UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIRIQU

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS

ESCUELA DE QUMICA

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUMICA

SEPARACIN DE PROTENAS PRESENTES EN SUERO POR ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA.

ESTUDIANTES: DANIEL BEJERANO 4-777-1401 REINA ROS 4- 751-1141 KATHERIN MIRANDA 4-753-2207.

PROFESORA: ALBERTINA MONTENEGRO

FECHA DE ENTREGA: 28/06/2012.

SEPARACIN DE PROTENAS PRESENTES EN SUERO POR ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA. 28/ Junio/ 2012. I. Objetivos: Realizar la tcnica de electroforesis para separar protenas presentes en suero humano empleando cmara vertical y agentes desnaturalizantes. Conocer la definicin de tcnica de electroforesis. Familiarizarse con la instrumentacin y terminologa de la electroforesis. II. Marco Terico:

La electroforesis es el movimiento de partculas elctricamente cargadas a travs de un gas o lquido como resultado de un cambio elctrico formado entre unos electrodos sumergidos en el medio. La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido, o bien a travs de una matriz porosa o en disolucin. Dependiendo de la tcnica que se use la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa. Los analitos estn cargados de electricidad, lo que se puede demostrar introduciendo dos electrodos conectados a una fuente de corriente continua en una solucin, en cuyo caso la partculas se mueven segn el signo de su carga, sea hacia el nodo (anoforesis o hacia el ctodo (catoforesis). La velocidad de desplazamiento de las micelas, por unidad de intensidad del campo, es variable y depende de su carga y de la resistencia que le opone el disolvente. El movimiento de las molculas est gobernado por dos fuerzas: por un lado la friccin con el disolvente dificultara el movimiento porque al moverse los solutos chocaran con las molculas del disolvente generando as una fuerza opuesta al movimiento .Las molculas tienden a moverse en forma aleatoria debido a que poseen energa cintica propia. La suma de estas fuerzas hace que las molculas no migren de una manera homognea. (Dra. Hilda Mariln Garca Prez1 1 Master en Ciencias Bioqumicas. Investigadora Agregada. (UNIV
DIAG 2000; 1(2):31-41).)

Mediante la electroforesis es posible separar molculas biolgicas en dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo elctrico. Se dio una visin general de la electroforesis en geles de poliacrilamida para protenas presentes en suero, se incorporaron nuevos conocimientos tomados de la literatura reciente a los conceptos tradicionales de este mtodo, como son la adicin de compuestos de restriccin de la difusin y que aumentan la estabilidad de los geles.

III.

Materiales y Reactivos

Cmara de electroforesis Micropipeta. Vasos qumicos Jeringuillas Guantes Puntas descartables Flotadores para microtubos 20;200;1000 (microlitros) 500 ml 5cc

Reactivos y Toxicidad.

Dodecilsulfato de sodio: masa molar 288.38 g/mol; punto de fusin 479k (206c); densidad 1.010 kg/m3; punto de ebullicin -273.15C; causa problemas en la piel, dermatitis. Persulfato de amonio: slido blanco cristalino granulado; peso molecular 132.14g/mol; olor inodoro; punto de fusin 235c;fcil solubilidad en agua caliente ,soluble en agua fra; el contacto prolongado produce irritacin en los ojos y piel. Azul de bromofenol: polvo cristalino de color purpura o rojo; el contacto con la piel, ojos y por ingestin produce irritaciones leves. 2-mercapto-etanol:liquido;olor desagradable ,a huevos putrefactos ;incoloro hasta amarillo Etanol: lquido; incoloro; masa molar 46,07g/mol; punto de fusin 158.9k;punto de ebullicin 351.6k;temperatura crtica 514c;densidad 789kg/m3;puede afectar el sistema nervioso central, provocando estados de euforia,desinhibicin,mareos,somnolencia,confusin,alucinaciones.al mismo tiempo baja los reflejos .en concentraciones altas ralentiza los movimientos ,impide la coordinacin correcta de los miembros, prdida temporal de la visin. Tris base: es un producto qumico con propiedades bsicas, que tiene un pka de 8.1 .puede ser utilizado para amortiguar las soluciones de drsticos cambios en el pH, mantenindolo en el rango de 7 a 9. Glicina: slido blanco; densidad 1607 kg/m 3; masa molar 75.07g/mol; punto de fusin 509k; punto isoelctrico 5.97.

 Acrilamida: blanca, inodora y cristalina, soluble en agua, etanol y ter .se emplea en la fabricacin de papel, extraccin de metales y en la sntesis de poliacrilamida.

IV.

Procedimiento.

1. Ensamblaje de la cmara de electroforesis El ensamblaje de la cmara de electroforesis varia de acuerdo al modelo del equipo.es importante sealar que la cmara ya ensamblada deber estar ubicada sobre una superficie totalmente plana y nivelada, este paso es importante en el momento en que se vierte la solucin del gel Gel dentro de la cmara, ya que se evita el derrame de la solucin y la generacin de matriz desnivelada. 2. Preparacin de los geles de poliacrilamida Usar guantes durante la manipulacin de las soluciones. Realizar la preparacin del gel de resolucin a una concentracin de acuerdo a las necesidades. Una vez finalizada la preparacin, el catalizador TEMED mezclarlo de manera uniforme en todo el volumen, agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la lnea trazada. Aadir una capa de butanol-agua sobre la solucin de poliacrilamida para evitar el ingreso de molculas de oxgeno que retarden la polimerizacin. Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerizacin la solucin de poliacrilamida remanente. Eliminar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces con agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol. Preparacin del gel separador 12% Agua destilada Tris-base 1.5M, pH 8.8 SDS 10% Acrilamida/bis 30% 2.3ml 1.8ml 70 l 2.8ml

Persulfato de amonio 10% (preparado el mismo da) TEMED

24 l

6l

3. Electroforesis (condiciones para la corrida) Usar guantes para evitar la degradacin de las molculas por la accin de las proteasas. Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizado en un tanque conteniendo buffer de electroforesis o de resolucin para protenas 1x ,dicho tanque lleva dos electrodos uno positivo y uno negativo que sern conectados a una fuente de poder ,al momento de sumergir los geles en el tanque asegurarse que los pocillos del gel estn cubiertos por el buffer. Se puede cargar un mximo de 20 microgramos de protena por pozo, proceder a depositar la muestra en los pocillos evitando la contaminacin del de al lado, para obtener una resolucin optima de las bandas Cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables de los electrodos. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje. Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida haya llegado a los lmites de la parte inferior del gel. Separar el gel de empacamiento del gel de resolucin. Hacer una pequea muesca en una de las esquinas del gel. 4. Proceso de revelado Se paso el gel a un recipiente con 50ml de metanol al 50% en agua destilada. Agitar por 30 minutos. Decantar la solucin fijadora y agregar 50ml de solucin de teir que contiene azul coomasie al 0.1% disuelto en metanol al 40% y cido actico al 10%.agitar por 30 minutos. Desteir mediante dos lavados con solucin de metanol al 40% y cido actico al 10%.30 minuto de agitacin por cada lavado. Efectuar el ltimo lavado con etanol 50% durante 20 minutos.

5. Secado del gel Colocar el gel entre dos capas de papel celofn previamente sumergido en agua por 15 minutos ,utilizando como soporte un vidrio cuadrado grueso .procurar que no queden burbujas de aire dentro del papel porque pueden daar el gel. Fijar los extremos del papel celofn con prensas y dejar el vidrio inclinado para que escurra el agua durante 24 horas. Despus de las 24 horas, retire las prensas y recorte el exceso de papel celofn.

V.

Resultados y Discusin

Resultados Figura.1. Desarrollo Electrofrico (Preparacin del Gel).

Figura.2. Desarrollo Electrofrico (Corrida)

Figura. 3. Proceso de Revelado. (Tincin y Lavado)

Figura.4. Proceso de Secado.

Figura 5. Reaccin de polimerizacin de la acrilamida

Discusin La electroforesis de protenas ms ampliamente usada es SDS. Su nombre significa la electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS ('SDSpoliacrilamida gel electrophoresis'). Fue descrito por Laemmli (Laemmli (1970), Nature, 277, p. 680). Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las muestras se

desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS que desnaturaliza y recubre a la protena con cargas netas negativas), y se separan como cadenas polipeptdicas aisladas. Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin vinlica del monmero acrilamida CH2=CH-CO-NH2 y del monmero entrecruzador N, N-metilen-bis-acrilamida CH2 = CH- CO - NH - CH2- NH - CO - CH = CH2. La polimerizacin se inicia con la formacin de radicales libres del monmero, que se producen por radicales libres de oxgeno, por causa de la accin de iones Persulfato. Las aminas terciarias como el N, N, N, N-tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta reaccin, porque causan la formacin de radicales libres del Persulfato. Esta reaccin es fuertemente inhibida por altos niveles de oxgeno, por lo que la solucin debe ser desgasificada para lograr una formacin de gel reproducible. La movilidad de las protenas vara entre otras causas porque la viscosidad del agua aumenta a bajas temperaturas (la distancia recorrida es aproximadamente 20 % mayor en la regin central que es ms caliente). Este efecto puede atenuarse con el empleo de un tampn ms diluido o manteniendo temperaturas bajas durante el desarrollo de la electroforesis. La determinacin del tiempo adecuado de corrida es muy importante, pues corridas muy cortas impiden que las muestras avancen el espacio necesario para su correcta separacin, pero tambin se ha probado que tiempos de corrida cortos minimizan la dispersin de la muestra y el ensanchamiento de la banda. Las protenas coloreadas naturales como la mioglobina, hemoglobina, ferritina y citocromo C, pueden ser observadas directamente en los geles, sin embargo la visualizacin de la mayora de las protenas requiere el uso de colorantes. Los colorantes orgnicos fueron los que se emplearon primero para teir protenas en los geles (azul de Coomassie, etc.). Una rpida tincin, distincin y fijacin son esenciales en el caso de las protenas pequeas para evitar su elusin; la omisin del metanol de la solucin de tincin es beneficiosa ya que se reduce el tiempo de tincin y disminuye el hinchamiento de los geles. Existen diferentes tipos de tincin, entre ellos la plata que es muy sensible y tiene la caracterstica de producir generalmente colores caractersticos como tienden a colorearse de azul y algunas glicoprotenas que aparecen amarillas, carmelitas o rojas. Este efecto cromtico se ha demostrado que est dado por la difraccin de la luz en la plata. Se han las lipoprotenas que coloraciones carmelita o negro, sin embargo algunas protenas tienen desarrollado algunos procedimientos de tincin con plata para identificar ciertas protenas, con el empleo de combinaciones de tincin. La tincin con Coomassie puede emplearse para la determinacin de protenas cuando estas son abundantes, pero no para la determinacin de pureza de protenas trazas. Esta tincin requiere un medio cido para la generacin de la atraccin electrosttica entre las molculas del colorante y los grupos amino de las protenas. La atraccin inica es a travs de las fuerzas de Van Der Walls, que une a las protenas y al colorante formando un complejo. Esta unin es totalmente reversible en condiciones apropiadas. Se ha reportado la tincin de protenas por otros mtodos entre los que se encuentran: eriocromo negro, compuestos fluorognicos, modificacin de los aminocidos de las protenas. Notsu K y Shiratori M25 reportaron sumergir el gel despus de electroforesis en una solucin de sacridos, azcares, alcoholes de ms de 4 carbonos y polmeros solubles en agua; despus se introduce este entre 2 filmes de celofn transparentes y semipermeables

colocado en forma de sandwich a ambos lados del gel o en uno y en el otro una lmina plstica. De esta forma los componentes acuosos del gel son remplazados por los de la solucin. Esto permite que el gel se seque, sin causar su ruptura, deformacin, prdida de la transparencia y sin necesidad de emplear calor o presin reducida ni ningn aparato especial. No se han reportado variaciones en geles tratados con este mtodo despus de 2 aos. Se recomienda el empleo de un poliol como el glicerol como un agente hmedo cuya funcin es adems de actuar como un agente de restriccin de la difusin, impedir que el gel se seque por la evaporacin durante la conservacin, lo que evita la ruptura de este. Una polimerizacin muy rpida puede deformar las bandas, porque ocurre una contraccin no uniforme del gel, en este caso debe reducirse el TEMED y el Persulfato de amonio o adicionar ferricianuro de potasio, con el objetivo de hacer ms lenta esta. El empleo de niveles bajos de catalizador provoca que la superficie del gel se torne desigual y tienda a romperse con facilidad, pero el empleo de altas concentraciones provoca que los geles tiendan a cuartearse. Este problema puede solucionarse en geles de altas concentraciones, al poner una capa de alcohol isobutlico en lugar de agua (en geles de bajas concentraciones deben emplearse alcoholes de altas densidades). La electroforesis nos permites separar las protenas del suero de plasma sanguneo mediante la migracin de sus molculas hacia los electrodos de carga opuesta cuando fueron sometidos a un campo elctrico .Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por accin del campo elctrico, lo cual genera protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilo en el ctodo .el tampn es, por esta razn esencial durante la electroforesis para evitar que el nodo se acidifique y el ctodo se haga ms bsico ,pero no debe afectar a las molculas a separar. Adems la fuerza inica condiciona la movilidad electrofortica de las sustancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatacin y en la conductividad de todo el sistema, por lo tanto .es necesaria una fuerza inica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegara a interferir en el sistema. Las protenas presentan grupos variables en la superficie lo que permite solubilizar en un medio celular cuando el campo elctrico aplicado a las molculas de menor peso molecular migran a mayor velocidad, el patrn de protena inyectada marca varias rayas de los cuales cada uno equivale al peso molecular de la protena segmentada quedando arriba la de menor peso molecular, y la de mayor peso molecular se desplaza mas. El valor de la corriente elctrica depender de la pureza inica del buffer amortiguador.

VI.

Conclusiones:

 Los geles de poliacrilamida poseen propiedades como elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad qumica lo cual es excelente medio de soporte para separacin electrofortica. La electroforesis es la migracin de molculas cargadas en solucin como respuesta a la presencia de un campo elctrico. Hay muchos factores que desempean una funcin importante en la separacin electrofortica, como son pH, fuerza inica, gradiente de potencial, tiempo de corrida, concentraciones de acrilamida y bisacrilamida, etc. Las condiciones ptimas de una buena separacin, en la prctica se determinan experimentalmente, con el anlisis de cmo influyen los diferentes factores en la electroforesis en cuestin. La naturaleza de la muestra sirve de gua para alcanzar las condiciones en la que se deben obtener los mejores resultados. La velocidad de las partculas depende de la carga de las mismas, de la intensidad del campo elctrico y del coeficiente de friccin de las molculas con el medio. Las protenas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo de su movilidad electrofortica albuminas alfa, beta y gama globulinas. La velocidad de migracin depende principalmente de la fuerza del campo, de la carga, forma, masa y tamao de la molcula, as como de la fuerza inica, viscosidad y temperatura del medio en el que las molculas se estn moviendo. En la tincin de los geles de poliacrilamida se utiliza tincin con plato, tincin con azul coomasie .dependiendo del fin del anlisis. Los geles de poliacrilamida se obtienen polimerizando monmeros de acrilamida en cadenas largas y entrecruzndolas.

VII.

Bibliografas: Chvez Planes MA, Daz Brito J, Prez U, Delfn J. Temas de enzimologa. Tomo 2. Facultad de Biologa Universidad de La Habana, 1990. MATHEWS, C.; VAN HOLDE, K. 2002. BIOQUMICA. Madrid, Pearson Educacin. 3ra Ed. Campell MK. Biochemistry. 2 ed. Saunders: College Publishing.1995.

Garca HM. Adaptacin de geles de poliacrilamida a sistema PhastSystem. [Tesis de Maestra.] Facultad de Biologa UH. Diciembre del 2000 webpages.ull.es/users/bioquibi/practicas/4.pdf www.uco.es/.../16%20ELECTROFORESIS%20GELES%20PAA.pdf javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/.../libros/.../electroforesis.html www.qb.fcen.uba.ar/ib/electroforesis2.ppt.

VII.

Cuestionario:

1Qu se entiende por electroforesis en condiciones no desnaturalizantes y que agentes la determinan? Una electroforesis nativa es la que somete a las protenas a migracin sin desnaturalizacin. En esta situacin las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y de su forma. Adems se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades y entre protenas, separndose los complejos. Los sistemas tampn (buffer) empleados en estos caso son: trisglicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

2Explique el principio de la separacin electrofortica en papel de celulosa y acetato de celulosa. Seale algunos ejemplos de sus usos. Se usa para la separacin y caracterizacin de protenas y otras molculas. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de absorcin mnima, por lo que se evita la formacin de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Las protenas de suero se pueden separar por esta tcnica. Se usa en anlisis de fluidos biolgicos.

3-

Cmo afecta el pH la movilidad de una protena?

Las protenas presentan una carga elctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo elctrico. En su punto isoelctrico la protena tiene carga neta cero.

Por debajo del pI las protenas estarn cargadas positivamente y por encima del pI negativamente.