Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa

Prctica 9
DETERMINACIN DE Listeria monocytogenes

Equipo: 5
Alumnos: Alvarado de Len Sergio Daniel Flores Santos Adriana Martnez Crdova Luis Yair Novelo Rivas Oscar Emmanuel Grupo: 3LM2 Asignatura: Inocuidad Alimentaria Profesores: Snchez Andrade Miriam Cruz Pacheco Karina Fecha: 27 de Noviembre del 2012 Observaciones:

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ndice
OBJETIVOS METODOLOGA REPORTE DE TOMA DE MUESTRA RESULTADOS ANLISIS DE RESULTADOS CONCLUSIONES FUENTE DE INFORMACIN. 3 4 5 6 7 11 12

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Objetivos
1. Conocer la normatividad e importancia de la determinacin de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos frescos y/o procesados. 2. Conocer la metodologa para determinar la presencia de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos para establecer su calidad sanitaria, con base a las normas de calidad oficiales. 3. Aplicar las tcnicas establecidas para determinar la presencia y describir la morfologa colonial de Listeria monocytogenes en alimentos frescos y/o procesados 4. Interpretar los resultados obtenidos para Listeria monocytogenes segn la normatividad y explicar cuales son las medidas para prevenir su presencia en alimentos frescos y/o procesados.

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Metodologa

Transferir 25 g del alimento a un matraz conteniendo 125 ml de caldo Listeria

Incubar de 24 a 48 horas a 352C

Del caldo Listeria inocular por estra cruzada en Agar OXA.

Incubar a 352C de 24 a 48 horas.

Identificar e inocular un tubo con SIM o MIO, RM, VP, caldo urea y gelatina nutritiva

Incubar a 352C durante 48 horas

Leer Pruebas.

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Reporte de toma de muestra

Nmero de unidades y/o cantidad: 300 ml Distribuidor o voluntario: Cafetera El buen Comer, UPIBI. Lugar: Acueducto s/n, La Laguna Ticomn, Gustavo A. Madero, 07340 Ciudad de Mxico, Distrito Federal Nombre Genrico: Salsa de Tomates y chiles verdes. Observaciones: La muestra fue tomada en la cafetera de la UPIBI, aproximadamente a las 9:00 hrs, esta fue transportada hasta el laboratorio en un vaso de plstico, dicho vaso fue proporcionado por el mismo establecimiento.

La salsa se encontraba en un contenedor de barro y se serva con una chuchara de madera, estaba al intemperie.

Nombre y Firma del Analista

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Resultados
Tabla 1. Resultados Listeria monocytogenes.

Producto Caldo Listeria. Queso SI Pescado SI Salchicha SI Jugo de SI Naranja Salsa SI

Agar OXA. Colonias Blancas.

SIM. M+ I-

MIO. M+ IOM+ IO-

RMVP. -

Caldo Urea. -

* No hubo M + descripcin I.

Ausente segn NOM 143 Colonias Indetermin M + Negras. a-do IOColonias No gelifico. M Blancas, Ihalo negro. O-

Leche de SI Ausente segn NOM 184 Chocolat e No hubo reporte de resultados por parte del equipo. Yogurt

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Anlisis de Resultados
El mtodo para detectar la presencia de L. monocytogenes se basa en el aislamiento y la diferenciacin de especies de Listeria spp., principalmente por la fermentacin de carbohidratos y la actividad hemoltica de los miembros de este gnero. Descripcin de microorganismo en base a caldo, agar y pruebas bioqumicas. Caldo Listeria. La peptona y extracto de carne proveen de carbono, nitrgeno, minerales, vitaminas y otros factores de crecimiento para que los organismos crezcan. La esculina es hidrolizada por las especies de Listeria para formar esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de fierro (citrato frrico amoniacal) que contiene el medio para producir un complejo negro a caf rojizo que aparece en el medio rodeando las colonias. La Listeria monocytogenes es tolerante a las sales biliares. El agar es el agente solidifcate. Agar OXA. Medio de cultivo selectivo y diferencial, que contiene los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano de Listeria. Es diferencial para el desarrollo de Listeria, debido a que el producto de hidrlisis de la esculina en presencia de iones Fe3+ forma un compuesto fenlico de color negro. La selectividad para Listeria, se obtiene por el agregado del Suplemento Selectivo para Oxford Modificado Agar Base, debido a que contiene antibiticos que inhiben total o parcialmente el desarrollo de la flora acompaante presente en la muestra. Despus de la incubacin se registro el crecimiento de microorganismos. La mayora de las cepas de Listeria monocytogenes y otras de Listera ssp. , forman colonias blancas de aproximadamente 1 mm de dimetro, por lo regular se forma un halo de coloracin obscura tras pasar 24 horas, lo cual no aplico en nuestra placa, pero aun as por indicaciones de la profesora se procedi a realizar pruebas bioqumicas; si se hubiera obtenido el halo negro seria debido a reaccin a la esculina exhibida por la Listeria. Pruebas Bioqumicas. SIM: con esta determinaramos si la bacteria a travs de Triptofanasas poda degradar el Triptfano indol (-), si haba produccin de H2S a partir de aminocidos azufrados (-) y si la bacteria era mvil. (+).

Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa Por razones tcnicas no pudimos leer resultados de esta prueba, ya que nuestro tubo con el medio no gelifico. MIO: Usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol. Altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y triptena. La triptena aporta grandes cantidades de triptfano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo. No se mostro movilidad no existi un enturbiamiento del medio o por crecimiento que se difundiera mas all de la lnea de inoculacin. La reaccin a la ornitina fue negativa no hubo un color prpura del medio. La presencia de acidez, otorgara condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. El indol, no fue producido a partir del triptfano (no tripftonasas). El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de. Kovacs o de Erlich, indicara una reaccin positiva la cual no sucedi. RM-VP y Caldo Urea. Por ser anaerobias facultativas, catalasa positivas y oxidasa negativas. Las reacciones de Voges-Proskauer y rojo de metilo resultaron positivos. Al presentar un metabolismo fermentativo generaron cido a partir de la glucosa, lo que conllevo a resultados positivos y no fermentativos de xilosa, generando cidos y diacetilo. Para ver la reaccin se utilizo los reveladores alfa-naftol y KOH Hidrolizaron la esculina en pocas horas, pero no la urea ni la gelatina. Con respecto a la salsa la NOM que le corresponde, la NOM093, no indica nada con respecto a Listeria por lo que en teora deberan encontrarse ausentes, cosa que las bioqumicas confirmaron. Los alimentos listos para consumir son los ms relacionados con los brotes de listeria, ya sean de origen animal o vegetal: quesos, yogurt, pescados o embutidos crudos y curados. Para evitar esta presencia indeseada, una de las medidas ms importantes es disponer de una materia prima con una buena calidad microbiolgica inicial y, sobre todo, que el proceso de elaboracin se lleve a cabo bajo las ms estrictas condiciones de higiene, ya que someter el alimento a una atmsfera modificada o a bajas temperaturas no detiene el crecimiento de listeria.

Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa En productos fermentados y curados, la bacteria puede sobrevivir a la fermentacin y crecer una vez finalizado el proceso, siempre y cuando est en concentraciones altas en la materia prima. De ah que la calidad bacteriolgica de sta sea uno de los parmetros fundamentales para evitar la listeria. En el caso de alimentos sometidos a tratamiento trmico, la listeria sobrevive en escasas ocasiones, pero puede detectarse en las etapas posteriores de elaboracin, si no se llevan a cabo las medidas higinicas necesarias. Cualquier alimento, por tanto, es susceptible a la contaminacin en alguna de sus etapas de elaboracin. Se le ha aislado en alimentos manufacturados y su entorno de fabricacin. Puede formar pelculas biolgicas o en superficies de acero inoxidable de los equipos, refrigeradores, superficies hmedas de plantas procesadoras y por su relativa capacidad de crecer a bajas temperaturas, convierte las cmaras frigorficas de la industria alimentaria en potenciales placas de cultivo de Listeria. Recordemos que el al llegar a su maduracin comienza a colonizar el resto de las superficies a su alcance. Normalmente, se ha detectado en el 100% de los drenajes de la cmara, indicando entonces que el nivel de contaminacin en la empresa es elevado. ste puede ser un punto de control industrial de especial inters Tambin se le ha detectado en alimentos elaborados y su entorno en el hogar, como superficies de mesadas y cocina, fregadero, trapos de limpieza e interior de la nevera por lo que debemos prestar atencin a la higiene del frigorfico y observar el cao de desage, en donde la supuesta suciedad de agua y tierra, en verdad es de Listeria. La contaminacin del alimento puede producirse durante el procesamiento antes del envasado y cuando son manipulados en el punto de venta, por ejemplo a travs de cortadoras en establecimientos. El problema con L. monocytogenes es que se encuentra en todos los ambientes, sobreviviendo y creciendo incluso a temperaturas de refrigeracin. Es de gran problemtica ya que se encuentra de forma natural en todo el ambiente, siendo incluso el humano un gran portador de este microorganismo, por lo que deben emplearse buenas practicas de manejo y de higiene a fin de evitar que este se propague, siendo importante debido a su alta tasa de mortandad en personas inmunodeprimidas, como lo son los infantes, adultos mayores y mujeres embarazadas. Para entonces evitar la contaminacin con ambos microorganismos, lo que se debe hacer es primeramente evitar dentro de las posibilidades del proceso, que el personal entre en contacto directo con los alimentos, utilizando los guantes, cubre-bocas y cofias necesarios. Si bien L. monocytogenes puede crecer en condiciones de refrigeracin, todo esto reducir el riesgo de que crezca el microorganismo, y en caso de que llegue a contaminarlo, una buena cadena de frio har que si bien se replica no

Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa es su temperatura ptima de crecimiento, por lo que el riesgo de ingerir la dosis infecciosa es menor. Para una prevencin y control, los grupos vulnerables deben evitar el consumo de alimentos conservados por tiempo prolongado en heladera, evitar ingerir carnes crudas o poco hechas, evitar la ingesta de vegetales crudos sin lavar o mal lavadas por apuro, mantener las carnes no cocidas separadas de los vegetales, alimentos cocinados y alimentos precocinados y recalentar bien restos de alimentos o alimentos precocinados; en lo referente a la industria se recomienda: Mejorar el diseo higinico de los equipos para evitar que se formen nichos de microorganismos. Establecer procesos para destruir la bacteria una vez envasado el alimento, por ej. Pasterizacin, irradiacin, etc. Usar aditivos o conservadores que retardan el desarrollo de Listeria Modificar las prcticas de los operarios cuando sea necesario Establecer sectores bien separados para aislar completamente los productos cocidos de los crudos Extremar la higiene en las salas de fleteado y de envasado

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Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa Conclusiones Como se vio en la prctica se dispone de una variedad de mtodos convencionales y rpidos para la deteccin e identificacin de L. monocytogenes en muestras de alimentos. Los mtodos convencionales siguen siendo el patrn de oro con el que se comparan los restantes mtodos. Habitualmente, son muy sensibles. En estos mtodos se utilizan agentes selectivos y procedimientos de enriquecimiento para reducir el nmero de microorganismos contaminantes y permitir la multiplicacin de L. monocytogenes. Aunque no se necesite con fines reglamentarios, se dispone de diferentes niveles de tipificacin de las cepas de L. monocytogenes. Es muy importante prevenir la contaminacin por este patgeno, por lo que a nivel industrial es de suma relevancia el monitoreo continuo de dichos microorganismos. Las pruebas bioqumicas son un mtodo mediante el cual los identificamos fcilmente con ayuda de unas tablas determinadas gracias a sus capacidades observadas y estudiadas. El desafo para la industria alimentaria es mantener alejada a L. monocytogenes de los lugares donde se procesan o almacenan alimentos listos para el consumo. Para ello deben tenerse implementados rigurosos programas de limpieza y sanitizado y utilizar higienizantes o biocontroladores capaces de eliminar al patgeno Por otro lado el consumidor debe ayudar a reducir el nmero de casos, teniendo claro quienes son los grupos de riesgo y tomando las precauciones necesarias con la alimentacin. El patgeno va a continuar estando presente en todos lados, pero al respetar estas medidas dejar de ser una amenaza permanente para la salud de los consumidores. A pesar de los esfuerzos realizados a la fecha, este microorganismo constituye aun un desafo que el hombre deber vencer en un futuro muy cercano y es necesario redoblar los esfuerzos para reducir la incidencia de listeriosis, debido al alto porcentaje de mortalidad de esta enfermedad.

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Fuente de informacin.
NORIEGA, L. M.; IBEZ, S.; GONZLEZ P.; YAMAMOTO, M.; VIAL, P. 2008. Listeria monocytogenes: Informe de un aumento de casos en mujeres embarazadas y revisin de la literatura. Revista Chilena de Infectologa 25: 343-350. ROSSI, L.; PAIVA, A.; TORNESE, M.; CHIANELLI, S.; TRONCOSO, A. 2008. Brotes de infeccin por Listeria monocytogenes: Una revisin de las vas que llevan a su aparicin. Revista Chilena de Infectologa 25(5):328-335. Otras Regulaciones Estatales de Inocuidad Alimentaria http://www.nasda-hq.org/nasda/nasda/Foundation/ foodsafety/index.html Listeria monocytogenes Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de Inspeccin e Inocuidad Alimentaria. http://www.fsis.usda.gov/fact_sheets/listeria_monocytogenes/index.asp

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