Expresin de genes forneos en levadura: una revisin

INTRODUCTION

La levadura Saccharomyces cerevisiae tiene varias propiedades que se han establecido como una herramienta importante en la expresin de protenas extraas a la investigacin, industriales o de uso mdico. Como un organismo alimentario, es altamente aceptable para la produccin de protenas farmacuticas. En contraste, Escherichia coli tiene pirgenos de la pared celular txicos y clulas de mamfero puede contener ADN oncognico o viral, de modo que los productos procedentes de estos organismos deben ser probados ms extensamente. La levadura se puede cultivar rpidamente en medios simples y a alta densidad celular, y su gentica son ms avanzadas que cualquier otra eucariota, de manera que se puede manipular casi tan fcilmente como E. coli. Como un eucariota, la levadura es un organismo husped adecuado para la produccin de alto nivel de secretada, as como protenas citoslicas solubles. La mayora de los vectores de expresin de levadura se han basado en el plsmido de copias mltiples 2p y contener secuencias para la propagacin en E. coli y en la levadura, as como un promotor de levadura y el terminador de la transcripcin eficiente del gen extrao (Figura 1). La reciente expansin rpida en la levadura de la gentica molecular ha dado lugar a un gran aumento en nuestra comprensin de estos componentes, y como resultado ahora hay una desconcertante variedad de sistemas y mtodos para la propagacin de ADN extrao en la levadura promotor. En muchos casos se han empleado nuevos enfoques ingeniosos, por ejemplo, en el aumento de la fuerza de los promotores nativos o la estabilidad de los vectores de expresin. Haremos lo posible para revisar las opciones disponibles en la actualidad y cmo se relacionan con diferentes necesidades. La insercin de un gen extrao en un vector de expresin no garantiza un alto nivel de la protena extraa; la expresin gnica es un proceso de mltiples pasos complejos y pueden surgir problemas en numerosas etapas, a partir de la transcripcin a travs de la estabilidad de protenas. En el pasado, la expresin del gen heterlogo a menudo ha sido tratada empricamente-un nmero de organismos husped podra ser probado para la expresin exitosa y bajos rendimientos o fallos se pas por encima. Con frecuencia, se haban hecho conclusiones inapropiadas, por ejemplo, aproximadamente relativas fortalezas promotor, simplemente a partir del conocimiento del vector de entrada y la final nivel de estado estacionario de la protena extraa. Sin embargo ahora hay una considerable experiencia acumulada en la expresin de genes forneos en la levadura. En muchos casos, esto ha llevado a la identificacin de un problema particular en una etapa especfica en la cadena de eventos, y a continuacin, a menudo a su solucin. Entre los eucariotas levadura ofrece posibilidades sin precedentes para la resolucin de tales problemas a causa de la potencia de la gentica clsica y molecular combinados. Hemos tratado de dibujar junto ejemplos de esto en la literatura, y de nuestra propia experiencia. Estos deben ser tiles para predecir y resolver problemas con nuevos genes, y debe ser aplicable, en muchos casos, a otros sistemas de expresin, procariota y eucariota.

La secrecin de protenas extraas que son secretadas de forma natural es a menudo necesaria para su correcto plegamiento, y es altamente ventajoso debido a la pureza inicial del producto en el medio de cultivo substancialmente libre de protena. Aunque ha habido varios xitos comerciales que utilizan la levadura, la zona se ha presentado con frecuencia problemas, sobre todo para las grandes protenas. A pesar de una mayor comprensin de los procesos de secrecin, el mayor xito en la mejora de los rendimientos en los ltimos aos ha estado con un enfoque clsico mutagnesis aleatoria. Un nmero de otras levaduras se han convertido en importantes organismos husped para la expresin de gen extrao debido a las ventajas en la fuerza del promotor, la eficiencia de la secrecin, o la facilidad de crecimiento a alta densidad celular. En el futuro algunos de estos a menudo se utilizan en lugar de S. cerevisiae. Por ello, hemos dedicado una seccin importante a discutir otras levaduras Pichia pastoris, en particular en los que hay muchos ejemplos de expresin de alto nivel. Un rea que a menudo es ignorado por los bilogos moleculares, sino que debe ser considerado desde el principio en el diseo vectorial es la fisiologa de expresin de genes forneos. Esto incluye la fisiologa del crecimiento de alta densidad celular y la induccin del promotor, as como el efecto de expresar una protena extraa sobre el metabolismo de la clula husped. Nos hemos reunido ejemplos de la toxicidad de protenas extraas y su efecto en la causa de seleccin de variantes que expresan ofgenetic rendimientos ms bajos, en muchos casos, estos efectos pueden ser controlados. Por ltimo, vamos a discutir las consideraciones implicadas en la ampliacin y optimizacin fermentador industrial a travs de ejemplos con diferentes sistemas promotores de S. cerevisiae y Kluyveromyces lactis y con P.pustoris. TRANSFORMACIN Y SELECCIN MARCADORES Transformacin. Los primeros mtodos para la transformacin de S. cerevisiae involucrados eliminacin enzimtica de la pared celular para producir esferoplastos que podra tomar el ADN en el tratamiento con calcio y polietilenglicol. Los transformantes se sembraron en una parte superior de agar selectivo, isotnica para la regeneracin de la pared celular. Un mtodo ms conveniente se desarroll ms tarde en el que las clulas de levadura intactas se hicieron competentes por tratamiento con iones de litio '*' Este mtodo es ahora ampliamente utilizado a pesar del hecho de que da frecuencias ms bajas;.. Una variacin utilizando DMSO aumenta la frecuencia de 25-f0ld '~ Ms recientemente, un tercer enfoque, la electroporacin, se ha usado, y un mtodo altamente eficiente ha sido reportado por Meilhoc et. El proceso de transformacin parece ser algo mutagnica, tanto para el anfitrin y para el introducido DNA.72 Sin embargo la frecuencia de la mutacin es lo suficientemente baja que no debe ser una preocupacin importante aqu. Tambin, Danhash et al.83 han informado de que la transformacin induce un fenotipo hereditario de bajo crecimiento en S. cerevisiae. Un factor importante a considerar en la expresin de genes extraos es la amplia variacin frecuente en la productividad de los diferentes transformantes cuando se utilizan vectores de 2p. Esto parece ser debido a una variacin estable inexplicable en el nmero de copias del plsmido entre los diferentes

transformantes ^. ^ ^ "^ ^ ^ Es evidente, por lo tanto es importante analizar un nmero de transformantes cuando optimizar la expresin.

Marcadores de seleccin auxotrficas

Marcadores de seleccin auxotrficas Las primera y ms comnmente utilizado marcadores para la seleccin de transformantes fueron LEU2, TRPI, URA3, HIS3 y se utiliza en las cepas mutantes correspondientes que se auxtrofo para leucina, triptfano, uracilo e histidina, respectivamente (Tabla 1). Estas cepas estn ampliamente disponibles, y algunos contienen no reversible alelos mutantes construidos para dar bajas tasas de fondo en las transformaciones. Seleccin Continuacin requiere el uso de medios de crecimiento que carecen de los nutrientes mnimos relevante. Vale la pena sealar que TRPI y URA3 vectores se pueden seleccionar en la presencia de hidrolizados de protena de cidos (que carecen de triptfano y uracilo, por ejemplo, casamino cidos) que a menudo se aade a los medios de comunicacin semidefinida con el fin de mejorar las tasas de crecimiento. Una variante de uso frecuente de LEU2, LEU2-d, 24 tiene un promotor truncado y se expres mal, de modo que su seleccin da lugar a nmeros de copias de plsmidos muy alto. "'Seleccin directa de transformantes con este marcador es ineficiente y requiere el sphaeroplast mtodo, a pesar de los bajos niveles se pueden obtener usando el mtodo de litio, si las clulas se incuban durante la noche en medio no selectivo antes de la seleccin. los vectores que

contienen tanto LEU2-d y otro marcador, por ejemplo, URA3, se puede mantener en cualquiera de las copias de alta o baja nmero dependiendo de la seleccin utilizado. Loison et al.237 utiliza un vector de expresin que contiene estos marcadores para el antgeno P28 esquistosomiasis-I y producto obtenido en el 3% de la protena celular total (TCP) en un medio deficiente en uracilo O 25% en leucina-medio deficiente. Loison et tambin construy un promotordefectuoso alelo URA3, URA3-d, que da alto nmero de copias en un medio deficiente en uracilo. URA3 y LYS2 son particularmente verstil en el que tambin hay mtodos para contra-seleccin del marcador. Por lo tanto uru3 las clulas pueden ser seleccionados por su resistencia a la antimetabolito de cido 5-fluoro-ortico txico, 37 y LYS2 las clulas se pueden seleccionar para la resistencia al cido un-aminoadpico. Estos mtodos se pueden utilizar ya sea para seleccionar mutaciones en las cepas prototrficas o para seleccionar para la prdida de plsmido en los transformantes.

Figura 1. 2 vectores de expresin basados en S. cerevisiae para basan en promotores galactoseinducible. (a) pWYG4 tiene 2p elementos ORI-STB, el promotor GALI, y 2p D gen terminator, un sitio de clonacin NcoI que contiene el ATG se utiliza para insertar genes extraos. (b) pWYG7L tiene intacta 2 ORI, STB, REPI y REPZ, el GAL7promoter y utiliza theFLPterminator; extranjero genes se insertan en el polienlazador con sus extremos 5 'en el BmHI o NcoI sitio.

Marcadores seleccionables dominantes Marcadores dominantes son tiles ya que aumentan la variedad de cepas husped que pueden ser probados para incluir prototrfica y cepas industriales de S. cerevisiae, y se puede utilizar para la seleccin en medio rico. Como la mayora de las cepas son sensibles al antibitico aminoglucsido G418, el marcador de resistencia a G418, codificada por el transposn Tn903 de E. coli, se puede utilizar, aunque es ineficaz en la seleccin directa de transformantes transformants.frequencies estn previstas aceptables se incuban durante la noche en no a medio selectivo antes de la extensin en placas en G418 agar. El uso de glicerol en lugar de glucosa como fuente de carbono durante la seleccin reduce el nmero de colonias no transformadas mutantes resistentes a G418 que surgen. "Se necesitan mltiples copias de el marcador de resistencia a G418 Tn903 para conferir resistencia en clulas de levadura a menos que se utiliza un promotor de levadura, en cuyo caso es activo en una sola copia. Puede ser prudente para omitir la seleccin con antibiticos que afectan a ribosomas, tales como G418, durante la induccin de vectores de expresin debido a la posibilidad de aumento de la incorporacin errnea de aminocidos. Otros marcadores de resistencia a antibiticos que han sido utilizados con xito en la levadura son BI5O higromicina y la resistencia al cloranfenicol. Cobre-resistencia en la levadura es conferida por mltiples copias del gen CUP1 y por lo tanto puede ser utilizado como un marcador dominante en las cepas sensibles (CUPIS). Se ha demostrado ser til en vectores multicopia, en particular con las cepas industriales. Otros dos marcadores que pueden ser utilizados para el vector de nmero de copias de la amplificacin por el aumento de seleccin de medicamentos son los virus del herpes simple gen de la timidina quinasa y la dihidrofolato reductasa. Autoseleccin Una serie de "sistemas de autoseleccin" se han ideado para garantizar que la seleccin del plsmido se mantiene, independientemente de las condiciones de cultivo. Bussey y Meaden "mostraron que la expresin de un ADNc que codifica la toxina asesina de levadura y el gen de la inmunidad se podran utilizar para la auto-seleccin de transformantes de levaduras de laboratorio o industriales desde plsmido libre de clulas se matan por las clulas que contienen el plsmido. otro sistema se ha utilizado el pombe gen de triosa fosfato isomerasa de Schizosaccharomyces para estabilizar plsmidos en las clulas que carecen del gen de S.cerevisiae activa, durante el crecimiento en glucosa. Loison et al. Utilizado ura3 piel 1 cepas como anfitriones de plsmidos que contienen el gen URA3. Estos son no viable ya que se bloquean tanto en la de novo y vas de salvamento para la sntesis de uridina 5'-monofosfato; mantenimiento de un plsmido URA3 es ese caso, obligatoria para la viabilidad incluso en uracilo que contienen los medios de comunicacin. Puesto que el doble mutante sin plsmido es no viable, el transformante se obtuvo por acoplamiento de un 1 cepa de piel con una cepa ura3 que contiene el plsmido URA3, y seleccionando el plsmido que contiene ura3 de piel 1 progenie. Posteriormente, Loison et 1. fueron capaces de aislar directamente espontneos de piel 1 mutantes ura3 a partir de clulas transformadas con un

plsmido URA3 mediante la seleccin para la resistencia a 100 pg / ml de 5fluorouracilo y luego cribado de colonias resistentes para la resistencia a 300 pg/ml5-fluorouridine.We han encontrado que es posible generar URA3 transformantes estables por una sola seleccin directa en 1,3 mg / ml (10 mM) 5-fluorouracilo al que nicamente las pieles 1 mutantes deben ser resistentes. fig 2. Vectores episomales Replicones extracromosmicos se basan ya sea en plsmidos de levadura containin replicacin autnoma secuencias (ARS) que funcionan como orgenes de replicacin, o en el crculo 2p nativa de Saccharomyces ".Una enumeracin conteniendo tanto episomal y la integracin de vectores ha sido elaborado por los padres. Vectores ARS ARS vectors estn presentes en mltiples copias por clula (1 a 20), pero aremitotically altamente inestable, libre de plsmidos clulas de la acumulacin a una velocidad de hasta 20% por generacin sin seleccin, debido a la ineficiente la transmisin a las clulas hijas durante la division.celularesIncluso cuando se cultivan bajo seleccin de la proporcin de las clulas que contienen el plsmido pueden ser muy bajo, dando una nmero de copias media correspondientemente baja. ARS vectores se pueden estabilizar mediante la adicin de la levadura secuencias centromricas (CEN), pero el nmero de copias se reduce luego a 1 o 2 por clula. "En la prctica ARS Vectores casi nunca se usan para el gen extrao expresin y ARSICEN vectores slo se utilizan donde se desea bajo nivel de expresin. 2 vectores basados Con mucho, los vectores de expresin ms utilizados se basan vectores lanzadera de E. coli-levadura en 2 2 es un 6,3 kb plsmido presente en la mayora de las cepas de Saccharomyces en alrededor de 100 copias por haploides genoma (figura 3). El plsmido codifica cuatro genes: FLP (o A), Sust. (o B), REP2 (o C) y D. Adems, 2p contiene un origen de replicacin (ORI, que se comporta como un tpico ARS elemento), el locus STB (necesarias en cis para la estabilizacin), y dos 599 bp secuencias repetidas invertidas. FLP

codifica una recombinasa especfica de sitio que promueve

Figura 2. Estabilidad de un vector URA3 en las cepas de tipo salvaje y 5fluorouracilo-resistente. Un vector de expresin de P-galactosidasa (pWYG4-lac z) se introdujo en la cepa KY 117 y mutantes espontneos resistentes a 10 mM5-fluorouracilo fueron de tipo selected.Wild (1) y mutante (2) transformantes se cultivaron durante diez generaciones en medio inductor no selectivo, a continuacin, se sembraron en placas no selectivas que contienen XGal y galactosa a ensayo para la expresin de P-galactosidasa. Las colonias blancas, lo que indica la prdida de plsmidos, no estuvieron presentes en la cepa mutante. Esto indica autoseleccin del vector en la cepa 5-fluorouraciloresistente. Figura 3. Las dos formas del plsmido 2. Cis-elementos se muestran como cajas y genes llenas de cajas abiertas, regiones repetidas invertidas estn alineados; vase el texto para una descripcin detallada. mover de un tirn sobre los objetivos de recombinacin FLP (FRT) dentro de las repeticiones invertidas, por lo que las clulas contienen dos formas de 2, A y B. A pesar del hecho de que no le confiera el fenotipo conocido y de hecho puede ser ligeramente desfavorable para la celula huesped 2 se hereda de forma estable, libre de plsmidos clulas surgen a razn de 1 en lo 4 por generacin. Esto se logra mediante dos mecanismos: (1) por parte la superacin del fuerte sesgo materna en el plsmido transmisin, y (2) por amplificacin para corregir las fluctuaciones en el nmero de copias causadas por ineficiente transmisin. Segregacin eficiente depende de que el STB locus en cis y los 1y REP2 productos gnicos REP. La amplificacin supera la regulacin de acogida que restringe cada origen de replicacin a una iniciacin por ciclo celular, sino que parece depender de la repeticin invertida secuencias y el producto del gen FLP. segn el modelo propuesto por Futcher, FLP promueve recombinacin entre replicado y no replicado ADN que se produzca la inversin y dos replicacin horquillas pueden seguirse unos a otros alrededor del crculo. Replicacin termina despus de una segunda recombinacin, y recombinacin adicional genera 2 mltiple monmeros. Los vectores 2p 2p simples contienen la ORI-STB, un marcador seleccionable de levadura, y el plsmido bacteriano secuencias (por ejemplo pWYG4, Figura l), y se utilizan en una 2p + cepa de acogida que suministra rEPL y REP2 protenas. Vectores de expresin ORI-STB son los ms cmodo de usar de forma rutinaria en el laboratorio debido a su pequeo tamao y facilidad de manipulacin. Son diez veces ms estables que los plsmidos ARS, perderse en 1 a 3% de las clulas por generacin en no selectivo condiciones, y estn

presentes en 10 a 40 copias por clula. En las clulas 2p libres de tales plsmidos se comportan como vectores del ARS. Vectores ORI-STB de uso comn contener un fragmento EcoRI de 2,2 kb o un 2,1 kb Hind111 fragmento de la forma B de 2p, cada uno con unrepeticin invertida. Con el fin de limitar la recombinacin con 2p, la repeticin invertida puede ser retirado, pero Es importante no quitar adyacente STB-distal secuencias, ya que estos parecen tener un importante papel en la proteccin del STB transcripcional inactivation.Cabe sealar que los vectores lanzadera que contienerepeticiones invertidas van a existir como una variedad de recombinantes con la adicin 2p.In nativa, hay parece haber cierta competencia entre exgena Vectores de 2p y 2p nativa de tal manera que el nmero de copias de tanto est deprimido(oprime). Vectores lanzadera 2p basados ms complejos contienen los genes REP1 y REP2 adems de ORI-STB y por lo tanto pueden ser utilizados en cepas husped 2p-libres. Es ms complicado que los vectores ORI-STB, pero ms estable y ms adecuado para la ampliacin. Muchos ejemplos de este tipo de vector se interrumpen en D (por ejemplo, pJDB248), y algunos en el FLP (por ejemplo, pJDB219) de manera que no pueden dar la vuelta o amplifican en clulas 2p-libres. Sin embargo FLP plsmidos pueden llegar alto nmero de copias en las clulas 2p libres, presumiblemente a travs asimtrica segregacin. En 2p + cepas que pueden amplificar de forma independiente si tienen dos repeticiones invertidas, orfollowing integracin en 2p si tienen slo uno repita. Recientemente, se han desarrollado vectores que tienen todas las regiones funcionales de 2p intactos, mediante la insercin del ADN extrao en el nico sitio SnaBI entre ORI y STB. Estos son altamente estable, pero an 20 a 80 veces menos estables que 2p nativa, posiblemente debido a la transcripcin de bajo nivel a travs del STB. En futuras vectores similares deben encontrar amplio uso en la expresin de genes forneos. Vectores libres del ADN bacteriano puede ser ventajoso en la expresin del gen extrao en relacin con las autoridades reguladoras de alimentos y medicamentos. Ellos se pueden hacer en una de dos maneras: (1) por la integracin targetted de un casete de expresin en 2p nativa, o (2) mediante el uso de un vector lanzadera que puede eliminar las secuencias bacterianas in vivo mediante la recombinacin por escisin. Usando el ltimo enfoque, Chinery y vectores de desintegracin 'Hinhcliffe.constructed que utiliza la FLP / FRT sistema a ADN bacteriano especial insertado en el sitio XbaI de una de las repeticiones invertidas. Insertos Vectorwith en el sitio PstI nico en D o en el sitio SnaBI entre el STB y ORI eran extremadamente estables, a pesar de que no est claro si la estabilidad se mantiene tras la insercin de un casete de expresin de alto nivel. Un nmero de vectores de nmero-alta-ultra-copia (por ejemplo, pWYG7L, Figura 1) se basa en pJDB219 que contiene toda la forma 2p B clonado en el plsmido pMB9 bacterianas con interrupcin de FLP. El marcador seleccionable es LEU2-d cuyo uso resulta en un nmero muy alto nmero de copias (200 a 400 copias por genoma haploide), la fraccin de clulas con el nmero de copias del plsmido se seleccionan constantemente ms alta, lo que resulta en una menor tasa de crecimiento. Crecimiento selectivo o el uso de otros marcadores da un nmero de copias ms normal de alrededor de 50 por clula. pJDB219 se utiliza mejor en las clulas 2p-libres ya que puede sufrir recombinacin mediada por FLP con 2p residente, lo que lleva a la prdida del

ADN extrao, pero la retencin del marcador LEU2-d. En las clulas 2p libres pJDB219 es muy estable debido a su elevado nmero y la cooperacin, por lo que es adecuado para el cultivo a gran escala. Versiones FLP de pJDB219, por ejemplo, pxy, tienen una mayor estabilidad en medio no selectivo. Dado que toda la secuencia de pMB9 no ha sido determinada, puede ser ms conveniente utilizar una variante de pJDB219 basado en pBR322, por ejemplo, pC1 / 1. Los vectores pueden tener un nmero de copias muy elevado incluso en condiciones no selectivas si se suministra recombinasa FLP adicional. Por ejemplo, la induccin de FLP de una sola copia integrada del gen bajo el control del promotor GAL1 conduce a un cambio en el nmero de copias del plsmido de <50 a 200-400. Alternativamente, la alta copia de auto-selectiva URA3-d marcador se puede utilizar en una cepa husped de piel 1. Vectores nmero de copias Regulados La expresin de genes extraos, pudiendo ser regulada mediante la induccin de un aumento en el nmero de copias del vector. Se han descrito dos tipos de vectores episomales de levadura con nmero de copia regulada: (1) vectores con centrmeros regulables, y (2) 2p vectores en clulas con FLP inducible (vase ms arriba). El primer tipo depende de la observacin de que los elementos CEN pueden ser inactivados por la transcripcin. ChlebowiczSledziewska y Sledziewski construyeron vectores que contienen la glucosa promotor ADH2 reprimible adyacente a CEN3 y, o bien una ARS o 2p STB-ORI. En el nmero de copias de vectores de ARS se podra aumentar de 1-2 a 5-10 por un interruptor de la glucosa a etanol como fuente de carbono. En el nmero de copias de vectores ORI-STB podra aumentar de 1-2 a aproximadamente 100 y el vector fue muy estable. Tales vectores se podran usar para aumentar el grado de regulacin en la expresin de protenas txicas. Los vectores de integracin (vectores YIP) La integracin cromosmica ofrece una alternativa ms estable con el mantenimiento episomal de ADN extrao. En la integracin de Saccharomyces se produce normalmente por recombinacin homloga. Los vectores de integracin (YIP) contienen ADN cromosmico de levadura para la integracin de destino, as como un marcador seleccionable y un replicn bacteriano. Los vectores se digirieron por lo general en un nico sitio de restriccin en el ADN homloga ya que esto promueve la transformacin de alta eficiencia y la integracin objetivos. Tales resultados individuales de cruce de integracin en una duplicacin de la secuencia diana cromosmica, por lo que el vector pueda posteriormente "estallar out 'por recombinacin por escisin. Sin embargo, los integrantes son bastante estables, la tasa tpica de prdida de vector de ser <1% por generacin en ausencia de seleccin. Para la integracin del vector conveniencia pueden ser dirigidos para el alelo mutante cromosmico del marcador de seleccin utilizado. Sin embargo, continua la seleccin de los transformantes resultantes es ineficaz, ya que la duplicacin de ADN se puede escindir y un marcador de tipo salvaje retenido. Por el contrario, la seleccin continua es eficaz donde la integracin est dirigida en otro lugar. Cuando se utilizan altas concentraciones de ADN de los vectores de integracin en las transformaciones, inserciones en tndem multicopia pueden dar como resultado, presumiblemente debido a eventos de recombinacin repetidos.

Integrantes de mltiples copias son relativamente estables y se han utilizado, por ejemplo, en los estudios de dosis gnica. Transposicin Un tipo alternativo de integracin, transposicin, hace uso de la doble recombinacin homloga para sustituir el ADN cromosmico de levadura, dando como resultado una estructura estable y sin duplicaciones. Cuando se requiere un transformante estable de copia nica este es el mtodo de eleccin. Vectores de transposicin contienen el ADN exgeno y marcador de seleccin flanqueado por ADN de levadura homloga a 5 'y 3' regiones del ADN cromosmico que se sustituye. Antes de la transformacin el vector se digiere con enzimas de restriccin que liberan el fragmento transplacing con 5 'y 3' homloga. La frecuencia de transformacin es baja de manera que el mtodo sphaeroplast se utiliza por lo general, y la estructura cromosmica de los transformantes se debe comprobar fenotpicamente y por anlisis de transferencia Southern. Integracin en reiter ADN Un nmero de estrategias basadas en la integracin en reiter ADN cromosmico se han utilizado para generar estables integrantes multicopia. En la actualidad los mejores resultados en trminos de nmero de copias y la expresin parece estar utilizando la integracin en el clster de ADN ribosmico (ADNr). El cluster de ADNr se compone de alrededor de 140 repeticiones en tndem de una unidad de 9,1 kb en el cromosoma XII. Lopes et. han construido un vector de integracin, pMIRY2, que contiene una porcin de la unidad de ADNr y el marcador LEU2-d. La transformacin con pMIRY2 digerido en SmaI o HpaI dio transformantes Leu 'con 100-200 copias integradas en un espaciador no transcrito del locus ADNr. El uso de los marcadores promotor defectuosos LEU2-d u otro era importante para el aislamiento de los integrantes alto nmero de copias. Los transformantes fueron altamente estables, 80-100% de las copias integradas siendo retenidas despus de 70 generaciones, y los niveles de protena extraa producidos utilizando el promotor PGK fueron tan altos como de vectores 2. Este enfoque tambin se podra utilizar como una alternativa a los vectores episomales en especies en las que se ha encontrado ninguno. Otra reiterada ADN que puede ser utilizado como una diana para la integracin es la Ty elemento transponible que est presente en 30 copias por genoma 4Oen la mayora de las cepas de Saccharomyces. Kingsman y. se describe el uso de un vector de transposicin targetted para reemplazar Ty, cuyo nmero de copias podra ser amplificada usando el marcador de seleccin LEU2-d. Los niveles de interfern producidos a partir de dichos transformantes amplificados eran varias veces ms alto que a partir de una sola copia ARS / CEN vectores pero casi diez veces menor que con los vectores de 2p. Jacobs et. . Utilizando vectores similares con el fin de co-expresar las diferentes formas de hepatitis B antgeno de superficie (HBsAg). Se obtuvieron transformantes que contienen de una a varias copias del vector sin la necesidad de amplificacin. Los transformantes de mltiples copias consistieron principalmente en el ADN transplacing en un solo locus Ty 1 y surgieron por un mecanismo inexplicable. Con el fin de co-expresar las diferentes formas de HBsAg en la relacin deseada, una y una cepas se transformaron con cada vector, integrantes multicopia seleccionados, y diploides hechas. Diploides estables con un total de 10 copias fueron hechas, pero los niveles de expresin que pareca ser baja.

ms recientemente Shuster. han utilizado que se integran por sola cruzado en 6 elementos, que existen ya sea solo o como parte de Ty en todo el genoma de S. cerevisiae. Ellos construyeron un vector que expresa el gen lacZ de E. coli con los marcadores LEU2 y CUP1. Transformantes Leu 'fueron seleccionados despus de la transformacin con el vector digerido por XhoI, que corta en el elemento 6 en el fragmento marcador LEU2. Estos fueron seleccionados para el cobre-resistencia para aislar integrantes multicopia que rindieron hasta diez veces el nivel j3-galactosidasa de las cepas de una sola copia. La integracin en 6, junto con el cruce de integrantes haploides, se ha usado para generar una cepa 20-copia para la secrecin eficiente de factor de crecimiento nervioso. Vectores Transposicin Un enfoque diferente para la integracin de copias mltiples es el uso de vectores de transposicin de Ty anlogos a los vectores retrovirales para clulas de mamfero. Ty transpone a travs de una transcripcin de longitud completa que est encapsidado en partculas similares a virus y transcribe de forma inversa a ADN, que puede entonces integrar en mltiples sitios. En los vectores de transposicin de un promotor regulado, por ejemplo, Gall, se utiliza en lugar de la 6 Ty promotor para generar una transcripcin que abarca el gen extrao y un marcador seleccionable. Seales de terminacin de la transcripcin deben ser retirados a partir del gen marcador de la transcripcin de longitud completa para ser producido. Toda la unidad se coloca en un vector episomal para la transformacin inicial, pero puede perderse despus de la induccin de la transposicin. Boeke y. obtenido nmero de integrantes relativamente bajos de copias (1-10) por este mtodo, pero puede resultar factible utilizar el gen LEU2-d para la amplificacin. Aunque este mtodo no est completamente desarrollado que podra ser til en una variedad de levaduras, Ty desde codifica todas las funciones necesarias para la transposicin. PROMOTORES transcripcinal y de TERMINATORS Promotores extranjeros frente a levaduras La expresin de genes forneos en la levadura se examin tan pronto como llegaron a estar disponibles los procedimientos de transformacin. El primer estudio fue del gen b-globina de conejo que fue encontrado para dar lugar a transcritos anormales en el que los intrones no estaban empalmados. En unos pocos casos se inici correctamente la transcripcin extranjera, por ejemplo, con zena, pero en promotores transcripcionales extranjeras generales se encontr que han iniciacin aberrante, por ejemplo, Drosophila ade8 o eran totalmente inactivo, por ejemplo, virus del herpes simple timidina quinasa. Por lo tanto para la transcripcin eficiente de genes extraos encontr el uso de promotores de levadura con ADNc wassoon a ser esencial. El primer ejemplo publicado fue el uso de un fragmento de 1500 pb 5 'del gen para la expresin intracelular ADHL eficiente de los leucocitos a-interfern. Promotores de ARNm de levadura consisten en al menos tres elementos que regulan la eficacia y la precisin de la iniciacin de la transcripcin: secuencias de activacin aguas arriba (UAS), elementos TATA y elementos de iniciador. Muchos tambin contienen elementos que intervienen en la represin de la transcripcin. UAS, que tienen algunas similitudes con potenciadores de mamferos, determina la actividad y la regulacin del promotor a travs de la unin especfica a activadores de la transcripcin (por ejemplo, GAL4 y GCN4),

y actuar a distancias variables 5 'al sitio de iniciacin. Algunos UAS han sido asignados a las regiones cortas de ADN, por ejemplo, la vescula UAS GAL10 a una regin intergnica 108 pb que contiene cuatro secuencias cortas de simetra dada. Estas secuencias (17-21 pb) son necesarias y suficientes para la unin de GAL4 de la trans-activador y de la galactosa-regulacin, y actan de forma sinrgica. UAS de algunos genes expresados constitutivamente contienen tractos de poli (dA-dT) que probablemente activan la transcripcin al afectar la estructura nucleosoma. TATA elementos (consenso TATAA) se encuentran 40 a 120 pb aguas arriba del sitio de inicio, en contraste con la distancia ms rgida de 25 a 30 pb en eucariotas superiores, y proporcionar una ventana dentro de la cual puede producirse la iniciacin. El elemento iniciador, que est mal definido, dirige la iniciacin de ARNm en los sitios estrechamente adyacentes. Promotores de levadura pueden ser altamente compleja, que se extiende ms de 500 pb, que contiene mltiples UAS s y sitios reguladores negativos, y mltiples elementos TATA asociados con diferentes sitios de iniciacin. La mayora de los promotores se regulan en cierta medida, pero los ms poderosos, los promotores glicolticos estn mal reguladas. Esto los hace indeseable para uso en el cultivo a gran escala, en donde hay ms oportunidades para la seleccin de las clulas no expresan, y no adecuados para la expresin de protenas txicas. En tales casos, es preferible usar un promotor estrechamente regulado de manera que la etapa de crecimiento se puede separar de la fase de expresin. A pesar de una severa limitacin de la eficiencia con mltiples copias, GaLI ha sido el promotor regulado ms utilizado. Sin embargo,ahora hay una gran variedad de promotores nativos u obra de ingeniera (Tabla 3); la eleccin correcta es crtico para cualquier aplicacin, especialmente cuando es un proceso a ser mayor escala. Promotores glucolticos Los primeros promotores utilizados eran abundantes de genes que codifican enzimas glicolticas, por ejemplo, alcohol deshidrogenasa I (ADHL), fosfoglicerato quinasa (PGK) deshidrogenasa gliceraldehdo-3-fosfato (GAP). Estos fueron en primera idea a ser constitutiva, pero ms tarde se encontr que ser inducida por la adicin de glucosa, por ejemplo, expresin de uninterfern usando el promotor PGK se indujo 20 - a 30 veces mediante la adicin de glucosa a un cultivo crecido en el acetato como carbono -. glucolticos fuente de promotores son los ms poderosos de S.cerevisiue, por ejemplo ARNm de PGK se acumula a 5 % del total. A pesar de su relacin de induccin pobre, los vectores de ADHI, PGK y GAP se han utilizado ampliamente en el laboratorio, y en algunos casos industrialmente. El promotor PGK ha sido estudiada con cierto detalle: se extiende ms de 500 pb, contiene un complejo de UAS en -473 a-422 con respecto al sitio de iniciacin, un elemento regulador de choque de calor, y otras caractersticas que contribuyen a la iniciacin precisa y eficiente. Por el contrario, se sabe menos acerca de otros promotores glucolticas, como GAP. Hay tres genes GAP, de los cuales GAP491 o TDH3 es el ms altamente expresado y cuyo promotor ha sido utilizado con xito para expresar un nmero de protein.The promotor de longitud completa se extiende sobre aprox. 700 pb, pero ha habido una serie de informes de los fragmentos ms pequeos que tienen actividad promotora completa, por ejemplo, un fragmento de 198 pb. Sin embargo,

parece que la actividad de los promotores GAP491 ms cortas depende de secuencia de vector bacteriano.

Promotores de galactosa-regulados Los ms potentes promotores fuertemente regulados-de S. cerevisiae son los de los genes de la galactosa-regulado GALI, GAL7, y Galio, que participan en el metabolismo de la galactosa. La galactosa-regulacin en la levadura est muy bien estudiado y se ha convertido en un modelo de sistema clave para la regulacin de la transcripcin eucaritica (revisado en la referencia 201). Muchos genes estn involucrados en la regulacin de los promotores GAL, pero la interaccin central es entre el trans-activador codificado por GALI, el represor codificado por GAL80, y la UAS GAL (Figura 4). La unin de la protena GAL4 a la UAS es necesaria para la induccin; GAL80 se une la protena GAL4 y acta como un represor a menos que se aade la galactosa. Las regiones de la protena GAL4 que se unen GAL80 y la UAS se han definido, como tienen las caractersticas estructurales de los diferentes promotores GAL.

GALI, GAL7 y mRNAs Galio son inducidos rpidamente> 1000 veces aprox. 1% del total de ARNm en la adicin de galactosa. Los promotores estn fuertemente reprimidas por la glucosa, por lo que en glucosa en cultivos crecidos induccin mxima slo se puede lograr siguiente agotamiento de la glucosa. Inducciones galactosa pueden llevarse a cabo en una de tres maneras: (1) por el crecimiento de el cultivo en un ('neutral') azcar no reprimir, noninducing, cuando muy rpida induccin sigue adicin de galactosa, (2) por el crecimiento de la cultura en la medio de glucosa, pero la eliminacin de la glucosa por centrifugacin y lavado de las clulas antes de la resuspensin en medio de galactosa (esto conduce a un retraso de 3 a 5 h en

la induccin '), y (3) haciendo crecer las clulas en medio que contiene tanto glucosa y galactosa, cuando la glucosa se metaboliza preferentemente antes de que pueda producirse la induccin con galactosa. Los dos primeros mtodos se utilizan con frecuencia para pequea escala, pero no son prcticos en inducciones a gran escala. Cabe sealar que muchas cepas de uso comn tienen mutaciones en el gen de permeasa de galactosa (GAL2) y no son inducibles.

La Figura 4. Galactosa regulacin en la levadura. Los genes implicados en la regulacin y el metabolismo y su localizacin cromosmica se muestran. La estimulacin se indica con lneas gruesas con las flechas y la inhibicin por lneas con barras. El gran fondo de conocimientos de la regulacin de galactosa ofrece la posibilidad de manipular el sistema en un nmero de maneras con el fin de mejorar sus caractersticas para la produccin de protenas. Tres tipos de manipulaciones que se han llevado a cabo son los siguientes: (1) la sobreexpresin de trans-activador; (2) el uso de mutaciones en la va de la galactosa-reguladora o de la glucosa-represin, y (3) la construccin de quimrico promotores galactosa-regulados. Protena GAL4 est presente en una o dos molculas por clula y, por otra parte, GAL80 represor es en exceso de esta y es inducible por galactosa. Por lo tanto, incluso con los promotores de una sola copia, la transcripcin GAL est limitada por la escasez de la protena GAL4, aunque otros factores tambin supone una limitacin con multi-copia promotor. Con vectores de expresin de mltiples copias de GAL4 limitacin se ve agravada, por ejemplo la expresin pgalactosidase partir de un vector GAL-lacZ aumenta slo dos veces en ir desde una sola copia de un vector 2p. Tanto con vectores individuales y multi-copia, de dos a tres aumentos de plegado se pueden obtener en GAL80 cepas, pero la expresin se convierte entonces en constitutiva. La sobreexpresin de la GAL4, ya sea mediante la insercin del gen en el vector de expresin de mltiples copias, o mediante el uso de un vector de expresin de la integracin de ADHIGAL4 de copia nica, aumenta los niveles de productos 2 - a 3 veces, pero de nuevo en el arroz de perder regulacin estricta. Schultz et. utilizado an-GAL4 Galio

integrado de vectores de expresin con el fin de producir en exceso la protena GAL4 de manera galactosa-regulado. La transcripcin a partir del vector de expresin diana, que codifica el virus de Epstein-Barr (VEB) gp350, se aument 5 veces. Hemos probado un sistema similar que utiliza un vector de ADH2, GAL4 expresin integrada con el fin de producir en exceso la protena GAL4. Este sistema altera la regulacin de los vectores de expresin GAL para que se induzcan por la glucosa-agotamiento. El uso de un gen constitutivo GAL4, es decir, uno que no interacta con GAL80 represor, que era posible aumentar los niveles de P-galactosidasa producidos a partir de un vector Gall multi-copia por 2 - a 4 veces (MARAND JJC, resultados no publicados). Con el fin de facilitar la induccin de la galactosa-glucosa-cultivadas cultivos, se ha examinado el uso de mutantes defectuosos en global o especfica GALglucosa-represin. En Regl-1 mutantes eficiente galactosa-induccin se produce con galactosa a proporciones de glucosa de 5: 1 0.248 Hovland y usa un procedimiento de seleccin novedoso para aislar mutantes resistentes a la glucosa, y se encontr un mutante reg1 (regl-501) en el que se produjo la induccin eficiente incluso con galactosa / glucosa relaciones de 1/100. Una cepa biliar Regl-501 se hizo que no puede metabolizar la galactosa para que los niveles muy bajos de galactosa (por ejemplo, 0,2%) podra ser utilizado, en presencia de exceso de glucosa, para la induccin eficiente. En un intento de combinar la alta actividad de los promotores glicolticos con la estricta regulacin de los promotores GAL, promotores hbridos se han construido donde un UAS glucoltica se sustituye por un UAS GAL. Sin embargo, los resultados publicados no sugieren que estos hbridos son ms eficientes que los promotores GAL. Bitter y Egan han descrito el uso de una UAS hbrido GAPIGAL para la expresin de y el interfern, que es txico para las clulas de levadura. La insercin de un fragmento de UAS GALI-GAL10 55 pb entre el GAP UAS y el elemento TATA galactoseregulation confiere al promotor. Niveles de producto fueron significativamente mayores que con el promotor GAP natal, en gran parte debido a un aumento espectacular del nmero de copias del vector, del 1 al 20 a 50 por clula. Asimilar tipo de promotor hbrido (PAL) se ha construido, mediante la sustitucin de la UAS PGK con una chica UAS, y se utiliza para la produccin regulada de ainterferon y albmina de suero humano. Sin embargo, no hay comparacin de la eficiencia de los promotores GAL y PAL ha sido publicada; sera de esperar que todos los promotores hbridos UAS GAL-fueran severamente limitados por la protena GAL4. Promotores fosfato regulados El promotor del gen de la fosfatasa cida, PH05, est regulada por la concentracin de fosfato inorgnico y se ha utilizado ampliamente para la expresin gnica extranjera. En el correo de los primeros estudios, se utiliz un fragmento de ADN de 1,4 kb PH05 para impulsar la produccin de un interfern, que fue inducida de 200 veces por el cambio a medio de bajo fosfato. Ms recientemente, las caractersticas estructurales y la regulacin de el promotor PH05 se han estudiado en detalle (revisado en la referencia 394). El promotor, que abarca alrededor de 400 pares de bases de ADN, contiene dos UAS que son necesarias y suficientes para la regulacin. Estos contienen secuencias de 19 pb dada que se unen la PH04 trans-activador. Dado que el promotor PH05 no es muy fuerte, se han hecho intentos de utilizar los PH05 UAS para conferir regulacin de promotores glucolticas. . Hinnen et 0,1 construy una serie de GAP / PH05 UAS hbridos y los prob en vectores de

expresin para eglin C. Algunos promotores hbridos rindieron hasta el doble de la cantidad de producto como GAP, pero la relacin de induccin fue de 2 - a 5 veces en comparacin a 40 veces para PHOS. Dado que no se dispona de los datos de nmero de copias no se pueden sacar conclusiones sobre la fuerza del promotor relativa. Kramer et.constructed una cepa husped sensible a la temperatura en el PH04 trans-activador y defectuoso en la PH080 represor (Pho4> PHO80) para lograr la induccin de fosfato independiente de la PH05 promotor regulado por la temperatura. En la reduccin de la temperatura desde 35 C a 23 C se logr una induccin de 50 veces de un-interfern, pero el nivel absoluto era slo una dcima parte que en las clulas inducidas de tipo salvaje. Promotores represor de glucosa o glucosa promotores represibles. La glucosa-represin es un sistema global de regulacin de la expresin de un nmero de genes, incluyendo los genes de fermentacin de azcar, por la disponibilidad de la glucosa. Las levaduras utilizan preferentemente los azcares tales como la glucosa que entran en la va glucoltica directamente. Los genes implicados en sacarosa o metabolismo de la galactosa se transcripcionalmente reprimidos por glucosa. Los ejemplos tpicos de promotores regulados principalmente por la glucosa-represin son los de la ADH2, los genes del SUC2 y CycL, que codifica la alcohol deshidrogenasa II, invertasa y el iso-1-citocromo c, respectivamente. El promotor de ADH2 es a la vez potente y bien regulada y se ha utilizado para la expresin de genes forneos. Puesto que se reprime ms de 100 veces por la glucosa, que puede ser utilizado para la expresin eficiente de protenas txicas, por ejemplo, similar a la insulina factor de crecimiento I (IGF-I). El anlisis de delecin ha identificado una regin de 260 pb 5 'del sitio de iniciacin que contiene dos UAS suficientes para la actividad promotora completa y la regulacin. UAS1 es una repeticin invertida de 22 pb que se une la ADRL trans-activador. "'Hemos utilizado la regin de 260 pb, que se monta fcilmente a partir de oligonucletidos sintticos, en vectores de expresin eficientes (MAR y JJC, resultados no publicados). Con el fin de mantener la represin de ADH2, las clulas deben ser cultivadas en exceso de glucosa (por ejemplo, 8%) hasta la induccin, que se efecta mediante el cambio a un medio fresco que contiene una fuente de carbono no fermentable, por ejemplo, etanol, glicerol, rafinosa, etc Alternativamente, ADH2can ser inducida mediante el cultivo inicialmente en una menor concentracin de glucosa (por ejemplo, 1%) que se va agotando gradualmente. Sistemas de represor de glucosa tienen una desventaja potencialmente seria en las fermentaciones industriales: es difcil mantener glucoserepression ajustado bajo condiciones de limitacin de glucosa, que son necesarios para lograr una alta densidad celular. Irani et al.ls7 mostr que los factores transcripcionales, incluyendo la ADR1 trans-activador, se convirtieron limitante para ADH2 de la transcripcin a partir de plsmidos de mltiples copias. La sobreexpresin de la ADR1 conduce a la prdida de la regulacin, pero ADH2-regulado sobreexpresin de ADR1, de un vector de la integracin de una sola copia, se ha utilizado para aumentar la eficiencia de los sistemas de expresin ADH2 sin prdida de reg ~ lation.I ~ n ~ th 'es forma en que ha sido posible aumentar la expresin de la Pgalactosidasa a partir de una sola copia de ADH2-ZacZ vector por 4 - a 10 veces. El sistema por lo general resulta en aproximadamente un aumento de 3

veces en el rendimiento de las protenas intracelulares y se utiliza para la produccin comercial (J. Shuster, comunicacin personal). Promotores glucolticas / ADH2 hbridos se han construido mediante el trasplante de las UAS de ADH2 GAP en proximales secuencias promotoras. Cousens et aZ.78 fusiona los ADH2 UAS que contienen el 22 pb dada 320 pb aguas arriba del elemento GAP TATA, y fueron capaces de lograr una produccin estrictamente regulados de la superxido dismutasa (SOD), proinsulina fusin de> 15% tcp Sin embargo, no hay comparacin crtica de la fuerza de la ADH2, BPA, y promotores hbridos ha sido publicado. Otros sistemas de promotores regulados. Algunos otros sistemas promotores regulados son dignas de comentario aqu: estos son de inters debido a su induccin es independiente de los nutrientes de cultivo y por lo tanto puede ser controlado sin perturbar de otro modo la cultura. Un sistema de temperatura regulada sobre la base de acoplamiento de control de tipo ha sido utilizado por un nmero de grupos. Las mutaciones en los genes SIR de-reprimen los loci de tipo de apareamiento silenciosas, de modo que una o genes especficos de un no se expresan. La represin del promotor MFAL est mediada por el represor MATa2 que se une una secuencia de operador 31 pb. Brake et al.42primero inform el uso de una cepa MATasir3 "para la secrecin de hEGF usando el factor a (MFAL) promotor. Con mutacin de la no permisiva (35 C.) a la (25oC) temperatura permisiva dado lugar a una induccin en secretada hEGF de 10 ng / l de 4 mg / l. el operador a2 se ha transferido a la fuerte ADHZ y TPZ (triosa fosfato isomerasa) promotores y demostrado que confieren temperatura de regulacin en una cepa MATa sir 3. Sledziewski et insertar hasta cuatro operadores entre los elementos UAS y TATA del promotor TPZ y fueron capaces de obtener una regulacin estricta (> induccin SO-pliegue de la P-galactosidasa) y la actividad completa. Inexplicablemente, los promotores ADHZ hbridos no eran estrictamente regulados por temperatura. El sistema parece susceptible de ajuste fino mediante el uso de temperaturas de induccin intermedios. Un sistema similar se ha desarrollado mediante la insercin de dos operadores a2 en el promotor PGK, el logro de una relacin de induccin> loo-veces sin ninguna reduccin en la actividad. Un nuevo tipo de sistema promotor utiliza la capacidad de los receptores de hormonas esteroides de mamferos para funcionar como activadores de la transcripcin en la levadura. Schena etl.constructed un vector de expresin CZ CDy bajo el control de tres elementos en tndem de 26 pb de respuesta a glucocorticoides fusionados aguas arriba del promotor. En clulas de levadura tambin que expresan el receptor de glucocorticoides, un gen reportero CAT podra ser inducido 50 - a 100 veces a niveles altos mediante la adicin de desoxicorticosterona (DOC). El grado de induccin fue valorable ms de 1 nM a 10 Mm-DOC y fue muy rpida (t,, de 7 a 9 minutos). Un sistema similar se ha desarrollado el uso de un promotor PGK hbrido que contiene elementos de respuesta a andrgenos. Un ddition de cantidades crecientes de dihidrotestosterona inducidas cantidades crecientes de reportero 13galactosidasa durante un intervalo de varios cientos de veces, y la gama podra extenderse a 1400 veces, variando el nmero de copias de los genes del receptor o reportero. En conclusin, los sistemas de esteroide-regulados

parecen ser potente y bien-controlado, y podran utilizarse en levaduras que carecen de promotores con estas cualidades (por ejemplo K.Zactis y Spombe). El promotor del gen CUPL, codificacin metalotionena de cobre, se ha usado en la expresin vectors.IL3T su promotor est estrechamente regulada y independiente de los parmetros del cultivo. La concentracin de iones Cu2 + para la induccin depende de la de cobre y la resistencia de la cepa husped de 0.0 mM de 1 (sin gen CUPL) a 0,5 mM (> 6 copias). Seleccin de nuevos promotores de levadura Un nmero de mtodos de seleccin o cribado tiene ha utilizado con el fin de identificar nuevos promotores a partir de una biblioteca genmica. Los procedimientos de seleccin pueden ser ideados para los promotores regulados, por ejemplo, el represor de glucosa promotores de los genes GUT2 y ALCS que codifican la deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato y vacuolar endroprotease B, respectivamente. Sistemas de promotores extranjeros Promotores extranjeros no reconocidas por la levadura RNA la polimerasa puede, en principio, ser utilizado siempre que el cognado ARN polimerasa es co-expresada. la bacterifago T7 ARN polimerasa es altamente activa y ha sido utilizado en un nmero de procaritico y organismos eucariotas. T7 ARN polimerasa, idealmente con una seal targetting nuclear adicional, puede ser expresada a partir de un promotor GAL1 y puede de manera eficiente transcribir ADN en la clula de levadura. Sin embargo, el T7- inducida lacZ ARNm no se traduce en la levadura, debido ya sea a la ausencia de 5 'tapas y / o de poliadenilacin, o a una horquilla estable formado en el 5 'En regin. Clulas animales un problema similar se ha resuelto mediante el lder del virus de la encfalo miocarditis para promover traduccin independiente de caperuza, IO8 pero esto parece estar inactivo en la levadura (CAS, resultados no publicados). si el problema de traduccin se resolvieron una levadura T7 sistema sera muy potente, ya que GALI-impulsado expresin de la polimerasa actuara como un etapa de amplificacin. Levaduras terminadoras Levadura terminadores de la transcripcin son generalmente presentar en vectores de expresin para el ARNm eficiente 3 ' terminar la formacin. Terminadores de procariota o los genes eucariotas superiores no son normalmente activo en levadura, aunque hay excepciones, como el Drosophila gen ade8. Terminacin eficiente es probablemente necesaria para la expresin mxima: eliminacin de las secuencias de 'terminacin' 3 'del gen CYC1 result en una mayor ARNm y una reduccin dramtica en el nivel de mRNA. Terminacin de la transcripcin de los ARNm de levadura es comprendida menos que en las bacterias y en eucariotas superiores. Transcripcin bacteriana termina en el extremo 3 madura 'del ARNm. En mayor formacin del extremo eucariotas mRNA 3 'implica de escisin y poliadenilacin, aguas abajo de la seal AAUAAA, de mRNAs precursores que se extienden varios cientos de nucletidos ms all de la codificacin regin. Contrariamente a las ideas anteriores, parece que la levadura ARNm siguen el mismo patrn de terminacin, el procesamiento y la poliadenilacin del pre-ARNm como una mayor eucariota. Sin embargo, en estos procesos son la levadura estrechamente unida y se producen a una distancia ms corta, cerca del extremo 3 'del gen.

Han sido implicados Un nmero de secuencias de consenso como parte del ARNm 'terminador', especialmente la secuencia tripartita TAG .. (T-ricos) .. TA (T) GT .. (AT-ricos) .. TTT y TTTTTATA. El comnmente tripartito motivo encontrado muestra mala conservacin y es tolerante de las grandes alteraciones de la secuencia, lo que sugiere que una caracterstica general, tales como alta AT-contenido puede ser crtico. Sin embargo, esto no puede ser suficiente, ya que los terminadores son con frecuencia ausentes en el ADN rica en AT, y puede ser unidireccional, lo que implica alguna secuencia especificidad. Ms reciente la evidencia sugiere que una variedad de diferentes seales, unidireccionales y bidireccionales, se utilizan en levadura. Terminadores de un nmero de genes han sido utilizado en vectores de expresin, por ejemplo, TRP1, 'ADH1, GAP MFL, etc Con el fin de simplificar vectorial la construccin, un terminador de 2 p puede ser utilizado, por ejemplo la FLP'73 (pWYG7L, Figura 1) o D gen terminador. FACTORES QUE AFECTAN LA EXPRESION INTRACELULAR. INICIACION DE TRANSCRIPCION. La expresin gnica se regula con ms frecuencia en el nivel de la transcripcin, y en general se supone que el nivel de ARNm de estado estacionario es una primaria determinante del rendimiento final de una protena extraa. El nivel de ARNm se determina tanto por la tasa de iniciacin y la tasa de rotacin. En la mayora de los casos el rendimiento de una protena extraa expresado usando un promotor de levadura ha sido mucho ms bajo que el rendimiento de la protena homloga usando el mismo promotor. Usando el promotor PGK en un vector multicopia varias protenas se acumulande 1 a 2% t.c.p., mientras que con todo el PGK gen fosfato- glicerina quinasa se acumula a ms Estos niveles reflejan en gran medida la menores cantidades de los PGK transcriptos contra extranjeros para un mximo de 20 genes, aunque parece que hay ser una excepcin. 'Se sugiri que la reduccin niveles se debieron a t 1/2 corto o las transcripciones extranjeras, pero Mellor et mostr que uninterfern ARNm no era inestable, pero se inici en una menor tasa seis veces. La adicin de aguas abajo PGK secuencias restaurar el nivel de mRNA a la de PGK ARNm, lo que sugiere la presencia de un aguas abajo secuencia de activacin (DAS), localizado a la primera 79 codones, requeridos para la transcripcin mxima. Tambin se ha encontrado evidencia indirecta para un DAS con el gen de la piruvato quinasa (PYK). accesorio del gen ZacZ a la PYK promoter resultado en una cada de 30 veces en la molaridad ARNm, mientras que su t1/2 disminucin de slo dos veces, en consonancia con una de 15 veces cada en la tasa de iniciacin. Los PYKDAS supuestos es activa en los vectores individuales y mltiples copias, ha sido localizado en el nt 500 y 800 con respecto a la iniciacin ATG, y parece ser capaz de reemplazar funcionalmente la PGK DAS (A. Brown, comunicacin personal). La evidencia de reas de salud tambin se ha encontrado en el gen de la lipoamida deshidrogenasa, 414a ND en Ty2 ADN.

Dado que la evidencia ahora puede favorecer la existencia de reas de salud en ciertos genes, es posible que se encuentran en muchos otros. Puede haber algo circunstancial evidencia de esto, por ejemplo, multi-copia GAL7 da niveles de uridytransferase de> 15%, mientras que las protenas extraas rara vez alcanzan este nivel. Lo Hay que destacar que muchos otros factores podran en cuenta estas diferencias. Si DASs se caracterizan, puede ser posible para incorporarlos en fragmentos del promotor aguas arriba con el fin de crear vectores de expresin ms eficientes. Alternativamente, si Dass llegar a ser muy dependiente de la posicin, que podra ser colocado dentro de un intrn que sera extirpados antes de la traduccin. Si ninguno de estos trabajo Opciones y, a continuacin la transcripcin mxima slo ser alcanzable usando protenas de fusin, por ejemplo, para PGK. Vectores de expresin de levadura con frecuencia dan lugar a numerosas transcripciones inesperadas debidas a fortuita promotores en el ADN plsmido bacteriano. esto no se sabe si pueden afectar a genes extraos expresin, pero transcripciones antisentido a travs de la gen extrao puede ser eliminado mediante el uso de bidireccional terminadores o por yuxtaposicin juiciosa con 2p ADN (por ejemplo, FLP terminador). RNA de elongacin. El alargamiento o elongacion de las transcripciones no se piensa normalmente para afectar a la tasa global de la transcripcin, pero el rendimiento de larga duracin transcripciones podra verse afectada por secuencias fortuitas en genes extraos que causan pausa o terminacin. Estas bien podran actuar en el misma manera como terminadores de levadura natural o bien por una diferentes mecanismos. Hemos encontrado evidencia de esto en una

proporcin notablemente elevada de los genes que han examinado, especialmente, pero no exclusivamente, en los que tienen inusualmente alta AT-contenido. Aunque no se ampliamente reconocido, este problema podra ser una muy razn comn de bajos rendimientos o el fracaso completo de expresin de genes forneos en la levadura. Hemos enumerado ejemplos de la falta de expresin de los Genes AT-ricos de la Tabla 4. La presencia de truncado ARNm no se ha demostrado en todos los casos, pero el ejemplo ms claro es publicado en la expresin de la rica en AT Clostridium tetani ADN que codifica fragmento de la toxina del ttanos C. ARN se analiz desde el gen nativo y de cada una de tres versiones del gen sinttico que contiene progresivamente ms ADN, a partir del extremo 5 '(Figura 5). La transcripcin longitud aument a travs de esta serie, con slo el gen totalmente sinttico dar ARNm de longitud completa como se las principales especies. Todas las transcripciones cortos y largometrajes eran discretos, abundante y polyadenylated. El ADN de 1,5 kb de C. tetani se muestra para contener por lo por lo menos seis sitios de poliadenilacin fortuitos que eran eliminado mediante el aumento de contenido de GC (del 29% al 47%). Los genes parcialmente sintticos dieron lugar a la baja niveles de productos de traduccin de escorrenta, pero eficientes produccin del fragmento C se logr con slo el gen totalmente sinttico. El problema con los genes ricas en AT significa que anlisis de los genomas con alto contenido de AT-(por ejemplo, Plasmodium falciparum o Dictyostelium discoideum) por complementacin en S. cerevisiae no es posiblemente vale la pena como una estrategia general. Tales estudios podra ser tratado en S. pombe, aunque el trabajo reciente sugiere que las dos levaduras tienen un mecanismo conservado para la formacin final mRNA 3 '. Ms preocupante an, hay evidencia de el mismo problema con genes que tienen una media ATcontenido similar a la de levadura (60%). Con el gen env de VIH-I, truncada ARNm se encontr en P. pastoris, pero no de S. cerevisiae. La mutagnesis de una secuencia se asemeja a una poliadenilacin consenso de poliadenilacin desactiva un importante sitio, pero revel varios sitios dbiles que se eliminaron mediante el aumento de contenido de GC utilizando sntesis qumica (C.A.S. y R. G. Buckholz, en preparacin). La frecuencia de este problema, las que lo hara deseable ser capaz de predecir su ocurrencia, y para resolverlo sin recurrir a la sntesis de genes. Por desgracia, parece ser muy difcil identificar sitios de poliadenilacin mediante la bsqueda de consensos secuencias, especialmente en el ADN rica en AT. En el caso de los el fragmento de gen C, uno de los ARNm cortos podran se han debido a una nica secuencia TTTTTATA, pero una serie de motivos tripartitos fueron encontrados en regiones sin sitios de poliadenilacin. En la actualidad la nica solucin es aumentar el contenido de GC de secciones ofensivas de genes por qumica sntesis. El xito de las soluciones ms generales depender de si el problema se debe a verdadera terminacin prematura o posttranscriptional desacoplado procesamiento. En el primer caso, una RNA polimerasa extranjera que utiliza diferentes terminacin seales, por ejemplo, T7 ARN polimerasa, podra producir ARNm de larga duracin. Por desgracia, la T7 sistema no se desarrolla plenamente en la levadura (ver transcripcin promotores y terminadores). Si el problema es uno de procesamiento post-transcripcional entonces se puede ser necesario el uso de una expresin extranuclear vector de, por ejemplo, uno basado en los

plsmidos ricas en AT lineales de K. lactis que tambin se pueden propagar en S. cerevisiae, para segregar las transcripciones de la nuclear enzimas de procesamiento. ESTABILIDAD DE RNA La vida media del ARNm de levadura van de 1 a 100 min y por lo tanto puede tener un profundo efecto sobre el nivel de estado estable (revisado en la referencia 47). la cuidadoso estudio de 15 mRNAs escogidos al azar mostr dos poblaciones, una con t ms largos, 2s, (40 a 100 min) y uno con t1/2 ms cortos (de 6 a 20 min) 0,47 Dentro de cada clase hay una relacin inversa entre la longitud del mRNA y la estabilidad. Sin embargo, hay un cierto desacuerdo sobre esta divisin en dos diferencia entre categoras; estable e inestable ARNm puede ser que estos ltimos han desestabilizar elementos, puesto que las secuencias de la URA3 de corta duracin ARNm desestabilizar PYKmRNA. Un nmero de la ARNm inestables se ha encontrado recientemente que codificar protenas ribosomales (A. Brown, personal la comunicacin); la LAC2 ARNm exterior tiene un t1/2 de 27 min. La insercin de codones de parada prematura en los Urales, URA3 y PGK ARNm se ha demostrado que causa su desestabilizacin, lo que sugiere que la unin al ribosoma puede contribuir a la estabilidad del ARNm. Sin embargo, el mismo resultado no se observ para un PYK y PYK-LAC2 ARNm, lo que sugiere un complejo relacin entre la estabilidad del mRNA y traduccin. Santiago et al. Encontrado obvia correlacin entre la carga del ribosoma y la estabilidad durante diez mRNAs diferentes. Parece que hay algunos ejemplos de baja mRNA la estabilidad es un factor primario en pobres rendimientos de protenas extraas. Debido a la falta de conocimiento de los mecanismos de degradacin de mRNA de levadura es imposible para predecir si un ARNm exterior ser estable, aunque podramos esperar ARNm largos sean algo menos estable que las cortas. Secuencias ricas en AU en los extremos 3 'de los ARNm de mamferos algunos conferir inestabilidad, pero no se sabe si que funcionan en la levadura. Cuando la inestabilidad ARNm es diagnosticado como un problema, rendimiento global podra ser mejorado por (i) el uso de un promotor ms potente, (ii) el uso de un promotor con ms rpida induccin cintica, o (iii) sintetizar qumicamente el gen con codones o borrar los 3 'sin traducir alterados una regin con la esperanza de que los determinantes inestabilidad sern eliminados.

Figura 5. Terminacin de la transcripcin fortuita en la toxina tetnica fragmento de ADN C ATricos. (A) Cuatro genes que codifican el fragmento C se muestran, sinttico contenido con de de el ADN mayor GC

(sombreada). Se indican los extremos 3 aproximado 'de las transcripciones que se generan en la levadura. (B) de transferencia que de ARN de CNorthern fragmentos slo muestra

especficas de estos genes: TETlS ARNm dieron de abundante

longitud completa.