Anlisis

Instrumental
Prof. Dr. Eliel R. Romero Garca


VIII- Mtodos de
aislamiento y
purificacin
Antecedentes

A mediados del siglo XX la mayora de las separaciones analticas
se llevaban a cabo por los mtodos clsicos (v.g. precipitacin,
destilacin y extraccin), pero ahora muchas de ellas se realizan por
cromatografa y electroforesis.

La cromatografa es un mtodo aplicado en mltiples ramas de la
ciencia (v.g. Qumica analtica, Bioqumica, Ciencias de los
materiales, Qumica Ambiental).

A principio del siglo XX, Mikhail Tswett separ los pigmentos
vegetales(clorofilas y xantofilas) haciendo pasar disoluciones de
estos compuestos a travs de una columna de vidrio rellena con
CaCO
3
finamente empacado. Las especies separadas aparecan
como bandas coloreadas en la columna por lo que le design a su
mtodo Cromatografa, del griego chroma color y graphein
escribir.

Mltiples premios Nbel han sido otorgados a investigadores que
hicieron uso de tcnicas cromatogrficas en sus hallazgos entre
1937 y 1972.
Generalidades

La cromatografa agrupa un conjunto de mtodos y tcnicas cientficas
que permiten separar compuestos estrechamente relacionados en
mezclas complejas.
En toda separacin cromatogrfica, la muestra se desplaza con una
fase mvil (sea gas, lquido o fludo supercrtico), y dicha fase mvil se
hace pasar a travs de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y
que se fija a una columna o una superficie slida.
Los componentes de la muestra se debern distribuir de modo distinto
entre ambas fases, pues aquellos componentes que son retenidos
fuertemente por la fase estacionaria se movern lentamente con el flujo
de la fase mvil; de otra forma, los componentes que se unan dbilmente
a la fase estacionaria fluirn con rapidez con la fase mvil.
En consecuencia de la misma movilidad, los componentes de la muestra
se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse (de
manera cualitativa y/o cuantitativa).
Clasificacin de los mtodos cromatogrficos
Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar de dos maneras:
1. Por el tipo de contacto:
Cromatografa de columna: un tubo estrecho contiene la
fase estacionaria a travs de la cual se hace pasar la fase
mvil a presin
Cromatografa en un plano: la fase estacionaria se fija
sobre una placa plana o a los intersticios de un papel, en
donde la fase mvil se desplaza a travs de la fase
estacionaria por capilaridad o gravedad
2. Por el tipo de fase mvil y estacionaria y los equilibrios de
transferencia de los solutos en las fases:
Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases
Cromatografa de fludos supercrticos
Antecedentes.
Uno de los ejemplos ms bsicos y de importante aplicacin en
los inicios de la separacin y purificacin de sustancias es la
cromatografa en papel
Cromatografa en papel
Flujo de
la fase
mvil
Aplicaciones de la cromatografa de lquidos
Exclusin por tamao
Penetrabilidad sobre gel
Filtracin sobre gel
Adsorcin
Intercambio
inico
Reparto
Reparto en
fase reversa
Reparto en
fase normal
10
2

10
3

10
4

10
5

10
6
P
e
s
o

m
o
l
e
c
u
l
a
r

Polaridad creciente
Insoluble en agua Soluble en agua
No polar Inico
No inico polar
Gran parte de la Bioqumica moderna se basa en el uso
de mtodos de cromatografa en columna y la
electroforsis para separar las biomolculas, en particular:

1. La cromatografa de intercambio inico
2. La cromatografa de afinidad
3. Cromatografa lquida-slido (o de adsorcin)
4. Cromatografa de exclusin molecular
Tipos de cromatografa de Lquidos
1. Cromatografa en fase Normal (NPC):
Permite separar molculas en base a su polaridad,
Utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto
de inters es muy polar.
El analito polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria y la fuerza de absorcin
incrementa a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el
compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el
tiempo de retencin.
La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de
inters, sino tambin por efectos estericos, til para separar y diferenciar los ismeros
estructurales.
El uso de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los
compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de
retencin.
La NP-HPLC ya no es comumente utilizada con la aparicin de la RP-HPLC por la falta de
reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos alteran el
estado de hidratacin de la silica o almina de la fase estacionaria.
Tipos de cromatografa de Lquidos
2. Cromatografa en fase reversa (RPC):
Permite separar molculas en base a su polaridad,
Consiste en una fase estacionaria apolar y una fase mvil de polaridad moderada.
El principio de la cromatografa en fase reversa es semejante al de la
cromatografa en capa fina (Thin Layer Chromatography TLC).
La fase estacionaria es de partculas de slica qumicamente modificadas con
hidrocarburos saturados, insaturados o aromticos de diferentes tipos. Esto
convierte a la fase estacionaria en una matrz apolar.
Para este tipo de cromatografas se emplean mezclas de solventes polares, tales
como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoles alifticos.
Tambin se conoce como cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC) cuando
se emplean substituyentes y matrices compatibles con fluidos biolgicos, p.ej. En
la purificacin de protenas y carbohidratos.
En este la RPC las molculas se retienen en la columna en virtud de las
interacciones hidrofbicas que establecen con la slica modificada, aunque dichas
interacciones son en general bastante dbiles, son generalmente muy numerosas y
para elur las molculas es casi siempre necesario disminuir la polaridad del
disolvente; para ello se puede substituir el agua de la fase mvil con un solvente
orgnico cuya concentracin se va aumentando gradualmente.
La versatilidad y eficiencia de este tipo de cromatografa se ha visto incrementada
con el uso de sistemas de alto desempeo (HPLC, del ingls "High Performance
Liquid Chromatography") que utilizan alta presin para mejorar la resolucin y
reducir los tiempos de separacin.
Los sistemas de alto desempeo pueden tambin emplearse en otros tipos de
cromatografas, de manera que para referirse a la cromatografa en fase reversa en
sistemas de alto desempeo se emplea la abreviatura HPLC-RPC.
Por ejemplo en la separacin e identificacin de Pptidos y aminocidos.
En la separacin de aminocidos y pptidos mediante fase reversa la resina
ms comnmente empleada posee una cadena lineal de 18 carbonos y se
denomina como C
18
.
|SiO
2
|-(CH
2
)
17
-CH
3

Se requiere de sistemas C
18
-HPLC.
La muestra se aplica a la columna en solucin acuosa acidificada con cido
trifluoroactico, un cido orgnico voltil y que se requiere muy puro. Para
mejorar la solubilidad de los pptidos formados por aminocidos muy apolares
se aade al solvente un 10 a 20% de acetonitrilo (CH
3
CN).
A fin de elur de la columna los aminocidos ms apolares es necesario
aumentar la concentracin de acetonitrilo en el sistema. Esto se hace en forma
gradual durante la elucin, lo cual permite una gran resolucin en la
separacin de las molculas.
El sistema C
18
-HPLC completo requiere, una bomba peristltica
que inyecta la fase mvil a la columna a alta presin para que el
flujo de lquido sea adecuado, un generador de gradientes para
variar la proporcin de solvente en la fase mvil y el inyector
permite la aplicacin de la muestra.
A la salida de la columna se coloca un detector (generalmente de
absorcin ultravioleta o de fluorescencia) y si se desea recuperar
las molculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
En el anlisis y la cuantificacin de aminocidos, la recuperacin
de la muestra es innecesaria; pero cuando se separan pptidos
producto de la fragmentacin de una protena para propsitos de
secuenciacin, el colector es indispensable.
Cromatograma tpico











Los picos se relacionan segn su "tiempo de retencin" con estndares, que permiten
identificar los aminocidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de
ellos se determina calculando el rea la curva del pico correspondiente.
1. Cromatografa de adsorcin (lquido-slido):
La fase estacionaria es un slido sobre el que las molculas se adhieren por un
efecto de adsorcin fsico-qumico.
El parmetro implicado es el coeficiente de adsorcin
El mecanismo de separacin esta basada en la competencia de los
componentes de la muestra por los sitios activos en un absorbente como el
silicagel.
2. Cromatografa inica:
La fase estacionaria presenta en su superficie sitios
inicos y la fase mvil es una disolucin tampn acuosa
La fase estacionaria permite el intercambio de estos
contraiones mviles con iones de la misma carga de la
muestra.
La separacin depende de los coeficientes de distribucin
inica
Materiales de relleno de las columnas de intercambio
aninico y catinico (fase estacionaria)
Cromatografa de
intercambio inico
3. Cromatografa de exclusin:
La fase estacionaria es un material poroso, cuyo
tamao de poro se eligen en relacin con el tamao de
las especies por separar.
Se realiza un tamiz molecular de permeabilidad
selectiva
Tambin designada como filtracin en gel o
permeabilidad en gel, segn la naturaleza acuosa u
orgnica de la fase mvil
El coeficiente de distribucin se designa como
coeficiente de difusin
The largest molecules will elute first with a volume
equal to the void volume and the smallest molecule will
elute last with a volume equal to volume 1 and volume 2
Large molecules
cannot penetrate the
pore of the matrix
and the accessible
volume for large
molecules is equal to
volume 1
Medium-sized molecules
can partially penetrate
the pore and the
apparent column
volume will be equal to
volume 1 plus part of
volume 2
Small molecules can
completely penetrate the
pore and the accessible
volume will be equal to
volume 1 plus volume 2.
Selectividad: Distribucin por el tamao de poro
Cromatografa de exclusin
molecular
Cromatografa lquido-lquido (o de reparto):
La fase estacionaria es un lquido inmovilizado sobre un
material inerte y poroso que solo desempea un papel de
apoyo
El proceso transcurre por impregnacin
4. Cromatografa de afinidad (de fase enlazada):
La fase estacionaria se fija covalentemente a un polmero.
La fase mvil transporta los analitos que se unen por
enlaces coordinados a la fase estacionaria para ser luego
removidas las molculas afines por el paso de molculas de
mucho mayor afinidad y son arrastradas por la elucin.
El mtodo se basa en un coeficiente de reparto K de la
disolucin entre las dos fases.
Cromatografa de afinidad
Aplicaciones de la cromatografa de lquidos

1. Purify protein in one day ??
Among about of dozen kinds of chromatography the most universal
and useful are:
Cromatography type Purification fold
Ion-exchange chromatography 2 - 10
Gel-filtration 2 - 3
Hydrophobic chromatography 2 - 10
Affinity and pseudo affinity chromatography up to hundreds
Muestra
MW<2000
MW>2000
Hidrosolubles
Inico
No inico
IC
HPLC
pares inicos
HPLC
fase normal
HPLC
fase inversa
Organosolubles
Polar
No polar
HPLC
fase normal
HPLC
fase normal
HPLC
fase inversa
HPLC
fase inversa
Hidrosolubles
Organosolubles
SEC
Filtracin en gel
IC
HPLC
fase inversa
SEC
Permeabilidad en gel
Gua para la seleccin de diferentes tcnicas cromatogrficas
que utilizan una fase mvil lquida
Sample Type LC Mode

Positional isomers LSC or LLC
Moderate Polarity Molecules LSC or LLC
Compounds with Similar Functionality LS or LLC
Ionizable Species IEC
Compounds with Differing Solubility LLC
Mixture of Varying Sized Molecules GCC
II. Cromatografa de gases (GC)
La fase mvil es un gas inerte (H, He, N
2
)
Se dividen segn el fenmeno aplicado en:
Cromatografa gas-liquido:
La fase mvil es un gas y la estacionaria es un lquido
impregnado a un soporte inerte que puede ser simplemente la
pared de la columna
El coeficiente de reparto K es el implicado
Cromatografa gas-slido:
La fase estacionaria es un slido poroso (grafito, gel de slice
o aluminio) y la mvil es un gas
Efectiva para mezcla de gases y compuestos voltiles
El parmetro implicado es el coeficiente de adsorcin
Cromatgrafo de gases
Columna tubular abierta de pared recubierta (WCOT):
la pared interior de la columna est recubierta de una fase
estacionaria lquida.
Columnas tubulares abiertas recubiertas de soporte
(SCOT): la fase estacionaria lquida recubre un soporte
slido unido a la pared interior de la columna.
Columna tubular abierta de capa porosa (PLOT): la
pared interior est recubierta de una fase estacionaria
slida.
Al disminuir el grosor de la fase estacionaria
1. disminuye la altura de plato
2. disminuye el tiempo de retencin
3. disminuye la cantidad de analito que se puede analizar
Columnas para CG
Cromatografa de gases: las columnas de separacin
El tefln es un polmero prcticamente inerte usado para la CG:
-CF
2
-CF
2
-CF
2
-CF
2
-CF
2
-
Cromatografa de gases: las columnas de separacin
CG o CL con fase estacionaria quiral (pticamente activa) es til para separar enantimeros,
v.g. los L y D aminocidos
Las ciclodextrinas son muy tiles para estas separaciones ya que poseen una cavidad quiral
hidrfoba de 0.78 nm y otra apertura opuesta ms pequea, cuyos extremos hidroxilos se
pueden bloquear con cadenas de pentilo o trifluoroacetilo (-C(=O)-CF
3
) para disminuir la
polaridad de las caras. Cada enantimero posee distinta afinidad por la cavidad interior de la
ciclodextrina, por lo que dos enantimeros se separan a medida que pasan por la columna
Medicamentos hidrfobos que son insolubles en agua forman complejos estables dentro de las
ciclodextrinas cuyo interior es hidrfilo, por lo que se plantea su uso en formulaciones de
medicamentos
Aplicaciones de la CG para los distintos
tipos de columnas
SOLVENTES
Solventes Polares
Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile

Solvents No polares
N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane
III. Cromatografa de fluidos supercrticos (SFC)
La fase mvil es un fluido en estado supercrtico, v.g. CO
2
a
50 C y 150 bar (15 MPa); los SFC comparten caractersticas
de lquidos y de gases
La fase estacionaria puede ser un slido o lquido
Rene las ventajas de la LC y la GC
Los Cromatogramas
Separacin de una mezcla A y B por cromatografa de elucin en columna y la
seal de salida del detector en las distintas fases de la elucin
Distancia
recorrida
El detector responde a la concentracin de los analitos y se coloca al final de la columna,
registra la seal en funcin del tiempo (o del volumen de la fase mvil aadido), se obtienen
una serie de picos, generando un grfico denominado CROMATOGRAMA.
Los cromatogramas son tiles para el anlisis cualitativo y cuantitativo, puesto que la
posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la
muestra
Las reas bajo los picos proporcionan la medida cuantitativa de la cantidad de cada
componente.
Esta especie es retenida
ms fuertemente, por lo
que se retrasa durante la
migracin
CROMATOGRAMAS
metros
En ocasiones, la identificacin de los compuestos moleculares por
cromatogramas es aleatoria, por lo que se recomienda asociar dos
tcnicas complementarias, v.g. un cromatgrafo acoplado a
espectrmetro de masas o IR.
Estos mtodos de segundo orden permiten colectar la informacin de
forma independiente y determinar con certeza la composicin de las
mezclas complejas o la concentracin de ciertos compuestos (v.g. de
cantidades del orden de nanogramos)
Aumento de
la separacin
de las bandas
Disminucin de
las velocidades
y la dispersin
de las bandas
Bandas
dispersadas
y solapadas
El movimiento de avance por la columna aumenta la distancia entre las dos
bandas y al mismo tiempo ocurre un ensanchamiento de ambas zonas
Conforme pasa el tiempo de recorrido se ensancha la banda de resolucin de
cada componente, por lo que disminuye la eficacia de la columna
Efecto de la velocidad de migracin
La eficacia de una columna para separar dos solutos depende, en parte, de las
velocidades relativas con las que eluyen las dos especies y son determinadas por
las constantes de equilibrio durante la distribucin
El equilibrio de distribucin implica la transferencia de analito entre las fases
mvil y estacionaria
A
mvil
A
estacionaria
La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de
distribucin (razn de distribucin o coeficiente de distribucin):



Esta ecuacin se limita a la proporcin directa entre las concentraciones de
soluto en la fase mvil y la estacionaria en la cromatografa lineal en donde los
cromatogramas muestran picos gaussianos simtricos y de tiempos de
retencin idependientes de la concentracin de analitos
Velocidad de migracin
M
S
C
C
K =
Factor de retencin

Cuando el factor de retencin de un soluto es <<< 1 la elucin
es tan rpida que es muy difcil determinar con exactitud los
tiempos de retencin
Cuando el factor de retencin es del orden de 20 a 30 o mayor
los tiempos de retencin son excesivamente largos
Idealmente, se busca que las condiciones de las separaciones
de mezclas de solutos arrojen factores de retencin del rango de
entre 2 y 10
Tiempo de retencin
Es el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que el
pico de concentracin del analito alcanza al detector y se simboliza como t
R

Se le designa tiempo muerto t
M
al tiempo que le toma a la muestra no retenida
alcanzar al detector. La velocidad de la muestra no retenida coincide con la
velocidad promedio del movimiento de las molculas de la fase mvil por tanto
tambin se considera como el tiempo que le toma a una molcula de la fase mvil
pasar a travs de la columna
Lnea base
(ausencia de
analito)
En ocasiones hay picos
pequeos que corresponden a
muestras que no se retienen
Estos picos
sirven de
referencia y en
ocasiones se
adicionan
Cuando se disponen de sustancias mixtas, previo a
un anlisis, el tiempo de retencin permite identificar
las muestras comparando los tiempos de migracin de
cada componente
Tiempo de retencin
Factor de retencin de Kovats
El ndice de retencin de Kovts para un
analito se define por:
t
R
(A)Tiempo de retencin ajustado del
analito A
t
R
(N)Tiempo de retencin ajustado de n-
alcano con N carbonos
t
R
(n)Tiempo de retencin ajustado de n-
alcano con n carbonos (n = N + 1 carbonos)
(

+ =
) ( ' log ) ( ' log
) ( ' log ) ( ' log
100 100
A R t n R t
N R t A R t
N I
Interpolacin
logartmica de los t
R
t
M
t
R
(A)

t
R
(N)

t
R
(n)

t
Ejemplo:
Si los tiempos de retencin de son t
R
(CH
4
) = 0,5 min,
t
R
(octano) = 14,3 min, t
R
(compuesto ?) = 15,7 min y
t
R
(nonano) = 18,5 min, hallar el ndice de retencin
del compuesto desconocido.
SOLUCIN
15 . 857
2 . 15 log 0 , 18 log
8 , 13 log 2 , 15 log
100 ) 8 ( 100 =
(

+ = I
Factor de selectividad o
Se define como el cociente del coeficiente de distribucin de la
especie ms fuertemente retenida (K
B
) entre el coeficiente de
distribucin de la menos retenida (K
A
):


Segn esta definicin o debe ser siempre mayor que 1; pero
tambin se puede determinar en funcin de a sus factores de
retencin de los analitos o desde el cromatograma:
A
B
K
K
= o
A
B
k
k
'
'
= o
M A R
M B R
t t
t t

=
) (
) (
o

0
t
M
t
RA
t
RB
A
B
t
RB
t
RA
M A R
M B R
t t
t t

=
) (
) (
o
t
R
= tiempo de retencin reducido
Factor de selectividad o
Comparacin de curvas gaussianas en picos de un cromatograma
Los cromatogramas reales distan mucho de presentar un pico gaussiano, puesto
que se produce una irregularidad en la concentracin en la zona de depsito de la
sustancia que se encuentra en la cabeza de la columna, la velocidad de la fase
mvil es nula en las paredes de la columna y mxima en el centro de esta.
La simetra del pico se traduce a dos parmetros: el factor de simetra (F
a
) y
factor de cola (F
c
), medidos al 10% de la altura
a
b a
F
a
b
F
c a
2

+
= =
Picos de elucin gaussianos
10%
100%
b
a
Deformaciones en los picos de elucin

Algunos picos no son ideales y presentan deformaciones hacia
la cola o hacia el frente.
En el primer caso la cola del pico que aparece a la derecha del
cromatograma se alarga mientras el frente se acorta
bruscamente
En la deformacin hacia el frente ocurre lo contrario, pues se
muestran picos con asimetra frontal
Deformaciones en los picos de elucin

Las causas de esta asimetra pueden ser:
1. Un coeficiente de distribucin no lineal
2. La asimetra frontal suele presentarse cuando se ha
introducido exceso de muestra
Estas distorsiones no son deseables puesto a que
conducen a peores separaciones y a tiempos de
elucin no reproducibles
El ensanchamiento de la banda
Durante la migracin de una molcula, esta presenta miles de
transferencias entre la fase estacionaria y la fase mvil, y el
tiempo que pase entre cada interaccin es muy irregular y es
dependiente de la energa trmica que gane en el proceso
generando tiempos de residencia entre cada fase transitorios y a
veces largos, por tanto su migracin en la columna es muy
irregular
El ensanchamiento de la banda
Algunas partculas se incluyen en la fase mvil
desplazndose con rapidez y otras se incorporan
accidentalmente en la fase estacionaria retrasndose su
migracin.
En consecuencia ocurre una dispersin simtrica de las
velocidades alrededor del valor medio (comportamiento de la
molcula promedio)
El ensanchamiento de la banda
La anchura la banda aumenta conforme se mueve a travs de
la columna ya que dispone de ms tiempo para que la
dispersin tenga lugar
Por tanto, la anchura de la zona es directamente proporcional
a la permanencia en la columna e inversamente proporcional a
la velocidad de flujo de la fase mvil
Procesos cinticos que contribuyen al
ensanchamiento del pico
Eficacia de la columna
Martin y Synge aplicaron la comparativa de la columna
cromatogrfica con una torre de destilacin, con la analoga de que
se constituyen las columnas de mltiples capas estrechas,
discretamente contguas, denominados platos tericos de Craig:


Donde:
H= altura del plato terico
N= el nmero de platos
L= longitud del relleno de la columna
H
L
N =
Perfil del analito en el extremo final del relleno
Definicin de la altura del plato (H)
Se supone que en cada plato se establece el equilibrio de la especie entre la
fase mvil y estacionaria. El movimiento del analito a travs de la columna
se trataba como una transferencia por etapas de la fase mvil equilibrada de
un plato al siguiente en una constante dinmica de adsorcin-desorcin. Pero
falla por no abordar el ensanchamiento de las bandas.
Detector
Concentracin en
la columna
L
Eluyente
Seal
0
Distancia
migrada (m)
Altura equivalente al plato terico (HETP)
Es la longitud necesaria de la columna por la lograr el equilibrio de
distribucin (es una medida de la eficiencia de la columna).

Platos tericos (N)
A medida que un soluto migra en la columna , ocupa una zona
al ensancharse, esta dispersin lineal o
L
, representada por la
varianza o
2
L
aumenta con la distancia recorrida L:

A partir de un pico de elucin de un compuesto, del cual se
pueda medir la o
2
temporal, se podr calcular para el compuesto
la eficacia terica N y deducir el valor de H sabiendo que
H=L/N:
L H
L
=
2
o
Eficacia de la columna
2
2
2
2
o o
R
L
t L
N = =
o
t 0
s
e

a
l

Variables que influyen en la eficacia de la
columna
FACTORES GENERALES QUE FAVORECEN LA
RESOLUCIN
1. Incrementar L
2. Disminuir el dimetro de la columna (d
p
)
3. Disminuir la velocidad de flujo
4. Uniformidad del relleno de la columna
5. Empacado uniforme de la columna
6. Disminuir el tamao de la muestra
7. Seleccionar una fase estacionaria,
8. una fase mvil, y
9. una presin apropiados
10. Para la LC usar un adecuado y mejor gradiente de elucin
Factor de resolucin entre dos picos R
Se utiliza para determinar la eficiencia de la separacin de dos
picos, entre mayor sea R mejor ser la separacin
Se calcula a partir del cromatograma y con las ecuaciones:
2 2
1
1
4
1
177 . 1
2
2 1
1 2
2
2
+ +

=
+

=
+

=
+

=
k k
k k N
R
k
k
N R
t t
R
t t
R
B
B A
R R
B A
R R
A B
A B
o
o
o o
e e
Efecto de la longitud de la columna en la resolucin
El problema general de la elucin en cromatografa
The compounds listed in Table 2 were separated on an nonpolar, 95% methyl,
5% phenylpolysiloxane column, 30 m long, 0.25 mm ID, and 0.25 micrometer
film thickness.
About 1 microliter of the hydrocarbon sample were injected. Approximately 5
nanograms (ng) of each component was injected per 1 microliter. A flame
ionization detector (FID) was used.
Optimizacin del anlisis cromatogrfico
La cromatografa es preferentemente usada en anlisis
cuantitativo, y para esto se miden las reas de los picos con
precisin y para esto se deben separar muy bien los picos
La resolucin R y el tiempo de elucin son las dos variables
dependientes ms importantes que se deben considerar
La idea es separar lo mejor posible los compuestos en el menor
tiempo posible
Se debe considerar un tiempo de estabilizacin antes de re-usar
las columnas
La longitud de la columna define en muchas ocasiones la
resolucin de las separaciones
Si solo interesan un tipo de componentes de la mezcla se pueden
usar detectores especficos
Optimizacin del anlisis cromatogrfico
La cromatografa siempre se delimita a un tringulo cuyos
vrtices corresponden a la resolucin, velocidad y capacidad, los
tres son parmetros que se oponen.
Una cromatografa optimizada utiliza al mximo el parmetro
ms eficaz, la selectividad, localizada cerca del vrtice de la
resolucin.
Resolucin
Capacidad Velocidad
1
2
3
La parte sombreada indica el
terreno correspondiente a la
analtica, que saca provecho
de los parmetros K, N, k, L,
o y R
Evaluacin:
1. Investigar los diferentes tipos de detectores utilizados en
los cromatgrafos de gases, lquidos y fludos
supercrticos, as como el fundamento tcnico
2. Investigar, analizar y sintetizar al menos un artculo
cientfico donde se aplique al menos uno de los mtodos
de cromatografa de gases (gas-liq., gas-sol), de lquidos
(liq-liq, liq-sol) y de fludos supercrticos