Universitatea Tehnica Gh. Asachi Iasi.

Facultatea de Inginerie Chimica si Protectia Mediului

Determinarea rapid a cafeinei utiliznd microextracia cu solvent i cromatografia gazoas cuplat cu spectrometria de mas

Botezatu Vasilica Madalina

Grupa:2502 Specializare:PFC

Introducere
n 1820, la solicitarea lui Goethe, farmacistul german Friedlieb Ferdinand Rungef izoleaz cofein pur din boabele de cafea. n 1821, independent de Runge, farmacitii francezi Pierre Joseph Pelletier, Joseph Bienaim Caventou i Pierre Robiquet reuesc de asemenea s izoleze cafeina. n anul 1832 Pfaff i Justus von Liebig descoper formula chimic a cofeinei (C8H10N4O2) Formula structural va fi descoperit n 1895 de Hermann Emil Fischer. Numele de cafein provine de la cafea, din care a fost izolat pentru prima oar substana. Dup nomenclatura IUPAC, denumirea cafeinei este 1,3,7-Trimethyl-2,6-purindion sau, pe scurt, 1,3,7-Trimethylxanthin . Cafeina face parte din grupul purinelor, ca i teofilina i teobromina. Structura cafeinei const dintr-un inel dublu, care la exterior are o serie de substitueni, n centru fiind nucleul purinic. Cafeina sau cofeina se gsete n principal n Coffea arabica i Camellia thea. Exist o serie de buturi stimulante care conin cofein: Pepsi Cola 25-30mg sau ceaiul negru 50-100 mg. Cafeina este un stimulant psihomotor cu efect de intensitate moderat, care se menine pn la 8 ore. Dozele de 100-200 mg au ca efect o stare de voiciune, atenueaz starea de oboseal, cresc capacitatea de efort intelectual i/sau fizic i amelioreaz performanele psihomotorii .
Dozele de 250-300 mg produc efecte diferite: fie de iritabilitate, nervozitate, tremur, insomnie, pirozis dac sunt administrate la consumatorii ocazionali, fie senzaie de bine, scderea iritabilitii, senzaie de bine dac doza este administrat la consumatorii cronici. Efectul stimulant respirator este minim la doze mici, dar poate deveni relevant prin mrirea reactivitii centrilor bulbari la dioxidul de carbon. Cafeina particip i la relaxarea musculaturii netede bronice, cu ameliorarea schimburilor gazoase sub aspect cantitativ. Cafeina stimuleaz contracia inimii, cu consum mrit de oxigen la nivelul miocardului, ceea ce poate fi considerat ca factor limitativ al performanei cardiace. La nivelul circulaiei periferice, determin o vasodilataie arteriolar cu scderea rezistenei locale. Cafeina este un puternic stimulant al secreiei gastrice clorhidropeptice. La nivel renal crete circulaia sanguin i inhib reabsorbia

tubular de sare, ceea ce produce efectul de slab diuretic. Cei ce sufera de ulcer, boli de inima, hipertensiune arteriala si anemie trebuie sa evite utilizarea cafeinei. Consumul indelungat de cafeina poate sa dea un oarecare grad de dependenta, iar la intreruperea brusca a administrarii apare sindromul de sevraj, manifestat prin iritabilitate si dureri de cap.

Determinarea rapid a cafeinei dintr-o singur pictura de buturi i produse alimentare, utiliznd microextracia cu solvent i cromatografia gazoas cuplat cu spectrometria de mas

S-a propus o metod simpl i rapid de curare a probei i preconcentrare pentru determinarea cantitativ a cafeinei ntr-o pictur din buturi i produse alimentare prin cromatografie gazoas cuplat cu spectrometria de mas (GC/MS), utiliznd microextracia cu solvent pictur cu pictur (DDSME). Condiiile optime experimentale pentru DDSME au fost: cloroformul ca solvent de extracie, timp de extracie de 5 minute, 0.5L volumul fazei extrase i nici un adaos de sare la temperatura camerei. Aceast metod optimizat prezint o liniaritate bun ntre 0.05 i 5.0 g/mL, cu un coeficient de corelaie de 0.980. Deviaia standard relativ (RSD) i limitele de detecie (LOD) ale metodei DDSME/GC/MS au fost de 4.4%, respectiv 4.0 ng/mL. Recuperarea relativ a cafeinei din buturi i produse alimentare a fost de 96.6-101%, ceea ce arat o fiabilitate bun a acestei metode. DDSME exclude dezavantajele majore ale acestei metode convenionale de extracie a cafeinei, cum ar fi consumul mare de probe i de solvent organic, precum i procesul lung de pre-tratare al probei. Acest studiu dovedete c tehnica DDSME/GC/MS poate fi aplicat ca un instrument de diagnostic simplu, rapid i fezabil pentru aplicaii biologice, ale mediului nconjurtor sau ale produselor alimentare, pentru analiza real a unor cantiti foarte mici de prob.

1. Introducere
Cafein (1,3,7-trimetilxantina sau 3,7-dihidro-1,3,7- trimetil-1H-purina-2,6-diona) este un alcaloid ce apare n mod natural n frunzele de ceai, boabe de cafea i boabe de cacao sau frunze

i este utilizat n mod tradiional pentru efectele sale stimulatoare. Oamenii consum cafein n cafea, ceai, cacao, ciocolat, multe buturi rcoritoare i unele medicamente. Cafeina pur este inodor i are un gust amar. Aceasta este unul din aditivii permii, din punct de vedere legal, n buturi, avnd o limit superioar de tolerabilitate de 0.015% (g/g). Aceasta stimuleaz sistemul nervos central i inima, acioneaz ca diuretic i intensific activitatea creierului. Cu toate acestea, cantitatea mare de cafein consumat de fiinele umane poate cauza simptome nedorite, cum ar fi tremor, tahicardie, problem gastrointestinal, convulsii i chiar moarte. Prin urmare, este important s se monitorizeze cafeina n buturi i alimente pentru meninerea sntoas a organismului. S-au propus mai multe metode de analiz bazate pe spectrometria UV-vis, HPLC, GC, spectrometria IR cu transformata Fourier (FTIR), cromatografia de schimb ionic, electroforeza capilar (CE) pentru determinarea cafeinei din buturi i produse alimentare. Dintre aceste metode, metodele spectrometrice implic etape obositoare, laborioase i care necesit timp pentru pre-tratarea a probelor, i de asemenea, exist posibilitatea producerii interferenelor (teobromina i teofilina). Determinarea cromatografic a analiilor necesit prepararea probelor prin extracia lichidlichid (LLE) sau prin extracia n faz solid (SPE). Aceste metode necesit, de asemenea, timp i o cantitate mare de reactivi i solveni. Microextracia recent a analiilor prin microextracia n faz solid (SPME) i microextracia n faz lichid (LPME), incluznd microextracia ntr-o singur pictur (SDME), microextracia n faz lichid pe diferite fibre (HP-LPME) i microextracia cu solvent pictur cu pictur (DDSME) au fost aplicate cu succes pentru analiza probelor farmaceutice i de mediu. Dintre aceste metode, SPME i HF-LPME necesit fibre pentru extracia analiilor. n ceea ce privete metoda SDME, doar o singur micro-pictur de solvent este utilizat c faz acceptoare, care este agat n vrful unei microseringi i imersat n soluie apoas pentru extracia analiilor.. Aceast metod este foarte simpl, comod i are costuri foarte mici n comparaie cu SPME i HF-LPME. SDME folosete pn la 20mL soluie apoas pentru extracia analiilor. n faza organic. Din punct de vedere comercial i economic, volumul de prob ar trebui redus la o cantitate mai mic, ceea ce ar putea fi util pentru industria de consum i producie deoarece poate reduce, cu siguran, costul probelor. Astfel, DDSME este cea mai

bun tehnic care se potrivete acestor obiective deoarece doar o pictur (7L) de prob din soluie a fost utilizat pentru extracia analitului. Aceasta este prima aplicaie a metodei DDSME/GC/MS utilizat pentru analiza unor probe reale de buturi i produse alimentare, utilizndu-se 7L (o pictur) de prob din soluie pentru extracia cafeinei timp de 5 minute la temperatura camerei i, ulterior, determinat prin GC/MS.

2. Analiza experimental
2.1. Reactivi i produse chimice Apa purificat a fost preparat cu ajutorul sistemului Milli-Q. Toi solvenii organici au fost de grad HPLC. Metanolul a fost achiziionat de la Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, SUA). Cloroformul i diclormetanul au fost obinute de la Mallinckrodt (Paris, KY, SUA). Toluenul a fost achiziionat de la J.T. Baker (NJ, SUA). Octanul a fost achiziionat de la SigmaAldrich (Steinheim, Germania), iar cafeina de la Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Soluia stoc standard a fost preparat prin dizolvarea a 10 mg cafein n 10 mL de metanol i a fost depozitat n sticle cu dop la 200C. Soluiile de lucru standard au fost preparate prin diluarea soluiei stoc standard n ap deionizat. 2.2. Colectarea i prepararea probelor ase buturi (Coca Cola, Spirit, Coca Cola Light, Pepsi, cafea Columbia, Tea Drink) i ase produse alimentare (Ceai negru, verde i ceai Oolong, cafea Nescafe, ciocolat Kaisers Milk, stafide Choco Ball), au fost colectate de pe pieele locale din Tamusi, Taiwan. Probe de 25 mL de buturi au fost colectate n pahare de 100 mL i pstrate ntr-o baie cu ultrasunete timp de 10 minute pentru a se degaja gazul prezent n probe. Apoi, dup ce a fost filtrat prin hrtie de filtru Whatman nr 44, filtratul a fost diluat cu ap deionizat n funcie de cafeina prezent n probe. Probe de 0.5 g de ceai negru, verde i ceai Oolong i cafea Nescafe au fost cntrite separat n pahare de 100 mL, i 45 mL de ap fierbinte a fost adugat fiecrei probe. Probele au fost pstrate n ap fierbinte timp de 5 minute, cu o temperatur constant de 80 0C. Soluia a fost filtrate prin hrtie de filtru Whatman nr 44, iar filtratul a fost diluat n funcie de concentraia cafeinei prezent n prob.

O prob de 4.0 g ciocolat a fost dizolvat n 45 mL ap fierbinte i amestecat cu un agitator mecanic, meninnd temperatura la 800C timp de 30 min. Soluia a fost filtrat prin hrtie de filtru, iar diluia a fost fcut n funcie de concentraia de cafein prezent. 2.3. Modaliti de extracie ale microextraciei cu solvent pictur cu pictur n Fig. 1 este prezentat o schi a aparaturii DDSME pentru extracia cafeinei dintr-o pictur de prob din soluie. O pictur (7L) de ap pur coninnd 10 g/mL cafein a fost colectat ntr-o fiol de 100 L. Apoi, 1 L de solvent organic acceptor a fost colectat ntr-o microsering de 10 L pentru extracia DDSME i injectarea n sistemul GC/MS. nainte de extracia cafeinei, microseringa a fost splat cu solvent de extractive pentru a preveni bulele de aer care pot duce la erori n ceea ce privete reproductibilitatea rezultatelor. Acul a fost introdus n fiol cu prob i imersat n prob de soluie apoas. Seringa a fost inut n poziie fix n scopul de a plasa consecvent vrful acului n 7L faza apoas. Apoi, pistonul seringii a fost lsat jos pentru a expune 5L de solvent de extracie n faz apoas. Dup 5 minute, doar pictura organic a fost luat napoi n sering. n cele din urm, seringa a fost retras din fiol cu prob i solventul extras a fost injectat direct n sistemul GC/MS pentru analiza cafeinei. Toate experimentele au fost realizate la temperatura camerei.

Fig.1. Schta aparaturii DDSME pentru extracia cafeinei dintr-o pictur de soluie

2.4. Analiza GC/MS Analiza cafeinei a fost realizat ntr-un sistem GC model Varian 3800, combinat cu un spectrometru de mas cu surs intern de captare a ionilor, n conformitate cu modalitatea de ionizarea electronic. Heliu (99.999%) a fost utilizat ca gaz de transport cu un debit de 1.0 ml/min. Separarea prin GC a cafeinei a fost realizat prin utilizarea unei coloane capilare DB-5 obinut de la Supelco, Bellefonte, PA, USA. Urmtorul program de temperatur a fost meninut n timpul separrii cafeinei: 150 0C timp de 1 minut, 2300C cu 200C/min timp de 2 minute, iar timpul total al analizei a fost de 7 minute. Injectrile au fost realizate la 2500C. Dispozitivul de captare, linia de transmisie i colectorul au fost setate la 200, 280 i respectiv 500C. Gama de mase a spectrelor a fost de 50-250 Da. Monitorizare selectiv a ionilor (SIM) a fost utilizat pentru a efectua toate experimentele cantitative ale cafeinei. Ionii utilizai pentru confirmarea valorilor m/z ale cafeinei au fost 194, 109, 82 i 52.

3. Rezultate i discuii
3.1. Optimizarea metodei DDSME n acest studiu, metoda DDSME a fost aplicat pentru toate extraciile cafeinei din faza apoas n faza organic. Cel mai bun randament de extracie al cafeinei a fost realizat prin optimizarea efectelor seleciei solventului, timpului de extracie, volumului expus al fazei extrase, precum i adugarea de sare n faza apoas. Eficiena metodei de extracie a fost evaluat n funcie de media peak-urilor a trei injectri succesive (n=3). 3.1.1. Selectarea solventului organic Proprietile chimice ale unor solveni organici diferii s-au bazat pe polaritatea acestora, solubilitatea analiilor. i caracterul imiscibil cu faza apoas. De asemenea, acetia ar trebui s prezinte un comportament excelent n ceea ce privete GC. Solvenii organici utilizai pentru extracia cafeinei din faza apoas au fost cloroformul, diclormetanul, toluenul i n-octanul, extracie timp de 5 minute la temperatura camerei n absena adaosului de sare. Cloroformul s-a dovedit a fi cel mai potrivit solvent pentru extracia cafeinei din soluie apoas, datorit solubilitii ridicate ale substanelor analizate cu acesta. De asemenea, solubilitatea cafeinei n cloroform este de nou ori mai mare dect a apei la temperatura camerei.

Astfel, cloroformul a fost ales pentru determinrile experimentale ulterioare. Rezultatele efectului solvenilor sunt prezentate n tabelul 1. 3.1.2. Timpul de extracie Timpul de extracie este un alt factor care ar putea afecta eficiena extraciei analiilor. din faza apoas n faza organic. Ca i cu LLE i SPME, nu este necesar pentru LPME s ating echilibrul, deoarece aceasta nu este o extracie complet, ci o compartimentare ntre faza apoas i cea organic. Efectul timpului de extracie asupra eficienei extraciei cafeinei din faza apoas a fost studiat prin monitorizarea variaiei zonei peak-ului, cu timpul de extracie de 3, 5, 7, 10 i 15 minute, la temperatura camerei. Tabel 1. Efectul solventului asupra eficienei extraciei cafeinei utiliznd DDSME/GC/MS

O serie de probe de ap (10 g/mL de cafein) au fost preparate, iar variaia zonei peak-ului a fost investigat aa cum se poate vedea n Fig. 2. Eficiena extraciei s-a dovedit a fi maxim la 5 minute, iar apoi a sczut rapid. n DDSME, dup timpul de extracie de 5 minute, a aprut problema epuizrii solventului, ceea ce a cauzat scderea eficienei de extracie a solventului. Prin urmare, timpul de extracie de 5 minute a fost utilizat pentru extracia cafeinei pentru experimentele ulterioare.

Fig.2. Efectul profilelor timpului asupra eficienei extraciei cafeinei obinut prin DDSME (nivelul concentraiei de 10 g/mL; cloroform ca solvent de extracte; volumul de expunere 0.5L al fazei acceptoare; fara adaos de sare la temperatura camerei) 3.1.3. Volumul de expunere al fazei de extracie Volumul de expunere al solventului organic n faza apoas este un factor foarte important care afecteaz eficiena extraciei a DDSME. Astfel, volumul diferit al fazei de extracie, de la 0.2 la 1.0 L, a fost expus la faza apoas. Extracia prin DDSME a cafeinei din faza apoas a fost stabilit la 5 minute-timp de extracie, n absena adaosului de sare, la temperatura camerei. Fig. 3 prezint creterea eficienei extraciei cafeinei n cazul n care volumul de expunere al fazei de extracie a fost crescut la 1.0 L. Exist posibilitatea miscibilitii fazei apoase pe msura ce volumul de expunere al fazei acceptoare crete mai mult de 0.5 L, i acest lucru a provocat, de asemenea, o precizie sczuta (RSD, >12%) a rezultatelor prezentate n Fig. 3.

Fig.3. Efectul volumului de expunere al fazei acceptoare asupra eficienei extractei cafeinei obinut prin DDSME (nivelul concentraiei de 10 g/mL; cloroform ca solvent de extracie; volumul de expunere 0.5L al fazei acceptoare; fara adaos de sare la temperatura camerei) O analiz a testrii varianei (ANOVA) a fost efectuat n scopul de a verifica variabilitatea rezultatelor la volume de expunere diferite. Valoarea varianei obinute prin testul ANOVA nu a fost statistic semnificativ diferit. Cu toate acestea, pentru alte experimente, 0.5 L-volum de expunere al fazei de extracie a fost utilizat n scopul de a menine o precizie mai bun (RSD,

<5%) a rezultatelor i o manipulare mai uoar a solventului organic din volumul extrem de mic al probei (7 L). 3.1.4. Adaosul de sare Adaosul de sare n soluia apoas poate reduce solubilitatea analiilor. n faza apoas i poate spori migrarea lor spre faza organic n SDME i LLE. Efectul concentraiei srii asupra extraciei cafeinei a fost evaluat prin adugare de clorur de potasiu (0-30%) n soluia apoas (10g/mL of cafein). Fig. 4 arat c zona peak-ului a sczut ci creterea concentraiei KCl n intervalul studiat. Acest lucru se datoreaz migraiei libere a analitului ce a fost interzis prin creterea concentraiei ionului din sare i a vscozitii fazei apoase. Prin urmare, sarea nu a fost utilizat pentru experimente ulterioare.

Fig.4. Efectul adaosului de sare asupra eficienei extraciei cafeinei obinut prin DDSME (nivelul concentraiei de 10 g/mL; cloroform ca solvent de extracte; volumul de expunere 0.5L al fazei acceptoare; fara adaos de sare la temperatura camerei) 3.2. Factorul de mbogire i evaluarea metodei Factorul de mbogire (EF) este definit c raportul dintre concentraia de analit n faza acceptoare (Co) i concentraia iniial a analitului (Ci) n soluie apoas: EF= Co/Ci. Condiiile optime de extracie au fost utilizate pentru a investiga factorul de mbogire. Factorul de mbogire al cafeinei pentru extracia la temperatura camerei a fost 16. Un grafic de calibrare liniar a fost obinut n intervalul de concentraie al cafeinei de 0.05-5.0 g/mL pentru

10

soluii standard. Valoarea coeficientului de corelaie a fost de 0.980, ceea ce indic o bun corelaie cu zona peak-ului n funcie de concentraia de cafein. n plus, rspunsul liniar al peakurilor SIM obinute cu soluiile stoc reale a fost comparat cu DDSME n Fig. 5. Limit de detecie (LOD) a metodei DDSME a fost calculat ca fiind de trei ori deviaia standard (3). Limit de detecie obinut n apa deionizat a fost de 4.0 ng/mL. Reproductibilitatea metodei a fost evaluat prin efectuarea a ase analize repetate (n=6) ale soluiei standard de 10 g/mL cafein. Deviaia relativ standard (RSD) a metodei a fost de 4.4%.

11

Fig.5. Peak-urile SIM obinute cu metoda DDSME (e-h) n comparaie cu o soluie stoc real de cafein (a-d) 12

3.3. Metoda DDSME pentru determinarea cafeinei ntr-o pictur din buturi i produse alimentare Metoda DDSME a fost aplicat cu succes pentru determinarea cafeinei din diferite buturi i produse alimentare. O cantitate de 7L (o pictur) din probe diluate de buturi, ceai, cafea i ciocolat au fost luate ntr-o fiol pentru extracia cafeinei prin DDSME i apoi analizate prin GC/MS. Valoarea cantitativ a cafeinei din buturi i produse alimentare a fost calculat pe baza curbei de calibrare. Rezultatele obinute pentru buturi i produse alimentare de soi diferit sunt rezumate n tabelele 2 i 3. Concentraia de cafein din buturi i alimente a variat de la 74.8 la 389.6 g/mL i 0.1530.51 mg/g cu RSD de 3.0-7.3 i 2.3-7.5%. Pentru a verifica corectitudinea metodei, cantiti cunoscute de cafein au fost adugate probelor cu buturi i alimente n scopul de a evalua recuperarea relativ (table 4). Recuperarea relativ a cafeinei n buturi i alimente a fost gsit a fi ntre 96.6-101% cu o precizie (RSD) de 3.9-6.3%. Tabel 2. Determinarea cafeinei ntr-o pictur de buturi prin metoda DDSME/GC/MS

Tabel 3. Determinarea cafeinei ntr-o pictur de soluie de produs alimentar prin metoda DDSME/GC/MS

13

Tabel 4. Rezultatele recuperrii relative ntr-o pictur de buturi i alimente

3.4. Efectul matricei Cele mai bune valori ale recuperrii (96.6-101%) obinute n probe de buturi i produse alimentare demonstreaz c matricea nu a avut nici un efect asupra analizei cafeinei prin metoda DDSME. Factorul de mbogire a fost calculat n prob de butur (alcool) ca fiind similar cu apa deionizat. Factorul de mbogire gsit n butur (alcool) a fost de 14 n condiii optime de desfurare a DDSME. Acest rezultat a relevant faptul c matricea probei de butur analizat nu a avut nici un efect asupra extraciei cafeinei.

4. Concluzii
Pentru prima dat metoda DDSME/GC/MS este aplicat cu succes pentru determinarea cafeinei ntr-o pictur de buturi i alimente diferite. Aceast metodologie este simpl, rapid, senzitiv, i necesit volume mici de prob (7L) pentru separarea i preconcentrarea cafeinei. De asemenea, este o tehnic low-cost datorit utilizrii unor cantitii mici de solvent i reactivi pentru extracia cafeinei pe parcursul experimentelor. S-a dovedit c DDSME/GC/MS este un instrument de diagnostic simplu, eficient i rapid pentru analiz cantitativ a unor cantiti n urme de droguri n probe biologice de dimensiuni ultra-mici, cum ar fi urina i sngele.

14

Bibliografie:

15