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COMPLEMENTO C3 Y C4 Introduccin Objetivos General Especficos Marco terico Definicin.

Es un sistema complejo de alrededor de 30 protenas plasmticas o tisulares presentes en el suero y en la superficie de numerosas clulas, que por su mecanismo de accin pertenece a los sistemas enzimticos cuya activacin se produce en forma de cascada, es el principal mecanismo efector de la inmunidad humoral y tiene un gran poder inflamatorio; su papel en la patognesis es de gran relevancia en la Inmunologa clnica. Importancia Opsonizacin: (Recubrir los patgenos para promover o mejorar la fagocitosis). Atraccin de fagocitos y activacin Lisis de bacterias y clulas infectadas Regulacin de la respuesta de anticuerpos Favorece a la eliminacin de complejos inmunes y de productos de la inflamacin. Ofrece proteccin contra la infeccin por bacterias pigenas, las cuales causan pus, entre ellos se encuentran los estreptococos y estafilococos. Eliminacin de clulas apoptticas Funciones

Desventajas La activacin del sistema de complemento puede causar Inflamacin, lo cual es de mucha importancia para la Inmunologa clnica.

Anafilaxis, por la liberacin de la histamina Acumulacin de las protenas del C. Cambios en el medio y la carga de la membrana Modificacin de las propiedades y func. Estimulacin de la funcin celular Lesiones e hinchazn de la membrana Dao o desintegracin de la membrana Vas de activacin Indicadores de la activacin. Deficiencias C1q, C1r, C1s, C4, C2: LES, lupus discoide, vasculitis GN. C3: Infecciones pigenas recurrentes. C5, C6, C7, C8: Infecciones diseminadas por Neisseria. Inh. C1: Angioedema hereditario. Mecanismos De Regulacin Del Complemento Dado el potencial lesivo del sistema del complemento, ste se encuentra estrechamente regulado por diversos mecanismos y molculas, cuyo objeto es evitar la lisis de las clulas autlogas. El mecanismo ms simple de regulacin es la baja concentracin y labilidad de muchos de sus factores. No obstante los factores que actan en la regulacin del complemento ejercen su accin en distintos puntos tanto en la va clsica como en la alternativa o ltica, centrndose fundamentalmente en la activacin de C3.

Inhibicin de C1 El inhibidor de la C1 esterasa (C1inh) inhibe la formacin de C3b convertasa de la va clsica por su capacidad de unin a los fragmentos C1r y C1s. En los casos de deficiencia en C1inh (edema angioneurtico hereditario), el C1 activado degrada elevadas cantidades de C2 produciendo un acumulo de C2b. Este factor es degradado anormalmente por plasmina lo que da lugar a C2-Kinina que es un potente vasodilatador y aumenta la permeabilidad vascular produciendo los edemas caractersticos del cuadro. Inhibicin de C4 El factor C4BP (C4-binding protein) tiene la capacidad de captar C4b facilitando su disociacin del complejo C4b2a e inhibiendo, por tanto, la actividad de convertasa de C3. El factor I (FI) es una esterasa de tipo serina que circula en forma activada. El C4b disociado es susceptible de ser atacado por el factor I y ser degradado en C4c y C4d. Los receptores de membrana DAF (factor acelerador de la degradacin) y la MPC (cofactor protenico de membrana) se encuentran ampliamente distribuidos en clulas inmunes y no inmunes. Tienen la capacidad de inhibir la unin, facilitar la disociacin de C4b y C2a (DAF) o favorecer que el factor C4b pueda ser degradado por el FI (MCP). Estos receptores son de gran importancia en los mecanismos de prevencin de lisis de las clulas autlogas. Inhibicin de C3

La regulacin de C3, al ser ste el factor central en la activacin del complemento, es probablemente el mecanismo de regulacin ms importante. El factor H (FH) es una protena plasmtica homloga a la C4BP que tiene la capacidad de unir C3b en la fase fluida. El Factor I ataca entonces C3b liberando una pequea fraccin C3f y convirtindolo en iC3b. Por otra parte FH tambin promueve la disociacin del complejo C3bBb. Un defecto en este tipo de regulacin acontece en un tipo de glomerulonefritis (membranosa tipo II), en la que aparecen autoanticuerpos (factores nefrticos) que se une al complejo C3bBb, estabilizndolo y hacindolo resistente a la accin de FH. Los receptores de membrana CR1, DAF y MCP actan sobre el C3b de forma semejante a su actuacin sobre C4b: inhiben la unin o facilitan la disociacin C3bBb (CR1, DAF) o actan como cofactores del factor I en la degradacin de C3b unido a la membrana (CR1, MCP). En este caso C3b tambin se degrada a iC3b, sobre el que el factor I puede seguir ejerciendo su actividad cataltica originando las fracciones C3c y C3dg. Todos estos mecanismos inhiben la capacidad de C3b de formar convertasa de C5, as como de que C3b medie la adherencia celular. Sin embargo iC3b s mantiene la capacidad de adherencia a clulas fagocticas por los receptores de estas clulas para iC3b (CR1, CR3 y CR4) (Tabla 13.2). Inhibicin del MAC La protena S (vitronectina) es una glucoprotena plasmtica con capacidad para unirse al complejo C5b67 impidiendo que ste se una a la membrana celular. CD59 es una protena ampliamente distribuida en las membranas celulares que inhibe la insercin de C9 en el complejo C5b-8. El factor de restriccin homloga (Homologous Restriction Factor, HRF) tambin est ampliamente distribuido en la membrana de las distintas clulas y presenta una funcin equivalente al CD59. La capacidad de MAC de lisar las clulas puede ser modulada tambin por una protena circulante llamada SP-40,40, esta es un heterodmero que ha sido aislado de complejos solubles C5-9. Podra ser un componente normal de MAC cuyo efecto principal sera controlar la capacidad de MAC de lisar las clulas. El mecanismo de accin de SP-40,40 es desconocido. De los factores reguladores estudiados DAF (Facilita la disociacin de C4b y 2a), HRF (Inhibe la insercin de C5b-8 y la polimerizacin de C9) y CD59 (Inhibe la insercin de C5b-

8 y la polimerizacin de C9), se piensa que actan exclusivamente en la inhibicin de la lisis de las clulas del propio organismo donde asienta. Estas protenas de membrana se detectan fundamentalmente en eritrocitos y clulas endoteliales que son las clulas que se encuentran en mayor peligro de autolisis por el complemento. Kit del complemento REACTIVOS SUMINISTRADOS EN EL KIT Los reactivos deben ser almacenados a 2-8C. Durante su almacenamiento, en el antisuero pueden aparecer sedimentos o turbiedad que no son debidos a contaminacin microbiana y que no influyen sobre su actividad. En estos casos ser necesario filtrar el antisuero antes de usarse. Para este fin, la opcin ms recomendable consiste en el uso de filtros desechables con tamao de poro de 0.45 m. La fecha de caducidad es imprimida en la etiqueta del envase y se refiere al componente cerrado y almacenado a 2-8C. A/S Antisuero: 1 vial (5 mL) de antisuero policlonal desarrollado en cabra, contra los factores de complemento humano C3c y C4 altamente purificados. Conservante: NaN3 (<0.1%). Listo para usarse. Despus de cada utilizacin, almacenar el reactivo hermticamente cerrado a 2-8C por 4 semanas. No congelar. Los ttulos de anticuerpos (T), nos indican la cantidad en mg de antgeno precipitado en gel de agarosa por 1 mL de antisuero. Estos niveles se determinan mediante inmunodifusin radial y estn indicados en la etiqueta del vial. M293.es Rev.7 11/2008 NPP4-NPP5 C3c-C4 M293.es Rev.7 11/2008 Pag. 2/4 MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS El antisuero debe ser utilizado con los siguientes reactivos: Calibrador Protenas S, (Ref. NCPP1) Control Protenas S/L, (Ref. NCPP2L) Control Protenas S/M, (Ref. NCPP2M)

Control Protenas S/H, (Ref. NCPP2H) Diluyente, (Ref. NDPP1) Tampn de Reaccin, (Ref. NDPP2) Nefelmetro Delta (Ref. 010138) Materiales desechables y muestras como descrito en el Manual de Uso para el Nefelmetro Delta. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para obtener resultados correctos y reproducibles, ajustarse a las siguientes disposiciones: No usar los reactivos despus de su fecha de caducidad. Evite que se produzca cualquier contaminacin entre muestras y reactivos; para ello, debern utilizarse puntas desechables para cada muestra y reactivo. Para evitar contaminaciones personales y ambientales, debern observarse las siguientes normas de seguridad: Utilizar guantes desechables durante la manipulacin del material potencialmente infeccioso y durante el ensayo. No fumar, comer, beber o aplicar cosmticos durante la ejecucin del ensayo. Evite salpicaduras y formacin de aerosoles; en caso de que se presenten, lave cuidadosamente con una solucin de hipoclorito de sodio al 3%. Todo este material de limpieza debe manejarse como potencialmente infeccioso y desecharse correspondientemente.

Los reactivos para los cuales no se proporciona una ficha de seguridad, no contienen sustancias qumicas peligrosas o, si las contienen, stas estn por debajo de los lmites de concentracin establecidos en el Decreto Italiano D.Lgs.285/98, de conformidad con la directiva 91/155 de la CEE. De acuerdo con el decreto Italiano D.L. no. 22, de fecha 05.02.97, de conformidad con las directivas de la CEE (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), todos los productos de desecho que se originen tanto a partir de los procedimientos manuales como de los automticos estn clasificados como material de desecho peligroso especial (clasificacin europea cdigo 180103). Como tales, deben entregarse a empresas especiales, calificadas para recoger y disponer de este tipo de desechos.

TOMA Y PREPARACIN DE LAS MUESTRAS Las muestras se realizan en suero humano. Los sueros tendrn que haber coagulado completamente y, despus de haber sido centrifugados, debern estar libres de partculas o trazas de fibrina en suspensin. Asegurarse de que las muestras estn perfectamente lmpidas antes de ensayarlas. Por lo tanto las muestras extremadamente lipmicas o los sueros congelados que aparezcan turbios despus del descongelamiento deben ser clarificados por centrifugacin (10 minutos a aprox. 15000 g). Las muestras pueden conservarse a 2-8C durante 8 das; para perodos ms largos (1 ao) se recomienda conservar las muestras a -20C. Evitar repetidos ciclos de congelamientodescongelamiento de las muestras. Hay que tener en cuenta que la molcula de C3 puede fragmentarse, segn el grado de envejecimiento y de conservacin de las muestras examinadas, con produccin del componente C3c. Siendo el antisuero dirigido contra el fragmento C3c, ser posible observar resultados ms bajos en los sueros frescos. Durante la conservacin de las muestras, la escisin de C4 en C4c se verifica de manera mucho ms lenta, en comparacin con el componente C3. En este caso ser posible observar valores aumentados de C4 despus de un largo periodo de conservacin. NPP4-NPP5 C3c-C4 M293.es Rev.7 11/2008 Pag. 3/4 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO Todos los pasos estn realizados automticamente por el equipo. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente (15-25C). Consultar el procedimiento del ensayo descrito en el Manual de Uso para el Nefelmetro Delta, que preveen la disposicin de lo siguiente: Curva de calibracin: preparada automticamente por el equipo por medio de diluciones seriales del Calibrador (NCPP1) con su respectivo Diluyente (Ref. NDPP1). Estas diluciones se utilizarn para la calibracin, que queda vlida siempre y cuando los controles ensayados se mantengan dentro de los lmites estimados. La calibracin debe repetirse necesariamente cada vez que se use un nuevo lote de antisuero. Muestras: Antes de ser ensayados, los sueros sern diluidos automticamente por el equipo en relacin 1:20 para el ensayo de los factores de complemento humano C3c y C4

con el respectivo Diluyente (Ref. NDPP1). Si los valores resultaran fuera del margen de medicin se recomienda repetir el ensayo utilizando una dilucin mayor o ms baja. Control de calidad interno: Para cada serie de muestras y cada vez que se use un nuevo vial de antisuero, es necesario aplicar un control de exactitud y precisin mediante los Controles para Protenas S/L (Ref. NCPP2L), S/M (Ref. NCPP2M) y S/H (Ref. NCPP2H). Los controles se tratan como las muestras analizadas. Para los lmites esperados, referirse a la relativa tabla suministrada con el envase de los controles mismos. CLCULO DE LOS RESULTADOS La evaluacin de las muestras se realiza automticamente, por medio de la elaboracin de los resultados con una funcin logit-log. VALORES NORMALES Los siguientes valores de C3 y C4 tan slo son orientativos. Es aconsejable que cada laboratorio defina un rango de referencia propio. Protena suero C3 0,9 - 1,8 g/L C4 0,1 - 0,4 g/L FUNCIONAMIENTO DEL ENSAYO ESPECIFICIDAD El antisuero utilizado resulta ser especfico para la determinacin de los factores de complemento humano C3c o C4. SENSIBILIDAD La sensibilidad del ensayo queda definida como el lmite inferior de la curva de calibracin y por eso depende de la concentracin de las protenas en el calibrador. Los rangos de medicin estn detallados en el Manual de Uso para el Nefelmetro Delta.

PRECISIN La precisin fue evaluada midiendo la variabilidad intraensayo e interensayo. Intraensayo Interensayo Protena n repl. Valor medio [g/L] CV % n repl. Valor medio [g/L] CV % C3c 15 1.41 2.5 16 1.53 4.2 C4 15 0.36 1.3 15 0.35

4.1 CORRELACIN ENTRE MTODOS Las muestras de suero fueron examinadas con antisuero Radim contra los factores de complemento humano C3c(y) o C4 (y). Tales resultados fueron comparados con un sistema nefelomtrico de referencia (x). La correlacin de resultados se resume en la siguiente tabla: Protena Regresin lineal ndice de correlacin n sueros C3c y = 0.77 x + 0.30 0.96 77 C4 y = 0.988 x + 0.02 0.97 36 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La presencia de turbiedad o partculas puede interferir con el procedimiento del ensayo. Por eso se recomienda remover por centrifugacin eventuales partculas debidas a sueros no completamente coagulados o por desnaturalizacin de protenas. Por causas tcnicas relacionadas con la produccin y/o el envejecimiento de las muestras, los resultados obtenidos con los sueros de control y con los sueros empleados para el control de calidad interlaboratorios pueden variar en funcin del mtodo utilizado. Por lo tanto, podra ser necesario evaluar los resultados refirindose a valores especficos para cada mtodo empleado.

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