Prctica N1: Fragilidad osmtica del eritrocito

Objetivo:
a)

Conocer la fragilidad de los eritrocitos frente a diferentes efectos fsicos y qumicos.

Teora: El paso del agua hacia dentro o fuera de las clulas es un proceso biolgico de importancia. Si las concentraciones mol/L de solutos en ambos lados de la membrana celular son las mismas, la presin osmtica es igual y las soluciones son isotnicas sin que haya paso neto de lquido en ningn sentido. La concentracin de solutos en la sangre es isotnica con una solucin de 0,9% de cloruro de sodio. La concentracin de cloruro de sodio 0,85< 0,9%, se llama solucin salina normal o fisiolgica o suero fisiolgico. Si los glbulos rojos se colocan en una solucin salina de distinta concentracin ml/L por ejemplo agua destilada (0 mol/L), el agua entra en el eritrocito que se hincha al lmite de su capacidad, se rompe la membrana plasmtica y la hemoglobina que contiene se dispersa al estado molecular de la solucin. El proceso se llama hemlisis y puede producirse por otros mecanismos diferentes de la accin osmtica, como es el efecto de enzimas, sustancias qumicas, toxinas, etc. En una forma hereditaria de anemia, la esferocitosis, la fragilidad osmtica de los eritrocitos est aumentada y es uno de los elementos de diagnstico. Si los eritrocitos se colocan en una solucin de mayor concentracin de solutos hipertnica- el agua sale de los eritrocitos que se arrugan y aparecen al microscopio como ruedas dentadas (crenados). Algunos de los solutos del plasma sanguneo no son capaces de atravesar las paredes de los capilares y esto confiere una mayor presin osmtica que la del lquido extracelular y como resultado una movilizacin de agua hacia dentro de los capilares que mantienen las venas llenas y previenen el colapso. En algunos casos de desnutricin o de falla renal la concentracin de solutos (albmina) en el plasma disminuye y el flujo de agua hacia dentro de las venas disminuye y sta se acumula en los tejidos que se hinchan en la condicin llamada edema. Los lquidos para uso intravenoso deben ser isotnicos, y el tratamiento del colapso vascular del shock se hace con transfusin de plasma (albmina) con solutos que no atraviesan las paredes vasculares.
Material y Reactivos:

1.
2. 3. 4. 5.

Tubos y pipetas Espectrofotmetro Centrfuga, Potencimetro, Bao de Mara.

6. Muestra biolgica: sangre de mamfero y ave 7. Solucin anticoagulante de ethylen diamine tetra-acetico (EDTA) 0,1%. Usar 500uL por cada 3 mL. 8. Solucin salina amortiguadora (fosfato salino) a pH 7,4 de cloruro de sodio al 1%

Mg. Ana Gutirrez Romn (anaisabelflor@gmail.com)

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Experimento N1: Fragilidad Osmtica

Procedimiento: Para cada muestra sangunea realizar el siguiente esquema de evaluacin: Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Concentracin de NaCl % 0,00 0,10 0,35 0,45 0,50 0,55 0.6 0,7 0,85 Sol. Fosfato salino (NaCl 0,00 0,50 1,75 2,25 2,50 2,75 3,0 3,5 4,25 1%) pH 7,4 ml. Agua destilada ml. 5,00 4,50 3,25 2,75 2,50 2,25 2,0 1,5 0,75 Sangre total con EDTA 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 ml. Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer en espectrofotmetro a 530 nm usando el tubo 9 como blanco (0% de hemlisis) Haga una grfica de los valores de hemlisis en % contra la concentracin de NaCl

Experimento N2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad osmtica

Procedimiento: Reactivos Concentracin de NaCl Sol. Fosfato salino (NaCl 1%), pH7,4 Agua destilada Sangre total con EDTA Mezcla e incubar a C / 30 minutos % ml. ml. ml. 1 0,00 0,00 5,00 0,05 ambiente 2 0,85 4,25 0,75 0,05 Sobre hielo 3 0,85 4,25 0,75 0,05 ambiente 4 0,85 4,25 0,75 0,05 37 5 0,85 4,25 0,75 0,05 45

Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer el sobrenadante en espectrofotmetro a 530 nm. Usar agua destilada como blanco. Expresar el resultado como el porcentaje de hemlisis a cada valor de temperatura de incubacin. Se calcula utilizando el valor de la absorbancia del sobrenadante del tubo donde ocurre la mxima hemlisis como el 100%.

Experimento N3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmtica

Procedimiento: Reactivos Concentracin de NaCl pH Sol. Fosfato salino (NaCl 1%) Agua destilada Sangre total con EDTA % ml. ml. ml. 1 0,00 0,00 5,00 0,05 2 0,85 5,6 4,25 0,75 0,05 3 0,85 7,4 4,25 0,75 0,05 4 0,85 8,9 4,25 0,75 0,05

Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer el sobrenadante en espectrofotmetro a 530 nm. Usar agua destilada como blanco. Expresar el resultado como el porcentaje de hemlisis a cada valor de pH. Se calcula utilizando el valor de absorbancia del sobrenadante, del tubo donde ocurre la mxima hemlisis como el 100%.
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Cuestionario: 1. Una solucin salina que es isotnica para eritrocitos es necesariamente isotnica para otro tipo de clulas? 2. Cules son las causas de la hipernatremia? 3. Cmo se comportara el eritrocito en un estado de hipernatremia?

Literatura complementaria: Michael J. Dewey. Jamie L. Brown, y Ferez S. Nallaseth.1982 Genetic Differences in Red Cell Osmotic Fragility: Analysis in Allophenic Mice. Blood, 59: 986-989 J. H. BOLTON 1949. The distribution curve of erythrocyte fragility: a different method of presentation of fragility of erythrocytes to hypotonic saline, with preliminary remarks on the function of reticulocytes. Blood 4: 172-178

Mg. Ana Gutirrez Romn (anaisabelflor@gmail.com)

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