2012/2013

BIOQUMICA EXPERIMANTAL I

SEPARAO E ANLISE DE COMPONENTES CELULARES POR CENTRIFUGAO DIFERENCIAL

Professor Francisco Pinto | Ana Fonseca n41872, Alina Ardel n 42628, Joaquim Veiga n41871, Mariana Pedro n41851

ndice
Resumo ........................................................................................................................................3 Parte Experimental .......................................................................................................................6 Apresentao e Discusso dos Resultados ...................................................................................7 Esquema da centrifugao diferencial .....................................................................................7 Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato ....................................8 Frao Mitocondrial Determinao da atividade do sucinato:citocrmo c oxidoreductase 11 Frao lisossomal Determinao da atividade da fosfatase cido .......................................16 Distribuio dos marcadores enzimticos estudados.............................................................19 Anlise da frao nuclear isolamento do DNA ....................................................................22 Concluso ...................................................................................................................................24 Bibliografia .................................................................................................................................25

Resumo
Nesta atividade experimental houve vrios objetivos a cumprir. O primeiro objetivo foi realizar uma centrifugao diferencial de um homogenato de fgado de porco, cujas fraes resultantes frao nuclear, mitocondrial leve e pesada e frao citoslica ou solvel -, seriam material de estudo para os objetivos seguintes: determinao da atividade do sucinato c oxireductase e do fosfatase cido -ambos marcadores enzimticos -, determinao da concentrao proteica das fraes e, por ltimo, anlise da frao nuclear por extrao do DNA. Aquando da realizao da centrifugao diferencial, foi necessrio, em primeiro lugar, obter um homogenato de fgado. Para isso recorreu-se ao homogeneizador de Potter Elvehjen, um mtodo mecnico simples de aplicar, adequado para tecidos moles e friveis como o fgado. Visto esta experincia focar-se no isolamento de componentes sub-celulates, o homogeneizador de Potter possui uma grande vantagem para esta experincia: permite uma boa preservao da estrutura e funo dos organitos celulares. No entanto, qualquer que seja o tipo de homogeneizador utilizado sempre necessrio considerar as condies de ensaio: pH, fora inica, composio do meio de isolamento que, neste caso j estava preparado, e a temperatura que fundamental manter, visto poder aumentar exponencialmente devido ao mecnica do homogeneizador e outros fatores externos. Obtido o homogenato, prosseguiu-se sua centrifugao diferencial onde o extrato submetido a rotaes de altas velocidades numa sequncia de centrifugaes seguidas, a velocidades crescentes do rotor, onde o sobrenadante resultante da centrifugao anterior o sujeito a submeter centrifugao seguinte at se obter a ltima frao, a citoslica. Esta tcnica separa os componentes do homogenato com base nas diferenas da sua densidade e tamanho, correspondendo, este ltimo, ao raio da partcula, e fora centrfuga aplicada: partculas com um tamanho maior sedimentam mais facilmente, mesmo que submetidas a uma velocidade menor. No entanto, h que considerar outros fatores como a forma: partculas com uma forma assimtrica sedimentam mais lentamente que as simtricas. Obtidas as fraes, recolheram-se cinco amostras diferentes de cada para diferentes anlises. A primeira experincia realizada para este fim foi a anlise da frao mitocondrial recorrendo determinao da atividade de um marcador enzimtico - enzima que se localiza exclusivamente numa determinada frao sub-celular que se pretende estudar -, o succinato: citocromo c oxireductase, enzima associado exclusivamente membrana interna mitocondrial, tendo como funo a catlise da reao de oxidao do citocromo c a fumarato. Para determinar a atividade do succinato em cada uma das amostras de fraes recolhidas recorreu-se medio espectrofotomtrica, a 550nm, da reduo do citocromo c pelo succinato, ao longo de um tempo determinado (1 minuto). de salientar que foi utilizado cianeto para bloquear a re-oxidao - induzida por um enzima pertencente cadeia respiratria, citocromo oxidase - do citocromo c, posteriormente reduzido pelo succinato. Por anlise de resultados obtidos, tal como previsto, foi observada uma grande tendncia para o aumento da absorvncia. Havendo uma absorvncia crescente, significa que a concentrao da soluo aumenta, ao longo do tempo e, assim sendo, conclui-se que o marcador enzimtico existe nessa mesma soluo e est ativo, permitindo afirmar a presena de mitocndrias. Esta 3

anlise fornece duas informaes importantes acerca da amostra: a presena de mitocndrias numa frao sub-celular e pureza da mesma. Isto significa que a atividade indesejada de um marcador, numa frao diferente daquela que contm o componente para o qual especfico (neste caso, mitocndria), indicadora da impureza, ou seja, frao contaminada; por outro lado, uma grande atividade do marcador na frao desejada indica a pureza da respetiva amostra. A seguinte experincia realizada foi a determinao da atividade do fosfatase cido enzima marcador cuja atividade permite detetar a presena de lisossomas. Para determinar a atividade do fosfatase cido e consequente presena de lisossomas, introduziu-se em cada uma das amostras das fraes coletadas uma quantidade de substrato artificial, pnitrofenilfosfato (pNPP), que por possuir um grupo fosfato terminal serve de substrato para o enzima marcador cuja atividade (hidrolise de ligaes ster do fosfato) indica a presena destes componentes sub-celulares. Ora, partindo da anlise dos resultados obtidos, verificouse por medio espectrofotomtrica a presena de p-nitrofenol produto da catlise do pNPP pelo fosfatase cido - indicando a presena de lisossomas. Ao contrrio das concluses retiradas na anlise da atividade do succinato, neste caso, nada se pode concluir acerca do grau de pureza das fraes, visto os lisossomas possurem tamanhos muito variados e terem sido repartidos pelas fraes ao longo das centrifugaes sucessivas a velocidades crescentes. A terceira atividade experimental realizada focou-se no doseamento de protenas em cada frao pelo mtodo do biureto com desoxicolato. Para fins de doseamento proteico necessrio construir uma curva de calibrao que permite determinar, de modo estimativo e aproximado, a concentrao desconhecida de protenas de uma amostra (neste caso, de cada frao: nuclear, mitocondrial leve e pesada e frao citoslica) por comparao e correspondncia da sua absorvncia quela determinada por outra protena de concentrao conhecida (neste caso, BSA). Para construir a curva de calibrao, fizeram-se triplicados de vrias amostras contendo BSA nas quais a concentrao desta protena aumenta rtmica e gradualmente. Assim, para cada concentrao conhecida de BSA corresponde uma absorvncia, resultando uma curva de calibrao padro. Feita a curva de calibrao, prossegue-se a leitura das absorvncias de cada frao coletada, e olhando para a mesma, fazem-se corresponder linearmente os valores obtidos s respetivas concentraes descritas pela curva. A ltima parte desta experiencia laboratorial foi a anlise da frao nuclear e isolamento do DNA. Para isolar o DNA adequadamente necessrio ter conhecimento acerca da sua estabilidade qumica e do ambiente celular que o abrange. Os aspetos mais importantes a considerar aquando do manuseamento do DNA so: estabelecer um intervalo de pH apropriado que compreenda todas as condies de estabilidade da molcula utilizando um tampo favorvel; trabalhar a uma temperatura que no ultrapasse os 80/90 oC visto a maior parte das molculas de DNA desnaturarem acima desse valor limite; uma soluo com uma fora inica apropriada para que as ligaes por hidrognio no se alterem adio de EDTA; dissociar as histonas protenas associados ao DNA formando a cromatina do complexo DNA- protena, por adio de SDS; desproteinizar a soluo tratando-a com clorofrmio (lcool isoamlico) para que esta se livre de enzimas que possam estar em soluo como DNases (desoxiribonucleases), que danificam gravemente o DNA, e outros componentes celulares 4

solveis; por ltimo, ter ateno ao stress mecnico aplicado sobre o DNA que pode levar quebra das suas cadeias, reduzindo o seu tamanho. Aps o tratamento rigoroso do DNA tal como descrito anteriormente, este foi submetido a uma centrifugao (3500 x gav) a partir da qual se obteve trs fases visivelmente separadas: uma fase aquosa (superior), uma fase orgnica (inferior) e uma interfase entre estas duas fases constituda por uma banda compacta de protenas desnaturadas. Ora, sendo a fase aquosa que contm o DNA, esta separada e tratada com etanol que o faz precipitar. Assim, o DNA precipitado novamente dissolvido em soluo tampo para que seja possvel concretizar leituras espetrofotomtricas da sua absorvncia e, consequentemente, determinar a sua concentrao em soluo.

Parte Experimental
A atividade experimental foi seguida em grande parte pelo protocolo, tirando pequenas alteraes: - No utilizamos fgado de rato, mas sim de porco, que j tinha sido previamente extrado. - Na determinao da atividade do fosfatase cido, no dilumos de acordo com a tabela do protocolo, apenas realizmos uma diluio 1/10, no executando a diluio a 1/20. - Para traar a curva de calibrao com BSA, no doseamento de protenas, o zero foi acertado com gua destilada e no com os tubos de controlo, visto termos feito 3 rplicas, correspondendo estas a 3 ensaios cujas absorvncias eram diferentes, no obrigando que o grfico assuma 3 absorvncias distintas para o zero.

Apresentao e Discusso dos Resultados

Esquema da centrifugao diferencial:

Pesar o fgado e cort-lo em pequenos pedaos (mfgado=16,197g)

Adicionar meio de isolamento gelado (10mL/g fgado - 162mL)

Transferir pores desta mistura para um homogenizador de PotterElvehjem pr-arrefecido

Centrifugar a 1000x gav durante 10 min a 4C (C1)

Dividir o homogenato de fgado (H) por tubos de centrifuga prarrefecidos

Transferir o fgado homogenizado para um erlenmeyer pr-arrefecido e colocado em gelo

Remover cuidadosamente os tubos da centrifuga de modo a no pertubar os pellets e manter em gelo

Remover o sobrenadante (S1) cuidadosamente para outros tubos de centrfuga com auxilio da pipeta de Pasteur

Suspenda o pellet 1 (P1) em 20 mL da soluo tamponada Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM; NaCl 150 mM; EDTA 100 mM e mantenha os tubos em gelo

Remover o sobrenadante (S2) de C2 para outros tubos de centrifuga

Centrifugar S1 a 3000x gav durante 10 min a 4C (C2)

Guardar um amostra do P1 para a determinao das actividades enzimticas e concentrao proteica

Suspender P2 em 1,0 mL de meio de isolamento/g fgado. Manter em gelo

Centrifugar o sobrenadante S2 a 15000x gav durante 20 min a 4C (C3)

Guardar o sobrenadante (S3) de C3

Guardar uma amostra do P2 para a determinao das atividades enzimticas e concentrao proteica

Guardar uma amostra do P3 para a determinao das actividades enzimticas e concentrao proteica

Suspender o pellet (P3) em 1,0 mL de meio de isolamento/g fgado. Manter em gelo

A centrifugao esperada para cada uma das fraes a seguinte: no pellet 1 iremos encontrar a frao nuclear que contm os ncleos, alguns restos de clulas que sofreram rutura parcial, ou que no chegaram a sofrer rutura, e ainda fragmentos de membrana plasmtica. desta frao que extramos o DNA e determinamos a sua concentrao. O pellet 2 a frao mitocondrial pesada que compreende os mitocndrios, peroxissomas e grande parte dos lisossomas. No pellet 3 temos a frao mitocondrial leve que contm os ribosossomas, polissomas e pequenas vesculas provenientes principalmente do retculo endoplasmtico e do complexo de Golgi. O sobrenadante 3 ir ser a frao solvel/citoslica que ir ter as enzimas.

Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato

Nesta parte da experincia, por se tratar de um doseamento de protenas, todo o procedimento realizado em triplicado para podermos ter um resultado mais aproximado do real. Ento para podermos traar a reta de calibrao temos que utilizar 3 valores medidos, apresentados em seguida no Quadro 1: Absorvncias a 540 nm Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 0,042 0,058 0,044 0,068 0,089 0,074 0,088 0,111 0,085 0,136 0,162 0,120 0,177 0,225 0,173 0,219 0,282 0,205 0,268 0,300 0,259 0,320 0,341 0,305 0,388 0,464 0,369 0,482 0,485 0,466

Tubos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Quadro 1 Valores medidos de absorvncia a 540 nm para o mtodo do Biureto

Assim, como sabemos os valores do volume (v) e da concentrao de BSA (c), podemos calcular a massa (m) a partir da equao:

Para o tubo 1, por exemplo:

Para o resto dos tubos, calculmos a massa de uma forma anloga. Os resultados esto apresentados no Quadro 2: Tubos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 [BSA] mg/mL VBSA (mL) 0,0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1,0 mBSA (mg) 0 0,25 0,5 1 1,5 2 2,5 3 4 5

Quadro 2 Concentrao, volume e massa de BSA

Sabendo agora a massa de BSA podemos traar a reta de calibrao para o mtodo do Biureto com os 3 valores de absorvncia:

Reta de calibrao
0,6 Absovncia 540nm 0,5 0,4 y = 0,0869x + 0,0552 R = 0,9746

0,3
0,2 0,1 0

Massa da protena (g)

Grfico 1 - Reta de calibrao de doseamento de protena pelo mtodo do Biureto

De seguida, procedeu-se medio das absorvncias dos tubos que continham homogenato, pellet 1, pellet 2, pellet 3 e sobrenadante 3. A cada tubo retirou se 1 mL da amostra e foram adicionados 2 mL do reagente do Biureto. Foram feitos 3 ensaios por se tratar de um doseamento de protenas. As absorvncias medidas encontram-se no Quadro 3: Absorvncias a 540 nm Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 0,064 0,071 0,047 0,204 0,224 0,139 0,123 0,070 0,081 0,165 0,220 0,280 0,193 0,158 0,185

Amostra Homogenato P1 P2 P3 S3

Mediana 0,071* 0,204 0,081 0,220 0,185

Quadro 3 - Absorvncias medidas das amostras para o mtodo do Biureto.

*Utilizamos o valor mais alto em vez do valor mediano j que com este valor a massa iria ser muito menor. Sabendo a equao da reta de calibrao, y=0,0869x+0,0552, sendo o declive m=0,0869 e a ordenada na origem b=0,0552, e a mediana das absorvncias medidas, podemos calcular a massa da protena presente em cada frao. Mas primeiro temos que saber a massa de protena num mL de soluo (A), que podemos deduzir a partir da equao:

Para o clculo de massa de protena num mL de homogenato:

Conhecendo a massa de protena presente num mL de soluo, temos que ir multiplicar essa massa pelo volume de soluo de onde se retirou 1 mL para anlise (para as 3 amostras multiplica-se por 4, que foi o volume de gua destilada adicionado para suspender o pellet) para saber a massa de protena nos 4 mL existentes (B):

Seguidamente, para podermos saber a concentrao de protena (c) divide-se a massa da protena pelo volume da alquota (para o homogenato e P1 multiplica-se por 0,5, enquanto que para o P2, P3 e S3 multiplica-se por 0,75):

Para sabermos a massa de protena total da frao (mprotena) multiplica-se a concentrao de protena (c) pelo volume de cada frao (V):

Para o resto das amostras, os clculos foram os mesmos. No Quadro 4 encontram-se os restantes resultados: A (mg) 0,181818 1,712313 0,296893 1,896433 1,493671 c (mg/mL) 1,4545455 13,698504 1,5834292 10,114308 7,9662447 Vfrao (mL) 162 20 16,2 16,2 15,7 mprotena 235,6364 273,9701 25,65155 163,8518 125,07

Homogenato P1 P2 P3 S3

Quadro 4 - Dados para o clculo da massa total de protena e valor da mesma para as diferentes amostras.

O valor da massa do homogenato deveria ser a maior, j que era de esperar que neste se encontre mais protena do que em qualquer outra frao. Isto pode ser explicado pelo fato de irem clulas intatas para a frao nuclear (P1), visto ter sido a primeira a ser centrifugada.

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Frao Mitocondrial Determinao da atividade do sucinato:citocrmo c oxidoreductase

Nesta parte do trabalho realizou-se um estudo enzimtico do sucinato:citocromo c oxidoreductase, visto que este enzima catalisa reaes decorrentes nos mitocndrios, em duas vias metablicas importantes, a cadeia respiratria e o ciclo do cido ctrico (TCA). Assim podemos confirmar, pela ocorrncia destas reaes, que a segunda frao (P2) corresponde frao mitocondrial. Esta uma reao complexa, uma vez que se trata de uma reao acoplada. O primeiro passo corresponde oxidao do succinato a fumarato, pela oxidao da ubiquinona a ubiquinol (representados por Q e QH2, respetivamente, na equao):

A reao representada acima catalisada pelo succinato desidrogenase, um enzima que se encontra associado membrana mitocondrial e que utiliza o FAD como cofactor. De seguida, o ubiquinol que se formou vai reagir com o citocromo c, pela catlise com ubiquinona:citocromo c oxidoreductase, ficando na sua forma reduzida (equao 2):

Desta forma, a reao global vem:

Sabendo que o citocromo c na sua forma reduzida tem um mximo de absorvncia a 550nm e que medida que ocorre a catlise pelo succinato:citocromo c oxidoreductase h um aumento de absorvncia, fez-se o ensaio enzimtico para cada frao (H, P1, P2, P3 e S3) no espectrofotmetro e seguiu-se esse aumento ao longo do tempo, durante um minuto.

Figura 1 representao das duas reaes referidas, oxidao do succinato e reduo do citocromo c, que ocorrem no mitocndrio.

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Os grficos obtidos para os ensaios de cada frao foram os seguintes:

Homogenato
0,58 0,57 0,56 Abs 0,55 550nm 0,54 0,53 0,52 0 10 20 30 t (s)
Grfico 2 absorvncia a 550nm do homogenato, seguida durante 1 min.

y = 0,0007x + 0,5284 R = 0,9993

40

50

60

P1
0,7 0,68 0,66 Abs 0,64 550nm 0,62 0,6 0,58 0,56 0 10 20 30 40 50 60 y = 0,0016x + 0,58 R = 0,9915

t (s)
Grfico 3 absorvncia a 550nm da fraco nuclear, seguida durante 1 min.

P2
0,62 0,61 0,6 0,59 Abs 0,58 550 nm 0,57 0,56 0,55 0,54 0,53 0 10 20 30 t (s)
Grfico 4 absorvncia a 550nm da fraco mitocndrial, seguida durante 1 min.

y = 0,0012x + 0,5341 R = 0,9994

40

50

60

12

P3
0,63 0,62 0,61 Abs 0,6 550 nm 0,59 0,58 0,57 0 10 20 30 t (s)
Grfico 5 absorvncia a 550nm da fraco lisossomal, seguida durante 1 min.

y = 0,0008x + 0,5773 R = 0,9998

40

50

60

S3
0,422 0,421 0,42 y = 1E-04x + 0,4152 R = 0,9303

0,419 Abs 0,418 550 nm 0,417

0,416 0,415 0,414 0 10 20 30 t (s)
Grfico 6 absorvncia a 550nm do sobrenadante final, seguida durante 1 min.

40

50

60

Exemplificando os clculos feitos, para o ensaio correspondente frao do homogenato vem: Para calcular a Abs550nm, utiliza-se o valor do declive (m) de cada grfico e a t, que 60 segundos. Equao da recta: Ento: , de onde

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A partir da velocidade inicial da reao de reduo do citocromo c, que foi seguida espectrofotometricamente a 550nm, possvel calcular a sua atividade enzimtica. Esta velocidade inicial corresponde razo da variao de concentrao por unidade de tempo (em mol min-1). De acordo com a Lei de Lambert-Beer, sabe-se que a concentrao (c) proporcional Abs550nm:

Como tanto a Abs550nm como a c so por unidades de tempo, estas duas grandezas permanecem proporcionais uma outra. Desta forma, como o coeficiente de absoro molar do citocromo c 550nm = 2,1 x 104 M-1 cm-1 e o percurso tico l=1 cm, ento vem:

Uma vez que se quer obter a velocidade em mol min-1 necessrio fazer o quociente entre c e t e multiplicar este valor pelo volume total da cuvette, sendo este igual a 2177,5L= 2,1775 x 10-3 L. Ento, a velocidade inicial da reao calculada da seguinte forma:

Para calcular a atividade enzimtica (nmero de moles que reagem por unidade de tempo) em U mL-1, tem de se realizar o quociente entre a velocidade da reao (calculada no passo anterior) e o volume da frao em estudo (50 L = 50 x 10-3 mL). Sabendo tambm que uma unidade enzimtica corresponde quantidade de enzima que catalisa a reao de reduo do citocromo c velocidade de 1 nmol min-1, conclui-se que necessrio multiplicar a Vreaco por 1 x 109 mol. Assim a atividade enzimtica em U mL-1 do homogenato dada por:

Para se obter a atividade total do enzima multiplica-se a atividade por mililitro, obtida no passo anterior, pelo volume total de homogenato, que era 162 mL. Ento vem:

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Os clculos realizados para as restantes fraes foram anlogos aos exemplificados para o homogenato e os resultados obtidos encontram-se resumidos no seguinte quadro: Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3 Volumet (mL) 162,0 20,0 16,2 16,2 15,7 Abs550/t (min-1)
0,042 0,096

Atividade (U/mL) 87,100 199,086 149,314 99,543 12,443

Atividadet (U) 14110,200 3981,714 2418,891 1612,594 195,353

0,072 0,048 0,006

Quadro 5 - resumo dos resultados obtidos para o volume total, Abs550nm/t, atividade enzimtica e atividade total de cada frao.

Teoricamente, como a atividade enzimtica que estamos a estudar caracterstica da frao mitocondrial (pellet 2) prev-se que a esta seja maior nessa frao. No caso que estudmos, verifica-se um aumento de atividade do homogenato para o pellet 1, sendo que este apresenta um valor da mesma ordem de grandeza que o pellet 2 e 3 (aproximadamente) e o mais elevado das cinco fraes. O pellet 1 corresponde frao nuclear, onde se espera que existam ncleos, DNA e cromossomas associados a histonas, RNA mas tambm haver provavelmente restos de clulas que no foram totalmente quebradas. Isto torna justificvel o valor elevado que obtivemos, pois estas clulas, como so de maiores dimenses que os restantes organitos da frao, podem difratar a luz, obtendo-se valores de absorvncia maiores, comprometendo os restantes clculos que levam ao valor da atividade enzimtica. O pellet 2 contm a frao mitocondrial pesada, onde se devem encontrar os mitocndrios, peroxissomas e a maior parte dos lisossomas. Nesta frao, seria de esperar obter o maior valor de atividade enzimtica, no entanto esse corresponde ao do pellet 1 e acontece pelas razes j referidas. Para o pellet 3, o valor de atividade enzimtica obtido j um pouco mais baixo, mas continua relativamente prximo do valor do pellet 2, o que de esperar uma vez que esta frao corresponde frao mitocondrial leve. Em ultimo lugar, o sobrenadante 3, tem atividade praticamente nula, pois o que tem o menor declive, m = 1 x 10 -4 0, de onde se pode deduzir que no contm mitocndrios na sua composio.

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Frao lisossomal Determinao da atividade da fosfatase cido

O procedimento realizado para a determinao da atividade do fosfatase cido consistiu na preparao de dois conjuntos de tubos, os tubos A contendo apenas uma frao da amostra e os tubos B com uma frao de amostra diluda, numa proporo de 1:10. Ao contrrio do que est descrito no protocolo, no foi realizado o conjunto de tubos C, que iria conter uma frao com uma diluio de 1:20. De seguida, foram lidas as absorvncias dos tubos referidos, aps a reao do fosfatase cido com o p-nitrofenilfosfato (pNPP), formando-se o intermedirio p-nitrofenol e depois o p-nitrofenolato, aquando da adio de NaOH, que para a reao. Este ltimo apresenta uma colorao amarela e ento pode ser determinado espectrofotometricamente a 400nm. Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Figura 2 esquema da reao do fosfatase cido com o pNPP, formando o intermedirio p-nitrofenol que depois se converte em p-nitrofenolato (de cor amarela) ao parar a reao com o NaOH.

Tubos A Tubos B (1:1) (1:10) 1,485 0,108 1,545 1,348 2,321 1,020 0,263 0,057 0,168 0,047

Quadro 6 absorvncias a 400nm dos tubos A e B.

Os valores de absorvncia obtidos para cada conjunto de tubos A e B, encontram-se resumidos no quadro acima e permitiro calcular a atividade do fosfatase cido. Como a Lei de Lambert-Beer s vlida para valores de absorvncia at 1,5 e todos os nossos tubos A excedem ou esto muito prximos desse valor decidimos usar apenas os valores de absorvncia obtidos para os tubos B, que se encontram dentro dos limites da equao referida. De seguida apresentam-se os clculos efetuados para o homogenato, que servir como exemplo, uma vez que para as restantes fraes foram realizados clculos anlogos.

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Para se obter a atividade enzimtica do enzima fosfatase necessrio calcular primeiro a velocidade da reao:

*Considera-se Abs400nm como o valor final lido no espectrofotmetro, pois esta a variao dos valores de absorvncia observados e considerou-se o incio igual a 0, onde no havia reao. Atravs da Lei de Lambert-Beer, temos que:

*Onde l = 1 cm (percurso ptico) e 400nm = 2,1 x 104 M-1 cm-1 (coeficiente de absoro molar do p-nitrofenol (pNP) Como o volume ensaiado foi igual para as vrias fraes (a soma de todas as solues adicionadas igual a 4 mL = 4 x 10 -3 L) e que M significa mol L-1, ento multiplicando o resultado anterior pelo volume em litros, obtm-se a velocidade da reao em mol min-1:

No caso do fosfatase cido, uma unidade enzimtica (U) definida como a quantidade de enzima que catalisa a formao de 1 mol de p-nitrofenol (pNP) por minuto. Assim,

O volume de frao adicionado foi de 0,1 mL, mas uma vez que tivemos de utilizar os valores dos tubos B, temos de considerar a diluio de 1:10, considerando-se ento um volume de 0,01 mL. A atividade por mililitro ento dada por:

Finalmente, para se obter a atividade total do enzima, multiplica-se a atividade calculada acima pelo volume total da frao.

Os restantes resultados, correspondentes s restantes fraes, encontram-se resumidos no seguinte quadro:

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Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Volumet (mL) 162,0 20,0 16,2 16,2 15,7

Diluio Abs400 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10 0,108 0,263 0,057 0,168 0,047

Abs400/t (min-1) 0,0108 0,0263 0,0057 0,0168 0,0047

Atividade (U/mL) 0,2057 0,5010 0,1086 0,3200 0,0895

Atividadet (U) 33,3257 10,0190 1,7589 5,1840 1,4055

Quadro 7 resumo dos resultados obtidos para o volume total, a diluio realizada, Abs400nm, Abs400nm/t, atividade enzimtica e atividade total de cada frao.

Este ensaio foi realizado com o objetivo de identificar a presena de lisossomas, uma vez que o fosfatase um enzima que indica a presena dos mesmos. No entanto, como estes organitos tm um tamanho muito heterogneo encontram-se espalhados pelas vrias fraes e nem possvel isol-los, e logo a atividade do fosfatase est presente em todas as fraes.

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Distribuio dos marcadores enzimticos estudados

Nesta parte da anlise de resultados calculou-se a atividade especfica do enzima (nmero de moles que reagem por unidade de tempo e unidade de massa), atravs da concentrao de protena e da massa de protena obtidas anteriormente, pelo mtodo do biureto.

A atividade especfica uma medida de grau de pureza de um enzima, supostamente sendo baixa no extrato original, isto , homogenato, aumentado medida que os contaminantes da soluo diminuem. Desta forma, exemplificam-se os clculos efetuados para o homogenato: Atividade especfica do succinato: citocromo c oxidoredutase:

Atividade especfica do fosfatase cido:

Para o resto das fraes, os resultados encontram-se no quadro 8: Succinato:citocrmo c Atividade do fosfatase oxidoreductase cido Volumet [protena] Amostra Atividade Atividade Atividade Atividade (mL) (mg/mL) (U/mL) especfica (U/mL) especfica (U/mg) (U/mg) Homogenato do fgado Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3 162 20 16,2 16,2 15,7 38173,091 87,1 59,88125 0,2057143 0,1414286

5479,4016 199,08571 14,533391 0,5009524 0,0365699 415,55517 149,31429 94,298048 0,1085714 0,0685673 2654,3989 99,542857 9,8417866 0,32 0,0316383

1963,5997 12,442857 1,5619476 0,0895238 0,0112379

Quadro 8- Valores obtidos para cada marcador enzimtico referente a cada frao em estudo

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A seguir, so apresentados os grficos dos resultados da atividade especfica:

Succinato:citocrmo c oxidoreductase
100 90 Atividade especfica (U/mg) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 Frao
Grfico 7 Atividade especfica do succinato:citocromo c oxidoreductase das vrias fraes

Fosfatase cido
0,16
Atividade especfica (U/mg) 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 1 H 2 P1 3 P2 Frao
Grfico 8 Atividade especfica do fosfatase cido das vrias fraes

4 P3

5 S3

Sucesso do fracionamento celular: Por anlise dos resultados experimentais, pode-se concluir que o fracionamento celular foi relativamente bem sucedido. Comeando por analisar a atividade do sucinato (citocromo c oxidoreductase), marcador enzimtico cuja localizao e atividade exclusiva das mitocndrias por estar associado membrana interna mitocondrial, observa-se que existe atividade, maior ou menor, 20

em todas as fraes. Olhando para os valores indicadores da atividade especfica do succinato, a frao analisada que mais se destaca pela sua elevada atividade deste enzima o P2, mas tambm o homogenato apresenta grande atividade. Tal como esperado a frao P2, correspondente frao mitocondrial, apresenta os valores mais elevados de atividade, j que nesta que se encontram os mitocndrios. A amostra de homogenato analisada, por no ter sido submetida a qualquer processo de seleo e posterior centrifugao, uma frao que possui toda a integridade do contedo celular (mitocndrias, ncleos, citosol, lisossomas). Assim sendo, justificvel que o homogenato apresente os valores elevados para a atividade enzimtica especfica do sucinato, pois, acolhe uma quantidade relevante de mitocndrias. Quanto ao fosfatase cido, que um enzima lisossomal, normal que haja atividade especifica em todas as fraes. Como os lisossomas so heterogneos em relao ao seu tamanho e forma, difcil separ-los e isol-los numa s frao. Mas seria de esperar que a frao que contivesse maior atividade enzimtica seria o P2, j que esta a frao onde se encontram os lisossomas. Falando do processo de centrifugao, pode-se concluir que este foi relativamente eficaz. Apesar de se ter conseguido separar os componentes celulares em vrias fraes, ocorreram alguns erros experimentais, tais como: - Uso de fgado de porco, que contm tecido conetivo difcil de separar e de homogeneizar; - A homogeneizao um processo importante porque funciona como meio de suspenso, ajuda a preservar a integridade dos componentes e atua como meio de arrefecimento. possvel que a homogeneizao no tenha sido bem sucedida, deixando as clulas intatas, o que ir fazer com que o fracionamento celular no fosse muito eficaz; - Ao usar o homogenizador de Potter-Elvehjem, este poder ter aquecido por ao mecnica, o que levar a desnaturao das enzimas, afetando assim as vrias fraes celulares.

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Anlise da frao nuclear isolamento do DNA

Fluxograma dos passos envolvidos na preparao de DNA:

Adicionar 3 mL de SDS 10% (m/V) ao sedimento j ressuspendido em soluo tamponada Tris-HCl (pH 8,0) 10mM; NaCl 150mM; EDTA 100mM
Adicionar um volume de clorofrmio:lcool isoamlico (24:1, V/V). Tapar. Misturar com cuidado durante 20 a 30 min

Misturar cuidadosamente por inverso

Aquecer a mistura num banho de gua a 60C durante 10 min, continuando a agitar cuidadosamente

Adicionar 4,6 mL de NaClO4 5M e misturar cuidadosamente por inverso

Arrefecer a mistura temperatura ambiente ou mergulhar o tubo em gua

Centrifugar a 3 500x gav durante 10 min

Tranferir cuidadosamente o sobrenadante que contm os cidos nucleicos, para um tubo Corex de 30 mL

Precipitar os cidos nucleicos com 2 volumes de etanol absoluto a -20C

Dissolver o sedimento de DNA em 20 mL de uma soluo tampo citrato (pH 7,0) 0,015M contendo 0,15M NaCl

Centrifugar a 600x gav durante 10 min. Desprezar o sobrenadante

Misturar por inverso

Determinar a concentrao de DNA na preparao atravs da leitura e registo de absorvncia a 260nm, aps acertar o zero do espectrofotmero. Registar tambm a leitura de absorvncia a 280nm

Depois de realizarmos esta parte da experincia, como indicado no fluxograma acima apresentado, medimos a absorvncia a 260 e 280 nm da amostra de DNA diluda, visto que os valores de absorvncia da amostra no diluda no abrangiam os pretendidos de acordo com a lei de Lambert-Beer, 0<Abs<1,5. Foram usadas cuvettes de quartzo que no absorvem nos valores de comprimento de onda referidos. Para fazermos a diluio (1:10), junta-se 0,3 mL de DNA amostra a 2,7 mL de gua destilada. Assim usamos a gua para ser o branco das medies.

Sabendo que 1 U.A260 corresponde a uma concentrao de DNA de 50 g/mL, podemos saber a concentrao de DNA:

1 U.

------------------------------ 50 -----------------22

= 15,1
Para sabermos a concentrao de DNA na amostra sem estar diluda temos que multiplicar a concentrao de DNA na amostra diluda pelo fator de diluio, que neste caso 10:

0,151 mg/mL
Conhecendo que dissolvemos o sedimento de DNA em 20 mL de uma soluo tampo citrato (pH 7,0) 0,0015M contendo 0,15M NaCl, podemos calcular a massa de DNA do sedimento:

3,02 m = 0,00302g
Para calcularmos a percentagem de DNA obtido por g de fgado, tem de se ter em conta que a mfgado=16,197. Assim, a % ( ) dada por:

%(

)=

%(

)=

= 0,0186

Grau de Pureza do DNA Para podermos avaliar o grau de pureza do DNA do fgado, isto , averiguar se o DNA foi bem purificado ou se ainda se encontram protenas associadas ao DNA presentes, temos que fazer a razo entre a Abs260 e Abs280.

= 1,9739

O DNA tem o pico de absorvncia aos 260 nm enquanto que o pico de absorvncia das protenas aos 280 nm, j que existem alguns resduos de aminocidos que tm cadeias laterais aromticas (tirosina, fenilalanina e triptofano). Assim quanto maior for a absorvncia a 280 nm, maior ser a contaminao do DNA com protenas. Quando em condies timas, quando s se encontra DNA presente, a Abs260 = 2 X Abs280, portanto quanto mais prxima de 2 for a razo Abs260/Abs280 mais purificado encontra-se o DNA. Neste caso, a razo entre as absorvncias 1,97, o que podemos concluir que h uma boa purificao do DNA.

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Concluso
Esta experincia teve como objetivo separar, por centrifugao, e analisar as vrias fraes celulares (Pellet 1, Pellet 2, Pellet 3, Homogenato e Sobrenadante final) a partir de um fgado de porco. Cada frao foi posteriormente analisada atravs de estudo da atividade enzimtica. Primeiro, realizou-se o doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato para cada frao. Com os valores das absorvncias obtidos conseguimos traar uma reta de calibrao. Com esta reta podemos calcular a concentrao e a massa de protena das diferentes fraes. A frao que continha maior quantidade de protena, isto , maior massa, deveria ser o homogenato, mas isso no acontece, sendo o P1 a ter maior massa, o que pode ser explicado devido a esta frao conter restos das clulas do fgado intatas. A seguir determinou-se a atividade do succinato:citocromo c oxireductase para podermos proceder caracterizao bioqumica das vrias fraes. Esta enzima uma enzima mitocondrial, logo vai atuar em processos que ocorram no mitocndrio. Assim podemos concluir que no pellet 2 que se encontra a frao mitocondrial, j que nesta frao que existe uma maior atividade enzimtica. Quanto a determinao da atividade do fosfatase cido, sabemos que um enzima que indica a presena de lisossomas. A atividade mxima deste enzima deveria ver-se no pellet 3, mas neste caso encontra-se no pellet 1. Podemos concluir ento que houve algum erro experimental, relacionado tambm com o fato de esta frao conter clulas intatas. Por fim, atravs do isolamento do DNA, podemos calcular a concentrao de DNA presente no pellet 1, isto , a frao nuclear. Quando foi calculado o grau de pureza do DNA, como o valor obtido est muito prximo de 2, o que quer dizer que o DNA estava bem purificado. No geral, pode-se afirmar que a experincia no foi to bem sucedida como esperado, j que a frao nuclear estava contaminada, propagando erros nas vrias anlises que foram realizadas.

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Bibliografia
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