thoroughness, and diagnostic
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Captulo 1 - Resumo
criteria. Incidence of mitochondrial disease in children under 10 years of age in the Central Region of Portugal was 1/ 6500 newborns, which is high compared to other paediatric series. In 2006 the prevalence in this region was 1/ 18500 children under 10 years of age, which confirms the high mortality caused by these disorders in childhood. The diagnostic approach for mitochondrial disorders is complex, since there is no simple test to confirm or exclude them. The apparent over-representation of respiratory chain enzymatic deficits and the relative paucity of histological abnormalities in our patients led us to analyse the mitochondrial studies performed. The patients were reclassified using the Nijmegen scale, after exclusion of enzymatic and molecular genetic data. With this new classification (the clinical and laboratory Nijmegen general criteria), a higher level of diagnostic certainty was obtained, confirming the value of diagnostic suspicion and respiratory chain enzymatic evaluation in this group of children. The diagnosis in our patients was mostly based on the clinical and respiratory chain biochemical studies, as would be expected in a paediatric population, in whom most mitochondrial disorders are caused by mutations in the nuclear DNA. These were investigated in only a few patients in our series and frequently yielded positive findings. As expected, pathogenic mutations in mitochondrial DNA, although broadly investigated, were rarely found. Since mitochondrial abnormalities, both enzymatic and morphological, are frequently secondary to other disease states, it is crucial to carry out in depth molecular genetic studies. A diagnostic chart, which emphasises the correlation of clinical, histological and enzymatic data with pathogenic mitochondrial and nuclear abnormalities, is presented in this work. Taking into account the present study and our resources, a new diagnostic scale based on the Nijmegen group classification, to be used in our Hospital, is proposed. It consists of two groups of data (clinical, metabolic/ imaging and histopathology versus respiratory chain enzymatic activity), both classified as definite, probable, possible and unlikely. The combination of general and enzymatic criteria allows a final patient diagnosis to be made. This new classification, being more restrictive than the one we employed in the present study, strengthens the need to use the entire patients data to decide on the appropriate molecular genetic studies, according to the proposed diagnostic chart. We conclude that there is a great need to reinforce collaboration among the groups investigating mitocondrial disorders, in order to establish uniform diagnostic criteria, a definition and classification. Adequate support to patients and families will not be possible unless the prevalence and natural history of these disorders are well defined.
Captulo 2 - Introduo
CAPTULO 2 INTRODUO
2. INTRODUO
2.1 Razo de ser deste trabalho
Este trabalho o corolrio da minha actividade clnica que desde cedo foi guiada pela circunstncia de ser igualmente Assistente Convidada de Bioqumica da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra. A minha vida acadmica tem-se centrado em transmitir aos alunos de Medicina os conhecimentos de Bioqumica que fui adquirindo ao longo dos anos, coando-os pelo filtro da aplicao clnica. O meu interesse pelas doenas da cadeia respiratria mitocondrial (DCRM) foi suscitado na segunda metade da dcada de 80, ento interna de Pediatria do Hospital Peditrico de Coimbra (HP), ao deparar-me com alguns casos clnicos em que a DCRM era includa no diagnstico diferencial, enfrentando a frustrao pela incapacidade de o provar ou excluir. Recordo em particular dois doentes, actualmente adultos e j transferidos para clnica de adultos, com Sndrome de Leigh. Sabe-se agora que ambos tm mutao no gene SURF1 com dfice do complexo IV da cadeia respiratria mitocondrial (CRM). poca, a hiptese de DCRM era apenas uma conjectura diagnstica. Senti assim a necessidade de pugnar para que o diagnstico deste grupo to importante de patologias metablicas pudesse ser feito no mbito do HP. Encontrava-me numa posio privilegiada de ponte entre a clnica e o laboratrio devido ao cargo de Assistente de Bioqumica. A Professora Doutora Catarina Oliveira dirigia vrias linhas de investigao no mbito das cincias neurolgicas, que inclua algumas reas afins das DCRM, como a patologia do envelhecimento. Reconhecida a necessidade e a possibilidade, foi a Professora Doutora Manuela Grazina fazer um estgio na investigao laboratorial, bioqumica e gentica das DCRM no Servio do Professor A. Munnich, em Paris. Em 1993, a Consulta de Doenas Metablicas, a funcionar no HP desde 1987, deu lugar Unidade de Doenas Metablicas, com uma pediatra e mais tarde duas, dedicadas quase em exclusividade s doenas hereditrias do metabolismo. O reconhecimento da importncia das DCRM na patologia peditrica por parte da direco clnica do HP, associado aos grandes avanos clnicos e tecnolgicos entretanto verificados, permitiu a implantao do diagnstico laboratorial das DCRM no Laboratrio de Bioqumica Gentica do Centro de Neurocincias e Biologia Celular da Universidade de Coimbra (CNC). Em 1996 foram finalmente criadas condies para o estudo funcional da CRM e do cido
desoxirribonucleico mitocondrial (mtDNA) em amostras de tecidos humanos naquele Laboratrio. A resposta regular s solicitaes clnicas comeou a ser dada no ano seguinte, tendo vindo a ser continuamente optimizada. O percurso foi longo e difcil. Trabalhmos muitas vezes em hipoxia e em desacoplamento entre a cadeia respiratria e a fosforilao oxidativa. Posso por isso dizer que se produziu muito lactato e se perdeu
muita energia sob a forma de calor! Mas essa aprendizagem foi extremamente importante e o rendimento energtico j razovel, embora haja ainda muito caminho a percorrer, nomeadamente em termos de estudos de gentica molecular. Quando tenho de comunicar s famlias ou aos doentes a suspeita de DCRM recorro habitualmente a metforas, comparando as clulas dos tecidos e rgos humanos a fbricas especializadas e realando a importncia das centrais energticas que so as mitocndrias no funcionamento daquelas. O tema desenvolvido, comparando a produo de energia a partir dos alimentos a uma fogueira onde se d a sua combusto, com consumo de oxignio e produo de dixido de carbono e gua. Esta imagem, embora primitiva, para bastante o mau til, pois permite da explicar os eventuais bem factores como as
concorrentes
funcionamento
referida
fogueira,
consequncias da resultantes, como o fraco rendimento energtico que atinge os rgos de modo diferente e a acumulao de fumo, traduzido pelo lactato e as espcies reactivas de oxignio (Reactive Oxygen Species - ROS), com os inerentes prejuzos no funcionamento celular. Uma outra imagem que me tem sido til para explicar a fisiopatologia das DCRM a comparao da produo de energia qumica, a sntese do trifosfato de adenosina (ATP), com a de energia nas centrais hidroelctricas: cada um dos degraus da CRM (complexos I, III e IV) corresponderia aos da queda de gua, cuja energia cintica armazenada na barragem. A perturbao do funcionamento do(s) degrau(s) da central hidroelctrica, a incapacidade de a fazer chegar a gua ou de a recolher a jusante, impediria o adequado armazenamento de energia. Por outro lado, a gua desperdiada nessas circunstncias poderia provocar estragos, semelhana da aco das ROS. Esta imagem permitiu explicar a utilizao de coenzimas e varredores de radicais livres nas teraputicas propostas. Recordo em particular a reaco de um casal que tinha feito aturadas pesquisas na internet quando soube que vinha consulta por suspeita de DCRM: aps a explicao, socorrendo-me de um esquema desenhado na hora, as expresses de plena compreenso foram reforadas por um afinal, isto extraordinariamente simples! bvio que as DCRM esto muito longe de ser simples! Espero com este trabalho contribuir para a divulgao entusiasta deste assunto de tanta relevncia clnica, de modo a torn-lo mais inteligvel e interessante e simultaneamente combater o preconceito de que a Bioqumica uma cincia, intragvel e perfeitamente dispensvel numa prtica clnica de qualidade.
10
2.2 Importncia e actualidade do tema
2.2.1
Nota histrica
Nos finais do sculo XVIII, Antoine Lavoisier provou que o oxignio constituinte do ar permitia a combusto de compostos orgnicos. As mitocndrias foram observadas pela primeira vez por citologistas h menos de dois sculos (1840). No primeiro quartel do sculo XX, foram desenvolvidas experincias decisivas sobre mecanismos da respirao e feita a caracterizao da citocromo oxidase (COX). S em meados do sculo XX foi possvel isolar as mitocndrias atravs do fraccionamento subcelular por centrifugao diferencial e demonstrar que so o local da respirao celular, observar a sua estrutura em dupla membrana e relacion-las com o ciclo de Krebs, a -oxidao dos cidos gordos, a CRM e a fosforilao oxidativa. Simultaneamente foi sendo descrita a CRM localizada na membrana interna da mitocndria e a ligao entre o transporte de electres e a sntese de ATP. Na mesma poca, foi demonstrado o duplo controlo genmico em mitocndrias de levedura. (Resenha histrica adaptada de Lestienne, 1999). Em 1961 Peter Mitchell props a teoria quimiosmtica, segundo a qual a transferncia de energia entre o transporte de electres na CRM e a sntese de ATP era mediada por um gradiente electroqumico transmembranar de protes (Mitchell, 1961). Luft e colaboradores (1963) descreveram o primeiro caso de doena mitocondrial (um caso de hipermetabolismo no tiroideu), devido a um defeito no acoplamento entre a CRM e a fosforilao oxidativa. No mesmo ano surgiria o conceito de fibras vermelhas rotas (Ragged Red Fibres - RRF) associadas s doenas mitocondriais (Engel e Cunningham, 1963). Em 1977 Shapira descreveu as doenas mitocondriais como encefalomiopatias e dez anos mais tarde DiMauro publicou uma classificao bioqumica destas doenas (DiMauro et al., 1987). O carcter potencialmente multissistmico das doenas mitocondriais, bem evidente na criana, levou Munnich e o grupo francs a design-las por citopatias mitocondriais (Munnich et al., 1996). Entretanto, foram sendo dados passos decisivos na caracterizao molecular das doenas mitocondriais: em 1981 Sanger e a sua equipa estabeleceram a sequncia completa do mtDNA da placenta humana. Em 1988 foram identificadas as primeiras deleces do mtDNA, heteroplsmicas, em algumas doenas neuromusculares e a principal mutao associada neuropatia ptica hereditria de Leber (Leber Hereditary Optic Neuropathy - LHON) (Holt et al., 1988; Lestienne e Ponsot, 1988; Wallace et al., 1988). Em 1993 antecipava-se o interesse de uma classificao gentica das doenas mitocondriais, embora s dois anos mais tarde tivesse sido relatada a primeira mutao do DNA nuclear (nDNA) (DiMauro e Moraes, 1993; Bourgeron et al., 1995). 11
O conceito actual de doena mitocondrial restringe-se s doenas primrias da fosforilao oxidativa - Oxphos disorders (entendida esta como a cadeia respiratria e a sntese de ATP) ou DCRM (Naviaux, 2004). Apesar de todos os progressos, o diagnstico destas patologias continua a ser difcil na maior parte dos casos, sobretudo na criana. Em Portugal, a Unidade de Biologia Clnica do Instituto de Gentica Mdica Jacinto de Magalhes do Porto (a partir de 1995) e o Laboratrio de Bioqumica Gentica do CNC (desde 1996) prestam servio de diagnstico das DCRM para todo o Pas.
2.2.2
Dimenso do problema
As DCRM so um importante grupo de doenas hereditrias do metabolismo de reconhecimento crescente nas ltimas dcadas. At h poucos anos, eram encaradas como excepcionalmente raras, afectando um a dois indivduos por milho e mesmo incompatveis com a vida ps-natal. Em 1996 as DCRM foram consideradas das doenas hereditrias do metabolismo mais frequentes em Neurologia Peditrica (Zeviani et al., 1996). No mesmo ano, foi realado o facto de as manifestaes extra neurolgicas das DCRM serem muito frequentes na criana (Munnich et al., 1996). Estudos epidemiolgicos recentes tm concludo por uma incidncia entre 1/2000 e 1/7600 nado-vivos, colocando as DCRM ao nvel das doenas hereditrias do
metabolismo mais frequentes, mesmo mais do que a fenilcetonria, cuja incidncia no rastreio em Portugal de 1/10000 (Naviaux, 2004; Schaefer, 2004; Thorburn, 2004; http://www.diagnosticoprecoce.org/). Metade dos casos manifestar-se-ia clinicamente nos primeiros cinco anos de vida e os restantes mais tarde, desde a idade escolar at terceira idade (Naviaux, 2004; Schaefer, 2004). No que diz respeito prevalncia das DCRM, os dados so mais escassos. A prevalncia pontual de DCRM, em doentes diagnosticados entre 1984 e 1998, com idades abaixo dos 16 anos numa populao de 360000 habitantes na Sucia ocidental era de 4,7 /100000 (Darin et al., 2001). A prevalncia de doenas causadas por mutaes do mtDNA numa populao adulta em idade activa, no nordeste de Inglaterra, foi estimada em 6,6 /100000 (Chinnery e Turnbull, 2001). Um estudo epidemiolgico das DCRM no noroeste de Espanha, que envolveu 51 doentes de 0-16 anos, diagnosticados entre 1990 e 2004, revelou uma incidncia de 1,43 casos / ano e uma prevalncia de 8,7 casos / 100000 habitantes/ano (Castro-Gago et al., 2006). de prever que aqueles nmeros venham a aumentar nos prximos anos devido ao maior alerta dos clnicos para estas patologias, expanso da capacidade de diagnstico laboratorial e ao sucessivo reconhecimento de novos quadros clnicos de apresentao e das alteraes genticas subjacentes (Testa et al., 2005). 12
2.2.3
Estrutura e funes energtica e termognica das mitocndrias
Estrutura funcional - Como se ilustra nas figuras 1 e 2, as mitocndrias so organelos intracelulares com funes de extrema importncia, com destaque para a sntese de ATP, a principal fonte intracelular de energia. Neste contexto, a oxidao do piruvato, a -oxidao dos cidos gordos, a cetognese e o ciclo de Krebs, isto , as principais vias metablicas produtoras de energia, processam-se na mitocndria.
Figura 1 - Importncia da mitocndria no metabolismo celular.
As mitocndrias esto envolvidas em muitos outros processos, como a interconverso de aminocidos e a biossntese das porfirinas/do heme e da ureia (Stryer, 1995; Nelson e Cox, 2000). Tm ainda papel relevante na homeostase intra-celular do clcio (com implicaes em muitas vias de sinalizao intracelular), na regulao da libertao pancretica de insulina e na apoptose (Nelson e Cox, 2000; Brookes et al., 2004). As mitocndrias tm sido descritas como organelos de forma oval, bem delimitados, com dupla membrana, em que a membrana interna, de muito maior superfcie do que a externa, pregueada, como ilustrado na figura 3 (Stryer, 1995; Nelson e Cox, 2000). A noo de mitocndrias como organelos independentes e estticos est ultrapassada. O conceito actual de que se trata de uma estrutura citoplasmtica flexvel, em que ocorre fuso, fisso e movimento intracelular de um modo constante e rpido, para o que so necessrias dinaminas e outras protenas em relao estreita com o citoesqueleto. Aquela flexibilidade funcionalmente vantajosa, nomeadamente ao permitir uma distribuio intracelular no homognea e varivel, dependente das necessidades regionais de energia, bem como uma relao de proximidade com o retculo
endoplsmico, o principal local de armazenamento celular de clcio (Brookes et al., 2004; Koopman et al., 2005).
13
Figura 2 - Principais vias de produo de energia - papel da mitocndria.

Abreviaturas: PDH- piruvato-desidrogenase; OAG - -oxidao dos cidos gordos; CRM- cadeia respiratria mitocondrial; NADH- nicotinamida-adenina dinucletido reduzido; FADH2- flavina-adenina dinucletido reduzido; ATP- trifosfato de adenosina.
MIM
MEM Figura 3 - Estrutura da mitocndria - compartimentos mitocondriais.

Abreviaturas: MIM- membrana interna da mitocndria; MEM- membrana externa; espao im- espao intermembranar.
A existncia da dupla membrana permite definir na mitocndria quatro regies: a matriz, a membrana interna, a membrana externa e o espao intermembranar (figura 3). As duas membranas mitocondriais so muito diferentes, tanto na composio como na funo. A membrana externa da mitocndria permevel a grande parte de pequenas molculas e aos ies, devido sua riqueza em porina, protena transmembranar que funciona de poro. A passagem de clcio , no entanto, feita atravs de um transportador: o canal aninico dependente de voltagem da membrana externa da mitocndria (Brookes et al., 2004). A membrana interna da mitocndria contem um fosfolpido especfico, a cardiolipina e extremamente rica em protenas, muitas das quais com aco 14
enzimtica. impermevel a quase todos os ies e molculas polares. O potencial de membrana da membrana interna da mitocndria negativo do lado da matriz e positivo do lado do espao intermembranar (cerca de - 0,15V). Este potencial de membrana muito importante no transporte mitocondrial de biomolculas. Para a travessia de metabolitos atravs da membrana interna da mitocndria existem transportadores e mecanismos de transporte (shuttles) especficos. No caso do dinucletido de nicotinamida e adenina reduzido (NADH) produzido no citosol, por exemplo, durante o processo da gliclise e dada a impermeabilidade da membrana interna da mitocndria ao NADH, a transferncia de equivalentes reduzidos efectua-se atravs de reaces acopladas. Assim, utilizado o shuttle do malato-aspartato, nomeadamente no fgado, rim e corao, que permite a formao de 2,5 molculas de ATP por cada NADH. Este shuttle reversvel e s activado no sentido do transporte de NADH para dentro da mitocndria se a relao NADH/NAD+ for maior no citosol do que na mitocndria. Pode ainda ser usado o shuttle do glicerol-3-fosfato, que ir fornecer os equivalentes reduzidos ao dinucletido de flavina e adenina (FADH) mitocondrial, formando-se FADH2, o qual posteriormente oxidado na CRM. O rendimento energtico menor (1,5 ATP/FADH2), contudo a produo de energia, isto , de ATP, mais clere. Um outro importante exemplo de protena de transporte especfica da membrana interna da mitocndria o transportador de nucletidos da adenina [ATP-adenina dinucletido (ADP) translocase (ANT1)]: a concentrao mitocondrial de ADP um factor limitante da sntese de ATP. (Stryer, 1995; Nelson e Cox, 2000).
Funo energtica - Dizer que as mitocndrias so as centrais energticas das clulas um lugar comum. De entre as vias metablicas orientadas mais especificamente para a produo de energia, apenas a oxidao da glicose a piruvato extramitocondrial (figuras 1 e 2). A oxidao completa da glicose d origem a 30 a 32 molculas de ATP, 25 a 27 das quais so produzidas na mitocndria (Stryer, 1995). O sistema de fosforilao oxidativa ou CRM em sentido lato, composto por cinco complexos enzimticos multiprotecos (I-V) localizados na membrana interna da mitocndria e dois transportadores mveis de electres, coenzima Q (CoQ) e citocromo c, a via comum final para a produo de energia intracelular, seja ela derivada dos glcidos, lpidos ou prtidos (figura 2). A oxidao das molculas produtoras de energia (glicose, cidos gordos e esqueleto carbonado dos aminocidos) est a cargo de oxidoreductases, enzimas que associam a oxidao dos substratos reduo de coenzimas (NAD+ e FADH). Estas sero subsequentemente reoxidadas na CRM, sendo os electres e protes transferidos em cascata, de acordo com o potencial redox dos substratos, at ao oxignio molecular, com formao de ATP e gua. O fluxo de electres do NADH e do FADH2 at ao oxignio molecular promovido por uma diferena de potencial de 1,14V e de 0,88 volts, respectivamente (potencial de 15
reduo ou redox, E0: NADH -0,32; FADH -0,06; O2 0,82V). Processa-se atravs dos complexos proteicos I a IV da CRM e dos dois transportadores, como j referido. O NADH reoxidado a nvel do complexo I (NADH desidrogenase), que transfere os electres para o complexo III (citocromo reductase), via CoQ. Da, os electres transitam para o citocromo c e o complexo IV ou COX at ao oxignio. O FADH2 cede os seus electres directamente CoQ. O fluxo de electres atravs da CRM um processo exergnico, isto , os electres perdem energia livre em cada transferncia, sendo esta perda suficientemente importante a nvel dos complexos I, III e IV, de modo a promover a translocao de protes da matriz para o espao intermembranar. Este movimento cria um gradiente de [H+], com alterao do potencial de membrana, acentuando a sua negatividade. O retorno dos H+ matriz o motor da sntese de ATP, levada a cabo pelo complexo V, ATP sintase. Assim, na fosforilao oxidativa a fora electromotriz libertada pela oxidao das macromolculas convertida, atravs de um fluxo/refluxo de protes (fora protonomotriz), em ligaes fosfato de alta energia (Nelson e Cox, 2000). Esta interdependncia entre a transferncia de electres provenientes da oxidao dos substratos a nvel da CRM e a sntese de ATP, designada por acoplamento foi postulada em 1961 por Mitchell, como anteriormente referido (Mitchell, 1961). A oxidao da maior parte das molculas bioenergticas gera NADH, que ao ser oxidado na CRM, produz cerca de 2,5 molculas de ATP/molcula. Em alguns passos da oxidao dos cidos gordos e de outros cidos orgnicos h reduo do FAD (em vez do NAD), integrado em flavoprotenas transportadoras de electres que incluem o complexo II. A oxidao de uma molcula de FADH2 leva produo de 1,5 molculas de ATP. Em resumo, a CRM constituda por trs bombas de protes (complexos I, III e IV) ligadas por dois transportadores mveis de electres (CoQ e o citocromo c), associadas a flavoprotenas transportadoras de electres (que incluem o complexo II) e ATP sintase, complexo V (figura 4). O complexo I (NADH desidrogenase ou NADH-Q reductase) o maior complexo da CRM. constitudo por 46 subunidades, sete das quais codificados pelo mtDNA (figura 5). Tem a forma de um L (ou de bota): a parte horizontal, hidrofbica, embebida na membrana interna da mitocndria, contm as subunidades codificadas pelo mtDNA (ND1 a ND6 e ND4L) e a parte vertical, hidroflica, projecta-se na matriz (Janssen et al., 2006b). Ao seu nvel, os electres do NADH so transferidos para um grupo prosttico de flavina-mononucletido (FMN) e da para uma srie de ncleos ferro-enxofre, onde o ferro alterna entre as formas oxidada (Fe3+) e reduzida (Fe2+). O fluxo de dois electres do NADH para CoQ atravs do complexo I leva sada de quatro H+ da matriz para o espao intermembranar. O complexo II (ou succinato-CoQ reductase), de que faz parte a succinato
desidrogenase, enzima do ciclo de Krebs, catalisa a oxidao do succinato a fumarato com reduo do seu grupo prosttico, FAD. Os electres do FADH2 so transferidos para 16
centros Fe-S e da para a CoQ. constitudo por quatro subunidades, todas codificadas pelo nDNA (figura 5).
Figura 4 - Esquema funcional da cadeia respiratria mitocondrial.

Est indicado o fluxo de electres do NADH atravs do complexo I e do FADH2 do complexo II e outras flavoprotenas para a coenzima Q e desta para o complexo III. Os electres passam do complexo III ao IV atravs do citocromo c e finalmente ao oxignio. O gradiente electroqumico criado pela transferncia de protes para o espao intermembranar (a nvel dos complexos I, III e IV) promove a na sntese de ATP pelo complexo V, formando-se gua. Abreviaturas: MIM -membrana interna da mitocndria; EIM- espao intermembranar; MEM- membrana externa da mitocndria; CoQ- Coenzima Q; Cytb- citocromo b.
(Adaptado de DiMauro e Schon, 2006)
A glicerol-fosfato desidrogenase e as desidrogenases dos cidos gordos apresentam o mesmo mecanismo de transferncia de electres para a CRM. Tanto o complexo II, como as outras flavoprotenas que transferem electres do FADH2 para a CoQ no so bombas de protes porque a variao de energia livre da reaco pequena. A ubiquinona, CoQ10 ou CoQ, de presena ubiquitria nas membranas celulares, um derivado de quinona, com uma longa cauda isoprenide (de 10 unidades), que a torna praticamente apolar e lhe permite difundir rapidamente na zona central da membrana interna da mitocndria. Varia entre a forma oxidada, ubiquinona e a reduzida, ubiquinol (CoQH2), transportando dois electres por molcula. O complexo III (ubiquinol - citocromo reductase ou complexo citocromo bc1) constitudo por 11 polipeptdeos, um dos quais de sntese mitocondrial (citocromo b) (figura 5). Da composio do complexo III fazem parte dois tipos de citocromos (b e c1) e uma protena Fe-S. Os electres so transferidos para o ncleo Fe-S e depois para os citocromos c1 e b. O fluxo de um par de electres atravs deste complexo leva extraco/sada de dois H+ da matriz. 17
O citocromo c uma protena hidrossolvel, constituinte de uma vasta famlia de protenas que contm heme e so transportadores de electres (um por molcula), variando o ferro hmico entre as formas Fe2+ e Fe3+. O complexo IV (COX) formado por 13 componentes proteicos, trs dos quais codificados pelo mtDNA (subunidades I, II e III) (figura 5). Catalisa a transferncia de quatro electres do citocromo c para o O2, reduzindo-o a gua. As subunidades mitocondriais da COX contm os seguintes centros redox envolvidos na transferncia de protes: 2 grupos heme (a e a3) e dois ies cobre (CuA e CuB). Est bem estabelecido que o fluxo de electres efectuado do citocromo c para o centro CuA, seguindo para o heme a, o centro heme a3-CuB e finalmente para o oxignio. Quatro protes so translocados para o lado citoslico da membrana interna da mitocndria por cada par de electres que flui atravs da COX. O complexo V (ATP sintase, F0-F1 ATPase) constitudo por 16 peptdeos, sendo dois de sntese mitocondrial (ATPase6 e ATPase9) (figura 5). Apresenta trs pores: F0, um canal de protes (a unidade condutora de protes), hidrofbica, que mergulha na membrana interna da mitocndria, F1, a unidade cataltica, hidroflica, que sintetiza ATP a partir de ADP e ortofosfato e duas hastes, uma central e outra lateral, que une F0 e F1. As unidades codificadas pelo mtDNA (ATPase 6 e ATPase 8) localizam-se na poro F0. A sntese de ATP associa-se dissipao do gradiente protnico criado pela CRM. A reaco reversvel, podendo haver hidrlise de ATP com utilizao da energia libertada na translocao de protes para o espao intermembranar. A sntese de ATP, a partir de difosfato de adenosina (ADP) e ortofosfato ligados a F1, um processo que no consome energia por si mesmo. O papel do fluxo protnico atravs do complexo V seria o de libertar o ATP da enzima e no propriamente a sua sntese. O principal mecanismo regulador da actividade da ATP sintase a concentrao do substrato (ADP). A enzima pode ser estimulada ou inibida de acordo com as necessidades energticas da clula (Das AM, 2003). Durante a privao de O2 ou em outras condies em que o potencial de membrana diminua, a ATP sintase pode mant-lo custa da hidrlise de ATP associada a transporte de protes para o espao intermembranar. Este mecanismo tem a vantagem de manter o potencial elctrico necessrio nomeadamente importao mitocondrial de protenas. O sistema limitado pela protena inibidora (IF1), que se liga a F1 a valores baixos de pH na matriz mitocondrial, inactivando-o. Os complexos da CRM organizam-se em estruturas supramoleculares, supercomplexos, tambm designados por respirassomas. Para o sistema de fosforilao oxidativa humano foram propostos dois supercomplexos: o maior, formado por um complexo I, dois complexos III e quatro complexos IV (I1, III2 IV4) e o outro constitudo por dois complexos III e quatro complexos IV (III2 IV4). Aqueles supercomplexos acompanharse-iam de um complexo II monomrico e de um complexo V dimrico, na proporo de 2:1:3:3. A formao dos supercomplexos teria vantagens funcionais, nomeadamente o 18
direccionamento dos substratos, evitando a competio com outras enzimas, o reforo cataltico, diminuindo o tempo de difuso dos substratos, o sequestro de ROS, como a semi-ubiquinona, e a estabilizao dos complexos individuais (Schgger, 2002). A maior parte do ATP produzido pela ATP sintase transportada para fora da mitocndria atravs do ANT1, o transportador de nucletidos de adenina. A
disponibilidade de ADP essencial para o funcionamento da CRM /fosforilao oxidativa, sendo o quociente [ADP] / [ATP] um dos principais factores de controlo da sntese de ATP. O ATP tem uma semi-vida intracelular muito curta, sendo imediatamente utilizado para as funes celulares dependentes de energia, ou armazenado sob a forma de fosfocreatina. O ATP transfere para a creatina a ligao fosfato de alta energia, atravs da reaco catalisada pela creatina cinase (CK). O sistema da creatina actua como uma reserva de energia de mobilizao rpida em todas as clulas, nomeadamente a nvel cerebral e muscular, atravs da reaco inversa, tambm catalisada pela CK. As clulas captam a creatina circulante atravs de um transportador especfico e armazenam-na sob a forma de fosfocreatina, por aco da CK e ATP. Este processo extremamente importante no msculo, onde se encontra cerca de 94% da creatina total (Wyss e Kaddurah-Daouk, 2000).
Funo termognica - Uma das mltiplas funes da mitocndria a manuteno da temperatura corporal nos animais endotrmicos, como o homem. A produo de calor deve-se ao desacoplamento entre a CRM e a sntese de ATP por aco de uma protena de transporte de protes da membrana interna da mitocndria, a termogenina ou UCP1 (Uncoupling protein1). A UCP1 promove a reentrada dos protes na matriz mitocondrial a partir do espao intermembranar, permitindo que a energia armazenada pelas bombas de protes se dissipe sob a forma de calor, em resposta liplise induzida pela noradrenalina. A UCP1 pertence a uma famlia da qual se conhecem mais quatro elementos (UCP2-5). O papel termognico est bem estabelecido apenas para a UCP1 (Jezek et al., 2004; Erlanson-Albertsson, 2003). O tecido adiposo castanho, especializado na termognese, muito vascularizado e rico em mitocndrias e em UCP1. Nos recmnascidos constitui 5% da massa corporal e extremamente importante na adaptao vida extra-uterina e na resistncia hipotermia. praticamente inexistente nos adultos (Symonds et al., 2003; Klingenspor, 2003). A dissipao de energia sob a forma de calor ocorre em todas as clulas, nomeadamente na adaptao ao frio, mas a mediao molecular da mesma controversa, j que a UCP1 se expressa apenas no tecido adiposo castanho (Hagen e Vidal-Puig, 2002; Andrews et al., 2005). O desacoplamento entre a CRM e a fosforilao oxidativa ocorre igualmente com a ruptura da membrana interna da mitocndria provocada por um detergente ou aco mecnica. O mesmo acontece (com manuteno da estrutura mitocondrial) por aco de substncias lipossolveis que, como o 2,4-dinitrofenol (DNP) e outros compostos 19
aromticos acdicos (FCCP carbonilcianeto de p-trifluorometoxi-fenilhidrazona e m-CCPcarbonilcianeto de membrana interna m-clorofenilhidrazona), podem da mitocndria (Stryer, transportar protes Tambm atravs da como a
1995).
ionforos
valinomicina promovem o desacoplamento, ao dissiparem o potencial de membrana da membrana interna da mitocndria. Estas substncias desacopladoras so muito
importantes no estudo laboratorial das funes mitocondriais (Rustin et al., 1994).
2.2.4
Dupla regulao gentica da mitocndria
Ao contrrio de todos os outros organelos celulares, as mitocndrias tm uma dupla regulao gentica, uma vez que contm cido desoxirribonucleico prprio, o mtDNA. Como se ilustra na figura 5, a participao deste muito pequena em termos quantitativos (13 polipeptdeos codificados pelo mtDNA contra mais de 1000 protenas diferentes de origem nuclear). No entanto, o seu papel extremamente importante (DiMauro 2006c; MITOMAP, 2008). A presena intracelular do mtDNA o mais importante argumento a favor da teoria endosimbitica, isto , de que as mitocndrias descenderiam de bactrias aerbias que colonizaram clulas eucariotas, glicolticas, h 1,5 billies de anos (Ruiz-Pesini et al., 2006). Os genes nucleares relacionados com as mitocndrias podem assim subdividir-se em quatro grupos: os que codificam componentes estruturais da CRM, os que codificam factores de assembling dos complexos enzimticos da CRM; os responsveis pela estabilidade do mtDNA e os envolvidos na biognese da mitocndria (Zeviani e Carelli, 2003). Quase todas as protenas mitocondriais so codificadas pelo nDNA, sintetizadas no citosol como protenas precursoras e subsequentemente importadas para os vrios locais das mitocndrias. A importao mitocondrial um processo complexo dependente de translocases (TOM- Translocase of the Outer Membrane e TIM- Translocase of the Inner Membrane) e de outros complexos proteicos envolvidos na topologia das protenas dentro da mitocndria (Chacinska e Rehling, 2004). As protenas precursoras contm, na maior parte dos casos, sequncias de sinalizao, clivveis por peptidases. So acompanhadas no seu percurso por factores citoslicos e mitocondriais, chaperones, que impedem a sua agregao e mantm a sua conformao proteica (ex: Hsp70 chaperon citoslico ou protena do choque trmico e a MSF - mitocondrial importing stimulating factor). As referidas sequncias de sinalizao interagem com receptores mitocondriais especficos, de modo a que as protenas sejam translocadas para dentro da mitocndria (Neupert, 1997; Truscott et al, 2003). A translocao dependente do potencial de membrana mitocondrial (Baker et al., 2007).
20
Figura 5 - Dupla regulao gentica da mitocndria

Esquema do mtDNA e distribuio dos genes codificantes das subunidades dos complexos da CRM. Os genes que codificam protenas, sete subunidades do complexo I (ND), trs subunidades da citocromo oxidase (COX), o citocromo b, subunidade do complexo III (Cyt b) e duas subunidades da ATP sintase (6 e 8) esto representados a sombreados variados. Dos genes que codificam componentes envolvidos na sntese proteica, os 22 genes do RNA de transferncia mostramse branco e os RNAs ribossmicos 12S e 16S esto representados a ponteado claro. A regio da ansa D (D-loop) controla a iniciao da replicao e transcrio do mtDNA.
(adaptado de MITOMAP, 2008 e de DiMauro e Schon, 2006)
Para alm das subunidades dos complexos enzimticos do sistema da fosforilao oxidativa, dos chaperones e dos transportadores, o ncleo contribui com muitos outros agentes para o normal funcionamento da mitocndria, nomeadamente factores de montagem (assembling factors), como as protenas codificadas pelo NDUFAF1 e pelo SURF1 para os complexos I e IV, respectivamente (Prez-Martnez et al., 2008; Fernndez-Vizarra et al., 2009). A replicao e a manuteno do mtDNA esto igualmente dependentes do nDNA, uma vez que os factores que as controlam so codificados por genes nucleares (DGUOK, POLG1, Twinkle, ANT1). A comunicao entre os dois genomas um processo complexo e ainda mal elucidado (Spinazzola e Zeviani 2005). Como ilustrado na figura 5, o mtDNA humano uma molcula dupla, circular, de 16,6 kilobases, com duas cadeias complementares: leve e pesada, L e H, respectivamente de light strand e de heavy strand. Contm 37 genes que codificam 13 polipeptdeos constituintes dos complexos I (ND1-6, ND4L), III (citocromo b), IV (COX I-III) e V 21
(ATPase 6 e 8) da CRM, dois cidos ribonucleicos (RNA) ribossmicos e 22 RNA de transferncia para a sua expresso. Todas as sequncias codificantes so contnuas, sem separao por intres (Zeviani e Carelli, 2003). Possui ainda uma regio de 1121pb que regula a transcrio e replicao do mtDNA, a ansa D (DiMauro e Schon, 2006; RuizPesini et al., 2006). O mtDNA corresponde a cerca de 1% do DNA total. As mitocndrias so poliplides, contendo 2-10 cpias de mtDNA por organelo. Cada clula contm centenas de mitocndrias e consequentemente at vrios milhares de cpias de mtDNA. Num indivduo saudvel, todas as cpias do mtDNA so idnticas, situao referida como homoplasmia (Schapira, 2006). A diviso mitocondrial e a replicao do mtDNA so independentes do ciclo celular. Na diviso celular vai assim haver segregao mittica, isto , cada clula filha receber um lote varivel de mitocndrias e de cpias do mtDNA (figura 6). A replicao do mtDNA inicia-se em dois locais distintos, primeiro a nvel da cadeia H, mais precisamente na regio OH (origem da cadeia H) designada por ansa D (D-loop: displacement loop), no sentido dos ponteiros do relgio. D-se depois a replicao da cadeia L, em sentido contrrio. A transcrio feita em bloco e no de cada gene separadamente, como acontece com o nDNA, isto , todos os genes so sintetizados inicialmente como dois transcritos gigantes policistrnicos, um codificado pela cadeia H e outro pela cadeia L. Os mtRNA mensageiros e de transferncia so posteriormente clivados e modificados de modo a promoverem a sntese dos peptdeos codificados pelo mtDNA. O cdigo gentico mitocondrial diferente do nuclear. Ao longo da evoluo simbitica, o mtDNA (das bactrias primitivas) foi sendo englobado pelo ncleo, pelo que a maioria dos genes mitocondriais est presente no ncleo. Essa transferncia ainda continua, mas as alteraes ao cdigo gentico do mtDNA (que surgiram antes da linhagem fungoanimal) tornam as transferncias mais recentes ininteligveis para a sntese proteica citoslica. Estes genes so designados por pseudogenes (NUMTs- Nuclear mitochondrial DNA sequences) e localizam-se tipicamente em regies no codificantes do nDNA. A existncia de pseudogenes mitocondriais no ncleo levanta questes prticas porque, se inadvertidamente amplificados por polymerase chain reaction (PCR) e sequenciados, as suas variantes podem ser tomadas por mutaes do mtDNA (Woischnik e Moraes, 2002). O mtDNA tem uma taxa de mutao dez vezes superior ao nDNA (Finisterer, 2006). Pensa-se que a elevada taxa de mutaes (polimorfismos mutaes adaptativas e neutras - e mutaes patognicas) seja devida sensibilidade do mtDNA leso oxidativa por ROS formadas na matriz como subproduto da fosforilao oxidativa. Ao contrrio do nDNA, o mtDNA no est protegido por histonas, no sofre recombinao durante a meiose, nem teria mecanismos de reparao eficazes (Scheffler, 2001). No entanto, foi recentemente demonstrado que as mitocndrias de mamfero tm 22
mecanismos de reparao do DNA semelhantes aos nucleares (Mason e Lightowlers, 2003). De qualquer modo, o mtDNA altamente polimrfico, com vrias diferenas de sequncia entre indivduos do mesmo grupo tnico e ainda mais entre grupos tnicos diferentes. Estas diferenas permitem definir hapltipos do mtDNA, baseados em padres especficos de polimorfismos. Os hapltipos parecem influenciar o processo de
envelhecimento, a susceptibilidade a determinadas doenas e mesmo a expresso clnica de algumas mutaes do mtDNA. O seu conhecimento possibilita seguir movimentos migratrios de grupos tnicos (Wallace et al, 1999; Pereira et al., 2005). Em caso de mutao do mtDNA podem coexistir na mesma clula cpias de mtDNA normal e mutadas (heteroplasmia). A segregao mittica pode no ser completamente aleatria e haver uma seleco activa que elimine ou concentre o mtDNA mutante: haver assim dfice da CRM e fosforilao oxidativa nuns tecidos e no noutros. Para que um rgo ou tecido apresente alteraes funcionais significativas dever atingir um certo nvel de mtDNA mutado, o chamado efeito limiar (figura 6).
Figura 6 - Segregao mittica das mitocndrias durante a diviso celular.

A segregao mittica das mitocndrias pelas clulas filhas produz uma grande variedade de gentipos, desde quase todas normais at quase todas mutadas. A partir de um certo nvel de cpias de mtDNA mutado surgem manifestaes clnicas (efeito limiar).
(adaptado de Shoffner e Wallace, 1995)
23
Aquele efeito depender da mutao e da dependncia energtica do tecido em causa, bem como da fase de desenvolvimento do indivduo e do ambiente gentico (mitocondrial e nuclear) e somtico (Shoffner e Wallace, 1995). As mitocndrias so herdadas exclusivamente da me. Uma mutao do mtDNA ser transmitida a todos os filhos e filhas, mas s estas a passaro aos descendentes. Embora as mitocndrias paternas entrem no ovcito durante a fertilizao, so selectiva e precocemente destrudas (Sutovsky et al., 2004). Durante a ovognese verifica-se um efeito de gargalo na medida em que apenas cerca de 1% das mitocndrias maternas do ovcito passam para o embrio inicial, o que se designa por gargalo gentico. Destas, s as centrais faro parte do embrio: gargalo somtico. Assim, a probabilidade de transmitir uma mutao do mtDNA de um nico genoma mitocondrial baixa. O grau de transmisso duma alterao do mtDNA para a gerao seguinte imprevisvel (Thorburn e Dahl, 2001).
2.2.5
Stress oxidativo, apoptose e envelhecimento
Stress oxidativo e mitocndria - Responsveis por cerca de 90% do consumo celular de oxignio, as mitocndrias so uma importante fonte intracelular de ROS, estimandose que, em condies fisiolgicas, at 0,1 a 5% do oxignio consumido seja incompletamente oxidado e convertido em ROS (Kang e Hamasaki, 2005). A reduo do oxignio passa por vrios intermedirios altamente reactivos. O radical livre de oxignio a formar-se primeiro na mitocndria o anio superxido (O2.-) que se transforma em perxido de hidrognio (H2O2) espontaneamente ou por aco da superxido-dismutase (SOD). O H2O2, na presena de ies metlicos como o ferro, pode transformar-se em radicais hidroxilo (OH.) pela reaco de Fenton. Dentro da mitocndria ser pouco provvel que tal acontea devido ligao dos ies por protenas da matriz (Brookes 2004). Os principais locais de produo de OH. na mitocndria so os complexos I e III. Os perxidos lipdicos, formas aciladas do H2O2, so um outro importante grupo de ROS produzidas na mitocndria, ocorrendo a nvel dos complexos I e III. A peroxidao lipdica iniciada pela desprotonao de fosfolpidos insaturados pelo Fe2+ livre, previamente reduzido a nvel da CRM e no pelo O2- (Kang e Hamasaki, 2005). A produo de O2- e de perxidos lipdicos iniciada pela libertao de electres da CRM, o que ocorre com maior intensidade quando a CRM est num estado muito reduzido, tal como acontece quando bloqueada (Kang e Hamasaki, 2005). O potencial de membrana um importante modulador da produo de ROS. Por outro lado, as ROS podem estimular o desacoplamento mitocondrial. As ROS tm sido consideradas subprodutos da respirao celular responsveis pela leso oxidativa de macromolculas como os cidos nuclecos, as protenas e os lpidos, 24
contribuindo para o envelhecimento (Harman, 2003). O mtDNA, que se replica continuamente, mesmo em clulas diferenciadas ps-mitticas como os neurnios e os micitos, um alvo importante da leso pelas ROS. Estas levam rotura das cadeias e modificaes das bases, entre as quais se destaca a guanina, que transformada em 8oxoguanina e originam vrias mutaes (A:T Foi demonstrado que o O2C:G e C:G T:A).
externo pode gerar potencial de membrana e a sntese de
ATP, atravs da reduo do citocromo c do espao intermembranar, que passaria os electres ao complexo IV, constituindo assim a mitocndria um local de varrimento de ROS. Tem igualmente sido reconhecida a importncia das ROS na sinalizao celular, em processos como a proliferao celular e a apoptose, entre outros (Brookes, 2004).
Papel na apoptose e envelhecimento - A apoptose uma forma de morte celular programada, diferente da necrose, til para remover clulas indesejadas ou lesadas. Trata-se de um processo que envolve a mitocndria e o retculo endoplsmico e em que um grupo de cistena-proteases (caspases) activado atravs de uma cascata de sinalizao que leva degradao do nDNA e morte celular. Estudos em mitocndrias isoladas demonstraram que em condies de baixa concentrao de ATP, elevao do clcio citoslico ou aumento da produo de ROS, o ANT1 da membrana interna da mitocndria e outras protenas da membrana externa da mitocndria, como o canal aninico dependente de voltagem (VDAC) e o receptor perifrico de benzodiazepinas, sofrem uma alterao conformacional, transformando-se no poro de transio
mitocondrial (MTP-mitochondrial transition pore), zona de contacto e abertura entre as membranas interna e externa da mitocndria. Este poro, cuja formao pode ser activada e inibida por um grande nmero de estmulos, permite a dissipao do potencial de membrana e do gradiente de pH, a libertao do citocromo c e de outros factores promotores da morte celular, como o factor de iniciao da apoptose (AIF-Apoptosis Initiating Factor) e a DNAse activada por caspase (CAD- Caspase Activated DNAse), para o citosol. Com a abertura do referido poro, os ies equilibram-se entre a mitocndria e o citosol, causando intumescncia da mitocndria e consequente ruptura da membrana externa da mitocndria (Peter et al., 1997; Crompton, 1999; Hengartner, 2000; Raha e Robinson, 2001; Brookes et al., 2004). A adaptao da funo mitocondrial vai ocorrendo constantemente ao longo do desenvolvimento. Os embries humanos esto adaptados produo glicoltica, anaerbia, de energia, adquirindo gradualmente a capacidade de metabolismo aerbio, oxidativo, durante o desenvolvimento pr e ps implantao (Clough, 1985). No desenvolvimento pr-natal podem distinguir-se trs fases: fase ovrica, glicoltica, correspondente biognese das mitocndrias; fase uterina, oxidativa, em que no embrio h uma mudana do metabolismo anaerbio para o aerbio (acompanhada pela expresso dos genes codificados pelo mtDNA e declnio dos genes glicolticos) e fase 25
perinatal, com a replicao do mtDNA, relacionada com o aumento dos nveis de oxignio associados ao nascimento (Knudsen e Green, 2004). A mitocndria tem sido largamente implicada no processo de envelhecimento, pelo facto de ser o maior produtor de ROS, envolvidos como intermedirios ou subprodutos da apoptose. costume dizer-se que com a idade vamos ficando enferrujados. A sabedoria popular postulou h muito a teoria mitocondrial do envelhecimento! Esto bem documentados o papel do ferro na produo de ROS e a acumulao de mutaes do mtDNA com o envelhecimento, bem como a implicao patognica das mitocndrias em doenas com ele associadas (Grazina et al., 2006; Kujoth et al., 2006).
26
2.3 As doenas da cadeia respiratria mitocondrial
2.3.1
Definio e manifestaes clnicas
O conceito de DCRM, citopatias mitocondriais ou doenas da fosforilao oxidativa tem limites difceis de definir devido grande variabilidade de quadros clnicos, no uniformidade de critrios de diagnstico e existncia de frequentes alteraes secundrias da fosforilao oxidativa. Muitas outras doenas e frmacos ou txicos podem cursar com ou estar na origem de alteraes secundrias da fosforilao oxidativa e at do mtDNA (Maurer e Moller, 1997; Modica-Napolitano et al., 2003; Haugaard et al., 2005). O mesmo tipo de alteraes pode igualmente contribuir para a patognese de doenas polignicas como a diabetes mellitus e outras (Wardell et al., 2003; Brealey et al., 2002; Kang et al., 2005; Enns et al., 2003; Svistunenko et al., 2006; Grazina et al., 2006). Nesta linha, em 2000, Leonard e Shapira subdividiram as DCRM em duas classes: I e II. A classe I engloba as doenas resultantes de mutaes do mtDNA ou do nDNA que codificam subunidades dos complexos enzimticos da CRM e da fosforilao oxidativa, isto , doenas congnitas; as doenas da classe II resultam da mutao de genes nucleares que codificam outras protenas mitocondriais e/ou de toxinas (exgenas ou endgenas) e so predominantemente neurodegenerativas (Leonard e Schapira, 2000). Mesmo o conceito de doena mitocondrial como erro inato do metabolismo ainda lato, uma vez que engloba muitas outras doenas monognicas, incluindo outros defeitos enzimticos mitocondriais que afectam indirectamente a fosforilao oxidativa (Schapira 2002; Enns et al., 2003; Schwab et al., 2006). As doenas primrias da fosforilao oxidativa, que se designaro por DCRM, podem ser definidas como doenas monognicas da CRM devidas a uma mutao patognica bem definida do mtDNA ou nDNA ou a um dfice significativo da CRM de presumvel base monognica, isto , primrio e no secundrio a uma outra doena (Naviaux, 2004; Schaefer, 2004). Neste contexto, a ataxia de Friedreich, que se tem situado numa zona fronteira da definio, deveria ser considerada uma DCRM, uma vez que a alterao no gene da frataxina afecta a estrutura e funo dos complexos I, II e III (DiMauro e Rustin, 2009). O primeiro doente com uma doena da fosforilao oxidativa foi descrito por Luft em 1963, embora j anteriormente fossem conhecidos casos de acidose lctica hereditria. Curiosamente, tratava-se de um caso de hipermetabolismo causado por um
desacoplamento entre o transporte de electres e a sntese de ATP (Luft et al., 1962). Apesar de s estar referido na literatura apenas mais um caso de doena de Luft, a investigao do caso inicial um marco histrico no reconhecimento das DCRM (DiMauro et al., 1976). 27
Inicialmente consideradas miopatias ou encefalomiopatias, as DCRM podem originar qualquer sintoma, em qualquer rgo ou tecido, em qualquer idade (Shy e Gonatas, 1964; Willis et al., 2000; McFarland et al., 2002; Barclay et al., 2005; Munnich, 2006). Apesar de afectarem predominantemente os rgos de maior consumo energtico como o sistema nervoso (central e perifrico) e o msculo (incluindo o cardaco), as DCRM podem atingir o sistema hematopoitico, o fgado e o pncreas, entre outros, isoladamente ou em associao, originando quadros multissistmicos. Ao contrrio da maior parte das outras doenas hereditrias do metabolismo, as DCRM tm muito frequentemente incio na idade adulta (Naviaux, 2004).
Clnica multissistmica - As DCRM so intrinsecamente doenas multissistmicas, dado a universalidade do uso do ATP nos sistemas biolgicos e o facto de mais de 95% do ATP ser produzido na mitocndria (Figura 7). Manifestam-se frequentemente nos primeiros tempos de vida, incluindo o perodo pr-natal, devido s elevadas necessidades energticas decorrentes do crescimento (Sue et al., 1999). Traduzem-se por alteraes musculares, neurolgicas, endocrinolgicas, gastrointestinais, hematolgicas, renais e/ou psiquitricas (Munnich et al., 2001, Hirano et al., 2006). Um dos dados orientadores do diagnstico clnico o envolvimento de um nmero crescente de rgos durante a evoluo (Almeida et al., 2004). Munnich sistematiza a clnica das DCRM em subgrupos, que se sobrepem: neurolgica, muscular, cardaca, renal, nutricional, heptica, endcrina, hematolgica, otolgica, oftalmolgica, dermatolgica e morfolgica (Munnich et al., 2001).
Clnica neuro-psiquitrica - Nas DCRM o atingimento do sistema nervoso central (SNC) e/ou perifrico frequente no incio da doena e quase constante nos estdios finais de evoluo. Pode ocorrer logo no perodo neonatal com um quadro de encefalopatia aguda com acidose lctica, indistinguvel da sepsis, por vezes com sinais de sofrimento pr-natal que dificultam o parto (Garcia et al., 2005). A clnica de encefalopatia aguda ou crnica pode ter incio aps um perodo varivel de
neurodesenvolvimento normal ou quase normal e traduzir-se por regresso psicomotora, com ou sem convulses (Diogo et al., 2005). Praticamente todos os sinais de sofrimento do SNC podem estar presentes em vrias combinaes, tais como: hipotonia, sinais do tronco cerebral (oftalmoplegia, cerebelosa, alterao dos movimentos oculares e apneias ou
recorrentes),
ataxia
convulses,
mioclonias,
sndrome
piramidal
extrapiramidal e neuropatia perifrica (Pereira et al., 2007). O atingimento do sistema nervoso perifrico seria particularmente frequente na apresentao no adulto (Fisnterer et al., 2001; Hays et al., 2006). As manifestaes clnicas das DCRM abrangem igualmente alteraes do foro psiquitrico/ neuropsicolgico como depresso, alteraes da concentrao e do 28
raciocnio, alucinaes, alteraes da personalidade, autismo, atraso mental, regresso do neurodesenvolvimento e demncia, entre outros (Turconi et al., 1999; Graf et al., 2000; Jaksch et al., 2001; Oliveira et al., 2005; Finsterer, 2006; DiMauro et al., 2006a). frequente haver prostrao e agravamento do quadro neurolgico durante as intercorrncias infecciosas, nomeadamente nas crianas (Wolf e Smeitink, 2002).
Clnica muscular - As formas miopticas da DCRM so caracterizadas por fraqueza progressiva e hipotonia, com intolerncia ao esforo e atrofia muscular. O lactato plasmtico normal ou moderadamente elevado, mas pode aumentar significativamente com o exerccio fsico (Artuch et al., 1998b; Finsterer e Milvay, 2002). O aumento da CK no tpico das miopatias mitocondriais, ocorrendo ocasionalmente (Spinazzola e Zeviani, 2005). Nos primeiros meses, o envolvimento muscular pode manifestar-se por uma hipotonia global, que contrasta com a aparente normalidade das restantes aquisies do neurodesenvolvimento e que pode ser difcil de distinguir clinicamente da hipotonia de origem central (Grazina et al., 1999). A manifestao mais grave a miopatia letal infantil, com acidose lctica e insuficincia respiratria, de evoluo multissistmica, fatal antes do ano de idade (Shofner e Wallace, 1995; Bernier et al., 2002). Foram descritas formas de hipotonia neonatal transitria por dfice do complexo IV (DiMauro et al., 1983; Wada et al., 1996). Menos habitual nas DCRM, so crises de rabdomilise com mialgia e mioglobinria (de Lonlay-Debeney et al., 1999; Kollberg et al., 2005).
Clnica cardaca - O envolvimento cardaco nas DCRM traduz-se mais frequentemente por miocardiopatia, sendo mais raros a no compactao do ventrculo esquerdo e as arritmias. A miocardiopatia, com ou sem insuficincia cardaca, pode surgir isolada ou associada a outras manifestaes clnicas, como forma de apresentao ou no decorrer da evoluo. mais frequentemente hipertrfica, mas pode ser tambm dilatada (Vilarinho et al., 1997a; Tessa et al., 1999; Towbin, 2006; Estevinho et al., 2008). A histologia mostra muitas vezes fibrose intersticial ou fibroelastose. O lactato plasmtico estaria elevado nas formas neonatais, podendo ser normal nas tardias (Munnich et al, 2001). Mutaes no gene da tafazina (TAZ) esto na base da sndrome de Barth, de outras miocardiopatias no sindrmicas e de casos de no compactao do ventrculo esquerdo ligados ao cromossoma X (Spencer et al, 2006). O lugar das DCRM na etiologia das miocardiopatias est por definir. A avaliao sistemtica dos casos sem causa conhecida atravs do estudo mitocondrial em bipsia endomiocrdica poder contribuir para o esclarecimento deste ponto, j que esto descritos doentes com DCRM limitada ao miocrdio (Rustin et al., 1993).
29
Alteraes do ritmo e da conduo cardaca so tpicas da sndrome de Kearns-Sayre (KSS) e da LHON, embora possam surgir noutros contextos clnicos (Nikoskelainen et al., 1994; Chawla et al., 2008).
Figura 7 - Diversidade da apresentao clnica das DCRM. (adaptado de Munnich et al., 2001)
Clnica renal - As manifestaes renais das DCRM no so raras na criana. Comeam habitualmente nos primeiros dois anos de vida, sendo o quadro mais caracterstico a tubulopatia proximal, que pode ser incompleta (Morris et al., 1995). Pode ocorrer tambm doena glomerular, traduzida por sndrome nefrtica ou nefropatia
tubulointersticial crnica. Na experincia de Munnich, a clnica renal associa-se habitualmente a lactato plasmtico normal, mas pode haver hiperlactacidria ou presena de intermedirios do ciclo de Krebs na urina (Munnich et al., 2001).
Clnica digestiva e nutricional - O atraso de crescimento ponderal e estatural nas crianas com DCRM, nem sempre explicado por outros sintomas associados
nomeadamente digestivos, muito frequente e pode ser de incio pr-natal (Munnich et 30
al., 1996; Bernier et al., 2002). Uma inflexo no explicada das curvas de crescimento pode ser a nica manifestao da doena durante algum tempo. So tambm possveis vmitos recorrentes, diarreia crnica com atrofia vilositria e/ou insuficincia pancretica excrina, que pem como diagnsticos diferenciais a intolerncia s protenas do leite de vaca, a doena celaca ou a sndrome de Shwachman-Diamond (Cormier-Daire et al., 1994). Os quadros de pseudo-obstruo intestinal crnica fazem parte da sndrome MioNeuro-Gastro-Intestinal Encephalopathy (MNGIE). A hipocitrulinmia seria um marcador das DCRM com atingimento do intestino delgado, tal como de outras doenas congnitas ou adquiridas que cursam com reduo da massa intestinal (Parfait et al., 1999; Crenn et al., 2008; Atkuri et al., 2009). Os sintomas gastrointestinais podem melhorar ou desaparecer com o tempo, medida que surge a afeco de outros rgos (McShane et al., 1991).
Clnica heptica - As DCRM so uma importante causa de insuficincia heptica grave na criana. Segundo Munnich possvel distinguir dois subgrupos, de acordo com o curso clnico: forma neonatal, severa (40%), de incio na primeira semana de vida e atingimento neurolgico (hipotonia grave, epilepsia mioclnica e atraso psicomotor) e forma tardia (60%) com incio do 2 ao 18 ms de vida, envolvimento neurolgico inconstante e evoluo por vezes fatal. Em ambos os grupos h esteatose (micro ou macronodular) e cirrose e elevao do lactato no lquor ou plasma (Munnich et al., 2001). Alguns destes casos esto associados a depleo do mtDNA (Mancuso et al., 2005).
Clnica
endcrina
Nanismo
por
dfice
de
IgF1,
diabetes
mellitus
hipoparatiroidismo so as manifestaes endocrinolgicas mais frequentes das DCRM (Yialamas et al., 2006). Hipotiroidismo, dfice de ACTH ou insuficincia supra-renal foram igualmente descritos neste contexto (Artuch et al., 1998; Bruno et al., 1998). A diabetes mellitus, tipo I ou II, surge habitualmente no adulto jovem, raramente como forma de apresentao. No entanto, foram descritos casos de diabetes mellitus de incio neonatal. A diabetes mellitus das DCRM est quase sempre associada a surdez e a insuficincia cardaca ou heptica. Vrios adultos jovens com a mutao A3243G, a mais frequentemente associada sndrome Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke-like episodes (MELAS), apresentaram diabetes mellitus e surdez neurosensorial isoladas, sem anticorpos anti-ilhus (Kadowaki et al., 1994). Num estudo que englobou 550 doentes diabticos japoneses seleccionados aleatoriamente, foi encontrada a mutao MELAS em 0.9% dos casos e em nenhum caso dos 250 controlos com tolerncia normal glicose (Otabe et al., 1994).
31
Clnica hematolgica - As DCRM podem apresentar-se ou cursar com alteraes hematolgicas como anemia, neutropenia, trombocitopenia, pancitopenia ou eosinofilia em contexto sindrmico, como por exemplo na sndrome de Pearson, ou no. A mielodisplasia, com sideroblastos em anel e vacuolizao dos precursores da medula ssea caracterstica da PS e da MLASA (mitochondrial Myopathy, Lactic Acidosis, Sideroblastic Anemia) (Cormier et al., 1990; Inbal et al., 1995).
Clnica otolgica - A surdez neurosensorial, mais frequentemente sindrmica, pode ser manifestao de DCRM. A surdez no sindrmica est associada a mutaes especficas do mtDNA (T7445C ou A1555G). A mutao A1555G, em particular, confere uma maior sensibilidade ao efeito ototxico dos aminoglucosdeos, respondendo por 15% de todos os casos de surdez associada queles frmacos. No entanto, aquela exposio no indispensvel para que a surdez ocorra (Chinnery, 2006b). A surdez associada a mutaes do mtDNA rara na criana (Tessa et al., 2001).
Clnica oftalmolgica - As manifestaes oftalmolgicas so muito numerosas, ocorrem frequentemente no decurso da doena, podendo fazer parte de sndromes. Degenerao retiniana, atrofia ptica, cataratas, opacidade crnea, estrabismo,
oftalmoplegia externa ou total so manifestaes possveis. O nistagmo e o estrabismo so particularmente frequentes na criana, enquanto a oftalmoplegia externa tpica do adulto (Vilarinho et al., 1998; Carelli et al., 2006; Rose et al., 2008; Grazina et al., 2008).
Clnica dermatolgica - As alteraes da pele e fneros surgem em associao com outras manifestaes. Pigmentao mosqueada das reas expostas luz, acrocianose, alopcia, pili torti e trichorexis nodosa, queratodermia palmoplantar, nevus epidrmico, ictiose e colesteatoma foram descritos em alguns doentes (Bodemer et al., 1999).
Clnica pr-natal - As DCRM no so uma causa comum de malformaes. No entanto, fcies invulgar semelhante da sndrome fetal alcolica, microcefalia pr-natal, alteraes da forma e implantao dos pavilhes auriculares, mos curtas, braquidactilia e hipoplasia das unhas, bem como a associao VACTERL (anomalias Vertebrais; atrsia Anal; defeito Cardaco: comunicao interventricular; fstula Traqueo-Esofgica, com atrsia do esfago; anomalias Renais; alterao dos membros - Limb: displasia radial) foram descritos associados a DRCM (von Kleist Retzow et al., 2003; Damian et al., 1996). De entre as manifestaes pr-natais mais frequentes, conta-se a restrio de crescimento intra-uterino isolada ou associada a outras anomalias, como polihidrmnios, miocardiopatia hipertrfica, alteraes do ritmo cardaco e hidronefrose (Gibson et al., 2008). 32
Sndromes mitocondriais - A maior parte das DCRM foram identificadas e sistematizadas por neurologistas e oftalmologistas de adultos. Foram sendo definidas associaes de sinais e sintomas caractersticos (sndromes mitocondriais),
habitualmente designadas pelo autor que as descreveu (mesmo antes de se associarem a DCRM) ou por acrnimos, a partir das iniciais das principais manifestaes. As sndromes so mais frequentemente observadas em adultos jovens ou adolescentes e esto frequentemente associadas a alterao do mtDNA (figuras 8 e 9). Apenas algumas das sndromes mitocondriais, como as de Leigh, de Pearson, de Alpers e a de Barth se manifestam tipicamente na infncia.
Figura 8 - Mapa de morbilidade do genoma humano mitocondrial.

DNA mitocondrial: genes codificantes de protenas (a vermelho): sete subunidades do complexo I (ND); trs unidades do complexo IV (CO), citocromo b (cyt b) e duas subunidades do complexo V (A6 e A8); dois rRNAs (12S e 16S) e 22 tRNA (identificados pela letra do cdigo do aminocidos correspondente). Em itlico- doenas mais frequentemente ou predominantemente associadas com mutao num determinado gene; a azuldoenas da sntese proteica mitocondrial; a vermelho- doenas provocadas por mutaes em genes codificantes de protenas. ECM- encefalomiopatia; FBSN- necrose estriatal bilateral familiar; PEO- oftalmoplegia externa progressiva PPK- queratoderma palmoplantar SIDS- morte sbita infantil.
(adaptado de DiMauro e Schon, 2006)
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Sndrome ou Doena de Alpers (OMIM #203700) - Tambm conhecida por doena de Alpers-Huttenlocher, caracterizada por hipotonia muscular, epilepsia refractria, dfice visual, atraso do desenvolvimento psicomotor e do crescimento, hepatopatia (infiltrao lipdica e cirrose micronodular) com acidose lctica e vmitos, e atrofia cerebral (gliose, espongiose e perda neuronal). Os poucos casos de causa conhecida so devidos a DCRM. Em alguns doentes foi demonstrado dfice do complexo IV. Recentemente foi identificado uma mutao (G7706A) no gene COXII do mtDNA (Simonati et al., 2003). Noutros casos tm sido detectadas mutaes no gene da polimerase gama (POLG1) (Gordon, 2006; Spinazzola e Zeviani, 2005; Horvath et al., 2006).
Sndrome de Barth (OMIM # 302060) de transmisso ligada ao cromossoma X (Xq28). Associa miopatia cardaca e esqueltica, neutropenia, mitocndrias anormais e acidria 3-metilglutacnica tipo II. A miocardiopatia de incio pr ou neonatal, com neutropenia cclica, atraso de crescimento e miopatia. Caracteriza-se por uma evoluo rapidamente fatal na maioria dos casos. Est associado com mutaes no gene TAZ, que codifica para as tafazinas. As tafazinas so uma famlia de protenas homlogas das aciltransferases dos fosfolpidos e a sua alterao leva a dfice da sntese de cardiolipina (Barth et al., 1999; Barth et al., 2004; Spencer et al., 2006; Chicco e Sparagna, 2007).
Dfice primrio de CoQ (OMIM #607426) - Embora no se possa considerar propriamente uma sndrome mitocondrial no sentido definido anteriormente, o dfice primrio de CoQ merece destaque pelas suas implicaes teraputicas. As alteraes genticas subjacentes no so ainda conhecidas na maior parte dos casos. Trata-se de uma doena autossmica recessiva, aparentemente rara. Desde a primeira descrio, em 1989, j possvel com distinguir convulses pelo e menos ataxia cinco variantes et clnicas al., principais: doena
encefalomiopatia
(Ogasahara
1989);
multissistmica severa da infncia com encefalopatia, hepatopatia e nefropatia (Rotig et al., 2000); sndrome de Leigh, com atraso de crescimento (Van Maldergem et al., 2002); forma predominantemente cerebelosa com ataxia e atrofia cerebelosa (Lamperti et al., 2003) e miopatia isolada (Lalani et al., 2005). Um estudo de 135 doentes com ataxia geneticamente indefinida de incio na infncia identificou dfice de CoQ em 10% dos casos (Lamperti et al., 2003).
Sndrome (Mitochondrial autossmica
de depleo Depletion recessiva,
do
DNA mitocondrial (OMIM uma fatal doena antes
#251880)
MDS
Syndrome)
multissistmica da idade
da
infncia, Atinge
habitualmente
escolar.
predominantemente o fgado, msculo, crebro e rim, em graus e idades de incio variveis. Distinguem-se trs formas hepticas (neonatal, infantil e pr-escolar) e duas 34
miopticas (infantil e pr-escolar). A forma heptica pr-escolar corresponderia sndrome de Alpers (Nhyan et al., 2005). A sndrome de depleo define-se pela diminuio do contedo do mtDNA (baixa da relao mtDNA/nDNA), sem mutaes nem rearranjos adicionais (Moraes et al., 1991; Hirano et al., 2001). Na maioria dos casos desconhece-se a base molecular (Carrozo et al., 2003). A forma mioptica tem sido associada a mutaes do gene da timidina cinase (TK) e a heptica a mutaes do gene da desoxiguanosina cinase (DGUOK) ou do MPV17 (que codifica para uma protena da membrana interna da mitocndria, de funo desconhecida) (Saada et al., 2001; Mancuso et al., 2005; Oskoui et al., 2006; Wong et al., 2007). Mutaes no gene SUCLA2, da succinil- coenzima A (CoA) sintetase, muito mais raras, tambm foram associadas a depleo do mtDNA (DiMauro e Gurgel-Giannetti 2005).
Figura 9 - Doenas da cadeia respiratria mitocondrial com origem no nDNA no mtDNA .

DCRM com origem no mtDNA (acima, a vermelho) e no nDNA (abaixo, a azul) e correlao gentipo fentipo, com designao dos genes envolvidos.
(adaptado de DiMauro e Schon, 2006)
35
Doena ou miopatia mitocondrial letal infantil (OMIM #551000) - LIMD ou LIMM (Lethal Infantile Mitochondrial Disease/ Myopathy) uma entidade que tem incio na infncia com hipotonia, atraso do neurodesenvolvimento, alterao das provas hepticas (com extensa esteatose microvesicular e alguma fibrose) e acidose lctica marcada. A evoluo fatal no primeiro ano de vida ou pouco depois (Brown et al., 1992; Gibson et al., 2008).
Neuropatia ptica hereditria de Leber (OMIM #535000) - A LHON (Leber Hereditary Optic Neuropathy) a doena causada por alterao do mtDNA mais frequente, com uma prevalncia estimada em 12/100000 habitantes (Man et al., 2003). Afecta predominantemente homens na terceira dcada de vida e menos frequentemente mulheres ligeiramente mais velhas. Caracteriza-se por atrofia ptica bilateral, sequencial, com perda relativamente rpida, indolor, de viso central, inicialmente num olho, estendendo-se ao outro no intervalo de dias a meses, raramente anos. A viso residual inferior ou igual a 1/10. A fundoscopia mostra alteraes patognomnicas de
microangiopatia telangiectsica circumpapilar e edema das fibras nervosas volta do disco, sem derrame da fluorescena na angiografia de fluorescncia (pseudo-edema). Em alguns casos, h associao com outras manifestaes clnicas como arritmias cardacas, neuropatia perifrica ou envolvimento do SNC, nomeadamente leses da substncia branca tipo esclerose mltipla ou do tronco cerebral e do cerebelo. Trata-se de uma doena do mtDNA que afecta subunidades do complexo I. A mutao 11778/ND4 a mais prevalente, ocorrendo em mais de metade dos casos, e est associada a pior prognstico da funo visual. Outras mutaes, menos frequentes, que tambm afectam subunidades do complexo I codificadas pelo mtDNA so: 3460/ND1 e 14484/ND6 (a menos deletria, associada melhor taxa de recuperao da funo visual). H ainda a referir as mutaes chamadas secundrias de Leber, polimorfismos encontrados com maior frequncias nos doentes com LHON do que na populao geral e que teriam um efeito sinrgico. Um outro subgrupo de mutaes est associado a doenas relacionadas com a LHON, como a mutao T14459A/ND6 da variante LHON/Distonia/ Sndrome de Leigh. Na maior parte dos casos, as mutaes patognicas de LHON esto presentes em homoplasmia em todos os familiares maternos, mas s alguns (50% dos homens e 10% das mulheres) expressaro a doena, provavelmente por interferncia de factores genticos e/ou ambientais (Carelli, 2002; Man et al., 2002).
Sndrome GRACILE (OMIM #603358) - A designao um acrnimo de: Growth Retardation, Aminoaciduria, Cholestasis, Iron overload, Lactacidosis, and Early death. Tambm conhecida por sndrome de Fellman, um dos fentipos associados ao dfice da protena de assembling do complexo III codificada, pelo gene BCS1L (Visap et al., 2002). 36
Sndrome de Kearns-Sayre - KSS (OMIM #530000) - A sndrome foi descrita por aqueles autores em 1958. definida pelos critrios de Rowland: oftalmoplegia externa progressiva e retinopatia pigmentar com incio antes dos 20 anos, associados a pelo menos uma das seguintes alteraes: ataxia, elevao da proteinorrquia (>100mg/dl) e defeito de conduo cardaca (Rowland, 1994). A base molecular mais frequente desta sndrome a presena de grandes deleces nicas (habitualmente detectveis no tecido muscular, mas no nos leuccitos) e mais raramente de duplicaes ou mutaes dos genes do mtDNA que codificam tRNAs (Moraes et al., 1989).
Sndrome de Leigh (OMIM #256000) - A encefalomielopatia subaguda necrotisante, descrita em 1951, caracterizada por leses focais, bilaterais e simtricas de degenerao espongiforme no tronco cerebral, gnglios da base, tlamo, cerebelo, medula e nervos pticos. Apresenta-se tipicamente na infncia, (80% dos casos nos primeiros dois anos de vida) com regresso psicomotora, ataxia e hipotonia e subsequentes sinais de leso do tronco cerebral (oftalmoplegia, atrofia ptica, ptose, distonia e alteraes respiratrias), tendo mau prognstico. Foram tambm descritas formas juvenis e do adulto, menos graves (Vilarinho et al., 1997b; Lyon et al., 2006; Finsterer, 2008). Os defeitos da CRM, especialmente dfices dos complexos IV e I, esto entre as causas conhecidas da sndrome de Leigh. A maioria seria provocada por mutaes em genes nucleares, nomeadamente o gene SURF1 que codifica um factor de assembling do complexo IV (Morris et al., 1996; Zhang et al., 2007). Num subgrupo significativo de casos tm sido identificadas mutaes do mtDNA, designadamente nos genes da ATPase6, do ND5 do complexo I ou do tRNA (Lys): MILS - Maternally Inherited Leigh Syndrome (Vilarinho et al., 2000; Tsao et al., 2003; Zhang et al., 2007; Finsterer, 2008). Os dfices da piruvato-desidrogenase encontram-se entre as causas mais frequentes da sndrome de Leigh, a seguir aos dos complexos IV e I (Miyabayashi et al., 1985; Shoffner e Wallace, 1995). Foram ainda descritos casos pontuais de dfice dos complexos II e III, de CoQ e da biotinidase e de depleo do mtDNA, entre outros (Baumgartner et al., 1989; Absalon et al., 2001; Filiano et al., 2002; Van Maldergem et al., 2002; Pagnamenta et al., 2006)
Associao MEGDEL (OMIM sem referncia) De acordo com o acrnimo definidor, associa: MEthylGlutaconic aciduria with sensori-neural Deafness, Encephalopathy Leighlike (Wortmann et al., 2006).
Sndrome MELAS
(OMIM
#540000)
Das iniciais dos sintomas definidores:
Mitochondrial Encephalopathy, Lactic Acidosis and Stroke-like episodes. definida pela trade: episdios tipo acidente vascular cerebral antes dos 40 anos de idade, encefalopatia caracterizada por convulses e/ou demncia e acidose lctica (ou 37
hiperlactacidmia) e/ou RRF. Refora o diagnstico a presena de pelo menos dois destes sinais: desenvolvimento psicomotor normal prvio, cefaleias ou vmitos recorrentes (Hirano et al., 1992). Outras alteraes incluem atraso psicomotor ou mental, ataxia, surdez, diabetes mellitus e fraqueza muscular, entre outros. Os elementos distintivos dos episdios tipo acidente vascular cerebral so leses de hipodensidade nas imagens de ressonncia magntica cerebral (RMN), mais frequentes nas regies occipitais e temporais do que nas frontais, que no respeitam um territrio vascular e elevao do lactato, que pode ser limitada ao SNC (Matthews et al., 1991). Tm sido descritas alteraes dermatolgicas nalguns casos (Carmi et al., 2001). Embora se trate de uma doena do mtDNA, os primeiros casos foram descritos em crianas em 1984 (Pavlakis et al., 1984). A mutao A3243G, do tRNA encontrada em cerca de 80% dos doentes com MELAS. Por outro lado, metade dos doentes com esta mutao apresenta uma clnica diferente de MELAS (Hammans et al., 1991; de Vries et al., 1994).
Sndrome MERRF (OMIM #545000) - De: Myoclonus Epilepsy Ragged-Red Fibres. Associa epilepsia mioclnica progressiva e ataxia presena de RRF. Outras
manifestaes frequentes so: neuropatia perifrica, lipomas, baixa estatura, surdez e atrofia ptica. A idade de incio tem variado entre os 5 e os 75 anos, sendo mais frequente nos adultos. Pode ser causada tanto por mutaes do mtDNA (cerca de 80% dos casos devem-se a uma mutao do tRNA A8344G) como do nDNA (gene POLG1) (Shoffner et al., 1990; Van Goethem et al., 2003).
Sndrome MIDD (OMIM #520000) - De: Mitochondrial Inherited Diabetes and Deafness. Est associado mutao A3243G, do mtDNA (Maechler e Andrade, 2006).
Sndrome MIRA (OMIM sem referncia) - De: Mitochondrial Recessive Ataxia Syndrome. , a par da SCAE e da SANDO (ver adiante), uma sndrome de ataxianeuropatia com incio nas 2 e 3 dcadas de vida, associada a mutaes do gene POLG1 (Hakonen et al., 2005; Copeland, 2008).
Sndrome MLASA (OMIM #600462) De: mitochondrial Myopathy, Lactic Acidosis, Sideroblastic Anemia. Embora conhecida h muito, foi pela primeira vez descrita como sndrome em 1995 (Rawles e Weller 1974; Inbal et al., 1995). Pode associar ainda dismorfismo facial, microcefalia e atraso do neurodesenvolvimento. Mais recentemente, foram documentadas mutaes no gene da pseudouridina sintetase-1 (PUS1), com repercusso funcional no tRNA mitocondrial e citoslico em alguns doentes (Patton et al., 2005).
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Sndrome de Mohr-Tranebjaerg (OMIM #304700) - Sndrome de surdez-distonia ligada ao cromossoma X, caracteriza-se por surdez neurosensorial, distonia, disfagia, cegueira cortical, fracturas e parania ou dfice mental. causada por mutaes de um gene envolvido na importao mitocondrial, DDP1 (Deafness Distonia Peptide)
(Tranebjaerg et al., 1995; Ezquerra et al., 2005).
Sndrome MNGIE (OMIM #603041) - De: Mitochondrial NeuroGastroIntestinal Encephalopathy. Tambm designada por POLIP (Polyneuropathy, Ophthalmoplegia, Leucoencephalopathy, Intestinal Pseudo-obstruction) uma doena multissistmica, autossmica recessiva que se inicia antes dos 20 anos de idade e leva morte pelos 40 anos. Os transtornos da motilidade gastrointestinal levam a pseudo-obstruo intestinal progressiva, diarreia crnica e malnutrio (Hirano et al., 1994). Cursa habitualmente com hipocitrulinmia. As alteraes moleculares subjacentes so habitualmente mltiplas deleces ou depleo do mtDNA, associadas a mutaes no gene da timidina fosforilase (TP) (Nishino et al., 1999). A reduo da actividade daquela enzima leva a acumulao tissular e plasmtica da timidina e da desoxiguanosina (Valentino et al., 2007).
Sndrome MSL (OMIM 151800) - De: Multiple Symmetric Lipomatosis. Trata-se de uma doena tpica do adulto do sexo masculino, frequentemente associada a alcoolismo, que se manifesta por lipomas mltiplos no capsulados geralmente na regio cervical ou ombros, associados em 30% dos casos a alteraes neurolgicas (ataxia cerebelosa ou sinais piramidais) (Hirose et al., 2006; Finsterer 2006). Tem sido ocasionalmente descrita em crianas e associada a disfuno mitocondrial e/ou alteraes do mtDNA (Klopstock et al., 1997; Casali et al., 1999; Muoz-Mlaga et al., 2000; Castro-Gago et al., 2003).
Sndrome NARP (OMIM #551500) - De: Neuropathy, Ataxia, Retinitis Pigmentosa. Associa neuropatia perifrica, ataxia cerebelosa e retinopatia pigmentar a convulses e demncia, podendo incluir enxaqueca e atraso mental (Holt et al., 1990). A idade de incio varia entre um e 32 anos. de transmisso materna, sendo que a mutao mais frequente a T9893G do mtDNA, que afecta a ATPase 6 (complexo V). A hipocitrulinmia persistente que se verifica nesta sndrome e em outras DCRM poder ser considerada um marcador de envolvimento intestinal, com dfice da sntese intestinal de citrulina por falta de ATP (Parfait et al., 1999; Naini et al., 2005; Crenn et al., 2008).
Oftalmoplegia externa crnica progressiva (OMIM #157640; #609286 ) - A CPEO (Chronic Progressive External Ophthalmoplegia) uma das mais frequentes manifestaes das miopatias mitocondriais (Carelli et al., 2006). Apresenta-se como ptose lentamente progressiva e limitao multidireccional 39 da mobilidade ocular,
sobretudo para cima. Por vezes associa-se a fraqueza muscular e/ou alteraes neurolgicas como demncia, episdios tipo acidente vascular cerebral, ataxia ou convulses. Pode ainda integrar a KSS (Rowland, 1994). A alterao molecular subjacente pode ser uma grande deleco do mtDNA (formas espordicas) ou deleces mltiplas do mtDNA (identificveis em tecidos ps-mitticos como o msculo), de transmisso mendeliana (Moraes et al., 1989). A maior parte das formas autossmicas dominantes (adPEO) tm mutaes em um dos trs genes ANT1, Twinkle ou POLG1. Algumas formas recessivas (arPEO) estariam associadas a mutaes POLG1; outras, a mutaes pontuais do mtDNA, sendo por isso de transmisso materna (Spinazzola e Zeviani, 2005).
Sndrome de Pearson - PS-(OMIM #557000) - uma sndrome que ocorre tipicamente na criana, sendo tambm designado por Pearson marrow-pancreas syndrome. Caracteriza-se por anemia sideroblstica refractria com neutropenia e trombocitopenia variveis, vacuolizao dos precursores da medula ssea, insuficincia pancretica excrina e hiperlactacidmia. Inicia-se nos primeiros meses de vida por anemia ou diarreia e fatal antes dos 3 anos em mais de metade dos casos (Pearson et al., 1979). Os sobreviventes recuperam espontaneamente, mas geralmente desenvolvem KSS (Lee et al., 2007). Est associado a grandes deleces ou duplicaes
heteroplsmicas do mtDNA (Cormier et al., 1990; McShane et al., 1991).
Sndrome SANDO (OMIM #607459) De: Sensory Ataxic Neuropathy, Dysarthria, Ophthalmoplegia. Nestes doentes tm sido detectadas mutaes do gene POLG1 (Mano et al., 2003; Spinazzolla e Zeviani 2005; Longley et al., 2005; Gago et al., 2006).
Sndrome SCAE (OMIM *174763) - De: juvenile Spino-Cerebellar Ataxia, Epilepsy syndrome. Associa-se a mutaes do gene POLG1 (Spinazzola e Zeviani 2005).
Sndrome de Sengers (OMIM %212350) Caracteriza-se por cataratas congnitas, miocardiopatia hipertrfica, miopatia e acidose lctica (Sengers et al., 1975; van Ekeren et al., 1993). Em alguns doentes foi provado dfice da CRM em msculo e dfice de ANT1 (Jordens et al., 2002; Morava et al., 2004).
40
2.3.2
Diagnstico e classificao.
A clnica das DCRM extraordinariamente pleomrfica. Alguns doentes tm quadros clnicos muito sugestivos de DCRM, enquadrveis em sndromes, mas a maior parte apresenta sintomas inespecficos, comuns a muitos outros diagnsticos. Por outro lado, existe uma significativa sobreposio clnica entre muitas das sndromes mitocondriais descritas (Munnich et al., 2001). O msculo tem sido o tecido de eleio para avaliao das alteraes funcionais e histolgicas associadas s DCRM, no s porque muitos dos doentes apresentam encefalomiopatia ou miopatia, como pelo facto de os micitos, tal como os neurnios, terem um potencial de replicao celular muito baixo e portanto maior probabilidade de acumular sinais funcionais e morfolgicos de leso mitocondrial. Nas situaes em que h envolvimento de outros rgos ou sistemas, poder ser vantajoso optar pelo estudo inicial do rgo em causa, quando acessvel (Rustin et al., 1993). Mesmo em encefalopatias sem envolvimento heptico evidente, pode ser til estudar o fgado, sobretudo se a investigao do msculo tiver sido normal ou inconclusiva (Panetta et al., 2005). Conhecem-se mutaes patognicas em mais de 30 genes do mtDNA e em mais de 30 genes do nDNA (Thorburn, 2004). As alteraes do mtDNA so responsveis pela maior parte dos casos de DCRM na idade adulta e de at 25% dos casos na criana. A pesquisa directa das mutaes mais frequentes do mtDNA a partir de sangue, sedimento urinrio ou msculo est indicada no caso de algumas sndromes clssicas. Em alguns centros realizada a sequenciao completa do mtDNA nos casos suspeitos (Wong e Boles, 2005). No entanto, em muitos doentes e particularmente na idade peditrica o diagnstico continua a basear-se na demonstrao de um dfice funcional da CRM (Thorburn et al., 2004b).
Estudo funcional da cadeia respiratria A avaliao funcional do sistema da fosforilao oxidativa difcil (Grazina et al., 2001)., visto a mitocndria ser um organelo com mltiplas e complexas funes, como j referido. Por outro lado, a demonstrao, directa ou indirecta de um dfice funcional da CRM no garante que este seja primrio (Fosslien, 2001; Thorburn et al. 2004a; Schwab et al., 2006).
Sinais bioqumicos indirectos de patologia mitocondrial A avaliao do estado redox dos tecidos consiste na determinao do lactato, piruvato e corpos cetnicos (-hidroxibutirato e acetoacetato) nos fluidos orgnicos. A incapacidade de reoxidao do NADH e do FADH2 pela CRM leva acumulao mitocondrial das respectivas formas reduzidas, com aumento da relao NADH/NAD+ e 41
FADH2/FADH. Consequentemente, observa-se um aumento da razo -hidroxibutirato/ acetoacetato e da razo lactato/ piruvato, formas indirectas de avaliar o potencial redox mitocondrial e citoslico, respectivamente (Bonnefont et al., 1991). H acumulao de substratos no oxidados, nomeadamente do piruvato e consequentemente da respectiva forma reduzida, o lactato, cuja formao favorecida pela presena de um aumento razo NADH/NAD+. Verifica-se nestas situaes exacerbao da normal elevao psprandial da lactacidmia, uma vez que h obstruo a jusante. Pode igualmente surgir cetonmia paradoxal (isto , elevao no perodo ps-prandial), sobretudo quando h envolvimento heptico significativo, j que a acetil-CoA proveniente da glicose via piruvato no pode ser normalmente oxidada no ciclo de Krebs devido ao bloqueio da CRM. Quando a acumulao de lactato/ piruvato significativa pode acompanhar-se de uma elevao da alanina, resultante da transaminao do piruvato (Morava et al., 2006a). Pelo facto de as refeies tornarem o dfice mais notrio, pode ser til a determinao repetida do lactato, piruvato e alanina no pr e no pos-prandial (ciclo redox) ou aps sobrecarga oral de glicose (Ching-Shiang et al., 1992; Poggi-Travert et al., 1996; Touati et al., 1997). A lactacidmia aps exerccio muscular, para o que necessrio a colaborao do doente, pode contribuir tambm para o diagnstico, nomeadamente quando h clnica de miopatia (Argov, 1998). A determinao do estado redox do lquido cefalorraqudeo til sobretudo quando h clnica neurolgica com lactacidmia normal. Por outro lado, a ressonncia magntica espectroscpica protnica (1H RMS) pode detectar picos de lactato nas leses enceflicas, nos ncleos da base do crebro (mesmo que nestes no se detectem leses em RMN) ou no lquido cefalorraqudeo (Rocha et al., 2008). A hipoxmia de qualquer origem a causa mais frequente de dfice secundrio da CRM e um diagnstico diferencial importante na hiperlactacidmia (Duke, 1999). As condies de colheita e processamento das amostras biolgicas, nomeadamente do sangue, so muito importantes na interpretao dos resultados do estudo redox (Bonnefont et al., 1991; Diogo et al., 1999). A ausncia da demonstrao de acumulao de lactato no exclui formalmente a DCRM, j que tm sido descritas formas de DCRM com confirmao molecular e nveis normais de lactato (Finsterer et al., 2001, Scaglia et al., 2004; Bohm et al., 2006). Nas DCRM, a determinao dos cidos orgnicos nos fluidos biolgicos pode mostrar alteraes. Um dfice funcional da CRM leva ao bloqueio secundrio das vias metablicas a montante, como o ciclo de Krebs e a oxidao do piruvato proveniente da gliclise, dos cidos gordos e do esqueleto carbonato de muitos aminocidos. Dele pode resultar a acumulao e excreo urinria anormal de cidos orgnicos, nomeadamente
intermedirios da -oxidao dos cidos gordos e do ciclo de Krebs (Gibson et al., 1992; Hagenfeldt, 1998; Sim et al., 2002; Yano et al., 2003). Por outro lado, algumas acidrias 42
orgnicas
podem
associar-se
alteraes
mitocondriais
funcionais
secundrias.
Considerando que grande parte das aminoacidopatias e acidrias orgnicas se devem a defeitos de enzimas da matriz mitocondrial, no de estranhar esta estreita relao, no s de proximidade como de eventual partilha de mecanismos reguladores comuns. O estudo dos cidos orgnicos nos fluidos biolgicos, designadamente urina e lquor, pode assim contribuir para o diagnstico diferencial destas patologias (Barschak et al., 2006).
Estudo da capacidade mitocondrial de produo de energia - O estudo da produo de energia pela mitocndria recorre a mtodos sensveis, para os quais so necessrios tecidos frescos como clulas inteiras - linfcitos, linfoblastos, fibroblastos, micitos, mioblastos - ou msculo - homogeneizado ou mitocndrias isoladas- (Rustin et al., 1994; Thorburn et al., 2004a; Janssen et al., 2006a). A avaliao do declnio da concentrao de oxignio em tecidos frescos por polarografia um exame muito sensvel do funcionamento da CRM. Permite localizar um eventual dfice na CRM, atravs da avaliao indirecta da oxidao de vrios substratos, na presena e ausncia de inibidores especficos. De entre os inibidores do fluxo de electres atravs da CRM a nvel dos vrios complexos destacam-se pela sua utilidade neste contexto: rotenona- complexo I; malonato - complexo II; antimicina A complexo III; cianeto e azida - complexo IV; oligomicina-B -complexo V (Rustin et al., 1994). Com a medio do consumo de oxignio em condies basais e aps adio de ADP e com o recurso a desacopladores possvel detectar situaes de desacoplamento entre o fluxo de electres atravs da CRM e a sntese de ATP. As condies tcnicas especficas so difceis de padronizar e os resultados devem ser interpretados em conjunto com os restantes dados da avaliao da funo mitocondrial (Rustin et al., 1994; Malgat et al., 1999). A quantificao de ATP habitualmente realizada por bioluminescncia usando a reaco da luciferina-luciferase (Lemasters e Hackenbrock, 1979; Short, 2004). A fosfocreatina pode igualmente ser doseada nos tecidos (Janssen et al., 2006a). A ressonncia magntica nuclear do msculo com espectroscopia do fsforo 31 (31P RMS) pode ser utilizada no diagnstico, antes de mtodos mais invasivos como a bipsia. Tem a vantagem de permitir uma avaliao quantitativa dos ndices de funo mitocondrial in vivo, de um modo seriado. Em contrapartida, uma tcnica cara, com necessidade de protocolos muito bem estabelecidos e frequentemente reservada a investigao (Bendahan et al., 2006). O achado de uma diminuio da relao fosfocreatina/ fsforo inorgnico em repouso, com uma recuperao lenta aps o exerccio considerado um indicador fidedigno de disfuno mitocondrial (Argov, 1998; Jeppesen et al., 2007). O estudo da oxidao de substratos marcados com succinato e o malato, entre outros, atravs da medio do 43
14 14
C, como o piruvato, o
CO2 formado, um mtodo
de avaliao da actividade das enzimas oxidativas intervenientes e da produo global de energia mitocondrial. Um obstculo na CRM leva acumulao de NADH e FADH2, com a consequente inibio daquelas actividades enzimticas. O uso de inibidores especficos permite localizar o dfice, tal como nos outros testes de avaliao global da CRM. Ao possibilitar a avaliao da actividade de outras enzimas mitocondriais, como a piruvatodesidrogenase e as enzimas da -oxidao dos cidos gordos, este estudo pode contribuir para o diagnstico diferencial (Janssen et al., 2006a; Wolf e Smeitink, 2002). A utilizao de substncias radioactivas limita o seu uso mais generalizado no diagnstico.
Actividade enzimtica dos complexos da CRM - A determinao da actividade enzimtica dos complexos da CRM por espectrofotometria o processo mais usado para avaliao funcional da CRM. Embora os mtodos sejam na maior parte dos casos sobreponveis, no h uniformidade na apresentao dos resultados, nem na
interpretao dos mesmos. Estes so expressos de vrios modos: em quantidade de substrato/minuto/mg de protena ou grama de tecido, actividade corrigida para a citrato sintase, para o complexo IV ou para o complexo II, isto , expressa como ratio entre a actividade do complexo em causa e a da enzima marcadora (Chrtien et al., 1994; Bernier et al., 2002; van den Heuvel et al., 2004; Barclay et al., 2005; Enns et al., 2005). Do mesmo modo, os valores so referidos ao limite inferior do normal ou a uma percentagem da mdia do valor de referncia (v.r.) (Rustin et al., 1994; Thorburn et al., 2004b; Janssen et al., 2006a). Finalmente, alguns investigadores valorizam como diagnsticas alteraes da relao das actividades dos complexos da CRM entre si, traduzindo um desequilbrio funcional da CRM (Geromel et al., 1997).
Outros estudos - O doseamento de componentes com influncia no funcionamento da CRM, como a CoQ, o citocromo c e a cardiolipina, entre outros, pode ser til no diagnstico das DCRM (Boitier et al., 1998; Appaix, 2000; Barth et al., 2004; Montero et al., 2005; Quinzii et al., 2008). A quantificao da CoQ, habitualmente realizada no msculo e/ou fibroblastos por HPLC (cromatografia lquida de alta preciso), o modo mais directo de detectar o dfice da sua sntese, uma das poucas DCRM verdadeiramente tratveis. Conhecem-se igualmente casos de dfices secundrios de CoQ no msculo que melhoram com a suplementao (Quinzii et al., 2006). Potenciais dfices de citocromo c poderiam ser rapidamente detectados pelo estudo polarogrfico (Rustin et al., 1994). Alternativamente, pode quantificar-se por
espectrofotometria os componentes da CRM contendo citocromo c em mitocndrias isoladas (Appaix, 2000). Em casos de suspeita de sndrome de Barth possvel o rastreio dos doentes candidatos ao estudo do gene TAZ (da tafazina) pela determinao das diversas fraces 44
da cardiolipina em sangue em carto, plaquetas, linfcitos, fibroblastos ou tecidos (Barth et al., 2004; Kulik et al., 2008; Houtkooper et al., 2009). tambm possvel a avaliao dos componentes proteicos das enzimas da CRM atravs de tcnicas electroforticas ou do uso de anticorpos especficos (Calvaruso et al., 2008; Willis et al., 2009). A inviabilidade de fibroblastos ou de linfcitos num meio de cultura com galactose (em vez de glicose) poder constituir um teste de rastreio de DCRM e /ou de dfice de piruvato-desidrogenase. Quando h disfuno do metabolismo oxidativo, a utilizao da galactose em vez da glicose no suficiente para fazer face s necessidades energticas das clulas. As clulas com dfice energtico no sobrevivem naquelas condies de cultura (Robinson et al., 1992; Bernier et al. 2002). A tecnologia de cbridos permite determinar a origem mitocondrial ou nuclear de um defeito da CRM. As clulas do doente, despojadas de ncleo (citoplastos), com mitocndrias contendo mtDNA eventualmente mutado, so fundidas com clulas p0, com mitocndrias desprovidas de mtDNA na sequncia de tratamento com brometo de etdio. Se aps a fuso, os cbridos (citoplasma hbridos) resultantes manifestarem o dfice da CRM, aquele tem origem provvel no mtDNA do doente. No caso contrrio a causa residir no nDNA (King e Attardi, 1989; Tiranti et al., 1995).
Contributo da anatomo-patologia - O msculo, como tecido ps-mittico, acumula evidncia do sofrimento mitocondrial, traduzido por modificaes estruturais e
proliferao das mitocndrias. Tem sido considerado a pedra basilar da investigao mitocondrial, j que pode mostrar leses mesmo quando no afectado clinicamente (Vogel, 2001). Aquelas alteraes podem ser encontradas noutros tecidos, como o fgado, o miocrdio, o rim e o intestino, entre outros (incluindo o encfalo). Os tecidos afectados devem ser investigados sempre que possvel (Chow e Thorburn, 2000). No entanto o contributo da histologia no diagnstico das DCRM no especfico, j que frequente encontrarem-se alteraes morfolgicas das mitocndrias em muitas outras patologias, nomeadamente outras miopatias (Chou, 1968; Jongpiputvanich 2005). As anomalias morfolgicas identificadas no msculo podem ser decisivas, no s para o diagnstico de DCRM, como para o diagnstico diferencial. Os estudos funcionais em homogeneizados de msculo podem no detectar alteraes quando a percentagem de fibras lesadas baixa (menos de 10%) ou quando a proliferao mitocondrial compensadora intensa. Neste caso, pode at mesmo haver aumento da actividade global de um ou mais complexos da CRM. A histopatologia muito importante neste contexto, j que pode detectar alteraes no homogneas sem traduo quantitativa, mas apenas qualitativa, o que acontece sobretudo nas doenas heteroplsmicas do mtDNA (Romero et al., 1999). 45 et al.,
contributo
da
anatomo-patologia
no
diagnstico
das
DCRM
resume-se
demonstrao da acumulao de mitocndrias anormais e/ou do dfice de um ou mais complexos da CRM. As RRF, caracterizadas pela acumulao subsarcolmica de mitocndrias anormais, so assim designadas pelo seu aspecto com a colorao com o tricrmio de Gomori, em que densas coleces de mitocndrias aparecem coradas de vermelho brilhante. So caractersticas das mutaes pontuais tRNA ou dos rearranjos (deleces e duplicaes) do mtDNA, embora possam surgir nas mutaes dos genes do mtDNA que codificam protenas ou nos do nDNA. O nmero de RRF varia entre 3-10% das fibras e, no mesmo doente, a sua densidade pode variar com a regio muscular em causa (Romero et al., 1999). Podem ocorrer igualmente em outras doenas musculares primrias ou
secundrias e em indivduos idosos, a partir dos 40 anos (Dalakas et al., 1990; Rifai et al., 1995; Pesce et al., 2001). A sua presena na criana muito rara e sempre anormal (Chow e Thorburn, 2000; Wolf e Smeitink, 2002; Miles et al., 2006). Com a colorao para a succinato-desidrogenase (SDH), um mtodo histoenzimolgico que evidencia a actividade daquele componente do complexo II da CRM, a acumulao de mitocndrias traduz-se por uma colorao azul intensa: fibras azuis rotas (blue ragged fibres). As RRF ou as fibras azuis rotas, sempre valorizadas na criana como sinal de DCRM, so-no no adulto apenas se presentes em mais de 2% das fibras, uma vez que podem surgir com o avano da idade (Walker et al., 1996). Na criana as alteraes morfolgicas das mitocndrias traduzem-se mais
frequentemente pela presena de pequenos agregados subsarcolmicos, em forma de crescente (Miles et al., 2006). A sua presena em mais de 2% das fibras antes dos 16 anos de idade tem sido considerada critrio de DCRM (Bernier et al., 2002). Os dfices dos complexos da CRM podem demonstrar-se por mtodos
histoenzimolgicos (actividade enzimtica especfica) ou imunocitoqumicos (uso de anticorpos especficos). A alterao mais frequente a presena de fibras COX negativas, sempre valorizadas na criana e nos adultos, acima dos 2% ou 5%, antes ou aps os 50 anos, respectivamente. A distribuio das fibras COX negativas pode apresentar um padro heterogneo, relacionado com mutaes do mtDNA, ou um padro homogneo, indicativo de alteraes do nDNA. Na criana, a presena de fibras COX negativas ainda mais rara do que a de RRF e, ao contrrio do adulto, tem tendncia a ser generalizada (Miles et al., 2006). Nos raros casos de dfice do complexo II podem observar-se fibras SDH negativas (Rustin e Rtig, 2002; Dawson et al., 2003) Os diversos componentes proteicos dos complexos da CRM podem ser identificados nos tecidos, independentemente da actividade enzimtica, por anticorpos especficos que reagem com um anticorpo secundrio ligado a um fluorocromo ou peroxidase (Hanson et al., 2002).
46
As fibras musculares tipo I, identificadas pela colorao castanha clara com a ATPase a pH 9,4, distinta do tom mais escuro das fibras tipo II, so fibras de contraco lenta, ricas em mitocndrias e lpidos, pobres em glicognio e dependentes do metabolismo oxidativo. Apresentam uma marcada actividade das enzimas oxidativas mitocondriais, como a NADH-TR (Nicotinamida-Adenina-Dinucletido- Tetrazolium Reductase), a SDH, a COX e a ATPase a pH baixo. Nos msculos com DCRM h frequentemente um aumento da normal variao do dimetro das fibras e da percentagem de fibras tipo I, o que pode dever-se a um mecanismo de compensao. No entanto, a valorizao diagnstica destes achados controversa (Romero et al., 1999; Enns et al., 2005; Miles et al., 2006). Nas DCRM podem ainda verificar-se alteraes inespecficas, como acumulao moderada de glicognio e de lpidos e atrofia muscular neurognica, entre outras (Sarnat e Marn-Garcia, 2005). A demonstrao em microscopia electrnica de mitocndrias morfologicamente
anormais importante no diagnstico das DCRM. No entanto a interpretao das imagens no fcil. A microscopia electrnica pode mostrar agregados subsarcolmicos ou intermiofibrilhares de mitocndrias, alongamento das cristas com orientao irregular, padro em favo de mel, rodas concntricas ou pobreza de cristas, com aspecto vacuolizado. A deteco de incluses mitocondriais anormais do tipo cristalino ou globular, ou ainda a acumulao de gotculas lipdicas igualmente possvel (Bernier et al., 2002; Mierau et al., 2004). A frequncia com que nas DCRM so detectadas alteraes mitocondriais em microscopia electrnica varivel. Esta variao pode estar relacionada com as condies tcnicas e os critrios utilizados, j que so necessrias colheitas e processamentos muito rigorosos e as mitocndrias apresentam normalmente um alto grau de pleomorfismo (Kyriacou et al., 1999). A indicao da microscopia electrnica na suspeita de DCRM objecto de controvrsia (Mierau et al., 2004). O estudo anatomo-patolgico do encfalo, habitualmente realizado no contexto de autpsia, tem importncia diagnstica, designadamente nas sndromes de Leigh e de Alpers.
Estudos de gentica molecular - Conhecem-se mais de 190 mutaes patognicas do mtDNA (DiMauro et al., 2006; MITOMAP, 2008). O estudo do mtDNA mostra alteraes patognicas numa boa parte dos casos de DCRM no adulto e at 25% dos casos na criana (Rotig et al., 2004; Thorburn et al., 2004b). A maioria das alteraes do mtDNA apresenta-se em heteroplasmia e comporta-se como recessiva, isto , o fentipo surge para elevados graus de heteroplasmia, que, de resto, varivel com os tecidos (Boulet et al., 1992; Sciacco et al., 1994). Assim, a deteco de uma mutao no mtDNA no significa necessariamente uma relao causal
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com a clnica. H que quantific-la e frequentemente pesquis-la em vrios tecidos para a poder valorizar. As mutaes do mtDNA so classificadas em rearranjos de grande escala (deleces parciais ou duplicaes) e em mutaes pontuais. Os primeiros afectam vrios genes, so invariavelmente heteroplsmicos e so usualmente espordicos. As mutaes pontuais podem ser heteroplsmicas (mais frequentemente) ou homoplsmicas (ex: LHON) e so de transmisso materna, embora ocorram frequentemente de novo, sobretudo na criana (Thorburn, 2004). Os mtodos laboratoriais mais frequentemente usados para pesquisar mutaes pontuais conhecidas so a Polimerase Chain Reaction- Restrition Fragment Lengh Polymorfism (PCR-RFLP) e a PCR- alelo-especfica (PCR-AS) (Wong e Boles 2005). Na primeira, faz-se a pesquisa de uma mutao de cada vez, com amplificao por PCR do fragmento de mtDNA que contm o local da mutao, seguida da digesto dos produtos de PCR com uma enzima de restrio que corta os fragmentos mutados e os normais de um modo diferente. Assim, os fragmentos resultantes da digesto so separados por electroforese em gel de poliacrilamida no desnaturante (BN-PAGE) e visualizados com brometo de etidium. A quantificao da heteroplasmia faz-se por densitometria de bandas, que permite a deteco de 5-10% de heteroplasmia. A PCR- AS, mais sensvel (at 1% de heteroplasmia), permite a deteco de mltiplas mutaes pontuais ao mesmo tempo, atravs de PCR multiplex (com mltiplos primers) seguida de anlise dot blot dos produtos de PCR com oligonucletidos alelo-especficos marcados com
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(sondas). Actualmente, a deteco de mutaes e a determinao simultnea do grau de heteroplasmia podem ser feitas por um mtodo muito sensvel, a PCR em tempo real (Bai et al., 2004). A pesquisa de mutaes pontuais desconhecidas pode fazer-se por vrios mtodos baseados na deteco da heteroplasmia, como SSCP (Single-Strand
Conformation Polymorfism) e rastreio de mtDNA heteroduplex (hbrido) e/ou por sequenciao directa do mtDNA. O rastreio de grandes rearranjos do mtDNA (superiores a 500kb), incluindo deleces e duplicaes faz-se por anlise de southern blot. Aps extraco do DNA total, digesto com enzimas de restrio e separao dos fragmentos em gel de agarose, as bandas so transferidas para uma membrana (de nitrocelulose ou nylon), hibridizadas com uma sonda marcada para o mtDNA e detectadas por autorradiografia, sendo avaliado o seu tamanho. As deleces do mtDNA tambm podem ser detectadas por PCR-RFLP (Wong e Boles, 2005). A avaliao semi-quantitativa do mtDNA pode ser feita por southern blotting comparando a quantidade de um dado gene mitocondrial com a de um gene nuclear (Moraes et al., 1991). A anlise por PCR em tempo real permite a quantificao mais rpida e mais rigorosa do mtDNA (Chabi et al., 2003; Bai et al., 2004).
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O estudo de genes do nDNA que codificam protenas mitocondriais feito por sequenciao directa (Pquignot et al., 2001 Mandel et al., 2001).
Critrios de diagnstico - As doenas so construes humanas H doentes e no doenas Se a classificao das DCRM por sndromes pode ser til nos adultos, o mesmo no se verifica na criana. Embora frequentemente multissistmicas, as DCRM podem manter-se localizadas a um rgo ou sistema durante uma boa parte da sua evoluo. Dever-se- colocar a hiptese de DCRM nos casos de miopatia e/ou de encefalopatia de causa desconhecida ou perante uma associao inexplicada de sintomas envolvendo rgos aparentemente no relacionados pela sua funo ou origem embrionria (Munnich 1996). A abordagem laboratorial destes doentes difcil, visto a mitocndria ser um organelo com mltiplas e complexas funes, a cadeia respiratria ser constituda por complexos multi-enzimticos codificados por dois DNA diferentes e o seu funcionamento estar dependente de vrios outros componentes, nomeadamente sistemas de transporte membranar. Por outro lado, modificaes bioqumicas do ambiente mitocondrial podem interferir com aquele funcionamento, directa ou indirectamente. A hiperlactacidmia um dado inespecfico, podendo ter muitas outras causas e no detectada num nmero significativo de doentes. Mesmo a deteco de alteraes do mtDNA no em muitos casos suficiente, j que estas podem no se acompanhar de sintomas (o que acontece frequentemente em estudos familiares de LHON) ou ser secundrias (Shinde et al., 2006). Devido inexistncia de testes diagnsticos definitivos e universalmente aplicveis, tm surgido vrias tentativas de classificao dos doentes com suspeita de DCRM que tm em conta aspectos clnicos, bioqumicos, neurorradiolgicos, anatomopatolgicos e moleculares. Associam frequentemente critrios majores e minor para estabelecer o grau de certeza diagnstico, semelhana dos critrios de Jones revistos para a febre reumtica (Special Writing Group, 1992). Walker definiu em 1996 critrios gerais de DCRM (Walker et al., 1996). Em 1999 Nissenkorn publicou os Wolfson criteria for mitochondrial disease (Nissenkorn et al., 1999). Os critrios de Walker foram adaptados criana por Bernier em 2002: modified Walker criteria for mitochondrial disease (Bernier et al., 2002). No mesmo ano, foram divulgados os Nijmegen criteria for mitochondrial disease (Wolf e Smeitink, 2002). Em 2004, Naviaux chamou a ateno para a existncia de problema de codificao relativamente s DCRM: a dcima classificao internacional das doenas da Organizao Mundial de Sade tem 10 cdigos de classificao de DCRM: doenas mitocondriais gerais (E88.3X), MELAS (E88.31), MERRF (E88.32), Sndrome de Leigh (G31.82), Sndrome de Alpers (G31.81); KSS (H49.81); LHON (G42.22); Miopatia mitocondrial (G93.7); piruvato-desidrogenase, piruvato-carboxilase e fosfoenolpiruvato-carboxicinase (E74.4) e outras doenas mitocondriais (E88.39) (OMS - CID10, 1994). Este facto afecta 49
o seu registo correcto, nomeadamente em termos epidemiolgicos e sobretudo a vida dos doentes no que se refere aos apoios na doena (Naviaux, 2004).
A classificao das DCRM tem sido um desafio e um tema em constante evoluo. A classificao gentica resolveria o problema, mas a sua aplicao prtica limitada por duas circunstncias. Por um lado, uma parte significativa dos doentes, sobretudo peditricos, no tem diagnstico molecular. Por outro, existe uma fraca correlao entre o gentipo e o fentipo, sobretudo nas DCRM associadas a mutaes do mtDNA. O nDNA representa 99% do DNA total e codifica cerca de 1400 protenas mitocondriais, 14% das quais esto directamente envolvidas na fosforilao oxidativa (Schon, 2009). Desde a deteco das primeiras alteraes do mtDNA (Holt et al., 1988; Lestienne e Ponsot 1988; Wallace et al., 1988) e do nDNA (Bourgeron et al., 1995) muitas outras mutaes tm sido descritas. No MITOMAP esto sistematizadas, e em actualizao constante, as mutaes do mtDNA e nDNA conhecidas (Ruiz-Pesini et al., 2006; MITOMAP, 2008). Uma classificao gentica possvel das DCRM est resumida no captulo Anexos (pgina 255).
2.3.3
Fisiopatologia e tratamento
Como anteriormente referido, nas DCRM a relao gentipo/ fentipo de um modo geral pobre (Riggs et al., 1984; Naviaux 2004), sobretudo nas devidas a mutaes do mtDNA (Rubio-Gozalbo et al., 2000a). As deleces do mtDNA podem estar associadas a CPEO, KSS, PS, mas tambm a MELAS, diabetes isolada ou miocardiopatia. A mutao A3243G, a causa mais frequente de MELAS, tambm foi encontrada em doentes com CPEO, KSS e diabetes isolada, entre outros (Schapira, 2006). A expresso fenotpica das mutaes do mtDNA/ nDNA depende de muitos outros factores para alm da mutao causal, como a funo e necessidade energtica de cada clula/ tecido, a existncia de isoenzimas especficas de orgo ou fase de
desenvolvimento e o efeito cumulativo de toxinas ou outros factores ambientais. No que se refere s mutaes do mtDNA so ainda importantes, o grau de heteroplasmia, a distribuio tissular e o efeito limiar, a aco de genes nucleares modificadores e a presena de determinados hapltipos (polimorfismos) (Kunz, 2003; Limongelli et al., 2004). A fisiopatologia das DCRM largamente desconhecida e provavelmente no uniforme. O dfice energtico, a leso pelas ROS e o aumento da apoptose so consequncia directa da alterao funcional da CRM (Brenner et al., 1998). O stress oxidativo tem sido implicado em casos concretos de DCRM (Neves et al., 2008). Num modelo animal de LHON e em cbridos foi demonstrado o papel patognico das ROS inactivando o transportador de glutamato, com elevao dos nveis daquele aminocido (Qi et al., 50
2003; Beretta et al., 2004). O papel do superxido (O2.-) foi igualmente demonstrado em cultura de fibroblastos de doentes com a mutao NARP e dfice do complexo V (Geromel et al., 2001). A alterao do metabolismo intracelular de clcio e do papel sinalizador intracelular da mitocndria ser tambm de considerar na patognese das DCRM, nomeadamente na diabetes mitocondrial. Em particular, a mutao A3243G do mtDNA poderia impedir a exocitose da insulina em resposta elevao da glicmia (Brookes et al., 2004; Maechler e Andrade, 2006). Por outro lado, as protenas respiratrias alteradas poderiam funcionar como auto-antignios e desencadear mecanismos auto-imunes de leso tissular (Campos et al., 1997). Na sndrome MELAS foram demonstrados proliferao mitocondrial excessiva nos vasos musculares e cerebrais, RRF COX positivas no msculo e diminuio da citrulina e arginina (nos episdios tipo acidente vascular cerebral e tambm nos perodos intercrticos). Foi postulada a existncia de um dfice de xido ntrico (e respectivo efeito vasodilatador) decorrente do seu sequestro a nvel dos grupos heme da COX, o que parece comprovado pelo efeito benfico da teraputica com L-arginina (Schon e DiMauro 2003; Kubota et al., 2004; Koga et al., 2007). Finalmente, as variaes de sequncia do mtDNA (polimorfismos) podem contribuir para diferenas funcionais individuais, conferindo susceptibilidade para certas doenas, no s primrias da CRM, mas tambm neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), psiquitricas (doena bipolar) e neoplsicas (Munakata et al., 2004).
Tratamento geral - O tratamento das DCRM apenas sintomtico na grande maioria dos casos, sendo no entanto extremamente importante para a melhoria da qualidade de vida dos doentes (Chinnery et al., 2006a; DiMauro et al., 2006b). Implica uma vigilncia clnica regular, de modo a detectar e tratar precocemente possveis complicaes, como diabetes, surdez, cataratas e envolvimento cardaco, entre outros (Phoenix et al., 2006; Schaefer et al., 2006). A fisioterapia e as terapias ocupacional, respiratria e da fala podem ser teis em muitos casos. Reala-se a importncia do exerccio fsico, mesmo e sobretudo nos doentes com miopatia, j que a inactividade promove a atrofia muscular e agrava os dfices e (Taivassalo et al. 2006). Foi demonstrado que o exerccio aerbio benfico nos doentes com fentipo predominantemente muscular. No entanto, a melhoria clnica da funo mitocondrial demonstrada por medio in vivo (com
31
P RMS, entre outras)
cursou com aumento da percentagem de mtDNA mutante, o que levanta questes em relao s suas consequncias a longo prazo (Taivassalo et al., 2001) Muitas DCRM cursam com convulses, que de um modo geral respondem aos anticonvulsivantes (Kang et al., 2007). Quando no h alternativa teraputica ao valproato de sdio, alguns autores defendem a administrao concomitante de L51
carnitina, uma vez que o valproato inibe a captao da carnitina. No deve no entanto aquele anticonvulsivante ser usado nos doentes com sndrome de Alpers ou sua suspeita, pelo risco de insuficincia heptica fatal (Bicknese et al., 1992; Gordon, 2006). Do mesmo modo, h que evitar o uso de outros frmacos que sejam potenciais toxinas mitocondriais (Bindoff, 1999). Na DCRM a dieta deve ser equilibrada e normocalrica. O excesso de calorias aumenta a acumulao de substratos a montante dos dfices enzimticos, com agravamento da hiperlactacidmia e da produo de ROS, entre outras consequncias (Faulks et al., 2006; Wallace, 2001). A proporo recomendada em hidratos de carbono e lpidos no consensual (Bindoff, 1999; Sanz et al., 2006). A dieta cetognica teria interesse, no s nos dfices do complexo I, mas de um modo mais geral nas crianas com DCRM e epilepsia (Panneta et al., 2004; Kang et al., 2007).
Teraputica farmacolgica especfica - O lactato, que se acumula numa proporo significativa de casos de DCRM neurotxico em altas concentraes. O dicloroacetato um inibidor especfico da piruvato-desidrogenase cinase, estimulando assim a actividade da piruvato desidrogenase. deste modo a terapia mais eficaz na diminuio dos nveis de lactato (Stacpoole et al., 2008). No entanto, a sua utilizao nas DCRM no consensual devido frequncia de neuropatia perifrica associada (Kaufmann et al., 2006; Stacpoole et al., 2008) Na sndrome MELAS foi provada a eficcia teraputica da administrao de L-arginina, intravenosa na fase aguda (0,5g/Kg/d) e oral nos perodos intercrticos (0,15-0,3g/Kg/d) (Kubota et al., 2004; Schon e DiMauro 2003; Koga et al., 2007). Nas dcadas de 80 e 90 foram colocadas nfase e expectativa no tratamento com transportadores de electres, cofactores enzimticos e varredores de ROS. Apesar de teoricamente interessantes, e excepo de casos anedticos, os resultados prticos so pouco encorajadores. Um desses casos, o de intolerncia ao exerccio numa adulta jovem (com uma mutao no gene do citocromo b), foi tentada a substituio funcional do complexo III por uma associao de vitaminas K e C (Eleff et al., 1984). A dramtica melhoria inicial, documentada por
31
P RMN, no se manteve nem ocorreu noutros casos
semelhantes (DiMauro, 2006b). Marriage demonstrou que a suplementao de cofactores in vitro a linfcitos de doentes com DCRM aumenta significativamente a sntese de ATP (Marriage et al., 2004). A utilizao do succinato como fonte alternativa de electres nos dfices do complexo I e na sndrome MELAS (A3243G) com aparente sucesso foi referido em apenas dois doentes (Shoffner et al., 1989; Oguro et al., 2004). Numa criana com dfice do complexo IV por mutao no gene SCO2 (que codifica uma protena de assembling que introduz o cobre na holoenzima), o histidinato de cobre foi eficaz na regresso da miocardiopatia, mas no nas outras manifestaes da doena (Freisinger et al., 2004). 52
O uso de varredores de radicais livres de oxignio (vitaminas E e C, CoQ10, idebenona, glutatio e dihidrolipoato) ou de enzimas, como a superxido-dismutase, baseia-se na constatao de que nas DCRM h um aumento do stress oxidativo (Panneta et al., 2004). Foi demonstrada uma diminuio dos nveis do glutatio, reforando a lgica do seu uso no tratamento das DCRM (Hargreaves et al., 2005). O tratamento precoce com antioxidantes poderia melhorar o prognstico dos doentes com LHON (Schapira, 2006). O uso frequente da CoQ e derivados no tratamento das DCRM resulta no s da sua eficcia referida em numerosos casos, mas tambm da sua aparente inocuidade. Se o efeito est definitivamente provado como teraputica de substituio, a eficcia da CoQ como transportador de electres e varredor de radicais livres nas DCRM no consensual (Matthews et al., 1993; Lodi et al., 2001; Hausse et al., 2002; Mashima et al., 2000) A justificao para a utilizao teraputica de algumas substncias, como a CoQ10, a Lcarnitina ou o cido flico, resulta da demonstrao de deficincia primria ou secundria em alguns casos de DCRM. A identificao crescente de dfices de CoQ, nomeadamente da sua sntese, veio relanar o uso da idebenona em doses elevadas: 30mg/Kg/dia at 600mg/dia (DiMauro e Rustin, 2009). A sua eficcia, embora globalmente boa, no se verifica em todos os casos (Aure et al., 2004; Salviati et al., 2005; Artuch et al., 2006). As DCRM podem cursar com dfice secundrio de carnitina por aumento da excreo urinria de acil-carnitinas acumuladas por inibio de outros processos oxidativos mitocondriais. A administrao exgena de carnitina corrigiria o dfice e evitaria o ciclo vicioso decorrente da falta de carnitina necessria -oxidao dos cidos gordos. Em doentes com KSS e outras DCRM foi demonstrada uma diminuio dos nveis de folatos no lquor e a sua relao com leucodistrofia, que melhora aps tratamento (Allen et al., 1983; Dougados et al., 1983; Pineda et al.,2006). Estaria assim indicado o uso precoce de cido folnico (1-2,5mg/Kg/dia) nas DCRM com encefalopatia (Ramaekers et al., 2007). A utilizao teraputica do monofosfato de creatina nas manifestaes miopticas das DCRM tem como fundamento terico o seu papel como armazm de ligaes fosfato de alta energia rapidamente mobilizveis, mormente a nvel muscular, bem como a constatao do aumento das massas musculares e eventualmente da fora muscular decorrentes do seu uso em altas doses. A eficcia teraputica da creatina nas formas miopticas das DCRM no entanto controversa (Tarnopolsky et al., 1997; Zange et al., 2002; Kornblum et al 2005). Uma anlise dos ensaios clnicos publicados sobre a eficcia das medidas teraputicas actualmente disponveis (vitaminas e suplementos alimentares, agentes farmacolgicos e exerccio fsico) concluiu que no h clara ou estudos controlados que demonstrem a eficcia de qualquer interveno teraputica nas DCRM e que necessria mais investigao nesta rea (Chinnery et al., 2006 a).
53
Novas estratgias teraputicas - Teraputica farmacolgica dirigida mitocndria - Os doentes com DCRM podero vir a beneficiar a mdio ou longo prazo da chamada interveno farmacolgica dirigida mitocndria, que tem sido desenvolvida nos ltimos anos. Os mecanismos que permitem direccionar os frmacos ou outras substncias biologicamente activas como o DNA para as mitocndrias fazem uso dos valores elevados do potencial da membrana interna da mitocndria e da maquinaria de importao proteica mitocondrial, entre outros (Weissig, 2005). - Terapia Gnica - A crescente identificao dos genes responsveis pelas DCRM, tanto do mtDNA como do nDNA, e o fracasso das abordagens teraputicas clssicas tm levado proposta de mltiplas formas de terapia gnica, ainda em fase de investigao laboratorial, em cultura de clulas ou modelos animais (Larsson e Rustin 2001; Wallace 2001; Duarte e Videira, 2009). Nas DCRM associadas ao nDNA, a substituio do gene em causa debate-se com os mesmos problemas levantados para as outras doenas mendelianas, como sejam o correcto encaminhamento dos vectores, a especificidade tissular, as respostas
imunolgicas e a adequada insero do vector no genoma nuclear (Owen et al., 2000; Owen
e Flotte, 2001; Schon e DiMauro 2003).
Nas doenas primrias do mtDNA levantam-se problemas especficos devido poliplasmia e heteroplasmia e distribuio heterognea do mtDNA mutante nas clulas e tecidos. A dificuldade maior est no desenvolvimento de sistemas especficos de insero de DNA ou outros agentes efectivos nas mitocndrias em todo o corpo de um organismo vivo (DSouza e Weissig 2004; Smith et al., 2004). Tm sido investigadas mltiplas estratgias idealizadas para corrigir os defeitos do mtDNA, entre as quais se destacam: a) A converso dos genes mutados do mtDNA em genes normais do nDNA, ie a sntese citoplasmtica do produto de um gene mitocondrial normal previamente introduzido no ncleo. A subsequente fuso com uma sequncia codificadora permitiria a entrada na mitocndria (expresso alotpica). b) A importao de genes de outras espcies, equivalentes dos genes mutados (expresso xenotpica). c) A manipulao da heteroplasmia do mtDNA, fazendo descer a percentagem de mtDNA mutado para nveis inferiores ao limiar de expresso clnica, atravs da remoo do mtDNA mutante ou da inibio da sua replicao. A remoo seria conseguida com molculas antigenmicas dirigidas ao mtDNA na mitocndria: caties lipoflicos ou molculas com uma pr-sequncia peptdica (ex: cidos nuclecos peptdicos -PNAs). Endonucleases de restrio especficas para o mtDNA mutante inibiriam a sua replicao. Os doentes com miopatia mitocondrial poderiam beneficiar de estratgias de
manipulao da heteroplasmia pela proliferao das clulas satlite (ricas em mtDNA nativo) induzida por leso local (com miotoxinas, por exemplo) ou pelo exerccio 54
excntrico (contraces de alongamento). A reduo do mtDNA mutado dever-se-ia a uma fuso das clulas satlite com as fibras musculares maduras. Desconhecem-se as suas consequncias a longo prazo, j que pode haver exausto das clulas satlite ou aumento do mtDNA mutado com o tempo. O desvio da heteroplasmia pela seleco positiva das clulas com mtDNA nativo foi conseguido com a substituio da glicose por corpos cetnicos como fonte de energia numa cultura de cbridos contendo mtDNA de um doente com KSS (Santra et al., 2004). Esta seleco natural das clulas mais ricas em mtDNA nativo em meio adverso abriria perspectivas para o eventual uso mais generalizado de dieta cetognica no tratamento de doentes com DCRM (DiMauro, 2006). - Interveno no metabolismo dos nucletidos mitocondriais - Tm sido identificadas vrias DCRM em que alteraes do metabolismo dos nucletidos na mitocndria esto no centro da fisiopatologia. Mutaes nos genes POLG1, ANT1, Twinkle, Timidina fosforilase, TK2 e DGUOK provocam alteraes da manuteno do mtDNA e possvel que a manipulao dos nveis de nucletidos livres na mitocndria possa ser til para o tratamento destes doentes. A vitamina B12 poderia ser vantajosa neste contexto (Chinnery e Bindoff, 2003). Nos doentes com MNGIE, a diminuio dos nveis de timidina e desoxiuridina atravs da hemodilise revelou-se demasiado efmero, estando em investigao o uso de transplante de clulas histaminais alognicas (DiMauro, 2006b). Nas sndromes de depleo do mtDNA provocados por dfice da DGUOK, a administrao dos produtos em falta, monofosfato de desoxiguanosina (dGMP) e monofosfato de desoxiadenosina (dAMP) poder vir a ser uma arma teraputica, a julgar pelos resultados em fibroblastos dum doente (Taanman et al., 2003).
2.3.4
Prognstico e aconselhamento gentico
O prognstico das DCRM de um modo geral sombrio, com acentuada morbilidade e morte prematura (Chinnery et al., 2006). A mortalidade varia entre 10-50% /ano aps o diagnstico, na criana e entre 5-20% /ano aps o incio clnico, no adulto (Naviaux, 2004). O facto de nas crianas predominarem as mutaes do nDNA e de a sndrome de Leigh, incluindo a forma MILS, ser uma condio de incio precoce, so factores que influenciam adversamente o prognstico (Rubio-Gozalbo et al., 2000a). De facto, com excepo dos muito raros casos com boa evoluo, como o dfice benigno da COX (DiMauro et al.,1983; Zeviani et al.,1987; Lev et al.,2002; Debray et al.,2007c), o prognstico grave nas apresentaes peditricas, estando directamente relacionado com a precocidade da apresentao clnica (Garcia-Cazorla, 2005). Numa srie de 101 crianas com dfice da COX, 66% faleceram antes da idade adulta, metade das quais nos primeiros dois anos de vida (Bohm et al., 2006). Um dos factores que afecta desfavoravelmente a sobrevida de crianas com DCRM a existncia de miocardiopatia 55
(Scaglia et al., 2004). Foi demonstrada maior gravidade de apresentao clnica nos doentes peditricos do sexo masculino com mutaes no gene POLG1 (Horvath et al., 2006). Tambm outras DCRM, como a LHON tm estado associadas a maior gravidade no sexo masculino (Carelli et al., 2003; Hudson et al., 2005), o que seria indcio da modulao do defeito primrio por genes modificadores.
A teraputica preventiva atravs do aconselhamento gentico e diagnstico prnatal cada vez mais importante nas DCRM. So doenas congnitas, que podem apresentar todas as formas de hereditariedade. Uma parte significativa parece ser espordica (Thorburn, 2004; Horvath et al., 2006). Segundo Thorburn, em termos de aconselhamento gentico das DCRM, h trs tipos de situaes a considerar (Thorburn e Dahl, 2001): DCRM por mutao do nDNA; DCRM com diagnstico baseado em dfice significativo de um ou mais complexos da CRM ou outros critrios majores, sem mutao patognica identificada e DCRM por mutao do mtDNA DCRM por mutao do nDNA - So conhecidos cada vez mais genes nucleares com mutaes que afectam directamente a CRM (MITOMAP, 2008). So todos de transmisso autossmica, excepto a Sndrome de Barth que ligada ao X. As DCRM por mutao do nDNA so predominantemente de apresentao peditrica (Rubio-Gozalbo et al., 2000a). A identificao de uma mutao num gene nuclear permite um clculo preciso do risco de recorrncia e diagnstico pr-natal fivel por anlise directa da mutao em vilosidades corinicas e mesmo diagnstico gentico pr-implantao. DCRM com diagnstico baseado em critrios majores, sem mutao
identificada - Na maior parte das crianas com DCRM, o diagnstico baseia-se na identificao de um dfice enzimtico com base gentica desconhecida, pelo que o risco de recorrncia incerto. Em certas circunstncias, possvel calcular aquele risco, tendo em conta o tipo de dfice, a apresentao clnica e a histria familiar (Thorburn e Dahl 2001). Alguns centros oferecem diagnstico pr-natal baseado em doseamento
enzimtico nas famlias com um caso ndex de DCRM sem mutao patognica conhecida apenas nos casos em que o probando foi sintomtico nos primeiros meses de vida (isto , se provvel que o defeito seja autossmico recessivo), na ausncia de evidncia de que possa tratar-se de uma mutao do mtDNA, no caso do defeito enzimtico ser expresso em fibroblastos em cultura e se houver disponveis culturas de fibroblastos dos pais (Niers et al., 2003). As DCRM, mesmo as causadas por mutaes de genes nucleares (possibilidade da existncia de isoenzimas) e sobretudo as que tm origem no mtDNA, apresentam especificidade tissular, pelo que difcil prever, com base no estudo funcional da CRM nas vilosidades corinicas, o tipo de tecidos afectados e sua gravidade futura numa criana. Se os fibroblastos (que tm uma origem embrionria comum aos coricitos e 56
amnicitos) apresentam, a par do msculo, o mesmo tipo de dfice, assume-se empiricamente que a especificidade tissular seria eliminada (Niers et al., 2003). Esta interpretao no , no entanto, consensual (Thorburn, 2004). De qualquer modo, apenas 30 a 60% dos dfices da CRM encontrados no msculo se expressam tambm em fibroblastos, o que reduz significativamente o nmero de famlias a quem possvel oferecer um diagnstico pr-natal (Niers et al., 2003, van den Heuvel et al., 2004). As famlias devem ser sempre informadas da possibilidade de falsos negativos, ie, de que uma actividade enzimtica normal nas vilosidades corinicas no garante um beb sem DCRM. A maior parte dos centros oferece diagnstico pr-natal para os dfices do complexo IV e apenas alguns o fazem para os do complexo I (Ruintenbeek et al., 1996; Thorburn e Dahl 2001; Niers et al., 2003). DCRM por mutao do mtDNA - O diagnstico pr-natal das doenas causadas por mutaes do mtDNA, causa da maior parte dos casos de DCRM em doentes adultos e de at 20-25% nas crianas, dificultado pelas suas caractersticas de transmisso e distribuio. Em regra, as grandes deleces do mtDNA no so hereditrias nem transmissveis e ocorrem de novo (na ovognese ou na fase inicial da embriognese). Quando presentes num ovcito fertilizado, tm muito pouca probabilidade de passar pelo gargalo entre o ovo e o embrio (DiMauro, 2006b). Um estudo multicntrico de 226 famlias demonstrou que as mes no afectadas tm muito pouca probabilidade de ter um segundo filho doente. No entanto, mas nas mes com deleco esse risco de um em 24 (Chinnery et al., 2004). Nas mutaes heteroplsmicas, a avaliao da transmisso da mutao dificultada pelo efeito de gargalo gentico que ocorre durante o desenvolvimento e que resulta numa grande variao do teor de mtDNA mutante transmitido aos diferentes descendentes (Brown et al., 2006). J as mutaes homoplsmicas, como a LHON, sero transmitidas a todos os descendentes. Mesmo nestes casos, o aparecimento de manifestaes clnicas difcil de prever devido penetrncia varivel (Brown et al., 2006). No caso das mutaes pontuais do tRNA, o diagnstico pr-natal na prtica impossvel. De facto, a percentagem de mutao dos amnicitos ou vilosidades corinicas no necessariamente representativa dos outros tecidos fetais e a carga mutacional medida em amostras pr-natais pode mudar in tero ou aps o nascimento devido segregao mittica (Chou et al., 2004). Excepo, seriam as mutaes da ATPase6 associadas com NARP/MILS (White et al., 1999). Na prtica, a preveno da transmisso da maior parte das doenas associadas a mutaes do mtDNA passa por os pais optarem por no terem filhos ou recorrer a um dos seguintes procedimentos: diagnstico pr-natal em casos seleccionados; diagnstico pr-implantao; transferncia de citoplasma e dador de ovcito com fertilizao in vitro ou transferncia nuclear (Thorburn e Dahl 2001). Este procedimento, que consiste na transferncia de um ncleo de um ovo fertilizado para um citoplasma de um dador saudvel foi realizado com sucesso em 57 ratos e foi aprovado em 2005 para
experimentao em humanos no Reino Unido (Brown et al., 2006). Embora levante questes ticas, seria a forma mais eficaz de prevenir a transmisso materna de um defeito do mtDNA (Chinnery e Bindoff, 2003).
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Captulo 3 - Objectivos
CAPTULO 3 OBJECTIVOS
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Captulo 3 Objectivos
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3. OBJECTIVOS
Neste trabalho fiz uma reflexo sobre o diagnstico das DCRM no HP, quando se completou uma dcada desde a implementao dos mtodos de estudo funcional e gentico da mitocndria nos doentes em que se coloca a suspeita desta patologia. Neste contexto, defini como principal objectivo deste estudo retirar, da experincia de uma dcada e da reviso bibliogrfica sobre a prtica de outros grupos, os ensinamentos necessrios a uma melhor actuao clnica no futuro. Para atingir este objectivo procurei sucessivamente: 1. Da reviso dos processos clnicos dos doentes investigados naquele perodo, e aps a sua classificao de acordo com critrios de diagnstico actuais, apurar os sinais e sintomas que legitimam uma investigao da cadeia respiratria mitocondrial (CRM) na populao servida pelo HP. 2. Dos estudos funcionais inespecficos da CRM, inferir quais os que contribuem de um modo inequvoco para o diagnstico. 3. Definir quais os diagnsticos diferenciais a considerar e, consequentemente, as investigaes etiolgicas a fazer, antes da realizao de uma bipsia para estudos mitocondriais. 4. Avaliar os procedimentos diagnsticos especficos de DCRM que foram sendo usados ao longo deste perodo, nomeadamente no que se refere ao estudo da CRM, e correlacionar os seus resultados com a clnica e o diagnstico final. 5. Aplicar populao em estudo os dois sistemas de critrios de diagnstico das DCRM na criana mais usados internacionalmente, com o objectivo de definir uma bateria diagnstica fidedigna, aplicvel no contexto da realidade clnico-laboratorial do HP. 6. Identificar os estudos especficos da funo da cadeia respiratria mitocondrial e dos mtDNA e nDNA) a realizar, de modo a tornar mais sensvel, especfica e rentvel a investigao etiolgica destes doentes. 7. Estabelecer um plano de acompanhamento dos doentes seguidos na Unidade de Doenas Metablicas do HP, em colaborao com as outras especialidades mdicas e cirrgicas, de acordo com guidelines internacionais, de modo a proporcionar a estes doentes o melhor nvel possvel de cuidados assistenciais. Tive como segundo objectivo fazer uma estimativa da incidncia e prevalncia das DCRM com incio das manifestaes clnicas na primeira dcada de vida na Regio Centro de Portugal. Finalmente, propus-me contribuir, atravs da divulgao da experincia da Unidade de Doenas Metablicas do HP, para um melhor conhecimento das DCRM em pacientes
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portugueses, de modo a incentivar o seu diagnstico mais precoce, com vista ao aconselhamento gentico e ao desenvolvimento de terapias mais eficazes
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Captulo 4 Material e Mtodos
CAPTULO 4 - MATERIAL E MTODOS
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4. MATERIAL E MTODOS
4.1 Caracterizao da amostra em estudo

A amostra objecto da presente avaliao o grupo das crianas investigadas no HP por suspeita de DCRM entre 1997 e 2006 (10 anos). Foram considerados apenas os doentes cuja investigao incluiu o estudo de tecidos extra-sanguneos: msculo, fgado e/ou miocrdio. Fez-se a anlise retrospectiva dos processos clnicos dos doentes acima referidos, no que se refere raa, sexo, idade e clnica de apresentao, antecedentes pessoais, histria familiar, rea de residncia, exames complementares de diagnstico realizados, diagnstico final e evoluo clnica. Avaliou-se os seguintes parmetros clnicos: antecedentes gestacionais e perinatais, antecedentes familiares, idade de incio dos sintomas, apresentao e evoluo clnicas. Foram ainda analisados o rastreio de envolvimento multiorgnico e outra investigao etiolgica, incluindo os estudos mitocondriais inespecficos e especficos. Dos antecedentes gestacionais e perinatais avaliou-se: o nmero de ordem da gestao, o seu tipo (normal, de risco por mortes pr-natais anteriores ou outras causas) ou complicada (ameaa de aborto e/ou parto prematuro, doena materna e/ou fetal, diminuio dos movimentos fetais) e sua durao; o ano de nascimento; o nmero de ordem e tipo de parto [eutcico/ distcico (frceps/ ventosa/ cesariana)]; o registo de asfixia perinatal (definida como ndice de Apgar inferior ou igual a 3 ou 7 ao 1 e 5 minutos, respectivamente) e a necessidade de reanimao neonatal e tipo de reanimao (mscara e oxignio, entubao endotraqueal com ventilao assistida); a antropometria ao nascimento; a histria de internamento no perodo neonatal e sua durao. Dos antecedentes familiares, assinalou-se: a etnia, o distrito da residncia familiar, a existncia e tipo de consanguinidade, a histria de mortes inesperadas em familiares prximos e respectiva idade, a idade e estatura maternas, os antecedentes patolgicos relevantes nos pais e irmos e nos familiares das linhas materna e paterna. O tipo de apresentao clnica foi subdividido em crnico ou agudo, neurolgico e/ou muscular (designado por NM) ou extra neurolgico e/ou muscular (designado por ENM) e, segundo o mtodo de Nijmegen, em muscular, neurolgico ou multissistmico (Wolf e Smeitink, 2002). As manifestaes clnicas na apresentao e evoluo foram analisadas por rgos ou sistemas e verificada a existncia de sndromes mitocondriais clssicas. A evoluo clnica foi classificada em NM ou ENM e em multissistmica ou limitada a menos de trs rgos ou sistemas. Foram considerados o prognstico funcional e vital [melhoria, estabilizao do quadro clnico, agravamento ou evoluo fatal (perfil temporal do bito, antes ou aps os seis meses de evoluo da doena)] e as idades dos doentes no fim do perodo do estudo ou do bito. 65
A antropometria ao nascimento foi aferida pelas tabelas de Fenton (Fenton, 2003). O crescimento estaturoponderal e do permetro ceflico foi avaliado pelas tabelas publicadas por Jones (Jones, 1997). A apreciao do desenvolvimento psicomotor foi realizada com recurso a vrias escalas: a escala de competncias do neurodesenvolvimento infantil (Growing Skills II), a escala de desenvolvimento de Ruth Griffiths e a escala de inteligncia de Weschler para crianas - III (WISC III) (Griffiths, 1970; Griffiths, 1984; Martin e Sundara, 2003; Weschler, 2003). Na Growing Skills II foram considerados 14 nveis para 10 reas do neurodesenvolvimento global, nomeadamente: postura passiva, postura activa,
locomoo, manipulao, visual, audio e linguagem, expresso da linguagem, interaco social, autonomia e cognio. Calculou-se em cada caso um quociente de desenvolvimento (QD) aproximado, multiplicando por 100 o ratio entre a mdia das idades de desenvolvimento estimadas para as diferentes reas e a idade cronolgica. Na escala de desenvolvimento mental de Ruth Griffiths foram avaliadas as reas motora, pessoal-social, audio-fala, coordenao olho-mo, realizao e raciocnio prtico. Os resultados foram expressos em termos de QD (Griffiths, 1984). Com a WISC III, foram calculados os Quocientes Intelectuais (QI) verbal, de realizao e escala completa (Weschler, 2003). Utilizou-se uma escala de gravidade do atraso de desenvolvimento psicomotor adaptada da classificao da deficincia mental da Associao Americana de Psiquiatria (Organizao Mundial de Sade, 1994; American Psychiatric Association, 2002). Considerou-se haver atraso de desenvolvimento psicomotor ligeiro, moderado, grave ou profundo quando o QD ou o QI obtido na avaliao anterior bipsia foi de 5069, 35-49, 20-34 e inferior a 20, respectivamente. O atraso do neurodesenvolvimento foi classificado de global quando duas ou mais das reas avaliadas estavam atingidas. As crianas com epilepsia foram classificadas de acordo com a classificao das convulses e sndromes epilpticos da International League Against Epilepsy (ILAE) (Liga Portuguesa contra a epilepsia, 1996). Estabeleceu-se como ano do diagnstico e idade de diagnstico aqueles em que foi realizada a primeira bipsia para estudos mitocondriais. A demora no diagnstico foi definida como o intervalo de tempo entre as primeiras manifestaes (excludas as prnatais) e a execuo da primeira colheita de tecidos para estudos mitocondriais. O tempo de evoluo foi estabelecido como o intervalo de tempo entre os primeiros sintomas e a idade do bito ou o fim do perodo de estudo. Considerou-se haver evoluo multissistmica quando trs ou mais sistemas orgnicos (nervoso central, nervoso perifrico, muscular esqueltico, ocular, auditivo, cardaco, heptico, renal, digestivo e cutneo) foram atingidos, de um modo no secundrio. Assim, as alteraes ortopdicas e pulmonares consideradas decorrentes da doena neurolgica e/ou muscular no foram consideradas neste contexto, o mesmo
acontecendo com as insuficincias cardaca e renal associadas a falncia multiorgnica 66
terminal. As alteraes oftalmolgicas por leso de pares cranianos (por exemplo: estrabismo, oftalmoplegia e ptose) foram consideradas como fazendo parte das manifestaes NM. Foram analisados os exames complementares de diagnstico realizados a cada doente para investigao etiolgica. Estes foram ditados pela clnica e evoluo, no tendo havido um protocolo de investigao aplicado a todos. O rastreio (clnico, bioqumico, electrofisiolgico, imagiolgico e/ou histolgico) de envolvimento multiorgnico (fgado, rim, corao, msculo, sistema nervoso e perifrico, pncreas, intestino, endcrino, medula ssea, viso, audio e pele) foi feito na maior parte dos doentes. As imagens do SNC obtidas por tomografia axial computorizada (TAC) e/ou RMN foram caracterizadas quanto presena ou no de atrofia (global, cortical, subcortical, cerebelosa, do tronco ou do corpo caloso), de leses (traduzidas por hipersinal nas sequncias de TR longo ou/e hipossinal em T1 em RMN e/ou hipodensidade em TAC) da substncia branca supra ou infratentorial, ncleos da base (lenticular e caudado), tlamo, substncia negra, ncleos vermelhos, ncleos subtalmicos, substncia cinzenta periaquedutal, pednculos, protuberncia, bolbo raquidiano e ncleos cerebelosos.
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4.2 Estudos mitocondriais
4.2.1
Estudos bioqumicos
A colheita de sangue para estudo redox ou lactato isolado foi realizada sem garrotagem e com o mnimo possvel de luta, em veia perifrica ou central. Um ponto redox no sangue associou a determinao da glicmia e dos cidos gordos livres, ao lactato, piruvato, -hidroxibutirato e acetoacetato. A amostra (2,5ml) foi recolhida para tubo com EDTA e fluoreto de sdio. No lquor, foram determinados o lactato e o piruvato. A poro destinada aos doseamentos do piruvato e do acetoacetato, tanto no sangue como no lquor, foi imediatamente desproteinizada com cido perclrico a 8%, na proporo de um tero de fluido biolgico para dois teros de cido (medidos com micropipeta Gilson, cabeceira do doente. O transporte imediato das amostras at ao laboratrio foi feito em recipiente com gelo. As amostras foram analisadas no mesmo dia da colheita ou congeladas a -20C at serem processadas, menos de 72 horas aps a colheita, de acordo com as recomendaes publicadas (Vassault et al., 1991). As determinaes do lactato, piruvato, -hidroxibutirato e acetoacetato, glicose e cidos gordos livres foram feitas por mtodos espectrofotomtricos (Czok e Lamprecht, 1974; Williamson et al., 1962; Shimizu et al., 1980; Noll, 1984). Nos ltimos anos do perodo do estudo foi possvel a realizao de 1H RMS na maior parte dos doentes submetidos a estudo por RMN enceflica. Os estudos de 1H RMS foram efectuados em equipamento de 1.5 tesla (Signa, GE) por tcnica PRESS (Point resolved spectroscopy) com TE (echo time) de 144ms (milisegundos). Foi apreciada a existncia de picos anormais de lactato em zonas lesionais e/ou nos gnglios da base do crebro (Boddaert et al., 2008). Considerou-se haver hiperlactacidmia para valores de lactato plasmtico superiores a 2,1mM em qualquer idade e acidose lctica quando a lactacidmia superior a 7mM se associou a acidose metablica sem outra causa conhecida. Subdividiu-se a amostra em termos de lactacidmia em cinco subgrupos: acidose lctica; hiperlactacidmia em trs ou mais determinaes; hiperlactacidmia em menos de trs determinaes; lactato normal em menos de trs determinaes; lactato normal em trs ou mais determinaes, O lactato do lquor foi considerado elevado quando superior a 2,1mM em qualquer idade. A relao lactato/piruvato foi tida como elevada se superior a 20, tanto no plasma como no lquido cefalorraqudeo. A cetonmia foi analisada pelo ratio entre os nveis de corpos cetnicos (somatrio do -hidroxibutirato e acetoacetato) e de cidos gordos livres determinados em simultneo e pela razo -hidroxibutirato/ acetoacetato. Valores normais: cetonmia total - 0,11 68
0,09 (0,02-0,20) uM; -hidroxibutirato/ acetoacetato - 2,9 2,2 (0,7 -5,1) (Diogo et al., 1999). O estudo dos aminocidos nos fluidos biolgicos foi realizado por cromatografia de troca inica, de acordo com protocolos bem estabelecidos (Thomson e Miles, 1964). Definiu-se hiperalaninmia como nveis plasmticos de alanina superiores a 410uM, significativa se superiores a 450M. Nveis plasmticos de prolina superiores a 410M foram classificados como hiperprolinmia. Os cidos orgnicos urinrios foram determinados por cromatografia capilar em fase gasosa acoplada espectrometria de massa (Duez et al., 1996).
A colheita de sangue para estudo mitocondrial em linfcitos (5-10ml) foi realizada por puno venosa para tubos com EDTA e transporte imediato ao laboratrio. A recolha de bipsias de msculo esqueltico foi realizada no bloco operatrio com anestesia geral em sesso cirrgica programada para o efeito ou, sempre que possvel, em coordenao com outras cirurgias de que o doente necessitasse. Na induo anestsica e durante a interveno foram usados (nas doses habituais): tiopental/ propofol, sevoflurano, fentanil/ alfentanil e rocurnio/ atracurio. O msculo deltide esquerdo foi o de eleio, excepto nos casos em que a cirurgia simultnea expunha outros grupos musculares ou nas colheitas post mortem, em que se usou por vezes msculo da parede abdominal. As bipsias hepticas foram realizadas com agulha, guiadas por ecografia e com o doente anestesiado com sevoflurano e alfentanil. Quando necessrio, foram realizadas colheitas imediatamente aps a morte (at 3 hora). Todos os espcimes de miocrdio foram colhidas nestas condies. As amostras de msculo, fgado e miocrdio foram imediatamente congeladas em neve carbnica e transportadas ao Laboratrio de Bioqumica Gentica do CNC, sendo conservadas temporariamente em arca congeladora a -80C, quando necessrio. No primeiro perodo do estudo separou-se simultaneamente uma amostra fresca de msculo esqueltico em meio prprio (meio de extraco de mitocndrias) para transporte, isolamento de mitocndrias e estudo polarogrfico.
Nos primeiros anos do perodo do estudo foram feitas a avaliao polarogrfica e a determinao da actividade enzimtica dos complexos II, III e IV da CRM em linfcitos e dos complexos I a V em mitocndrias isoladas de msculo. Em todo o perodo do estudo esteve disponvel a determinao da actividade enzimtica dos complexos I a V da CRM em homogeneizado de tecidos (msculo esqueltico, fgado e miocrdio). O isolamento de linfcitos e de mitocndrias de msculo esqueltico e a preparao de homogeneizados de tecidos foram realizados segundo os mtodos descritos por Rustin (Rustin et al., 1994). A concentrao de protenas foi determinada 69
pelos mtodos de Bradford ou de Lowry, consoante o teor proteico da amostra era inferior a 5 ou superior a 10g/ml, respectivamente (Lowry et al., 1951; Bradford, 1976). A anlise do consumo de oxignio foi feita por polarografia em linfcitos e em mitocndrias isoladas, de acordo com o mtodo usado por Rustin, com a utilizao de um elctrodo de oxignio do tipo Clarke em duas cmaras. Estudou-se segmentos especficos da CRM: o segmento I-IV, o complexo II e o complexo III, atravs da oxidao do malato-piruvato, do succinato e do duroquinol, respectivamente, com o uso de activadores e inibidores especficos (Rustin et al., 1994). As actividades enzimticas dos complexos da CRM e da citrato sintase foram avaliadas de acordo com os protocolos publicados por Darley-Usmar e por Rustin num espectrofotmetro de duplo comprimento de onda (DW -2000, Aminco) associado a um registador (Graphtec Pen Plotter MP 4400) e a um banho termostatizado (37C), ligado ao compartimento onde se colocou a amostra (Rustin et al., 1994). Nos linfcitos foram estudados os complexos II, III, IV e o segmento II+III da CRM e a citrato sintase por espectrofotometria. Nos homogeneizados de tecidos (msculo, fgado, miocrdio) e nas mitocndrias isoladas, foram tambm investigados os complexos I e V da CRM, assim como o segmento I+III. A aplicao dos mtodos anteriormente referidos s amostras biolgicas em causa foi descrita por Grazina (Grazina, 2004). A actividade enzimtica foi expressa de quatro modos diversos: nmol/min/mg protena, em funo do limite inferior do v.r.; nmol/min/mg protena, em funo da percentagem da mdia do v.r.; corrigida para a citrato sintase, em funo do limite inferior do v.r.; corrigida para a citrato sintase, em funo da percentagem da mdia do v.r. Considerou-se ser a actividade enzimtica da CRM inferior ao normal (num tecido ou no total dos tecidos estudados em cada doente), sempre que pelo menos um dos complexos enzimticos (I a V) apresentasse valor inferior ao normal (inferior a 30% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase) em qualquer tecido. Nas amostras com dfice de trs ou mais complexos da CRM, foi estabelecido haver dfice generalizado ou mltiplo, respectivamente se estava ou no envolvido o complexo II.
4.2.2
Estudos anatomo-patolgicos
As amostras de msculo para estudo histolgico foram divididas em trs pores: uma conservada em formol, outra, em gluteraldedo e a terceira, enviada a fresco ao laboratrio. O fragmento fresco, processado 15-30 aps a colheita, foi colocado numa rolha de cortia e congelado em isopentano arrefecido em azoto lquido (-160C). Com o criostato foram feitos cortes de 8-10 m de espessura e aplicadas as diferentes tcnicas histoqumicas e histoenzimolgicas, a seguir mencionadas. Tcnicas histoqumicas: 70
hematoxilina / eosina avaliao da estrutura geral do msculo; Periodic Acid-Schiff (PAS) - presena de glicognio; Oil Red O presena de lpidos; Tricrmio Gomori cora as mitocndrias, alm de outras estruturas como as barras (rods) da miopatia da nemalina e vacolos; permite identificar as fibras vermelhas rotas. Tcnicas
histoenzimolgicas: Nicotinamida Adenina Dinucletido - Tetrazolium Reductase (NADHTR) - cora as mitocndrias, retculo sarcoplsmico e tbulos-T; Succinato-desidrogenase (SDH) identifica as mitocndrias; SDH modificada mais sensvel do que a anterior, demonstra as fibras com excesso de mitocndrias; COX - evidencia mitocndrias; ATPase miofibrilhar a pH 4.35 e a 9.4 permite distinguir os tipos de fibras (Old e Johnson 1989; Dawson et al., 2003). O fragmento fixado em gluteraldedo a 4% foi dividido em pequenas pores de 1x2mm. Estas foram includas em Epon, cortadas em fatias semi-finas, com 0,5 a 1 m de espessura (Ultramicrtomo e Knifemaker Leica) e coradas com o azul de toluidina. A partir destes cortes semifinos foram seleccionadas as reas a estudar em microscopia electrnica, tendo sido feitos cortes ultrafinos (em grelhas de cobre Bio-Rad)
contrastados com acetato de uranilo - segundo Valentin e citrato de chumbo - segundo Reynolds (Microscpio Electrnico Jeol - JEM 100S). As amostras de fgado e miocrdio foram submetidas ao estudo em microscopia ptica. Foram enviadas ao laboratrio fixadas em formol e a sua morfologia foi analisada aps colorao com hematoxilina-eosina. Tcnicas especficas, como a colorao para 1antitripsina, foram aplicadas em casos seleccionados.
4.2.3
Estudos de gentica molecular
A extraco bem como a quantificao de cidos nuclecos dos tecidos, essencialmente mtDNA e nDNA, foram efectuadas de acordo com os mtodos habituais (Sambrook et al., 1987; Moore et al., 1997). O estudo do mtDNA foi realizado com recurso a tcnicas de PCR, (Coen et al., 1997), incluindo a PCR de produtos longos (L-PCR) (Paul et al., 1996), a PCR de flanqueamento de deleces (FD-PCR) (Kaluz et al., 1996), a PCR especfica de mutao (MS-PCR) (Wu et al., 1989; Ehlen e Dubeau, 1989; Newton et al., 1989; Kwok et al., 1990), a PCR-RFLP ie, com o uso de enzimas de restrio, electroforese em gel de agarose (Moore et al., 1997) e sequenciao automtica (Ausubel et al., 1997), adaptadas (Grazina, 2004). As mutaes investigadas e as tcnicas usadas para a deteco de deleces sofreram uma evoluo ao longo do perodo de estudo (ver Anexos, tabelas 40 a 44, pginas 257265). As amostras de DNA foram rastreadas para grandes deleces usando L-PCR e, na segunda metade do perodo de estudo, FD-PCR. As mutaes 71 pontuais foram
pesquisadas por MS-PCR e PCR-RFLP. Sempre que foi detectada uma alterao do mtDNA, os produtos em soluo foram purificados por electroforese em gel de agarose. A confirmao das alteraes encontradas foi feita por sequenciao automtica. Na ltima parte do perodo do estudo, foi realizado um rastreio alargado de mutaes por PCR e sequenciao automtica. As alteraes nele encontradas foram confirmadas por PCRRFLP (Grazina, 2004). A quantificao do mtDNA foi feita num caso suspeito de depleo com PCR em tempo real (real time PCR). Em casos seleccionados, foi realizado o estudo de algumas mutaes do nDNA associadas a DCRM, nomeadamente os genes DGUOK e SURF1, por sequenciao.
72
4.3 Critrios de diagnstico utilizados
Aplicaram-se retrospectivamente os critrios de DCRM de Walker adaptados a doentes peditricos pela equipa de Melbourne- critrios de Bernier (Walker et al., 1996; Bernier et al., 2002). Os critrios clnicos e laboratoriais so considerados majores ou minores, consoante o grau de importncia diagnstica que lhes atribuda (tabelas 1-4). Alguns critrios no foram usados porque no investigados nos nossos doentes, nomeadamente o crescimento dos fibroblastos em meio com galactose, o estudo em linhas celulares ou a avaliao dos componentes proteicos dos complexos da CRM. Classificou-se os nossos doentes em quatro grupos de segurana diagnstica: definido, provvel, possvel e improvvel. Definido, se preenchia dois critrios majores ou um critrio major e dois critrios minores. Provvel, se tinha um critrio major e um minor ou pelo menos trs critrios minores. Possvel, se preenchia um major ou dois minor, um dos quais laboratorial. Quando o doente cumpria apenas critrios minores e no associava critrios clnicos e laboratoriais, foi considerado improvvel que tivesse uma DCRM (Bernier et al., 2002). De acordo com a existncia ou no de um outro diagnstico etiolgico, os doentes foram ainda subdivididos em DCRM primria e secundria. Analisou-se comparativamente os vrios subgrupos diagnsticos finais, com destaque para o com DCRM definida primria.
Com o objectivo de aferir os critrios de diagnstico utilizados recorreu-se a uma comparao dos resultados assim encontrados nos nossos doentes com os obtidos com a aplicao de parte da escala diagnstica de DCRM peditrica do grupo de Nijmegen nossa amostra. A escala de Nijmegen utiliza dois conjuntos de critrios, na ausncia de diagnstico molecular: os gerais (subdivididos em trs categorias: clnicos, metablicos/imagiolgicos e morfolgicos) e os estudos bioqumicos mitocondriais (oxidao de substratos marcados com
14
C, produo de ATP e de fosfocreatina e actividade enzimtica dos
complexos da CRM). Cada um dos grupos de critrios classifica os doentes em DCRM improvvel, possvel, provvel e definida e o diagnstico final obtido atravs do cruzamento dos resultados em cada um dos conjuntos, numa tabela de dupla entrada (Wolf e Smeitink, 2002). Por limitaes metodolgicas, foi aplicada amostra apenas a poro da escala correspondente aos critrios gerais de Nijmegen. Esta valoriza de 0 a 4 pontos trs grupos de itens: apresentao clnica (muscular, neurolgica ou multissistmica), investigaes metablicas e outras (incluindo a imagem cerebral) e investigao morfolgica. As investigaes referentes aos critrios sublinhados no quadro no foram feitas em nenhum dos doentes em anlise (tabelas 5 e 6). 73
Tabela 1 - Critrios majores de diagnstico de DRCM aplicados aos 200 doentes.
I CLNICOS 1 - Encefalomiopatia clinicamente completa 2 - Sndrome de Leigh (encefalopatia necrotisante subaguda) 3 - Sndrome de Alpers (poliodistrofia infantil progressiva) 4 - Encefalopatia mitocondrial letal infantil/ Miopatia letal infantil (fraqueza severa, generalizada
e progressiva, dispneia/polipneia, acidose lctica e envolvimento multissistmico; fatal < 1 ano idade)
5 - Sndrome de Pearson (medula pncreas) 6 - Sndrome de Kearns-Sayre 7 - Sndrome MELAS (encefalopatia mitocondrial, acidose lctica e acidente vascular cerebral) 8 - Sndrome MERRF (epilepsia mioclnica e RRF) 9 - Sndrome NARP (neuropatia, ataxia e retinite pigmentar) 10 - Sndrome MNGIE (doena mioneurogastrointestinal e encefalopatia) 11 - LHON (neuropatia ptica hereditria de Leber) 12 - Combinao inexplicada de sintomas multissistmicos (pelo menos trs orgos/ sistemas) + Curso clnico progressivo com episdios de exacerbao ou histria familiar materna positiva para DCRM provvel ou definitiva + Excluso de outras causas
II- HISTOLGICOS
Bipsia msculo esqueltico: > 2% de RRF
III ENZIMTICOS
1.-.>2% de fibras COX negativas numa bipsia muscular (ou 5% se >50 anos de idade) 2 - <20% de actividade mdia do v.r. de qualquer complexo da CRM num tecido 3 - <30% de actividade mdia do v.r. de qualquer complexo da CRM numa linha celular 4.-. <30% de actividade mdia do v.r. do mesmo complexo da CRM em >1 tecido
IV- FUNCIONAIS
Controlo respiratrio ou relao estado 3/ 4: < 3 SD da mdia
V MOLECULARES
Identificao de alterao do mDNA ou do nDNA de indiscutvel patogenicidade.
Para o mtDNA, cumprindo os seguintes critrios: 1) heteroplasmia (excepto LHON); 2) presente em nveis significativos; 3) ligao ao mesmo fentipo em pelo menos dois casos de famlias diferentes; 4) ausncia da mutao em saudveis, excepto familiares assintomticos; 5) transmissibilidade do defeito da CRM com o mtDNA em cbridos; 6) alterao de aminocidos, rRNA ou tRNA conservados ao longo da evoluo.
Os critrios sublinhados no foram usados.
v.r. - valor de referncia
(adaptado de Bernier et al., 2002)
74
Tabela 2 - Critrios clnicos minor de diagnstico de DRCM aplicados aos 200 doentes.
I - CLNICOS
1- Neurolgico 1 - Hipotonia ou hipertonia neonatal 2 - Alterao da suco/ dificuldades alimentares no perodo neonatal 3 - Coma cetoacidtico 4 - Doena do movimento 5 - Ataxia cerebelosa 6 - Atraso motor 7 - Hipotonia axial 8 - Sndrome piramidal 9 - Demncia ou atraso mental 10 - Epilepsia/ mioclonias 11 - Episdios do tipo acidente vascular cerebral 12 - Neuropatia perifrica 13 - Apneia recorrente 14 - Poliodistrofia 15 - Leucodistrofia 16 - Episdios de prostrao inexplicada e/ou agravamento com infeces intercorrentes
2- Muscular
1 - Miopatia ocular (oftalmoplegia externa e ptose) 2 - Hipotonia e fraqueza muscular progressiva 3 - Intolerncia ao exerccio 4 - Atrofia muscular/ emaciao 5 - Mialgias/ rabdomilise (mioglobinria) 6 - Intolerncia ao esforo com distrofia muscular
3- Cardaco
1 - Defeitos de conduo 2 - Miocardiopatia hipertrfica ou, mais raramente/, dilatada (fibrose intersticial, fibroelastose)
4- Renal
1 - Sndrome de Fanconi (frequentemente parcial) 2 - Sndrome nefrtico 3 - Nefropatia tubulointersticial crnica
5- Nutricional
1 - Restrio de crescimento intra-uterino 2 - Atraso crescimento ps-natal / m progresso ponderal 3 - Anorexia severa 4 - Vmitos recorrentes 75
5 - Diarreia crnica com atrofia vilositria e/ou insuficincia pancretica excrina 6 - Pseudo-obstruo intestinal crnica (no adulto)
6- Heptico
1 - Insuficincia heptica (neonatal severa / tardia). 2 - Elevao das enzimas hepticas 3 - Esteatose, cirrose, micro ou macronodular
7- Endcrino
1 - Diabetes mellitus 2 - Hipoparatiroidismo 3 - Hipotiroidismo 4 - Dfice de ACTH 5 - Nanismo (-4 a -6 SD com GH normal; diminuio de IgF1 com alterao do estado redox plasma)
8- Hematolgico
Anemia macroctica / pancitopenia (sideroblastos em anel e vacuolizao precursores)
9- Otolgico - Surdez neurosensorial 10 - Oftalmolgico

1 - Degenerao retiniana / distrofia 2 - Atrofia ptica 3 - Catarata 4 - Opacidade crnea
11- Dermatolgico
1- Pigmentao mosqueada das reas expostas luz 2 - Acrocianose 3 Hipertricose 4 - Alopecia
5 - Cabelo anormal (seco, espesso, quebradio) Pili torti/ trichorrhexis nodosa 6 - Keratoderma palmoplantar (descrito + surdez) 7 - Nevo epidrmico 8 Ictiose 9 - Colesteatoma
12- Dismorfismo
1 - Facial (associado a microcefalia e atraso de crescimento pr ou ps-natal) Face redonda, fronte alta, nariz pequeno com filtro achatado e longo; pavilhes auriculares de implantao baixa, angulao posterior com hlix deficiente e lbulos hipoplsicos 2 - Mos curtas, braquidactilia, hipoplasia das falanges distal e mdias, hipoplasia das unhas 3 - Associao VATER (Vertebral, Anal, Traqueo-Esofgico, Renal)
13- Outros
1 - Lipomatose simtrica mltipla 2 - Nado-morto com pobreza de movimentos intra-uterinos na histria familiar 3 - Colapso/ morte neonatal na histria familiar
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Tabela 3 - Outros critrios minores de diagnstico de DRCM aplicados aos 200 doentes.
II - HISTOLGICOS
1 - Um a 2% de RRF (30-50 anos de idade) 2 - Presena de RRF (< 30 anos de idade) 3 - > 2% acumulao mitocondrial subsarcolmica (<16 anos de idade) 4 - Alteraes mitocondriais difusas na microscopia electrnica em qualquer tecido III ENZIMTICOS 1 - Demonstrao de um defeito de expresso dos complexos da CRM - uso de acs 2 - Vinte a 30% da actividade mdia do v.r. de qualquer complexo da CRM num tecido 3 - Trinta a 40% da actividade mdia do v.r. de qualquer complexo da CRM numa linha celular 4 - Trinta a 40% da actividade mdia do v.r. do mesmo complexo da CRM em >1 tecido IV - FUNCIONAIS 1 - Controlo respiratrio ou relao estado 3/ 4: dois a 3 desvios-padro abaixo da mdia 2 - Fibroblastos incapazes de crescer num meio sem glicose e com galactose V.- MOLECULARES Identificao de alterao do mDNA no previamente reconhecida como estando associada com o sndrome de apresentao e preenchendo alguns, embora no todos, os seis critrios VI - METABLICOS 1 - Elevao do lactato, piruvato e/ou alanina (prolina) no lquor e/ou sangue 2 - Elevao das protenas do lquor na suspeita de KSS 3 - Alterao metabolismo msculo/ crebro: 31P-MRS/ PET (Positron Emission Tomography) 4 - Diminuio do volume de oxignio no mximo de exerccio (VO2max), da diferena arteriovenosa de oxignio (AVO2D) ou do limiar para lactato na ergonometria (no explicados pela falta
de exerccio)
v.r. - valor de referncia
Tabela 4 - Graus de diagnstico final de DRCM segundo a classificao de Bernier.
DEFINIDO
2 majores ou 1 major + 2 minores
PROVVEL
1 major + 1 minor ou 3 minores
POSSVEL
1 major ou 2 minores (um dos quais laboratorial)
IMPROVVEL
2 minores (ambos clnicos ou laboratoriais) ou 1 minor
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Tabela 5 - Critrios gerais de DCRM de Nijmegen.
I Clnicos (mximo: 4 pontos)

A - Apresentao muscular sinais e sintomas musculares (mximo: 2 pontos) 1- Oftalmoplegia externa progressiva (2 pontos) 2- Ptose, facies mioptica (1 ponto) 3- Intolerncia ao exerccio (fadiga prematura ou anormal, fraqueza, dores musculares ou caimbras
aps actividades normais da vida diria) (1 ponto)
4- Diminuio da fora muscular (evidenciada por testes formais, se possvel, ou sinal de Gowers
positivo ou ausncia/ diminuio do controlo ceflico ou atraso do desenvolvimento motor os ltimos s se o desenvolvimento mental for normal ou muito avanado em comparao com o motor) ou
hipotonia muscular (no perodo neonatal e at uma idade de neurodesenvolvimento de 6 meses, com
queda da cabea no teste de traco, controlo ceflico pobre, deixar-se deslizar quando suspenso pelas axilas, postura em r dos membros inferiores quando acordado e cabea e membros pendentes quando em suspenso ventral) (1 ponto)
5- Episdios de rabdomilise aguda (episdios agudos com dor muscular severa, fraqueza muscular,
elevao excessiva da creatina cinase - CK- ou mioglobinria) (1 ponto)
6- Electromiograma anormal (ligeiras alteraes miopticas: potenciais de aco da unidade motora

de amplitude e durao reduzidas ou com recrutamento precoce ou reduo da amplitude e durao dos potenciais de aco da unidade motora com aumento do nmero de potenciais polifsicos).
Qualquer outro envolvimento: SNC (mximo: 1 ponto) ou multissistmico (mximo:2 pontos) mximo 2 pontos (ver aquelas estas seces). B - Apresentao do SNC (mximo: 2 pontos, 1 ponto cada) 1 - Atraso ou ausncia de desenvolvimento psicomotor (atraso significativo em duas ou mais
reas do neurodesenvolvimento: motricidade grosseira e fina, cognio, fala/linguagem, pessoal/social ou actividades da vida diria, tal como demonstrado em testes de rastreio) ou atraso mental (QI <70)
2 - Perda de capacidades adquiridas 3 - Episdios tipo acidente vascular cerebral (hemianpsia, hemiplegia transitrias etc.) 4 - Migraine 5 - Convulses francas ou electroencefalograma anormal (lentificao da actividade de base,
actividade epileptiforme generalizada, ou lentificao ou actividade convulsiva focais)
6 - Mioclonias ou epilepsia mioclnica 7 - Cegueira cortical (perda de viso e nistagmo optocintico num doente com o restante exame
visual normal e respostas pupilares luz intactas)
8 - Sinais e sintomas piramidais (hipertonia muscular, opisttonus, hiperreflexia osteotendinosa,

Babinsky, etc)
9 - Sinais e sintomas extrapiramidais (atetose, distonia, movimentos involuntrios)
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10 - Sinais e sintomas de leso do tronco cerebral (distrbios autonmicos como apneias centrais,
hipoventilao central, bradicardia ou taquicardia sinusal; dificuldades na deglutio, nistagmo, estrabismo; ondas III a V anormais ou ausentes nos potenciais evocados auditivos)
11- Sinais/sintomas de envolvimento cerebeloso (ataxia, tremor intencional, disdiadococinesia) Qualquer outro envolvimento msculo (mximo 1 ponto) ou multissistmico (mximo 2 pontos) mximo 2 pontos (ver aquelas estas seces). C - Envolvimento multissistmico (mximo: 3 pontos, 1 ponto cada sistema) Hematolgico 1 - Anemia sideroblstica; 2- Pancitopenia Tracto gastrointestinal 1 - Alterao aguda ou crnica da funo heptica (elevao das enzimas hepticas, diminuio
da sntese de protenas hepticas, diminuio da excreo de bilirrubina, hipoglicmia)
2 - M progresso ponderal (insuficiente aumento de peso, peso abaixo do P3, ou -2DP ou a cruzar
percentis).
3 - Alterao da funo pancretica excrina (> 7% excreo de gordura) 4 - Pseudo-obstruo intestinal (obstipao, dor tipo clica e vmitos, sem obstruo orgnica) 5 - Diarreia crnica, sem outra causa conhecida (> 3 semanas) Endcrino 1 - Baixa estatura (<-2 DP ou < P3) 2 - Atraso pubertrio 3 - Diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2 ou reduo da tolerncia glicose 4 - Hipoparatiroidismo Cardaco 1 - Miocardiopatia (hipertrfica ou dilatada) na ausncia de vitium cordis ou hipertenso 2 - Bloqueio de conduo (aurculo-ventricular I a III, de ramo, sndromes de pr-excitao) Renal 1 - Tubulopatia proximal (sndrome de Fanconi completo ou parcial) 2 - Glomerulosclerose focal e segmentar (bipsia) Oftalmolgico 1 - Catarata 2 - Atrofia ptica 3 - Retinopatia (electrorretinograma) Audio - Surdez neurosensorial Nervo - Neuropatia perifrica Geral 1 - Exacerbao dos sinais e sintomas anteriores com doenas intercorrentes banais 2 - Morte neonatal ou infantil, sbita, inexplicada na histria familiar Qualquer outro envolvimento msculo ou SNC mximo 1 ponto (ver aquelas seces) 5 - Diabetes inspida central
79
Critrios gerais de DCRM de Nijmegen (continuao)
II - Investigao metablica e outras (mximo: 4 pontos)

1 - Lactato plasma > 2000 mol/l (espontneo, ps-prandial ou teste de tolerncia glicose oral) em pelo menos trs ocasies (2 pontos) 2 - Aumento da razo lactato/piruvato > 18 (s se o lactato estiver elevado) (1 ponto) 3 - Aumento da alanina (plasma) > 450 mol/l (2 pontos) 4 - Aumento do lactato do lquor (> 1800 mol/l, pontua s se o lactato do plasma normal) (2 pontos) 5 - Aumento das protenas do lquor (1 ponto); 6 - Aumento da alanina do lquor (2 pontos) 7 - Urina: aumento da excreo de lactato ou intermedirios do ciclo de Krebs (2 pontos) 8 - Aumento da excreo dos cidos etilmalnico ou 3-metilglutacnico ou dicarboxlicos
(adpico, subrico, sebcico) (1 ponto)
9 - Aumento do Pi e reduo da razo fosfocreatina/ Pi no msculo (31P RMS) (2 pontos) 10 - RMN: sndrome de Leigh (leses hiperintensas em T2 a nvel dos putamina, globos plidos,
ncleos caudados) (2 pontos)
11 - RMN: leses do tipo das do acidente vascular cerebral -AVC - (no confinadas a um
territrio vascular) ou leucodistrofia ou atrofia cerebral/cerebelosa (1 ponto);
12 - 1H-RMS cerebral: pico de lactato claramente visvel (1 ponto)
III -Morfologia (mximo: 4 pontos)

1 - Fibras vermelhas rotas (Ragded Red Fibres - RRF) ou fibras azuis rotas (Ragged Blue
Fibres- RBF): se presentes num doente peditrico =2 pontos; se 2 % =4 pontos

2 - Fibras COX-negativas: se presentes num doente peditrico =2 pontos, se 2%=4 pontos 3 - Colorao pela COX globalmente muito reduzida (excludos problemas tcnicos) (4 pontos) 4 - Colorao pela SDH anormal (reduzida ou irregular) (1 ponto) 5 - Vasos sanguneos fortemente corados pela SDH (2 pontos) 6 - Microscopia electrnica: mitocndrias anormais (mximo 2 pontos): agregados subsarcolmicos ou intermiofibrilhares de mitocndrias (1 ponto); mitocndrias alargadas ou alongadas (2
pontos); aumento das cristas com orientao irregular, padro em favo de mel, rodas concntricas ou
pobreza de cristas (no ltimo caso- aspecto vacuolar/ vazio das mitocndrias) (2 pontos); incluses mitocondriais anormais (cristalinas, globulares) (2 pontos); gotculas lipdicas (1 ponto)
(adaptado de Wolf e Smeitink, 2002)
80
Tabela 6 - Graus de diagnstico segundo os critrios gerais de DCRM de Nijmegen.
Pontuao total 8 12 pontos 5 7 pontos 2 4 pontos 1 ponto
Grau de diagnstico
Definido Provvel Possvel Improvvel
(adaptado de Wolf e Smeitink, 2002)
Realizou-se a anlise de concordncia entre as classificaes obtidas com os critrios gerais de Nijmegen e com a escala de Bernier adaptada, isto , sem os estudos funcionais e moleculares da CRM, no constantes da primeira, relativamente aos 200 doentes e a subgrupos especficos. Fez-se ainda a anlise de concordncia entre as diferentes formas de traduzir o resultado da actividade enzimtica (< 20% e < 30% da mdia do v.r. e inferior ao limite inferior do normal, com ou sem normalizao para a citrato sintase) e os nveis de diagnstico obtidos pela aplicao amostra dos critrios gerais de Nijmegen. Comparou-se o grupo Definido com Outros e com Possvel/Improvvel e o grupo Definido/Provvel com Outros, com os valores funcionais expressos nas diferentes unidades.
81
4.4 Incidncia e prevalncia na Regio Centro de Portugal
Fez-se a estimativa da incidncia e prevalncia de DCRM na Regio Centro de Portugal. Excluram-se 16 dos 78 doentes com o diagnstico de DCRM definida primria por terem nascido fora da Regio Centro. A incidncia de DCRM com manifestao clnica na primeira dcada de vida foi calculada pela razo entre o nmero de crianas com DCRM e o nmero de nado-vivos na Regio Centro de Portugal no perodo de 1989-1996 (oito anos). A prevalncia pontual foi determinada pelo quociente entre o nmero de doentes com menos de 10 anos de idade, vivos em 31 de Dezembro de 2006, e o nmero de crianas da mesma idade residentes na Regio Centro de Portugal em 2006.
4.5 Anlise estatstica
A anlise estatstica deste trabalho foi efectuada com o apoio dos softwares SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) e Stata (Data Analysis and Statistical Software). Na estatstica inferencial foram usados apropriadamente os testes do quadrado, o teste T-Student e ANOVA de um factor. Foi feita tambm anlise de sobrevivncia com curvas de Kaplan Meier e testes de Log-Rank. Na anlise de concordncia, o valor de Kappa foi valorizado do seguinte modo: <0 sem concordncia; 0,0-0,2 - concordncia muito baixa; 0.21 0.40 baixa; 0.41 0.60 moderada; 0.61 0.80 total/ completa; 0.81 1.00 quase perfeita. Em toda a anlise estatstica realizada utilizou-se como nvel de significncia p=0.05. Para no tornar a anlise estatstica dos resultados pesada e repetitiva, sempre que se indica existir diferena/relao entre duas variveis essa diferena/relao
estatisticamente significativa.
82
Captulo 5 Resultados
CAPTULO 5 RESULTADOS
83
84
5. RESULTADOS
5.1 Caracterizao clnico-laboratorial da amostra
5.1.1
A clnica das crianas com suspeita de doena mitocondrial
De 1997 a 2006 (10 anos) foram investigados no HP 200 doentes com clnica sugestiva de DCRM, atravs de anlise de tecidos (msculo esqueltico, fgado e/ou miocrdio). Cento e cinco doentes (52,5%) eram do sexo masculino, com uma relao masculino / feminino 1,1:1. A distribuio dos casos investigados ao longo dos anos em que o estudo decorreu, sendo o ano referenciado pela data da colheita de tecidos para estudo mitocondrial, est representada na figura 10.
35 30 25 20 15 10 5 0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
n = 200
N de casos
Anos do estudo
Figura 10 - Distribuio dos casos investigados por anos do perodo de estudo.
Apresentao clnica As 200 crianas, todas de raa caucasiana, faziam parte de 196 famlias (quatro pares de irmos). Havia consanguinidade em 16 famlias (8%), em primeiro grau em trs casos. Registou-se uma histria de morte inesperada de familiares prximos em 47 famlias (24%), mais de um tero das quais (38%), no perodo neonatal e mais de metade (60%) nos dois primeiros anos de vida. Em duas famlias, o pai tinha falecido subitamente.
85
Constatou-se doena relevante nos progenitores em 52 famlias (19 pais e 41 mes). Nestas, a doena era do foro neurolgico em 17, psiquitrico em 9 e endcrino em 4. Havia antecedentes mrbidos significativos em 110 famlias (56%): 85 (77%) e 55 (50%), nas linhas materna e paterna respectivamente. Tratava-se de um primeiro filho em 90 casos (46%) e do nico filho poca da investigao, em 60 (31%). Em 12 casos (6%) havia histria de irmos falecidos. Dos 140 doentes com irmos vivos, 19 tinham irmos com patologia relevante (14%). Quarenta e seis crianas (23%) tinham nascido fora da Regio Centro. Quarenta e sete doentes (24%) pertenciam ao distrito de Coimbra (figura 11).
Figura 11 - Mapa de distribuio dos doentes por distrito.

O nmero de doentes em cada um dos distritos est sinalizado.
Oitenta e seis doentes (43%) eram fruto de uma primeira gestao. A gestao tinha sido considerada de risco por morte pr-natal anterior em 12 casos (6%). Tinham ocorrido complicaes na gravidez em 54 casos (27%): ameaa de abortamento em duas gestaes e de parto prematuro em 12; doena materna em 28 (hipertenso arterial, pr-eclmpsia e/ou colestase gravdica em sete e infeces no urinrias em seis) e doena fetal em 11 (hidrmnios: 5). Havia referncia a diminuio dos movimentos fetais em 10 casos. Vinte e nove partos (15%) foram de pr-termo. O parto foi distcico em 77 casos (39%), motivando frceps ou ventosa em 19 (10%) e cesariana em 58 (29%). Dezanove recm-nascidos (10%) tiveram critrios de asfixia perinatal. Tinha sido feita reanimao com entubao traqueal e ventilao assistida em 14 recm-nascidos e com 86
mscara e oxignio em 22. Sessenta e trs recm-nascidos (32%) tinham tido internamento neonatal superior ao habitual: 22 at uma semana e 10, por mais de um ms.
Em 153 casos (76,5%) a clnica de apresentao foi predominantemente NM e os 47 restantes (23,5%) apresentaram-se com sinais de outro tipo, ENM., como atraso de crescimento e/ou alteraes hepticas, cardacas, oftalmolgicas ou multissistmicas. A idade de apresentao clnica variou entre o primeiro dia de vida e os 9 anos de idade, com uma mdia de 10 meses e uma mediana de 3 meses. Na tabela 7 relacionase a idade de incio com o tipo de apresentao.
n = 200
1,1 1 0,9 0,8 86% 97% 100%
% cumulativa
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 35% 0,2 0,1 0 NN < 6M < 12M < 2A < 6A < 10A 59% 71%
Grupos etrios
Figura 12 - Idade de incio de manifestaes clnicas nos vrios grupos etrios

Abreviaturas: NN- perodo neonatal; <6M - primeiro semestre de vida; <12M primeiro ano (lactente); <2 A primeiros dois anos; <6 A primeiros 6 anos; <10 A primeira dcada de vida; M- meses de vida; A- anos de vida.
Tabela 7 - Relao entre a idade e o tipo de apresentao clnica em 200 doentes.
Idade incio Total ENM NM
n 200 47 153
Mnimo 1d 1d 1d
Mximo 9A 9A 8A
Mediana 3M 1M 3M
Mdia 10M 11M 9M
DP (A) 1,46 1,99 1,25
Abrevisaturas: 1d primeiro dia de vida; M- meses de vida; A- anos de vida
87
Cerca de um tero das crianas (35%) teve manifestaes clnicas no perodo neonatal e 59%, no primeiro semestre de vida. A quase totalidade dos doentes (96,5%) apresentou-se nos primeiros cinco anos e todos antes dos 10 anos de idade (figura 12).
No que diz respeito s circunstncias da apresentao clnica, o grupo de 200 doentes foi subdividido em dois, como referido na tabela 8, com implicaes no diagnstico e no prognstico: doentes crnicos (148/200; 74%), que representam 82% dos casos NM e 47% dos ENM; doentes agudos - crianas previamente saudveis (32) ou com doena crnica (20) que sofreram um episdio mrbido agudo, fatal ou altamente incapacitante: 26% da amostra total (52/200) e que corresponde a 18% dos NM e 53% dos ENM. Inclui trs casos de morte sbita, uma aos 21 meses de idade em criana com atraso de crescimento desde os cinco meses e duas, em crianas anteriormente saudveis, aos 4 meses e aos 4 anos, respectivamente.
Tabela 8 - Relao entre a idade de incio dos sintomas e o tipo de clnica na altura do estudo.
Idade incio Crnico Agudo
n 148 52
Mnimo 0 dias 0 dias
Mximo 8A 9A
Mediana 4M 14 dias
Mdia 10M 9M
DP (anos) 1,29 1,87
Abreviaturas: M- meses de vida; A- anos de vida; Crnico doente crnico, sem agudizao; Agudo - episdio agudo, fatal ou altamente incapacitante em criana saudvel ou com doena crnica.
Cinquenta crianas tinham apresentado alteraes pr-natais: restrio de crescimento intra-uterino (26), malformaes (25) e/ou dismorfismos (12); miocardiopatia dilatada com diagnstico pr-natal (um); taquicardia fetal com hidropisia tratada in tero (um). As malformaes mais frequentes (figuras 13 e 14) foram do foro ortopdico (luxao congnita da anca: cinco; malformao dos ps: quatro, artrogripose: trs) ou cardiovascular (comunicao interauricular: quatro; comunicao interventricular: trs; artria umbilical nica: dois; cor triatrium: um; malformao dos grandes vasos: um). A restrio de crescimento intra-uterino era simtrica em nove recm-nascidos e assimtrica nos restantes (11 ponderais e do comprimento, em seis). Dos 144 casos com acesso ao registo do permetro ceflico ao nascimento, em trs havia microcefalia, todos com atraso de crescimento simtrico. Registou-se macrossomia num caso. Das 50 crianas com alteraes clnicas pr-natais, 33 (67%) tiveram sintomas que motivaram cuidados mdicos no perodo neonatal, nove no primeiro semestre de vida e duas, no segundo semestre.
88
n = 25
3 1 12
11
Ortopdica
Cardio-vascular
Digestiva
Oftalmolgica
Figura 13 - Malformaes congnitas na amostra em estudo.
Figura 14 - P convexo num dos doentes da nossa srie.
Na figura 15 esto representados os sinais e sintomas mais frequentes na apresentao no grupo NM (153 doentes): atraso e/ou regresso do desenvolvimento psicomotor em 77 doentes (50%), hipotonia muscular em 62 doentes (41%), miopatia em 35 doentes (23%) (sendo manifestao clnica isolada em trs casos) e convulses em 32 doentes (21%). Como discriminado na tabela 9, foram encontradas outras alteraes do exame neurolgico em 14 doentes (9%). Observaram-se ainda outros sinais e sintomas, nomeadamente, apneias em nove crianas (6%), alteraes da suco/deglutio em nove doentes (6%) e estrabismo em oito doentes (5%). Havia atraso do
neurodesenvolvimento em 66 (43%) e regresso em 11 (7%) doentes. O atraso era global em 40 crianas, da linguagem em 17 e de predomnio motor, em nove. As manifestaes ENM, forma de apresentao em 47 crianas, seis das quais foram objecto de publicao (Diogo et al., 1998), consistiram em: atraso de crescimento psnatal (19 com m progresso ponderal, dos quais seis com atraso estatural), cardiopatia (11), doena heptica (10), alteraes metablicas sintomticas (nove) [acidose lctica (seis), hipoglicmia (cinco)], dfice visual (seis), digestiva (cinco) [vmitos persistentes ou cclicos (quatro) diarreia crnica (um)], pancitopenia (trs), morte sbita (dois) e eczema grave (um) (figura 16).
89
n = 152
Atraso/RegressoDPM Hipotonia Miopatia Convulses Coma OutrasAlt.Ex.Neurolgico Apneias Estrabismo Alt. suco/deglutio Microcefalia/Macrocefalia 0
n = 153
51%
41% 23% 21% 9% 9% 6% 5% 5% 3%

10 20 30 40 50 60 70 80
N de casos
Figura 15 - Sinais e sintomas de apresentao neurolgica e/ou muscular em 153 doentes.

Abreviaturas: OutrasAlt.Ex.Neurolgico- outras alteraes do exame neurolgico; Alt.- alteraes
Tabela 9 - Apresentao clnica outras alteraes neurolgicas em 14 doentes.
Outras alteraes exame neurolgico Ataxia Sndrome piramidal Distonia Tremor Paralisia flcida Total 6 4 2 1 1 14
Como se pode ver na figura 16, a apresentao cardaca ocorreu em 23% dos casos com manifestaes clnicas iniciais ENM (11 doentes), sendo a miocardiopatia dilatada a alterao mais frequentemente observada (figuras 17 e 18).
90
48 nn== 47
Atraso Crescimento Cardaca Heptica Metablica Dfice visual Digestiva Pancitopenia Morte sbita Eczema grave 0 2% 5 10 15 20 4% 6% 13% 10% 23% 21% 19% 40%
N de casos
Figura 16 - Sinais e sintomas de apresentao ENM em 47 doentes.
n = 11
1 2
6 2
Miocardiopatia dilatada Arritmia
Miocardiopatia hipertrfica Cardiopatia congnita sintomtica
Figura 17 - Apresentao cardaca observada em 11 doentes.
Figura 18 - Cardiomeglia num doente com miocardiopatia dilatada
91
Dez doentes apresentaram clnica inicial do foro heptico (figura 19).
n = 10
Insuficincia heptica
Colestase
Hepatite
Figura 19 - Apresentao heptica observada em 10 doentes.
Evoluo A evoluo foi rapidamente fatal (em menos de uma semana) em nove doentes: quatro (3%) dos do grupo NM e cinco (11%) dos do ENM. Este grupo inclui dois recm-nascidos cuja apresentao foi aguda e a evoluo rapidamente fatal. A morte foi
retrospectivamente atribuda a choque hemorrgico por descolamento da placenta, num e a choque sptico, no outro. Durante o perodo do estudo foi perdido o seguimento de trs doentes, 2 a 9 anos aps a bipsia, pelo que foram includos na anlise da sintomatologia de evoluo. A sintomatologia nas crianas que sobreviveram primeira semana de doena (191) est representada na figura 20. Em 41 das 149 crianas (28%) do grupo NM que sobreviveram primeira semana, surgiram alteraes ENM. Nas restantes 108, o quadro clnico manteve-se NM. Em 31 (74%) dos 42 doentes do grupo ENM que sobreviveram primeira semana houve posterior envolvimento NM. Assim, em 180 de todas as crianas (191) sobreviventes primeira semana de doena (94% destes casos) assistiu-se a uma evoluo com atingimento NM (figura 20). Constatou-se evoluo multissistmica em 44 (23%) dos doentes que ultrapassaram a primeira semana de doena. Como se pode observar na figura 20, as alteraes do foro neurolgico prevaleceram (92% dos casos), destacando-se o atraso e/ou regresso do desenvolvimento psicomotor em 154 destes doentes (88%) (figura 21).
92
n=191
Neurolgica Alt.Crescimento Oftalmolgica Muscular Respiratria Osteoarticular Cardaca Heptica Hematolgica Surdez Digestiva Renal Dermatolgica Endocrinolgica 0 18% 15% 15% 14% 10% 8% 6% 5% 4% 3% 20 40 60 80 100 120 140 160 25% 32% 46%
92%
180
200
N de casos
Figura 20 - Evoluo clnica das 191 crianas sobreviventes primeira semana de doena.
Oftalmolgica - inclui 29 casos com estrabismo, oftalmoplegia e/ou ptose, sem dfice visual Abreviaturas: Alt.Crescimento- alterao do crescimento.
n = 175
A/RDPM Hipotonia Epilepsia Alt. pares craneanos Sindrome piramidal Mov.anormais/distonia Micro/macrocefalia Alt.comport./Autismo Ataxia Coma Neuropatia perifrica 0 9% 20 40 60 80 100 120 140 160 180 27% 23% 22% 19% 17% 15% 40% 38% 53% 88%
N de casos
Figura 21 - Evoluo neurolgica em 175 crianas sobreviventes primeira semana de doena.

Abreviaturas: A/RDPM - atraso e/ou regresso do desenvolvimento psicomotor: 119 crianas apresentaram atraso, 24 atraso e regresso e 11, regresso do desenvolvimento psicomotor. Hipotonia muscular foi observada em 93 doentes, sendo
generalizada em 55 doentes e axial em 38 doentes. Mov. anormais / Distonia: movimentos anormais em 28 doentes e distonia em 20 doentes. Micro/ Macrocefalia: microcefalia 33 crianas e macrocefalia em cinco. comportamento- 24 doentes e perturbao do espectro autista - 20 crianas. Alt.comport./ Autismo: alteraes
93
Em 24 dos 35 casos de regresso havia um perodo de atraso de desenvolvimento psicomotor prvio. A avaliao do neurodesenvolvimento foi realizada com a escala de Growing Skills na maior parte dos casos (139). O atraso de desenvolvimento psicomotor, identificado em 154 crianas, foi classificado em ligeiro, moderado, severo e profundo em 35, 31, 37 e 51 casos, respectivamente (figura 22).
n=191
26%
20%
18% 19% 16%
Sem ADPM ADPM Severo
ADPM Ligeiro ADPM Profundo
ADPM Moderado
Figura 22 - Desenvolvimento psicomotor nos sobreviventes primeira semana de doena.

Abreviaturas: ADPM- atraso de desenvolvimento psicomotor.
Setenta crianas apresentaram epilepsia. A figura 23 mostra uma criana com epilepsia refractria e regresso do desenvolvimento psicomotor.
Figura 23 - Criana com encefalopatia epilptica (sndrome de West).

Note-se a hipotonia axial marcada e a necessidade de alimentao por sonda nasogstrica (a) e o electroencefalograma com graves alteraes do ritmo de base, padro peridico (de surto-supresso), tanto durante a viglia como no sono, em que os surtos correspondem frequentemente a espasmos, assinalados com setas (b).
94
A classificao da epilepsia dos nossos dontes est resumida na tabela 10. Dos 33 doentes que apresentaram convulses no incio da doena, todas evoluram para epilepsia, com excepo de uma que sofreu encefalopatia aguda fatal. Apenas seis das 70 crianas com epilepsia no sofreram de atraso e/ou regresso do desenvolvimento psicomotor.
Tabela 10 - Classificao da epilepsia em 70 doentes investigados por suspeita de DCRM.
EPILEPSIAS
n=70
1. Parciais 1.2 Sintomticas 1.2.1/2 Frontotemporal 1.2.3 Lobo occipital 2. Generalizadas 2.1 Idiopticas 2.1.4 E. de ausncias da criana 2.1.8 Outras no definidas 2.2 Criptognicas ou sintomticas 2.2.1 S.West 2.2.2 S.Lennox-Gastaut 2.3.1 Sint. etiologia no especif. 2.3.2 Sint. sndromes especficos 3. Indeterminadas* 3.1 Com crises parciais e generalizadas 3.1.1 Crises neonatais 3.1.2 E. mioclnica grave lactente 3.1.5 Outras indeterminadas 3.2 Sem caractersticas inequvocas* 4. Sndromes especiais 4.2 Crises/estados mal epilptico isolados 4.3 Crises em acontecimento agudo
*quanto a serem parciais ou generalizadas. Abreviaturas: E.- Epilepsia; Sint.- sintomticas; especif. especificada.
2 1
3 4
7 1 9 6
9 1 6 14
5 2
Registou-se
evoluo
microceflica
macroceflica
em
33
crianas,
respectivamente, todas com atraso e/ou regresso do desenvolvimento psicomotor. Dos 26 casos que evoluram para coma, em sete este foi causado por insuficincia heptica fatal. Transtornos da motilidade oral e/ou facial e da suco/ deglutio, de fisiopatologia complexa, eventualmente atribuveis a leso dos nervos cranianos, foram registados em 95
66 casos, sendo as alteraes da suco/deglutio (44 crianas) e o estrabismo/ oftalmoplegia (estrabismo-24; oftalmoplegia-14; ambos-dois casos) os mais frequentes (figura 24). Em 21 doentes havia associao de um ou mais sinais ou sintomas.
n = 66
11 16 44
34
Alterao suco/deglutio Ptose palpebral
Estrabismo/ Oftalmoplegia Disartria
Figura 24 - Sintomatologia atribuvel a alterao dos pares cranianos.
Vinte crianas apresentaram disfuno do espectro autista. Vinte e quatro doentes sofreram alteraes do comportamento que justificaram interveno farmacolgica especfica. Foi demonstrada neuropatia perifrica por meios electrofisiolgicos e/ou histolgicos em 16 das 29 crianas que apresentaram clinicamente ausncia de reflexos
osteotendinosos ou hiporreflexia acentuada.
Figura 25 - Malnutrio (a); alimentao por gastrostomia (b) em crianas da nossa srie.
96
Em 88 dos 191 casos com mais de uma semana de evoluo assistiu-se a transtornos do crescimento, mormente atraso ponderal (75 casos) e/ou estatural (68 casos), por vezes grave, como se ilustra na figura 25a. Em nove dos 169 casos que sobreviveram mais de seis meses foi realizada gastrostomia para alimentao (figura 25b). Registou-se excesso de peso em cinco crianas. Em 61 doentes foram assinalados problemas oftalmolgicos distintos de alteraes da refraco. Em 29 destes casos, havia transtorno dos nervos oculomotores aparentemente isolado (isto , ptose palpebral, estrabismo e/ou oftalmoplegia). Na figura 26 mostra-se trs dos nossos doentes na posio de mxima abertura dos olhos (a, b, c; note-se a inclinao da cabea para trs no caso b), tendo o caso (c) igualmente oftalmoplegia total. Nos outros 32 doentes foi detectada leso oftalmolgica com ou sem alterao dos nervos oculomotores: atrofia ptica, tal como a ilustrada na figura 26d (em 12 crianas), nistagmo (em nove), retinopatia (em nove) apraxia ocular (em seis) e outras alteraes (em trs).
Figura 26 - Envolvimento oftalmolgico em trs doentes da nossa srie (a e b) ptose palpebral bilateral; (c) - oftalmoplegia; (d) atrofia ptica.
Havia evidncia clnica de sofrimento muscular em 47 doentes, com diminuio da fora muscular em 44, hipotrofia marcada das massas musculares (no justificada pela desnutrio e/ou alteraes neurolgicas) em 24 e mialgias e/ou intolerncia ao exerccio (no provocada directamente por insuficincia cardiorespiratria) em 19 (cinco dos quais com episdios de mialgias, sem mioglobinria). As alteraes do foro respiratrio e ortopdico estiveram frequentemente relacionadas com o quadro neurolgico: pneumonias de repetio em 14 crianas; apneias e/ou insuficincia respiratria em 26 casos, oito dos quais com apoio ventilatrio domicilirio; complicaes ortopdicas em 26 doentes, consistindo em luxao coxofemoral e/ou escoliose, paralticas, em 23. 97
A miocardiopatia hipertrfica foi a manifestao cardaca mais frequente durante a evoluo (15 casos num total de 29 com envolvimento cardaco). Oito crianas sofreram de insuficincia cardaca secundria ou em contexto de falncia multissistmica, tal como se ilustra na figura 27.
n = 29
1 6
15
Miocardiopatia hipertrfica Miocardiopatia dilatada
Insuficincia cardaca secundria Bradiarritmia
Figura 27 - Evoluo cardaca observada em 29 doentes.
Como documentado na figura 28, houve compromisso heptico em 31 doentes, com destaque para a citlise e o dfice de sntese (em 24 e 12 crianas, respectivamente). Cerca de um tero dos casos (11 crianas) com envolvimento heptico cursaram com colestase. Em um havia hepatomeglia, com esteatose confirmada por histologia, sem alterao da funo heptica.
n = 31
11 24
12
12
Citlise
Dfice sntese
Hepatomeglia
Colestase
Figura 28 - Evoluo heptica observada em 31 doentes.
98
Em 19 doentes foram registadas transtornos hematolgicos fora do contexto de sepsis e/ou insuficincia heptica. A anemia ferripriva, reversvel, foi a mais frequentemente observada (11 doentes). Houve pancitopenia persistente em trs crianas, alterao do nmero de plaquetas em trs, neutropenia isolada em uma e alterao da coagulao noutra. Em 16 crianas foi documentada surdez. Tratava-se de surdez neurosensorial em 11 casos (76%), sindromtica em todos. Os vmitos repetidos e/ou prolongados, frequentemente associados a prostrao e outras alteraes neurolgicas crnicas/ permanentes foram os sintomas digestivos mais comuns (oito casos dos 13 com manifestaes digestivas). Em quatro crianas houve pseudo-ocluso intestinal e numa, diarreia crnica. Manifestaes renais foram constatadas em 12 crianas. Oito doentes evoluram com tubulopatia proximal e quatro com insuficincia renal aguda. Destaca-se um caso de insuficincia renal crnica que motivou transplante renal. O atingimento endcrino foi registado em oito casos (atraso pubertrio/ hipogonadismo em quatro casos, hipotiroidismo em trs casos; hiperinsulinismo neonatal transitrio num caso) e o cutneo, em sete (hirsutismo em cinco casos, acrocianose em cinco casos e outros em trs casos).
Cento e noventa e sete crianas foram seguidas at ao fim do perodo de estudo. A mortalidade e a morbilidade neste grupo de doentes esto assinaladas na figura 29. Na tabela 11 resume-se o tempo de evoluo e a mortalidade nos 197 doentes cuja evoluo at ao fim do perodo de estudo se conhece. Os sobreviventes (144) tinham ento entre um e 33 anos de idade, com mdia e mediana de 12 anos.
n = 197
6 26
112
53
Melhorado
Agravado
Falecido
Mesmo estado
Figura 29 - Evoluo da morbilidade e mortalidade em 197 doentes.
99
Tabela 11 - Mortalidade e tempo de evoluo em 197 doentes.
Tempo de evoluo (*) Falecidos Sobreviventes
n
53 144
Mnimo
0** 1,2
Mximo
15,3 31,9
Mediana
0,8 9,5
Mdia
2,8 10,4
SD
3,5 5,7
* em anos; **primeiro dia de vida
Cinquenta e trs crianas (27%) faleceram entre o primeiro dia de vida e os 21 anos de idade (mdia de 2,8 anos; mediana de 0,8 anos - 9 meses). Quase todas faleceram na primeira dcada de vida, 17% no perodo neonatal e 83% antes dos 5 anos de idade, como se pode ver na tabela 12.
Tabela 12 - Mortalidade em 53 doentes - idade do bito.
Idade bito 7d[ [7 - 30d[ [1 - 6M[ [6 - 12M[ [1 - 2A[ [2 - 5A[ [5 - 10A[ [10A Total
n 3 6 13 8 7 7 4 5 53
% 6 11 25 15 13 13 8 9 100
% cumulativa 6 17 42 57 70 83 91 100 100
Nas tabelas 13 e 14 correlaciona-se o tipo de apresentao clnica (ENM ou NM) com tipo de doente (agudo ou crnico) e a evoluo.
100
Tabela 13 - Clnica na apresentao e tipo de doente - agudo ou crnico.
Tipo doente* Crnico Agudo Total
ENM n 22 25 47 % 47 53 100
NM n 126 27 153 % 82 18 100
Total 148 52 200
Abreviaturas: ENM- extra-neurolgica e/ou muscular; NM- neurolgico e/ou muscular. *Tipo de doente no diagnstico: doente crnico - sem agudizao; doente agudo - episdio agudo, fatal ou altamente incapacitante em criana previamente saudvel ou com doena crnica.
Tabela 14 - Circunstncias clnicas no diagnstico.
Tipo doente Clnica no diagnstico Sobrevivncia bito > 6M evoluo* bito < 6M evoluo* Total
Crnico Crnica 145 3 0 148
Agudo Total
Aguda fatal/ grave 1 19 0 20 1 0 31 32
147 22 31 200
Relao entre o tipo de doente, clnica no diagnstico e prognstico vital. * evoluo da doena.
5.1.2
Caracterizao laboratorial da amostra
Em todos os casos a investigao etiolgica incluiu o estudo de outros tecidos alm do sangue perifrico. As bipsias foram programadas em sesses operatrias prprias em 154 crianas (77%) e realizadas juntamente com outras cirurgias (oportunistas) em 21 (10,5%), tal como representado na figura 30. As colheitas de tecidos foram realizadas logo aps a morte em 25 doentes (12,5% dos casos), quatro dos quais tinham sido submetidos a bipsia prvia. A figura 31 ilustra a distribuio dos tecidos investigados nos 200 doentes. Em cada caso foi investigado um ou mais tecidos. Em 193 doentes (96,5%) foi estudado o msculo esqueltico, em 41 (20,5%), o fgado e o miocrdio, em 11 (5,5%). O miocrdio foi investigado simultaneamente com o fgado e o msculo, em colheita post mortem imediata, em todos os 11 casos. Em sete crianas, o fgado foi o nico tecido investigado.
101
n = 200
11% 11%
2%
76%
Programada
Oportunista
Post-mortem
Progr +Post-mortem
Figura 30 - Tipo de colheita de tecidos realizada em 200 doentes.

Abreviaturas: Programada- em sesso operatria prpria; Oportunista juntamente com outra cirurgia; Progr +Post mortem duas colheitas: em sesso operatria prpria e post mortem.
n = 200
180 160 140 120 100 80 60 40 12% 20 0 Msculo Musc+Fg M+F+Mioc Fgado 6% 4% 80%
N de casos
Figura 31 - Tecidos estudados por doente.

Abreviaturas: Musc+ Fg msculo e fgado; Musc+F+ Mioc msculo, fgado e miocrdio.
Exames complementares de diagnstico - A investigao etiolgica em cada doente foi orientada pela clnica. Referem-se de seguida os exames complementares mais relevantes realizados para avaliao funcional multiorgnica e diagnstico
diferencial. Os resultados dos estudos do lactato e piruvato, dos aminocidos, dos cidos orgnicos e histolgicos, usados simultaneamente para diagnstico diferencial e mitocondrial, sero tratados no captulo da investigao da cadeia respiratria mitocondrial.
102
Em 19 crianas foi investigada a possibilidade de sndrome de maldigesto e de dfice de absoro, tendo cada uma destas situaes patolgicas sido confirmada em um caso. O teste do suor, realizado em oito crianas e os nveis de cido flico e vitamina B12, quantificados em 11, mostraram sempre valores normais. A presena de acares redutores na urina, pesquisada em 18 crianas, foi detectada em quatro, duas das quais no contexto de insuficincia heptica fatal. No terceiro, o acar em causa foi a lactose, o que, no contexto clnico de doena heptica de causa desconhecida, levou ao estudo dos poliis urinrios, que se revelaram normais. Na figura 32 destacam-se os exames complementares mais usados para diagnstico diferencial.
N de casos 0
CDTransferrina Caritipo Lisosomas Peroxisomas GAA&creatina Purinas&Pirim T3T4TSH N-transmis PiruvatoDH Sulfitest cOrtico H Crescimento cbiliares S-acetona 7dehidroCLT Anormal Total
20
40
60
80
100
120
Figura 32 - Exames complementares realizados para diagnstico diferencial.

Abreviaturas: CDTransferrina- transferrina srica deficiente em carbohidratos; GAA e creatina- cido guanidoactico e creatina urinrios; N-transm- neurotransmissores (aminas biognicas) lquor e urina; PiruvatoDH - piruvato-desidrogenase; cOrtico cido ortico urinrio; H Crescimento- hormona do crescimento; S-acetona- succinilacetona; cbiliares- cidos biliares plasmticos e urinrios; 7dehidroCLT 7-dehidro-colesterol.
De entre os estudos hormonais, realizados em 61 doentes, destacam-se os da funo tiroideia (53 doentes), trs dos quais alterados (hipotiroidismo: dois hipofisrios) e os da hormona de crescimento (11 doentes), todos normais. O doseamento da piruvato-desidrogenase e o da biotinidase foram realizados em 31 e em 10 casos, respectivamente. O primeiro foi feito em linfcitos (26 doentes), msculo (trs doentes) e /ou fibroblastos (cinco doentes) e o segundo em sangue colhido em carto. A determinao de ambas as enzimas foi feita em quatro doentes. Identificou-se 103
Tipo de exame
um caso de dfice de piruvato-desidrogenase (numa criana com sndrome de Leigh) e nenhum dfice de biotinidase. Em trs crianas foi diagnosticada doena lisossmica: duas com dfice de -1glucosidase (doena de Pompe) que tinham alteraes musculares histolgicas
orientadoras e uma com leucodistrofia metacromtica (dfice de arilsulfatase A), em que a RMN cerebral mostrava leses compatveis com aquele diagnstico. Em nenhum dos 76 casos em que o estudo foi orientado por sinais inespecficos foi confirmada doena lisossmica. Nos seis doentes nos quais foi identificada elevao da percentagem de transferrina hipoglicosilada, a focagem isoelctrica da transferrina identificou quatro casos com um perfil de insuficincia heptica, um dfice de glicosilao das protenas do tipo I e um do tipo X. Em doentes seleccionados (22), foram feitos outros estudos enzimticos na procura de um diagnstico etiolgico que no se confirmou, nomeadamente a galactose-1-fosfato uridil-transferase (em seis casos), enzimas envolvidas no metabolismo do glicognio (em seis casos), na -oxidao dos cidos gordos (em trs casos) e no metabolismo dos neurotransmissores, respectivamente da descarboxilase dos L-aminocidos aromticos e da dihidrobiopterina reductase - DHPR- (em dois casos cada). Estudos bioqumicos para rastreio de doena de Wilson (cobre urinrio e ceruloplasmina plasmtica) foram realizados em sete casos, com resultados normais em todos. O caritipo em leuccitos do sangue perifrico e/ou em fibroblastos da pele foi normal em 113 crianas. Em 14 destes casos, foi ainda realizado estudo por FISH (Hibridizao In Situ por Fluorescncia) das regies subtelomricas, tendo-se identificado trs rearranjos subtelomricos crpticos: 46,XX,ishder(22)t(7;22) (q36;q13.3)
(G31340+,D22S1726-), correspondendo a uma monossomia parcial da regio telomrica do brao longo do cromossoma 22 associada a uma trissomia parcial da regio telomrica do brao longo do cromossoma 7; 46,XY,add(9)(q34.3).ishdup(9)
(q34.11?qter9) (wcp9+.D9S2168+)dn, correspondendo a uma trissomia parcial da regio distal do brao longo do cromossoma 9 por duplicao de novo; e 46,XX,ishdel(1) (p36.3) (CEB108-), ou seja, uma monossomia da regio telomrica do brao curto do cromossoma 1. Foram pesquisadas pela tcnica de FISH e no detectadas, as microdeleces cromossmicas associadas s sndromes velocardiofacial (22q11.2) e lisencefalia de Miller-Dicker (17p13), em duas e uma criana, respectivamente. Em 16 crianas investigadas para Sndrome de Angelman, diagnosticou-se um caso de deleco materna da regio crtica detectada por estudos de metilao e citogenticos [46,XY.ish del(15) (q11.2q11.2) (SNRPN-,UBE3A-)]. No se identificou nenhum caso de Sndrome do X-frgil nos 33 investigados. No foram detectadas mutaes patognicas nas crianas nas quais foi feito o estudo molecular da distrofia miotnica, da atrofia muscular espinhal ou da Sndrome de Rett. 104
Nos outros estudos moleculares realizados incluem-se as mutaes mais comuns do dfice da desidrogenase dos hidroxi-cidos gordos de cadeia longa e da dos cidos gordos de cadeia mdia (LCHAD, MCAD) e das glicogenoses Ia e Ib, entre outras, tal como ilustrado na figura 33.
Glicogenoses SDS Ataxia Friedereich LCHAD/MCAD
Tipo de estudos
S. Rett Outros Atrofia M Espinhal Distrofia Miotnica Lipofuscinose Cer N Ang/P-W X-frgil 0 5 10 15 20 25 30 35
Anormal Total
N de casos
Figura 33 - Exames complementares para diagnstico diferencial - estudos moleculares.

Abreviaturas: Ang/P-W Angelman / Pradder Willi; Lipofuscinose Cer N- lipofuscinose ceride neuronal; LCHAD/ MCAD desidrogenases dos hidroxi-cidos gordos de cadeia longa e dos cidos gordos de cadeia mdia; SDS- sndrome de Shwachman-Diamond.
Seis crianas foram submetidas a colheita de medula ssea, que se revelou normal em cinco. A sexta, na qual se veio a diagnosticar Sndrome de Pearson, mostrou aplasia de todas as linhas celulares e sideroblastos em anel. O rastreio de alteraes da imunidade celular e humoral, levado a cabo em 44 casos, foi normal em todos. Os estudos microbiolgicos, realizados de acordo com a clnica, foram negativos na sua maioria. Como resumido na tabela 15, em oito casos uma infeco viral ter estado na origem do (ou pelo menos associada ao) episdio agudo, que constituiu doena inaugural em sete. Em dois deles no se identificou o presumvel vrus, mas a necrpsia demonstrou a existncia de meningoencefalite num e pericardite com miocardite focal no outro. Num outro caso foi demonstrada no perodo ps-natal uma infeco por citomegalovrus, mas as manifestaes clnicas tiveram incio antes do nascimento e a pesquisa de citomegalovrus por PCR no sangue do carto do diagnstico precoce foi negativa. 105
Tabela 15 - Suspeita de DRCM e infeco por vrus.
Clnica
Encefalite; suspeita de ADEM1 Fgado granuloso pr-natal Insuficincia heptica aguda Doena celaca + Endo/miocardite
(c)
Vrus
Serol.
PCR
Comentrio
Imunofluorescncia
Evoluo
Falncia multiorgnica Estado vegetativo Atraso crescimento Hiperlactacidmia Fatal2
InfluenzaA
Neg
nr
+ secrees respiratrias
(a)
CMV Herpes + EBV No identif
Pos
Neg(a)
CartoDP
(b)
Neg(b)
Pos
uma
determinao
(c)
Neg
necrpsia
Fatal2 Fatal2
Meningoencefalite Miocardiopatia
(d)
No identif
Neg
(d)
necrpsia uma
(e)
dilatada/ miocardite Falncia heptica fulminante Encefalite; suspeita de ADEM Miocardiopatia dilatada Insuficincia heptica aguda
1
EBV
Pos
(e)
Pos
determinao
(f)
Fatal2
Adenovrus
Pos
(f)
nr Pos/ Neg nr
uma
determinao
(g)
Fatal2
Adenovrus
Pos
(g)
duas
determinaes
(h)
Estado vegetativo
Rubola
Pos(h)
duas
determinaes
(i)
Miopatia
Parvovrus
Pos(i)
Neg
uma
determinao
Fatal2
Abreviaturas: Serol. diagnstico serolgico; Neg- negativo; Pos- positivo; CartoDP- em sangue do carto do diagnstico precoce; nr- no realizado; No identif- no identificado. CMV- citomegalovrus
2
EBV- vrus Epstein-Barr; 1ADEM (Acute
Disseminated EncephaloMyelitis) encefalomielite aguda disseminada. Fatal no episdio agudo.
Foi realizado pelo menos um exame de imagem cerebral (ecografia, TAC e/ou RMN) em 179 dos 200 doentes estudados. Em 125 (70%) havia alteraes, como discriminado na tabela 16 para cada um dos referidos exames.
Tabela 16 - Exames de imagem cerebral realizados em 179 doentes.
n=200 Anormal Total
Ecografia 8 (14%) 56
TAC 46 (69%) 67
RMN 112 (75%) 149
Total 125 (70%) 179
TAC - tomografia axial computorizada; RMN ressonncia magntica nuclear.
106
Em 14 doentes, a ecografia foi o nico mtodo de imagem cerebral usado, tendo sido anormal em dois. Nos outros seis casos em que a ecografia cerebral mostrou alteraes, estas tambm se verificaram na TAC e/ou RMN. Em 43 dos 165 doentes que realizaram RMN e/ou TAC cerebral no foram detectadas alteraes. A atrofia do SNC, presente em 94 doentes, foi a nica alterao encontrada em 41 casos. A sua distribuio est resumida na tabela 17. O caso ilustrado na figura 34 associou leucoencefalopatia e atrofia severa.
Tabela 17 - Distribuio da atrofia do SNC em 94 doentes.
Atrofia Cortical Subcortical Corpo Caloso Cerebelo Generalizada Tronco
Total=94 73 40 32 19 8 7
% 78 43 34 20 9 7
Figura 34 - Atrofia corticosubcortical marcada e leucoencefalopatia num doente.

Imagem de RMN em corte coronal ponderado em FLAIR aos 2 meses de idade em criana com acidose lctica, falecida no primeiro ano de vida. As setas assinalam leses de leucoencefalopatia, periventricular (a tracejado) e dos pednculos cerebelosos inferiores (lineares).
Em 81 doentes outro tipo de leses (associadas ou no a atrofia) estava presente, sendo simtricas em 14. A sua distribuio est resumida na tabela 18.
107
Tabela 18 - Distribuio das alteraes detectadas na RMN e/ou TAC cerebral em 81 doentes.
RMN e/ou TAC cerebral Substncia branca supratentorial Ncleos da base Tlamo Protuberncia Bolbo Substncia cinzenta periaquedutal Pednculos Substncia nigra Substncia branca infratentorial Ncleos subtalmicos Ncleos vermelhos Ncleos cerebelosos
N=165 35 24 11 9 9 8 8 5 5 3 2 2
% 21 15 7 5 5 5 5 3 3 2 1 1
Abreviaturas: TAC - tomografia axial computorizada; RMN ressonncia magntica nuclear.
Na figura 35 mostra-se imagens de RMN cerebral de uma criana com sndrome de Leigh.
Figura 35 - Imagens de RMN numa criana de dois anos com sndrome de Leigh.
Cortes axiais ponderados em T2 (TR/TE 3600/96): (a)- leses hiperintensas, simtricas envolvendo os ncleos lenticulares (setas estreitas) e a substncia branca periventricular (setas largas); (b)- atrofia cerebelosa vermiana (asterisco).
O estudo histolgico do msculo, fgado e/ou miocrdio foi realizado em 191 doentes (figura 36). Em 30 casos foram estudados simultaneamente o msculo e o fgado e em cinco, os trs tecidos.
108
A bipsia muscular foi realizada no msculo deltide esquerdo em 89% dos casos. Em 90 doentes foi feito estudo de msculo em microscopia electrnica.
n = 191
200 180 160 140 N de casos 120 100 80 60 40 20 0 Muscular Heptica Cardaca 38 30 9 6 75 185
Total Anormal
Figura 36 - Resultados do estudo histolgico realizado em 191 doentes.
O estudo em microscopia ptica do msculo esqueltico mostrou alteraes em 75 dos 185 doentes em que foi realizado, como se ilustra na figura 37.
n = 185
VariabilidadeDimetro PredomnioFibrasI AcumulaoLpidos ActividadeOxidativa AtrofiaNeurognica AcumulaoGlicognio Outro AtrofiaFibrasII Infiltrado Inflamatrio FibrasVermelhasRotas 0 4% 4% 2% 1% 5 10 15 20 25 30 35 40 7% 7% 15% 18% 21% 36%
N de casos
Figura 37 - Resultados do estudo histolgico do msculo em microscopia ptica em 185 doentes.
109
A figura 38 ilustra as alteraes histolgicas do msculo mais informativas no contexto de suspeita de DCRM em doentes da nossa srie.
Figura 38 - Imagens do estudo histolgico do msculo.

(a) a bipsia foi habitualmente realizada na regio deltide; (b) fibras vermelhas rotas (RRF) evidenciadas com o tricrmio de Gomori (setas); (c) e (d) colorao histoenzimolgica com a succinato desidrogenase (SDH) e a citocromo oxidase (COX), respectivamente, demonstrando aumento da actividade oxidativa sob a forma de crescentes subsarcolmicos por acumulao de mitocndrias (setas); (e) colorao pela hematoxilina-eosina mostra atrofia muscular neurognica neste caso; (f) acumulao de lpidos revelada pelo azul de toluidina.
Cada doente apresentou uma ou mais das seguintes alteraes: aumento da normal variao de dimetro das fibras (36 casos), predomnio de fibras tipo I (21 casos), 110
aumento da actividade oxidativa subsarcolmica (15 casos, cinco dos quais com formao de crescentes), acumulao de lpidos (18 casos), atrofia neurognica (sete casos), acumulao de glicognio (sete casos), atrofia de fibras tipo II (quatro casos), miopatia inflamatria (trs casos), fibras vermelhas rotas - RRF (dois casos) e outras anomalias (quatro casos). Em 13 das 90 crianas cuja amostra de msculo foi analisada em microscopia electrnica havia uma ou mais das seguintes anomalias: modificao da estrutura mitocondrial (em sete doentes) sobrecarga de glicognio intra/ extra lisossmico (em quatro doentes), acumulao de lpidos (em dois doentes) e alteraes compatveis com conectivite (num doente). As alteraes mitocondriais consistiram em: pobreza de cristas, com vacuolizao (em quatro casos), mitocndrias com alterao da estrutura das cristas (em dois casos) e mitocndrias em aglomerados, com matriz granulosa, cristas concntricas e incluses paracristalinas (num caso). Foram encontradas alteraes em 30 dos 38 doentes em que foi feita microscopia ptica do tecido heptico (figura 39). A esteatose foi a alterao mais frequente, sendo macrovacuolar em quatro doentes, microvacuolar em dois e mista em sete. No nico caso estudado em microscopia electrnica no foram encontradas anomalias.
n = 38
Esteatose Fibrose Necrose Hepatite Colestase Outro Cirrose Glicognio 0 2 8% 4 6 8 10 12 11% 11% 16% 16% 16% 24%
34%
14
N de casos
Figura 39 - Resultados do estudo histolgico do fgado em microscopia ptica em 38 doentes.
Havia alteraes cardacas em seis dos nove casos estudados post mortem: vacuolizao citoplsmica (em trs casos), miocardite com ou sem pericardite e vasculite (em dois casos) e vesculas lipdicas (num caso). Muitos outros exames, como os ecogrficos e os electrofisiolgicos, realizados de acordo com a clnica, no mbito do rastreio de envolvimento multiorgnico e do 111
diagnstico diferencial, permitiram diagnsticos sindromticos como miocardiopatia, neuropatia perifrica ou retinopatia, entre outros.
Investigao da cadeia respiratria mitocondrial Os nveis de lactato plasmtico foram determinados pelo menos uma vez em 197 doentes (98,5%). Encontrou-se hiperlactacidmia em uma ou mais ocasies em 148 casos (75%). Os doentes foram classificados em cinco classes de gravidade, como ilustrado na figura 40. Em 29 doentes a lactacidmia, realizada em trs ou mais ocasies, era normal em todas as determinaes. Em 20 doentes, a lactacidmia, realizada em uma ou duas ocasies, era normal. Em 58 casos a hiperlactacidmia foi detectada em apenas uma ou duas ocasies, sem acidose. Em 73 casos verificou-se hiperlactacidmia sem acidose, em pelo menos trs determinaes. Dezassete doentes tiveram acidose lctica.
n=197
80 70 60
N de doentes
50 40 30 20 10 0 N 3 det. N <3 det. Elev.<3 det. Elev.3 det Acid.Lctica
Figura 40 - Lactacidmia em 197 doentes classificados em cinco classes de gravidade.

Abreviaturas: N 3 det. lactacidmia normal em trs ou mais determinaes; N <3 det. lactacidmia normal em menos de
trs determinaes; Elev.<3 det. lactacidmia elevada em menos de trs determinaes, sem acidose; Elev.3 det. lactacidmia elevada em trs ou mais determinaes, sem acidose; Acid.Lctica acidose lctica.
Em 154 doentes foi feita a determinao do piruvato plasmtico, sendo estabelecida a relao lactato/ piruvato. Nas 89 crianas com hiperlactacidmia, aquela relao foi superior a 20 em 73 (82%) casos. O lactato do lquor, doseado em 93 doentes (47% da amostra total) estava elevado em 26 (28%). Em dois destes, a lactacidmia foi normal. Em 47 dos 93 doentes (50%) houve concordncia entre os valores do lactato no lquido cefalorraqudeo e no plasma, sendo 24 elevados e 20 normais em ambos os exames determinados simultaneamente, 112
como reportado na tabela 19. A lactatorraquia estava elevada em cinco de seis dos 17 doentes com acidose lctica nos quais foi doseada, sendo que em um era normal.
Tabela 19 - Relao entre os valores do lactato plasma e no lquor em 93 doentes.
n=93 Lactato plasma Normal Elevado
Lactato lquor Normal 20 47 Elevado 2 24
A razo lactato /piruvato era superior a 20 em 17 dos 26 casos com lactato elevado no lquor. Nos 21 doentes com lactato elevado no plasma e no lquor e em quem foi determinado o piruvato, verificou-se concordncia relativamente ao quociente
lactato/piruvato no plasma e no lquor em 17 casos (81%), estando aumentado em 13 e normal em quatro casos. Em 34 crianas foi feita RMS. Em todas foi determinada a lactacidmia e em metade, o lactato no lquido cefalorraqudeo. Foram identificados picos de lactato na espectroscopia em nove doentes (26%), como se ilustra na figura 41.
Figura 41 - 1H RMS num doente mostrando picos anormais de lactato
Dos nove casos com espectroscopia positiva, em apenas um no foi demonstrada hiperlactacidmia (tabela 20).
Tabela 20 - Relao entre a lactacidmia e os resultados da RMS em 34 doentes.
n=34 RMS Lactato N
Lactato plasma N 3 113 >N 22
Lactato>N
RMS - ressonncia magntica espectroscpica.
Em 12 dos 17 casos em que foi feita espectroscopia e determinao da lactatorraquia, os valores foram congruentes (10 casos e 2 casos com lactato normal e elevado, respectivamente), como referido na tabela 21.
Tabela 21 - Relao entre o lactato no lquor e os resultados da RMS em 17 doentes.
n=17 RMS Lactato N Lactato>N
Lactato lquor N 10 2 >N 3 2
Abreviaturas: LCR lquor; RMS - ressonncia magntica espectroscpica.
Os valores de alaninmia foram pelo menos uma vez superiores ao normal (410M) em 42 doentes e superiores a 450M em 36 dos 172 doentes em quem foi determinada. Nos 42 casos de hiperalaninmia, o lactato plasmtico estava elevado em todos, excepto em dois (tabela 22).
Tabela 22 - Relao entre a alaninmia e a lactacidmia em 39 doentes.
Lactacidmia Normal Elevada Total
Alaninmia Normal 37 94 131 Elevada 2 40 42 Total 39 134 173
A prolinmia foi quantificada em 173 crianas, sendo superior ao normal em 13. Destas, todas tiveram hiperlactacidmia e hiperalaninmia, excepto uma (tabelas 23 e 24).
Tabela 23 - Relao entre prolinmia e a lactacidmia em 173 doentes.
Prolinmia Normal
Lactacidmia Normal 38 114 Elevada 122
Total 160
Elevada Total
1 39
12 134
13 173
Tabela 24 - Relao entre a prolinmia e a alaninmia em 173 doentes.
Prolinmia Normal Elevada Total
Alaninmia Normal 130 1 131 Elevada 30 12 42
Total 160 13 173
Na tabela 25 resumem-se os resultados da relao entre os nveis de lactato, alanina e prolina no plasma e a existncia de picos de lactato em 1H RMS nos doentes em quem foram determinados. A concordncia de resultados entre a
1
H RMS e a lactacidmia,
alaninmia e prolinmia foi de 32%, 91% e 69%, respectivamente.
Tabela 25 - Relao entre lactato, alanina e prolina no plasma e os resultados da RMS.
Lactacidmia n=34 RMS Lactato normal Lactato elevado Normal 3 1 Elevado 22 8
Alaninmia n=32 Normal 22 2 Elevado 1 7
Prolinmia n=32 Normal 21 8 Elevado 2 1
Abreviatura: RMS - ressonncia magntica espectroscpica.
A figura 42 resume a investigao redox realizada nos 200 doentes.
115
Espectroscopia
34
Lactato LCR
93
Tipo de exame
Lactato Plasma
197
Anormal Total
Prolinmia
173
Alaninmia
173
50
100
150
200
N de casos
Figura 42 - Estudo redox realizado nos 200 doentes em estudo.
A cromatografia de cidos orgnicos urinrios foi feita em pelo menos uma ocasio em 175 crianas (88% dos doentes). Mostrou alteraes em uma ou mais determinaes em 34 crianas (19%): excreo aumentada de lactato e/ou intermedirios do ciclo de Krebs (em 16% dos casos); alteraes compatveis com defeito da -oxidao dos cidos gordos (em oito, 5% dos casos), ambos os anteriores (em cinco, 3% dos casos); outras alteraes (em seis, 3% dos casos).
A avaliao enzimtica dos complexos I-V da CRM por espectrofotometria foi realizada em 198 dos 200 casos do estudo. Em 191 doentes foi estudado o msculo (mitocndrias isoladas em 46, homogeneizado em 102 doentes e ambas as preparaes em 43 doentes), em 41 doentes, o homogeneizado de fgado e em 11 doentes, o do miocrdio. O msculo foi o nico tecido estudado em 157 casos. Em 23 doentes foi analisado o msculo e o fgado e em sete apenas o fgado. Nos 11 doentes em que foi estudado o miocrdio, o msculo e o fgado foram igualmente investigados. Em 25 casos foram realizadas colheitas nas primeiras trs horas post mortem para estudo da CRM, independentemente de j ter ou no havido bipsias anteriores. Todas as amostras de miocrdio pertencem quele grupo. Foi detectado dfice (menos de 30% da mdia do v.r. corrigido para a citrato sintase) de um ou mais complexos da CRM em pelo menos um tecido em 130 doentes (65,7%). Em 90 casos (46%), o dfice era major, isto , inferior a 20% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase (figura 43).
116
n=198
34% 46%
20% Major minor Normal
Figura 43 - Avaliao enzimtica dos complexos I-V da CRM em 198 doentes.

Foi demonstrado dfice de um ou mais complexos da CRM em pelo menos um tecido em 130 casos: Major (< 20% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase) em 90 doentes e minor (20 e <30% da mdia), em 40 crianas.
O complexo IV, isoladamente ou em associao, foi o mais frequentemente afectado (89 doentes), seguido do I (68), do V (42), do III (40) e do II (22), como referido na figura 44.
200 180 160 140 130 109 177 158 146
N de doentes
120 100 80 60 60 40 20 0 I II III IV 18 23 10 11 17 50 29
Dfice major Dfice minor Normal
27 25
Complexos enzimticos da CRM
Figura 44 - Actividade dos complexos enzimticos da CRM em 198 doentes.

Normal: 30% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase; dfice minor: 20% a < 30%; dfice major < 20%.
O complexo II foi o menos afectado (21 doentes). Esteve associado a dfice dos complexos IV, I, V e III, em 21, 17, 13 e oito casos, respectivamente. Todos os doentes
117
com dfice do complexo II apresentaram dfice generalizado da CRM, isto , do complexo II e de pelo menos mais dois complexos. Em 20 casos, o dfice foi mltiplo (envolvimento de pelo menos trs complexos, excepo do II), em 35 casos detectou-se deficincia de dois complexos (I+IV em 16 doentes) e nos restantes 55 casos, dfice isolado dos complexos: I (14 casos), III (nove casos), IV (25 casos) e V (sete casos), como ilustrado na figura 45.
n = 130
7% 11%
5%
19%
(I+IV =12%)
15%
28% 15%
ComplexoIV
Mltiplo
Generalizado
DoisComplexos
Complexo I
Complexo III
Complexo V
Figura 45 - Dfices enzimticos da CRM em 130 doentes.

Dfice enzimtico: inferior a 30% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase. Dfice de dois complexos em 35 doentes (27%), dos quais I+IV em 16 casos (12%). Dfice generalizado - dfice do complexo II e de dois ou mais complexos. Dfice mltiplo- dfice de trs ou mais complexos, excepo do II.
Considerando apenas os casos com valores inferiores a 20% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase (critrio major) observado em 91 doentes, o dfice isolado do complexo IV foi o mais frequente (24% dos casos), seguido do complexo I (23% dos casos) e dos complexos I+IV (13% dos casos). Os dfices mltiplos e generalizados representaram 16% e 9%, respectivamente (figura 46). Um dos doentes acima referido como tendo dfice major do complexo I apresentou valores do complexo I em msculo e em fgado entre 20 e 30% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase.
118
n = 91
IV I I+IV 14 12 9 5 4 4 3 1 0 5 10 15 20 25 16 23
Complexos da CRM
Mlt Gen I+V V III III+IV I+II
N de doentes
Figura 46 - Dfices enzimticos major da CRM em 91 doentes.

Dfice enzimtico major: inferior a 20% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase; Mlt - dfice mltiplo: trs ou mais complexos, excepo do complexo II; Gen- dfice generalizado: trs ou mais complexos, incluindo o complexo II. *Um caso com valores em msculo e em fgado > 20% e 30% foi considerado dfice major.
Quanto contribuio dos diferentes tecidos para o diagnstico verificou-se que o msculo mostrou alterao funcional da CRM em 60% dos casos, o fgado em 83% dos casos e o miocrdio em 100% dos casos em que foram investigados, como exposto na figura 47.
100% 7 80% 77 60% 38 8
40%
Normal Dfice minor Dfice major
20% 76 0% Msculo n=191 Fgado n=41 Miocrdio n=11 26 10
Figura 47 - Actividade da CRM por tecido em 198 doentes.

Normal: 30% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase; dfice minor: 20% a < 30%; dfice major: <20%.
119
Anlise do DNA mitocondrial e nuclear - Os estudos do mtDNA foram realizados nos vrios tecidos (msculo, linfcitos, fgado e/ou miocrdio) ao longo do perodo de estudo. (ver Anexos, tabelas 40-44, pginas 257- 265) Na figura 48 representa-se a distribuio do tipo de rastreio (restrito, intermdio e alargado) realizado nos diferentes tecidos dos 200 doentes. O rastreio alargado foi feito em linfcitos, msculo, fgado e miocrdio em 8, 30, 11 e 2 doentes, respectivamente e o intermdio em 26, 70, 12 e 6 casos. O rastreio foi restrito em amostras de linfcitos, msculo, fgado e miocrdio em 77, 92, 14 e 1 doentes, respectivamente. No global, foi realizado um rastreio restrito, intermdio e alargado em 91, 75 e 34 doentes, respectivamente, em amostra de msculo e/ou fgado.
200 180 160 140 N de casos 120 100 80 60 40 20 0 Restrito Intermdio Tipo de estudo Alargado Miocrdio Fgado Msculo Linfcitos
Figura 48 - Rastreio de mutaes e deleces do mtDNA em 200 doentes.
Em cinco casos foi possvel identificar uma alterao patognica primria do mtDNA: em dois casos com deleco do mtDNA (um com sndrome de Pearson - deleco de 4404pb e outro com sndrome de Kearns-Sayre - deleco comum - 4977pb), numa criana com sndrome de LHON atpico, com a mutao G11778A, num doente com sndrome de Leigh de hereditariedade materna (T8993G MILS) e numa criana com miopatia mitocondrial com RRF e miocardiopatia (A3302G). Num grupo de nove doentes em quem foram detectadas deleces em msculo, fgado e/ou miocrdio (tratando-se da deleco comum em trs casos), est em curso a avaliao do grau de heteroplasmia. Num terceiro grupo de cinco crianas foram detectadas mutaes secundrias de LHON.
120
Dos sete doentes nos quais foi estudado o gene SURF1, encontrou-se alterao em trs com sndrome de Leigh, um com uma insero e outro com uma deleco no gene SURF1 e num outro doente, entretanto falecido, uma mutao Q8L em heterozigotia no exo 1 do gene SURF e dois polimorfismos (T280C e C573G nos exes 4 e 6, respectivamente). Nos dois primeiros doentes tinha sido demonstrado um dfice do complexo IV em msculo. Foi identificado um caso de depleo do mtDNA com duas mutaes pontuais (c.353 G>A (p.R118H) no exo 3 e c.749 T>C (p.L250S) no exo 6) do gene da
desoxiguanosina cinase (DGUOK). A tabela 26 resume a relao entre a alterao genotpica encontrada e o fentipo clnico e bioqumico (dfice da CRM).
121
Tabela 26 - Correlao gentipo-fentipo nos 23 doentes com alterao molecular.
Clnica Sndrome de Pearson Sndrome Kearns-Sayre Insuf.Hep.+Encefalopatia Miopatia+Miocardiopatia LHON Sndrome de Leigh Sndrome de Leigh Sndrome de Leigh Sndrome de Leigh Encefalopatia inespecfica Encefalopatia inespecfica Encefalopatia inespecfica Encefalopatia inespecfica Encefalopatia epilptica Autismo Doena multissistmica Doena multissistmica Miocardiopatia
I -
II -
III -
IV -
V -
Msc nd
Fg nd Mj nd mi mi mi
Mio nd nd Mj Mj -
DNA Del 4404pb Del 4977pb Depleo (DGUOK) Mut A3302G Mut G11778A Mut T8993G
Mj -
mi -
Mj -
Mj Mj Mj Mj -
Mj -
Mj Mj Mj Mj nd
SURF1 SURF1 SURF1(heterozigtico)

Del 6927pb Del 6175pb e 6248pb Del 4977pb Del 4977pb Del 4977pb Del 7163pb Del 12807pb Del 10659pb Del 11169pb
Mj Mj mi Mj Mj mi
mi Mj mi -
Mj mi Mj Mj -
mi Mj -
mi Mj Mj mi mi Mj Mj Mj mi -
Encefalopatia inespecfica Encefalopatia inespecfica Autismo Hepatopatia MPP. Morte sbita
duas mut 2 LHON duas mut 2 LHON duas mut 2 LHON uma mut 2 LHON uma mut 2 LHON
Abreviaturas: Msc- msculo; Fg- fgado; Mio- miocrdio. (-) actividade normal; mut- mutao; del- deleco; pb- pares de bases. Mj- dfice major (actividade enzimtica < 20% da mdia do v.r. normalizada para a citrato sintase); mi- dfice minor (actividade enzimtica 20% e < 30%). MPP- m progresso ponderal.
122
5.1.3
Classificao diagnstica dos doentes
Aplicao amostra dos critrios de Bernier para o diagnstico de DCRM Como se ilustra na figura 49, a aplicao retrospectiva nossa amostra dos critrios de DCRM adaptados criana (Bernier et al., 2002) permitiu classificar 95 doentes como tendo DCRM definida, 77 DCRM como provvel e 28 DCRM como possvel ou improvvel (10 e 18, respectivamente). Como referido em Material e Mtodos (pgina 73), o diagnstico de DCRM foi considerado definido quando se associaram dois critrios majores ou um major e dois minor; provvel, se estavam presentes um critrio major e um minor ou trs ou mais minor; possvel, se havia apenas um critrio major ou dois minor, um dos quais laboratorial e improvvel nos restantes casos.
n = 200
10
18
95
77
Definida
Provvel
Possvel
Improvvel
Figura 49 - Classificao dos 200 doentes segundo os critrios de DCRM de Bernier.
A tabela 27 resume a distribuio do tipo e nmero de critrios que permitiram o diagnstico final dos 200 doentes, segundo a classificao de Bernier em quatro nveis de probabilidade diagnstica: definido, provvel, possvel e improvvel. Na figura 50 resume-se os critrios majores registados em 100 crianas. Dezoito doentes preenchiam critrios clnicos major. Quatro crianas cumpriam o critrio clnico major de uma combinao inexplicada de sintomas multissistmicos, curso progressivo ou histria familiar sugestiva de doena mitocondrial e excluso de outras causas. A presena de uma sndrome mitocondrial clssica verificou-se em 14 casos (7% da amostra): sndrome de Leigh (oito) e encefalopatia letal infantil, sndrome de Pearson, LHON, KSS, NARP e MELAS, um caso de cada. Em trs crianas com sndrome mitocondrial clssica (uma NARP e duas sndromes de Leigh) no foram reunidos critrios de DCRM definida, mas apenas de DCRM provvel. 123
Tabela 27 - Critrios clnico-laboratoriais que permitiram o diagnstico final nos 200 casos.
Critrios Clnicos 0 0 Critrios laboratoriais 1m 2m 3m 1M 1M+1m 1M+2m 2M+1m 2M+2m Total 2

Definido 2 16 3 7 22 1* 1
1m
3 9 7
2m
6 17 12
3m
7 20 13 4 9 19 3 1
1M
1 2 1 1
Total
18 49 33 5 18
65 6
4 1
5 1
40
Provvel
64
Possvel
76
18
200
Improvvel
Abreviaturas: M= major m= minor; os nmeros em cada clula correspondem ao n de casos que cumprem os critrios de diagnstico nesta tabela de dupla entrada; a colorao de fundo corresponde ao grau de diagnstico. 1* - Um dos casos de morte sbita no pontuou clnica nem laboratorialmente: aps reanimao cardaca, manteve-se em morte cerebral, tendo a lactacidmia normalizado e o estudo da CRM e do mtDNA sido normal.
n = 100
8 18
91
Histolgico
Molecular
Clnico
Enzimtico
Figura 50 - Diagnstico de DCRM - critrios majores registados em 100 doentes.
124
Em 90 casos havia um dfice enzimtico de um ou mais complexos da CRM inferior a 20% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase em pelo menos um tecido e num outro, um dfice entre 20 e 30% do mesmo complexo em dois tecidos. Oito doentes cumpriram critrios moleculares majores: deleces e mutaes
patognicas do mtDNA em dois e trs casos, respectivamente e mutaes do nDNA em trs. Dois doentes apresentaram RRF em mais de 2% das fibras em bipsia muscular, critrio histolgico major. Em 182 crianas no foram registados critrios clnicos major. Os critrios clnicos minor mais frequentemente observados nesse grupo foram neurolgicos (em 158 casos), nutricionais (92), oftalmolgicos (47), musculares (35), hepticos (27) e cardacos (22), como se ilustra na figura 51. De entre os critrios hepticos de notar que nos nossos doentes o tipo de esteatose heptica - macrovacuolar, microvacuolar ou mista - (integrada nos critrios clnicos minor da classificao de Bernier) no se correlacionou com o diagnstico final.
n = 182
Neurolgico Nutricional Oftalmolgico Muscular Heptico Cardaco Outros Otolgico Dermatolgico Dismorfolgico Renal Endcrino Hematolgico
0 6 4 3 2 20 40 60 80 100 120 140 13 10 27 22 21 35 47 92
158
160
180
N de doentes
Figura 51 - Diagnstico de DCRM - critrios clnicos minores registados em 182 doentes.
Os critrios laboratoriais minores observados nos nossos doentes esto resumidos na figura 52. Na figura 53 d-se uma perspectiva global da distribuio relativa dos critrios laboratoriais nos 200 doentes.
125
n = 200
9 10 39
154
Molecular
Histolgico
Enzimtico
Metablico
Figura 52 - Diagnstico de DCRM - critrios laboratoriais minores em 200 doentes.
n = 198
100% 90% 80% 70%
39 9 10 154 91 8 2
Enzimtico Molecular Histolgico Metablico Minor Major
% de doentes
60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
Figura 53 - Diagnstico de DCRM - critrios laboratoriais em 200 doentes.

Por definio, os critrios metablicos so considerados minores.
Diagnstico final Quanto ao diagnstico final, em 38 crianas (19%) chegou-se a um outro diagnstico etiolgico. Setenta e oito crianas (39%) tiveram o diagnstico de DCRM definida primria. Em 84 doentes (42%) no se chegou a um diagnstico etiolgico. Estes foram classificados como DCRM primria provvel (61 casos), possvel (nove) ou improvvel (14) (figura 54).
126
n = 200
19% 42%
39%
Sem diagnstico
DCRM
Outro diagnstico
Figura 54 - Diagnstico final dos 200 doentes em estudo.
Em 38 dos 200 doentes (17 dos 95 casos com critrios de DCRM definida; 16 dos 77 casos de DCRM provvel e cinco dos 28 casos de DCRM possvel ou improvvel) chegouse a outro diagnstico etiolgico, pelo que as alteraes da funo mitocondrial, quando presentes, foram consideradas secundrias (figura 55).
90 80 70 61 60 78
n = 200
N de doentes
50 40 30 23 20 10 0 Definido Provvel Pos/Improv 17 16
Primria Secundria
Nveis de diagnstico
Figura 55 - Diagnstico final em 200 doentes.

Em 38 casos (22% dos definidos, 26% dos provveis e 22% dos possveis ou improvveis) chegou-se a outro diagnstico etiolgico. As alteraes da funo mitocondrial, quando presentes, foram consideradas secundrias.
127
De entre os outros diagnsticos etiolgicos, encontrados em 38 doentes, o grupo das outras doenas hereditrias do metabolismo foi o mais representado, com 12 casos (tabelas 28 e 29).
Tabela 28 - Outros diagnsticos etiolgicos em 38 doentes.
n=38 doentes Outras DHM Infeco Cromossomopatia Glicogenose x Hipotiroidismo Hipoxia/isqumia Outras causas Total diagnsticos Total de doentes
Total 12 10* 4 3 2 2 7** 40 38
DCRM definida 2 4 7 1 1 1 1 3 18 17
Abreviaturas: DHM - doena hereditria do metabolismo. * Associada a outro diagnstico em dois casos. ** Outras causas: sndrome de Shwachman-Diamond; sndrome de Noonan; distrofia muscular de Ullrich; doena celaca com miocardite viral; falncia heptica por intoxicao com paracetamol; paralisia cerebral; pneumonia/golpe de calor.
Tabela 29 - Outras doenas hereditrias do metabolismo em 12 doentes.
Outras Doenas Hereditrias do Metabolismo Total Doena da Glicosilao das Protenas Doena de Pompe Dfice Mltiplo das AcilCoADesidrogenases Dfice da Piruvato-Desidrogenase Dfice do Cofactor do Molibdnio Glicogenose tipo IV Dfice Hidroxi-AcilCoA Desidrogenases de Cadeia Longa Leucodistrofia Metacromtica Lipofuscinose Ceride Neuronal Total 2 2 2 1 1 1 1 1 1 12 DCRM Definida 2 0 1 0 0 0 1 0 0 4
128
Quatro doentes com o diagnstico final de outra doena hereditria do metabolismo cumpriram critrios de DCRM definida: dois casos de doena da glicosilao das protenas (Congenital Disorders of Glycosilation - CDG), a criana com Dfice das Hidroxiacil-CoA Desidrogenases de Cadeia Longa (LCHADD) e uma das duas crianas com Dfice Mltiplo das Acil-CoA Desidrogenases (MADD), mais precisamente com dfice da respectiva oxido reductase (a outra criana com MADD apresentava deficincia da flavoprotena transportadora de electres e cumpria critrios de DCRM provvel). Os outros diagnsticos de doena hereditria do metabolismo desta srie foram: doena de Pompe (dois casos) e dfice da piruvato desidrogenase, glicogenose tipo IV, dfice do cofactor do molibdnio, leucodistrofia metacromtica e lipofuscinose ceride neuronal (um caso cada). Em trs doentes foi documentada acumulao significativa de glicognio no msculo mas no se chegou a um outro diagnstico, pelo que foram designados como sofrendo de glicogenose x. Uma delas, com sobrecarga de glicognio no msculo e no fgado, cumpriu critrios de DCRM definida. A infeco (viral ou presumivelmente viral em nove casos) foi o segundo grupo etiolgico mais frequente. Num recm-nascido foi documentada sepsis a Streptococcus Faecalis e Enterobacter. Este caso e outros seis com infeco viral demonstrada ou presumida (a herpes vrus e Epstein-Barr, a vrus Epstein-Barr, a adenovrus com falncia heptica, a parvovrus e meningoencefalite e peri-miocardite virais) cumpriam critrios de DCRM definida. A clnica e evoluo destes doentes esto resumidas na tabela 15 (pgina 106). Em duas crianas (com os diagnsticos de glicogenose x e de doena celaca) associouse infeco viral confirmada (citomegalovirose pr-natal) ou presumida (peri-miocardite na necrpsia), respectivamente. Os outros diagnsticos associados a critrios de DCRM definida corresponderam a intoxicao por paracetamol com insuficincia heptica, descolamento placentar com isqumia perinatal aguda, cromossomopatia, hipotiroidismo central no contexto de panhipopituitarismo e distrofia muscular de Ullrich.
A idade aquando da colheita de tecidos realizada por suspeita de DCRM variou entre o primeiro dia de vida e os 18 anos, com uma mediana de 4 e uma mdia de 5 anos (figura 56). Como se ilustra na figura 57, a demora mdia no diagnstico foi calculada em 4,4 anos (0 dias a 18 anos; mediana: 2,8 anos). Em 27 casos, o intervalo entre o incio das manifestaes clnicas e o diagnstico foi de 10 ou mais anos.
129
n = 200
30% 29%
25% 22%
% de doentes
20% 16% 15%
15%
10% 6% 5%
9%
4%
0% 1M[ [1-6M][ [6-12M[ [1-2A[ [2-6A[ [6-10A[ [10A
Grupos etrios
Figura 56 - Idade da colheita de tecidos em 200 doentes.
25%
24% 21%
20%
% de doentes
15%
13%
14%
14%
10%
8% 5%
5%
3%
0% <30d [1-3M[ [3-6M[ [6-12M[ [1-3A[ [3-5A[ [5-10A[ [10A
Demora no diagnstico
Figura 57 - Demora no diagnstico em 200 doentes.
Como demonstrado na figura 58, ao longo do perodo de estudo verificou-se uma tendncia para o aumento do nmero de doentes agudos com episdio fatal ou incapacitante e uma diminuio do nmero de doentes crnicos com agudizao fatal ou incapacitante. O nmero de doentes crnicos investigados manteve-se praticamente constante.
130
100 90 80
% de doentes
70 60 50 40 30 20 10 0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
Crnico CrFatal/Inc. AgFatal/Inc. Linear (Crnico) Linear (CrFatal/Inc.) Linear (AgFatal/Inc.)
Ano do estudo
Figura 58 - Evoluo do tipo de doente investigado ao longo do perodo do estudo.

% de doentes- n de doentes/ n total de casos estudados no ano em causa. Tendncia ao aumento do nmero de doentes agudos com episdio fatal ou incapacitante, diminuio do nmero de doentes crnicos com agudizao fatal ou incapacitante e relativa estabilidade do nmero de doentes crnicos investigados. Abreviaturas: Crnico- doentes crnicos; CrFatal/Inc- doentes crnicos com agudizao fatal ou incapacitante; AgFatal/Incdoentes agudos com episdio fatal ou incapacitante.
Feita a anlise do diagnstico final por ano do estudo, assistiu-se a uma tendncia ao decrscimo de diagnsticos de DCRM e a aumento dos casos sem diagnstico. O nmero de outros diagnsticos manteve uma linha de tendncia estvel (figura 59).
70 60 50 40 30 20 10 0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
SemDiagn DCRM OutroDiagn Linear (SemDiagn) Linear (DCRM) Linear (OutroDiagn)
% de doentes
Ano do estudo
Figura 59 - Evoluo do diagnstico final ao longo do perodo do estudo.

% de doentes- n de doentes/ n total de casos estudados no ano em causa. Tendncia ao decrscimo da percentagem de doentes com DCRM, ao aumento relativo dos casos sem diagnstico e estabilidade da % de doentes com outros diagnsticos. Abreviaturas: SemDiagn- sem diagnstico etiolgico; OutroDiagn- outro diagnstico.
131
5.1.4
Anlise de alguns aspectos particulares da amostra
Factores de prognstico vital Investigou-se a relao entre a mortalidade e o incio dos sintomas no primeiro semestre de vida e o tipo de apresentao, NM/ENM. Estabeleceu-se curvas de sobrevivncia para os parmetros mais relevantes, a saber: envolvimento cardaco, heptico, hiperlactacidmia, acidose lctica, hiperalaninmia e diagnstico final. Quando os sintomas se iniciaram no primeiro semestre de vida, a mortalidade foi mais elevada (34,7% versus 14,6%; p=0,002). A apresentao ENM estive tambm ligada a um pior prognstico (faleceram 23% dos 153 casos de apresentao NM e 51% dos 47 do grupo ENM; p=0,000). A sobrevida foi independente do gnero (Log Rank 0,726; masculino/feminino: mdia 8,4 versus 9,5) e do registo de hiperlactacidmia em pelo menos uma ocasio (Log Rank 0,586; mdia: 9,1 vs 8,8 anos). Foram factores associados a mortalidade mais elevada: o envolvimento cardaco (Log Rank 0,000; mdia: 6,4 versus 9,3 anos) e o compromisso heptico (Log Rank 0,000; mdia: 4,3 versus 9,7 anos) (figura 60).
Figura 60 - Anlise de factores clnicos que influenciaram a sobrevida em 200 doentes.

(a) presena de envolvimento cardaco (b) presena de envolvimento heptico.
Do mesmo modo, os doentes com hiperlactacidmia documentada em mais de trs ocasies (Log Rank 0,011; mdia: 8,2 versus 9,8 anos), com acidose lctica (Log Rank 0,000; mdia: 3,0 versus 9,6 anos) ou com hiperalaninmia (Log Rank 0,040; mdia: 8,6 versus 9,5 anos), sobretudo se superior a 450 M (Log Rank 0,004; mdia:
132
8,2 versus 9,6 anos), tiveram pior prognstico (figura 61)
Figura 61 - Anlise de factores laboratoriais que influenciaram a sobrevida em 200 doentes.

(a) presena de hiperlactacidmia sem acidose em trs ou mais ocasies; (b) presena de acidose lctica; (c) presena de alanina plasmtica superior a 450 M.
Os casos nos quais foi encontrado um outro diagnstico etiolgico estiveram associados a menor sobrevida (Log Rank 0,000; mdia de sobrevida: 4,8 versus 9,8 anos) e a bito mais precoce (Log Rank-0,000; mdia de idade de morte 0,5 versus 3,2 anos), como ilustrado na figura 62.
Figura 62 - Sobrevida e diagnstico final.

(a) os doentes com um outro diagnstico final tiveram menor sobrevida (anlise em 200 doentes) e (b) bito no primeiro semestre de doena (anlise dos 53 doentes falecidos).
A mortalidade foi mais acentuada (maior percentagem de crianas falecidas) e mais precoce (maior percentagem de falecimentos na primeira semana e no primeiro semestre 133
de doena) no grupo com outros diagnsticos (tabela 30).
Tabela 30 - Grupos diagnsticos versus mortalidade.
bitos SemDiagn DCRM OutroDiagn 12% 30% 53%
1semana doena 10% 9% 30%
1semestre doena 20% 52% 85%
Abreviaturas: SemDiagn- sem diagnstico etiolgico; DCRM- doena da cadeia respiratria mitocondrial definida; OutroDiagn- outro diagnstico etiolgico.
Circunstncias de colheita de tecidos para diagnstico Procurou-se saber se as circunstncias de colheita de tecidos para diagnstico [(em todos os casos de colheita post mortem imediata (25 crianas), em sesso operatria prpria (154) ou programada com outra cirurgia (21)] se relacionaram com o diagnstico final e a deteco de dfice funcional dos complexos I a V da CRM no msculo, no fgado e no global dos tecidos. Como se evidencia nas figuras 63 e 64, chegou-se a um outro diagnstico final em 48% dos casos com colheitas post mortem e em 14% dos doentes submetidos a colheitas in vivo. Em comparao com as colheitas post mortem, constatou-se uma relao estatisticamente significativa entre as colheitas in vivo e doena primria (p=0,000; OR=5,8), DCRM definida, (0,009; OR=3,3), DCRM definida primria versus definida secundria (p=0,000; OR=8,6) e normalidade dos complexos I a V da CRM no global dos tecidos (p=0,039; OR=3). Nos doentes com colheitas in vivo, aquelas em que foram realizadas em sesso operatria prpria tiveram outros diagnsticos em 15% dos casos em comparao com 5% dos submetidos a colheitas oportunistas (isto , em que se aproveitou a sesso operatria de outras cirurgias). Da anlise estatstica dos parmetros acima referidos, concluiu-se que os doentes com colheitas programadas tiveram mais diagnsticos de DCRM definida (p=0,014; OR=3,8) e definida primria (p=0,012; OR=4,5), bem como dfice da CRM no msculo (p=0,008; OR=3,5) e no total dos tecidos (p=0,003; OR=4) do que os doentes com colheitas oportunistas (figuras 63 e 64). A distribuio dos casos por nveis de diagnstico de DCRM, primria e secundria, relacionado com o tipo de colheita est representada na figura 64.
134
100% 90% 80% % de tecidos estudados 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Programada n=154 "Oportunista" n=21 Post-mortem n=25 n=200
Primrios Secundrios
Figura 63 - Condies de colheita de tecidos e tipo de diagnstico final, primrio ou secundrio.
100%
n = 200
% de colheitas de tecidos
80%
60%
Post-mortem n=25
40%
"Oportunista" n=21 Programada n=154
20%
0%
Definido 1
Outros 1
Definido 2
Outros 2
Figura 64 - Condies da colheita de tecidos e diagnstico final em 200 doentes.

Definido 1 - DCRM definida; Outros 1 - Sem diagnstico; Definido 2 - Outro diagnstico, com critrios de DCRM definida; Outros 2 - Outro diagnstico, sem critrios de DCRM definida.
Medicao aquando da colheita de tecidos para diagnstico Analisou-se a medicao aquando das colheitas de tecidos para estudos funcionais da CRM, nomeadamente o nmero e tipo de frmacos: anticonvulsivantes (em particular o valproato de sdio), antipsicticos (risperidona e outros), antibiticos (incluindo os antivirais) e medicamentos para tratamento da insuficincia cardaca, de sintomas digestivos, de doena heptica e outros (figura 65). Noventa e trs crianas (46,5%) 135
estavam medicadas aquando da colheita de tecidos para estudos mitocondriais, 73% das quais em politerapia. Os frmacos mais frequentemente em causa foram os
anticonvulsivantes (45 casos), os antibiticos (19) e os antipsicticos (15).
n = 200
14,5% 5,5%
53,5% 12,5%
14,0%
Mais de trs frmacos
Trs frmacos
Dois frmacos
Um frmaco
Sem medicao
Figura 65 - Medicao aquando da colheita de tecidos para estudos mitocondriais.
Vinte e cinco crianas estavam medicadas com valproato de sdio, s ou em associao com outros anticonvulsivantes (figura 66).
n = 200
7,0% 5,5%
6,5%
3,5%
77,5%
No
Valproato
Valproato+OAC
OAC
OACassociao
Figura 66 - Medicao anticonvulsivante aquando do estudo mitocondrial.

Abreviatura: OAC- outros frmacos anticonvulsivantes.
A risperidona era o frmaco usado por 11 dos 15 doentes medicados com antipsicticos. Em trs casos estava associado a outro medicamento do mesmo grupo. 136
Trs crianas estavam medicadas com aciclovir intravenoso (associado a antibiticos em duas). Frmacos para tratamento de insuficincia cardaca, de sintomas do foro digestivo, de doena heptica e outros foram registados em 20, 16, sete e nove casos, respectivamente. Procurou-se uma correlao entre a toma de frmacos e o seu tipo aquando do diagnstico (sem medicao, com trs ou mais frmacos, anticonvulsivantes, valproato de sdio, antipsicticos, risperidona, antibiticos) e a presena de dados laboratoriais relevantes no diagnstico [acidria orgnica, hiperlactacidmia, hiperalaninmia,
hiperprolinmia, dfices dos complexos da CRM ( I no msculo, IV no msculo, I a V no msculo, I a V fgado e I a V no global dos tecidos)] e entre a medicao e o diagnstico de DCRM definida. Neste grupo de doentes a toma de qualquer medicao esteve estatisticamente relacionada com o dfice da CRM no global dos tecidos estudados (p=0,037; OR=2) e o diagnstico de DCRM definida [55,8% dos com DCRM definida e 38,1% dos sem DCRM definida faziam medicao (p=0,012; OR=2)]. Por outro lado, o uso de trs ou mais medicamentos associou-se a um mais frequente diagnstico de DCRM definida (p=0,077; OR=2) e de hiperprolinmia (p= 0,029; OR=3,5). A deteco de cidos orgnicos anormais esteve relacionada com o uso de trs ou mais medicamentos (p=0,043; OR=2,4). Da anlise dos subgrupos de frmacos, apenas o uso de antibiticos mostrou relao significativa com a demonstrao de cidos orgnicos anormais (p=0,034; OR=3,2). A toma de valproato de sdio ou de antipsicticos no estiveve associada a alteraes nos cidos orgnicos urinrios. Do mesmo modo, no houve associao entre o uso da risperidona e o dfice do complexo I ou da CRM em geral.
Caracterizao dos doentes com o diagnstico de DCRM
Crianas com o diagnstico de DCRM definida primria -Setenta e oito doentes foram classificados segundo os critrios de Bernier como tendo DCRM definida primria, isto , sem que se tivesse chegado a um outro diagnstico mais plausvel. A anlise deste grupo de doentes, que se distriburam igualmente por ambos os sexos, foi objecto de publicao (Diogo et al., 2009), transcrita em Anexos, pginas 283- 288. Segue-se uma anlise comparativa entre o grupo de doentes com DCRM definida primria e os outros grupos. As crianas com DCRM definida primria eram fruto de uma primeira gestao em 42% dos casos. Na altura da bipsia diagnstica, 37% eram filhos nicos, comparativamente com 30% dos casos sem DCRM definida primria.
137
A idade materna (28 anos versus 27,5 anos), complicaes na gravidez, idade gestacional, parto distcico (33,4% versus 41,8%), asfixia perinatal (14,1% versus 22,1%) e internamento no perodo neonatal (29,5% versus 32,8%) foram semelhantes no grupo das DCRM definidas primrias e no dos outros doentes. As complicaes do grupo hipertenso arterial/ pr-eclmpsia/ colestase gravdica foram menos frequentes no primeiro grupo, diferena sem significado estatstico. No houve dissemelhanas entre os dois grupos, com e sem DCRM definida primria, nos antecedentes familiares no que diz respeito a consanguinidade (7,7% versus 9%) e mortes inesperadas em familiares prximos (26,9% versus 22,1%). As mortes inesperadas pr-natais foram menos frequentes no grupo definido primrio do que nos outros (28,6% versus 55,6%). O mesmo se verificou quando se limitou a anlise ao ncleo familiar restrito (irmos e progenitores) (7,7% versus 12,3%). Em relao s mortes inesperadas em familiares adultos ocorreu o contrrio (14,3% versus 3,7%). Os dois nicos casos de pais falecidos pertenciam ao grupo de DCRM definida primria. H mais vezes referncia a antecedentes familiares patolgicos maternos do que paternos em ambos os grupos: 10,3% versus 7,4% no dos com DCRM definida primria e 2,6% versus 0,8% nos outros doentes. O incio dos sintomas no grupo das DCRM definidas primrias ocorreu entre o primeiro dia de vida e os 8 anos, verificando-se antes dos 6 meses de idade em cerca de metade (55%) dos casos (mediana 4 meses; mdia 9,5 meses). A idade e tipo de apresentao (isto , NM/ENM, doena crnica/ episdio agudo grave) foram semelhantes nos dois grupos em apreciao. Da anlise da frequncia dos sinais clnicos de apresentao e evoluo no se encontrou diferena entre o grupo com DCRM definida primria e as restantes crianas, excepto no que se refere ocorrncia de malformaes e/ou dismorfismos, mais raro no grupo das definidas primrias (7,7 versus 19,8%; p=0,021). A mediana da idade da bipsia foi de 2,9 anos versus 4 anos e a mediana da demora diagnstica foi de 2 versus 3 anos no grupo de doentes com DCRM definida primria e no dos outros, respectivamente. Faleceram ou viram o seu estado agravar-se 42,3% e 37,7% crianas no grupo de DCRM definida primria e no dos outros, respectivamente. O bito ocorreu em 29,5% dos casos com DCRM definida primria e em 24,6% nos outros. Sobreveio nos primeiros 6 meses de evoluo em 47,8% e 36,7% dos casos (em 8,7% e 23,3% na primeira semana de doena), respectivamente. A mediana da idade do bito foi idntica ( 0,7 versus 0,8 anos). O tempo de evoluo foi, no grupo com DCRM definida primria e no dos outros, respectivamente de 0,7 e 0,4 anos nos que faleceram e 11,6 e 8,8 anos nos sobreviventes. A idade mdia e mediana dos sobreviventes no fim do estudo era de 13,2 e 11,5 anos e de 13 e 11 anos, respectivamente. 138
No se encontraram diferenas estatisticamente significativas entre as crianas com DCRM definida primria e os outros doentes nos restantes parmetros analisados no que respeita histria familiar e pessoal e apresentao e evoluo clnicas. Do mesmo modo, no foram encontradas diferenas estatisticamente significativas nos parmetros anteriormente referidos entre os doentes com DCRM definida primria (n=78) e os com DCRM possvel ou improvvel primria (n=23).
DCRM definida primria e secundria - Na reviso dos doentes com diagnstico de DCRM definida primria (n=78) e secundria (n=17), considerou-se, para alm dos dados clnicos anteriormente referidos, outros parmetros clnicos e laboratoriais, alguns dos quais foram usados como critrio de diagnstico: envolvimento neurolgico, metablico, heptico, cardaco e renal, atraso de crescimento, atraso/regresso do desenvolvimento psicomotor, dados imagiolgicos do crebro, nveis de lactato no lquor, lactacidmia, nveis plasmticos de alanina e de prolina e cidos orgnicos urinrios. Verificou-se que no grupo das crianas com DCRM definida primria houve maior incidncia de doena crnica [71,8% versus 23,5% (p= 0,000)]. No grupo de DCRM definida primria a apresentao NM [77 versus 29,4% (p=0,000)] e a evoluo NM
[85,5 versus 69,2 % (p=0,002)] foram mais frequentes. A evoluo multissistmica foi mais frequente no grupo de DCRM definida secundria, diferena sem significado estatstico [25% versus 46% (p=0,117)]. Nos doentes com DCRM definida secundria a idade da colheita de tecidos foi mais precoce [1,8 versus 5,2 anos (p=0,001)] e a demora diagnstica, mais curta [0,98 versus 4,4 anos (p=0,000)]. Nestes, verificou-se uma maior mortalidade [76,5 versus 29,5% (p=0,000)], e uma mortalidade mais precoce [92% versus 52% nos primeiros seis meses de doena (p=0,014)]. O tempo de evoluo foi consequentemente mais curto nos falecidos daquele grupo [0,3 versus 2,1 anos (p=0,011)]. O tempo de evoluo dos sobreviventes foi semelhante (11,2 anos) nos dois grupos. Na tabela 31 representam-se os resultados da anlise comparativa de alguns parmetros clnicos relevantes nos dois subgrupos de DCRM definida. No se observaram diferenas na frequncia de hiperlactatorraquia ou de elevao plasmtica do lactato, alanina ou prolina, de acidria orgnica ou de alteraes histolgicas entre os dois grupos de DCRM definida, primria e secundria. Nos doentes em que se obteve imagem cerebral (TAC e/ou RMN), havia alteraes em 69% dos 67 casos com DCRM definida primria e em todos os 10 casos com DCRM definida secundria (p=0,045).
139
Tabela 31 - Anlise de alguns parmetros clnicos nos dois subgrupos de DCRM definida.
DCRM Definida Apresentao
Primria (n=78) N % 58 3 74 4
Secundria (n=17) N % 7 5 41 29
p 0,008 0,001
Neurolgica Coma Acidose lctica e/ou hipoglicmia Heptica Insuficincia heptica

Evoluo
3 3 1 N 71 19 63 10 24 11 15 11 4
4 4 1 % 91 24 81 13 31 14 19 14 5
4 5 4 N 10 0 5 5 2 9 7 4 4
24 29 24 % 59 0 29 29 12 53 41 24 24
0,005 0,001 0,000 p 0,001 0,025 0,000 0,089 0,111 0,000 0,052 0,334 0,013
Neurolgica Mov.anormais e/ou distonia* Atraso e/ou RDPM ** #

Coma Atraso de crescimento
Envolvimento heptico #
Envolvimento cardaco Miocardiopatia
Envolvimento renal
# Mantm-se diferena com significado estatstico entre os dois grupos quando se considera isoladamente o atraso e a regresso do desenvolvimento psicomotor ou os vrios tipos de envolvimento heptico (hepatomeglia, colestase, citlise, insuficincia heptica). Abreviaturas: * Mov.- movimentos ** RDPM- regresso do desenvolvimento psicomotor.
140
5.2 Doena mitocondrial na criana na Regio Centro de Portugal

5.2.1 Incidncia
Considerou-se o nmero de nado-vivos na Regio Centro no intervalo de 8 anos (19891996), isto , os que teriam entre 10 e 18 anos no fim do perodo de estudo (Osrio, 19891996; Instituto Nacional de Estatstica, 2001) e o nmero de casos com DCRM definida primria diagnosticados em crianas nascidas na mesma Regio nesse perodo. A incidncia da DCRM definida, com manifestao clnica at aos 10 anos de idade na Regio Centro foi estimada em ~ 1 caso / 6500 nado-vivos (ou ~ 1,5 /10000). Na tabela 32 mostra-se a incidncia calculada tendo por base diferentes intervalos de tempo considerados.
Tabela 32 - Estimativa da incidncia de DCRM na Regio Centro de Portugal.
Ano de nascimento 1992-1996 1991-1996 1989-1996 n doentes 22 26 29 n nado-vivos 116983 142508 188209 Incidncia 1/ 5317 1/ 5481 1/ 6490 1,9/ 10000 1,8/ 10000 1,5/ 10000
5.2.2
Prevalncia
No fim do perodo do estudo havia 12 doentes com o diagnstico de DCRM definida primria, vivos, residentes na Regio Centro, com idades compreendidas entre os 0 e os 9 anos (inclusive). A estimativa da populao entre os 0 e os 9 anos de idade na mesma regio em 2006 de 222342 crianas (Instituto Nacional de Estatstica, 2007). Assim, a prevalncia pontual de DCRM no fim do perodo de estudo na Regio Centro foi calculada em 1 caso/ 18529 (ou 5,4 casos/ 100000) habitantes com menos de 10 anos de idade.
141
5.3 Anlise da escala diagnstica adoptada

Com o objectivo de aferir a escala diagnstica utilizada (Bernier et al., 2002) aplicou-se nossa srie de doentes os critrios gerais de DCRM usados pelo grupo de Nijmegen (Wolf e Smeitink, 2002), descritos no captulo Material e Mtodos (pgina 78). Repartidos pelas trs categorias de apresentao (muscular: 31, 15,5%; neurolgica: 125, 62,5% e multissistmica: 44, 22%), os 200 doentes foram classificados nos quatro grupos de diagnstico: DCRM definida (33: 17%), provvel (92: 46%), possvel (69: 35%) e improvvel (6: 3%) (figuras 67 a 69).
n= 200
3% 35%
17%
45%
Improvvel
Possvel
Provvel
Definido
Figura 67 - Classificao dos doentes segundo os critrios gerais de Nijmegen.
n = 200
200 180 160 140
0-4
N de casos
120 100 80 60 40 20 0 Muscular(0-2) Neurolgico(0-2) Multi-sist.(0-3) Metab.&Imag.(0-4) Morfolgico(0-4)
Zero Um Dois Trs Quatro
Figura 68 - Critrios clnico-laboratoriais gerais de Nijmegen preenchidos pelos 200 doentes.

O somatrio das alteraes clnicas (muscular, neurolgico e multissistmico) pontua de zero a quatro. Abreviaturas: Multi-sist.- multissistmico; Metab&Imag.- metablico e imagiolgico
142
Figura 69 - Critrios clnico-laboratoriais gerais de Nijmegen preenchidos em 200 doentes.

Segundo os critrios clnico-laboratoriais gerais de Nijmegen cada doente pontua de 0 a 12.
Segundo os critrios gerais de Nijmegen, 13% das 38 crianas com doena secundria (isto , com outro diagnstico etiolgico) e 17% dos 162 casos com doena primria tinham critrios de DCRM definida, diferena sem significado estatstico (figura 70).
n = 200
80 71 70 60 57
N de casos
50 40 30 20 10 0 Improvvel Possvel Provvel Definido 6 0 12 5 28 21
Primria:162 Secundria:38
Grau de diagnstico
Figura 70 - Classificao diagnstica nos 200 doentes segundo os critrios de Nijmegen.

A proporo de DCRM definida entre os casos de doena primria e secundria semelhante.
Como delineado na figura 71, a classificao de Bernier adaptada (isto , com excluso dos critrios relacionados com a actividade enzimtica da CRM e com o estudo molecular) 143
elege dois casos como definidos e 121 como provveis, contra 33 e 92, respectivamente, na escala geral de Nijmegen.
n = 200
70 60
% de casos estudados
50 40 30 20 10 0 Improvvel Possvel Provvel Definido
Nijmegen Bernier adaptada
Nvel de Diagnstico
Figura 71 - Aplicao das escalas geral de Nijmegen e Bernier adaptada amostra.

escala original de Bernier foram retirados os resultados da actividade enzimtica e do estudo molecular.
Da comparao dos resultados da aplicao das duas classificaes srie de 200 doentes, constatou-se que em 83 casos (42%) se obteve o mesmo nvel de diagnstico, em 105 casos (51%) a diferena no agrupamento diagnstico foi de um ponto e em 12 casos (6%), de dois pontos, nos quatro possveis. Houve discrepncia de um ou dois nveis a favor da classificao de Bernier, respectivamente em 24 e dois casos A diferena de um ou dois nveis a favor da classificao de Nijmegen verificou-se em 81 e 10 casos, respectivamente. A concordncia entre as duas classificaes, subdividindo a amostra em DCRM definida e DCRM no definida, foi muito baixa (Kappa=0,05). O valor de Kappa foi de 0,427 (concordncia moderada) quando se subdividiu a srie em DCRM definida ou provvel e DCRM possvel ou improvvel. Nos casos com sndrome mitocondrial, incluindo um com depleo do mtDNA (15 doentes), houve concordncia de resultados em 47%. O nvel de concordncia de diagnstico foi de 43% nos sete casos com diagnstico molecular e de 43% nas 164 crianas nas quais no foi encontrada uma outra causa para a doena, isto , com doena primria. Considerando o grupo dos 164 casos de doena primria concluiu-se por um diagnstico de DCRM provvel ou definida em 81doentes (49%) em ambas as classificaes. Nos casos com doena secundria houve cinco catalogados como DCRM definido na classificao de Nijmegen e nenhum na de Bernier adaptada. 144
5.4 Estudo mitocondrial funcional realizado - perspectiva clnica
5.4.1
Cetonmia
A avaliao dos corpos cetnicos (-hidroxibutirato e acetoacetato) e dos cidos gordos livres circulantes foi realizada (pelo menos uma vez) em 143 doentes: 74%, 73% e 61% das crianas com o diagnstico de DCRM definida, provvel e possvel/ improvvel, respectivamente. Em 128 dos 143 doentes no se encontrou um outro diagnstico (casos primrios). O nmero de determinaes variou entre uma (53 crianas) e cinco ou mais (25), com uma mediana de duas determinaes. Em 46 casos a cetonmia foi determinada mais do que uma vez no mesmo dia: antes e aps uma refeio em 24 doentes, antes e aps duas ou mais refeies no mesmo dia em 22 crianas e no contexto de teste de tolerncia glicose oral em sete casos. Os nveis plasmticos de corpos cetnicos corrigidos para os cidos gordos livres doseados simultaneamente (cetonmia relativa) variaram entre 0,08 e 6,9 (mdia: 0,97; mediana: 0,68). A razo -hidroxibutirato/ acetoacetato variou entre 0,36 e 50,2 (mdia: 7,8; mediana: 6,49). Detectou-se elevao ps-prandial da cetonmia (paradoxal) em 38 dos 46 doentes analisados. Com o objectivo de valorizar a cetonmia relativa e a razo -hidroxibutirato/ acetoacetato como critrios de diagnstico de DCRM, os valores destes parmetros foram relacionados com a presena de: envolvimento heptico, hiperlactacidmia,
hiperalaninmia, hiperprolinmia, dfice dos complexos I a V no global dos tecidos e diagnstico final (tipo e graus: definido primrio versus outros; definido primrio versus provvel primrio; definido primrio versus outros primrios). No conjunto dos 143 doentes verificou-se haver relao entre a cetonmia relativa e a presena de hiperlactacidmia (0,68 com lactato normal versus 1,05 com lactato elevado; p=0,011) e de dfice do complexo III (cetonmia: 0, 86 com III normal versus 1,4 com dfice do complexo III; p=0,014). A razo -hidroxibutirato/acetoacetato no se correlacionou com nenhum dos
parmetros analisados. A cetonmia relativa e a razo -hidroxibutirato/ acetoacetato no tiveram relao com o tipo e grau de diagnstico de DCRM, inclusive quando se comparou o grupo improvvel/possvel primrio (14 casos; mdias: 0,66 e 10,6, respectivamente para a cetonmia relativa e o quociente entre os corpos cetnicos) e grupo definido primrio (65 casos; mdias: 1,0 e 8,0), como se mostra na figura 72. Nos 128 casos de doena primria no se encontrou relao com significado estatstico entre os valores da cetonmia relativa ou da razo -hidroxibutirato/ acetoacetato e os parmetros em anlise anteriormente referidos. 145
Figura 72 - Relao entre a cetonmia e o grau de diagnstico de DCRM.

(a) - Relao entre o ratio corpos cetnicos/ cidos gordos livres (AGL) e o grau de diagnstico de DCRM; (b)- Relao entre o ratio hidroxibutirato/ acetoacetato e o grau de diagnstico. Improv.- improvvel
A presena de cetonmia paradoxal no se correlacionou com os diversos grupos de certeza diagnstica, o envolvimento heptico, a presena de hiperlactacidmia, de hiperalaninmia ou de hiperprolinmia, a elevao da relao lactato/piruvato plasmtica (avaliada em 33 dos 46 casos) e os dfices dos complexos I-V no seu conjunto.
5.4.2
Estudo polarogrfico
O estudo funcional da CRM por polarografia (com os substratos malato-piruvato, succinato e duroquinol) foi realizado em linfcitos em 74 casos e em mitocndrias isoladas de msculo em 70 casos. No estudo em linfcitos, o consumo de oxignio com o malato-piruvato foi sempre normal e apenas mostrou valores inferiores a 30% da mdia do v.r. com o succinato e o duroquinol em um e quatro dos 74 doentes, respectivamente. Na polarografia das mitocndrias isoladas observaram-se valores inferiores a 30% da mdia do v.r. em 22, 36 e 48 das 70 preparaes, respectivamente para o malatopiruvato, o succinato e o duroquinol. Para a preparao de mitocndrias, fez-se a anlise de concordncia entre a oxidao do succinato, do duroquinol e do malato-piruvato e a actividade dos complexos II, III e I a IV, respectivamente, cujo resultado referido na seco dedicada espectrofotometria (pgina 154).
146
5.4.3
A actividade enzimtica dos complexos da CRM
Expresso da actividade enzimtica A actividade dos complexos da CRM avaliada por espectrofotometria pode ser expressa de diferentes formas. Segue-se uma anlise comparativa de diferentes modos de expresso da actividade enzimtica do complexo IV, com o objectivo de vir a adoptar o modo e o limite de corte (cut-off) mais adequados para ser feito o diagnstico de dfice funcional da CRM. Os resultados da actividade do complexo IV em mitocndrias isoladas de msculo (89 casos) e no homogeneizado de msculo (145 casos) esto representados na tabela 33 e na figura 73.
Tabela 33 - Actividade enzimtica do complexo IV expressa de diversos modos.
Mitocndrias n=89
Homogeneizado n=145
%med Normal [20-30%[ [0-20%[ 44
%med/ CS 78
%md/ II 79
%med 73
%med/ CS 76
%md/ II 91
18 38
6 16
7 14
10 17
12 12
3 6
A actividade do complexo IV est expressa como % da mdia do v.r.: em nmol/min/mg protena (%med), normalizada para a citrato sintase CS - (%med/ CS) e normalizada para o complexo II da CRM (%md/ II). Mostra-se a percentagem de casos com actividade inferior a 20% da mdia do v.r., entre 20% e 29% da mdia do v.r. e normal (30% da mdia do v.r.) do complexo IV em mitocndrias de msculo (89 doentes) e em homogeneizado de msculo (145 doentes).
Com o objectivo de perceber se as unidades adoptadas neste estudo (actividade enzimtica corrigida para a da citrato sintase, em funo da percentagem da mdia do v.r.) teriam sido as mais adequadas, fez-se a anlise de concordncia dos diferentes modos de expressar a actividade enzimtica do complexo IV da CRM nas mitocndrias isoladas de msculo e no homogeneizado de msculo, exposta nas tabelas 34 e 35.
147
100 90 80
% de valores normais
70 60 50 40 30 20 10 0
Mit n=89 Hom n=145
nmol
nmol/ CS
nmol/ II
%med
%med/CS
%med/II
Figura 73 - Complexo IV em msculo em funo da expresso da actividade enzimtica.

Percentagem de amostras com valores normais de actividade do complexo IV em mitocndrias isoladas de msculo (89 doentes) e em homogeneizado de msculo (145 casos) em funo do modo de expresso da actividade enzimtica. Abreviaturas: Mit- mitocndrias; Hom- homogeneizado; nmol/min/mg protena, como ratio da actividade da citrato sintase CS e como ratio da actividade do complexo II da CRM; em todos os casos em funo do v.r. (nmol; nmol/CS, nmol/II) e em % da mdia do v.r. (%med, %med/CS, %med/II).
Tabela 34 - Unidades de expresso da actividade do complexo IV - mitocndrias de msculo.
MIT n=89 %med nmol %med/CS nmol /CS %md/II
%med
nmol ,586
%med/CS ,327 ,555
nmol /CS ,585 ,425 ,276
%md/II ,266 ,472 ,508 ,219
nmol / II ,310 ,541 ,413 ,315 ,482
Anlise de concordncia da actividade enzimtica do complexo IV da CRM em termos de normalidade ou deficincia entre as vrias unidades de expresso da mesma em mitocndrias isoladas de msculo de 89 doentes. Abreviaturas: %med - nmol/min/mg protena em relao mdia do v.r.; nmol - nmol/min/mg protena em relao ao limite inferior do v.r.; %med / CS - funo da citrato sintase (CS) em relao mdia do v.r. (unidades usadas no estudo); nmol / CS - funo da citrato sintase (CS) em relao ao limite inferior do v.r.; %md / II- funo do complexo II da CRM em relao mdia do v.r.; nmol / II - funo do complexo II da CRM em relao ao limite inferior do v.r.
Como descrito nos mtodos, o grau de concordncia moderado para valores de coeficiente de concordncia (Kappa) de 0.41 a 0.60 e total/ completa: 0.61 a 0.80.
148
Tabela 35 - Unidades de expresso da actividade do complexo IV - homogeneizado de msculo.
HOM n=145 %med nmol %med/CS nmol /CS %md/II
%med
nmol ,848
%med/CS ,710 ,669
nmol /CS ,628 ,530 ,773
%md/II ,378 ,286 ,425 ,505
nmol / II ,558 ,494 ,652 ,603 ,434
Anlise de concordncia da actividade enzimtica do complexo IV da CRM em termos de normalidade ou deficincia entre as vrias unidades de expresso da mesma em homogeneizado de msculo de 145 doentes. Abreviaturas: %med - nmol/min/mg protena em relao mdia do v.r.; nmol - nmol/min/mg protena em relao ao limite inferior do v.r.; %med / CS - funo da citrato sintase (CS) em relao mdia do v.r. (unidades usadas no estudo); nmol / CS - funo da citrato sintase (CS) em relao ao limite inferior do v.r.; %md / II- funo do complexo II da CRM em relao mdia do v.r.; nmol / II - funo do complexo II da CRM em relao ao limite inferior do v.r.
Comparou-se o diagnstico funcional de cada doente aplicando as diversas unidades de actividade enzimtica. Na figura 74 est representada a percentagem das crianas que apresentaram valores superiores ao limite inferior do v.r. ou 30% da mdia do v.r. com os diversos modos de expressar a actividade enzimtica.
40% 38% 35% 30% 34% 33%
%de casos com valores normais
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
nmol
nmol/CS
%med
%med/CS
Figura 74 - Valores normais de actividade enzimtica da CRM nas vrias unidades.

Percentagem de crianas com valores normais de actividade enzimtica em todos os complexos da CRM no conjunto dos tecidos estudados em 198 doentes, expressa nas vrias unidades consideradas. Normal: superior ao limite inferior do v.r. ou a 30% da mdia do v.r. Abreviaturas: nmol - nmol/min/mg protena em relao ao limite inferior do v.r.; nmol / CS - funo da citrato sintase (CS) em relao ao limite inferior do v.r.; %med - nmol/min/mg protena em relao mdia normal (isto , do v.r.); %med / CS - funo da citrato sintase (CS) em relao mdia do v.r. (unidades usadas no estudo).
149
Com o objectivo de avaliar a relevncia da normalizao da actividade enzimtica dos complexos da CRM para a citrato sintase, reviu-se a classificao diagnstica dos casos com dfice isolado do complexo IV, traduzindo aquela actividade sem a correco para a citrato sintase e aplicando os critrios j referidos Nos 25 casos com dfice isolado do complexo IV, quando a actividade foi traduzida nas unidades adoptadas (em percentagem da mdia do v.r. em funo da citrato sintase) 14 tinham valores entre 20 e 30% e 11, valores abaixo de 20%. Na reviso, aqueles nmeros passam a 6 e 17, respectivamente, sendo que em dois casos deixa de ser valorizado um dfice do complexo IV. Deste modo, 13 mudaram (52%) e 12 mantiveram-se no mesmo escalo de critrios laboratoriais totais. Em consequncia, 15 (60%) mantiveram o mesmo grau de certeza diagnstica, dois passaram de definido a provvel e oito de provvel a definido. Assim, dos 25 doentes com dfice do complexo IV, passaria a haver mais seis com o diagnstico de DCRM definida.
n = 198
120 108 100 94
N de casos
80 67 60
76
%med %med/CS
40
20
16
18 7 10
0 Improvvel Possvel Provvel Definido
Diagnstico final
Figura 75 - Influncia da correco para a citrato sintase no diagnstico final em 198 doentes.
A normalizao para a citrato sintase (CS) fez baixar o nmero de casos com diagnstico de DCRM definida. %mdia - percentagem da mdia do v.r.; %mdia/CS - percentagem da mdia do v.r. corrigido para a citrato sintase.
Aplicou-se
mesmo
procedimento
ao
total
dos
198
doentes
com
estudo
espectrofotomtrico da CRM e verificou-se concordncia de resultados em 138 (70%), sendo que 139 (70%) se mantiveram no mesmo escalo de critrios laboratoriais totais. Cento e cinquenta e duas crianas (78%) conservaram o mesmo grau de certeza diagnstica (figura 75, tabela 36). Em dois casos verificou-se uma discrepncia de trs nveis, tendo o diagnstico passado de improvvel a definido. A utilizao das unidades 150
em percentagem da mdia do v.r. no corrigida para a citrato sintase fez aumentar de escalo diagnstico 31 casos e baixar 15 e levou ao diagnstico de DCRM definida em 55% dos 198 casos (contra 48% nas unidades adoptadas). O somatrio dos diagnsticos de DCRM definida e provvel semelhante em ambos os casos (175 e 170) (tabela 36).
Tabela 36 - Influncia da normalizao para a citrato sintase no diagnstico final em 198 doentes.
DCRM Improvvel Possvel %mdia/CS Provvel Definido Total
% mdia Improvvel 14 1 1 0 16 Possvel 0 5 1 1 7 Provvel 2 3 51 11 Definido 2 1 23 82 Total 18 10
76 94
198
67
108
Em 78% dos casos (152 doentes) manteve-se o escalo de diagnstico. %mdia - percentagem da mdia em valor absoluto; %mdia/CS - percentagem da mdia corrigida para a citrato sintase (CS).
Quando se classificou os doentes com os critrios gerais de Nijmegen e o dfice funcional foi traduzido como inferior a 20% da mdia do v.r., inferior a 20% da mdia do v.r./ citrato sintase, inferior ao v.r. em nmol/min/mg e inferior ao v.r. em nmol/min/mg normalizado para a citrato sintase, atribuiu-se o diagnstico de DCRM definida a 17%, 17%, 16% e 15% dos casos, respectivamente. A anlise de concordncia entre os nveis de diagnstico (definido versus possvel/improvvel) e os valores da actividade enzimtica (normais versus inferiores ao normal) traduzidos nas diferentes unidades mostrou valores de Kappa prximos de zero em todos os cruzamentos.
O equilbrio entre a actividade dos complexos da CRM Com o objectivo de valorizar o equilbrio entre as actividades dos complexos da CRM seleccionou-se um subgrupo de 32 doentes com um quadro clnico muito sugestivo de DCRM, isto , com compromisso de trs ou quatro rgos/sistemas, nos quais as actividades enzimticas dos complexos I a V tinham sido normais. Neles avaliou-se a existncia de um desequilbrio da CRM atravs dos ratios entre as actividades enzimticas dos vrios complexos. Tratava-se de seis e de 26 doentes pontuados com quatro e trs pontos na vertente clnica dos critrios gerais de Nijmegen e nos quais o estudo funcional da CRM no msculo (o nico tecido estudado em todos os casos) tinha sido normal, segundo os critrios adoptados. Em seis casos havia desequilbrio na CRM. Em dois deles a actividade enzimtica dos complexos envolvidos (em nmol/min/mg de protena) era anormal (diminuda num e aumentada noutro). Nos restantes, nos quais se 151
incluem um caso de LHON e um de sndrome de Pearson, os valores da actividade enzimtica de todos os complexos eram normais (entre 30% e 156% da mdia do v.r.).
Valor diagnstico dos segmentos I+III e II+III No diagnstico dos nossos doentes no foi tida em conta a actividade dos segmentos I+III e II+III da CRM, apesar da mesma ter sido avaliada em todos. Com o objectivo de investigar a relevncia da avaliao daqueles segmentos no diagnstico das DCRM, fezse a correlao entre a actividade dos segmentos e a somatrio dos respectivos complexos e reviso do diagnstico final dos 198 doentes usando os dfices dos segmentos I+III e II+III como critrio de diagnstico adicional. Na figura 76 est resumida a correlao entre o dfice funcional dos segmentos I+III e a deficincia dos complexos I e/ou III e o dfice funcional do segmento II+III e a deficincia dos complexos II e/ou III. Na anlise de concordncia constatou-se valores de Kappa inferiores a 0,35 em todos os cruzamentos.
100% 90% 80%
% de casos
70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Mit. Msc. Hom. Msc. Hom. Fgado Mit. Msc. Hom. Msc. Hom. Fgado
Incongruentes Congruentes
I+III versus I-III
II+III versus II-III
Figura 76 - Correlao entre os segmentos I+III e II+III e os respectivos complexos enzimticos.

Correlao entre o dfice funcional dos segmentos I+III e II+III e a deficincia dos complexos I e/ou III e II e/ou III em 89 amostras de mitocndrias (Mit.) de msculo (Msc.), 145 amostras de homogeneizado (Hom.) de msculo congelado e 41 amostras de homogeneizado de fgado. O valor de Kappa foi inferior a 0,35 em todas as anlises, o que indica um grau concordncia baixo ou muito baixo.
Em 24% (5/21) e em 30% (12/40) dos casos com dfice do complexo II e do complexo III, respectivamente, constatou-se dfice do segmento II+III. Vinte e seis por cento
152
(18/48) dos doentes com actividade diminuda do complexo I e 60% (24/40) dos casos com dfice do III apresentaram diminuio da actividade do segmento I+III. Na reviso do diagnstico final usando os dfices dos referidos segmentos como critrio de diagnstico adicional, verificou-se que em cinco casos, o critrio funcional passaria de minor a major, em quatro de nenhum a minor e num caso de nenhum a major. Neste contexto, em cinco doentes haveria alterao da classe diagnstica (de provvel para definida). Os dfices simultneos dos segmentos I+III e II+III tm sido referidos como indicadores de dfice de CoQ. Em 10 crianas desta srie havia valores inferiores a 30% da mdia/ citrato sintase simultaneamente nos segmentos I+III e II+III. Todas apresentaram igualmente dfice de um ou vrios dos complexos I-V da CRM, sendo que em oito havia dfice do complexo III, isolado ou em associao.
Os complexos III e V em homogeneizado de tecido congelado Analisou-se o contributo diagnstico dos resultados do estudo da actividade enzimtica dos complexos III e V da CRM determinada em tecidos congelados na srie de doentes. A utilizao de amostras congeladas de tecidos para a avaliao da actividade daqueles complexos da CRM tem sido questionada por alguns investigadores (Rustin et al, 1994; Thorburn et al, 2004a). A actividade do complexo III da CRM foi determinada em homogeneizado de msculo, fgado e/ou miocrdio congelados em 144, 40 e 11 crianas respectivamente. Os valores eram normais em 89, 30 e seis casos respectivamente. A actividade do complexo III foi determinada em mitocndrias isoladas de msculo em 89 casos, tendo sido normal em 39. Em 43 crianas o estudo do complexo III foi feito em mitocndrias e no homogeneizado congelado da mesma amostra de msculo, apresentando resultados concordantes em 41 casos (95%). Quatro doentes apresentaram como nico critrio laboratorial major um dfice do complexo III em msculo, facto que foi decisivo para a sua incluso no grupo das DCRM definidas. Dois destes, nos quais o homogeneizado de msculo congelado foi o nico tecido estudado, passariam a ser considerados DCRM provvel num caso e possvel no outro se no tivesse sido tido em conta o estudo em amostra de tecido congelado. O complexo V da CRM foi determinado em homogeneizado de msculo, fgado e/ou miocrdio congelados em 145, 41 e 11 crianas respectivamente. A actividade do complexo V foi normal em 124, 26 e 7 doentes, respectivamente. O estudo do complexo V foi feito em mitocndrias isoladas de msculo em 86 casos, 66 dos quais tinham valores normais.
153
Nas 52 crianas em que foi feita a determinao da actividade do complexo V da CRM simultaneamente nas mitocndrias e no homogeneizado de msculo congelado, os valores foram coincidentes em 79% (41 casos). Quatro crianas apresentaram dfice major isolado do complexo V, o que foi determinante para a sua classificao como DCRM definida. Em todos os casos, o msculo foi o nico tecido estudado: em dois, o dfice verificou-se nas mitocndrias mas no no homogeneizado congelado; nos outros dois, verificou-se dfice major no homogeneizado de msculo congelado, no tendo sido avaliadas as mitocndrias. Se se tivesse optado por no valorizar o resultado da avaliao do complexo V em tecidos congelados, estes dois doentes mudariam de grupo diagnstico de definido a provvel. Neste contexto, um outro doente, com dfice minor do complexo V em homogeneizado de msculo, passaria de provvel a possvel
Anlise funcional de mitocndrias isoladas de msculo Em 89 doentes a anlise funcional da CRM incluiu mitocndrias isoladas de msculo. O estudo do msculo limitou-se s mitocndrias isoladas em 48 casos. Comparou-se em 70 doentes os resultados do consumo de oxignio em mitocndrias isoladas de msculo com a actividade espectrofotomtrica dos complexos ou segmentos da CRM correspondentes. Verificou-se valores concordantes entre os resultados da polarografia e os da espectrofotometria (actividades expressas em percentagem da mdia do v.r.) em 60%, 50% e 36% dos casos, usando como substratos o malatopiruvato, o succinato e o duroquinol, respectivamente. A anlise de concordncia foi negativa em todos os cruzamentos (Kappa 0,136; 0,027 e 0,030, respectivamente). A actividade enzimtica do complexo IV da CRM foi quantificada no homogeneizado inicial (isto , antes do isolamento das mitocndrias), nas mitocndrias isoladas e no homogeneizado de msculo congelado, em 41 amostras de msculo. Aquela actividade, em funo da citrato sintase, foi inferior a 30% da mdia do v.r. em 17 (58,5%) dos homogeneizados iniciais, 8 (20%) dos preparados de mitocndrias isoladas e 9 (22%) dos homogeneizados de tecido congelado. Em 23 (56%) amostras de msculo houve concordncia nos resultados obtidos pelos trs modos de avaliar o complexo IV: normal em 20 e deficiente em trs casos (figura 77). Em 28 (68%), 29 (71%) e 30 (73%) dos 41 casos havia conformidade em termos da existncia de dfice da CRM entre os resultados do homogeneizado inicial versus mitocndrias, do homogeneizado inicial versus homogeneizado de msculo congelado e das mitocndrias versus homogeneizado de msculo congelado, respectivamente. A anlise de concordncia foi baixa ou muito baixa (Kappa inferior a 0,36) em todos os casos.
154
n = 41
44%
56%
Concordantes
um discordante
Figura 77 - Actividade do complexo IV em trs preparaes de msculo de 41 doentes.

Actividade do complexo IV no msculo em 41 doentes: comparao entre o homogeneizado inicial, as mitocndrias isoladas e o homogeneizado de msculo congelado. Em 56% dos casos houve concordncia entre os resultados obtidos pelos trs diferentes mtodos de anlise.
A actividade enzimtica da CRM em linfcitos O estudo mitocondrial espectrofotomtrico da actividade dos complexos II, III e IV em linfcitos do sangue perifrico foi realizado em 90 doentes na primeira metade do perodo de estudo. No faz parte dos critrios de diagnstico de DCRM de Bernier, pelo que no foi analisado naquele contexto. Vinte e oito das 90 (31%) crianas, apresentaram dfice (inferior a 30% da mdia do v.r. em funo da citrato sintase) de pelo menos um dos complexos em linfcitos (figura 78): dfice do complexo IV em 16, do III em 10 e generalizado (II, III e IV) em dois doentes. Em 10 casos (11%) constatou-se dfices majores nas unidades adoptadas, todos do complexo IV. Os 90 doentes com anlise espectrofotomtrica em linfcitos fizeram igualmente estudo em amostra de msculo (figura 78). Apresentaram dfice (inferior a 30% da mdia/ citrato sintase) dos complexos II, III e/ou IV em 47casos (52%) em amostra de msculo esqueltico [em 32 das 51 preparaes mitocondriais (63%) e em 23 dos 61 homogeneizados de msculo (37%)]. Em quatro dos dez casos com dfice major do complexo IV em linfcitos, aquela actividade era normal no msculo.
155
n = 90
70 60 50
N de casos
40 Linfcitos 30 20 10 0 30% 20-30% <20% Msculo
Figura 78 - Actividade dos complexos II a IV em linfcitos e no msculo em 90 doentes.

Actividade dos complexos II a IV (percentagem da mdia do v.r. normalizada para a citrato sintase) em linfcitos e no msculo e sua relao em 90 doentes. Foi considerado o valor mais baixo em qualquer dos complexos e em qualquer das preparaes musculares.
Os complexos II, III e IV determinados em linfcitos e em msculo do mesmo doente estavam alterados no mesmo sentido (normais ou deficitrios) em ambas as preparaes em 41 dos 90 casos (46%) (23/51: 45% para as mitocndrias e 27/61: 44% para o homogeneizado. No se verificou concordncia entre as actividades dos complexos II, III e IV (isoladamente ou no seu conjunto) em linfcitos e em mitocndrias isoladas de msculo esqueltico, homogeneizado de msculo ou fgado ou no somatrio dos tecidos estudados (Kappa <0,5 em todas as comparaes). A actividade do complexo IV foi determinada em linfcitos em 22 das 41 crianas que tiveram o complexo IV avaliado em homogeneizado fresco, em homogeneizado congelado e em mitocndrias isoladas da mesma preparao de msculo, com resultados concordantes em 50%, 55% e 68% dos casos, respectivamente. Se o estudo funcional em linfcitos tivesse sido usado como critrio de diagnstico a par dos outros tecidos, teria feito variar o critrio funcional em 12 doentes. Seis manteriam o mesmo grau de diagnstico e os outros seis passariam a um grau superior, sendo que quatro seriam novos casos de DCRM definida.
156
Captulo 6 Discusso
CAPTULO 6 DISCUSSO
157
Captulo 6 Discusso
158
Captulo 6 Discusso
6.
DISCUSSO
Com o objectivo de tornar a discusso deste trabalho mais compreensvel, optou-se por abordar inicialmente os principais pontos referentes metodologia e resultados (a seleco clnico-laboratorial dos doentes e a abordagem diagnstica da mitocndria). Segue-se uma reflexo sobre o diagnstico atribudo aos 200 doentes (os critrios adoptados, as caractersticas dos doentes com DCRM definida e dos casos de DCRM secundria, bem como possveis factores de interferncia com o diagnstico final). Por fim, faz-se uma reflexo sobre a incidncia e a prevalncia das DCRM com incio na primeira dcada de vida, na Regio Centro de Portugal
6.1 Metodologia e resultados

6.1.1 Seleco clnico-laboratorial dos doentes
A amostra objecto da actual reviso o grupo das crianas investigadas no HP por suspeita de DCRM com recurso ao estudo de tecidos (msculo, fgado e/ou miocrdio), entre 1997 e 2006. Este perodo corresponde primeira dcada de implantao da investigao diagnstica das DCRM no HP. Na prtica clnica peditrica frequente atribuir-se uma possvel causa metablica, nomeadamente um dfice da CRM, a quadros clnicos complexos e/ou graves de etiologia no esclarecida. As DCRM so das doenas hereditrias do metabolismo mais frequentes (Thorburn, 2004). No entanto, a designao e o mbito do conceito de DCRM variam conforme os grupos que se dedicam a estas patologias: doenas mitocondriais, citopatias mitocondriais ou doenas da fosforilao oxidativa (Munnich et al., 1996; Smeitink et al., 2001; DiMauro e Schon, 2006). No se trata de uma entidade nosolgica, mas de um vasto grupo de doenas que tm em comum um dfice primrio da fosforilao oxidativa, sendo a sua classificao difcil (Naviaux, 2004). So patologias proteiformes, de apresentao clnica muito variada, colocando importantes questes de diagnstico diferencial com uma grande variedade de outras doenas. Podem atingir um ou mais rgos ou sistemas, de modo aparentemente aleatrio e habitualmente progressivo, sobretudo na criana (Munnich, 2006). A abordagem diagnstica das DCRM no consensual e no existe uma prova simples, de aplicao rpida e interpretao inequvoca que nos confirme ou exclua a hiptese. Uma amostra de sangue perifrico pode permitir em alguns casos, perante um quadro clnico tpico, sindromtico, ou no enquadramento de doena familiar j conhecida, detectar uma mutao do mtDNA ou do nDNA e estabelecer o diagnstico. No entanto, esta situao, relativamente frequente no adulto, rara na criana. Nesta, o diagnstico 159
Captulo 6 Discusso
passa pelo estudo em bipsia de tecidos na maior parte dos casos (Rustin et al., 1994; Thorburn et al., 2004a; Janssen et al., 2006a). A realizao de uma bipsia tecidual, nomeadamente do msculo esqueltico, habitualmente decidida aps muita
ponderao e na posse de fortes argumentos clnico-laboratoriais, uma vez que, na criana, um acto cirrgico com anestesia geral. A seleco dos doentes com investigao da CRM em tecidos extra-sanguneos excluiu desta anlise muitos outros casos, porventura mais numerosos, em que o estudo se limitou, no perodo do estudo, ao sangue perifrico. No surpreende pois que o grupo seleccionado apresente manifestaes clnicas graves e que se tenha obtido uma elevada taxa de confirmao diagnstica. Realizou-se a investigao de 20 doentes por ano em mdia. Em 2002 assistiu-se a um pico de 35 casos, 10 dos quais foram crianas autistas includas num estudo epidemiolgico (Oliveira et al., 2005). de prever que o nmero de doentes estudados por ano se mantenha ou reduza apenas ligeiramente. Os casos mais antigos, acumulados por falta de capacidade diagnstica, foram j investigados, ocasionalmente em situao de agravamento com desfecho fatal. No entanto, a actual disponibilidade de ferramentas laboratoriais para o diagnstico e o maior alerta para as DCRM tendero a manter aquele nmero, embora custa de um aumento dos casos sem diagnstico, tal como se demonstrou na nossa srie. O nmero de doentes com outros diagnsticos, embora muito varivel ao longo do perodo de estudo, mostrou tendncia a manter-se. Apesar de o ano de 2006 ter sido o segundo em nmero de casos com outros diagnsticos, admitese que o alargamento do rastreio neonatal a um grupo maior de doenas hereditrias do metabolismo a partir de 2005 venha a fazer baixar o nmero de crianas com erros inatos do metabolismo que colocam problemas de diagnstico diferencial com DCRM. No mesmo sentido, vai a melhoria da capacidade de diagnstico e tratamento de infeces graves antes de ser colocada a hiptese de DCRM.
Apesar de no se dispor de dados relativos ao nosso Pas, a taxa de consanguinidade em primeiro grau das famlias investigadas (1,5%) no parece ser muito elevada. O nmero de famlias com histria de mortes inesperadas em familiares prximos (tios, primos em primeiro grau e avs) elevado, atingindo quase um quarto das mesmas. De notar ainda a precocidade daquelas mortes: mais de metade ocorreu nos primeiros dois anos de vida. A proporo de antecedentes patolgicos relevantes nos progenitores (mais de um quarto) e nos familiares (mais de metade) tambm elevada. O facto de as mes e dos familiares maternos serem os que mais contriburam para esta morbilidade pode dever-se circunstncia de serem as mes as informantes habituais e, portanto, melhor conhecedoras do seu lado da histria familiar. excessivo interpret-lo como uma maior real incidncia de patologia na linha materna na suspeita de DCRM, patologias em que
160
Captulo 6 Discusso
paradigmtica, embora rara na criana, a hereditariedade materna (DiMauro e Schon, 2006). As DCRM so de um modo geral clinicamente graves na criana, levando
frequentemente deciso de no ter mais filhos. assim compreensvel que, apesar de quase metade (46%) dos doentes ser o primeiro filho do casal, cerca de um tero das crianas (31%) fossem ainda filhos nicos na altura do estudo. A incidncia de gravidez de risco por morte pr-natal anterior (6%) e/ou complicada (27%), de prematuridade (15%), de parto distcico (39%) e de asfixia perinatal (10%) elevada, o que est de acordo com a gravidade dos quadros clnicos.
As alteraes do foro NM, presentes em aproximadamente trs quartos dos nossos doentes, foram as que mais frequentemente levaram suspeita de DCRM, como habitual nestas patologias (Zeviani et al., 1996; Finsterer, 2006). O incio ENM, verificado em 24% das crianas desta srie, ocorre mais frequentemente em idade peditrica, chegando a ultrapassar 50% dos casos na experincia de alguns grupos (Munnich et al., 1996). As circunstncias da realizao de estudos mitocondriais nos nossos doentes foram diversas. Na maior parte dos casos, a bipsia foi programada e ocasionalmente includa no mesmo tempo anestsico de outro acto cirrgico. Em cerca de um quarto das crianas, a deciso de colher tecidos para estudos mitocondriais decorreu directamente do mau prognstico vital e da ausncia de um diagnstico etiolgico seguro poca. Em aproximadamente metade daqueles doentes foram realizadas colheitas de tecidos post mortem, nas primeiras trs horas aps o falecimento, como recomendado (Janssen et al., 2006a). Todas as amostras de miocrdio foram colhidas nestas circunstncias. A primeira bipsia miocrdica foi realizada no HP apenas no final de 2006 num doente no sujeito a estudo mitocondrial. De um modo geral, os resultados da investigao post mortem, incluindo os da autpsia, so demorados. Por outro lado, os estudos microbiolgicos, nomeadamente virais, s nos ltimos anos vo tendo uma resposta adequada. Este facto, associado opo de se realizar estudos mitocondriais em msculo fresco ou com tempo de congelamento muito curto, levou a que fosse feita investigao funcional da CRM que de outro modo no seria eventualmente realizada. Tal atitude ter contribudo para a constatada tendncia diminuio do nmero de diagnsticos de DCRM ao longo do perodo de estudo, embora sem traduo em maior taxa de outros diagnsticos etiolgicos. Quase todas as crianas (97%) manifestaram a doena nos primeiros cinco anos de vida, sobretudo no primeiro ano de vida (71% dos casos) e principalmente no perodo neonatal (35% dos casos). Este perfil est de acordo com o que ocorre nas doenas hereditrias do metabolismo de um modo geral, constituindo o nascimento e o 161
Captulo 6 Discusso
crescimento acelerado dos primeiros anos de vida importantes factores que fazem revelar dfices enzimticos subjacentes. O mesmo perfil temporal tem sido referido para as DCRM peditricas em particular (Saudubray et al, 2006; Rubio-Gozalbo et al., 2000a; Gibson et al., 2008). Segundo Naviaux, 20% das DCRM manifestam-se clinicamente antes dos 2 anos e 50% antes dos 5 anos de vida (Naviaux, 2004). Os dados publicados por Skladal permitem inferir que cerca de metade dos casos se apresentam antes dos 16 anos de idade (Skladal et al., 2003). A elevada percentagem (25%) de crianas com manifestaes pr-natais na nossa amostra demonstrativa da gravidade dos quadros clnicos dos doentes investigados. Nas DCRM tm sido descritos sinais e sintomas pr-natais do mesmo tipo das verificadas neste grupo de doentes, nomeadamente restrio de crescimento intra-uterino,
prematuridade e malformaes (Cormier-Daire et al., 1996; von Kleist-Retzow et al., 2003; Saada et al., 2007; Gibson et al., 2008). O envolvimento do SNC, no incio (75% dos doentes) ou durante a evoluo (92% dos casos), foi muito frequente neste grupo de crianas, como tpico das doenas hereditrias do metabolismo e em particular das DCRM. Quando h envolvimento multissistmico coloca-se mais prontamente a hiptese de DCRM. As formas limitadas a um rgo ou sistema, como o fgado, o miocrdio ou mesmo o SNC, durante uma boa parte ou toda a evoluo, tambm representadas na nossa srie, so as que levantam maior dificuldade diagnstica (Munnich, 2006). O atraso do neurodesenvolvimento, que atinge cerca de 10% da populao peditrica geral (Capute e Accardo, 1991), foi extremamente frequente e grave na nossa srie, atingindo 81% das 191 crianas que sobreviveram aps a primeira semana de doena: atraso severo ou profundo em quase metade (45%), com regresso em
aproximadamente um quinto (18%) das 191 crianas. A escala de avaliao mais usada (Schedule of Growing Skills II) um teste de rastreio que no permite uma traduo quantitativa do desenvolvimento psicomotor em termos de quociente de
desenvolvimento (QD) ou quociente de inteligncia (QI). Fez-se por isso uma adaptao da escala de atraso mental da Sociedade Americana de Psiquiatria, aplicada
retrospectivamente nesta amostra (American Psychiatric Association, 2002). Sendo a epilepsia, a par do atraso do neurodesenvolvimento, uma das manifestaes mais comuns de leso neurolgica na criana, no de estranhar que mais de um tero dos nossos doentes (70 casos) tenha apresentado epilepsia, na maior parte dos casos associada a atraso e/ou regresso do neurodesenvolvimento. Optou-se pela classificao da Liga Internacional Contra a Epilepsia (ILAE) de 1989, por ser de mais fcil aplicao retrospectiva (Liga Portuguesa Contra a Epilepsia, 1996). O carcter evolutivo da epilepsia em muitos dos doentes tornou particularmente difcil a sua catalogao. As DCRM tm sido referidas como estando associadas a epilepsia, sem que haja no entanto um tipo de epilepsia caracterstico (Khurana et al., 2008; Lee et al., 2008). A 162
Captulo 6 Discusso
sndrome de Alpers, que junta epilepsia refractria, degenerao cerebral difusa e cirrose heptica, actualmente considerada uma DCRM, frequentemente causada por mutaes no gene POLG1 (Naviaux e Nguyen, 2004; Davidzon et al., 2005; Gordon, 2006). Na nossa srie, apesar de oito doentes associarem epilepsia e citlise (seis) ou insuficincia de sntese heptica (dois), nenhum apresentou um quadro clnico sugestivo de sndrome de Alpers, pelo que no foi na altura quantificado o mtDNA, nem investigado o gene POLG1. Estes casos esto a ser reavaliados, uma vez que o envolvimento heptico na sndrome de Alpers poder surgir apenas no decurso da evoluo e por outro lado o espectro clnico associado a mutaes do gene POLG1 muito variado, incluindo encefalopatia inespecfica com ou sem envolvimento multissistmico (Horvath et al., 2006; Kollberg et al., 2006). As DCRM constituem uma possvel causa de sndrome de West (Shah et al., 2002; Blanco-Barca et al., 2004). Esta foi diagnosticada em sete crianas da nossa srie, trs das quais com DCRM definida primria (Silva et al., 2008). A associao de atraso e/ou regresso do neurodesenvolvimento epilepsia, que configurou em diversos casos o quadro de encefalopatia epilptica, traduz a gravidade do atingimento neurolgico neste grupo. As alteraes do movimento, identificadas num quinto (40) das nossas crianas e que tm sido descritas nas DCRM, so das manifestaes que colocam maiores problemas de diagnstico diferencial (Garcia-Cazorla et al., 2008). De acordo com a histria natural das DCRM, a suspeita diagnstica reforada quando durante a evoluo vo sendo envolvidos outros rgos (Munnich, 2006), o que aconteceu em quase um quarto dos nossos doentes. A gravidade dos quadros clnicos das crianas deste estudo ficou bem espelhada na elevada mortalidade (27%) e no agravamento clnico de um nmero significativo (13%) de casos.
A importncia dos sinais e sintomas apresentados levou a uma extensa investigao com vista adequada caracterizao clnico-laboratorial e ao diagnstico diferencial. Embora no tenha havido propriamente um protocolo de investigao, o rastreio de envolvimento multiorgnico foi feito na generalidade dos doentes. Aquele rastreio e a investigao de outras etiologias, ditadas pelas exigncias do diagnstico diferencial em cada caso, foram realizados de um modo faseado. O primeiro seguiu as recomendaes de Munnich (Munnich et al., 2001). O segundo foi talhado individualmente. Os diagnsticos diferenciais rastreados foram muito variados e compreenderam
cromossomopatias, alterao da funo tirodeia, infeces, aminoacidopatias, acidrias orgncias, dfices do ciclo da ureia, doenas lisossmicas, doenas dos peroxissomas, doenas da glicosilao das protenas e defeitos da sntese ou transporte da creatina, entre outros. 163
Captulo 6 Discusso
A avaliao do possvel envolvimento multissistmico e a excluso de outras doenas generalizadas, nomeadamente cromossomopatias e dfices da glicosilao das protenas fez-se antes da bipsia programada na maior parte dos casos. No entanto, em trs dos nossos doentes, o diagnstico de cromossomopatia foi confirmado s aps o estudo mitocondrial, pela repetio do estudo do caritipo aps um perodo de vrios anos, graas evoluo das tcnicas de citogentica. Curiosamente numa dessas crianas havia critrios de DCRM definida. O rastreio das doenas da glicosilao atravs da determinao da transferrina deficiente em carbohidratos, que s esteve disponvel na segunda metade do perodo de estudo, deve ser realizado para diagnstico diferencial na generalidade dos casos. A deficiente glicosilao proteica pode estar na origem de dfices secundrios da CRM (Briones et al., 2001), tal como se verificou nas duas crianas da nossa srie com aquele diagnstico, que cumpriam critrios de DCRM definida. A deciso de submeter um doente a uma anestesia para bipsia diagnstica complexa, j que o risco anestsico pode ser acrescido nestes casos. No entanto possvel faz-la com segurana mesmo em crianas com acidose lctica (Driessen et al., 2007). Nos nossos doentes e sempre que possvel, foi aproveitado o tempo anestsico de outras cirurgias necessrias ao doente para a realizao simultnea da bipsia muscular. O grupo de Nijmegen estabeleceu um ndice de probabilidade (baseado em vrios parmetros, como a idade, a lactacidmia, a relao lactato/piruvato e a alaninmia, entre outros) da positividade da bipsia para orientar a sua indicao (Rubio-Gozalbo et al., 2000b). Mais recentemente, o mesmo grupo apresentou o somatrio dos critrios clnicos e metablicos/imagiolgicos da vertente dos critrios gerais da sua escala de diagnstico de DCRM como orientador da indicao da bipsia para estudos mitocondriais em crianas. (Morava et al, 2006b). O desfecho fatal de uma proporo significativa de casos na nossa srie (26,5%) levou realizao de colheitas post mortem, sempre que possvel, mesmo em alguns doentes previamente investigados.
6.1.2
Abordagem laboratorial da mitocndria
As mitocndrias so organelos muito heterogneos que mudam de forma e de localizao dentro da clula de acordo com a sua actividade funcional (Kunz, 2003; Tieu e Przedborski, 2006). A CRM tem algumas particularidades que tornam singularmente difcil o estudo diagnstico das DCRM: uma dupla regulao gentica (de que decorrem a heteroplasmia, o efeito limiar e a variabilidade tecidual) e uma elevada actividade enzimtica residual (Thorburn e Smeitink, 2001). Dada a complexidade da etapa final comum da produo de energia, no existe uma abordagem laboratorial nica para estudar a CRM. Os mtodos existentes so de um modo geral complexos, com protocolos diversos e resultados de interpretao difcil, 164
Captulo 6 Discusso
frequentemente do mbito da investigao bsica e/ou clnica. O leque da investigao laboratorial muito amplo, indo de estudos histolgicos at anlises de gentica molecular e passando por estudos bioqumicos muito variados, com destaque para a enzimologia, de uso generalizado (Coenen et al., 1999; Hanson et al., 2002; Setterfield et al. 2002; Cossarizza, 2003; McKenzie et al., 2007). Subdividiu-se o estudo mitocondrial dos nossos doentes em avaliao global, indirecta, da funo mitocondrial e anlise especfica da actividade da CRM. Os resultados de ambos podem estar alterados por um dfice primrio da CRM ou secundariamente por outras patologias (Chrtien e Rustin, 2003; Thorburn et al., 2004a). A avaliao funcional foi complementada pelo rastreio das mutaes e deleces mais frequentes do mtDNA em todos os doentes e do nDNA em casos seleccionados. Com o estudo destes doentes contribuiu-se para que os mtodos de abordagem da funo da CRM com fins diagnsticos fossem implementados e desenvolvidos no Laboratrio de Bioqumica Gentica do CNC.
A hiperlactacidmia, critrio laboratorial minor de DCRM, foi demonstrada em cerca de trs quartos dos nossos doentes. no entanto bem conhecido que uma lactacidmia normal, mesmo quando no explicada por perda tubular proximal renal de lactato, no exclui uma DCRM (Poggi-Travert et al., 1996; Niaudet, 1998). A valorizao da hiperlactacidmia como indicador de DCRM problemtica, j que o diagnstico diferencial vasto e a sua determinao est sujeita a vrias fontes de erro, nomeadamente as decorrentes das condies de colheita e transporte de amostras (Chariot et al., 1994). No final dos anos 90 estabeleceram-se os v.r. do lactato, piruvato e corpos cetnicos no plasma em crianas, nas condies de colheita, transporte e processamento das amostras no HP (Diogo et al., 1999). O cido lctico, subproduto da gliclise anaerbia, acumula-se em variadssimas condies, nomeadamente hipoxia tecidual de qualquer origem, DCRM e outros estados mrbidos que alterem a homeostase mitocondrial, como acontece em alguns erros inatos do metabolismo e muitas outras doenas genticas ou adquiridas (Poggi-Travert et al., 1996; Duke, 1999; Kang et al., 2001; Saraiva et al., 2003; Thorburn et al., 2004a; Saudubray et al., 2006). As doenas hereditrias do metabolismo, nomeadamente as DCRM, no so, de facto, a causa mais frequente de hiperlactacidmia, tal como documentou Zeviani numa srie de 125 crianas com hiperlactacidmia, em que apenas 60 tiveram o diagnstico de doena hereditria do metabolismo, 42 das quais, o de DCRM (Zeviani et al., 1996). A disfuno da CRM leva acumulao de lactato e de corpos cetnicos e ao aumento dos quocientes lactato/ piruvato e -hidroxibutirato/ acetoacetato. A elevao destes ratios traduz a alterao do estado redox pela acumulao de coenzimas reduzidos (NADH e FADH2), ao nvel citoslico (lactato/ piruvato) e mitocondrial (-hidroxibutirato/ 165
Captulo 6 Discusso
acetoacetato).
O normal
aumento da
lactacidmia
ps-prandial
nestes
casos
exacerbado, podendo assistir-se a uma elevao paradoxal da cetonmia no perodo psabsortivo, quando mais NAD+ requerido para a catabolizao adequada dos substratos glicolticos. O quociente lactato/ piruvato era superior a 20 em 82% das 89 crianas com hiperlactacidmia nas quais foi determinado o piruvato no plasma. A elevao da relao lactato/ piruvato apontaria para uma deficincia da CRM, distinguindo-a dos defeitos da piruvato-desidrogenase, sendo que o poder discriminativo daquele quociente maior para valores de lactato mais elevados (Debray et al., 2007a). No entanto, no h unanimidade em relao ao limite inferior do normal para aquele quociente, variando entre 18 e 25 conforme os laboratrios (Poggi-Travert et al., 1996; Smeitink et al., 2003). No nico caso de dfice da piruvato-desidrogenase desta srie documentou-se acidose lctica, com relao lactato/piruvato entre 20 e 25, tanto no plasma como no lquor. No que se refere a valores da lactacidmia, no se demonstrou na nossa srie diferena estatisticamente significativa entre os grupos de DCRM definida primria e secundria. Do ponto de vista fisiopatolgico, a hipoxia semelhante a um dfice terminal da CRM. A intensidade da hiperlactacidmia e o ratio lactato/piruvato no so discriminativos quanto ao carcter primrio ou secundrio do dfice. Segundo Poggi-Travert (PoggiTravert et al., 1996), a presena de cetose contribuiria para o diagnstico diferencial entre doenas hereditrias do metabolismo energtico e a hiperlactacidmia por hipoxia tecidual, onde a cetose est habitualmente ausente. Na nossa amostra no foi possvel analisar a relao estatstica entre os nveis de corpos cetnicos nos dois grupos de crianas (com DCRM primria e secundria), uma vez que no subgrupo dos secundrios a cetonmia foi determinada em apenas um dos 17 casos. Tendo em conta a valorizao diagnstica da persistncia da hiperlactacidmia, subdividiu-se a nossa amostra em cinco grupos para anlise (lactato normal em menos de trs determinaes, normal em trs ou mais, elevado em menos de trs, elevado em trs ou mais ocasies e acidose lctica). A persistncia de valores elevados de lactato no plasma em vrias determinaes (verificada em cerca de metade dos doentes) e a associao da hiperlactacidmia com elevao da alanina e/ou prolina (em 40 de 134 doentes com hiperlactacidmia) tm sido considerados indicadores de disfuno da CRM (Bernier et al., 2002; Wolf e Smeitink, 2002). A presena de alaninmia normal diferenciaria mesmo a acidose lctica neonatal transitria de uma doena hereditria do metabolismo energtico (Morava et al., 2006a). A associao entre hiperlactacidmia e hiperprolinmia dever-se-ia inibio pelo lactato da sntese de citrulina e arginina a partir da prolina, demonstrada em entercitos de porco (Dillon et al., 1999). A lactacidmia varia com as refeies e o seu tipo, com a sobregarga de glicose e com o exerccio fsico (Chi et al., 1992; Poggi-Travert et al., 1996; Argov, 1998). Nos doentes da nossa srie, as colheitas foram frequentemente aleatrias em relao s refeies. 166
Captulo 6 Discusso
Num estudo prospectivo do grupo de Nijmegen, a hiperlactacidmia em jejum e aps teste de tolerncia glicose oral (mas no em ps-prandial) foi discriminativa em relao existncia de dfice da funo oxidativa em bipsia de msculo (Rubio-Gozalbo et al., 2000b). Segundo os autores, a falta de padronizao do intervalo de tempo at colheita ou do teor e/ou tipo de hidratos de carbono da refeio poderia justificar aquele resultado. Em 93 dos nossos doentes o lactato do plasma e do lquor foram determinados simultaneamente, mostrando valores normais ou elevados em ambos os fluidos biolgicos em 20 e 24 casos respectivamente. O lactato do lquido cefalorraqudeo tem origem predominantemente na gliclise das clulas cerebrais, sendo que nestas a sua eliminao mais lenta do que no sangue (Duke, 1999; Stacpoole et al., 1999). Vrios autores (Boddaert et al., 2008; Rocha et al., 2008) recomendam que em doentes com envolvimento neurolgico e lactacidmia normal se determine o lactato do lquor e/ou pesquise a existncia de picos de lactato na
1
H RMS cerebral. Em dois dos nossos
doentes havia hiperlactatorraquia com lactacidmia normal, o que refora aquela recomendao. Inversamente, no haveria vantagem em dosear a lactatoraquia nos doentes com acidose lctica, no pressuposto de que estaria passivamente elevada (Poggi-Travert et al., 1996). De facto, a lactatorraquia era normal em apenas um de seis doentes com acidose lctica da nossa srie em quem foi determinada. O fgado o principal responsvel pela remoo do lactato e alanina circulantes atravs da neoglicognese (Duke, 1999). Colocou-se por isso a hiptese de nos nossos doentes com insuficincia heptica haver maior frequncia de hiperlactacidmia e de
hiperalaninmia, o que no se verificou. A quase totalidade dos nossos doentes com hiperalaninmia ou hiperprolinmia tinha hiperlactacidmia, atestando uma boa correlao entre aqueles parmetros, como seria expectvel. Verificou-se igualmente concordncia entre os picos de lactato na
espectroscopia e elevao do lactato ou da alanina plasmticos. A ausncia de correlao com a prolinmia pode dever-se escassez do nmero de casos com hiperprolinmia submetidos a espectroscopia (trs). A bem estabelecida dependncia da cetonmia com o jejum e a no padronizao do horrio das colheitas nas crianas desta amostra levou a que se analisasse o ratio entre a cetonmia e a concentrao plasmtica de cidos gordos livres determinados
simultaneamente. A acumulao de coenzimas reduzidas (NADH e FADH2) devida ao bloqueio da CRM leva inibio dos processos energticos que dependem da sua reoxidao. Pode por isso haver aumento da cetognese com predomnio do hidroxibutirato, por falta de escoamento heptico da acetil-CoA, pelo menos numa primeira fase. A acumulao das coenzimas reduzidas leva por sua vez frenao dos processos produtores de acetil-coA (nomeadamente a oxidao do piruvato e a oxidao dos cidos gordos) e do ciclo de Krebs (Stryer, 1995). A esperada acumulao 167
Captulo 6 Discusso
de corpos cetnicos associada s DCRM com compromisso heptico no foi demonstrada nos nossos doentes, talvez por aquela frenao ser significativa em doentes crnicos. A cetonmia relativa e o quociente -hidroxibutirato/ acetoacetato no se correlacionaram com os dfices enzimticos da CRM, individualmente ou no seu conjunto, ao contrrio do esperado. Na mesma linha, a cetonmia paradoxal seria um marcador importante das DCRM, j que o bloqueio se torna mais evidente aps as refeies. No foi no entanto demonstrada relao entre a elevao ps-prandial da cetonmia e os dfices enzimticos da CRM nos doentes estudados. Avaliou-se ainda a possibilidade de a presena de cetose constituir um critrio de diagnstico de DCRM. Contudo, no foram detectadas diferenas com significado estatstico entre os grupos diagnsticos no que diz respeito cetonmia relativa, relao -hidroxibutirato/ acetoacetato ou presena de cetonmia paradoxal. Nas DCRM podem ocorrer bloqueios secundrios do ciclo de Krebs e da -oxidao dos cidos gordos, com consequente acidria orgnica (intermedirios do ciclo de Krebs e cidos dicarboxlicos, respectivamente). Neste contexto, outra fonte possvel de cidos orgnicos o esqueleto carbonado dos aminocidos, cujo catabolismo mitocondrial pode ser afectado (Ueno et al., 2001;Yano et al., 2003). A cromatografia dos cidos orgnicos urinrios, realizada em pelo menos uma ocasio na maioria das crianas deste estudo, pode por um lado contribuir para o diagnstico diferencial e por outro mostrar alteraes devidas disfuno da CRM. Para alguns investigadores, a presena de acidria orgnica constitui critrio de diagnstico de DCRM (Hagenfeldt, 1998; Wolf e Smeitink, 2002). Assim, ao contrrio do grupo de Bernier, que no usa os cidos orgnicos como critrio de diagnstico, o grupo de Nijmegen atribui dois pontos na sua classificao diagnstica excreo urinria de lactato ou de intermedirios do ciclo de Krebs e um ponto dos cidos etilmalnico, 3-metilglutacnico (metabolito do catabolismo mitocondrial da leucina) ou dicarboxlicos (Bernier et al., 2002; Wolf e Smeitink, 2002). Algumas variantes da acidria 3-metilglutacnica tm sido associadas a DCRM, nomeadamente na associao MEGDEL e na sndrome de Barth e outras DCRM de origem nuclear (Barth et al., 2004; Wortmann et al., 2006). O cido etilmalnico (que se acumula no MADD e na deficincia da acil-CoA desidrogenase de cadeia curta) pode estar secundariamente elevado nas DCRM e inibe por sua vez a CRM (Garcia-Silva et al., 1994; Barschak et al., 2006). Na nossa amostra, a alterao mais frequente dos cidos orgnicos urinrios foi a excreo aumentada de lactato e/ou de intermedirios do ciclo de Krebs e a acidria dicarboxlica. Em nenhuma das crianas da nossa srie (inclusive entre os rapazes com miocardiopatia) se demonstrou acidria 3-metilglutacnica. impossvel estabelecer em que medida a disfuno da CRM afecta os outros processos intramitocondriais e a prpria CRM por eles afectada, dificultando a interpretao dos estudos bioqumicos, em particular dos menos especficos.
168
Captulo 6 Discusso
O msculo foi o tecido investigado em mais de 95% das crianas da nossa srie. Seguindo a escola francesa, optou-se pelo msculo deltide e em alguns casos de colheitas post mortem, o msculo da parede abdominal (Touati et al., 2006). Alguns investigadores usam o quadricpete, nomeadamente o segmento vasto externo (Taylor et al., 2004; Janssen et al., 2006a). O msculo estriado e o tecido enceflico so tecidos ps-mitticos, isto , com potencial de replicao muito reduzido e altamente dependentes de mitocndrias intactas e funcionantes. Nestes tecidos, os dfices funcionais da CRM devidos a alteraes do mtDNA e/ou do nDNA vo-se agravando ao longo do tempo, sendo a mais facilmente identificados. Por esse motivo, assim como pela sua acessibilidade, o msculo esqueltico tem sido o tecido de eleio para o estudo da CRM, tanto no adulto como na criana (Rustin et al., 1994; Taylor et al., 2004; Thorburn et al., 2004b; Janssen et al., 2006a). Em muitos casos justifica-se a avaliao de outros tecidos, como o fgado ou o miocrdio (este tambm ps-mittico, mas de difcil acesso), mormente se clinicamente afectados. A investigao de amostras de rgos afectados fundamental para uma avaliao diagnstica correcta, dada a possibilidade de ocorrncia de dfices especficos de tecidos (Rustin et al., 1993). O recurso ao estudo do fgado e outros tecidos como os fibroblastos recomendado nos casos de forte suspeita clnica (mesmo com clnica de predomnio neurolgico), em que a investigao do msculo esqueltico tenha sido negativa (Edery et al. 1994; Panetta et al., 2005; Oglesbee et al., 2006). A anlise do fgado foi realizada em mais de um quinto dos doentes desta amostra, sendo que em sete crianas que apresentaram clnica predominantemente heptica foi o nico tecido investigado. As alteraes graves da coagulao no contexto de insuficincia heptica dificultam a realizao da bipsia, tal como se constatou na nossa experincia. Fez-se a investigao funcional mitocondrial em linfcitos em quase metade dos doentes (90), principalmente na primeira metade do perodo do estudo. A pesquisa em linfcitos tem a vantagem da fcil acessibilidade e possibilidade de repetio da colheita. O carcter proliferativo do sangue e a heteroplasmia caracterstica das alteraes do mtDNA levariam a que os dfices eventualmente detectados em outros tecidos pudessem no se traduzir nos linfcitos, o que constitui uma importante limitao ao seu uso diagnstico nas DCRM (Thorburn et al., 2004a; Van den Heuvel et al., 2004). Este no consensual, sendo opo para alguns investigadores (Rustin et al., 1994; De Wit et al., 2007), mas no para outros (Bernier et al., 2002; Wolf e Smeitink, 2002). Pode recorrerse cultura de linfcitos, tal como dos fibroblastos da pele. Estes partilham muitas das limitaes dos linfcitos como ferramenta de diagnstico das DCRM (Van den Heuvel et al., 2004; Solaini et al., 2008). Dada a especificidade do estudo em linfcitos, o predomnio de alteraes do nDNA na criana e a evoluo dos estudos de gentica molecular, pode vir a ser possvel limitar a investigao ao sangue perifrico em muitos dos doentes peditricos. 169
Captulo 6 Discusso
A avaliao da produo global de energia a partir de substratos especficos como o piruvato, o malato, o succinato ou os cidos gordos, entre outros, implica o uso de tecidos frescos, nomeadamente mitocndrias isoladas ou homogeneizados de tecidos ou clulas. O tecido deve ser transportado para o laboratrio num meio tampo prprio, a 4C, em menos de trs horas (Janssen et al., 2006a). Neste contexto, a avaliao da sntese de ATP em linfcitos poderia constituir um teste de rastreio das DCRM (Marriage et al., 2003). A avaliao do consumo de oxignio com o elctrodo de Clarke permite estimar o funcionamento global da CRM (Rustin et al., 1994; Sperl et al., 1997; Merlo-Pich et al., 2004). Apesar da necessidade de tecidos frescos e de condies tcnicas difceis de estandardizar, muitos investigadores usam-na como instrumento diagnstico, a par de outros (Rustin et al., 1994; Land et al., 2004). No estudo dos nossos doentes foi usada a polarografia em linfcitos e em mitocndrias isoladas de msculo. Devido aos constrangimentos acima referidos e ao facto de no se dispor de condies tcnicas de obteno de toda a informao possvel da avaliao polarogrfica, abandonou-se a sua realizao sistemtica para diagnstico na segunda metade do perodo do estudo. A vantagem da avaliao global de produo de energia mitocondrial permitir a deteco de transtornos no atribuveis directamente CRM, como dfice de substratos, de transportadores de caties ou de adenilatos e dfices da piruvato-desidrogenase, do ciclo de Krebs ou da -oxidao dos cidos gordos, condies que colocam questes de diagnstico diferencial (Rustin et al., 1994). O grupo de Nijmegen concluiu que em quase um tero dos casos com suspeita de DCRM nos quais se comprovou uma deficincia da produo de energia no foi possvel identificar dfice na actividade especfica de qualquer complexo da CRM ou da piruvato-desidrogenase (Wolf e Smeitink, 2002; Janssen et al., 2006a).
Os doseamentos da CoQ e do citocromo c, molculas envolvidas no transporte de electres entre os complexos da CRM, e o da cardiolipina, um fosfolpido da membrana interna da mitocndria importante na sua funcionalidade, no foram efectuados em nenhum dos doentes em discusso. Numa menina com atraso do neurodesenvolvimento, epilepsia e sndrome nefrtica, que evoluiu com insuficincia renal crnica e
miocardiopatia hipertrfica, est em curso o estudo da CoQ em fibroblastos. Nenhum dos sete doentes do sexo masculino com miocardiopatia, trs dos quais entretanto falecidos, cursou com neutropenia ou acidria 3-metilglutacnica, pelo que no foram na altura investigados para sndrome de Barth. Esta opo est a ser revista, uma vez nem sempre os doentes com sndrome de Barth apresentam quadros clnicos completos ou tpicos (Spencer et al., 2006; Yen et al., 2008). 170
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A quantificao da actividade enzimtica dos complexos da CRM nos tecidos dos nossos doentes fez-se por espectrofotometria de duplo comprimento de onda, o que permitiu utilizar amostras de reduzidas dimenses, da ordem dos 20mg no caso do fgado e dos 100-200 mg no do msculo, mesmo quando se isolou mitocndrias (Rustin et al., 1994). Foi assim possvel utilizar uma quantidade muito reduzida de tecido, o que particularmente relevante no caso de recm-nascidos e crianas pequenas. O volume de tecido disponvel para anlise pode, no entanto, ser um factor decisivo na fiabilidade dos resultados obtidos (Land et al., 2004). Os dfices da CRM mais frequentemente encontrados nas crianas da nossa srie envolveram os complexos IV (em 89 casos) e I (em 68 casos). Estes resultados so concordantes com a experincia de outros grupos que relatam os complexos I e IV (por esta ordem) como os mais frequentes na criana (Smeitink et al., 2001a; Scaglia et al., 2004;Bohm et al., 2006). O dfice do complexo IV (e no o do complexo I) o predominante no nosso grupo de doentes, afectando 70% dos casos com DCRM definida primria, tal como se verificou no noroeste de Espanha (Castro-Gago et al., 2006). A especificidade gentica do nosso grupo de doentes, eventualmente mais prxima da da populao galega, podem estar na origem desta discrepncia. Os complexos enzimticos da CRM tm particularidades que tornam a sua avaliao laboratorial especialmente difcil. Trata-se de protenas de membrana, organizadas em complexos multienzimticos, dependentes para o seu funcionamento de sntese, transporte e assembling adequados dos diferentes componentes. Por sua vez formam supercomplexos funcionalmente dependentes do meio, nomeadamente em termos de disponibilidade de cardiolipina, CoQ e citocromo c (Schgger e Pfeiffer, 2000). Como j referido, e ao contrrio das outras doenas hereditrias do metabolismo (incluindo as causadas por dfice de outras enzimas mitocondriais como a acidmia metilmalnica) que cursam com nveis de actividade enzimtica prximos do zero, as DCRM evoluem frequentemente com uma elevada actividade residual dos complexos da CRM. Esta pode mesmo ser normal nos tecidos acessveis ao estudo (Mirabella et al., 2000; Thorburn e Smeitink, 2001; Chrtien e Rustin, 2003; Thorburn et al., 2004a). A criana com LHON e alteraes neurolgicas disso um exemplo: o estudo
espectrofotomtrico da CRM em msculo, realizado em duas ocasies ao longo da evoluo, foi normal (Grazina et al., 2007). A distribuio de valores normais da actividade enzimtica da CRM no gaussiana, no sendo possvel estabelecer para as enzimas da CRM uma clara distino entre valores normais e anormais: observa-se um contnuo, bem como uma enorme disperso de valores (Bernier et al 2002; Chrtien e Rustin, 2003; Grazina, 2004; Thorburn et al., 2004b). Para ultrapassar esta dificuldade, alguns investigadores usam, no os valores absolutos da actividade enzimtica, mas os seus ratios, conseguindo uma diminuio da 171
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sua disperso e a distino entre normal e deficitrio (Chrtien et al. 1998). Tm sido publicados vrios mtodos de ajustamento dos resultados da actividade enzimtica da CRM, como a normalizao para a citrato sintase (de que no se conhecem dfices) ou para o complexo II (cujos dfices so muito raros) (Rustin e Rotig, 2002; Grazina 2004; Thorburn et al., 2004b). Uma questo relevante na avaliao da actividade enzimtica da CRM prende-se com o teor em mitocndrias do tecido estudado. O nmero e a funcionalidade das mitocndrias so influenciados pelo meio intra e extracelular, de acordo com a clula e rgo em causa (Thorburn et al., 2004a). O exerccio fsico e a variao da massa muscular com ele relacionada influenciam a sua riqueza em mitocndrias. Por outro lado, assiste-se a variaes patolgicas no nmero, forma e dimenses das mitocndrias associadas ao dfice da CRM, o que se traduz eventualmente na proliferao e acumulao de mitocndrias anormais, que so o substrato patognico das RRF (DiMauro e Morais, 1993). Esta questo torna-se ainda mais pertinente quando se faz o isolamento das mitocndrias, j que h normalmente perda associada ao procedimento: a actividade do complexo IV nas mitocndrias isoladas de cerca de 30-40% a do homogeneizado inicial (Rustin et al., 1994). A correco das actividades dos complexos para uma enzima marcadora como a citrato sintase, o complexo II ou o IV, usada em muitos laboratrios, tem como objectivo eliminar a possvel influncia de alteraes alheias CRM propriamente dita, mormente a variao do nmero e qualidade das mitocndrias da preparao (Janssen et al., 2006a; Wiedemann et al., 2000; Thorburn et al., 2004a). A citrato sintase em particular seria um bom ndice do teor de mitocndrias na preparao (DiMauro e Morais, 1993). A obteno de controlos normais decisiva, sobretudo quando se trata de validar a actividade enzimtica em msculo, que pode ser influenciada por factores como a idade, sexo, actividade fsica e estado de nutrio entre outros. A variabilidade da actividade da CRM com a idade e a necessidade de usar controlos normais para cada faixa etria tem sido objecto de controvrsia. O grupo de Melbourne demonstrou haver modificao da actividade da CRM no msculo em funo da idade, sendo aquela actividade menor nas idades extremas: nas primeiras semanas de vida, pela influncia da transio do meio relativamente anaerbio do feto para o meio extra-uterino, aerbio e no idoso, mais pela falta de uso do que pela acumulao de mutaes do mtDNA associadas idade (Kunz, 2003; Brierley et al., 1996). J no fgado e no miocrdio no haveria esta variao com a idade (Thorburn et al., 2004a). Foi demonstrada a duplicao da actividade dos segmentos I+III e II+III ao longo dos primeiros trs anos de vida, mas no da citrato sintase nem dos complexos II e IV (Majander et al., 1995). Outros investigadores no encontraram variao da actividade enzimtica da CRM com a idade, quer aquela fosse traduzida em valor absoluto (nmol/min/mg protena), quer como ratio entre os complexos da CRM (Chretien et al., 1998). 172
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A eventual variao dos valores normais com o grupo muscular estudado um outro factor a equacionar. Cada laboratrio elegeu e estabeleceu valores normais para um determinado tipo de msculo, como o deltide ou o vasto externo (Rustin et al., 1994; Janssen et al., 2000a). O recrutamento de controlos normais frequentemente feito entre pacientes submetidos a cirurgias ortopdicas de fracturas ou remoo de material de osteossntese. Talvez por isso muitos grupos tenham optado pelo vasto externo, uma vez que as cirurgias dos membros inferiores so mais frequentes. Alternativamente, a utilizao como v.r. dos dados obtidos em doentes cuja evoluo veio a demonstrar que a hiptese de DCRM era pouco consistente poder ser uma opo. Esta merece muitas reservas, atendendo possibilidade de alteraes da CRM secundrias a outras doenas (Chrtien e Rustin, 2003; Thorburn et al., 2004a). A crescente descrio de alteraes enzimticas secundrias da CRM associadas a dfices primrios de outras enzimas mitocondriais, incluindo as da prpria CRM, torna ainda mais intrincada a valorizao clnica dos resultados da actividade enzimtica da CRM (van den Heuvel et al., 2004). conhecido que no h uma relao directa entre os dados obtidos de estudos funcionais globais, como o consumo de oxignio e a sntese de ATP e a actividade enzimtica da CRM (Wolf e Smeitink, 2002). Quando nos nossos doentes se correlaciou os resultados da anlise polarogrfica e espectrofotomtrica que partida avaliariam segmentos correspondentes da CRM, verificou-se ausncia de concordncia nos casos em que foi possvel analis-la estatisticamente [oxidao do duroquinol versus actividade do complexo III em linfcitos e oxidao do malato-piruvato, succinato e duroquinol versus complexos I, II e III, respectivamente, em mitocndrias (valores expressos em percentagem da mdia do v.r.)]. Esta aparente discordncia que tem sido referida por outros prende-se com a possvel interferncia das ROS na polarografia e a diferente sensibilidade dos mtodos, polarogrfico e espectrofotomtrico (Land et al., 2004). Rustin (comunicao pessoal, 1994) demonstrou que possvel um consumo de oxignio normal com dfice da actividade do complexo IV at 50%.
diverso o modo como os diferentes autores traduzem os resultados da actividade enzimtica dos complexos da CRM: por mg de protena ou g de tecido, em funo do limite inferior do v.r. ou da mdia do v.r., com ou sem normalizao para uma enzima marcadora, como a citrato sintase, o complexo II ou mesmo o IV (Zheng et al. 1990; Rustin et al. 1994; Morris et al. 1996; Bernier et al., 2002; Elpeleg et al., 2005; Enns et al., 2005; Oskoui et al., 2006). Por outro lado, mesmo quando se opta por apresentar os valores em percentagem da mdia do v.r. corrigido para a citrato sintase, tambm no h consenso. Ao rever o modo de expresso da actividade do complexo I em diferentes centros de diagnstico, Thorburn concluiu que o limite inferior do v.r. variava entre 24 e 79% da mdia (Thorburn et al., 2004b). Valores anormais seriam os inferiores a 20% ou a 30% da mdia do v.r., utilizados respectivamente como critrio major e minor de 173
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diagnstico (Walker et al., 1996; Bernier et al., 2002). DiMauro valoriza nveis de actividade enzimtica inferiores a 40% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase (comunicao pessoal, 2009). No estudo polarogrfico dos linfcitos e nas mitocndrias dos nossos doentes verificouse concordncia entre os resultados traduzidos em percentagem da mdia do v.r. e os expressos em relao ao limite inferior do v.r. para a oxidao de todos os substratos excepto para a do duroquinol nas mitocndrias: o nmero de casos classificados como deficitrios substancialmente maior quando o resultado expresso em percentagem da mdia do v.r. No que diz respeito ao estudo espectrofotomtrico da CRM, a traduo da actividade enzimtica que se associou a um menor nmero de casos deficitrios em qualquer das preparaes musculares (79% nas mitocndrias e 91% no homogeneizado) foi como ratio do complexo II, em percentagem da mdia do v.r.. A correco da actividade do complexo IV para a citrato sintase, traduzida em percentagem da mdia do v.r., aumentou o nmero de doentes com valores normais, tanto nas mitocndrias isoladas, como no homogeneizado de msculo. Aquele aumento foi ainda mais notrio com a correco para o complexo II. O estabelecimento daqueles ratios ter assim aumentado a especificidade dos resultados. No entanto, tal s se verificou quando a actividade enzimtica foi expressa em percentagem da mdia do v.r.. Quando a actividade do complexo IV em mitocndrias isoladas foi apresentada em nmol/min/mg protena em relao ao limite inferior do v.r., a proporo de valores normais desceu com a correco para o complexo II e ainda mais para a citrato sintase. No homogeneizado de msculo, a normalizao tanto para a citrato sintase como para o complexo II levou a uma percentagem de valores normais maior, sobretudo no primeiro caso (ver figura 73, pgina 148). A avaliao dos resultados da actividade do complexo IV nas mitocndrias, expressa nas unidades por adoptadas neste trabalho (percentagem da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase) s mostrou concordncia com os valores corrigidos para o complexo II (tanto em funo do limite inferior do v.r. como em percentagem da mdia do v.r.). Quanto ao homogeneizado de msculo, houve uma boa concordncia (Kappa 0,61) entre a actividade expressa nas unidades adoptadas e a expressa nas outras unidades analisadas, excepto no que se refere percentagem da mdia do v.r. normalizado para o complexo II, em que a concordncia foi moderada (Kappa: 0,41-0,6). A proporo de relaes concordantes entre as diversas unidades para a actividade do complexo IV (isto , com valores de Kappa mais elevados) foi maior no homogeneizado de msculo do que nas mitocndrias. O processo de isolamento das mitocndrias leva a uma perda no controlvel da actividade da citrato sintase do homogeneizado inicial, j que as mitocndrias anormais podem ter densidades diferentes, justificando a
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necessidade de se proceder normalizao da actividade enzimtica determinada nas mitocndrias isoladas de msculo para a citrato sintase (Grazina, 2004).
Da reflexo sobre os resultados do estudo funcional da CRM na globalidade dos tecidos dos 198 doentes pode parecer irrelevante a escolha das unidades em que expressa a actividade enzimtica da CRM, j que a proporo de casos com valores normais no muito diferente, variando entre 30% e 38% (ver tabelas 34 e 35, pginas 148-9). Do mesmo modo, a correlao dos resultados enzimticos com a clnica, avaliada atravs da escala dos critrios gerais de Nijmegen, mostra percentagens de valores normais para o grupo de DCRM definida muito semelhantes (15 a 17%), quando expressos nas diversas unidades. No entanto, a anlise de concordncia entre a actividade normal e deficitria para as duas categorias diagnsticas analisadas (definido versus possvel/ improvvel) mostrou valores demasiado baixos (ver pgina 151). A questo pode assim ser decisiva para o caso individual, uma vez que a um doente pode ou no ser atribudo o diagnstico de DCRM consoante o modo como so apresentados os resultados dos estudos funcionais, nomeadamente os enzimticos. Nos primeiros anos deste estudo, a actividade enzimtica foi expressa em
nmol/min/mg protena em relao ao limite inferior do v.r., tal como o faz o grupo de Rustin, sem ser dado particular relevo aos ratios entre os complexos. Com a adopo da expresso da actividade enzimtica da CRM em percentagem da mdia do v.r. normalizada para a citrato sintase, o diagnstico de final teve de ser reconsiderado em vrios dos nossos doentes. Com o objectivo de avaliar a importncia desta questo, optou-se por reclassificar os doentes com dfice isolado do complexo IV, dado tratar-se de um grupo relativamente homogneo em termos funcionais. Com a actividade do complexo IV expressa em percentagem da mdia do v.r. sem correco para a citrato sintase, apenas 15 dos 25 doentes manteve a mesma classificao diagnstica. Dois daqueles doentes viram alterado o diagnstico de DCRM de definido a provvel e oito, de provvel a definido. A normalizao para a citrato sintase levara reduo do nmero de casos com diagnstico definido, questo de extrema relevncia prtica. O uso da citrato sintase ou outras enzimas marcadoras como referncia para a actividade enzimtica dos complexos da CRM diminui a disperso dos valores normais, como antes notado (Wibom et al., 2002; Grazina, 2004). O grupo australiano, que trabalha apenas com homogeneizados de tecidos congelados, usa a citrato sintase como enzima marcadora. (Thorburn et al., 2004a). O grupo de Nijmegen normaliza a actividade enzimtica dos complexos da CRM para a citrato sintase ou para o complexo IV, consoante o tecido em causa (Van den Heuvel et al., 2004). O grupo de Rustin usa o ratio entre os vrios complexos da CRM, nomeadamente a normalizao para o complexo
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II na avaliao da fraco mitocondrial com o mesmo objectivo (Rustin et al., 1994; Chrtien e Rustin, 2003. Cada laboratrio adoptou um mtodo de avaliar e expressar a actividade dos complexos da CRM, o que torna extremamente difcil o controlo de qualidade de resultados e a realizao de estudos multicntricos (Taylor et al., 2004). Uma vez que no h relao entre o fentipo bioqumico e o gentipo nos tecidos habitualmente estudados, como alis ficou patente tambm no nosso grupo de doentes, no h modo de comprovar qual o sistema de unidades que est associado a especificidade e sensibilidade mais elevadas (Mirabella et al., 2000).
Para o normal funcionamento da CRM fundamental que haja equilbrio entre a actividade enzimtica dos vrios complexos da CRM, de modo a permitir a adequada reoxidao das coenzimas e evitar a formao excessiva de ROS. Nas DCRM pode encontrar-se um aumento do nmero ou proliferao de mitocndrias e/ou elevao da actividade de um ou mais complexos da CRM, traduzindo uma adaptao funcional. Foi demonstrado que, independentemente da normalidade de cada um dos segmentos da CRM, um desequilbrio entre os mesmos, detectado pela alterao dos respectivos ratios, tem consequncias funcionais relevantes no que respeita oxidao de substratos (Geromel et al., 1997). Na nossa srie, seis dos 32 doentes com clnica muito sugestiva de DCRM apresentavam desequilbrio na CRM, apesar de a actividade dos complexos individuais ser normal. Neste contexto, significativo que duas das nossas crianas com alterao patognica do mtDNA, sem critrios enzimticos de diagnstico de DCRM, apresentassem desequilbrio da CRM.
As actividades dos segmentos I+III (NADH - citocromo c oxidoreductase) e II+III (Succinato citocromo c oxidoreductase) da CRM foram avaliadas em todos os nossos doentes submetidos a estudos enzimticos da CRM. Optou-se por no usar aqueles resultados como critrio de diagnstico, uma vez que os complexos I, II e III foram individualmente avaliados em todas os casos. Por outro lado, o estudo foi feito em mitocndrias isoladas em apenas 45% dos nossos doentes e conhecido que a actividade dos complexos I+III e II+III (dependentes da ubiquinona endgena) no se mantm estvel em tecidos congelados (Rustin et al., 1994; Thorburn et al., 2004a). Apesar de no haver concordncia entre a actividade dos segmentos I+III e II+III e a dos respectivos complexos isolados, a concordncia foi ligeiramente mais elevada nas mitocndrias do que nas outras preparaes, para ambos os segmentos. Nas 40 preparaes de homogeneizado de fgado, aquela concordncia foi ainda mais baixa, o que pode relacionar-se com o processo de congelamento.
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A determinao dos segmentos I+III ou II+III no mede a mesma realidade que o somatrio dos respectivos complexos (I: NADH - ubiquinona oxidoreductase; II: succinato - ubiquinona oxidoreductase e III (ubiquinol ferricitocromo c oxido reductase), embora os pontos de partida e de chegada sejam os mesmos. No nosso grupo de doentes, a coincidncia de resultados da actividade enzimtica dos segmentos e os do somatrio dos seus componentes em termos de dfice nas diversas preparaes no vai alm de 60% (em mdia), com nveis de concordncia baixos ou muito baixos (ver figura 76, pgina 152). No se encontrou na literatura referncia a esta questo. A determinao da actividade daqueles dois segmentos pode ser til quando, apesar dos complexos I, II e III terem actividades normais, ambos os segmentos apresentam dfice ou esto no limite inferior do normal, apontando ento para um possvel dfice de CoQ (Boitier et al., 1998). No caso publicado por Boitier os complexos I, II e III tinham actividades normais, apesar dos segmentos I+III e II+III mostrarem dfice profundo. Nas 10 crianas da nossa srie com dfice de ambos os segmentos I+III e II+III foi igualmente detectado dfice de complexos da CRM (nomeadamente do complexo III em oito casos), o que no apontava para um dfice especfico da CoQ. Foi demonstrado que os dfices do complexo II se traduzem com maior expresso no segmento II+III do que os do complexo III: a medio da actividade do segmento II+III detectaria dfices parciais do II, mas no do III (Taylor et al., 1993). No entanto, na nossa srie a percentagem de casos com deficincia simultnea no segmento II+III foi ligeiramente maior para os dfices do complexo III (30%) do que para os do II (24%), como referido em Resultados (ver pgina 152). Por outro lado, nos nossos doentes o complexo III parece ter influenciado mais o segmento I+III (60% de casos com dfice simultneo) do que o II+III (30%).
Alguns autores (Chrtien e Rustin, 2003; Thorburn et al., 2004a) questionam a validade do estudo do complexo III e sobretudo do do V em tecidos congelados. Aquelas reservas no so, no entanto, partilhadas por outros. Assim, Marin-Garcia e
colaboradores (Marin-Garcia et al., 2003) encontraram dfices dos complexos III e V em homogeneizado congelado de msculo em respectivamente 24 e 10 de 25 crianas com encefalopatia de causa indeterminada. Usaram a normalizao para a citrato sintase, mas no definiram dfice significativo. Pode-se especular (embora no provar) que esta elevada frequncia de dfices dos complexos III e V seja metodolgica e no real, dando corpo quelas reservas. Rustin e colaboradores (Chrtien e Rustin, 2003) chamaram a ateno para a maior frequncia relativa de dfices do complexo III em tecidos congelados e a sua raridade em amostras frescas. Tal facto dever-se-ia perda de actividade das enzimas que dependem das quinonas, como o complexo III e os segmentos I+III e II+III, por alterao da integridade da membrana interna da mitocndria associada ao congelamento. Por outro 177
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lado, o conhecimento daquela labilidade poder levar a no diagnosticar dfices parciais do complexo III (Bnit et al., 2009). A maior parte dos grupos que realizam o diagnstico laboratorial das DCRM no usa a determinao da actividade enzimtica do complexo V (Trounce et al., 1996; Wibom et al., 2002; Enns et al., 2005). Alguns investigadores defendem que a actividade da ATP sintase em homogeneizados congelados no estvel e por isso no se deve us-la para diagnstico (Thorburn et al., 2004a). Outros grupos doseiam o complexo V em mitocndrias isoladas e/ou homogeneizados frescos ou congelados. Neste ltimo caso, a amostra deve ser usada a curto prazo e no ter sido submetida a congelamentos e descongelamentos sucessivos, de modo a evitar a peroxidao dos lpidos membranares e a desorganizao estrutural da membrana interna da mitocndria, com a consequente dissociao dos componentes F1 e F0 do complexo V (Rustin et al., 1994; Bnit et al., 2006; Janssen et al., 2006a). O processo usado para o doseamento dos complexos III e V nos nossos doentes (incluindo o tempo de congelao a -80C antes do doseamento) foi bem aferido e uniformizado (Grazina, 2004). Fez-se uma anlise detalhada dos resultados complexos III e V em tecidos congelados nos nossos doentes, com o objectivo de avaliar a relevncia clnica do processo de congelao das amostras. A incidncia de dfices isolados do complexo III na nossa srie de doentes baixa (nove casos, quatro dos quais com valores inferiores a 20% da mdia do v.r. normalizado para a citrato sintase). O dfice do complexo III determinado em homogeneizado congelado foi determinante para o diagnstico de DCRM definida em apenas dois doentes. Por outro lado, em 41 das 43 crianas em que o complexo III foi investigado em mitocndrias e em homogeneizado congelado da mesma amostra de msculo verificou-se consistncia de resultados, o que refora a validade do mtodo usado. No que se refere ao complexo V, nos 52 doentes em que a actividade foi determinada nas mitocndrias isoladas e no homogeneizado congelado na mesma amostra de msculo, os valores coincidem em mais de trs quartos (41) dos casos. Os resultados no apoiam a hiptese de que o congelamento daria origem a falsas deficincias, uma vez que das amostras em que os resultados so dspares, verifica-se mais vezes um resultado normal no homogeneizado do que nas mitocndrias. O diagnstico de DCRM definida esteve dependente de um dfice major isolado do complexo V em
homogeneizado de msculo congelado, sem que tenham sido avaliadas as mitocndrias, em apenas dois dos nossos doentes.
Como foi mencionado anteriormente, a actividade enzimtica da CRM frequentemente determinada em mitocndrias isoladas de msculo, de linfcitos ou de fibroblastos em cultura (Rustin et al., 1994; Van den Heuvel et al., 2004). Outros grupos usam 178
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preferencialmente o homogeneizado de msculo fresco ou congelado (Thorburn et al., 2004a; Janssen et al., 2006a). Em 41 casos da nossa srie, o estudo do complexo IV foi realizado em trs preparaes diferentes da mesma amostra de msculo:
homogeneizado fresco (inicial), mitocndrias isoladas e homogeneizado congelado. Seria de esperar que os resultados das trs preparaes fossem sobreponveis para cada doente, o que se verificou em pouco mais de metade (56%) dos casos. A anlise de concordncia revelou nveis muito baixos para o par mitocndrias/ homogeneizado congelado e baixos para mitocndrias/ homogeneizado inicial e homogeneizado
congelado/ homogeneizado inicial. Embora no se possa afastar com segurana a existncia de algum problema metodolgico no estabelecimento de controlos normais ou no processamento das amostras, a explicao mais plausvel a de que, no sendo gaussiana a curva de distribuio de valores normais para todos os complexos, a definio arbitrria da normalidade como uma percentagem de um valor mdio pode fazer com que o mesmo indivduo apresente valores variveis, de acordo com o tipo de preparao. Em 22 dos 41 casos acima referidos, o complexo IV foi investigado tambm em linfcitos. A conformidade dos resultados do estudo do complexo IV em linfcitos com os das vrias preparaes musculares foi da mesma ordem de grandeza (50 a 68% dos casos) da das preparaes musculares entre si:68 a 73%; 56% no global (ver figura 78, pgina 156). Na prtica, as vrias preparaes do msculo comportaram-se como tecidos diferentes. Num dos doentes com sndrome de Leigh (sem estudo em amostra congelada de msculo) em quem se demonstrou uma deleco no gene SURF1, havia dfice major do complexo IV nos linfcitos e no homogeneizado inicial, mas no nas mitocndrias isoladas de msculo. Se neste caso o estudo do complexo IV se tivesse limitado s mitocndrias, no teria sido detectado o seu dfice, orientador do estudo molecular subsequente. A anlise enzimtica de mitocndrias isoladas e dos homogenizados preparados a partir de tecido fresco e de tecido congelado devem assim ser encarados como mtodos complementares e no alternativos. Se por um lado, o isolamento das mitocndrias, baseado em mtodos densitomtricos, pode levar eliminao das mitocndrias mais defeituosas por terem uma densidade diferente, por outro, o congelamento,
armazenamento e descongelamento dos tecidos pode levar a alteraes da estrutura mitocondrial, nomeadamente da membrana mitocondrial interna, com consequncias na sua funo. A anlise em mitocndrias isoladas seria assim mais especfica, embora menos sensvel que a do homogeneizado (Casademont et al., 2004; Grazina, 2004). O uso de tecidos frescos tem a vantagem adicional de se poder fazer uma avaliao da oxidao global de vrios substratos. Nessa perspectiva, alguns grupos como o de Nijmegem, elegeram a avaliao sistemtica em homogeneizado fresco (Janssen et al., 179
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2006a). Outros preferem o estudo em mitocndrias isoladas (Rustin et al., 1994). Ainda outros, sobretudo por questes que tm a ver com a distncia em relao aos locais de colheita das amostras, optam pelo estudo em amostras congeladas (Thorburn et al., 2004a; DiMauro comunicao pessoal, 2009). No nosso caso, abandonou-se a realizao sistemtica dos estudos a fresco na segunda metade do perodo de estudo, com o objectivo de racionalizar a utilizao de recursos.
A avaliao em linfcitos limitou-se aos complexos II, III e IV, como habitualmente sucede quando se usam estas clulas (Mir et al., 1999). A determinao dos complexos I e V requer maior volume de sangue e/ou cultura de clulas (Chretien et al., 2003b; Solaini et al., 2008). Recentemente, foi publicada uma abordagem metodolgica que permite a determinao do complexo I em amostras de pequeno volume mediante um processo especial de permeabilizao (De Wit et al., 2007). As actividades dos complexos II, III e IV foram mais vezes normais em linfcitos (cerca de dois teros dos casos) do que no msculo (quase metade dos casos). Tal seria de esperar de alteraes do mtDNA pelo facto de os linfcitos serem um tecido proliferativo. Os linfcitos so, neste contexto, menos sensveis e mais especficos do que o msculo (Thorburn et al., 2004a), o que foi igualmente demonstrado no conjunto dos doentes estudados no Laboratrio de Bioqumica Gentica do CNC (Grazina, 2004). Tratando-se de uma srie peditrica, o predomnio de alteraes do nDNA poderia contrariar aquela tendncia, o que no se verificou.
O contributo da anatomo-patologia, nomeadamente a do msculo esqueltico, para o diagnstico das DCRM muito importante em qualquer idade (Taylor et al., 2004; Kyriacou e Kyriakides, 2006). As RRF, as fibras COX negativas e a observao em microscopia electrnica de proliferao e alterao da estrutura mitocondrial tm sido valorizadas como critrio de diagnstico (Walker et al., 1996; Bernier et al., 2002; Wolf e Smeitink, 2002). No entanto, em pediatria aquelas alteraes tpicas so relativamente raras (Sarnat e Marin-Garcia, 2005). O aumento da actividade oxidativa subsarcolmica, evidenciada pela intensificao da colorao com SDH (mtodo mais sensvel para detectar a proliferao mitocondrial), com ocasional formao de crescentes mais frequente na criana (Wolf e Smeitink, 2002). Na nossa srie foram usadas as tcnicas histolgicas e histoenzimolgicas de rotina no estudo destas patologias. A anlise de msculo em microscopia electrnica foi realizada num nmero significativo de casos (90 de 185 cujo msculo foi investigado). Apenas em nove das 200 crianas no foi realizado qualquer estudo histolgico devido escassez da amostra. Em face da maior probabilidade do estudo histolgico ser no contributivo para o diagnstico, foi dada prioridade ao estudo funcional da CRM nesses casos. Apesar de ter sido feito estudo histolgico em mais de 95% das crianas, a percentagem de achados positivos 180
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relevantes pode considerar-se muito baixa. Registaram-se critrios histolgicos de diagnstico de DCRM em apenas 12 crianas, sendo major em duas e minor em 10. As RRF corresponderiam traduo morfolgica das alteraes do mtDNA que afectam a sntese proteica mitocondrial (De Vivo, 1993; Sarnat e Marin-Garcia, 2005; RubioGozalbo et al., 2000a). Tpicas, mas no patognomnicas de DCRM, as RRF podem surgir em outras miopatias, nomeadamente inflamatrias ou associadas ao processo de envelhecimento, sendo muito raras abaixo dos 5 anos de idade. (Rowland et al., 1991; Rifai et al., 1995; Kirby et al., 1999; Patterson, 2004). Cinco de uma srie de 42 crianas com dfice do complexo I apresentavam RRF (Kirby et al., 1999). Os 185 doentes da nossa srie foram submetidos a bipsia muscular numa idade mediana de 4 anos e o nmero de casos com alterao identificada no mtDNA foi baixo. Isto explicaria o facto de terem sido detectadas RRF em apenas duas das nossas 75 crianas com DCRM definida primria e estudo anatomo-patolgico do msculo. Uma apresentava KSS com a deleco comum e a outra tinha miopatia mitocondrial (e miocardiopatia hipertrfica, de manifestao mais tardia) com a mutao A3302G do mtDNA. Nestes doentes a bipsia muscular tinha sido realizada aos 14 e 6 anos de idade, respectivamente. A colorao com enzimas oxidativas como a NADH-TR, a SDH e a COX
(correspondentes aos complexos I, II e IV, respectivamente) fornece apenas resultados semiquantitativos da actividade enzimtica, mas permite identificar in situ variao de actividade em fibras individuais cuja alterao pode no ter traduo nos ensaios enzimticos (Old e Johnson 1989; Dawson et al., 2003; Carrozo et al., 2007). Enquanto a NADH-TR inespecfica, pois cora tambm o retculo endoplsmico (actividade NADH reductase no sensvel rotenona), as outras so especficas. No entanto, as fibras COX negativas podem ser encontradas em outras miopatias por alterao secundria (Dawson et al, 2003). Na nossa srie, 15 doentes apresentaram aumento da actividade oxidativa
subsarcolmica, cinco dos quais com crescentes em mais de 2% das fibras. No entanto, no houve nenhum caso de fibras distintamente COX negativas, apesar de o dfice do complexo IV ser o mais frequentemente identificado. A discriminao entre uma actividade residual elevada e a normal pode ser difcil em termos histoqumicos (Rutleledge e Finn, 2004). Por outro lado, a heterogeneidade da distribuio das fibras COX negativas pode ter contribudo para aquele resultado (Sarnat e Marin-Garcia, 2005; Haginoya et al., 1990). No nosso grupo de doentes, as alteraes do msculo esqueltico em microscopia ptica foram relativamente frequentes (40% do total de 185 doentes e 33% dos 75 casos de DCRM definida primria), mas de um modo geral inespecficas. Na experincia de Patterson metade dos casos com evidncia clnica e analtica de dfice da CRM apresentam morfologia muscular normal (Patterson, 2004). O aumento da variabilidade 181
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do dimetro das fibras, o predomnio das fibras tipo I (oxidativas) ou a atrofia das do tipo II (glicolticas) que ocorreram em muitas das nossas crianas, embora inespecficas, tm sido descritos em doentes com DCRM (Enns et al., 2005). O dfice do metabolismo oxidativo pode levar acumulao de glicognio e sobretudo de lpidos, tal como se constatou num subgrupo dos nossos casos (DiMauro et al., 1973; Chretien e Rustin, 2003). A atrofia muscular neurognica, demonstrada em alguns das crianas, tem sido descrita nas DCRM e impe diagnstico diferencial com outras entidades, nomeadamente a atrofia muscular espinhal (Rubio-Gozalbo et al., 1999; Lee et al., 2007). A percentagem de achados positivos em microscopia electrnica pode considerar-se muito baixa no nosso grupo de doentes: quatro em 50 crianas com DCRM definida primria e estudo do msculo em microscopia electrnica. Tal pode dever-se ao reduzido nmero de casos com alteraes do mtDNA, baixa faixa etria da populao investigada e significativa proporo de crianas com doena aguda, uma vez que as alteraes morfolgicas das mitocndrias levam tempo a instalar-se. No se
encontrariam alteraes mitocondriais tpicas antes dos 8 anos de idade (Mierau et al., 2004). No entanto, em vrias sries peditricas tem sido referida uma taxa mais elevada de alteraes mitocondriais em microscopia electrnica. Num grupo de 55 crianas com suspeita clnica de DCRM, Mierau (Mierau et al., 2004) detectou alteraes na microscopia electrnica em 10 de 18 casos com dfice enzimtico demonstrado (um caso com RRF) e em trs com estudo enzimtico normal. Numa outra srie de 31 crianas com DCRM definida (22) ou provvel (22), todas com alteraes histolgicas do msculo esqueltico sugestivas de DCRM e sem referncia aos outros critrios de diagnstico considerados, havia alteraes da microscopia electrnica em 48%, sendo que em cinco era a nica alterao morfolgica (Kyriacou e Kyriakides, 2006). Esta aparente disparidade entre a nossa srie e outras pode dever-se a diferenas no tipo de recrutamento dos doentes investigados. Por outro lado, questes tcnicas como o reduzido nmero de cortes estudados e de campos observados podem ter contribudo para a baixa taxa de alteraes detectadas. As referidas questes e a heterogeneidade da distribuio das alteraes mitocondriais podero justificar o facto de no terem sido detectadas alteraes mitocondriais em microscopia electrnica no tecido muscular da doente com RRF e a mutao A3302G do mtDNA. Apesar de terem sido descritos casos com RRF no confirmados em microscopia electrnica e considerados falsos positivos (Mierau et al., 2004), tal no parece ser o caso na nossa doente. Finalmente, mas no menos importante, os critrios usados, que incluram apenas alteraes mitocondriais tpicas, podem ter tambm contribudo para o elevado nmero de casos com microscopia electrnica normal. No h consenso sobre as alteraes estruturais mitocondriais diagnsticas de DCRM. Dado que existe um elevado grau de pleomorfismo nas mitocndrias, a valorizao de atipias de baixo grau controversa e a definio da fronteira entre o normal e o patolgico frequentemente arbitrria (Mierau et al., 2004; 182
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Patterson et al., 2004). Pode especular-se que os critrios usados na avaliao dos nossos doentes tenham sido muito restritivos. O uso da microscopia electrnica por rotina no diagnstico das DCRM controverso (Bourgeois e Tarnopolsky, 2004; Taylor et al., 2004; Kyriacou e Kyriakides, 2006). Trata-se de uma tcnica dispendiosa e trabalhosa que no est disponvel em todos os Hospitais. O estudo em microscopia electrnica de um to grande nmero dos nossos casos s foi possvel graas colaborao cedida pelo Servio de Anatomia Patolgica do Hospital Universitrio de Santiago de Compostela. Nas amostras de miocrdio no foram aplicadas tcnicas histoqumicas nem
microscopia electrnica, pelo que no se obteve toda a informao morfolgica possvel. A maior parte dos nossos doentes com estudo histolgico heptico (30 em 38) tinha alteraes, sendo a esteatose a mais frequente (13 casos). No se encontrou relao entre o tipo de esteatose (macro, micro ou mista) e o diagnstico final, tendo-se concludo por um diagnstico diferente do de DCRM em seis daqueles 13 doentes. Embora a infiltrao lipdica (macro e microesteatose), a fibrose e a cirrose ocorram tipicamente nas DCRM com envolvimento heptico como as sndromes de depleo do mtDNA, o tipo de esteatose no orientador do diagnstico (Morris, 1999; Gordon, 2006). Tratando-se de alteraes inespecficas, so comuns a muitas outras patologias (Sokol e Treem, 1999), como se verificou na nossa srie. Conclui-se pela necessidade de incluir na bateria diagnstica de DCRM todos os meios disponveis, incluindo a microscopia electrnica do msculo e dos outros tecidos investigados, uma vez que no h nenhum suficientemente sensvel e especfico. Este aspecto particularmente relevante nos casos sem diagnstico molecular.
A histria familiar, quando informativa e em associao com o quadro clnico, importante para a orientao dos estudos moleculares no caso individual (Thorburn et al., 2004b). Embora paradigmtica das DCRM, a hereditariedade materna das mutaes do mtDNA nem sempre bvia. De um modo geral, raro identificar uma hereditariedade mitocondrial tpica, com todos os descendentes de uma doente do sexo feminino afectados em maior ou menor grau. Tal acontece, no s pelo pequeno nmero de alteraes do mtDNA na criana, frequentemente espordicas, mas tambm pela reduzida prole nas famlias actuais (Taylor et al., 2002; Thorburn et al., 2004 a). O elevado nmero de casos da nossa srie em que o doente era o primeiro ou nico filho e a pequena dimenso das fratrias impossibilitaram a definio de um padro de hereditariedade na maior parte destas famlias. Numa delas, numerosa, com elevado grau de consanguinidade e em que vrios membros de ambos os sexos em todas as geraes apresentavam ptose palpebral e/ou atraso intelectual assume-se uma
transmisso autossmica dominante. O caso ndex, ainda sem diagnstico molecular, apresentava dfice major do complexo V em homogeneizado de msculo. Numa das duas 183
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famlias com dois irmos afectados, ambos preenchiam apenas critrios de DCRM provvel. Na outra famlia, as duas irms tinham DCRM definida com dfice do complexo IV estando em curso o estudo do gene SURF1. Identificou-se alteraes do DNA em 18 das 200 crianas (9%). Investigadas. No entanto, s em oito casos foram consideradas seguramente patognicas e usadas como critrio major de diagnstico. Sem prejuzo da investigao especfica caso a caso, a procura de mutaes pontuais no mtDNA foi feita segundo trs protocolos ao longo do perodo de estudo, sendo que o objectivo foi ir alargando o leque das alteraes rastreadas (ver em Anexos, pginas 257-265): pesquisa especfica das mutaes mais frequentes por MS-PCR, PCR-RFLP e finalmente PCR seguida de sequenciao de largas zonas do mtDNA onde tm sido mais frequentemente descritas alteraes associadas a doena (MITOMAP, 2008). As alteraes do mtDNA que foram pesquisadas em todos os nossos doentes esto mais frequentemente associadas s DCRM com manifestao clnica na adolescncia ou idade adulta: grandes deleces (CPEO, Sndrome de Pearson, KSS) A3243G e T3271C (MELAS) A8344G e T8356C (MERRF) G11778A, T14484C, G3460A e G15257A (LHON). Apesar da ampliao progressiva do estudo do mtDNA, em alguns dos casos mais antigos precocemente falecidos no foi possvel prosseguir o estudo molecular por falta de material biolgico. A quantidade de tecidos recolhidos por bipsia sempre problemtica em Pediatria, sobretudo na criana pequena. Nem sempre a reserva de sangue perifrico ou a cultura de fibroblastos permitem chegar a um diagnstico de DCRM
retrospectivamente, uma vez que as alteraes do mtDNA podem no se traduzir naqueles tecidos. A taxa de alteraes patognicas do mtDNA significativamente mais baixa nas crianas do que no adulto, embora possa chegar a 25% em alguns centros de referncia (Thorburn 2004; Shoubridge, 2001a). Em 2000 doentes de todas as idades
consecutivamente investigados, Liang encontrou uma positividade do rastreio de 12 mutaes patognicas comuns e grandes deleces do mtDNA por PCR-AS em apenas 5,4% dos casos, o que atesta a importncia da seleco dos doentes por um lado e dos mtodos usados por outro (Liang e Wong, 1998). As deleces nicas do mtDNA so de um modo geral espordicas. Tambm as mutaes do mtDNA ocorrem frequentemente de novo, como j foi mencionado (Thorburn et al., 2004b; Rotig et al., 2004). Na experincia de Thorburn, em mais de 60% de 50 famlias com uma criana afectada por uma mutao do mtDNA no havia qualquer indcio de hereditariedade materna (Thorburn et al., 2004b). Nas trs famlias da nossa srie com mutao patognica do mtDNA, esta foi tambm demonstrada nos familiares mais prximos, de acordo com um padro de hereditariedade materna, mas s num deles havia manifestaes clnicas.
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Os 6% de alteraes patognicas do mtDNA na nossa srie muito baixo em comparao com 10-25% de outras sries peditricas (Thorburn, 2004; Darin et al., 2001; Scaglia et al., 2004; Uusimaa et al., 2004). Durante o perodo do estudo foram assinaladas mais duas crianas com mutao do mtDNA, no includas nesta anlise por no terem feito bipsia muscular/ heptica: uma assintomtica, embora com
hiperlactacidmia moderada, com a mutao A3243G, herdada da me que sofre de miopatia mitocondrial e outra com a mutao A1555G em linfcitos, que consultou por encefalopatia inespecfica, tendo sido recusada pela famlia investigao mais invasiva. Foi demonstrada uma frequncia de 18% de mutaes pontuais tRNA e deleces em crianas com dfices da CRM (Uusimaa et al., 2004). A definio de dfice da CRM (actividade enzimtica inferior a 90% do limite inferior do v.r.) no entanto diferente da usada na nossa srie. Por outro lado, as regies do mtDNA investigadas no so exactamente as mesmas, o que pode ter contribudo para a diferena do nmero de mutantes identificado. Seria de esperar um maior nmero de casos com mutaes pontuais tendo em considerao a amplitude do rastreio de mutaes do mtDNA usado. O nmero de casos (trs) nos quais foram detectadas mutaes patognicas do mtDNA (G11778A, T8993G e A3302G) de facto muito baixo, o que poderia ser atribudo em parte baixa idade dos nossos doentes. Est bem estabelecido que as DCRM causadas por alteraes primrias do mtDNA se manifestam em idades mais tardias do que as associadas a mutaes do nDNA (Rubio-Gozalbo et al., 2000a). O mtodo de rastreio alargado permitiu a deteco de mutaes secundrias de LHON, de significado indefinido, em cinco crianas. Em nenhuma foi detectada atrofia ptica. Uma sofria de retinopatia pigmentar, com alteraes tpicas no electroretinograma. As designadas mutaes secundrias de LHON so polimorfismos do mtDNA que tm sido encontrados com maior frequncia em doentes de LHON do que na populao geral, pelo que se lhes tem atribudo um possvel papel sinrgico (Brown et al., 1997). Este papel de factor de ambiente gentico interferente na manifestao clnica de alteraes do mtDNA tem sido atribudo a muitos outros polimorfismos do mtDNA com base na associao de determinados hapltipos com fentipos clnicos (Torroni et al., 1997; Carelli et al., 2003). A elevada taxa relativa de mutaes secundrias encontradas ilustra bem uma das limitaes da sequenciao directa como mtodo de rastreio na prtica clnica: a deteco de um elevado nmero de polimorfismos ou alteraes homoplsmicas cujo significado patolgico indeterminado (Wong et al., 2005). Dada a grande variabilidade do mtDNA, as mutaes patognicas do mtDNA devem ser distinguidas dos polimorfismos para terem valor diagnstico, o que nem sempre fcil (Chinnery et al., 1999; Vilarinho et al 1999; Carelli et al., 2002; McFarland et al, 2002; Crimi et al., 2003; MITOMAP, 2008). O grau de heteroplasmia das mutaes do mtDNA identificadas nos nossos doentes (classicamente considerado um dos critrios de 185
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patogenicidade) foi avaliado de um modo aproximado por densitometria de bandas, tal como descrito na literatura (Wong e Boles, 2005). Para alm da associao com os clssicos sndromes de Pearson e de Kearns-Sayre, as deleces do mtDNA tm sido ligadas a quadros clnicos muito variados, desde doena multissistmica at vmitos cclicos ou insuficincia supra-renal (Boles e Williams, 1998; Lacbawan et al., 2000). O rastreio de grandes deleces nos nossos doentes foi feito por L-PCR e posteriormente por FD-PCR, como referido em Mtodos. Em cinco das nossas crianas foi identificada a deleco comum, valorizada como patognica em apenas duas que apresentavam clnica compatvel com a sndrome de Pearson (4404pb) e a de KSS (4977pb). Nos outros com a deleco comum, assim como em mais seis doentes em que se encontraram outras deleces, a patogenicidade no pde ser demonstrada, nomeadamente pela inespecificidade da apresentao clnica e por no ter sido ainda determinado o grau de heteroplasmia. Esta uma das limitaes da anlise molecular dos nossos doentes, o que est em vias de resoluo. De um modo geral, h uma relao directa entre a gravidade clnica e o grau de heteroplasmia das alteraes do mtDNA (Ferlin et al., 1997). O mtDNA mutante deve representar 60% ou mais do total do mtDNA para que haja dfice da CRM num rgo especfico (Boulet et al., 1992; Sciacco et al., 1994). A anlise semi-quantitativa do mtDNA e do grau de heteroplasmia pode ser feita por vrios mtodos com sensibilidade varivel. A determinao do nmero de cpias de mtDNA por PCR em tempo real actualmente o mtodo de eleio para a quantificao do mtDNA (Wong et al., 2005; Wong e Bai, 2006; Singh et al., 2006). Esta tcnica foi recentemente implementada no Laboratrio de Bioqumica Gentica do CNC e permitir avaliar o grau de heteroplasmia das alteraes do mtDNA e detectar casos de depleo do mtDNA atravs da sua quantificao (Chabi, 2003). Um importante subgrupo de casos com DCRM, tanto na criana como no adulto, devese a defeitos da comunicao intergenmica que se traduzem por diminuio do nmero de cpias do mtDNA e/ou deleces mltiplas (Spinazzola e Zeviani, 2005). A sndrome de depleo do mtDNA, que se apresenta frequentemente na infncia, tem sido associada a genes envolvidos no metabolismo dos desoxirribonucletidos:
desoxiguanosina cinase (DGUOK), polimerase gama (POLG1), timidina cinase2 (TK2) e o gene codificante da subunidade da succinil-CoA sintetase ATP especfica (SUCLA2) (Saada et al., 2001; Mancuso et al., 2003; Elpeleg et al., 2005; Mancuso et al., 2005; Horvath et al., 2006). Na nossa srie foi confirmada depleo do mtDNA no nico doente investigado nesse sentido. A depleo est associada a um grupo heterogneo de doenas, geralmente de incio precoce e correspondente faixa etria dos doentes em anlise. Com a maior disponibilidade da quantificao do mtDNA, vrios casos da nossa srie que
apresentaram clnica compatvel podero vir a revelar-se sndromes de depleo 186
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(Horvath et al., 2006; Oskoui et al., 2006). Outro subgrupo em que deve ser investigada a hiptese de depleo do mtDNA o das crianas que com dfices da CRM mltiplos (20 doentes) ou generalizados da CRM (13 doentes) e rastreio negativo para grandes deleces e as mutaes mais comuns que afectam a sntese proteica mitocondrial. De facto, foi recentemente demonstrada depleo do mtDNA (menos de 35% de cpias do mtDNA) em 18% de 270 casos peditricos com dfices mltiplos da CRM (Sarzi et al., 2007). Dada a frequncia crescente com que tm sido relatadas mutaes do gene POLG1, ser de fazer esse estudo nos doentes com encefalopatia epilptica, mesmo sem envolvimento heptico. O mesmo estaria indicado em todos os casos de encefalopatia de causa desconhecida ou de doena multissistmica com envolvimento neurolgico (Horvath et al., 2006). Estima-se que a maior parte das DCRM com incio em idades peditricas seja causada por mutaes nucleares, seguindo padres de hereditariedade mendeliana (Schon, 2000). O perfil clnico do nosso grupo de doentes aproxima-se mais do que descrito nas alteraes do nDNA: tendncia a apresentar-se mais precocemente, com clnica mais uniforme e pior prognstico do que os quadros clnicos associados a mutaes do mtDNA (Rubio-Gozalbo et al., 2000a). De entre as alteraes do nDNA mais frequentemente diagnosticadas esto as localizadas em genes que codificam protenas envolvidas na replicao e manuteno do mtDNA anteriormente mencionados ou factores de assembling dos complexos enzimticos da CRM, como o SURF1 do complexo IV (Land et al., 2004; Schapira, 2006). O baixo nmero de mutaes do nDNA detectadas nesta amostra deve-se provavelmente ao facto de s se ter estudado o gene SURF1 em casos seleccionados e quantificado o nmero de cpias de mtDNA em apenas um doente. Rotig e colaboradores (Rotig et al., 2004) sugerem que o estudo do gene SURF1 est indicado em todos os casos com dfice do complexo IV, qualquer que seja o quadro clnico, j que tm sido descritos fentipos diferentes do da sndrome de Leigh (Robinson, 2000; Shoubridge 2001b). Neste contexto, ser de investigar o gene SURF1 em todos os casos com dfice isolado do complexo IV da nossa srie. As trs crianas em quem foi detectada alterao patognica do gene SURF1 apresentaram-se como sndrome de Leigh. Dois tiveram incio tardio e evoluo crnica e neles foi identificado um dfice major do complexo IV no msculo. No terceiro, de incio precoce, com acidose lctica e evoluo rapidamente fatal, em que o estudo dos complexos da CRM em msculo foi normal, uma mutao patognica no gene SURF1 foi detectada em heterozigotia. Podemos especular sobre o eventual papel sinrgico dos dois polimorfismos do mtDNA encontrados nesta criana. Como teve miocardiopatia hipertrfica associada ao quadro neurolgico, est em curso a sequenciao do gene SCO2, uma vez que o estudo da CRM em fibroblastos deste doente mostrou um dfice minor do complexo IV (Papadopoulou et al., 1999). 187
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No se tem verificado correlao entre o gentipo mitocondrial e os fentipos clnico e bioqumico, sobretudo na criana, em que os quadros clnicos so pouco especficos. Nos casos suspeitos de DCRM sem quadro clnico-laboratorial orientador h que avanar para o rastreio de alteraes de todo o mtDNA ou para o estudo de cbridos de modo a determinar a origem nuclear ou mitocondrial do defeito gentico (King e Attardi, 1989). A quantificao do mtDNA deve estar facilmente acessvel e ser realizada perante quadros clnicos sugestivos. Na ausncia de alteraes detectadas ou no caso de elas sugerirem patologia do nDNA, o resultado do estudo funcional da CRM associado ao quadro clnico poder ser orientador do segmento do nDNA a investigar. O padro de alterao funcional da CRM detectado pode ser relevante neste contexto: a presena de dfice de mais do que um complexo enzimtico da CRM apontaria para uma mutao nuclear ou de genes do mtDNA envolvidos na sntese proteica mitocondrial, consoante estivesse ou no envolvido o complexo II, respectivamente (Sarzi et al., 2007).
6.2 O diagnstico final

6.2.1 Os critrios de diagnstico adoptados
As DCRM compreendem entidades nosolgicas muito diversas, tanto em termos de idade de apresentao, rgos ou sistemas atingidos, como de prognstico, traduzindose numa enorme variedade de quadros clnicos mal definidos e parcialmente sobrepostos. Apesar da ausncia de relao gentipo-fentipo na maior parte dos doentes, as classificaes genticas, usadas desde h muito sobretudo em clnica de adultos, so as mais consistentes (De Vivo 1993; DiMauro e Schon, 2006). No entanto, na maioria dos casos peditricos o diagnstico ainda predominantemente clnico-bioqumico-
morfolgico, mesmo nos centros com mais experincia (Wolf e Smeitink, 2002; Rotig et al., 2004; Thorburn et al., 2004a). O diagnstico e a classificao das DCRM so tarefa rdua, complexa, a necessitar de aperfeioamento (Naviaux, 2004; Rutledge e Finn, 2004; Miles et al., 2006; Wong e Bai, 2006). As manifestaes clnicas e as alteraes funcionais e morfolgicas das mitocndrias e mutaes do mtDNA/nDNA so a base do diagnstico, mas o nmero de peas do puzzle, o peso relativo de cada pea e o modo de encaixe so muito diversos e obviamente dependentes dos recursos disponveis e da experincia individual. Segundo Taylor (Taylor et al., 2004), o diagnstico das DCRM deveria ser feito de preferncia em centros que ofeream um programa completo, com diferenciao clnica, bioqumica, histoqumica e de gentica molecular apoiadas em programas de investigao activos. De facto, dada a sua complexidade, muito do estudo diagnstico tem de ser realizado num contexto de investigao bsica e clnica. 188
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Aps a publicao original de Walker em 1996, altura em que o conhecimento das alteraes do mtDNA estava a dar os primeiros passos e s se suspeitava de mutaes causais do nDNA, variados sistemas de classificao diagnstica tm sido propostos. Embora cada grupo baseie o diagnstico em critrios prprios, de um modo geral todos usam a associao da informao clnica com dados bioqumicos, histolgicos e/ou moleculares. O diagnstico de DCRM assente na demonstrao de uma mutao patognica, nuclear ou mitocondrial, associada a clnica sugestiva consensual (Walker et al., 1996; Nissenkorn et al., 1999, Bernier et al., 2002, Wolf e Smeitink, 2002). A classificao de Walker, apesar de algumas limitaes como a inespecificidade das manifestaes clnicas (sobretudo na criana) e as frequentes alteraes funcionais e estruturais das mitocndrias e mesmo do mtDNA secundrias a muitas outras doenas ou txicos, veio de certo modo uniformizar a linguagem diagnstica. A adaptao dos critrios de Walker idade peditrica protagonizada pelo grupo de Melbourne manteve a vantagem da classificao inicial, que o facto de as alteraes serem somativas, isto , no ser indispensvel fazer em cada doente toda a investigao enumerada (Bernier et al., 2002). A escala de Bernier tem sido a mais amplamente utilizada, talvez por no implicar estudos a fresco. No entanto, a escala diagnstica de DCRM peditrica do grupo de Nijmegen parece mais adequada, uma vez que utiliza dois conjuntos de critrios: os gerais e os bioqumicos mitocondriais numa tabela de dupla entrada, como referido em Mtodos (pginas 73; 78-81). Por outro lado, os sinais clnicos e sintomas da classificao de Nijmegen foram seleccionados com base em casos com diagnstico molecular de DCRM (Wolf e Smeitink, 2002). A validade dos critrios gerais como indicadores de DCRM foi recentemente confirmada, mostrando-se apropriados para diferenciar um grupo de doentes com DCRM com mutao identificada de um grupo de crianas com outras doenas genticas (Morava et al., 2006b). Na classificao dos nossos casos optou-se pela escala diagnstica de Bernier tendo em conta o tipo de investigao mitocondrial realizada nos nossos doentes e a sua aplicabilidade num estudo retrospectivo. De facto, os estudos mitocondriais funcionais disponveis no permitiram a aplicao dos critrios de diagnstico de Nijmegen, uma vez que no se dispunha da oxidao de substratos marcados com
14
C, nem da produo
de ATP e fosfocreatina. Na aplicao da escala de Bernier nossa amostra, aos critrios clnicos da escala original foram acrescentados os sinais e sintomas publicados por Munnich, tal como sugerido pelos autores (Munnich e Rustin, 2001; Bernier et al., 2002). Embora a classificao adoptada contemple alguns itens no investigados, tal no foi impeditivo da sua aplicao. o caso do controlo respiratrio, avaliado por polarografia. Apesar de ter sido feito o estudo polarogrfico em mitocndrias isoladas de msculo e em linfcitos na primeira metade do perodo de estudo, os resultados disponveis no permitiram calcular aquele parmetro, uma das limitaes do estudo ser retrospectivo. No foi assim possvel detectar casos com eventual desacoplamento entre o consumo de 189
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oxignio e a sntese de ATP, tal como descrito na doena de Luft (de que se conhecem apenas dois doentes) e mais recentemente em associao com a encefalopatia necrosante aguda infantil (Luft et al, 1962; DiMauro et al, 1976; Neilson et al, 2003; Luft, 2006). A aplicao dos critrios de DCRM de Bernier levou classificao dos nossos doentes como sofrendo de DCRM definida em quase metade dos casos (n=95). O facto de os grupos com diagnstico improvvel (18 casos) ou possvel (10 casos) serem to reduzidos pode dever-se a duas ordens de razes: o critrio de seleco dos doentes e a elevada taxa de dfices enzimticos da CRM encontrados. No que diz respeito seleco dos doentes, s foram includos na anlise as crianas submetidas a bipsia diagnstica (na maioria dos casos programada para esse fim) ou a colheita post mortem. Trata-se de um grupo de doentes com manifestaes clnicas particularmente graves, pelo que a probabilidade de se chegar a um diagnstico deveria ser significativa. A elevada taxa de dfices da CRM encontrados pode ser consequncia da primeira, isto da gravidade dos quadros clnicos, com um potencial de alteraes secundrias impossvel de calcular. O facto de em muitos doentes ter sido feito estudo de mais do que um tecido (msculo esqueltico, fgado e/ou miocrdio), sendo valorizado o valor mais baixo de actividade enzimtica encontrado em qualquer deles, contribuiu igualmente para o elevado nmero de diagnsticos de DCRM. Se o estudo enzimtico se tivesse limitado aos complexos I, II, III e IV no msculo, como acontece na maior parte das sries, o nmero de diagnsticos de DCRM definida seria de 91 e no 95. Inversamente, se tivessem sido usadas as actividades dos segmentos I+III e II+III no diagnstico enzimtico, mais cinco doentes seriam integrados no grupo das DCRM definidas. Do mesmo modo, se o resultado do estudo enzimtico da CRM em linfcitos tivesse sido includo no diagnstico, acrescentarse-ia ao grupo de DCRM definida mais oito novos casos: quatro crianas em que um dfice major em linfcitos no foi verificado no msculo e outras quatro nas quais o dfice minor do mesmo complexo em dois tecidos (linfcitos e outro) constituiria critrio major de diagnstico. Uma das crticas que pode fazer-se classificao adoptada neste estudo a de que mesmo uma clnica muito inespecfica pode pontuar e facilmente levar a um diagnstico definido desde que haja alterao funcional da CRM, que pode ser secundria. Em apenas 13 crianas se associaram critrios majores clnicos e critrios majores laboratoriais e s em cinco destas se identificou coexistncia de dois critrios majores laboratoriais. De facto, em 80 das 95 crianas com DCRM definida que apresentaram apenas critrios clnicos minor (19 das quais cumpriam apenas um critrio clnico) o nico critrio major que suportou o diagnstico foi o dfice enzimtico major da CRM em todos os casos, excepto num. Uma proporo no desprezvel (17) das 80 crianas acima referidas teve um outro diagnstico etiolgico, pelo que foram consideradas DCRM definidas
secundrias. no entanto impossvel negar que entre os doentes com o diagnstico de 190
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DCRM definida primria haja mais casos secundrios, porventura no identificados como tal. Observaram-se critrios clnicos major em apenas 18 dos nossos doentes, o que representa menos de 10% da amostra total. Este facto reflecte por um lado a raridade com que na criana se observam as sndromes mitocondriais clssicas, habitualmente associadas a alteraes do mtDNA. Por outro, o elevado ndice de suspeio levou investigao de muitos doentes apenas com base em sinais clnicos e laboratoriais inespecficos, por vezes em situaes extremas, como j referido. De entre os casos com encefalopatia clinicamente completa, a sndrome mais frequente foi a de Leigh, como habitual nas sries peditricas. Apesar de muitas crianas apresentarem epilepsia no incio ou durante a evoluo, no foi registado nenhum diagnstico de sndrome de Alpers, isto , com os critrios electroencefalogrficos clssicos e insuficincia heptica, pelo que o gene POLG1 no tinha sido investigado em nenhum doente at ao fim do perodo do estudo. Na nica criana com demonstrao de alterao da comunicao intergenmica (mutao no gene DGUOK), o quadro era o de insuficincia heptica predominante. Nesta, a suspeita inicial de dfice de -1-antitripsina (com padro electrofortico tpico e demonstrao de grnulos de -1-antiprisina na histologia heptica) foi abandonada face ao envolvimento neurolgico (hipotonia) e hiperlactacidmia que levaram suspeita de DCRM. Este caso ilustra bem as questes de diagnstico diferencial colocadas nestes doentes. O primeiro doente desta srie com DCRM definida, cujos resultados do estudo enzimtico foram confirmados pelo grupo de A. Munnich, teve um quadro compatvel com encefalopatia mitocondrial letal infantil. A criana com sndrome de Pearson apresentou-se como anemia grave e acidose lctica ao nascimento e teve uma evoluo tpica. Pelo contrrio, a doente de LHON atpica no s pelas alteraes neurolgicas associadas atrofia ptica como sobretudo pela precocidade da apresentao clnica e por se tratar de uma menina (Grazina et al., 2007). Nas doentes com clnica sugestiva de MELAS e de NARP no foram identificadas as mutaes tpicas no mtDNA. Finalmente, quatro crianas preencheram os critrios de citopatia mitocondrial estabelecidos por Bernier. Um dos referidos critrios a excluso de outras possveis causas metablicas e no metablicas para o quadro clnico, o que levanta a pertinente questo de o qu e at onde investigar em cada caso. Na presente srie, as alteraes neurolgicas predominaram entre os critrios clnicos minor. As manifestaes oftalmolgicas (mormente a deficincia da motilidade extraocular) e musculares foram tambm frequentes, corroborando a designao de encefalomiopatias classicamente atribuda s DCRM. Entre as alteraes neurolgicas, destaca-se o atraso de desenvolvimento psicomotor, a hipotonia e a epilepsia, sintomas inespecficos e que implicam diagnsticos diferenciais muito vastos. Em 12 das nossas 20 crianas com doena do espectro autista e hiperlactacidmia foi diagnosticada DCRM definida com base em dfices funcionais major 191
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da CRM em msculo. Um subgrupo destes doentes foi objecto de publicao (Oliveira et al., 2005). Os dfices energticos cursam frequentemente com clnica pr-natal, nomeadamente restrio de crescimento intra-uterino e malformaes (Cormier-Daire et al., 1996; Castro-Gago et al., 1999; Saada et al., 2007). Um quarto dos doentes da nossa srie (50 crianas) tinha tido manifestaes clnicas ante-natais, com predomnio do atraso de crescimento intra-uterino. Este, presente em 26 crianas, constituiu um critrio clnico minor includo no grupo das alteraes nutricionais. Neste grupo de critrios de diagnstico destacou-se tambm pela sua frequncia o atraso de crescimento ps-natal. Assim, cerca de metade das crianas da nossa amostra (92 casos) pontuaram um critrio nutricional (clnico, minor). O envolvimento heptico, traduzindo-se por insuficincia heptica com esteatose/ cirrose e o cardaco, nomeadamente miocardiopatia e arritmias so relativamente frequentes nas DCRM, mormente na criana (Munnich et al., 2001; Garcia-Cazorla al., 2006). Mesmo na ausncia de manifestaes clnicas evidentes, a avaliao da funo heptica e cardaca deve fazer parte do rastreio multissistmico na caracterizao destas doenas (Munnich et al., 2001; Bindoff, 2006; Towbin, 2006). Em 30 das nossas crianas foram registadas alteraes hepticas, 10 na apresentao (quatro das quais com insuficincia) e as restantes no decurso da evoluo. Duas cumpriam critrios clnicos major (uma com sndrome de depleo e outra com doena multissistmica). Vinte e duas crianas investigadas tinham atingimento cardaco. Em 11 havia manifestaes cardacas no incio do quadro clnico, nomeadamente miocardiopatia e arritmia. A sndrome de Fanconi total ou parcial, a sndrome nefrtica e a nefropatia tubulointersticial tm sido descritos em crianas com DCRM (Rotig e Niaudet, 2006). Especificamente, a nefropatia pode ser uma forma de apresentao do dfice em CoQ (Diomedi-Camassei et al., 2007). Na nossa srie de doentes, a tubulopatia proximal foi o critrio minor renal mais frequentemente invocado (sete casos). A doente com sndrome nefrtica submetida a transplante renal (que se apresentou como atraso de
desenvolvimento psicomotor e epilepsia) desenvolveu miocardiopatia hipertrfica. Teve o diagnstico de DCRM definida primria, uma vez que tinha um critrio clnico major (doena multissistmica, curso clnico progressivo e excluso de outras causas) e trs critrios minores laboratoriais (hiperlactacidmia, dfice minor enzimtico da CRM em msculo e uma deleco do mtDNA de patogenicidade no comprovada). Atendendo ao quadro clnico, est em curso o doseamento da CoQ em fibroblastos. As alteraes endcrinas estiveram pouco representadas nas nossas crianas,
provavelmente devido sua baixa faixa etria. A diabetes mellitus, a endocrinopatia que leva mais vezes suspeita de DCRM, est frequentemente associada a mutaes do mtDNA, manifestando-se clinicamente no adulto jovem (Yialamas et al., 2006). 192
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As alteraes dermatolgicas, registadas em 10 das nossas crianas (sete e trs casos com os diagnsticos de DCRM provvel e de DCRM definida primrias, respectivamente) limitaram-se acrocianose e hipertricose. O grupo de A. Munnich valoriza outras manifestaes como tricotiodistrofia e pigmentao anormal em reas expostas luz entre outras, que no foram detectadas na nossa amostra (Bodemer et al., 1999; Munnich, 2001). Em trs casos ocorreu morte sbita. Num deles (que preencheu critrios de DCRM improvvel) foi diagnosticado pneumonia e golpe de calor. Nos outros dois, um com atraso ponderal e histria de um irmo tambm falecido inesperadamente foi
considerado sofre de DCRM provvel primria e o outro, sem doena prvia, teria DCRM improvvel. Em ambos os casos primrios foi excluda a sndrome do QT longo, no tendo sido feito estudo histolgico ou da CRM do miocrdio. Na classificao diagnstica adoptada a morte inexplicada est prevista como critrio de diagnstico quando no caso ndex se se tratar de um nado-morto com pobreza de movimentos intra-uterinos ou se ocorrer no perodo neonatal (Bernier et al., 2002). Deste modo, o caso de DCRM improvvel primria (morte sbita aos 4 anos de idade, sem doena prvia) no preencheu qualquer critrio de diagnstico clnico ou laboratorial. A hiperlactacidmia verificada logo aps a reanimao da paragem cardaca, no se manteve durante o perodo de morte cerebral subsequente, pelo que no foi valorizada como critrio diagnstico. Na classificao de Nijmegen, a morte sbita e inesperada no valorizada como critrio de diagnstico, excepto quando ocorre em familiares no perodo neonatal ou na infncia. O dfice do complexo I com alteraes morfolgicas mitocondriais cardacas (Thorburn, 2006 comunicao pessoal) e a presena de mutaes do mtDNA (Opdal et al., 1999; DiMauro e Schon, 2006) foram associados morte sbita, o que a indicia como um possvel critrio clnico diagnstico de DCRM. Os dados da imagem cerebral, nomeadamente da RMN e da
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HRMS, so mais
valorizados na classificao de Nijmegen do que na do grupo de Melbourne, como j referido. Neste inclui-se apenas a leucodistrofia como critrio neurolgico minor e os picos de lactato na espectroscopia como critrio metablico minor. A anlise dos resultados da RMN cerebral das nossas crianas com DCRM vai ser publicada na Pediatric Neurology. No que diz respeito aos critrios laboratoriais, destaca-se na nossa srie o elevado nmero de dfices enzimticos da CRM (como j referido) e de casos com alteraes metablicas e a pobreza de alteraes histolgicas, mesmo em microscopia electrnica. Atrs fez-se referncia inespecificidade da elevao do lactato, alanina e/ou prolina, que pontuam como critrio metablico minor na escala usada, mesmo se s pontualmente observada. Pelo contrrio, o grupo de Nijmegen valoriza, neste contexto, a persistncia da elevao do lactato (em trs ou mais determinaes) e o aumento do
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ratio lactato/piruvato, tradutor da acumulao de NADH e FADH2 (ver em Mtodos, tabela 5, pgina 78-81). Embora valorizados como indicador de DCRM por alguns grupos, como o de A. Munnich (Munnich, 2006), os corpos cetnicos no figuram como critrio de diagnstico em nenhuma escala diagnstica publicada. No nosso grupo de crianas no foi possvel demonstrar para a cetonmia um valor indicativo de DCRM, como j referido. Tambm num estudo prospectivo do grupo de Nijmegen, o nvel e o ratio dos corpos cetnicos plasmticos ps-prandiais foram semelhantes nos casos com e sem dfice da funo oxidativa em bipsia de msculo (Rubio-Gozalbo et al., 2000b). O estudo histolgico dos doentes desta srie revelou-se particularmente pobre, com anteriormente discutido. Na escala adoptada, s a presena de RRF em mais de 2% das fibras constitui critrio major, o que se verificou em apenas dois casos, ambos com alteraes do mtDNA. As alteraes mitocondriais difusas em microscopia electrnica em qualquer tecido constituem apenas critrio minor, uma vez que podem estar
secundariamente associadas a grande nmero de outros processos patolgicos. Apesar disso, aquelas alteraes verificaram-se em apenas cinco das 90 amostras de msculo investigadas nos nossos doentes. Por outro lado, as amostras de fgado e miocrdio dos nossos doentes no foram objecto de observao em microscopia electrnica. Nas oito crianas com DCRM definida primria e alterao patognica do mtDNA e/ou do nDNA, o estudo funcional da CRM no msculo, realizado em sete, foi normal em trs. Nos 77 doentes com DCRM definida primria que fizeram estudo enzimtico da CRM, em 71 casos o dfice de um ou mais complexos da CRM foi o nico critrio major (e portanto determinante do diagnstico de DCRM). O facto de grande parte dos diagnsticos de DCRM definida dos nossos doentes terem sido baseados em dfices enzimticos da CRM, levou reavaliao do seu diagnstico. Sem entrar em linha de conta com os estudos molecular e enzimtico, comparou-se os novos graus de diagnstico assim obtidos com o resultado da classificao segundo os critrios gerais de Nijmegen. Em 83 dos 200 doentes, o nvel de diagnstico seria semelhante. Dos restantes, muito mais crianas atingiriam um nvel superior em um ou dois pontos (81 e 10 casos, respectivamente) com a classificao de Nijmegen do que com a de Bernier adaptada, o que atesta a segurana dos argumentos clnicolaboratoriais em presena. Do ponto de vista clnico e laboratorial geral, isto , excluindo a espectrofotometria da CRM e o estudo gentico, o nosso grupo de doentes assim mais valorizado como tendo quadros clnicos sugestivos de DCRM na classificao de Nijmegen. Poder-se- concluir que, apesar de o dfice da actividade enzimtica da CRM ser o critrio major que determinou o diagnstico de DCRM definida na maior parte dos casos, os outros parmetros, quando avaliados separadamente, corroboram os
resultados do estudo enzimtico realizado.
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O diagnstico de DCRM baseou-se assim na clnica e no estudo bioqumico da CRM, tal como seria de esperar numa populao peditrica em que a maioria das DCRM se deve a alteraes do nDNA (Rubio-Gozzalbo et al., 2000a). No entanto, a origem primria dos critrios clnicos, morfolgicos e enzimticos incerta na maior parte dos casos. A valorizao diagnstica de alteraes do mtDNA implica o cumprimento de critrios de patogenicidade bem estabelecidos, embora a heteroplasmia conte com vrias excepes (Cortopassi e Arnheim 1990; Chinnery et al 2000; Chinnery e Schon 2003). Na criana, ao contrrio do idoso, a possibilidade de modificaes secundrias do mtDNA remota, excepto quando devidas a perturbao da comunicao intergenmica. Esta traduz-se em deleces/ rearranjos mltiplos ou diminuio do nmero de cpias do mtDNA (Alberio et al., 2007).
6.2.2
O grupo dos doentes com doena mitocondrial definida
Noventa e cinco das 200 crianas cumpriam critrios de DCRM definida. Em 78 destas no se encontrou outra causa que explicasse a situao clnica, pelo que se considerou que sofriam de doena primria da CRM. Este grupo foi objecto de publicao (Diogo et al., 2009), conforme transcrito em Anexos (pginas 283 a 288). Um dos propsitos desta reviso foi procurar sinais e sintomas caractersticos de DCRM na criana diferentes dos usados como critrios de diagnstico e que pudessem vir a refor-lo e contribuir para o diagnstico diferencial. Nenhum dos parmetros clnicos ou laboratoriais analisados cumpriu aquele requisito. As manifestaes clnicas muito precoces verificaram-se tanto no conjunto das 200 crianas como no grupo das 78 com DCRM definida primria. A mesma distribuio etria da apresentao das DCRM na criana foi constatada por outros grupos (Naviaux, 2004). No se encontrou correlao entre a idade de incio e o diagnstico final (grau de certeza de DCRM e primrio ou secundrio). Ao contrrio das outras DHM (que vo no entanto sendo cada vez mais diagnosticadas tambm na idade adulta) as DCRM, inicialmente conhecidas como doenas do adulto jovem, revelam-se tanto no adulto como na criana (Skladal et al., 2003). Relativamente aos antecedentes pessoais e familiares tambm no se identificaram caractersticas distintivas de DCRM. As primeiras manifestaes clnicas das DCRM so ocasionalmente pr-natais. As complicaes gravdicas do grupo da eclmpsia poderiam ser uma manifestao de DCRM, pelo menos em algumas famlias, ou consequncia de um defeito fetal e placentar da oxidao dos cidos gordos (Torbergsen et al., 1989; Rakheja et al., 2002; Racine et al., 2004). No entanto, aquelas complicaes no foram mais frequentes nas crianas com DCRM. Ao contrrio do expectvel, houve maior incidncia de abortamentos/mortes fetais no grupo sem DCRM definida primria e foi semelhante a proporo de mortes inesperadas em familiares. 195
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O que sobressai nesta investigao a inespecifidade da clnica de apresentao e de evoluo das DCRM na criana, tal como foi documentado pela inexistncia, nos parmetros analisados, de diferenas estatisticamente significativas entre os grupos de doentes com e sem DCRM definida primria e entre os grupos de crianas com DCRM definida primria e com DCRM possvel/improvvel primria.
6.2.3
Doenas da cadeia respiratria mitocondrial secundrias
O diagnstico de DCRM definida pela classificao de Bernier no permite distinguir os casos primrios dos secundrios, seno quando se identifica a alterao do DNA subjacente. No entanto, h a salvaguarda da necessidade de excluir todas as outras causas possveis para que se possa valorizar como critrio major a existncia de uma doena multissistmica, progressiva ou com histria familiar materna positiva. Apenas 38 dos 200 doentes da nossa srie (19%) tiveram outro diagnstico, nmero baixo, mas esperado, dada a seleco feita. De facto, s foram includos os casos com suspeita de DCRM que justificaram a investigao em tecidos de bipsia ou post mortem. Cerca de dois teros (78) dos 116 doentes com uma causa identificada tiveram o diagnstico final de DCRM primria. Quase metade (17) das 38 crianas com um outro diagnstico etiolgico apresentou um critrio laboratorial major (enzimtico da CRM e /ou histolgico), sendo classificada como DCRM definida secundria. Este ltimo grupo correspondeu a 18% dos 95 casos de DCRM definida. Numa proporo considervel (42%) dos nossos doentes no se chegou a um diagnstico etiolgico, pelo que se levanta a questo de saber se a investigao etiolgica foi suficientemente exaustiva, nomeadamente no que se refere a outras causas possveis para os quadros clnicos particulares. Pode sempre conjecturar-se que se podia ter ido mais alm na investigao etiolgica, nomeadamente no estudo do caritipo, para o qual se dispe actualmente de tcnicas mais sensveis. A investigao foi, no entanto, bastante alargada, mormente nos casos de evoluo fatal. Em face da multiplicidade e importncia funcional da mitocndria, de esperar que os mecanismos patognicos de variadssimas doenas englobem uma disfuno da via comum final da produo de energia, ainda mal elucidada (Marin-Garcia et al., 1996; Neilson et al., 2003; Enns et al., 2003; Ventura et al., 2005; Schwab et al., 2006). Tm sido descritos elevao do lactato, dfices enzimticos da CRM e /ou alteraes mitocondriais morfolgicas em inmeras patologias (Jongpiputvanich et al., 2005; Hui et al., 2006; Schwab et al., 2006). A taxa elevada do lactato, constatada numa grande percentagem das crianas desta srie, pode ser devida a outras doenas hereditrias do metabolismo, que no tero sido investigadas exaustivamente. o caso do dfice da biotinidase e do da piruvato-desidrogenase que deveriam ter sido especificamente investigadas mais vezes, em face do elevado nmero de casos com doena neurolgica e 196
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hiperlactacidmia (Mitchell et al., 1986; Zeviani et al., 1996; Hui et al., 2006). A valorizao diagnstica de hiperlactacidmia por vezes difcil, quer num contexto de doena grave associada a hipoperfuso de qualquer etiologia, quer em muitas doenas crnicas, nomeadamente neurolgicas, em que a origem da elevao do lactato no clara (Duke, 1999; Kang et al., 2001). Dfices enzimticos da CRM em muitas doenas hereditrias do metabolismo e outras tm sido objecto de reflexo (Martinez Bermejo et al., 1994; Hui et al., 2006; Enns, 2003). Em quatro das 12 crianas da nossa srie com doenas hereditrias do metabolismo foi identificado um dfice da CRM. As doenas da glicosilao das protenas so patologias multissistmicas que implicam um diagnstico diferencial com as DCRM (Briones et al., 2001, Hui et al., 2006). Uma vez que cerca de metade das protenas do organismo humano so glicosiladas, admissvel que um defeito na glicosilao possa interferir na funo de um ou mais complexos enzimticos da CRM. Nos dois doentes com aquele dfice, o estudo funcional da CRM em tecidos, realizado antes do da transferrina deficiente em carbohidratos, (anlise s disponvel na segunda metade do perodo de estudo) mostrou dfice major da CRM. Nas DCRM pode haver dfice secundrio da -oxidao dos cidos gordos devido acumulao de cofactores reduzidos, NADH e FADH2, demonstrvel pela acidria orgnica e/ou perfil de acilcarnitinas caractersticos. Inversamente, tm sido descritos dfices secundrios da CRM nas doenas da -oxidao dos cidos gordos (Hui et al., 2006; Sim et al., 2002). Foi documentado que os steres de acil-CoA de cadeia longa inibem a sntese de ATP e o consumo de oxignio por obstruo ao transporte de succinato (Ventura et al., 2005). Num dos nossos casos com o diagnstico de MADD, por dfice da flavoprotena transportadora de electres, a CRM em mitocndrias isoladas de msculo foi normal. Contudo, num outro doente, com MADD por deficincia da oxidoreductase da flavoprotena transportadora de electres ubiquinona, a presena de dfices major da CRM em mitocndrias de msculo (complexos III, IV e V) pode ter contribudo para a maior gravidade do quadro clnico, de incio mais precoce e evoluo fatal. Situaes semelhantes foram reportadas por outros autores (Olsen et al., 2007), que descreveram dfices secundrios da CRM associados MADD por dfice da oxidoreductase, com resposta positiva riboflavina, o que no se verificou no nosso doente. A criana com o diagnstico final de LCHADD apresentou uma doena multissistmica grave de evoluo rapidamente fatal, pelo que foi submetida a investigao de DCRM. Com o alargamento do rastreio neonatal em Portugal a partir de 2005, que engloba actualmente grande parte dos defeitos da oxidao dos cidos gordos (http://www.diagnosticoprecoce.org/), a investigao diagnstica destes doentes mais rpida e fcil e no inclui o estudo da CRM. A determinao do perfil de acilcarnitinas do sangue por MS/MS - tandem mass spectrometry (usado actualmente no rastreio neonatal) faz agora parte dos estudos a realizar antes de mtodos mais invasivos como a bipsia. Para alm da sua utilidade no 197
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diagnstico diferencial, pode mostrar alteraes dos cidos orgnicos indicativas de patologia mitocondrial. Dfices enzimticos da CRM, transformaes morfolgicas mitocondriais e/ou
alteraes do mtDNA tm sido demonstrados em vrias miopatias e neuropatias (Wiedemann et al., 1998; Berger et al., 2003; Jongpiputvanich et al., 2005; Vondracek et al., 2007). Por sua vez, as DCRM podem traduzir-se clinicamente por quadros que simulam outras doenas neuromusculares, pelo menos durante uma parte da sua evoluo (Rubio-Gozalbo et al., 1999; Lee et al., 2007). Nas nossas duas crianas com doena de Pompe juvenil, o estudo funcional da CRM em msculo foi normal. A microscopia electrnica do msculo mostrou alteraes mitocondriais, a par da acumulao lisossmica de glicognio, na criana com clnica mais grave e mais precoce. Nesta doente houve alguma dificuldade diagnstica, j que a actividade da -glicosidase foi normal nos leuccitos, vindo a revelar-se deficitria nos fibroblastos. Na criana com distrofia muscular de Ullrich, confirmada mais tarde por estudo molecular, o diagnstico inicial de miopatia mitocondrial foi baseado na identificao de dfices mltiplos major da CRM (III, I+III, IV e V) em homogeneizado de msculo. Curiosamente, foi documentada uma diminuio do limiar de abertura do poro mitocondrial de permeabilidade transitria (mitochondrial permeability transition pore) com aumento da ocorrncia de apoptose nos mioblastos de doentes com distrofia muscular de Ullrich, pondo em evidncia a disfuno mitocondrial e abrindo caminho para novas abordagens teraputicas (Angelin et al., 2008). Em sete dos 10 casos da nossa srie com infeco (viral em nove) foi demonstrado dfice funcional da CRM. Embora as manifestaes clnicas e a evoluo destes doentes se possam atribuir infeco, no pode ser excluda a hiptese de haver um dfice mitocondrial funcional subjacente, agravado pela infeco. A existncia de uma DCRM revelada por uma infeco aparentemente banal poderia explicar a evoluo
inesperadamente desfavorvel que se verificou nestes doentes, oito dos quais faleceram. Na literatura consultada, no se encontrou resposta clara a estas questes. As DCRM poderiam manifestar-se por dfice imunitrio, tal como decorre da neutropenia nas sndromes de Pearson e de Barth (Finsterer, 2007). Foi descrito um caso de depleo do mtDNA associado a imunodeficincia dos linfcitos T (Reichenbach et al., 2006). Por outro lado, as infeces virais podem alterar o funcionamento mitocondrial normal, nomeadamente os processos de fisso e fuso, tal como foi demonstrado na infeco a citomegalovrus (McCormick et al.,2003). O transportador ADP/ATP poderia desempenhar o papel de auto-antignio em certas miocardites e miocardiopatias dilatadas associadas a infeces virais. A disfuno do transportador de nucletidos induzida pela infeco viral seria responsvel pela alterao da funo cardaca desses casos (Schulze e Schultheiss, 1995). A sepsis cursa com hipoxia tissular e excesso de produo de xido ntrico, inibidor da respirao mitocondrial in vitro. Baixas concentraes de ATP muscular foram 198
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associadas a mau prognstico em doentes com sepsis (Brealey et al., 2002). Por outro lado, foi demonstrado um dfice do complexo IV em ratos com sepsis induzida e, em consequncia, proposta a administrao de citocromo c como teraputica (Levy et Deutschman, 2007). A nica criana da nossa srie com sepsis documentada era um recm-nascido de termo com parto por cesariana por apresentao plvica, sem asfixia, que se apresentou no primeiro dia de vida com hipotonia generalizada e hipoglicmia. Evoluiu com falncia multiorgnica com acidose lctica persistente e multi-enfartes cerebrais, falecendo aos 13 dias de vida. Foram isolados Enteroco Faecalis e Enterobacter species na hemocultura e documentado dfice da CRM no fgado e no miocrdio (generalizado e mltiplo, respectivamente), mas no no msculo. Assumiram-se as alteraes da CRM como secundrias infeco, uma vez que aqueles dois germens, muitas vezes encontrados em associao, so causa de sepsis neonatal grave (Gupta et al., 2005; Martnez -Odriozola et al., 2007; Mullane, 2007). No entanto, como neste recm-nascido no havia factores de risco conhecidos para a colonizao com estas espcies bacterianas, pode-se especular sobre a existncia de um dfice da CRM subjacente agravante do prognstico (Benca et al., 2007; Hufnagel et al., 2007). A sndrome de Shwachman-Diamond, que se manifesta por insuficincia pancretica excrina, neutropenia ou pancitopenia e displasia esqueltica com baixa estatura, pe problemas de diagnstico diferencial com as DCRM, tal como aconteceu com a nossa doente, investigada inicialmente por suspeita de sndrome de Pearson. No se encontrou na literatura qualquer referncia associao entre DCRM ou disfuno mitocondrial e a sndrome de Shwachman-Diamond, de resto tambm no identificada na nossa doente (Shimamura, 2006; Costa et al., 2007).
6.2.4
Factores de possvel interferncia no diagnstico
Na interpretao do diagnstico final das crianas desta srie h outros factores a ter em conta, para alm da possibilidade de uma doena subjacente com alteraes mitocondriais secundrias, a saber: a medicao a que o doente estava submetido aquando da bipsia, o possvel efeito da anestesia usada para a sua realizao e o intervalo de tempo entre a colheita e o processamento, as circunstncias de
armazenamento e as condies de transporte da(s) amostra(s) biolgica(s). No caso de colheitas post mortem, as possveis alteraes decorrentes do estado agnico e da morte so tambm de considerar. A leso mitocondrial induzida por frmacos comum e poderia explicar muitos dos seus efeitos adversos (Brinkman et al., 1999; Fosslien, 2001; Arenas e Martn, 2003; Neustadt e Pieczenik, 2008). Quase metade (46,5%) das crianas deste estudo estava medicada, em politerapia na maior parte dos casos (75%). Foi verificada a medicao usada pelos doentes aquando da colheita de tecidos e a sua eventual influncia no 199
Captulo 6 Discusso
diagnstico
final
atravs
da
possvel
interferncia
nos
critrios
de
diagnstico
laboratoriais, nomeadamente a hiperlactacidmia e os dfices funcionais da CRM. O paracetamol uma causa importante de insuficincia heptica induzida por frmacos (William, 2004). transformado pelo citocromo P450 num metabolito txico no fgado que se conjuga com o glutatio, sendo excretado na urina. Em caso de intoxicao, ocorre uma depleo heptica do glutatio, com acumulao de ROS e diminuio da respirao mitocondrial (Dong et al., 2000; Jaeschke e Bajt, 2006). A criana falecida com insuficincia heptica aguda por intoxicao com paracetamol aos 9 meses de idade tinha aumento da actividade da citrato sintase e do complexo III e diminuio severa da actividade dos complexos I, II, IV e V em amostra de fgado colhida imediatamente aps a morte. A existncia de depleo do mtDNA subjacente, no excluda durante o perodo do estudo, dificilmente explicaria o dfice acentuado da actividade do complexo II (Sarzi et al., 2007). Muitos dos nossos doentes estavam sob teraputica anticonvulsivante aquando do estudo. O valproato de sdio foi objecto de particular ateno pela generalizao do seu uso e pela conhecida interferncia com o metabolismo mitocondrial, nomeadamente a nvel da CRM (Lus et al., 2007). O cido valprico e os seus metabolitos inibem a oxidao dos cidos gordos no fgado (Coulter DL, 1984; Baillie, 1992; Van Wouwe, 1995; Fromenty et Pessayre, 1997; Lam et al 1997; Delarue et al., 2000; Silva et al., 2001; Chitturi e George, 2002; Eyer et al., 2005; Knaap et al., 2008). A administrao aguda ou crnica de doses elevadas de valproato em ratos foi associada a deficincia da CRM (Rumbach et al., 1983; Ponchaut et al., 1992). A medicao com valproato pode estar na origem de citopatia mitocondrial com deposio lipdica microvesicular no msculo e alteraes mitocondriais estruturais (Kimura et al., 1989; Melegh e Trombits, 1997). As DCRM so em princpio uma contra-indicao para o uso de valproato, frmaco que pode desencadear uma evoluo fatal em alguns casos. semelhana das doenas do ciclo da ureia, as doenas do metabolismo energtico mitocondrial, como os dfices da oxidao dos cidos gordos ou da CRM, e em particular a sndrome de Alpers, devem ser consideradas um factor de risco para a insuficincia heptica induzida pelo valproato (Bicknese et al.1992; Leo, 1995; Delarue et al., 2000; Krhenbhl et al., 2000; Gordon, 2006). Ao contrrio do expectvel, o subgrupo das 45 crianas medicadas com anticonvulsivantes, e em particular o das 27 sob valproato, no teve acidria orgnica, hiperlactacidmia, hiperalaninmia, hiperprolinmia, dfices dos complexos da CRM (I no msculo, IV no msculo, I a V no msculo, I a V fgado e I a V no total dos tecidos)] ou diagnstico de DCRM definida com maior frequncia do que as restantes. Do mesmo modo, e ao contrrio do que seria de esperar, no se detectou maior frequncia de acidria orgnica nos doentes investigados sob teraputica com valproato. A risperidona foi o mais usado dos antipsicticos na nossa srie. Este grupo de frmacos inibe o complexo I da CRM, o que estaria relacionado com os sintomas 200
Captulo 6 Discusso
extrapiramidais secundrios (Maurer e Moller, 1997; Balijepalli et al., 2001; Sim et al, 2002; Modica-Napolitano et al., 2003; Casedemont et al., 2007). No entanto, no se verificou correlao com significado estatstico entre o uso da risperidona e o dfice do complexo I ou da CRM em geral neste grupo de doentes. No pode descartar-se a hiptese de que em algum caso individual o dfice do complexo I seja atribuvel aos neurolpticos. A associao entre a toma de antipsicticos e a ausncia de acidria orgnica pode dever-se ao facto de no subgrupo de doentes sob antipsicticos haver predominantemente manifestaes neurolgicas crnicas sem envolvimento sistmico. Vrios antibiticos tm sido associados a toxicidade mitocondrial, nomeadamente sobre tecidos especficos (como por exemplo das cefalosporinas sobre o crtex renal) ou quando usados em altas concentraes (no caso das fluoroquinolonas e dos macrlidos) (Tune et al., 1988; Duewelhenke et al., 2007). A toxicidade dos aminoglicosdeos em indivduos com a mutao A1555G do mtDNA (que altera a subunidade 12S do mtRNA ribosmico) devida possvel interaco daqueles frmacos com a CRM a relao mais conhecida. A referida mutao associa-se a surdez no sindrmica, nomeadamente a induzida pelos antibiticos aminoglicosdeos (Estivill et al., 1998). No conjunto das nossas crianas, todos os casos de surdez neurosensorial (11) eram sindrmicos, pelo que no se considerou pertinente analisar uma eventual correlao com histria de medicao com aminoglicosdeos. Na nossa srie os antibiticos foram usados no contexto de tratamento intensivo, em situaes que colocavam diagnstico diferencial com sepsis. De um modo geral, tratou-se de politerapia, incluindo cefalosporinas de terceira gerao e aminoglicosdeos. No foi demonstrada correlao entre o uso de antibiticos aquando da colheita de tecidos e sinais directos ou indirectos de alterao da CRM, excepto no que se refere acidria orgnica. De facto, esta foi mais frequente quando se usaram antibiticos ou se associaram trs ou mais frmacos, o que poder estar de acordo com a gravidade e o carcter multissistmico dos respectivos quadros clnicos. Os cidos orgnicos urinrios foram analisados em 14 dos 19 doentes sob antibioterapia, tendo sido anormais em cinco, com lactato, cidos dicarboxlicos e/ou intermedirios do ciclo de Krebs, isto , sugestivos de um distrbio mitocondrial funcional, em quatro. A associao da toma de qualquer dos frmacos analisados com o dfice da CRM e com o diagnstico de DCRM definida e a correlao entre o uso de trs ou mais medicamentos e o diagnstico de DCRM definida, presena de cidos orgnicos anormais ou de hiperprolinmia, poderia dever-se gravidade dos quadros clnicos destes doentes, decorrentes da disfuno mitocondrial subjacente. No entanto, embora no se tivesse conseguido demonstrar correlao entre aquelas alteraes e grupos especficos de frmacos, no se pode excluir que sejam secundrias. O facto de no ter havido relao entre a medicao e o carcter primrio ou secundrio da DCRM definida ou a presena de dfices enzimticos da CRM diminui aquela probabilidade. 201
Captulo 6 Discusso
Foi avaliado o possvel efeito da anestesia a que os doentes foram submetidos para a realizao da bipsia. A aco dos anestsicos, tanto locais como gerais, sobre a CRM tem sido objecto de numerosas publicaes. (Chazotte e Vanderkooi, 1981; Mir et al., 1999a; Kam e Cardone, 2007 ). Os anestsicos locais so usados na execuo de bipsias musculares em muitos hospitais, sobretudo de adultos. Os nossos doentes foram submetidos a anestesia geral, como referido em Material e Mtodos (pgina 69). Num estudo prospectivo em humanos foi demonstrada inibio da oxidao mitocondrial de vrios substratos pelos anestsicos gerais em msculo (Mir et al., 1999a). Os anestsicos volteis como o halotano, os barbitricos e o propofol inibem a CRM ao nvel do complexo I, tal como foi documentado em estudos animais, usando frequentemente doses supra-teraputicas (Hanley et al., 2002; Marik, 2004; Ohlson et al., 2004). O propofol foi recentemente associado a dfice da COX, da citrato sintase e da oxidao dos cidos gordos (Fodale e La Monaca, 2008). A sndrome do propofol (bradicardia com assistolia e um ou mais: acidose metablica, rabdomilise, hiperlipidmia e
hepatomeglia ou fgado gordo), que tem sido associada a infuso com doses elevadas e durante tempos muito prolongados daquele anestsico geral, uma complicao rara, potencialmente fatal e mais frequente em crianas. Seria devida diminuio do potencial de membrana com alterao do transporte dos electres atravs da membrana interna da mitocndria (Marik, 2004; Kam e Cardone, 2007). No entanto no previsvel que as baixas doses de propofol habitualmente usadas em anestesia durante curtos intervalos de tempo, como ocorreu nos doentes desta srie, tenham um efeito significativo sobre a CRM. Todas estas crianas foram submetidas a anestesia geral, tal como os indivduos que serviram como controlos normais do Laboratrio. Admite-se por isso que a possvel interferncia dos frmacos usados na anestesia geral, embora reconhecida e no controlvel, tenha sido mitigada pela universalidade do seu uso nestas circunstncias.
As colheitas de tecidos in vivo ocorreram mais frequentemente de um modo programado, com sesso cirrgica prpria, do que aproveitando o tempo anestsico de outra cirurgia de que o doente necessitasse. A proporo de casos com outro diagnstico foi maior nas colheitas programadas do que nas oportunistas, talvez devido a morbilidade mais acentuada (e portanto maior probabilidade de se encontrar um nexo causal) no grupo de doentes em que houve argumentos clnicos suficientes para programar a bipsia em tempo cirrgico prprio. A associao entre colheita programada e DCRM definida e definida primria, dfice da CRM no msculo e no total dos tecidos refora a convico de que a seleco dos doentes a submeter bipsia foi criteriosa. As condies de colheita, o intervalo de tempo at ao processamento laboratorial e as condies de armazenamento e de transporte so factores que devem ser bem controlados a fim de evitar falsos positivos. As amostras de msculo dos nossos doentes 202
Captulo 6 Discusso
destinadas a estudos a fresco foram imediatamente colocadas em meio adequado e transportadas para o Laboratrio, a 10 minutos de distncia do HP. As outras amostras foram imediatamente congeladas em neve carbnica no bloco operatrio e transportadas ao Laboratrio ou armazenadas em arca a -70C durante um ou dois dias. Enquanto a citrato sintase e os complexos I a IV se manteriam relativamente estveis a -70C por longos perodos, tal no aconteceria com os complexos V e os segmentos I+III e II+III, mais sensveis (Thorburn et al., 2004a). A maior frequncia de dfice enzimtico da CRM nas crianas com colheitas post mortem (eventualmente decorrente da gravidade inerente) deixa em aberto o papel das alteraes associadas morte. Em cerca de metade (48%) dos casos em que se efectuou os estudos com vista ao diagnstico diferencial em material colhido post mortem chegouse a um diagnstico diferente do de DCRM. Contudo, quando se utilizou material biolgico colhido in vivo, a percentagem de outros diagnsticos foi de apenas 14%. De facto, a gravidade da situao clnica (e no necessariamente a presena de sinais e sintomas muito sugestivos de DCRM) ditou a realizao do estudo mitocondrial em muitos daqueles doentes. As possveis alteraes mitocondriais encontradas nos tecidos colhidos post mortem, eventualmente decorrentes do estado agnico e da morte e a sua influncia no diagnstico final devem ser bem ponderadas. Thorburn analisou a actividade dos complexos I a IV da CRM e da citrato sintase de amostras de fgado colhidas entre 2,5 e 14 horas aps a morte e concluiu que os complexos II, II+III e III eram os que mostravam maior labilidade e que a actividade da citrato sintase se mantinha, mostrando os complexos I e IV uma vulnerabilidade intermdia (Thorburn et al., 2004a). Desse modo, quando uma amostra colhida post mortem mostra dfice isolado do complexo II ou do complexo III, as deficincias da CRM mais raras, poder-seia questionar a sua validade (Rustin e Rotig, 2002; Bnit et al., 2009). Nos nossos doentes, a anlise dos resultados da actividade enzimtica daqueles complexos (II e III) nos homogeneizados de msculo e de fgado no mostrou diferenas significativas entre as amostras de tecido colhidas in vivo e as colhidas post mortem, o que corrobora a hiptese do papel da gravidade clnica no diagnstico final.
203
Captulo 6 Discusso
204
Captulo 6 Discusso
6.3 As doenas mitocondriais na Regio Centro de Portugal

O HP o centro de referncia de nvel III para toda a Regio Centro do Pas. Funciona tambm como centro de nvel II para o distrito de Coimbra. A actual idade limite de admisso 13 anos, que substituiu os 11 anos a partir de 2001. Em caso de doena crnica, os doentes j seguidos so de um modo geral assistidos at aos 18 anos. Pode considerar-se que este estudo engloba praticamente todos os casos de suspeita de DCRM em crianas residentes na Regio Centro de Portugal, cuja doena se manifestou clinicamente at aos 10 anos de idade. Partindo desse pressuposto, foi feita uma estimativa da incidncia e da prevalncia das DCRM na rea de influncia do HP. Dada a especificidade das DCRM e considerando o facto de haver apenas dois Laboratrios com capacidade de resposta diagnstica na rea das DCRM em Portugal, compreensvel que cerca de um quarto (24%) dos doentes estudados seja proveniente de fora da zona centro. Excluindo as crianas nascidas fora da Regio Centro (16), os clculos epidemiolgicos basearam-se em 62 doentes. A incidncia de DCRM com manifestao clnica na primeira dcada de vida foi calculada como o quociente entre o nmero de crianas com DCRM e o nmero de nado-vivos na Regio Centro de Portugal no perodo de 1989-1996 (oito anos): 1/6490. Este intervalo foi escolhido de modo a que todos os doentes tivessem atingido os 10 anos de idade no fim do perodo de estudo. Os dois primeiros anos do perodo de estudo foram excludos por se considerar que no eram representativos da amostra, uma vez que os estudos mitocondriais estavam apenas a comear. Do mesmo modo, no foram obviamente includos na anlise os casos nascidos antes de 1996 com clnica na primeira dcada de vida, falecidos antes do incio do estudo. Pelas razes apontadas, esta estimativa da incidncia das DCRM na Regio Centro peca por defeito. A opo por intervalos de tempo mais recentes (e necessariamente mais curtos) conduziu a valores mais elevados para a incidncia: 1,8/10000 para o perodo entre 1991-1996 (6 anos) e 1,9/10000 para o perodo entre 1992 e 1996 (5 anos). A diferena traduz sem dvida a maior alerta para estas patologias e a capacidade diagnstica que se foi instalando ao longo do tempo. Apesar de se tratar de doenas potencialmente graves em qualquer idade, h uma relao inversa entre a idade de incio e a mortalidade, tal como foi demonstrado na nossa e em outras sries (Rubio-Gozalbo et al., 2000a; Debray et al., 2007b). Dada a elevada mortalidade na infncia, a prevalncia das DCRM abaixo dos 10 anos de idade muito inferior incidncia, tal como se verificou nesta srie. Constituindo um grupo de doenas muito variadas e de critrios de diagnstico mal definidos, os valores da incidncia e da prevalncia das DCRM so apenas estimativas. As revises epidemiolgicas publicadas nos ltimos anos apontam para uma incidncia das 205
Captulo 6 Discusso
DCRM entre 1:2000 e 1:5000 nado-vivos (Naviaux, 2004; Schaefer et al., 2004). O grupo de Melbourne estimou para a populao Australiana uma prevalncia das DCRM ao nascimento de 1:16129 na faixa etria abaixo dos 9-12 anos de idade e de 1:7634 na populao em geral. Os valores apontados para outras populaes diferem em funo do tipo de seleco dos doentes, dos critrios de diagnstico e do tipo de estudo em causa, sendo que a maioria retrospectivo (Uusimaa et al., 2000; Darin et al., 2001; Sciacco et al., 2001; Castro-Gago et al., 2006; Miles et al., 2006). Em comparao com outras sries peditricas, encontrou-se uma elevada incidncia de DCRM com manifestao clnica antes dos 10 anos de idade (1:6490). Na parte ocidental da Sucia, a incidncia de encefalomiopatias mitocondriais nos indivduos com menos de 16 anos de idade foi calculada em 1:21227 e em 1:11000 nas crianas com idade pr-escolar (Darin et al., 2001). A estimativa de uma incidncia de DCRM de 1: 69930 abaixo dos 16 anos de idade e de 1:35088 antes dos seis anos de idade, estimada para o noroeste de Espanha pelo grupo do Hospital Clnico Universitrio de Santiago de Compostela baseou-se na experincia de um servio de neuropediatria (Castro-Gago et al., 2006). Embora a maioria das crianas com DCRM desta srie tenha tido envolvimento do SNC durante a evoluo, a seleco de doentes foi feita com base na suspeita de DCRM de qualquer tipo. Por outro lado, tanto na srie sueca, como na espanhola, os critrios de diagnstico usados foram diferentes dos adoptados no nosso estudo, pelo que problemtico fazer comparaes. No entanto, tendo usado em princpio os mesmos critrios de diagnstico que os do grupo de Melbourne, a incidncia estimada para a populao peditrica da Regio Centro de Portugal cerca de 2,5 vezes mais elevada do que a da australiana (Skladal et al., 2003). Tal pode dever-se em parte a uma menor selectividade de incluso no actual estudo. O grupo australiano recebe amostras de tecidos congelados de doentes de todo o pas, sobretudo crianas (mais de 80% com menos de 15 anos), identificando dfice enzimtico major (complexos I a IV) em 22% dos casos (Thorburn et al., 2004a) Em contrapartida, no HP a taxa de deteco de dfices major primrios da CRM (excluindo os quatro casos de dfice do complexo V) foi de 37%. Os doentes da nossa srie estavam em geral gravemente afectados, o que se traduziu numa elevada taxa de mortalidade (30%). Uma proporo significativa de crianas (28%) estava criticamente doente aquando da investigao de DCRM, o que pode ter contribudo para a elevada percentagem de casos classificados como DCRM definida primria (39%), em comparao com dados publicados por outros grupos: 23 a 28% (Castelo et al., 2008; Munnich et al., 1996; Scaglia et al., 2004; Thorburn et al., 2004a). Apesar de se ter chegado a outro diagnstico numa proporo no
negligencivel de crianas (38 casos), algumas delas gravemente doentes e que vieram a falecer, muitas poderiam ter ficado sem diagnstico se tivessem sido usados critrios de incluso no estudo mitocondrial mais restritivos.
206
Captulo 7 Concluses
CAPTULO 7 CONCLUSES
207
Captulo 7 Concluses
208
Captulo 7 Concluses
7.
CONCLUSES
Numa rea to vasta, heterognea e ainda mal definida como a da medicina mitocondrial, habitual recorrer-se a anlises retrospectivas, tal como a que se apresenta neste trabalho (Munnich et al., 1996; Nissenkorn et al., 1999; Darin et al. 2001; Sciacco et al., 2001; Sklaldal et al., 2003; Scaglia et al., 2004; Bohm et al., 2006; Castro-Gago et al., 2006; Debray et al., 2007). Assume-se este constrangimento, na certeza de estar a abrir caminho para estudos prospectivos em Portugal, seguramente mais teis. Os dados resultantes desta anlise so dificilmente comparveis com os de outras sries, devido no s a diferentes critrios de seleco dos doentes e abordagens diagnsticas variadas, como s caractersticas genticas especficas da nossa populao. fundamental estabelecer critrios de diagnstico, definio e classificao uniformes para as DCRM. S ento ser possvel conhecer a sua prevalncia e histria natural e organizar adequadamente os servios de sade e sociais para apoio aos doentes e famlias (Naviaux, 2004). Este trabalho contribuiu para uma avaliao da importncia das DCRM na patologia peditrica no nosso Pas, atravs da estimativa da incidncia e prevalncia das mesmas na nossa Regio. A questo central que se coloca no final desta reviso qual a investigao da CRM que se justifica manter ou retomar ou que outra deve ser proposta, de modo a que se disponha de um conjunto de exames coerente e adequado para a investigao de futuros casos. As caractersticas de um centro de diagnstico mitocondrial ideal foram delineadas por Thorburn e Smeitink: fazer parte de um programa de diagnstico (clnico e laboratorial) completo; investigar clinicamente todos os suspeitos de DCRM antes de avanar para estudo invasivos; estudar de preferncia amostras de msculo a fresco; poder analisar outros tecidos de acordo com as indicaes clnicas; integrar-se em programas de controlo de qualidade, nomeadamente para os estudos enzimticos; trabalhar com protocolos clnicos e laboratoriais padronizados; dar resultados em menos de seis semanas, de preferncia num s relatrio; fazer parte de um consrcio de centros de diagnstico mitocondrial; oferecer aconselhamento gentico e diagnstico pr-natal; ter um programa de investigao prprio com recursos e capacidade tcnica para fazer estudos moleculares avanados e/ou de biologia celular como a anlise de cbridos (Thorburn e Smeitink, 2001). A parceria estabelecida na ltima dcada entre o HP, os HUC e o Laboratrio de Bioqumica Gentica do CNC tem algumas daquelas
caractersticas e potencialidade para desenvolver muitas das restantes. ainda necessrio um investimento real em meios humanos e tcnicos que permita avanos na anlise funcional do msculo a fresco e em fibroblastos e em estudos histolgicos e de 209
Captulo 7 Concluses
gentica molecular. Por outro lado, importante reforar a colaborao j existente com outros centros de investigao mitocondrial, no s em Portugal como no estrangeiro, de modo a estabelecer protocolos comuns e complementares.
7.1 Proposta de abordagem diagnstica
A necessidade de estudos a fresco, a no computorizao dos registos e a dificuldade de interpretao dos resultados levou a que os resultados da polarografia deixassem de ser includos no diagnstico de rotina. Ser de considerar a sua reintroduo com meios tcnicos actualizados e a possibilidade de avaliao do controlo respiratrio. A implementao do doseamento da CoQ, do estudo da oxidao dos substratos marcados com
14
C e da quantificao da produo de ATP devem ser equacionados neste contexto.
igualmente muito importante a determinao da actividade da piruvato-desidrogenase nas mesmas amostras de tecido e a par da dos complexos da CRM, tal como prtica de alguns grupos que investigam estas patologias (Caruso et al., 1996; Janssen et al., 2006a), uma vez que o dfice da piruvato-desidrogenase um dos diagnsticos diferenciais que mais frequentemente se coloca. Como foi realado ao longo deste trabalho, a abordagem dos doentes com suspeita de DCRM muito varivel, tendo dado origem a diversos algoritmos diagnsticos assentes em premissas comuns, isto , a conjugao de elementos clnicos (em sentido lato), metablicos, histolgicos, funcionais da CRM e moleculares (Smeitink et al., 2003; Taylor et al., 2004; Debray et al., 2007b). Da experincia adquirida neste estudo e da reviso da literatura, elaborou-se um algoritmo diagnstico para aplicao no estudo dos nossos doentes (figura 79 e tabela 37).
210
Captulo 7 Concluses
Figura 79 - DCRM na criana - algoritmo diagnstico.

DCRM definitiva clnica sugestiva + confirmao de alterao patognica do mtDNA/ nDNA de acordo com a escala de classificao proposta (pgina 215).
DCRM improvvel a definida
211
Captulo 7 Concluses
Tabela 37 - Algoritmo diagnstico da DCRM na criana notas
(1) Avaliao clnica
Quadro clnico Histria familiar

Hereditariedade autossmica (a): consanguinidade e/ou irmo afectado Hereditariedade materna (m): doena na linha materna estudo do nDNA; estudo do mtDNA
Rastreio laboratorial: redox plasma, cidos orgnicos urinrios; lactato/piruvato lquor;

provas de sobrecarga (teste de tolerncia glicose oral; exerccio).
Rastreio de envolvimento multiorgnico (SNC e perifrico, msculo, fgado, rim,

corao, pncreas, intestino, endcrino, medula ssea, viso, audio e pele). RMN cerebral / 1HRMS picos de lactato.
Concluso: Sndrome conhecida / Indicao para bipsia (critrios gerais de Nijmegen) Sndrome de Leigh
mtDNA linfcitos (+++ Histria Familiar -hereditariedade materna e/ou retinopatia):

mutaes NARP/Leigh 8993; MELAS 3243, MERRF 8344
Piruvato-desidrogenase (PDH) - linfcitos/ fibroblastos/ msculo/ fgado Bipsia msculo: piruvato desidrogenase, complexos CRM, histologia, CoQ, mtDNA.
Dfice IV sequenciao do gene SURF1, COX10, COX15; mt MTCO3 + miocardiopatia hipertrfica ? variante franco-canadiana Dfice I sequenciao do gene SCO2 sequenciao do gene LRPPRC
mutaes ND2, ND3, ND5 e ND6 mtDNA;
NDUFV1 NDUFS1,3,4,7 e 8 NDUFA2 C8ORF38 nuclear

Dfice V Dfice II Dfice III mtATP6
flavoprotein subunit A (SDHA) BCS1L assembling

genes mtDNA envolvidos na sntese proteica (tRNA e rRNA).
Dfices mltiplos
Se estudo anterior inconclusivo, considerar:
doseamento da Piruvato-carboxilase (linfcitos, fibroblastos, fgado, msculo) sobretudo se acidose

lctica ( hipoglicmia, hiperamonimia, citrulinmia e hiperlisinmia)
Encefalopatia de causa x ou doena multissistmica com envolvimento neurolgico:
Sndrome de Alpers clssica:

mutao A467T do gene POLG1; se negativo sequenciao POLG1
Sem critrios de S. Alpers

quantificao mtDNA em msculo (fgado); se depleo sequenciao POLG1
Hepatopatia /Insuficincia heptica de causa x

Considerar* quantificao mtDNA em fgado (de preferncia) ou msculo; se depleo estudo dos genes DGUOK, POLG1 (ver ponto 8)
(*sobretudo se hiperlactacidmia persistente e/ou encefalopatia)
212
Captulo 7 Concluses
DCRM na criana: algoritmo diagnstico notas (continuao)
(2) Estudo molecular mtDNA: Leigh/ NARP ( hipocitrulinmia), LHON, MERRF, MELAS Pearson, KSS, MELAS, Alpers nDNA (linfcitos): Barth (doseamento cardiolipina) TAZ. (> timidina e desoxiguanosina plasma) TP. msculo linfcitos
MNGIE SANDO
Alpers, SANDO, SCAE, CPEO autossmica dominante/recessiva, espordica
POLG1.
Twinkle (C10orf2). ANT1, Twinkle.

(depleo) ANT1.
CPEO autossmica dominante

Sangers (3) Bipsia
Msculo, fgado (de preferncia, rgo/tecido afectado). Considerar bipsia de pele (cultura de fibroblastos) sobretudo casos potencialmente fatais. Considerar necrpsia.
(4) Doseamento de CoQ Em msculo (e/ou fibroblastos), sempre que possvel (dfices 2os), sobretudo se: Ataxia/ atrofia cerebelosa, nefropatia, miocardiopatia e/ou miopatia. Leigh com atraso de crescimento.
Dfice de I+III e II+III com I, II e III N (5) Histologia
Histoqumica: Hematoxilina-Eosina (HE); Tricrmio Gomori; Periodic Acid-Schiff (PAS); Oil Red O. Histoenzimologia:
ATPase pH 4.35 e 9.4; Citocromo oxidase (COX). Nicotinamida Adenina Dinucletido - Tetrazolium Reductase (NADH-TR). Succinato-desidrogenase (SDH) e SDH modificada.
Microscopia electrnica: Sempre que possvel

(5a) No exclui DCRM Orientao de acordo com clnica e estudo enzimtico.
(5b) RRF - Fibras Vermelhas Rotas e/ou RBF -Fibras Azuis Rotas e/ou mitocndrias anormais > probabilidade de alt. (1as ou 2as) mtDNA quantificao/ rastreio de acordo com a clnica.
considerar estudo nDNA, de acordo com a clnica. (5c) Fibras COX negativas - Padro: heterogneo mtDNA; homogneo nDNA.
213
Captulo 7 Concluses
DCRM na criana: algoritmo diagnstico notas (continuao)
(6) Estudos enzimticos Em homogeneizado de msculo (fresco/congelado) ou outro tecido (fgado, rim ):
Complexos I-V; Segmentos I+III e II+III; Piruvato-desidrogenase.
(6a) Sem dfices enzimticos identificados:

Rever critrios gerais de Nijmegen para DCRM. Considerar bipsia de outro tecido (fgado, se estudo msculo normal) Considerar outras causas de dfice energtico 1 ou 2, por exemplo: dfice da piruvato desidrogenase, da oxidao dos cidos gordos, da biotinidase, da piruvato carboxilase. Se forte suspeita clnica estudo mtDNA/nDNA
(6b) Dfices enzimticos mltiplos/ generalizados:

Considerar depleo mtDNA Considerar mutaes do mtDNA que afectam a sntese proteica.
(6c) Dfice de um complexo enzimtico da CRM:
estudo do nDNA/ mtDNA de acordo com a clnica/ dfice enzimtico:

[hereditariedade autossmica (a); materna (m)] Ia Im II IIIa IIIm IVm IVa Va Vm
NDUFS1,2,3,4,6, 7 e 8; NDUFV1 e 2 ND1,2,3,4,4L,5 e 6 SDHA, B, C e D BCS1L, UQ-P Cyt b COX I, II e III (fibras COX negativas- perfil heterogneo) COX 10 e 15; SCO1 e 2, SURF1, LRPPRC (fibras COX negativas- perfil homogneo) ATP11,12; ATP a, b e g ATPase 6 e 8
(6d) Dfice de I+III e II+III com I, II e III N (7) Rastreio mtDNA
Dosear CoQ (ver ponto 4)
Mutaes mais frequentes e grandes deleces (Shouthern blot + L-PCR). (ver em Anexos, pgina 257) Se positivo quantificar heteroplasmia se deleces mltiplas estudo da nDNA (comunicao intergenmica) considerar sequenciao do mtDNA
Se negativo e forte suspeita clnica e laboratorial se alterao
confirmao e quantificao da heteroplasmia
(8) Defeitos da comunicao intergenmica

Hepatocerebral: DGUOK, POLG1, MPV17; Miopatia/Encefalopatia: POLG1; TK2; SUCLA2, ANT1 Twinkle; Encefalomioptico/ Multissistmico: POLG1; TP
214
Captulo 7 Concluses
7.2 Proposta de uma escala de classificao
Com base na anlise retrospectiva apresentada e tendo em conta os recursos locais actualmente disponveis, nomeadamente em termos de capacidade de investigao laboratorial de rotina da CRM, prope-se uma escala diagnstica, baseada na de Nijmegen, a aplicar no HP. Esta classificao baseia-se numa tabela de dupla entrada com os critrios clnico-laboratoriais gerais adaptados de Nijmegen, escalonados de um a quatro (improvvel, possvel, provvel e definido) e os resultados dos estudos enzimticos da CRM normalizados para a citrato sintase, em percentagem da mdia do v.r. Uma vez que no se dispe dos outros critrios bioqumicos usados por aquele grupo (oxidao de substratos
14
C e sntese de ATP/ fosfocreatina), os resultados dos estudos
enzimticos da CRM so distribudos por quatro subgrupos: superior ou igual a 40%, de 30 a 40%, de 20 a 30% e inferior a 20% da mdia do v.r., correspondentes ao grau de improvvel, possvel, provvel e definido, respectivamente (tabela 38).
Tabela 38 - Escala diagnstica de DCRM proposta.
Critrios clnico-laboratoriais gerais DCRM Actividade Enzimtica da CRM Improvvel 40% Possvel 30 - <40 Provvel 20 - <30 Possvel Possvel Provvel Definida Improvvel Possvel Possvel Provvel Improvvel Improvvel Possvel Possvel Improvvel Possvel Provvel Definida
Definida <20%
Possvel
Provvel
Definida
Definida
O grau de certeza diagnstica obtido atravs de uma tabela de dupla entrada:
Critrios clnico-laboratoriais gerais:

Cada uma das trs seces (clnica, metablica/ neurorradiolgica e morfolgica) pontuada de 0 a 4. Total: 8-12 Definida; 5-7 Provvel; 2-4 Possvel; 1 Improvvel (Wolf e Smeitink, 2002).
Actividade enzimtica de um ou mais complexos da CRM:

<20% Definida; 20 e <30 Provvel; 30 e <40 Possvel; 40% Improvvel.
Considera-se haver dfice da CRM quando pelo menos um dos complexos enzimticos apresenta actividade inferior a 40% da mdia do v.r. normalizada para a citrato sintase 215
Captulo 7 Concluses
(Grazina, 2004; DiMauro, 2009 - comunicao pessoal). Atravs da tabela de dupla entrada com os critrios clnicos e bioqumicos, pontua-se os cruzamentos de um modo mais restritivo do que na escala de Nijmegen (a favor dos critrios gerais quando haja discordncia), de modo a no sobrevalorizar os resultados do estudo enzimtico. A identificao de uma alterao patognica do mtDNA ou do nDNA, associada a clnica sugestiva, com ou sem alterao da funo mitocondrial nos tecidos estudados, faz o diagnstico de DCRM definida ou melhor, definitiva. Aplicou-se a classificao proposta e a de Bernier, adaptada pela subtraco dos critrios moleculares, amostra dos 198 doentes com estudo enzimtico da CRM da nossa srie. Como se pode observar na tabela 39a e b, as diferenas entre a classificao proposta e a de Bernier (sem o estudo molecular) no so maiores em termos absolutos do que as existentes entre a escala de Bernier (adaptada pela deduo dos critrios funcionais da CRM e moleculares) e a dos critrios gerais de Nijmegen.
Tabela 39 - Comparao da escala de diagnstico proposta com outras escalas de DCRM.
Be# versus C (a) Be>>C Be>C Be=C Be<C Be<<C Total

#
Be* versus Nj (b) Nj>>Be Nj>Be Nj=Be Nj<Be Nj<<Be Total n 10 81 81 24 2 198 % 5 41 41 12 1 100
n 1 55 108 34 0 198
% 0,5 28 55 17 0 100
sem molecular.
* sem enzimtico nem molecular.
Classificao diagnstica com as trs escalas em discusso em 198 doentes da nossa srie com investigao enzimtica da CRM. (a) segundo a classificao proposta (C) em cotejo com a escala de Bernier, adaptada pela excluso dos critrios moleculares (Be#); (b) segundo a aplicao dos critrios gerais de Nijmegen (Nj), em comparao coma a escala de Bernier, adaptada pela excluso dos resultados enzimtico e de gentica molecular (Be*). = doentes que ficam com a mesma classificao em qualquer das escalas; > ou < doentes cuja classificao difere de um ponto nos quatro possveis; >> ou << doentes cuja classificao difere de dois pontos nos quatro possveis.
Por outro lado, a anlise de concordncia entre a escala proposta (C) e a de Bernier sem o estudo molecular, subdividindo a amostra em DCRM definida e DCRM no definida mostrou um valor muito superior (Kappa=0,54) ao obtido na comparao entre a escala de Bernier sem o estudo enzimtico e molecular e a dos critrios gerais de Nijmegen (Kappa ~ 0,05).
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Captulo 7 Concluses
A opo por esta metodologia de diagnstico permite adoptar os critrios gerais de Nijmegen (validados por estudos moleculares) e fazer uma seleco mais rigorosa dos doentes para bipsia, escalonando-os de 0 a 8, de acordo com a pontuao obtida com os critrios clnicos e metablicos/ imagiolgicos. Posteriormente, entrando em linha de conta com os resultados histolgicos, ser possvel atribuir-lhes a pontuao de 0 a 12, agrup-los nas quatro referidas categorias e cruzar esta informao com os resultados do estudo funcional enzimtico da CRM. Na classificao que se prope, os casos com actividade enzimtica inferior a 20% da mdia do v.r. (definido) s sero considerados DCRM definida se pontuarem 3 ou 4 (provvel ou definido) na vertente clnico-laboratorial geral. A grande diferena em relao classificao de Bernier que os doentes com estudo enzimtico da CRM normal s sero classificados como definidos se for demonstrada uma mutao patognica (neste caso, definitivos), mesmo que tenham um critrio clnico major. A tnica ser assim colocada na importncia da clnica e do estudo funcional da cadeia respiratria como orientadores da investigao molecular. Apesar da maior frequncia das mutaes do nDNA na criana, o estudo completo do mtDNA numa fase relativamente precoce da investigao etiolgica susceptvel de uma relao custo/ benefcio adequada, na medida em que pode orientar para uma causa nuclear, ao serem detectadas alteraes sugestivas de um dfice da comunicao intergenmica ou excludas mutaes causais no mtDNA. A colaborao com o Laboratrio de Bioqumica Gentica do CNC no sentido da implementao de metodologias de avaliao funcional que permitam adoptar uma escala diagnstica semelhante de Nijmegen um dos nossos objectivos a cumprir num futuro prximo. Outro aspecto ainda mais premente o crescimento da capacidade diagnstica em termos de anlises de gentica molecular da CRM, numa colaborao em rede com Centros de Investigao e Diagnstico nacionais e estrangeiros.
217
Captulo 7 Concluses
7.3 O seguimento dos doentes adopo de um protocolo internacional

Se o diagnstico das DCRM complexo, a teraputica especfica tem sido considerada uma misso impossvel. Nos primeiros anos do perodo do estudo, adoptou-se um protocolo de tratamento que consistia numa associao de riboflavina, cido ascrbico, -tocoferol, ubiquinona/idebenona e carnitina, prescrita em todos os casos de DCRM confirmada ou fortemente suspeita. Se em alguns doentes houve alguma resposta clnica, ela foi transitria e raramente justificou a manuteno da teraputica a longo prazo, tal como de resto foi sendo referido na literatura (Mathews et al., 1993; Bindoff, 1999; Chinnery e Turnbull, 2001). As terapias propostas, frequentemente com bases fisiopatolgicas fundamentadas e ocasional traduo bioqumica favorvel mas sem a correspondente traduo clnica, continuam a ser controversas, requerendo muita investigao e alguma esperana (Kubota et al., 2004; Marriage et al., 2004; Kornblum et al., 2005; DiMauro et al., 2006; Rodriguez et al., 2007; DiMauro e Rustin, 2009). A objectivao dos resultados das vrias abordagens teraputicas passa por uma definio adequada das DCRM e conhecimento da sua histria natural. O grupo de Newcastle publicou uma escala semi-quantitativa para avaliao e seguimento de pacientes com DCRM em duas verses, uma para aplicao em crianas (Phoenix et al., 2006) e outra, em adultos (Schaefer et al., 2006), com vista a estabelecer a histria natural das DCRM e avaliar futuras intervenes teraputicas: Newcastle Pediatric/Adult Mitochondrial Disease Scale. O nosso objectivo passar a aplicar a escala peditrica nos doentes seguidos no HP. Aps contacto com os autores e com a sua permisso, fez-se a sua adaptao para portugus (ver Anexos, tabelas 4749, pginas 275 - 282).
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Captulo 8 - Referncias Bibliogrficas
CAPTULO 8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Captulo 8 Referncias Bibliogrficas
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8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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251
252
Captulo 9 - Anexos
CAPTULO 9 ANEXOS
253
Captulo 9 Anexos
254
Captulo 9 Anexos
9.
ANEXOS
9.1 Classificao gentica das doenas mitocondriais.
Classificao gentica das DCRM I- Defeitos do mtDNA

A) Mutaes pontuais
1 - Genes codificantes de protenas
NARP - T8993G/C MILS - T8993G/C LHON - G11778A, T14484C G3460A, A14495G
2 - Genes tRNA
MERFF - A8344G, T8356C MELAS - A3243G,T3271C, A3251G CPEO - A3243G, T4274C Miopatia - T14709C, A12320G Miocardiopatia - A3243G, A4269G, A4300G Diabetes e surdez - A3243G, C12258A Surdez neurosensorial no sindrmica - A7445G, T7511C (Sue et al., 1999) Queratoderma palmoplantar - A7445G (Sevior et al.,1998) Encefalomiopatia - G1606A, T10010C
3 - Genes rRNA
Surdez no sindrmica induzida pelos aminoglicosdeos -A1555G
B) Rearranjos- deleces (grandes deleces parciais) e duplicaes

Sndrome de Pearson, CPEO, KSS Diabetes e surdez Tubulopatia espordica
Adaptado de: Chinnery, 2003; Smeitink et al., 2001b e Thorburn e Dahl, 2001.
As referncias especficas esto assinaladas localmente.
255
Captulo 9 Anexos
II - Defeitos do nDNA
A) Genes que codificam subunidades dos complexos da CRM (complexos I e II)
Sndrome de Leigh
Dfice do complexo I subunidades do complexo I (NDUFS2,4,7 8 e NDUFV1); Dfice do complexo II- subunidade flavoproteica do complexo II (SDHA)
Leucodistrofia e epilepsia mioclnica - subunidade do complexo I (NDUFV1) Cardioencefalomiopatia - subunidade do complexo I (NDUFS2; NDUFV2) (Benit el al., 2003) Atrofia ptica e ataxia- subunidade flavoproteica do complexo II (SDHA)
B) Genes que codificam protenas auxiliares

- Defeitos de assembling (complexos III, IV e V)
Sndrome de Leigh - Protena de assembling da COX (SURF1) Sndrome de Leigh e tubulopatia proximal - Protena de assembling da COX (COX10) Cardioencefalomiopatia Protena de assembling da COX (SCO2); Protena de assembling da COX (COX15) (Antonicka H et al., 2003) Insuficincia heptica e encefalopatia Protena de assembling da COX (SCO1); Protena de estabilidade do mRNA da COX (LRPPRC) Tubulopatia, encefalopatia e insuficincia heptica - Protena de assembling do complexo III (BCSIL) Encefalopatia - Protena de assembling do complexo V - ATPase12 (De Meirleir et al., 2004)
- Defeitos na sntese de protenas ribossmicas (Kenmochi et al., 2001)
Acidose lctica neonatal fatal - protena MRPS16 (Miller et al., 2004)
C) Alteraes da comunicao intergenmica/ estabilidade do mtDNA

Oftalmoplegia externa autossmica dominante (adPEO),
- mutaes no transportador/ translocador de nucletidos de adenina (ANT1) - mutaes na DNA polimerase-gama (POLG); - mutaes na helicase Twinkle (C10orf2)
MNGIE mutao na timidina fosforilase (TP) Miopatia com depleo do mtDNA - mutaes na timidina kinase (TK2) Encefalopatia com insuficincia heptica - mutaes na desoxiguanosina kinase (DGUOK)
D) Alteraes da importao mitocondrial de protenas

Distonia-surdez - mutaes na protena DDP1 (TIMM8A)
E) Alteraes do meio lipdico (membranar)

Sndrome de Barth dfice da sntese de cardiolipina por mutao no gene da tafazina (TAZ)
F) Alteraes da homeostase mitocondrial (mutaes que afectam a funo da CRM)

Ataxia de Friedreich - FRDA Paraplegia espstica familiar -SPG7 Doena de Wilson - ATP7B Anemia sideroblstica e ataxia lig.X- ABC7 (putativo gene de transporte do ferro) (Allikmets et al., 1999)
G) Alteraes da fuso e motilidade

Fuso: Atrofia ptica dominante gene da GTPase relacionada com dinamina (OPA1); Charcot-Marie-Tooth tipo 2 - gene da mitofusina 2 (fuso) (MFN2) (Banchs et al., 2008) Motilidade: Paraplegia espstica familiar autossmica dominante - gene de uma das cinesinas (KIF5A )
Adaptado de: Chinnery, 2003; Smeitink et al., 2001b e Thorburn e Dahl, 2001.
As referncias especficas esto assinaladas localmente.
256
Captulo 9 Anexos
9.2 Alteraes do DNA mitocondrial investigadas
Tabela 40 - Alteraes do mtDNA pesquisadas no incio do estudo.
Tipo de alterao do mtDNA

Deleces (CPEO, S. Pearson, KSS) A3243G (MELAS) T3271C (MELAS) G3460A (LHON A8344G (MERRF) T8356C (MERRF) G11778A (LHON) T14484C (LHON) G15257A (LHON)
Tabela 41 - Deleces pesquisadas at 2004.
Deleces do mtDNA
Deleces 13-2,5 Kb entre 500 e 16200; XL-PCR Deleces 14,5-5,5 Kb entre 500 e 16200; L-PCR Deleces 5,3-2,3 Kb entre 8200 e 13700 Deleces 7,3-4,3 Kb entre 7200 e 14700 Deleces 12,8-9,8 Kb entre 3200 e 16200 Deleces 7,8-4,8 Kb entre 8000 e 16200 Deleces 8,5-5,5 Kb entre 6000 e 14700
Abreviatura: Kb- kilobases
257
Captulo 9 Anexos
Tabela 42 - Mutaes pesquisadas at 2004.
Mutaes do mtDNA
A1555G, ARNr 12S (Surdez no sindrmica / aminoglicosdeos) A3243G, ARNtLeu (UUR) (MELAS) T3256C, ARNtLeu (UUR) (MELAS, CPEO) A3260G, ARNtLeu (UUR) (MELAS, Miopatia, Miopatia e miocardiopatia) T3271C; delT, ARNtLeu (UUR) (MELAS) A3302G, ARNtLeu (UUR) (Miopatia) G3460A, ND1 (LHON) T4216C, ND1 (LHON) A4917G, ND2 (LHON)
A7445G ARNtSer (Surdez neurosensorial)

A8344G, ARNtLys (MERRF) T8356C, ARNtLys (MERRF, MELAS) G8363A, ARNtLys (MERRF, Miopatia e miocardiopatia, CPEO) T8993G/C, ATPase 6 (NARP, MILS) T9176C, ATPase 6 (FBSN- necrose estriatal bilateral familiar) G11778A, ND4 (LHON) G14459A, ND6 (LHON, Distonia) T14484C, ND6 (LHON) T14709C ARNtGlu (Miopatia, Diabetes) G15257A, Cyt b (LHON)
Tabela 43 - Deleces do mtDNA pesquisadas a partir de 2005.
Rastreio de deleces do mtDNA
3150 14704 3150 16192 3150 16406 7241 14704 8222 13727 8222 16192
258
Captulo 9 Anexos
Tabela 44 - Mutaes do mtDNA pesquisadas a partir de 2005.
Rastreio de mutaes e deleces do mtDNA

* Posio dos nucletidos no mtDNA
Regio investigada*
1435 - 1917
Mutaes pontuais
A1438G G1462A C1494T C1508T C1531T A1536G C1537T
Diabetes Mellitus Diabetes/ Surdez Surdez
Doenas associadas
Status
r/t RNA M (Prov) PRNP r/t RNA M (Prov) PRCod PRCod PRCod PRCod r/t RNA M (Cfrm)
A1555G
G1598A A1603G G1606A C1624T G1642A G1644T G1664A T1700C C1703T G1709A G1719A A1736G C1764T A1811G T1822C A1832G A1842G G1858A G1888A A1900G A3160T C3184T G3196A T3197C C3206T C3212T G3242A
Surdez
Ataxia Mioclnus e Surdez (AMDF) Sindrome de Leigh Encefalomiopatia Mitoc. Ac.Lctica e Episdios tipo AVC (MELAS) Sindrome de Leigh do Adulto
Adenoma paratiroideu espordico Cancro da Mama
3150 3769
Adenoma paratiroideu espordico

D de Alzheimer e D de Parkinson (ADPD) Encefalomiopatia, Encefalopatia, Miocardiopatia Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC
Sndrome mielodisplsico
MELAS, Diabetes Mellitus/Surdez (DF), Miopatia Mitocondrial Miopatia Mitocondrial S. de Kearns-Sayre (KSS) Miopatia Mitocondrial /CPEO Miopatia Mitocondrial Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC Miopatia Mitocondrial Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC Miopatia Miopatia e Miocardiopatia de Hereditariedade Materna (MMC) Diabetes Mellitus Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC Diabetes Mellitus Encefalopatia Miopatia Progressiva (PEM) Miopatia ocular Neuropatia ptica Hereditria de Leber (LHON) Miopatia Miopatia Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC Miopatia Mitocondrial Miopatia e Miocardiopatia de Hereditariedade Materna
PRCod PRCod r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) PRCod PRCod, PRNP PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRNP PRNP r/t RNA M (Prov) PRCod, PRNP PRNP PRCod PRNP
r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) PRCod r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) PRCod r/t RNA M (Prov), PRCod r/t RNA M (Prov) PRCod r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Cfrm)
A3243G
A3243T G3249A T3250C A3251G T3252G C3254G C3254T
C3256T
T3258C
A3260G
T3264C
T3271C
T3271C T3271delT T3273C C3275A G3277A A3280G A3288G A3290G T3291C
A3302G C3303T
T3308C G3316A
Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC Diabetes Mellitus No Insulino-Dependente (NIDDM), Neuropatia
MPRCC (PM), PRCod MPRCC (Unclear)
259
Captulo 9 Anexos
ptica Hereditria de Leber, Oftalmoplegia Externa Progressiva (PEO)
(3150 3769)
T3335C T3336C T3338C A3348G T3350C C3351T A3360G A3378G A3384G G3391A T3394C T3396C A3397G A3397G T3398C A3411G G3423T G3424T A3426G C3429T A3434G G3438A A3447G C3450T C3453T C3459T
Sndrome cardio-facio-cutneo desconhecido Leucodistrofia
Diabetes Mellitus No Insulino-Dependente (NIDDM), Neuropatia ptica Hereditria de Leber

D de Alzheimer e D de Parkinson Adenoma paratiroideu espordico
PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRNP PRNP PRCod PRCod PRCod MPRCC (Unclear), PRCod PRCod MPRCC (Prov) PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod
MPRCC (Cfrm*)
G3460A
A3465T A3480G G3483A G3496T C3497T A3505G G3531A A3537G C3546A A3547G T3552A 3566insC G3591A C3594T C3630T G3635A G3635A T3645C C3657G C3657A G3666A G3670A C3674T A3676C G3693A A3714G C3738T C3741T C3738T C4086T G4092A A4104G T4117C A4136G C4140T A4143G C4155A T4160C A4164G C4167T
Neuropatia ptica Hereditria de Leber
Neuropatia ptica Hereditria de Leber Neuropatia ptica Hereditria de Leber
Neuropatia ptica Isqumica Anterior No Arteritica (NAION)
Cancro do Pncreas Neuropatia ptica Hereditria de Leber Adenoma paratiroideu espordico Adenoma paratiroideu espordico Neuropatia ptica Isqumica Anterior No Arteritica
Neuropatia ptica Hereditria de Leber Cancro do Pncreas Neuropatia ptica Hereditria de Leber
Cancro do Pncreas
Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC Neuropatia ptica isqumica anterior no arteritica Neuropatia ptica Isqumica Anterior No Arteritica Neuropatia ptica Isqumica Anterior No Arteritica Miocardiopatia Hipertrfica de Hereditariedade Materna (MHCM) Neuropatia ptica Hereditria de Leber
4074 4703
Neuropatia ptica Hereditria de Leber Cancro do Ovrio, outras
PRCod PRCod PRCod MPRCC (Prov/2) MPRCC (Prov/2) PRCod PRNP PRCod PRCod PRNP PRNP PRNP PRNP PRCod, PRNP PRCod MPRCC (Prov) PRNP PRNP PRCod PRCod PRNP PRNP PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod PRNP PRNP PRCod PRNP PRNP PRCod MPRCC (Prov) PRCod PRCod PRCod MPRCC (Prov) PRCod PRCod
260
Captulo 9 Anexos
(4074 4703)
T4169C C4170A C4171A T4172C C4185T A4188G A4200T
Neuropatia ptica Hereditria de Leber Adenoma paratiroideu espordico Adenoma paratiroideu espordico
PRCod PRCod Prov PRNP PRCod PRCod, PRNP PRCod
T4216C
T4216C C4242T T4247C T4248C A4257G A4269G T4274C T4284A T4285C A4295G G4298A A4300G G4309A C4312T A4315G A4317G C4318G C4320T

MPRCC (Cfrm**)
PRNP PRCod PRCod PRCod PRNP r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov), PRCod
r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) PRCod PRNP r/t RNA M (Prov) PRCod r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Unclear) PRCod r/t RNA M (Prov) PRCod r/t RNA M (Prov) PRCod, PRNP r/t RNA M (Prov) PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod MPRCC (Prov) PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod
Neuropatia ptica Isqumica Anterior No Arteritica Miocardiopatia Fatal Infantil Plus (associada a MELAS) (FICP) Oftalmoplegia Crnica Externa Progressiva (CPEO) Apresentao familiar variada Oftalmoplegia Crnica Externa Progressiva
Miocardiopatia Hipertrfica de Hereditariedade Materna Oftalmoplegia Crnica Externa progressiva/ Esclerose Mltipla (MS) Miocardiopatia de Hereditariedade Materna (MICM) Oftalmoplegia Crnica Externa Progressiva
Atraso psicomotor Miocardiopatia Fatal Infantil Plus

Encefalomiocardiopatia mitocondrial Encefalopatia/MELAS D de Alzheimer e D de Parkinson Miopatia Miopatia Mitocondrial Adenoma paratiroideu espordico Miopatia
G4332A
T4336C A4343G 4370insA T4386C T4409C T4418C G4450A T4472C G4491A A4529T C4544T G4580A A4583G T4592C A4602G A4626G T4634C T4639C C4640A C4640A T4646C G4655A A4657G G4659A T4695C T4703C T4911C
Neuropatia ptica Hereditria de Leber Adenoma paratiroideu espordico
4886 5021
A4917G
A4918G G4924A C4931G T4945C A4958G G4959C A4961G T4977C G4985A G4991A T5004C A7250G T7251C
MPRCC (Cfrm**)
PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod
Cancro do Pncreas
Cancro do Pncreas
7241 7644
261
Captulo 9 Anexos
(7241 7644)
C7256T C7274T A7307G G7337A T7389C C7402T A7403G A7424G A7430G A7443G G7444A A7445C
Normal
Sem informao
Surdez Neuropatia ptica Hereditria de Leber, Surdez neurosensorial (SNHL) Surdez Surdez neurosensorial Encefalomiopatia Progressiva/ Ataxia Mioclnus e Surdez
PRCod, PRNP PRCod, PRNP PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod r/t RNA M (Prov) MPRCC (Prov), r/t RNA M (Prov) Prov
r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Cfrm)
A7445G 7472insC
C7476T G7497A T7510C
Normal / vrias doenas mitocondriais Miopatia Mitocondrial Surdez neurosensorial

Surdez neurosensorial Encefalomiopatia Progressiva /MERRF+MELAS (MERME) Normal / vrias doenas mitocondriais Epilepsia Mioclnica e Regresso Psicomotora (MEPR)
PRCod r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov)

r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Prov) PRCod r/t RNA M (Prov) PRCod PRCod Prov PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod r/t RNA M (Prov)
T7511C
T7512C G7521A A7543G T7579C T7581C T7587C G7600A A7617C T7621C C7626T G7642A A8245G G8249A G8251A C8252T T8260C G8269A T8277C G8290A G8292A A8296G A8308G G8313A C8320T G8328A T8337C G8342A
Encefalopatia mitocondrial
8222 8461
Normal and Several Mitochondrial diseases
Normal and Several Mitochondrial diseases
Diabetes Mellitus e Surdez (DMDF)/ Epilepsia Mioclnica e Fibras Vermelhas Rotas / Miocardiopatia Hipertrfica Encefalopatia Mio-Neuro-GastroIntestinal (MNGIE) Encefalopatia Encefalopatia mitocondrial Oftalmoplegia Externa Progressiva e Mioclnus Epilepsia Mioclnica e Fibras Vermelhas Rotas (MERRF) Miocardiopatia Miopatia Epilepsia Mioclnica e Fibras Vermelhas Rotas Epilepsia Mioclnica e Fibras Vermelhas Rotas Miopatia Miocardiopatia de Hereditariedade Materna +Surdez /MERFF
PRCod r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Unclear) r/t RNA M (Prov) PRCod r/t RNA M (Prov)
r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Prov), PRCod r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Cfrm) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov) r/t RNA M (Prov)
A8344G
A8348G T8355C
T8356C
G8361A T8362G G8363A C8386T G8392A C8414T T8415C T8426C T8427C C8428T C8431T A8435G T8448C T8450C C8932T A8938G A8953G
Neuropatia ptica isqumica anterior no arteritica Epilepsia Mioclnica e Fibras Vermelhas Rotas
Epilepsia Mioclnica e Fibras Vermelhas Rotas
8915 9413
Encefalomiopatia, Atraso Mental, Oftalmoplegia, Insuficincia Suprarenal Adenoma paratiroideu espordico
PRNP PRCod PRCod, PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod PRCod PRNP PRCod PRNP
262
Captulo 9 Anexos
(8915 9413)
T8957C C8964T A8982G T8987C G8989A
Cancro do Pncreas

Fraqueza muscular Neurognica, Ataxia e Retinite Pigmentar (NARP) / S. de Leigh Fraqueza muscular Neurognica, Ataxia e Retinite Pigmentar / S. de Leigh Sem doenas Encefalomiopatia Mitoc., Ac. Lctica e Episdios tipo AVC -like
PRNP PRCod PRCod PRCod, PRNP PRCod

MPRCC (Cfrm) MPRCC (Cfrm)
T8993C T8993G
G8994A A9007G C9027G A9052G G9053A G9055A T9101C G9123A T9128C A9132G A9150G G9163A
Normal Infertilidade Neuropatia ptica Hereditria de Leber
Controlo
Necrose estriatal Bilateral familiar (FBSN)/ S. de Leigh S. de Leigh
PRCod PRNP PRCod PRCod PRNP PRNP MPRCC (Prov) PRCod PRCod PRCod PRCod, PRNP PRCod
MPRCC (Cfrm) MPRCC (Prov) PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod, PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod PRCod, PRNP PRNP PRCod PRCod PRNP PRCod, PRNP PRCod PRNP PRNP PRNP PRNP PRCod PRCod MPRCC (Prov) MPRCC (Cfrm*)
T9176C
T9176G A9180G A9181G G9192A G9196A A9214G A9221G A9246G A9251G A9254G C9270T C9293T C9296T A9299G G9300A T9316C C9365T A9377G G9380A A9392G A9395G A9410G G11719A T11722C A11723G T11732C A11734G C11761T C11761T G11762A C11777A
Miopatia, Cancro do Fgado Oftalmoplegia, Surdez
Miopatia
Infertilidade Miopatia, Infertilidade
11719 11819
Miopatia Cancro da Boca Cancro da Mama Cancro da Mama Neuropatia ptica Isqumica Anterior No Arteritica
S. de Leigh Neuropatia ptica Hereditria de Leber
G11778A
C11779T C11788T A11797delA C11808A A11812G A11818C A13528G C13545T A13563G T13577C G13590A C13596G T13617C A13637G C13650T T13656C
Cancro da Boca Normal Normal Neuropatia ptica Hereditria de Leber - like
13515 13727
Cancro do Ovrio
PRCod PRCod PRNP PRNP PRCod PRNP MPRCC (Prov) PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod
263
Captulo 9 Anexos
(13515 13727)
C13692A G13702C C13704T G13707A
PRCod PRCod PRCod PRCod
G13708A
G13708A A13710G A13716G A13722G A14422G G14453A

MPRCC (Cfrm**)
PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod MPRCC (Prov)
MPRCC (Cfrm)
14420 14855
Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC S. de Leigh e Distonia (LYDT)/ S. de Leigh
G14459A
T14470A T14470C C14482A
Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC Neuropatia ptica Hereditria de Leber
Neuropatia ptica Hereditria de Leber Neuropatia ptica Hereditria de Leber S. de Leigh Neuropatia ptica Hereditria de Leber Neuropatia ptica Hereditria de Leber
PRCod PRCod, PRNP MPRCC (Prov)

MPRCC (Cfrm) MPRCC (Cfrm)
C14482G T14484C
C14485T T14487C T14488C A14495G A14497G T14498C T14502C A14527T G14544A T14551C G14560A C14562T A14564G A14566G C14568T G14569A A14572G T14577C A14582G A14587G A14596T G14620A A14666G C14668T T14674C A14687G A14693G
Normal, Cancro do Pncreas

Neuropatia ptica Isqumica Anterior No Arteritica
PRCod MPRCC (Prov) PRCod MPRCC (Prov) PRCod MPRCC (Prov) PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod MPRCC (Prov) PRCod PRCod PRCod PRCod, PRNP PRCod MPRCC (Prov) PRCod PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod
r/t RNA M (Cfrm)
T14709C
A14750G A14755T A14755G T14757C T14766C A14768G A14769C C14770T A14776G T14783C TTAA14787del T14788C A14793G T14798C G14846A T14849C 15023 - 15450 C15028T A15034G C15040T G15043A G15045A A15052G C15058T
Miopatia Mitocondrial + Diabetes Mellitus
Cancro da Mama D de Parkinson (PD), Encefalomiopatia Mitoc., Acidose Lctica e Episdios tipo AVC
PRCod PRCod PRCod PRNP PRCod PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod, PRNP
MPRCC (Prov)
Intolerncia ao exerccio Displasia septo-ptica
Miopatia (Desconhecida), Ptose bilateral
Cancro do Pncreas
PRCod PRNP PRCod MPRCC (Prov) MPRCC (Prov), PRNP PRCod PRNP PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod
264
Captulo 9 Anexos
(15023 15450)
G15059A T15067C T15071C G15084A C15088T T15097C G15106A G15110A T15115C G15148A G15150A G15168A T15191C C15194T T15197C C15199T C15201G A15203G G15217A A15218G A15226G G15227A A15236G G15242A G15243A A15244G A15256C G15257A G15257A A15258G C15265T G15301A T15310C T15313A G15314A G15317A G15323A A15326G T15345C G15346A G15355A C15367T T15394C A15422G T15440C
Miopatia Mitocondrial
Intolerncia ao exerccio Miopatia
Miopatia Ocular Adenoma paratiroideu espordico Intolerncia ao exerccio Intolerncia ao exerccio
Intolerncia ao exerccio
Encefalomiopatia mitocondrial Miocardiopatia Hipertrfica (HCM) Miopatia Ocular Neuropatia ptica Hereditria de Leber Cancro da Mama
Neuropatia ptica Isqumica Anterior No Arteritica Miopatia (Desconhecida), Ptose bilateral
Cancro do Fgado
MPRCC (Prov) PRCod PRCod MPRCC (Prov) PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod, PRNP PRCod, PRNP MPRCC (Prov) MPRCC (Prov) PRCod PRCod MPRCC (Prov) PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod MPRCC (Prov) MPRCC (Prov) PRCod, PRNP PRCod MPRCC (Unclear) PRNP PRCod PRNP PRCod PRNP PRCod PRCod PRCod PRNP PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod PRCod
MPRCC -Reported mtDNA Base Substitution Disease: Coding and Control Region Point Mutations r/t RNA M -Reported mtDNA Base Substitution Disease: rRNA/tRNA mutations Cfrm* - Mutao primria de Leber (LHON);
Cfrm** - Mutao secundria de Leber (LHON)
Cfrm - mais do que um grupo independente ter feito uma publicao acerca da patogenicidade da mutao
(apesar de poder haver diferentes fentipos clinicos) ou ocorrncias independentes da mutao tero resultado num mesmo fentipo. Dados adicionais sero necessrios para confirmar a patogenicidade de algumas destas mutaes
Prov - Provisrio: indica que apenas um grupo de trabalho ter reportado a mutao como patognica
Unclear pouco claro (mutao 2 ?, patognica quando associada a outras mutaes ?) PM - polimorfismo: algumas publicaes determinaram que a mutao um polimorfismo no patognico PRC - mtDNA Control Region Sequence Polymorphisms; Polimorfism PRNP - Unpublished mtDNA Polymorphisms NA - No aplicvel por se encontrar num tRNA PRCod - mtDNA Coding Region Sequence
NC - Regio no codificante;
265
Captulo 9 Anexos
9.3 Critrios de Bernier que levaram classificao dos doentes

Tabela 45 - Critrios majores em 200 doentes segundo a classificao de Bernier.
Total
Cl
b d c d c c c a d c b d a c a c d c a c d c a b c c b d d b c a d d a c b b b b c b d b b b c b
Clnicos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T
Hist
T
Enzimticos
1 2
1
Mol
T
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3
Lab
T
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
DF
Lab
d e f e e e d e e e d e e e e e g d e e e d e e d e d e h d d e g e f e e e e e e e c e e e e e
D D D* D D D D* D D D D D D* D D D D D D* D D D D* D D* D D D D D D D D D D* D D D* D D* D D D
1 1
1 1 1 1 1
1 1 1
1 1 1 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2 1 1 1
2 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
D D D D* D
Os dados de cada doente esto representados numa linha. Abreviaturas: Cl- clnico; Lab- laboratorial; T-total; Hist- histolgico; Enz- enzimtico; Mol- molecular; mi- minor Mj- major; a=1mi; b=2mi; c 3mi; d=1Mj; e=1Mj+1mi; f=1Mj+2mi; g =2Mj +1mi; h= 2Mj+2mi DF- diagnstico final: D- definido; P- provvel; S- possvel; I-improvvel. (*)- secundrio.
266
Captulo 9 Anexos
Critrios majores em 200 doentes segundo a classificao de Bernier (continuao).

Total
Cl
a d a c c c a b c a b d b a b a c a b b c a b c c a b b c b b b a b a c c b c c d c a c b d c c a d b
Clnicos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T
Hist
T 1
Enzimticos
2
1
Mol
T
1
Lab
T
1
DF
Lab
f b e f e d e e e e e g e e e f d e e e g e e e e e e d e d e d e e e e d e e e g e e d e e d b b a a
D D
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1
D D D D D D D D D* D D D* D D D* D D D D D* D* D D D D D D D D D D D D D* D D D D D D D D D D D* P* P
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
P* P
Os dados de cada doente esto representados numa linha. Abreviaturas: Cl- clnico; Lab- laboratorial; -total; Hist- histolgico; Enz- enzimtico; Mol- molecular; mi- minor Mj- major; a=1mi; b=2mi; c 3mi; d=1Mj; e=1Mj+1mi; f=1Mj+2mi; g =2Mj +1mi; h= 2Mj+2mi DF- diagnstico final: D- definido; P- provvel; S- possvel; I- improvvel. (*)- secundrio.
267
Captulo 9 Anexos

Total
Cl
c b b d c c c b a b c c c c b c b c a b c c b c b c b b b c a b c c c c c c b c b c c b b c b b c b a
Clnicos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T
Hist
1
Enzimticos
2 3 4 T
Mol
Lab
T
DF
Lab
a b b a a b b b b b a b a a a a a b b a b a a a a a b a b c b b b a b a b a a a b a c a a a a a b b d
P P P 1 1 P P P P* P P P P P P P P P P* P P P P P* P P P P P P P P* P P P P P P P P P P P P P* P P P* P* P P P 1 1 1 P*
Os dados de cada doente esto representados numa linha. Abreviaturas: Cl- clnico; Lab- laboratorial; T- total; Hist- histolgico; Enz- enzimtico; Mol- molecular; mi- minor Mj- major; a=1mi; b=2mi; c 3mi; d=1Mj; e=1Mj+1mi; f=1Mj+2mi; g =2Mj +1mi; h= 2Mj+2mi DF- diagnstico final: D- definido; P- provvel; S- possvel; I- improvvel. (*)- secundrio.
268
Captulo 9 Anexos

Total
Cl
b a b b c c b a c b c a c b c c a c c c b b a a a a a a a d a a c a b 0 a b b c b a c c 0 b b c c c
Clnicos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T
Hist
1
Enzimticos
2 3 4 T
Mol
Lab
T
DF
Lab
a b a b a b b d b a a b c a a a b c b a b a a a a a a a a 0 a a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 a 0 0 0 0 0
P P P P P P P* 1 1 1 P* P P P* P* P P P P* P P P P* P P S S S S S* S S 1 1 S S S I I I* I I I I I I I* I I I* I* I I I I
Os dados de cada doente esto representados numa linha. Abreviaturas: Cl- clnico; Lab- laboratorial; T-total; Hist- histolgico; Enz- enzimtico; Mol- molecular; mi- minor Mj- major; a=1mi; b=2mi; c 3mi; d=1Mj; e=1Mj+1mi; f=1Mj+2mi; g =2Mj +1mi; h= 2Mj+2mi DF- diagnstico final: D- definido; P- provvel; S- possvel; I- improvvel. (*)- secundrio.
269
Captulo 9 Anexos
Tabela 46 - Critrios minores em 200 doentes segundo a classificao de Bernier.

Total
Cl
b d c d c c c a d c b d a c a c d c a c d c a b c c b d d b c a d d a c b b b b c b d b b b c b
Clnicos
Neu
1
Laboratoriais
Ot Of D Di Out T
2 1 1 2 1 1 1
DF
T
D D D* D D D D*
Lb
d e f e e e d e e e d e e e e e g d e e e d e e d e d e h d d e g e f e e e e e e e c e e e e e
Nt
1
Hp
Ed
Hm
Hist
Enz
Mol
Mb
1 1
1 1 1 1 1 1 1 1
1 1
3 3 4 1
1 1
1 1
1 1 1
D D D D
1 1
1 1
3 2
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 2 5 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 2 2 2 2 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1
D D* D D D D D
1 1 1
D* D D D
1 1
D* D D*
D D
1 1
D D D D
1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1
D D D D* D D D* D D* D D D D D D D* D
Os dados de cada doente esto representados numa linha.
Abreviaturas: Cl- clnico; Lab- laboratorial; Neur- neurolgico; M- muscular; C- cardaco;R- renal; NT- nutricional; Hp- heptico; Ed- endcrino; Hm- hematolgico; Ot- otolgico; Of- oftalmolgico; D- dermatolgico; Di- dismrfico; Out- outros; T- total; Hist- histolgico; Enz- enzimtico; Mol- molecular; Mb- metablico; mi- minor Mj- major; a= 1mi; b= 2mi; c 3 mi; d =1Mj; e = 1Mj+1mi; f =1Mj+2mi; g = 2Mj+1mi; h = 2Mj+ 2mi DF- diagnstico final: D- definido; P- provvel; S- possvel; I- improvvel. (*)- secundrio.
270
Captulo 9 Anexos
Critrios minores em 200 doentes segundo a classificao de Bernier (continuao).

Total
Cl
a d a c c c a b c a b d b a b a c a b b c a b c c a b b c b b b a b a c c b c c d c a c b d c c a d b
Clnicos
Neu
1
Laboratoriais
Ot Of D Di Out T
1
DF
T
2 2 1 2 1 D D D D D D
Lb
f b e f e d e e e e e g e e e f d e e e g e e e e e e d e d e d e e e e d e e e g e e d e e d b b a a
Nt
Hp
Ed
Hm
Hist
1 1
Enz
Mol
Mb
1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 3 3 3 1 2 4 1 2 1
1 1
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 2
D D D D D* D D D* D D D*
1 1
2 1 2 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
D D D D D* D* D D D D D
1 1 1
2 2 4 1 1 2 1 1 1 1 1 6 3 1 2 1 2 1 1 4 2 2 1 2 1 1 2 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
D D
D D
1 1 1 1
1 1 1 1
D D D D* D
1 1 1
4 3 2 4 4
1 1 1 1
1 1 1 1 1 1
D D D D D D D
1 1
1 1 1 1
4 1
1 1
1 1
4 2 1 1 1 1
D D D*
1 1 1
1 1
1 1
3 3 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1
P* P P P
271
Captulo 9 Anexos
Critrios minores em 200 doentes segundo a classificao de Bernier (continuao).

Total
Cl
c b b d c c c b a b c c c c b c b c a b c c b c b c b b b c a b c c c c c c b c b c c b b c b b c b a
Clnicos
Neu
1 1 1
Laboratoriais
Ot Of D Di
1
DF
T
1 2 2 1 1 2 2 2 2 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 3 2 2 2 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 2 1 3 1 1 1 1 1 2 2 P P P P P P P* P P P P P P P P P P* P P P P P* P P P P P P P P* P P P P P P P P P P P P P* P P P* P* P P P P*
Lb
a b b a a b b b b b a b a a a a a b b a b a a a a a b a b c b b b a b a b a a a b a c a a a a a b b d
Nt
1 1
Hp
1
Ed
Hm
Out
T
4 2
Hist
Enz
Mol
Mb
1
1 1
1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1
3 4 3 2 1 2 3 1 4 3 3 2 1 4 2 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1
7 1 2 3
1 1
1 1 1
1 1 1
5 2
3 2
1 1
3 2 2 2 3 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1
3 3 1 4 3
1 1
3 3
1 1
2 4 2 3 4 2 1 2 3 2 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1
2 6 2 1 1 1
1 1
272
Captulo 9 Anexos
Critrios minores em 200 doentes segundo a classificao de Bernier(continuao).

Total
Cl
b a b b c c b a c b c a c b c c a c c c b b a a a a a a a d a a c a b 0 a b b c b a c c 0 b b c c c
Clnicos
Neu
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Laboratoriais
Ot Of
1
DF
T
1 2 1 2 1 2 2 P P P P P P P* P*
Lb
a b a b a b b d b a a b c a a a b c b a b a a a a a a a a 0 a a 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 a 0 0 0 0 0
Nt
Hp
Ed
Hm
Di
Out
T
2 1 2 2 3 3 2 1 3 2 3 1 4 2 4 4 1 4 3 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1
Hist
Enz
Mol
Mb
1
1 1
1 1
1 1
1 1
1 1 1
2 1 1 2 3 1
P P P* P* P P P P* P P P P* P P S S S S S* S S S
1 1 1 1
1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 2 3 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 3 1 2
1 1
1 1
S S I I I* I
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 2 2 3 2 1 4 3 1 1
I I I I I I* I I I* I* I I I I
1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1
2 2 3 3 3
273
Captulo 9 Anexos
9.4 Doena Mitocondrial - Escala de Seguimento de Newcastle

O uso da Newcastle Pediatric Mitochondrial Disease Scale aconselhado no s em casos de DCRM confirmada por diagnstico bioqumico ou gentico, mas tambm naqueles em que h uma forte suspeita de DCRM (Phoenix et al., 2006) Aquela escala de seguimento contempla quatro itens: funo existente; envolvimento sistmico especfico, avaliao clnica actual e qualidade de vida. Quase todas as incapacidades podem ser graduadas de 0-3: 0 normal, 1- ligeiro, 2- moderado e 3severo. A escala subdivide-se em trs verses especficas para cada faixa etria: 0-24 meses, 2-11 anos e 12-18 anos. Em todos os casos, o neurodesenvolvimento e as capacidades funcionais do doente devem ser comparadas com o normal para a idade. A escala deve ser preenchida pelo menos cada 6 meses nos primeiros 2 anos de vida e cada 6 a 12 meses nas crianas mais velhas.
274
Captulo 9 Anexos
Tabela 47 - Doena Mitocondrial - Escala de Seguimento de Newcastle (0 - 24 M).
0-24 meses
Funo existente (baseado apenas nas respostas dos pais e/ou curadores): viso, audio, comunicao, alimentao, mobilidade. Envolvimento sistmico especfico: convulses, encefalopatia, gastrointestinal, endcrino, respiratrio, cardiovascular, renal, heptico, hematolgico. De acordo com entrevista aos pais, conhecimento clnico da criana e registos clnicos. Avaliao clnica actual (no dia da consulta): crescimento (peso e estatura), desenvolvimento psicomotor, viso, ptose e movimento ocular, miopatia, piramidal, extrapiramidal, neuropatia. Questionrio com itens sobre qualidade de vida: a preencher pelos pais ou curadores.
Qualidade de vida - a preencher pelos pais (0-24 meses)

Este questionrio destina-se a dar-nos a sua opinio acerca da sade do (a) seu (sua) filho(a) nos ltimos tempos. Por favor, responda a todas as questes com um x no quadradinho em frente frase que lhe parecer mais adequada resposta que quer dar.
1) Como classificaria a sade geral do seu(sua) filho(a) nas ltimas 4 semanas? Muito m M Razovel Boa Muito boa
2) At que ponto que os problemas de sade fsica do(a) seu(sua) filho(a) limitaram a sua actividade (tal como moverse/deslocar-se ou brincar) nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
3) Como classificaria a energia/ vitalidade do(a) seu(sua) filho(a) nas ltimas 4 semanas? Nenhuma Pouca Alguma Bastante Muita
4) Como classificaria as dores/desconforto que o(a) seu(sua) filho(a) teve nas ltimas 4 semanas? Muitas Bastantes Algumas Poucas Nenhumas
5) Como classificaria o comportamento do(a) seu(sua) filho(a) em comparao com as outras crianas da mesma idade, nas ltimas 4 semanas? Muito mau/pobre Mau Razovel Bom Muito bom
6) Como classificaria a capacidade do(a) seu(sua) filho(a) para interagir com outras pessoas (ex: consigo, com os irmos ou outras crianas da mesma idade) em comparao o de outras crianas da idade dele(a), nas ltimas 4 semanas? Muito mau/pobre Mau Razovel Bom Muito bom
7) At que ponto que voc (pai/ me ou prestador de cuidados) teve problemas emocionais (ex: ansiedade, tristeza) provocados da doena do(a) seu (sua) filho(a), nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nenhum
8) At que ponto que teve o seu tempo limitado devido doena do(a) seu(sua) filho(a), nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
9) At que ponto que as actividades da famlia foram limitadas ou interrompidas devido doena do(a) seu(sua) filho(a), nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
10) Qual foi o custo financeiro da doena do(a) seu(sua) filho(a), nos ltimos 6 meses?
275
Captulo 9 Anexos
Muito elevado
Elevado
Moderado
Pequeno
Nenhum
11) Como classificaria a harmonia da sua famlia (capacidade/ habilidade da sua famlia para ir levando a vida), nas ltimas 4 semanas? Muito m M Razovel Boa Muito boa
12) Com que frequncia que a doena do(a) seu(sua) filho(a) teve um efeito positivo no(a) seu(sua) filho(a), no(a) senhor(a) ou na sua famlia (ex: ser bem tratada devido doena, conhecer gente nova), nas ltimas 4 semanas? Nunca Raramente Ocasionalmente Frequentemente Quase sempre
276
Captulo 9 Anexos
Tabela 48 - Doena Mitocondrial - Escala de Seguimento de Newcastle (2 - 11 A).
2 aos 11 anos
Funo existente (baseado apenas nas respostas dos pais e/ou curadores): viso, audio, comunicao, alimentao, cuidados pessoais (higiene, vestir, uso de utenslios ex: para comer) mobilidade, rendimento escolar. Envolvimento sistmico especfico: convulses, encefalopatia, episdios tipo acidente vascular cerebral (AVC), gastrointestinal, endcrino, respiratrio, cardiovascular, renal, heptico, hematolgico. De acordo com entrevista aos pais/criana, conhecimento clnico da criana e registos clnicos. Avaliao clnica actual (no dia da consulta): crescimento (peso e estatura), desenvolvimento psicomotor, viso, ptose e movimento ocular, miopatia, ataxia, piramidal, extrapiramidal, neuropatia. Questionrios com itens sobre qualidade de vida: a preencher pelos pais /curadores e pela criana dos 7 aos 11 anos.
Qualidade de vida - a preencher pelos pais (2-11 anos)

1) Como classificaria a sade geral do(a) seu(sua) filho(a) nas ltimas 4 semanas? Muito m M Razovel Boa Muito boa
2) At que ponto que os problemas de sade fsica do(a) seu(sua) filho(a) limitaram a sua actividade (tal como caminhar ou brincar com os amigos) nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
3) Nas ltimas 4 semanas at que ponto que os problemas de sade do(a) seu(sua) filho(a) limitaram a sua vida diria (tal como frequentar a escola, cuidar de si prprio) comparado com uma criana da mesma idade em perfeita sade? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
4) Quanta energia/ vitalidade teve o(a) seu(sua) filho(a) nas ltimas 4 semanas? Nenhuma Pouca Alguma Bastante Muita
5) Quantas dores/desconforto teve o (a) seu (sua) filho(a) nas ltimas 4 semanas? Muitas Bastantes Algumas Poucas Nenhumas
6) Nas ltimas 4 semanas at que ponto que o(a) seu(sua) filho(a) foi perturbado(a) por problemas emocionais? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
7) Nas ltimas 4 semanas at que ponto que o(a) seu(sua) filho(a) se mostrou satisfeito com as suas capacidades, o seu aspecto, a sua relao com as outras pessoas e a vida em geral. Muito insatisfeito Bastante insatisfeito Nem satisfeito nem insatisfeito Bastante satisfeito Muito satisfeito
8) Como classificaria o comportamento do(a) seu(sua) filho(a) em comparao com as outras crianas da mesma idade, nas ltimas 4 semanas? Muito mau/pobre Mau Razovel Bom Muito bom
9) Como classificaria a capacidade do(a) seu(sua) filho(a) interagir com outras pessoas (ex: fazer amigos, falar com outras
277
Captulo 9 Anexos
crianas ou estranhos) em comparao com as outras crianas da mesma idade, nas ltimas 4 semanas? Muito m M Razovel Boa Muito boa
10) At que ponto que voc (pai/ me ou prestador de cuidados) teve problemas emocionais (ex: ansiedade, tristeza) provocados pela doena do(a) seu (sua) filho(a), nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nenhum
13) Qual foi o custo financeiro da doena do(a) seu(sua) filho(a), nos ltimos 6 meses? Muito elevado Elevado Moderado Pequeno Nenhum
15) Com que frequncia que a doena do(a) seu(sua) filho(a) teve um efeito positivo no(a) seu(sua) filho(a), no(a) senhor(a) ou na sua famlia (ex: ser bem tratada devido doena, conhecer gente nova), nas ltimas 4 semanas? Nunca Raramente Ocasionalmente Frequentemente Quase sempre
Qualidade de vida a preencher pelo prprio (7-11 anos)

Gostaramos de saber como te tens sentido recentemente. Por favor, responde a todas as perguntas com um x no quadradinho em frente frase que te parecer mais adequada resposta que queres dar.
1) Como classificarias o teu estado de sade geral nas ltimas 4 semanas? Muito mau Mau Razovel Bom Muito bom
2) At que ponto que os teus problemas de sade limitaram a tua actividade fsica (tal como caminhar ou sair com os teus amigos nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
3) At que ponto que os teus problemas de sade limitaram a tua vida diria (tal como ir escola, cuidar de ti prprio), em comparao com uma pessoa da tua idade de perfeita sade, nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
4) Como te sentiste nas ltimas 4 semanas, em termos de energia/ vitalidade ? Nenhuma Pouca Alguma Bastante Muita
5) Tiveste dores ou desconforto nas ltimas 4 semanas? Muitas Bastantes Algumas Poucas Nenhumas
6) At que ponto que tiveste problemas emocionais (ex: sentires-te triste ou assustado), nas ltimas 4 semanas? Muitos Bastantes Alguns Poucos Nenhum
7) Nas ltimas 4 semanas at que ponto que te sentiste satisfeito com as tuas capacidades, o teu aspecto, a relao com as
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Captulo 9 Anexos
outras pessoas e a vida em geral. Muito insatisfeito Bastante insatisfeito Nem satisfeito nem insatisfeito Bastante satisfeito Muito satisfeito
8) Como classificarias o teu comportamento, em comparao com as outras pessoas da tua idade, nas ltimas 4 semanas? Muito mau Mau Razovel Bom Muito bom
9) At que ponto que achaste fcil conviver com os outros (ex: fazer amigos, falar com amigos ou estranhos) em comparao com as outras pessoas da tua idade, nas ltimas 4 semanas? Muito difcil Difcil Normal Fcil Muito fcil
10) Como classificarias a harmonia da tua famlia (capacidade/ habilidade da sua famlia para ir levando a vida), nas ltimas 4 semanas? Muito m M Razovel Boa Muito boa
11) Com que frequncia que a tua doena teve um efeito positivo em ti ou na sua famlia (ex: ser bem tratado devido tua doena, conhecer gente nova), nas ltimas 4 semanas? Nunca Raramente Ocasionalmente Frequentemente Quase sempre
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Captulo 9 Anexos
Tabela 49 - Doena Mitocondrial - Escala de Seguimento de Newcastle (12 - 18 A). 12-18 anos Funo existente (baseado apenas nas respostas dos pais e/ou curadores e criana): viso, audio, comunicao, alimentao, cuidados pessoais (higiene, vestir, uso de utenslios ex: para comer) mobilidade, rendimento escolar. Envolvimento sistmico especfico: convulses, encefalopatia, episdios tipo AVC, gastrointestinal, endcrino, respiratrio, cardiovascular, renal, heptico, hematolgico. De acordo com entrevista aos pais/criana, conhecimento clnico da criana e registos clnicos. Avaliao clnica actual (no dia da consulta): crescimento (peso e estatura), desenvolvimento psicomotor, viso, ptose e movimento ocular, miopatia, ataxia, piramidal, extrapiramidal, neuropatia. Questionrios com itens sobre qualidade de vida: um a preencher pelos pais /curadores e outro, pela criana.
Qualidade de vida - a preencher pelos pais (12-18 anos)

1) Como classificaria a sade geral do(a) seu(sua) filho(a) nas ltimas 4 semanas? Muito m M Razovel Boa Muito boa
2) At que ponto que os problemas de sade fsica do(a) seu (sua) filho(a) limitaram a sua actividade (tal como caminhar ou divertir-se com os amigos) nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
3) At que ponto que os problemas de sade do(a) seu(sua) filho(a) limitaram a sua vida diria (tal como frequentar a escola, cuidar de si prprio) comparado com uma pessoa da mesma idade em perfeita sade, nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
4) Como classificaria a energia/ vitalidade do(a) seu(sua) filho(a), nas ltimas 4 semanas? Nenhuma Pouca Alguma Bastante Muita
5) Como classificaria as dores/desconforto que o(a) seu(sua) filho(a) teve nas ltimas 4 semanas? Muitas Bastantes Algumas Poucas Nenhumas
6) Nas ltimas 4 semanas at que ponto que o(a) seu(sua) filho(a) foi perturbado(a) por problemas emocionais? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
7) Nas ltimas 4 semanas at que ponto que o(a) seu(sua) filho(a) se mostrou satisfeito(a) com as suas capacidades, o seu aspecto, a sua relao com as outras pessoas e a vida em geral? Muito insatisfeito Bastante insatisfeito Nem satisfeito nem insatisfeito Bastante satisfeito Muito satisfeito
8) Como classificaria o comportamento do(a) seu (sua) filho(a) em comparao com os outros adolescentes da mesma idade, nas ltimas 4 semanas? Muito mau/pobre Mau Razovel Bom Muito bom
9) Como classificaria a capacidade do seu (sua) filho(a) interagir com outras pessoas (ex: fazer amigos, falar com outras pessoas ou estranhos) em comparao com os outros adolescentes da mesma idade, nas ltimas 4 semanas?
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Captulo 9 Anexos
Muito m
Razovel
Boa
Muito boa
10) At que ponto que voc (pai/ me ou prestador de cuidados) teve problemas emocionais (ex: ansiedade, tristeza) provocados pela doena do(a) seu(sua) filho(a), nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nenhum
13) Qual foi o custo financeiro da doena do(a) seu(sua) filho(a), nos ltimos 6 meses? Muito elevado Elevado Moderado Pequeno Nenhum
15) Com que frequncia que a doena do(a) seu (sua) filho(a) teve um efeito positivo no(a) seu (sua) filho(a), no(a) senhor(a) ou na sua famlia (ex: ser bem tratada devido doena, conhecer gente nova), nas ltimas 4 semanas? Nunca Raramente Ocasionalmente Frequentemente Quase sempre
Qualidade de vida a preencher pelo prprio (12-18 anos)

Gostaramos de saber como te tens sentido recentemente. Por favor, responde a todas as perguntas com um x no quadradinho em frente frase que te parecer mais adequada resposta que queres dar.
1) Como classificarias o teu estado de sade geral, nas ltimas 4 semanas? Muito mau Mau Razovel Bom Muito bom
2) At que ponto que os teus problemas de sade limitaram a tua actividade fsica (tal como caminhar ou sair com os teus amigos) nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
3) At que ponto que os teus problemas de sade limitaram a tua vida diria (tal como ir escola, cuidar de ti prprio), em comparao com uma pessoa da tua idade de perfeita sade, nas ltimas 4 semanas? Muitssimo Muito Bastante Um pouco Nada
4) Como te sentiste nas ltimas 4 semanas, em termos de energia? Nenhuma Pouca Alguma Bastante Muita
5) Tiveste dores ou desconforto nas ltimas 4 semanas? Muitas Bastantes Algumas Poucas Nenhumas
6) At que ponto que tiveste problemas emocionais (ex: sentires-te triste ou assustado), nas ltimas 4 semanas? Muitos Bastantes Alguns Poucos Nenhum
7) Nas ltimas 4 semanas at que ponto que te sentiste satisfeito com as tuas capacidades, o teu aspecto, a relao com as outras pessoas e a vida em geral?
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Captulo 9 Anexos
Muito insatisfeito
Bastante insatisfeito
Nem satisfeito nem insatisfeito
Bastante satisfeito
Muito satisfeito
8) Como classificarias o teu comportamento, em comparao com as outras pessoas da tua idade, nas ltimas 4 semanas? Muito mau Mau Razovel Bom Muito bom
9) At que ponto que achaste fcil conviver com os outros (ex: fazer amigos, falar com amigos ou estranhos) em comparao com as outras pessoas da tua idade, nas ltimas 4 semanas? Muito difcil Difcil Normal Fcil Muito fcil
10) Como classificarias a harmonia da tua famlia (capacidade/ habilidade da sua famlia para ir levando a vida), nas ltimas 4 semanas? Muito m M Razovel Boa Muito boa
11) Com que frequncia que a tua doena teve um efeito positivo em ti ou na sua famlia (ex: ser bem tratado devido tua doena, conhecer gente nova), nas ltimas 4 semanas? Nunca Raramente Ocasionalmente Frequentemente Quase sempre
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Captulo 9 Anexos
9.5 Doena mitocondrial na Regio Centro de Portugal -publicao
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Captulo 9 Anexos
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Captulo 9 Anexos
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Lusa Maria de Abreu Freire Diogo Matos

Caracterizao Clnica e Bioqumica das Doenas Mitocondriais na Criana

Universidade de Coimbra 2009

Sob a forma de artigo original:

2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.3

2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4

4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3 4.4 4.5

5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.2

Doena mitocondrial na criana na Regio Centro de Portugal.....................141 Incidncia......................................................................................141 Prevalncia ....................................................................................141

5.2.1 5.2.2 5.3 5.4

5.4.1 5.4.2 5.4.3

6.1.1 6.1.2 6.2

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.3

As doenas mitocondriais na Regio Centro de Portugal .............................205

2.1 Razo de ser deste trabalho

2.2 Importncia e actualidade do tema

Estrutura e funes energtica e termognica das mitocndrias

Figura 1 - Importncia da mitocndria no metabolismo celular.

Figura 2 - Principais vias de produo de energia - papel da mitocndria.

MEM Figura 3 - Estrutura da mitocndria - compartimentos mitocondriais.

Figura 4 - Esquema funcional da cadeia respiratria mitocondrial.

(Adaptado de DiMauro e Schon, 2006)

importantes no estudo laboratorial das funes mitocondriais (Rustin et al., 1994).

Dupla regulao gentica da mitocndria

Figura 5 - Dupla regulao gentica da mitocndria

(adaptado de MITOMAP, 2008 e de DiMauro e Schon, 2006)

Figura 6 - Segregao mittica das mitocndrias durante a diviso celular.

(adaptado de Shoffner e Wallace, 1995)

Stress oxidativo, apoptose e envelhecimento

externo pode gerar potencial de membrana e a sntese de

2.3 As doenas da cadeia respiratria mitocondrial

Definio e manifestaes clnicas

nomeadamente digestivos, muito frequente e pode ser de incio pr-natal (Munnich et 30

Figura 8 - Mapa de morbilidade do genoma humano mitocondrial.

(adaptado de DiMauro e Schon, 2006)

Sndrome (Mitochondrial autossmica

de depleo Depletion recessiva,

DNA mitocondrial (OMIM uma fatal doena antes

Figura 9 - Doenas da cadeia respiratria mitocondrial com origem no nDNA no mtDNA .

(adaptado de DiMauro e Schon, 2006)

Das iniciais dos sintomas definidores:

(Tranebjaerg et al., 1995; Ezquerra et al., 2005).

heteroplsmicas do mtDNA (Cormier et al., 1990; McShane et al., 1991).

CO2 formado, um mtodo

P RMS, entre outras)

P RMN, no se manteve nem ocorreu noutros casos

Prognstico e aconselhamento gentico

Captulo 4 Material e Mtodos

CAPTULO 4 - MATERIAL E MTODOS

Captulo 4 Material e Mtodos

Captulo 4 Material e Mtodos

4.1 Caracterizao da amostra em estudo

Captulo 4 Material e Mtodos

acontecendo com as insuficincias cardaca e renal associadas a falncia multiorgnica 66

Captulo 4 Material e Mtodos

Captulo 4 Material e Mtodos

4.2 Estudos mitocondriais

Captulo 4 Material e Mtodos

Captulo 4 Material e Mtodos

Captulo 4 Material e Mtodos

Estudos de gentica molecular

Captulo 4 Material e Mtodos

Captulo 4 Material e Mtodos

4.3 Critrios de diagnstico utilizados