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Rsonance Magntique Nuclaire 1

LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE


(Apprentissage l'interprtation des spectres une et deux dimensions des chanes O-glycanniques)

TF 1/TF

Emmanuel MAES
Unit de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle UMR 8576 du CNRS, Universit des Sciences et Technologies de Lille F-59655 Villeneuve d'Ascq

Emmanuel Maes
Maes E. Mise jour 01/09

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Je voudrais ici remercier trs vivement, mon Matre, Monsieur le Dr Grard Strecker sans lequel ce livret naurait jamais pu exister. Grard ma accueilli dans son laboratoire en 1994, jai pu cette occasion suivre ma formation de D.E.A.. Celle-ci avait pour thme llucidation des structures glycanniques isoles de mucines damphibiens en relation avec la spcificit despces. Jai pu obtenir au terme de cette formation, une bourse du ministre de lenseignement et de la recherche dmontrant ainsi la qualit de lenseignement et de lapprentissage que jai suivis. Aprs ma thse de doctorat, obtenue en 1997, jai t recrut par le CNRS qui ma donn pour mission, lanalyse structurale des glycannes et glycoconjugus par Rsonance Magntique Nuclaire au sein de lUnit Mixte de Recherche 8576. Jai depuis particip la publication de plusieurs dizaines darticles scientifiques et tente de rendre plus accessible cette mthodologie une plus large communaut notamment par le biais denseignements en master biochimie. Merci Grard

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TABLE DES MATIERES


1. 2. 3. INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 5 SCHEMA GENERAL DUNE EXPERIENCE R.M.N. ............................................................................ 6 PRINCIPE DE BASE .................................................................................................................................. 7

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5


4.

Quest ce que la Rsonance Magntique Nuclaire ? ............................ 7 Quels sont les noyaux capables de fournir une rsonance ? ................. 7 Les tats nergtiques ........................................................................... 7 Frquence de prcession ....................................................................... 7 La rsonance.......................................................................................... 8
PRINCIPE GENERAL ................................................................................................................................ 9

Comment mesurer la frquence de prcession ? ................................. 10 Comment supprimer les signaux indsirables ? ................................... 11 Les monosaccharides........................................................................... 11 Les conditions de mesure..................................................................... 14 Les paramtres importants ................................................................... 14 4.5.1 Le dplacement chimique..............................................................15 4.5.2 La densit lectronique .................................................................16 4.5.3 Intensit des signaux.....................................................................16 4.5.4 La constante de couplage (J) ........................................................17 4.5.4.1 Le nombre de protons (figure 7) .............................................17 4.5.4.2 Angle entre deux protons .......................................................18 4.6 Comment apprhender linterprtation des spectres R.M.N. des Oglycannes ?......................................................................................................... 21 4.6.1 Mthodologie suivie.......................................................................21 4.7 Les expriences R.M.N. ....................................................................... 21 4.7.1 Le spectre proton (1H) une dimension ........................................21 4.7.2 Les spectres 13C et 31P une dimension....................................23 4.7.2.1 Le carbone : ...........................................................................23 4.7.2.2 Le phosphore : .......................................................................24 4.7.3 Lexprience COSY homonuclaire 1H/1H.....................................24 4.7.4 Exprience htronuclaire...........................................................24 4.7.4.1 HMQC : Heteronuclear MultiQuantum Coherence .................24 4.7.4.2 HMBC : Heteronuclear Multiple-Bond Correlation ..................25 4.7.5 Les expriences ROESY (Rotating frame Over Hauser Effect SpectroscopY) .............................................................................................25
5. ETUDE DUN EXEMPLE ......................................................................................................................... 27

4.1 4.2 4.3 4.4 4.5

5.1 5.2

Obtention et spectre 1H du N-actyl-galactosaminitol........................... 27 Spectre dun oligosaccharide-alditol ..................................................... 29 5.2.1 Spectre proton 1D de loligosaccharide .........................................30 5.2.1.1 Identification de losaminitol (Figure 15 C, D) .........................30 5.2.1.2 Observation de signaux particuliers .......................................31 5.2.2 Les expriences COSY 1H/1H .......................................................31 5.2.3 COSY 1 relais de loligosaccharide-alditol.....................................35 5.2.4 COSY 2 relais................................................................................37 5.2.5 Spectre HMQC de loligosaccharide-alditol ...................................39 5.2.6 Exprience ROESY .......................................................................41
EXPERIENCES COMPLEMENTAIRES................................................................................................ 43
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6.

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7. LINDICE SOACS ..................................................................................................................................... 44

7.1 7.2

Introduction ......................................................................................... 44 Principe ............................................................................................... 45 7.2.1 O-Glycannes ................................................................................45 7.2.1.1 Calcul des indices SOACS et SOACS-ol partir dun spectre 1D proton 46 7.2.1.2 Structures de O-glycannes sialyls ........................................47 7.2.1.3 Calcul des indices partir de spectres homonuclaires 2D ...47 7.2.1.4 Dfinition dune marge derreur ..............................................48 7.2.2 N-Glycannes.................................................................................66 7.3 Molcules de chimie organique ............................................................ 67 7.4 Conclusion............................................................................................ 70
8. 9. CONCLUSION .......................................................................................................................................... 71 BIBLIOGRAPHIE..................................................................................................................................... 72

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1. INTRODUCTION
Ce livret a pour but d'expliquer les principes et la mthodologie de la R.M.N. au plus grand nombre. Cest pourquoi de nombreuses simplifications et omissions ont t sciemment faites. Ceci rjouira les nophytes, ne drangera pas les amateurs, mais scandalisera probablement les spcialistes auxquels nous demandons quelques indulgences La Rsonance Magntique Nuclaire en milieu liquide est une technique puissante non destructive permettant de dterminer la structure des molcules biologiques et en particulier celle des oligosaccharides. Elle est base sur la proprit magntique de certains atomes (ou noyaux) dont le proton (1H), le carbone (13C) ou encore le phosphore (31P). Par consquent, les oligosaccharides sont particulirement adapts ce type dexprience. Dans ce livret nous aborderons brivement la thorie de la rsonance en prenant le modle vectoriel comme reprsentation du noyau. Ce modle, trs accessible pour un grand nombre dutilisateurs, ne correspond pas tout fait la ralit, mais il permet de simplifier considrablement la reprsentation du principe de R.M.N.. Aprs une brve description thorique nous tenterons dexpliquer le cheminement dune analyse structurale par RMN dun oligosaccharide-alditol. Enfin nous terminerons cette tude par lexplication dun nouveau type de requte informatique invente pour une recherche de squence glycannique plus aise dans les banques de donnes.

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2. SCHEMA GENERAL DUNE EXPERIENCE R.M.N.

Figure 1 : Reprsentation schmatique dune exprience R.M.N.

Lchantillon est plac dans un champ magntique statique intense (B0). Les molcules de cet chantillon sont soumises un champ magntique appliqu B1 qui provoque une perturbation des atomes considrs. Lapplication de ce champ de radiofrquence (RF) choisie (impulsion ou "pulse") est de courte dure, quelques microsecondes. Les noyaux gnrent leur tour un microchamp magntique qui sera capt par une bobine rceptrice, cest le signal R.M.N. (Donnes). Ces donnes sont envoyes un ordinateur o elles sont analyses et transformes en signal. Le traitement mathmatique, ou transforme de Fourier, permet de transformer le signal en spectre R.M.N.

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3. PRINCIPE DE BASE
3.1 QUEST CE QUE LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE ?
Certains noyaux sont comparables de petits aimants, qui soumis un champ magntique intense peuvent sous laction dun champ de radio frquence (RF) convenable, absorber une certaine quantit dnergie : cest le phnomne de rsonance. Il se traduit par le passage des noyaux dun tat nergtique favorable un tat nergtique dfavorable.

3.2 QUELS SONT LES NOYAUX CAPABLES DE FOURNIR UNE RESONANCE ?


Tous les noyaux ne prsentent pas de rsonance, il en existe deux types : Les noyaux sensibles au champ magntique externe qui possdent un spin nuclaire I gal comme le proton 1H, le carbone 13C, le phosphore 31P, lazote 15N ou le fluor 19F. Ils ont une circulation de charge sphrique, et possdent deux moments magntiques. Les noyaux spin I suprieur : le deutrium 2H lazote 14N, loxygne 17O ou encore le soufre 33S ont une circulation de charge non sphrique et possdent un moment quadripolaire nuclaire. Tous ces noyaux sont capables de rsonner mais dans des conditions diffrentes. Les noyaux non sensibles possdent tous un nombre de masse et un nombre atomique pairs. La parit de ces deux valeurs entranent un moment magntique nuclaire unique. Les noyaux de carbone 12C ou doxygne 16O possdent un spin I gal 0.

3.3 LES ETATS ENERGETIQUES


Soumis un champ magntique B0, un noyau de spin I non nul peut prendre 2I+1 orientations par rapport la direction de ce champ. Pour exemple, le proton (1H) qui possde un spin nuclaire I = prend 2 orientations, celles-ci correspondent au nombre quantique m : m = + lorsque le spin nuclaire est dans la mme direction que le champ appliqu, il est alors dans un tat nergtique favorable . m = - lorsque le spin nuclaire une orientation antiparallle au champ appliqu. Il est alors dans une position nergtique dfavorable . Lquation de Boltzman N/N = exp (-E/kT) dfinie le rapport des noyaux dans les deux tats dnergies. La transition entre deux tats demande un apport dnergie qui est fourni par une radio-frquence. Le passage dun tat un tat est appel "transition nergtique". Lnergie ncessaire est selon lquation de Bohr : E = (hB0)/2 = h0 ou h est la constante de Planke, le rapport gyromagntique du noyau excit et B0 lintensit du champ magntique.

3.4 FREQUENCE DE PRECESSION


Le noyau peut tre reprsent par un vecteur de moment magntique (avec une direction et une intensit). Ce moment magntique tourne, autour dun axe
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Rsonance Magntique Nuclaire 8 dirig suivant la direction du champ appliqu B0, la vitesse 0 = 20, ou 0 est la frquence de Larmor du noyau, elle est galement appele frquence de prcession, celle-ci est fonction du champ B0. (0 = B0 / 2)

3.5 LA RESONANCE
La rsonance consiste donc au passage du noyau dun tat nergtique favorable (suivant la direction B0) un tat nergtique dfavorable (antiparallle B0). Cette transition est induite par lapplication ponctuelle dun champ magntique B1 perpendiculaire B0 et de radiofrquence (RF) choisie 1. Pour avoir rsonance du noyau, il faut que la RF applique soit gale la frquence de prcession du noyau : B1 = 0 = B0/2 Larrt de lapplication de la RF va permettre le retour lquilibre des noyaux, cest le phnomne de relaxation (Figure 2).

Figure 2 : Reprsentation vectorielle de lapplication dune radiofrquence B1 sur un vecteur moment magntique reprsentant un spin nuclaire de proton. La rsonance est obtenue quand la RF applique 1 est gale la frquence de prcession du noyau 0.

Dans une molcule, comme un oligosaccharide, tous les protons ne sont pas quivalents et par consquent les frquences de prcession sont diffrentes. Cest pourquoi la RF B1 est applique avec des frquences croissantes ce qui permet datteindre la rsonance pour chaque noyau.

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4. PRINCIPE GENERAL
Dans cette partie nous nous intresserons aux moments magntiques totaux qui sont dfinis comme la magntisation macroscopique, M. Celle-ci reprsente la somme des moments magntiques des noyaux parallles et antiparallles. La population des noyaux dans un tat tant plus grande que la population , la magntisation M est donc oriente suivant la direction du champ B0. La magntisation macroscopique M est, dans un champ intense B0, parallle ce dernier, elle est appele dans ce cas magntisation longitudinale (Figure 3A). Lapplication dune RF dont la composante magntique (externe) B1 est perpendiculaire au champ B0 provoque le basculement de cette magntisation sur un plan xoy pour donner la magntisation transversale, cest le principe de limpulsion R.M.N. ou pulse (Figure 3B). Lapplication de cette radiofrquence choisie sera de courte dure (quelques microsecondes). Les noyaux, dans une position nergtique dfavorable, tendent revenir dans leur position initiale lquilibre. La magntisation transversale va revenir lquilibre en oscillant autour de laxe la frquence de prcession des noyaux (Figure 3C). Cette frquence est spcifique de chaque espce de noyaux et dpend de lenvironnement lectronique (densit lectronique) de ces derniers. A titre dexemple le galactose possde 8 protons diffrents par leur environnement et leur position. Ces derniers, qui ont chacun leur propre frquence de prcession, donnent alors 8 signaux diffrents.

Figure 3 : Reprsentation schmatique de lapplication dune radiofrquence B1 sur la magntisation macroscopique.

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4.1 COMMENT MESURER LA FREQUENCE DE PRECESSION ?


Larrt de lapplication de B1 va permettre la magntisation transversale de revenir sa position initiale le long de laxe z avec une frquence de prcession spcifique et pendant un certain temps T. La projection du vecteur de magntisation sur le plan xoy qui correspond la magntisation transversale dcrot en fonction du temps (Figure 3C). Cette dcroissance peut tre mesure et correspond au temps de relaxation transversale T2. De la mme manire, la composante Mz reprsente la magntisation transversale qui peut tre mesure et elle correspond au temps T1.

Loscillation des noyaux provoque un champ lectromagntique qui est capt par un rcepteur situ suivant laxe y. Le signal obtenu sappelle une FID1 ou dcroissance dinduction libre (Figure 3D). Ce signal est tout fait comparable celui produit par un guitariste qui pince une corde de sa guitare, le son rsultant, de frquence constante, a une intensit qui diminue en fonction du temps. Ce signal (S = f(t)) nest pas exploitable en tant que tel, cest pourquoi il est transform en fonction dune frquence. Cest la transforme de Fourier qui permet dobtenir le spectre connu I = f (Hz).

Figure 4 : La transforme de Fourier permet de transformer la FID totale qui est une fonction du temps S = f(t) en un spectrogramme qui est une fonction de frquence (Hz). Chaque signal correspond une frquence de prcession dun noyau donn.

FID : Free Induction Decay


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Rsonance Magntique Nuclaire 11 La FID finale est en fait, constitue dune superposition de sinusodes amorties, chacune delles correspondant un type de noyau. Il y a donc autant de sinusodes que de signaux R.M.N..

4.2

COMMENT SUPPRIMER LES SIGNAUX INDESIRABLES ?

Un monosaccharide comme le galactose possde 12 atomes dhydrogne chimiquement diffrents. En effet certains atomes sont chimiquement mobiles, cest notamment le cas des protons hydroxyls (-OH) et des protons des fonctions amines (-NH-). Ceux ci sont remplacs par des atomes de deutrium (2H) qui, dans les conditions de mesure standards, ne rsonnent pas. Ils sont par consquent invisibles sur un spectre R.M.N.. Cette opration sappelle lchange chimique. Cette modification consiste solubiliser lchantillon anhydre dans un volume de 2H2O (D2O), de lyophiliser et de solubiliser nouveau dans le mme solvant. Cette opration peut tre rpte plusieurs fois si ncessaire. Nanmoins le D2O nest pas enrichi 100% de deutrium si bien qu'il subsiste alors un signal rsiduel deau visible sur le spectre et not HOD (HO2H).

4.3 LES MONOSACCHARIDES


Les monosaccharides peuvent exister sous deux configurations diffrentes (appel D ou L) et un grand nombre de conformations (pyranique, furanique etc. ...) (pour revue McNaught 1997). Nanmoins les sucres pyraniques adoptent presque toujours les conformations chaises 4C1 ou 1C4 (Figure 5). Cest cette dernire qui est considre dans ce travail. La connaissance de la conformation des sucres est essentielle pour pouvoir interprter un spectre R.M.N.. La majorit des monosaccharides ont une conformation en 4C1 (Tableau 1) qui signifie que le carbone n 4 du cycle est au dessus du plan form par loxygne du pont hmiactalique et les carbones C2, C3, C5, alors que le carbone 1 est en dessous.

Figure 5 : Conformation en chaise 4C1 du -D-galactose. Les protons axiaux (en rouge) sont parallles entre-eux. Seul le proton H4 est en position quatoriale, il est alors parallle au plan du cycle (en gris).

Dans ce type de conformres, il existe 3 types de protons : Les protons axiaux parallles entre-eux (H 1, 2, 3, 5) Les protons quatoriaux (H 4) Les protons exocycliques (H 6, 6)

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Rsonance Magntique Nuclaire 12 Les molcules O-glycanniques sont gnralement isoles sous forme rduite. La N-actyl-galactosamine en position terminale rductrice sera donc sous forme dosaminitol non cyclique. Certains de ses protons ont des frquences de rsonances particulires, caractristiques et parfaitement identifiables.

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Tableau 1 : Reprsentation des principaux monosaccharides rencontrs dans les Oglycannes de type mucines. Les structures sont prsentes aprs change au deutrium, les protons indiqus en rouge sont observables sur un spectre. R : groupements N-actyl (NeuAc), N-glycolyl (NeuGc), OH (Kdn). La symbolique est utilise dans le tableau 7.

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4.4 LES CONDITIONS DE MESURE


Les programmes dimpulsions qui permettent dobtenir un signal sont courts, de lordre de la seconde. De ce fait les expriences sont rptes un certains nombre de fois et les FID accumules avant de procder la transforme de Fourier. Le rapport signal sur bruit (S/B) est alors amlior. En effet S/B est proportionnel N (o N est le nombre daccumulations). Les expriences R.M.N. doivent tre, en rgle gnrale, ralises dans les mmes conditions physico-chimiques. En effet les diffrents paramtres sont variables suivant la temprature et le pH des solutions (ajustement du pH possible avec DCl et NaOD). Etant donn que la R.M.N. peut ncessiter une tude comparative il convient de raliser les expriences temprature et pH constants, ce principe permettant alors de se rfrer aux banques de donnes des dplacements chimiques qui seront dfinis par la suite.

4.5

LES PARAMETRES IMPORTANTS

Chaque signal R.M.N. est caractris par plusieurs grandeurs qui sont caractristiques de chaque noyau considr. Ces paramtres donnent des informations sur le proton et son environnement. La dtermination de la structure primaire des oligosaccharides repose sur les diffrents critres que sont : Le dplacement chimique exprim en ppm (partie par millions) ou parfois en Hz La constante de couplage dont la grandeur est exprime en Hertz Lintensit du signal

Figure 6 : Reprsentation schmatique des paramtres R.M.N. contribuant lanalyse de la structure primaire des oligosaccharides (Daprs van Halbeek 1995).

Ces paramtres peuvent tre complts par dautres : Les effets nOe2 qui sont dues aux interactions dipolaires entre deux noyaux diffrents et voisins dans lespace et dont lintensit de corrlation est
2

nOe : nuclear Overhauser enhancement


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Rsonance Magntique Nuclaire 15 inversement proportionnelle R6. Ce paramtre est essentiel dans les analyses conformationnelles des oligosaccharides. Ce paramtre na pas de valeur numrique mais une valeur informationnelle. Le temps de relaxation longitudinal T1 (exprim en secondes) qui dcrit la cintique de retour des noyaux lquilibre aprs une impulsion. Le temps de relaxation transversale T2 (en seconde) dcrit le taux de dcroissance de la magntisation transversale. Pour les molcules de petite taille, comme les oligosaccharide-alditols, T1 et T2 sont similaires. Les macromolcules de type polysaccharide ont des temps T1 entre 0.1 et 1 seconde alors que T2 est infrieur 0.1s. Ces deux paramtres ont leur importance dans ltablissement des squences dimpulsions R.M.N. mais ne sont pas ncessaires dans linterprtation des spectres. 4.5.1 LE DEPLACEMENT CHIMIQUE Cette valeur dfinie () la position du signal sur laxe des frquences (axe x du spectre), la valeur sera mesure par rapport au signal rfrence par la relation suivante :

- = ref ref

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ref correspond au dplacement chimique des protons du T.M.S.3 (Tetra Methyl Silane) Ces protons ont la particularit d'tre dans un environnement dont la densit lectronique est la plus forte. La frquence de rsonance est calcule pour un rapport gyromagntique H = 26.752 x 107 rad T-1 s-1 et avec lintensit (en Tesla) du champ magntique B0 de lappareil utilis. Par exemple dans un champ B0 de 9.4 T la frquence de rsonance des protons du T.M.S. se trouve ref = H x B0 / 2 = (26.752 107 x 9.4)/ 2 = 400.22 MHz. Par dfinition le dplacement chimique T.M.S. = 0 ppm. : correspond la frquence de rsonance du signal observ. Les frquences , et ref sont trs grandes (MHz) cest pourquoi est exprim en ppm. Lchelle des spectres pour ltude des O-glycannes se situe entre 0 et 7 ppm soit pour un appareil de 400MHz, de 0 2800Hz. Cette valeur de dplacement chimique exprime lenvironnement direct du noyau considr. Si un noyau se trouve dans un environnement o la densit lectronique est trs forte (il est dit "blind") comme cest le cas pour les protons mthyliques (R-CH3), le dplacement chimique est alors faible. Par contre, si la densit lectronique est moins intense comme pour les protons anomres, le dplacement chimique sera plus grand (le proton est "dblind"). Ce paramtre est la base des "structural reporter groups" qui fournissent une carte didentit pour chaque oligosaccharides. (Vliegenthart et al 1983, Kamerling et al 1992)

T.M.S. : (CH3)4Si
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Tableau 2 : Correspondance des frquences de rsonance de noyaux couramment analyss dans le champ magntique correspondant. Isotope Spin abondance naturelle % Frquence de rsonance (MHz) dans un champ de : 1,8790 (T) 2,3488 (T) 4,8975 (T) 7,0463 (T)
1

9,395 (T) 11,744 (T) 17,615 (T) 400,000 100,577 40,531 161,923 500,000 125,721 50,664 202,404 750,000 188,580 75,996 303,606

H C N P

1/2 1/2 1/2 1/2

99,98 1,108 0,37 100

80,000 20,115 8,106 32,385

100,000 25,144 10,133 40,481

200,000 50,288 20,265 80,961

300,000 75,432 30,398 121,442

13

15

31

4.5.2 LA DENSITE ELECTRONIQUE La densit lectronique est responsable du blindage ou du dblindage des atomes observs. Pour valuer la densit lectronique il faut prendre en compte les proprits lectro-attractives ou lectro-rpulsives des atomes et des groupements chimiques (sulfate, phosphate etc. ...). Cette notion est dcrite par la constante dcran magntique , cette constante dpend, comme nous lavons vu, de la place du noyau dans la molcule mais galement du milieu dans lequel la molcule se trouve. Le champ statique effectif sera alors plus faible que le champ rel appliqu : Beff = Bo (1-). Le caractre lectro-attractif des groupements chimiques provoque un "dblindage" des atomes observs, a contrario un groupement lectro-rpulseur induit un blindage par augmentation de la densit lectronique autour des noyaux observs. Cette notion est galement importante puisquau plus un proton est dblind plus la radiofrquence B1 ncessaire faire basculer la magntisation transversale sera leve et inversement. Sur un spectre R.M.N. cela se traduit par deux zones, une zone dite des hauts champs magntiques et lautre des bas champs magntiques.

De ce principe, chaque proton dun monosaccharide aura son propre dplacement chimique (donc sa propre frquence de prcession), avec comme exception les protons chimiquement identiques qui possdent dans ce cas strictement le mme dplacement chimique. Nanmoins lintensit du signal observ sera proportionnelle au nombre de protons qui rsonnent la mme frquence. 4.5.3 INTENSITE DES SIGNAUX Les protons chimiquement identiques ont la mme frquence de prcession (ou frquence de rsonance) et ont de ce fait le mme dplacement chimique. Lintensit du signal considr sera directement proportionnelle au nombre de protons impliqus dans ce signal. Lintgration du signal par rapport
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Rsonance Magntique Nuclaire 17 un signal de rfrence permet alors de dterminer le nombre de protons. Cette proprit quantitative de lexprience R.M.N. permet danalyser le cas chant un mlange doligosaccharides. 4.5.4 LA CONSTANTE DE COUPLAGE (J) Cette entit est fondamentale dans la dtermination structurale et conformationelle des molcules. Cette valeur prend en considration deux lments : Le nombre de noyaux voisins, cest dire les noyaux coupls au noyau observ. Langle qui existe entre les deux noyaux considrs, la valeur de cet angle est importante puisquelle dtermine la largeur du signal observ. Il existe plusieurs types de constantes de couplage dont la nomenclature est la suivante : JY,Z : X reprsente le nombre de liaisons covalentes entre le noyau observ et le noyau voisin, Y et Z reprsentent les deux noyaux pris en compte. Ils peuvent tre identiques (H,H) ou diffrents (C,H). La constante de couplage gminal entre deux noyaux 2JC,H, 2JH,H. La constante de couplage vicinal entre deux protons (homonuclaire) 3JH,H ou htronuclaire 3JC,H. La constante 3JH,H Permet de dterminer sur les spectres COSY la nature des monosaccharides.
n X

J ou n 4, couplage longue distance.

4.5.4.1 Le nombre de protons (figure 7) Il est important de considrer le nombre de protons voisins, en effet le nombre de raies spectrales dun proton est gal 2n o n est le nombre de protons coupls au proton observ. Lintensit relative de ces raies, lorsque les constantes de couplage sont identiques, est donne par le triangle de Pascal.

1 1 1 1 2 1 1 3 3 1

aucun couplage, singulet (s) 1 noyau coupl, 2 raies dintensit 1 : 1, doublet (d) 2 noyaux coupls, 3 raies dintensit 1 : 2 : 1, triplet (dd) 3 noyaux coupls, 4 raies dintensit 1 : 3 : 3 : 1, quadruplet (ddd) etc. ...

1 4 6 4 1 1 5 10 10 5 1

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-D-galactose

10 Hz

ppm
H1

ppm
H4
3

OD H
CH 2OD

JH1,H2
H4

OD
CH2 OD

JH4,H3 JH4,H5

H2
H

H2
H5

OD DO DO H1
Doublet

OD DO H1
Quadruplet (pseudo-singul)

DO H

H3

H5

H2
OD H
CH 2 OD
3

OD H2
H

JH2,H1 JH2,H3

H4

C H2 OD

JH5,H6 JH5,H6' JH5,H4

H2
H5

OD DO H1

OD DO H1
3

DO H

DO H3

Quadruplet (pseudo-triplet)

Octuplet (pseudo-quadruplet)

OD H4
CH 2OD

H3
3

H6 3
3

H2
H

JH3,H2
H4

OD
CH 2OD

JH6,H6' 3JH6',H6 JH6,H5 3JH6',H5

OD DO H1
3

H2
H5

DO H3

JH3,H4

OD DO H1

DO H3

Quadruplet (pseudo-doublet)

Quadruplet (pseudo-doublet)

Figure 7 : Reprsentation des diffrentes constantes de couplages vicinaux (3JH,H) du galactose telles quelles peuvent tre reprsentes sur un spectre 2D type COSY.

4.5.4.2 Angle entre deux protons La relation entre la valeur en Hertz de la constante de couplage et langle dihdral () que font deux protons voisins peut tre schmatise par la relation de Karplus :

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H R3 C R4 R2 R1 R4 H R3 C H

H R2 R1 C

Cette proprit permet de dterminer lanomrie des sucres et leur nature. En effet, chaque monosaccharide est caractris par son schma de constante de couplage vicinal comme cela est indiqu dans le tableau 3.

Figure 8 : Reprsentation de langle dihdral () entre les protons H1 et H2 des deux anomres du galactose.

Ainsi pour les conformations et configurations classiques, les anomres prsentent en rgle gnrale une petite constante de couplage (J < 5Hz) et les anomres une grande constante de couplage 5 Hz <J > 12Hz.

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Rsonance Magntique Nuclaire 20


Tableau 3 : Rcapitulatif de toutes les constantes de couplage 3JH,H possibles des rsidus aldopyranosyles. Les symboles G et P reprsentent respectivement des constantes de couplage vicinal 3 JH,H grandes (>5 Hz) et petites (< 5Hz). (Koerner et al 1987). Les rsidus les plus frquemment rencontrs dans les oligosaccharide-alditols isols partir de mucines sont en caractres gras.

Strochimie des rsidus aldopyranosiques

J1,2 J2,3 J3,4 J4,5 G G G G G G G G G G P P G P G P

Configuration -gluco -ido strochimie impossible -galacto -altro

Conformation
4

Exemples de rsidus -D-Glc, -D-GlcNAc, -D-Qui (-D-Idose)

C1 C4

C1 C4

-D-Gal, -D-GalNAc, -L-Fuc, -D-Fuc (-D-Altrose)

G G G G P P P P P

P P P P G G G G P

G G P P G G P P G

G P G P G P G P G

strochimie impossible strochimie impossible -allo -gulo -gluco -ido strochimie impossible -galacto -manno -manno
4 4

C1 C1 C1 C4

(-D-Allose) (-D-Gulose) -D-Glc, -D-GlcNAc, -D-Qui (-D-Idose)

C1 C1 C1 C4 C1 C1 C1 C1

-D-Gal, -D-GalNAc, -L-Fuc, -D-Fuc -D-Man, -D-ManNAc, -L-Rha -D-Man, -D-ManNAc (-D-Gulose) ( or -D-Altrose, -D-Allose) ( et -D-Idose) (-D-Gulose) ( et -D-Talose)

P P P

P P P

G P P

P G P

-gulo et altro, allo et ido, gulo gulo et talo

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Rsonance Magntique Nuclaire 21

4.6 COMMENT APPREHENDER LINTERPRETATION DES O-GLYCANNES ?

DES SPECTRES

R.M.N.

La lecture des spectres R.M.N. est facilite par la connaissance de lorigine et de la mthode de sparation du produit analys. Les O-glycannes de type mucine sont gnralement isols ltat doligosaccharide-alditols ; cest pourquoi nous considrerons par la suite que tous les oligosaccharides tudis ici, le sont. Les indications apportes par les mthodes disolements (rsines changeurs dions, HPLC etc. ...) permettent dorienter la recherche dlments structuraux caractristiques des molcules acides ou neutres. La rduction des O-glycannes aprs -limination indique que ces oligosaccharides possdent tous un rsidu de N-actyl-galactosaminitol. Toutefois il arrive que certaines molcules aient subit une dgradation rcurrente avec ou sans rduction. Les produits obtenus possdent alors un rsidu de galactitol ou sont caractriss par la prsence dun hxne-ttrol (dgradation par deshydratation du N-actylgalactosaminitol), ce dernier compos est trs facilement identifiable la vue de la rsonance trs particulire de ses protons thylniques aux environs de 6 ppm. 4.6.1 METHODOLOGIE SUIVIE La ralisation dun spectre proton une dimension est systmatique. Elle permet de connatre plusieurs paramtres. Deux cas peuvent se prsenter : La molcule a dj t isole et, dans ce cas, les dplacements chimiques de ses protons sont strictement identiques ceux dj publis (cf &7). Lanalyse est alors termine. La molcule est nouvelle, la comparaison des dplacements chimiques avec la banque de donnes ne permet pas didentifier les monosaccharides et les liaisons. Dans ce cas les analyses R.M.N. doivent tre approfondies par la ralisation dexpriences deux dimensions. Les expriences COSY homo- et htronuclaire et ROESY permettent, dans la majorit des cas, didentifier la nature des monosaccharides de loligosaccharide et dlucider la structure primaire de ce dernier.

4.7

LES EXPERIENCES R.M.N.

4.7.1 LE SPECTRE PROTON (1H) A UNE DIMENSION Ce type dexprience apporte de nombreux renseignements linterprtation : La valeur des dplacements chimiques de chaque proton identifiable Le nombre de rsidus monosaccharidiques (nombre de protons anomres) La prsence ou non dacide sialique (prsence des protons axial et quatorial) Le nombre dosamines (nombre de raies correspondants aux groupements actamides) Le nombre de rsidus de 6-deoxyose et notamment de fucose (nombre de doublets caractristiques dans les hauts champs (1.1 < -CH3 <1.3) Accessoirement, ltat de puret de la molcule (intensit relative des signaux)
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Rsonance Magntique Nuclaire 22 Le spectre une dimension peut tre scind en trois rgions distinctes, comme lindique la figure 9 suivante :

Figure 9 : Ce schma, trs gnral, est valable pour tout O-glycanne de type mucine.

La rgion des protons anomres est importante4 (comprise entre 6 ~ 4.5 ppm), elle permet de dterminer le nombre de rsidus monosaccharidiques qui constituent loligosaccharide. Les constantes de couplage peuvent tre mesures discriminant lanomrie ou des sucres. La "bulk region" (~ 3.6 3.2 ppm) renferment de nombreux protons qui possdent une frquence de rsonance proche ce qui rend leur distinction trs difficile. Mais les protons ports par des carbones impliqus dans une liaison Oglycosidique sont trs souvent dblinds, ils peuvent alors glisss vers les bas champs. Par consquent ils peuvent tre distingus. Enfin la rgion comprise entre 1 et 3 ppm correspond diffrents protons qui apportent de nombreuses indications (prsence des protons quatorial et axial des acides sialiques, protons actamides des osamines, etc. ...). A titre dexemple, la figure 10 reprsente un spectre 1D dun oligosaccharidealditol, lemplacement des protons y est caractristique.

voir le chapitre 7
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Rsonance Magntique Nuclaire 23

Figure 10 : Spectre proton dun oligosaccharide-alditol ralis 400 MHz et 300K. Les dplacements chimiques sont mesurs par rapport une rfrence interne : les protons de l'actone rsonnent 2.225 ppm.

4.7.2 LES

SPECTRES

13

C ET

31

P A UNE DIMENSION

Comme nous avons pu lindiquer prcdemment, les 13C et 31P possdent un moment magntique nuclaire et il est donc possible de raliser les expriences R.M.N. Tandis que labondance naturelle du 13C est de 1/100 par rapport au 12C, les expriences seront alors plus longues et les quantits de matriels devront tre plus consquentes. Alors que labondance naturelle du 31P est de 100%, les expriences seront plus facilement ralisables. De la mme manire que pour le proton, la position et limplication de ces noyaux dans une fonction chimique particulire influenceront leurs dplacements chimiques (constante dcran). 4.7.2.1 Le carbone : La fentre spectrale de lobservation des carbones se situe entre 0 et 200 ppm. Ainsi les carbones anomres se situent entre 90 et 110 ppm, les autres carbones rsonnant entre 50 et 90 ppm. Les signaux des carbones des groupes methylnes (R-CH2-R) sont observs aux environs des 60-70 ppm, les carbones mthyliques (R-CH3) aux environs de 30 ppm et enfin le carbone dune fonction carboxyle environ 180 ppm. Une diffrence de = +10 ppm est significative dune substitution sur le carbone observ. A titre indicatif, la rfrence utilise pour obtenir les conditions de rsonance du carbone 13C est galement le T.M.S.. Le rapport gyromagntique des carbones de cette rfrence est 13C = 6.7283 107 rad T-1 s-1 (Tableau 2). Ce rapport reprsente le quart de celui du proton, la radio-frquence, dans un

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Rsonance Magntique Nuclaire 24 champ magntique identique au proton, utilise pour faire basculer la magntisation est alors gale au de celle utilise pour le proton. Par exemple, dans un champ de 9.4 T la rsonance du = 6.72 107 X 9.4 / 2 ~ 100MHz. 4.7.2.2 Le phosphore : La fentre spectrale dobservation du phosphore devra tre faite en deux fois. Cet atome peut tre impliqu dans un grand nombre de liaison avec des aglycones qui possdent des comportements de rsonances extrmement variables. Ainsi il sera choisi une fentre de 600 ppm centre 0 ppm. En effet les atomes de phosphore peuvent, par rapport au standard utilis, avoir des dplacements chimiques ngatifs. Cette fentre spectrale sera ajuste dans le cas de notre tude 20 ppm, centre 0 ppm. La rfrence (externe) utilise gnralement est lacide phosphorique, 31P = 0. 4.7.3 LEXPERIENCE COSY5 HOMONUCLEAIRE 1H/1H Le COSY 90 permet dobtenir des informations importantes. Cette exprience permet de corrler les protons qui sont coupls scalairement, en dautres termes celle-ci permet de transfrer la magntisation dun proton sur un proton voisin et permet donc de visualiser les constantes de couplage 3J entre 2 protons. Il existe plusieurs expriences COSY : COSY 90 : Il y a transfert de magntisation entre le proton H1 et H2 COSY R1 : COSY un relais, la magntisation est transfre du H1 H3 via H2 COSY R2 : La magntisation va jusquau proton H4 Il existe galement le COSY R3 et le TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY o COSY multirelay). Cette dernire exprience permet de transfrer la magntisation sur la totalit des protons dun monosaccharide. Nanmoins la visualisation des constantes de couplage y est beaucoup moins aise. Les expriences COSY sont fondamentales puisquelles permettent de mesurer toutes les constantes de couplage vicinales entre les diffrents protons et donc de dterminer la nature du monosaccharide (Tableau 3). Cette exprience permet, en plus, de dterminer les dplacements chimiques des protons qui rsonnent dans la "bulk region". 4.7.4 EXPERIENCE HETERONUCLEAIRE 4.7.4.1 HMQC : Heteronuclear MultiQuantum Coherence Cette exprience R.M.N. permet de corrler chaque proton avec lhtro atome sur lequel il est attach (1JH,C ~145Hz ; 1JH,N ~90Hz ). La finalit de cette exprience est indissociable des expriences COSYs ou TOCSY. Celles-ci permettent didentifier et de dterminer le dplacement de la majorit des protons de la molcule, le report de ces valeurs sur le spectre 1H-13C-HMQC permet didentifier les carbones correspondants et den dterminer leur
5

13

C est obtenue pour :

COSY : acronyme de COrrelation SpectroscopY


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Rsonance Magntique Nuclaire 25 dplacement chimique. La connaissance des dplacements chimiques des carbones permettent de dterminer la substitution par lobservation dun dblindage des carbones, + 5 << + 10 ppm. Il est noter que certaines variations sont plus ou moins importantes et apportent des informations quant la nature des liaisons et substitutions diverses. 4.7.4.2 HMBC : Heteronuclear Multiple-Bond Correlation Cette exprience permet dobtenir les corrlations et les couplages (3JH,P ~ JH,C ~8Hz) entre un proton et lhtroatome voisin. Ces informations sont dautant plus importantes quelles permettent de dterminer la squence de loligosacccharide. En effet les couplages 3J permettent de corrler les noyaux distants de trois liaisons covalentes, il est donc observ, pour un monosaccharide, les corrlations suivantes :
3 3 3

JH1,C3, 3JH1,C5 3JH2,C4, 3JH3,C5, 3JH3,C1, 3JH4,C2,3JH4C6, 3JH5,C3,3JH5C1 mais surtout JH1,CX o X est la position du carbone du monosaccharide inclus dans la liaison O-glycosidique. Malgr tout, cette exprience nest pas toujours possible. En effet si le spectre HMQC ncessite une concentration de matriel de lordre de la millimole, lexprience HMBC en ncessite 10 fois plus.

Figure 11 : Schma reprsentant les corrlations 3JH,C (en rouge) carbone/proton observes partir du proton H1 dans une exprience HMBC. La corrlation la plus intressante est celle qui indique la liaison O-glycosidique.

4.7.5 LES EXPRIENCES ROESY (ROTATING FRAME OVER HAUSER EFFECT SPECTROSCOPY) Ce type dexprience permet de visualiser les corrlations dipolaires proton-proton entre deux voisins proches dau plus 5 . Les corrlations peuvent tre dorigine intra- ou extra-rsidu. Il est vident que les interactions interrsidus sont plus intressantes puisquelles permettent de conforter la squence primaire de loligosaccharide-alditol.

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Rsonance Magntique Nuclaire 26

Figure 12 : Reprsentation dune corrlation dipolaire visible entre deux protons dans une exprience ROESY. Cette exprience associe lHMQC peut se substituer lexprience HMBC.

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Rsonance Magntique Nuclaire 27

5. ETUDE DUN EXEMPLE


5.1 OBTENTION ET SPECTRE 1H DU N-ACETYL-GALACTOSAMINITOL
Cet osaminitol est le point commun de tout O-glycanne de type mucine isol par -limination en milieu rducteur. Il semble donc intressant didentifier les signaux caractristiques de cet alcool.

Figure 13 : Schma simplifi de la -limination dune mucine et libration dun oligosaccharidealditol stable

Certain de ses protons sont effectivement parfaitement identifiables dans de trs nombreux spectres. Ils refltent alors la nature du noyau (core) de loligosaccharide-alditol. (Tableau 4)

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Rsonance Magntique Nuclaire 28

Figure 14 : Spectre RMN 1H du N-actyl-galactosaminitol. Le signal des protons du groupement N-actyl nest pas indiqu dans le spectre, il rsonne 2.055 ppm.

Tous les protons des monosaccharides ont des dplacements chimiques variables suivant la nature du noyau ("core") de loligosaccharide. Les monosaccharides du noyau sont dailleurs ceux qui sont le plus affects. Les protons H2 et H5 sont plus dblinds que les autres protons et "sortent" du massif (o "bulk region"). Ils sont, par consquent, plus facilement identifiables. La comparaison des dplacements chimiques avec les banques de donnes permet souvent de dterminer la nature de la substitution. Lidentification des autres protons est parfois possible si loligosaccharide est restreint quelques rsidus. Les protons H-3 et H-4 reprsents par 2 quadrupls identiques peuvent ainsi tre aisment distinguables, en effet le proton H-3 est dblind et rsonne aux environs de 3.8, 4 ppm alors que le proton H-4 rsonne aux environs de 3.3, 3.7 ppm. Lidentification de ces protons et la valeur de leur dplacements chimiques respectifs, ajouts aux protons H-2 et H-5, sont trs souvent suffisants pour lucider le type de noyau de loligosaccharide-alditol.

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Rsonance Magntique Nuclaire 29

Tableau 4 : Dplacements chimiques des protons des noyaux 1 6 (Daprs Kamerling et Vliegenthart 1992)

noyau 1

noyau 2

noyau 3

noyau 4

noyau 5

noyau 6

H-2 H-3

4.252 3.850 3.390 3.928 3.668 3.647 2.055

4.395 4.065 3.507 4.196 3.69 3.628 2.050 Gal Gal 4.468 3.542 n.d. 3.901 n.d. n.d. n.d. 3.901 n.d. n.d. n.d. -

4.395 4.061 3.468 4.281 3.931 n.d. 2.066 GlcNAc (6) 4.538 n.d. n.d. n.d. n.d. 3.932 n.d. 2.066

4.287 3.996 3.546 4.141 3.65 n.d. 2.037 GlcNAc 4.604 n.d. 3.584 n.d. n.d. 3.950 n.d. 2.085

4.280 3.984 3.519 4.230 3.905 n.d. 2.044 GlcNAc (3) 4.600 n.d. n.d. n.d. n.d. 3.949 n.d. 2.081 GlcNAc(6) 4.543 n.d. n.d. n.d. n.d. 3.931 n.d. 2.063

4.395 3.888 3.680 3.749 3.647 3.647 2.049 GalNAc 5.103 4.235 3.921 4.043 4.073 n.d. n.d. 2.060

4.242 3.841 3.379 4.021 3.933 n.d. 2.046 GlcNAc 4.553 n.d. n.d. n.d. n.d. 3.928 n.d. 2.059

GalNAc-ol

H-4 H-5 H-6 H-6 NAc

H-1 H-2

4.478 3.564

Autres rsidus

H-3 H-4 H-5 H-6 H-6 NAc

5.2 SPECTRE DUN OLIGOSACCHARIDE-ALDITOL


Loligosaccharide a t isol par -limination rductive dune mucine. La mthodologie disolement et de purification est la suivante : Mlange total des oligosaccharide-alditols => Chromatographie dchange anionique => Discrimination des isomres par CLHP 6. Les renseignements apports par les mthodes disolement indiquent que cet oligosaccharide-alditol est acide et de petite taille (Chromatographie de retard sur gel de silice).

CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance


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Rsonance Magntique Nuclaire 30 5.2.1 SPECTRE PROTON 1D DE LOLIGOSACCHARIDE

Figure 15 : Spectre proton de loligosaccharide ralis 400 MHz et 27C. Les parties expliques dans le texte sont agrandies

5.2.1.1 Identification de losaminitol (Figure 15 C, D) La prsence de pseudo-hexupls (ddd) aux dplacements chimiques 4.388 et 4.145 ppm correspondant respectivement aux protons H-2 et H-5 et la prsence dun signal actamide 2.044 ppm indique la prsence de N-actylgalactosaminitol (Figure 15 C, D). Combien y-a til de rsidus monosaccharidiques ?

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Rsonance Magntique Nuclaire 31 Lobservation de 3 protons anomres (A,B,C) aux dplacements chimiques7 respectifs A = 5.286, B = 4.710 et C = 4.598, indique la prsence de 3 rsidus monosaccharidiques (Figure 15B), les constantes de couplage 3 JH1,H-2 peuvent tre mesures :
3

JH1,H2 (Hz) P8 (3.4) G (7.8) G (7.8) anomre anomre anomre

rsidu A rsidu B rsidu C

=> Loligosaccharide est donc constitu de 3 rsidus monosaccharidiques et dun rsidu de N-actyl-galactosaminitol. 5.2.1.2 Observation de signaux particuliers La prsence dun doublet (Figure 15D) 1.242 ppm indique quil existe un monosaccharide possdant un groupement mthyle (R-CH3). Cette observation avec la prsence dun rsidu danomrie semble indiquer quil existe un rsidu de fucose. Lobservation dun seul signal actamide indique quil nexiste pas de Nactyl-hexosamine autre que la N-actyl-galactosamine rduite (Figure 15D). Labsence de signaux (entre 2 et 3 ppm) correspondants des protons axial et quatorial indique que loligosaccharide-alditol acide isol ne possde pas dacide sialique. La charge est donc porte par un autre groupement acide. Lobservation totale du spectre permet dindiquer que cet oligosaccharide nest pas contamin par un autre (Figure 15A). Lintgration des raies de protons anomres (Figure 15B) permet de donner lquimolarit des monosaccharides en proportion 1 : 1 : 1. Lintgration des groupements methyle et acetamide donne 3 : 3 (3 protons quivalents). Il nexiste donc quun seul dsoxy-sucre et une seule osamine (Figure 15D). Pour des raisons didactiques videntes nous admettons que la comparaison des dplacements chimiques avec la littrature et les banques de donnes ne donne pas dindications sur la structure de loligosaccharide-alditols. Il faut donc poursuivre les investigations par des expriences deux dimensions. 5.2.2 LES EXPERIENCES COSY 1H/1H Comment seffectue la lecture dun COSY ?

7 8

Le dplacement chimique scrit ou alors il est exprim en ppm P ou G signifient des constantes de couplage 3JH,H Petites ou Grandes.
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Rsonance Magntique Nuclaire 32

Figure 136 : Reprsentation schmatique dun spectre COSY avec le parcours des corrlations de H1 H-6.

La diagonale du spectre (Figure 16) reprsente le spectre 1D proton classique. Lexprience COSY va permettre de corrler les protons H1-H2 ; H2H3 et H3-H4 (Certaines corrlations seront dtermines par les expriences TOCSY). En partant du proton H1 le proton H2 est dtermin. La projection de ce signal (ou tache de corrlation) sur la diagonale permet de dterminer la corrlation H2-H3. Lidentification et la projection sur la diagonale du proton H3 permet didentifier le proton H4 et ainsi de suite. A noter que le spectre est parfaitement symtrique.

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Rsonance Magntique Nuclaire 33

Figure 147 : Spectre COSY 90 de loligosaccharide-alditol, le rsidu A est codifi en rouge, le B en bleu, le C en noir et losaminitol en vert

Cette exprience permet dune part didentifier les protons H2 des rsidus A, B et C et den dterminer les constantes de couplages respectives. Dautre part cette exprience permet de corrler les signaux H2 et H-5 de losaminitol avec leurs protons voisins.
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Rsonance Magntique Nuclaire 34 Il est important de souligner quau plus la rsolution9 est importante plus la valeur des constantes de couplage est prcise. Mesure des constantes de couplage 3JH2,H3 :
3

JH1,H2 (Hz) P (3.4) G (7.8) G (7.8)

JH2,H3 (Hz)

rsidu A rsidu B rsidu C

G (> 5Hz) G (> 5Hz) G (> 5Hz)

La consultation du tableau 3 permet dores et dj de discriminer un certain nombre daldopyranoses mais nest pas suffisante pour dsigner les monosaccharides B et C. En outre le monosaccharide A qui possde les constantes de couplage 3JH1,H-2 (P) et 3JH2,H3 (G) est un rsidu de fucose. En effet le tableau 3 indique que ces 2 constantes (P et G) sont attribuables 8 rsidus aldopyranoses diffrents, cependant la prsence dun dsoxy-sucre reprsent par la prsence dun doublet = 1.242 et labsence de groupement actamide montre formellement que le rsidu A est un -Fucose. A ce stade de lexprimentation nous pouvons affirmer que le compos possde un osaminitol et un rsidu de fucose. Bien que le COSY 90 puisse nous donner, dans ce cas, les autres constantes de couplage nous allons poursuivre linvestigation R.M.N. par une exprience COSY 1 relais.

Quest ce que la rsolution : La taille informatique dun spectre est donne en nombre de points. Le point reprsente lchantillonnage du signal. Ainsi une FID peut tre forme de 512 points, 1024, 2048 etc. ... Ainsi une FID de 2048 points permet dobtenir un rsolution spectrale 4 fois plus grande quune FID de 512 points cependant le temps daccumulation sera 4 fois plus important. La rsolution standard dun spectre COSY est de 2048 points en F2 et 512 points en F1.
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Rsonance Magntique Nuclaire 35 5.2.3 COSY 1 RELAIS DE LOLIGOSACCHARIDE-ALDITOL

Figure 158 : Spectre COSY 1 relais, mme codification que pour le COSY 90. Exprience ralise 27C et 400 MHz, rsolution 2048 (F2) X 512 (F1) pts.

Les protons H-2 identifis, les protons H-3 peuvent donc ltre trs facilement. Les corrlations H2-H3 et constantes de couplages sont parfaitement lisibles sur le spectre.

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Rsonance Magntique Nuclaire 36 Mesure des constantes de couplage :


3

JH1,H2 P G G

JH2,H3 G G G

JH3,H4

Fucose rsidu B rsidu C

P (<5z) P (<5z) P (<5z)

La consultation du tableau 3 permet ds maintenant de dterminer la nature des monosaccharides B et C. En effet, la combinaison des lments apports par le spectre 1D et les constantes de couplages mesures (B : GGP, C : GGP) montrent sans ambigut que les rsidus aldopyranosiques B et C correspondent 2 rsidus galactosyls. Labsence de groupement actamide surnumraire permet dliminer la prsence de N-actyl-galactosamine. De plus lobservation fine des signaux H3 des galactosyles B et C indique quils ont des dplacements chimiques franchement diffrents. Le proton H3-B est anormalement dblind ( = 4.326) compar au H3-C ( = 3.988). Cette indication permet de penser quil existe une substitution ce niveau par un groupement particulirement lectro-attracteur.

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Rsonance Magntique Nuclaire 37 5.2.4 COSY 2 RELAIS

Figure 19 : Spectre COSY 2 relais effectu 400MHz et 27C.

De la mme manire, le spectre COSY 2 relais (figure 19) permet, connaissant la position des protons H2 et H3, didentifier les protons H-4 de tous les rsidus. La mesure des constantes de couplages donne les rsultats suivants :

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Rsonance Magntique Nuclaire 38


3

JH1,H2 P G G

JH2,H3 G G G

JH3,H4 P P P

JH4,H5

Fucose Galactose Galactose

P (<5Hz) P (<5Hz) P (<5Hz)

Les expriences prcdentes ont permis de dterminer le nombre et la nature des monosaccharides, les dplacements chimiques de leurs protons. Ces indications permettent maintenant la lecture dun spectre htronuclaire de type HMQC. En effet, ces peuvent tre reports sur laxe F2 du spectre HSQC (Figure 20).

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Rsonance Magntique Nuclaire 39 5.2.5 SPECTRE HMQC DE LOLIGOSACCHARIDE-ALDITOL

Figure 20 : Spectre htronuclaire 1H/13C de loligosaccharide-alditol permettant de dterminer les corrlations entre les protons des rsidus et leurs carbones correspondants.

Le spectre de la figure 20 reprsente la partie du spectre la plus intressante o sont reprsentes toutes les corrlations carbone-proton qui ont un intrt dans la dtermination de la structure primaire de loligosaccharide.
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Rsonance Magntique Nuclaire 40 Le report des dplacements chimiques des protons (donns par le spectre COSY 2 relais, figure 19) permettent didentifier chaque carbone correspondant. Lobservation de singulet, de doublets et de triplets permet de discriminer les protons H2, H3 et H4 des rsidus galactosyles. Quelles sont les informations obtenues ? Le dplacement chimique des carbones La position des substitutions Lobservation des carbones C3 du Gal B, C2 et C4 du Gal C montre que les dplacements chimiques, compars ceux de la littrature, ont des valeurs qui correspondent des carbones fortement dblinds. Ils traduisent ainsi une substitution sur ces carbones. De la mme manire les dplacements chimiques du carbone C3 et C5 du GalNAc-ol indique que ce dernier possdent un noyau de type 1 : Gal(13)GalNAc-ol. Les carbones du rsidu fucosyle indiquent que ce monosaccharide est en position terminale non rductrice et quil nest donc pas substitu. Le spectre HMQC apporte donc les informations suivantes : Le Gal B est donc substitu en 3 Le Gal C est substitu en 2 et 4 Le GalNAc-ol est substitu en 3 Le fucose est en position terminale non rductrice et il nest pas substitu Loligosaccharide possde un noyau de type 1 Il reste ce niveau positionner les rsidus galactosyles et fucosyle sachant que le Gal li sur le GalNAc-ol peut tre le rsidu B ou C et quil peut tre substitu en 2, 3 et/ou 4. La solution est apporte dans ce cas par une exprience ROESY.

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Rsonance Magntique Nuclaire 41 5.2.6 EXPERIENCE ROESY

Figure 21 : Spectre ROESY de loligosaccharide-alditol ralis 400 MHz et 27C.

Connaissant tout les dplacements chimiques des protons il est maintenant trs ais de dterminer les corrlations spatiales entre certains protons. Le spectre de la figure 21 indique donc : Qu'il existe une corrlation entre le proton H1 du GalC avec le H3 du GalNAc-ol, le Gal C est donc li en C-3 sur le N-actyl-galactosaminitol confirmant par ailleurs la prsence dun noyau de type 1.
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Rsonance Magntique Nuclaire 42 Que le proton H1 du fucose avec les protons H2 et H3 du Gal C, le fucose peut donc tre li en 2 ou 3 sur le Gal C. Comme lHMQC nous a indiqu que le Gal C est substitu en 2 et 4 ; le rsidu de fucose est donc li en C-2 sur le Gal C. Et enfin, que le H1 du Gal B est corrl avec le H4 du Gal C. Le galactose B est donc li en 4 sur le Gal C. A ce niveau la squence est maintenant parfaitement connue :

Seule la substitution du galactose B reste inconnue. La mthodologie disolement et le spectre 1D 1H nous indiquent que ce compos est acide et quil nexiste pas dacide sialique. La charge est donc assure par un groupement sulfate. En effet la charge ne peut pas tre un groupement phosphate tant donn quil n'est pas observ de couplage fort Phosphore-Proton 3JH,P. Cette substitution peut dailleurs tre confirme par spectromtrie de masse (MALDITOF10). La squence primaire complte de loligosaccharide-alditol est donc la suivante.

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MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight


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6. EXPERIENCES COMPLEMENTAIRES
Certaines expriences non dcrites dans ce livret sont tout fait intressantes et se substituent celles prcdemment expliques. Elles requirent cependant une quantit de matriel plus importante. Citons par exemple, lexprience HMQC-TOCSY, qui permet de relier le proton son carbone correspondant (ex : 1H1-13C1, 1H2-13C2 etc) puis deffectuer une corrlation totale des protons de chacun des cycles. Ainsi chaque carbone il est possible dobserver toutes les corrlations C-H dun mme cycle et de la mme manire chaque proton il est observ toutes les corrlations H-C. Enfin il est important davoir conscience que toutes les expriences htronuclaires sont applicables pour tout les noyaux coupls des protons, 1H-31P HMQC, 1H31 P HMBC, 1H-31P HMQC-TOCSY. De plus certaines expriences une dimension dites slectives peuvent tre envisages avec les squences de type selmlev (tocsy selectif) ou selno (noesy selectif). Le principe de ces expriences est trs simple puisquil consiste envoyer limpulsion sur une frquence prcise (un proton anomre choisi, par exemple) encore appele O111. De cette manire, seules les corrlations scalaires (dans le premier cas) ou dipolaires (dans le second cas) appartenant au proton slectivement excit (O1) seront visibles sur le spectre. Ces expriences sont particulirement intressantes dans le cas de mlange doligosaccharides.

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Gnralement O1 est appele frquence porteuse, celle-ci peut tre utilise dans ces cas prcis dexcitations slectives
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7. LINDICE SOACS
7.1 INTRODUCTION Llucidation des structures primaires par RMN implique lutilisation videmment des constantes de couplage et des dplacements chimiques, qui sont les deux paramtres indispensables pour de telles tudes. Ces derniers, tant des constantes physiques indpendantes du champ magntique, sont susceptibles aux paramtres physico-chimiques tels que le pD, la temprature ou encore la force osmotique. Il est par consquent ncessaire pour ce qui suit de raliser les expriences dans les conditions standards daccumulation. Ces constantes sont maintenant rpertories dans quelques banques de donnes gratuites de rfrences comme la sweet-DB (reference), la Sugabase ou encore la GlycoBase pour les O- et N-glycannes ainsi que les glycannes libres. La BCSDB quant elle est dvolue aux polysaccharides bactriens. Nous ne citerons pas les quelques banques de donnes payantes qui sont notre point de vue inutiles et non avenues. Si lintrt des banques de donnes nest plus prouver, la recherche dune squence uniquement partir de ces donnes RMN se rvle fastidieuse tant lhtrognit et le choix, qui se doit tre judicieux, des dplacements chimiques sont grands. Cette difficult rend ltude structurale par RMN trs souvent inaccessible aux personnes non inities. Cest pourquoi nous sommes partis du principe que chaque molcule possde son spectre RMN, proton ou carbone, qui lui est propre. Ce spectre RMN reprsente la carte didentit de la molcule et ce dans des conditions standardises daccumulation des donnes.

Figure 22: Spectre proton dun O-glycanne classique, les dplacements chimiques sont calibrs par rapport au dplacement chimique des protons methyles de lactone. Seules les zones des protons anomres et des protons H3 axiaux des acides sialiques sont importantes

Nous avons de ce fait mis au point un nouveau type de requte appel indice SOACS (acronyme de Sum Of Anomeric Chemical Shifts) sur la base dun spectre une dimension. Cet indice est dune simplicit dconcertante et se base uniquement sur la valeur des dplacements chimiques des protons anomres qui sont facilement identifiables puisque dans une zone spectrale libre
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Rsonance Magntique Nuclaire 45 de tout autre proton (Fig. 22). Cet indice a t valid pour les O- et NGlycannes et nous sommes entrain de le valider pour dautres types de molcules (polysaccharides, glycannes libres, molcules de chimie organique). Il est souligner que sur plusieurs centaines de glycannes seuls quelques cas particuliers dindice identique (1 cas) et dindices trs proches ( < 0.01) sont dcris. Nous avons galement extrapol aux oligosaccharide-alditols, cet indice SOACS en un indice SOACS-ol qui comme lindique son suffixe intresse les molcules rduites. Ainsi le couple SOACS/SOACS-ol permet de lever toute ambigut et enfin il est souligner que ces molcules ont des spectres RMN compltement diffrents. Lutilisation de ces indices comme requte est actuellement utilise avec succs dans notre banque de donnes, la GlycoBase 7.2 PRINCIPE 7.2.1 O-GLYCANNES Ce type de glycanne peut-tre libr des protines soit par laction denzymes dont les spcificits sont parfaitement dcrites dans le chapitre correspondant de lencyclopdie Comprehensive Glycoscience [Vliegenthart 2007], ou encore de manire plus courante par hydrolyse chimique et notamment par -limination prcdemment dcrit dans ce livret (cf &5). Les conditions de -limination sont plus souvent ralises en milieu rducteur en prsence de borohydrure de Na ou de K de manire stabiliser les molcules libres. Ceci permet dviter les ractions de dgradation rcurrente lorsque des liaisons 1-3 sont prsentes sur le noyau de ces O-glycannes. Ainsi, lorsque ces O-glycannes sont librs de la sorte, ils sont rduits et stables, ils sont alors appels oligosaccharide-alditols. Lorsque les O-glycannes sont de type mucine, le sucre rduit form correspond au N-Acetyl-Galactosaminitol, cet alcool peut tre idalement identifi en RMN du proton par certains de ses dplacements chimiques12. Ceux-ci ont t dcrits dans un chapitre prcdent. Donc dans ce cas, lindice SOACS peut tre complment par un deuxime indice nomm SOACS-ol qui prend alors en compte le proton H-2 de ce rsidu de GalNAc-ol.

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Le dplacement chimique est symbolis par


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Rsonance Magntique Nuclaire 46 7.2.1.1 Calcul des indices SOACS et SOACS-ol partir dun spectre 1D proton

Figure 23 : Rgion anomre dun spectre de O-glycanne ralis dans leau lourde 300K. Seule cette partie suffit dterminer lindice SOACS.

Sur le spectre enregistr, il suffit dagrandir la partie spectrale correspondante aux protons anomres. Dans ce cas de glycanne, celle-ci est toujours, et sans exception, comprise entre 4.4 et 6 ppm. Sachant quun proton anomre, excepts quelques trs rares cas particuliers13, se dfinie par un doublet avec une constante de couplage petite, c'est--dire infrieure 5Hz pour les protons danomries alpha et suprieure 5 Hz pour les protons danomries beta. Pour le calcul de lindice SOACS-ol, lidentification du proton 2 du rsidu de N-Acetyl galactosaminitol est ncessaire. Il nest pas toujours vident didentifier ce multiplet sur un spectre 1 dimension toutefois il faut savoir que ce proton raisonne exclusivement entre 4.20 et 4.45 ppm. Son identification sur un spectre deux dimensions est beaucoup plus aise. Sachant galement que la RMN est quantitative14 il est souhaitable dintgrer de manire systmatique les signaux dintrts de manire ne pas omettre de valeurs de dplacement chimique. Sur la figure 23, 4 protons anomres sont observs aux 4.983, 4.871, 4.582 et 4.516. La dfinition de la valeur de lindice SOACS est obtenue simplement par laddition de ces quatre valeurs pour obtenir 18.952. Pour lindice SOACS-ol il suffit dadditionner la valeur du proton 2 du rsidu de N-Acetyl-galactosaminitol identifi ici 4.396, lindice SOACS-ol est donc : 18.952 + 4.396 = 23.347. Ce
Dans certains cas, le proton anomre peut-tre reprsent sous forme dun doublet de doublet dans le cas dun 2-deoxy sucre ou lorsquil sagit dun sucre 1-phosphate et quil existe une constante de couplage vicinale entre le phosphore et le proton anomre. Enfin il est noter quaucun de ces deux cas na encore t observ dans les O-glycannes de type mucine 14 Il se peut dans certains cas que deux protons anomres rsonnent, par pure concidence, au mme dplacement chimique.
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Rsonance Magntique Nuclaire 47 couple de valeurs est spcifique de cette molcule. Lune ou lautre (ou les deux) peut tre utilise comme requte dans la GB (Tab. 4, 5, 6 et GlycoBase). 7.2.1.2 Structures de O-glycannes sialyls Lacide sialique tant un ctose ne possde pas de proton anomre, toutefois il peut tre caractris sans ambigut par la lecture de son proton H3 axial. Ce proton quelque soit la nature de lacide sialique ou de son type de liaison rsonne systmatiquement entre 1.60 et 1.95 ppm. Ainsi partir de lexemple de la figure 24, lindice SOACS peut-tre calcul comme suit : IS = 5.406 + 5.237+4.893+4.701+1.682=22.009. Cette valeur peut-tre directement utilise comme requte dans la GB : http://glycobase.univ-lille1.fr/base/ La lecture de la valeur du proton H-2 du rsidu GalNAc-ol est dans ce cas trs hypothtique et ne peut-tre obtenue aprs la ralisation dun spectre homonuclaire deux dimensions.

Figure 24 : Spectre proton 1 dimension dun O-glycanne sialyl

7.2.1.3 Calcul des indices partir de spectres homonuclaires 2D La dtermination des indices dans ce cas est rendue beaucoup plus aise lorsquil y a superposition de signaux RMN. Evidemment, les spectres homonuclaires utiliss seront de type COSY90 ou TOCSY avec, pour ce dernier, un temps de mlange de lordre de 30ms. Dans ce cas la lecture des dplacements chimiques se fait sur laxe F2, de manire obtenir une meilleure dfinition des valeurs. Il est toutefois recommand de nutiliser que deux dcimales. Dans ce cas : IS : 5.38 + 4.68 + 4.61 + 4.60 + 4.59 + 4.47 = 28.33 IS-ol = 28.33 + 4.32 = 32.65

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Figure 25 : Dtails dun spectre COSY90 dun O-glycanne sulfat montrant les parties ncessaires au calcul de lindice SOACS.

7.2.1.4 Dfinition dune marge derreur Comme toute exprience, la spectroscopie de RMN peut tre soumise des erreurs exprimentales. Cest pourquoi, par principe, nous avons dcid le cas chant dutiliser une marge derreur qui peut-tre lapproximation de lexprimentateur. Nous avons dcid que lorsque la lecture des dplacements chimiques utiliss pour calculer le SOACS est faite sur un spectre proton une dimension, dutiliser une marge derreur de plus ou moins 0.002 ppm par unit monosaccharidique. Celle-ci peut-tre estime plus ou moins 0.005 ppm lorsque la lecture se fait sur un spectre 2 dimensions. Quoiquil en soit lutilisation de cette marge derreur nenlve en rien la pertinence de ces indices. IS/IS-ol : Nombre de dplacements chimiques () utiliss X 15 Ainsi pour les calculs faits prcdemment les indices incluant les marges derreurs peuvent tre utiliss de la manire suivante : IS : 6 => = 6 X 0.005 =+/- 0.03 28.30<IS<28.36 IS-ol : 7 => = 7 X 0.005 = +/- 0.035 32.615<IS-ol<32.685 Dans les tableaux 4,5 et 6 sont rpertoris les indices calculs pour des O-Glycannes de la littrature utilise.
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Au choix de lexprimentateur, nous proposons un 0.002 ppm pour la lecture des sur une 1D proton et 0.005 ppm pour une lecture sur un spectre 2D de type COSY ou TOCSY
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Tableau 4 : Classement des indices SOACS et SOACS-ol calculs pour les oligosaccharide-alditols isols de mucines oviducales damphibiens. rt : Rana temporaria (Florea 1997, Maes 1997), ra : Rana arvalis (Coppin 1999), xt : Xenopus tropicalis (Gurardel 2003), bv : Bufo viridis (Coppin 2002), rc : Rana clamitans (Delplace 2002), rr : Rana ridibunda (Mourad 2001), rd : Rana dalmatina (Florea 2002), rp : Rana palustris (Maes 1999) Nom Publi rt NIII-1a rt 100-4-a rt NIII-1b ra FNII-2 rt 200-3 rt NIII-2 rt 50-5-a Xt 10B rt 1 bv 10 Rt 50-4 ra FNII-4 rc D1 xt 5A rt 300-5 rd A-5 rtb 6 Ra 50-5 rt 200-7 rd N-4 rp N-2 rd N-3 ra FNII-3 rtb 4 rp 80-4a rd A-12A rd 3 rp 80-5 bv 8 rr 100-2 bv 9 rt 50-5-b rtb 13(1) ra 100-E rd A-4A rt 3 rd A-7A rc C1(D2) rd A-7B rr 200-I-2 rd A-6A xt 6 rtb 8 ra FNII-5 xt 5B rd A-6B rt 200-9 rtb 7 rt 200-8 rtb 9 ra FNII-6 ra 100-A rd A-3 IS 0,000 1,660 4,478 4,478 4,592 5,170 6,124 6,165 6,242 6,615 6,811 9,001 9,001 9,002 9,022 9,022 9,094 9,201 9,203 9,413 9,413 9,820 9,820 10,429 11,073 11,073 11,104 11,104 11,223 11,249 11,535 12,105 13,539 13,550 13,819 13,897 13,941 13,993 14,015 14,015 14,069 14,145 14,344 14,344 14,345 14,395 14,397 14,485 14,594 14,672 14,672 14,760 14,762 IS-ol 4,251 5,903 8,873 8,873 8,988 9,543 10,501 10,544 10,625 10,544 11,176 13,395 13,395 13,395 13,411 13,411 13,483 13,596 13,592 13,821 13,821 14,210 14,210 14,854 15,453 15,453 15,499 15,499 15,603 15,627 15,912 16,256 17,929 17,945 18,214 18,284 18,331 18,386 18,407 18,407 18,479 18,423 18,747 18,747 18,749 18,791 18,790 18,878 18,981 19,009 19,009 19,122 19,119 Nom Publi xt 5C rtb 14 rd A-19A xt 12A bv 11 rr 100-5 rd A-18 xt 9A rc C3 rc C2 rtb 13(4) rd A-8 ra 100-G rtb 12 rd A-4B ra 100-H rd A12-B ra 100-F rt 4 ra 100-D ra 50-10 rr 100-7 rd A-7C rr 200-II-6 rd N-8A rt 100-4b xt 8 xt 10A rc D3 rtb 10 rr N-II-6d rd N8-B xt 7 rd 4 bv 12 xt 12B rc C7 rc C5-3 rc C5-1 rc C5-4 ra 100-J bv 1 rr 100-10 ra 50-14B rd A-12C rt 5 rd A-15A rt 100-8 rr 100-9 rt 6 rt 2 rc D5(C2) rt 50-7b IS 15,289 15,595 15,784 15,846 16,378 16,381 16,459 18,511 18,570 18,737 18,879 18,952 18,963 18,994 19,169 19,244 19,276 19,276 19,286 19,320 19,374 19,381 19,393 19,393 19,650 19,673 19,809 19,863 19,956 20,010 20,087 20,338 20,431 21,994 21,994 22,126 23,161 23,238 23,298 23,476 23,833 23,856 23,909 23,909 24,018 24,130 24,223 24,233 24,287 24,421 24,435 24,493 24,557 IS-ol 19,59 23,93 3 20,17 6 20,09 9 20,70 4 20,76 3 20,82 8 22,90 2 22,96 9 23,12 1 23,27 7 23,34 7 23,35 5 23,39 3 23,56 4 23,61 5 23,64 5 23,64 5 23,67 5 23,67 0 23,72 8 23,74 1 23,78 5 23,78 5 23,98 9 24,03 2 24,09 9 24,16 0 24,34 6 24,38 8 24,45 0 24,62 4 24,73 1 26,23 1 26,23 261 ,42 272 ,62 2 27,62 3 27,68 0 27,85 9 28,15 6 28,23 7 28,25 4 28,25 4 28,36 3 28,51 8 28,55 4 28,56 8 28,65 0 28,75 3 28,78 3 28,88 3 28,95 4 Nom Publi rr N-II-8d rr 200-I-7 rt 50-7a rd A15-B xt 9B rt 100-6 rr N-II-10c bv 2 bv 13 rc C10-1 rc C8-1 rc C6 ra 100-M bv 3 rd A-19B rr 100-12 rr 400-II-4 rr 400-II-3 bv 4 rr 100-11 bv 5 ra 100-L rt 7 rd A-20 rtb 15(6) rc C10-4 rr 100-13 rr 200-I-10 rr 400-II-5 rr 400-II-6 rc C10-2 rc C10-3A ra 50-14A rc C10-3B rd A-21 rt 300-11 bv 6 rc C8-2 bv 14 rr 400-II-7 rr 200-I-8 bv 7 rc C11-4 bv 15 rr 200-I-9 rc C12 rc C14 rc C15-6 rc C16 rc C17-3 rc B1(C18) rc B2(C19) IS 24,621 24,663 24,770 24,892 24,967 25,156 25,794 25,816 26,582 27,727 27,825 28,242 28,339 28,626 28,827 28,879 28,895 28,976 29,231 29,288 29,429 29,508 29,592 29,778 30,522 32,816 33,811 33,871 33,888 33,896 33,954 33,979 33,986 33,987 34,050 34,326 34,448 34,924 36,184 38,488 38,904 38,976 39,188 41,390 43,252 44,434 49,237 49,375 53,744 58,143 68,452 68,455 IS-ol 28,988 29,017 29,114 29,223 29,270 29,476 30,096 30,197 30,818 32,339 32,212 32,628 32,667 33,027 33,160 33,234 33,246 33,340 33,231 33,651 33,662 33,732 33,924 34,050 34,908 37,264 38,176 38,236 38,232 38,257 38,488 38,369 38,198 38,377 39,039 38,668 38,676 38,699 40,414 42,839 43,255 43,199 43,577 45,613 47,591 48,821 53,775 53,959 58,132 62,529 72,840 72,841

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Rsonance Magntique Nuclaire 50


Tableau 5 : Classification des oligosaccharide-alditols compils par Kamerling and Vliegenthart (1992) en fonctions de leurs indices SOACS croissants et SOACS-ol
Numro de la sequence 1 2 5 3 4 9 10 78 78A 11 11A 85 7 165 19 17 18 16 8 60 29 90 94 166 79 83 83A 96 86 25 133 13 12 21 24 61 35 38 34 37 66 87 80 98 105 134 112 81 92 135 89 95 91 84 109 97 22 IS no 4.478 4.553 4.604 5.103 6.169 6.305 6.347 6.364 6.790 6.807 8.033 9.006 9.007 9.048 9.086 9.115 9.141 9.143 9.394 9.840 10.796 10.812 10.871 11.225 11.551 11.571 12.666 12.915 13.495 13.583 13.615 13.631 13.636 13.636 13.932 14.213 14.344 14.420 14.446 15.288 15.320 15.354 15.359 15.364 15.446 15.503 15.516 15.919 16.043 16.057 16.129 16.159 17.009 17.224 17.766 18.119 IS-ol 4.252 8.873 8.795 8.891 9.498 10.544 10.565 10.737 10.753 11.183 11.207 12.411 13.401 13.394 13.291 13.376 13.404 13.541 13.423 13.798 14.239 15.056 15.073 15.258 15.605 15.932 15.957 16.928 17.725 17.889 17.968 18.016 18.027 17.918 18.039 18.337 18.485 18.745 18.724 18.713 19.592 19.700 19.752 19.751 19.754 19.830 19.782 19.910 20.166 20.293 20.332 20.366 20.422 21.300 21.611 22.015 22.402 Numro de la squence 23 20 76 167 41 49 30 77 75 39 40 48 36 72 67 110 114 116 117 101 88 107 119 113 82 122 99 106 93 123 141 27 26 28 15 14 62 57 51 52 168 63 33 43 124 50 31 69 42 68 138 140 111 115 120 118 102 IS 18.132 18.195 18.398 18.405 18.580 18.738 18.757 18.760 18.824 18.833 18.843 18.99 19.507 19.746 19.830 19.977 19.981 19.989 20.004 20.194 20.436 20.443 20.506 20.578 20.594 20.598 20.711 20.714 21.216 22.303 22.565 22.634 22.636 22.658 22.695 22.790 23.369 23.464 23.466 23.466 23.727 23.775 23.872 23.922 24.021 24.026 24.063 24.112 24.189 24.237 24.517 24.530 25.053 25.069 25.132 25.334 25.550 IS-ol 22.419 22.437 22.79 22.806 22.973 23.018 23.154 23.15 23.215 23.238 23.241 23.272 23.773 24.026 24.139 24.362 24.274 24.275 24.282 24.586 24.815 24.830 24.886 24.856 24.989 24.974 25.111 25.102 25.466 26.687 26.954 27.040 27.033 27.050 27.084 27.191 27.774 27.728 27.749 27.736 28.135 28.181 28.272 28.323 28.405 28.308 28.459 28.504 28.589 28.629 28.902 28.916 29.440 29.350 29.508 29.590 29.949 Numro de la squence 108 125 100 126 137 45 46 136 54 58 53 127 44 70 139 121 103 104 143 142 146 47 151 162 164 147 157 154 74 159 32 145 59 56 55 71 144 149 65 64 152 153 160 150 148 155 158 163 161 156 73 IS 25.745 25.758 25.775 27.466 27.694 27.714 27.759 27.903 28.507 28.814 28.822 29.180 29.226 29.474 29.775 30.207 31.000 31.091 31.697 31.712 32.541 32.632 32.669 32.884 32.960 33.035 33.148 33.158 33.214 33.318 33.442 33.594 33.853 33.865 33.877 34.952 36.968 37.522 37.523 37.547 37.738 37.743 37.840 38.235 38.265 38.463 38.509 38.842 38.912 43.666 43.827 IS-ol 30.132 30.142 30.174 31.849 32.082 32.109 32.156 32.302 32.777 33.074 33.102 33.569 33.627 33.876 34.159 34.584 35.294 35.415 36.084 36.099 36.825 37.024 36.888 37.277 37.356 37.317 36.532 37.437 37.614 37.705 37.828 37.982 38.143 38.135 38.142 39.222 41.357 41.804 41.915 41.939 41.997 42.022 42.235 42.636 42.561 42.742 42.908 43.243 43.182 48.068 48.229

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 51


Tableau 6 : Rcapitulatif des structures compiles dans la rfrence Kamerling 1992. LINUCS ID, correspond la numrotation de la Sweet-DB. La symbolique est rsume tableau 1 (&4).
N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS n.d.

Maxi

LINUCS ID 1561

Mini 4,250 8,869 8,887 9,494 8,791 5,941 5,970 13,395 13,417 10,538 10,562 10,559 -0,006 11,177 11,201 18,019 18,008

IS-ol 4,252 8,873 8,891 9,498 8,795 5,945 5,974 13,401 13,423 10,544 10,568 10,565 0,000 11,183 11,207 18,027 18,016

Maxi 4,254 8,877 8,895 9,502 8,799 5,949 5,978 13,407 13,429 10,550 10,574 10,571 0,006 11,189 11,213 18,035 18,024

1 2 3 4 5 6 6A 7 8 9 9A 10 10A 11 11A 12 13 4,476 4,602 5,101 4,551 1,698 1,719 9,002 9,139 6,162 6,184 6,301 -0,004 6,786 6,803 13,625 13,609

4,478 4,604 5,103 4,553 1,700 1,721 9,006 9,143 6,166 6,188 6,305 0,000 6,790 6,807 13,631 13,615

4,480 4,606 5,105 4,555 1,702 1,723 9,010 9,147 6,170 6,192 6,309 0,004 6,794 6,811 13,637 13,621

375 630 632 631 636 660 634 633 26663 2108 2505 1825 13822 1824 4281 4279

14

22,780

22,790

22,800

12295

27,179

27,191

27,203

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 52


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

15

22,685

22,695

22,705

12296

27,072

27,084

27,096

16

9,137

9,141

9,145

8943

13,535

13,541

13,547

17

9,082

9,086

9,090

685

13,370

13,376

13,382

18

9,111

9,115

9,119

3668

13,398

13,404

13,410

19

9,044

9,048

9,052

3171

13,285

13,291

13,297

20

18,187

18,195

18,203

12298

22,427

22,437

22,447

21

13,630

13,636

13,642

4282

17,910

17,918

17,926

22

18,111

18,119

18,127

4290

22,392

22,402

22,412

23

18,124

18,132

18,140

4289

22,409

22,419

22,429

24

13,630

13,636

13,642

unreferenced

18,031

18,039

18,047

25

13,489

13,495

13,501

647

17,881

17,889

17,897

26

22,626

22,636

22,646

7045

27,021

27,033

27,045

27

22,624

22,634

22,644

12297

27,028

27,040

27,052

28

22,648

22,658

22,668

7046

27,038

27,050

27,062

29

9,836

9,840

9,844

80

14,233

14,239

14,245

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 53


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID 4285

Mini

IS-ol

Maxi

30

18,749

18,757

18,765

23,144

23,154

23,164

31

24,053

24,063

24,073

6679

28,457

28,469

28,481

32

33,418

33,432

33,446

12179

37,812

37,828

37,844

33

23,862

23,872

23,882

5022

28,260

28,272

28,284

34

14,436

14,442

14,448

1550

18,716

18,724

18,732

35

14,207

14,213

14,219

4278

18,477

18,485

18,493

36

19,499

19,507

19,515

4284

23,763

23,773

23,783

37

14,440

14,446

14,452

1549

18,705

18,713

18,721

38

14,338

14,344

14,350

637

18,737

18,745

18,753

39

18,825

18,833

18,841

1554

23,228

23,238

23,248

40

18,835

18,843

18,851

1553

23,231

23,241

23,251

41

18,572

18,580

18,588

4286

22,963

22,973

22,983

42

24,179

24,189

24,199

377

28,577

28,589

28,601

43

23,912

23,922

23,932

8946

28,311

28,323

28,335

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 54


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

44

29,214

29,226

29,238

1667

33,613

33,627

33,641

45

27,702

27,714

27,726

5009

32,095

32,109

32,123

46

27,747

27,759

27,771

unreferenced

32,142

32,156

32,170

47

37,927

37,943

37,959

unreferenced

42,317

42,335

42,353

48

18,982

18,990

18,998

8948

23,262

23,272

23,282

49

18,730

18,738

18,746

4288

23,008

23,018

23,028

50

24,016

24,026

24,036

8949

28,296

28,308

28,320

51*

23,456

23,466

23,476

8950

27,737

27,749

27,761

52*

23,456

23,466

23,476

8951

27,724

27,736

27,748

53

28,810

28,822

28,834

8952

33,088

33,102

33,116

54

28,495

28,507

28,519

8954

32,763

32,777

32,791

55

33,863

33,877

33,891

8953

38,126

38,142

38,158

56

33,851

33,865

33,879

12363

38,119

38,135

38,151

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 55


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

57

23,454

23,464

23,474

4296

27,716

27,728

27,740

58

28,802

28,814

28,826

8955

33,060

33,074

33,088

59

33,839

33,853

33,867

8956

38,127

38,143

38,159

60

9,390

9,394

9,398

376

13,792

13,798

13,804

61

13,926

13,932

13,938

4979

18,329

18,337

18,345

62

23,359

23,369

23,379

380

27,762

27,774

27,786

63

23,765

23,775

23,785

379

28,169

28,181

28,193

64

37,531

37,547

37,563

12181

41,921

41,939

41,957

65

37,507

37,523

37,539

12180

41,897

41,915

41,933

66

15,282

15,288

15,294

639

19,584

19,592

19,600

67

19,822

19,830

19,838

1674

24,129

24,139

24,149

68

24,317

24,327

24,337

1675

28,617

28,629

28,641

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 56


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

69

24,102

24,112

24,122

1673

28,492

28,504

28,516

70

29,462

29,474

29,486

12558

33,862

33,876

33,890

71

34,938

34,952

34,966

1678

39,206

39,222

39,238

72

19,738

19,746

19,754

1676

24,016

24,026

24,036

73

39,099

39,117

39,135

1679

43,499

43,519

43,539

74

33,200

33,214

33,228

1677

37,598

37,614

37,630

75* (23C)

18,816

18,824

18,832

3896

23,205

23,215

23,225

76* (23C)

18,390

18,398

18,406

3917

22,780

22,790

22,800

77

0,000

0,000

undetermined

0,000

0,000

78

6,343

6,347

6,351

696

10,731

10,737

10,743

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 57


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID 3622

Mini

IS-ol

Maxi

78A

6,360

6,364

6,368

10,747

10,753

10,759

79

11,219

11,225

11,231

12269

15,597

15,605

15,613

80

15,346

15,354

15,362

12345

19,742

19,752

19,762

81

15,508

15,516

15,524

12383

19,900

19,910

19,920

82

20,584

20,594

20,604

12340

24,977

24,989

25,001

83

11,545

11,551

11,557

9026

15,928

15,932

15,936

83A

11,565

11,571

11,577

3141

15,953

15,957

15,961

84

17,001

17,009

17,017

3142

21,290

21,300

21,310

85

8,027

8,033

8,039

697

12,403

12,411

12,419

86

12,907

12,915

12,923

3364

12,265

12,275

12,285

87

15,312

15,320

15,328

12385

19,690

19,700

19,710

88

20,426

20,436

20,446

13825

24,803

24,815

24,827

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 58


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

89

16,049

16,057

16,065

12338

20,322

20,332

20,342

90

10,790

10,796

10,802

4300

15,048

15,056

15,064

91

16,151

16,159

16,167

3455

20,412

20,422

20,432

92

15,911

15,919

15,927

12344

20,156

20,166

20,176

93

21,206

21,216

21,226

12386

25,454

25,466

25,478

94

10,806

10,812

10,818

4299

15,065

15,073

15,081

95

16,121

16,129

16,137

12349

20,356

20,366

20,376

96

12,658

12,666

12,674

12407

16,918

16,928

16,938

97

17,756

17,766

17,776

12408

22,003

22,015

22,027

98

15,351

15,359

15,367

5249

19,741

19,751

19,761

99

20,701

20,711

20,721

12384

25,099

25,111

25,123

100

25,763

25,775

25,787

12388

30,160

30,174

30,188

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 59


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID 7886

Mini

IS-ol

Maxi

101

20,184

20,194

20,204

24,574

24,586

24,598

102

25,538

25,550

25,562

16547

29,935

29,949

29,963

103

30,986

31,000

31,014

16548

35,278

35,294

35,310

104

31,077

31,091

31,105

16549

35,399

35,415

35,431

105

15,356

15,364

15,372

4297

19,744

19,754

19,764

106

20,704

20,714

20,724

12285

25,090

25,102

25,114

107

20,433

20,443

20,453

4298

24,818

24,830

24,842

108

25,733

25,745

25,757

12286

30,118

30,132

30,146

109

17,214

17,224

17,234

1826

21,599

21,611

21,623

110

19,967

19,977

19,987

5250

24,350

24,362

24,374

111

25,041

25,053

25,065

5253

29,426

29,440

29,454

112

15,495

15,503

15,511

12339

19,772

19,782

19,792

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 60


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID 12341

Mini

IS-ol

Maxi

113

20,568

20,578

20,588

24,844

24,856

24,868

114

19,971

19,981

19,991

12346

24,262

24,274

24,286

115 (22C)

25,057

25,069

25,081

12342

29,336

29,350

29,364

116

19,979

19,989

19,999

12343

24,263

24,275

24,287

117

19,994

20,004

20,014

12348

24,270

24,282

24,294

118

25,322

25,334

25,346

12347

29,576

29,590

29,604

119

20,496

20,506

20,516

5251

24,874

24,886

24,898

120

25,120

25,132

25,144

5254

29,494

29,508

29,522

121

30,193

30,207

30,221

5255

34,568

34,584

34,600

122

20,588

20,598

20,608

3310

24,962

24,974

24,986

123

22,291

22,303

22,315

3311

26,673

26,687

26,701

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 61


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

124

24,007

24,021

24,035

3923

28,389

28,405

28,421

125

25,742

25,758

25,774

3919

30,124

30,142

30,160

126

27,448

27,466

27,484

3920

31,829

31,849

31,869

127

29,160

29,180

29,200

3922

33,547

33,569

33,591

128 (60C)

20,501

20,511

20,521

3911

0,000

0,000

129

0,000

0,000

3912

0,000

0,000

130

0,000

0,000

3913

0,000

0,000

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 62


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

131

0,000

0,000

3914

0,000

0,000

132 (60C)

22,118

22,130

22,142

unreferenced

0,000

0,000

133

13,577

13,583

13,589

3460

17,960

17,968

17,976

134

15,438

15,446

15,454

3461

19,820

19,830

19,840

135

16,035

16,043

16,051

12406

20,283

20,293

20,303

136

27,891

27,903

27,915

12421

32,288

32,302

32,316

137

27,682

27,694

27,706

12419

32,068

32,082

32,096

138

24,505

24,517

24,529

12409

28,888

28,902

28,916

139

29,761

29,775

29,789

12411

34,143

34,159

34,175

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 63


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

140

24,518

24,530

24,542

12410

28,902

28,916

28,930

141

22,555

22,565

22,575

648

26,942

26,954

26,966

142

31,698

31,712

31,726

12423

36,083

36,099

36,115

143

31,683

31,697

31,711

12424

36,068

36,084

36,100

144

36,952

36,968

36,984

12420

41,339

41,357

41,375

145

33,578

33,594

33,610

12412

37,964

37,982

38,000

146

32,527

32,541

32,555

12498

36,809

36,825

36,841

147

33,021

33,035

33,049

12497

37,301

37,317

37,333

148

38,249

38,265

38,281

12505

42,543

42,561

42,579

149

37,504

37,522

37,540

12506

41,784

41,804

41,824

150

38,219

38,235

38,251

12502

42,618

42,636

42,654

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 64


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

151(15)

32,655

32,669

32,683

12500

36,872

36,888

36,904

152

37,722

37,738

37,754

12501

41,979

41,997

42,015

153

37,727

37,743

37,759

12503

42,004

42,022

42,040

154

33,144

33,158

33,172

12496

37,421

37,437

37,453

155

38,447

38,463

38,479

12499

42,724

42,742

42,760

156

43,648

43,666

43,684

12504

48,048

48,068

48,088

157

33,134

33,148

33,162

12508

37,516

37,532

37,548

158

38,493

38,509

38,525

12511

42,890

42,908

42,926

159

33,304

33,318

33,332

12509

37,689

37,705

37,721

160

37,824

37,840

37,856

12513

42,217

42,235

42,253

161

38,896

38,912

38,928

12510

43,164

43,182

43,200

162

32,870

32,884

32,898

12541

32,261

32,277

32,293

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 65


N Ref (Kamerling 1992)

Schma

Mini

IS

Maxi

LINUCS ID

Mini

IS-ol

Maxi

163

38,826

38,842

38,858

12512

43,225

43,243

43,261

164

32,946

32,960

32,974

12507

37,340

37,356

37,372

165

9,003

9,007

9,011

3459

13,388

13,394

13,400

166

10,865

10,871

10,877

3458

15,250

15,258

15,266

167

18,397

18,405

18,413

2540

22,796

22,806

22,816

168

23,717

23,727

23,737

378

28,123

28,135

28,147

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 66 7.2.2 N-GLYCANNES Lapplication de ce SOACS aux N-Glycannes est quasiment identique lexception de quelques paramtres. En effet, les N-Glycannes sont librs de diffrentes manires, enzymatiques ou chimiques, et leur extrmit terminale rductrice peut se trouver sous diffrentes formes. Ces N-Glycannes peuvent tre sous forme de glycopeptides16, de Glyco-asparagine17, peuvent tre rducteurs avec du chitobiose18 ou navoir quun seul rsidu de N-acetyl glucosamine en position terminale rductrice. Il est possible dans ces deux dernier cas de rduire le N-Glycannes pour obtenir un rsidu de GlcNAc-ol. De facto, lindice SOACS-ol nest pas dfini pour ce type de glycanne. De plus le rsidu Mannosyl substituant le chitobiose rsonne systmatiquement, dans les conditions standard daccumulation (D2O, pD 7) avec les protons du solvant rsiduel, il est par consquent rarement visible sur un spectre une dimension. Ainsi, seul ce rsidu nest pas pris en compte pour le calcul de lIS. Enfin, il est ncessaire dintgrer systmatiquement les protons observer pour valuer le nombre de protons prsents dans la molcule. Nous recommandons lorsque cela est possible denregistrer un spectre deux dimensions.

Figure 25 : Spectre une dimension dun N-glycanne oligomannosyl classique :

Seule la partie ou rsonnent les protons anomres est pris en compte. Le calcul de lIS seffectue donc de la mme manire que pour les O-Glycannes :

16 17

Le N-glycanne est alors li un peptide par liaison N-glycosidique sur une Asn Le N-glycanne est N-li sur un seul rsidu dAsn 18 chitobiose : -D-GlcpNAc-(1-4)-/-D-GlcpNAc
Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 67

Figure 26 : Partie anomre dun spectre de N-glycanne oligomannosyl enregistr 300K19

Dans ce cas : IS = 5.403 + 5.333 + 5.305 + 5.071 + 5.059 + 5.052 + 4.907 + 4.871 + 4.608 = 45.609 La marge derreur de +/- 9 X 0.002 =0.018 Pour les N-glycannes sialyls, tout comme pour les O-glycannes, le proton H3 axial de lacide (ou des) est pris en compte.

7.3 MOLECULES DE CHIMIE ORGANIQUE


Lapproche pour ce type de molcule est un peu diffrente. En effet, ces molcules sont en gnral tudies en RMN du carbone20 une dimension compte tenu de la quantit de matriel disponible. De facto, lindice calcul seffectuera sur la base des dplacements chimiques carbones. La dfinition spectrale permet ainsi dobtenir tous les des carbones de la molcule. Lindice calcul correspond dans ce cas laddition de tous ces . Ceci nous permet de dfinir un autre indice le SACCS acronyme de Sum of All Carbone Chemical Shifts . Ainsi nous avons partir de la littrature (Leroy et al 1972) calcul les indices SACCS dun certain nombre de molcules, ceux-ci sont rpertoris dans la table 7.

19 20

Ce glycanne nest pas encore rpertori dans la glycobase Rappel, seuls les isotopes 13C sont observables en RMN
Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 68


Table 7 : Classification (partielle) des structures de la rfrence Leroy (1972) en fonction de leur Indice SACCS. Malgr lexistence de SACCS identiques ou trs proches, nous remarquons que les molcules sont trs diffrentes, la simple comparaison de leur spectre suffit les discriminer.
Name Solvent N ref Indice SACCS chemical shifts

ethyl iodide 1-iodopropane ethylthiocyanate diethylamine dimethyl methylphosphonate tetrahydrothiophene ethanesulfonyl chloride N-nitrosodimethylamine pyrrolidine diethylsulfite tetramethylene sulfone 1,1,2-tribromomethane nitroethane ethylsulfate sym-dimethylethylenediamine 2-mercaptoethanol tetrahydrofuran 1-bromo-2-methylpropane 2-bromo-2-methylpropane 1,5-diaminopentane tert-butyl alcohol n-propanol 2-chloro-2-methylpropane piperidine 1,2,3-trichloropropane isopropylmethylamine 1,2-dibromopropane propylene oxide acetonitrile isobutyl alcohol 1,2-butanedithiol tetrahydropyran 1,1,2-trichloroethane 1-bromo-3-methylbutane 2-bromobutane 1,2-dichloropropane 1,2-dibromobutane 2-chlorobutane 1,2-dimethoxyethane 1-Chloro-3-methylbutane sec-butyl alcohol 1,2-dibromo-2-methylpropane propionitrile 1-chloropentane 2-amino-2-methyl-1-propanol N-methyl-sec-butylamine isopentyl alcohol 2-methylaminoethanol 2-chloro-2-methylbutane propylene glycol 2-amino-1-butanol dimethylglyoxime isobutyronitrile N,N-dimethyl-1,3-propanediamine choline chloride 3-chloro-1,2-propanediol 1,3-butanediol cyclobutylnitrile acetoneoxime acetic acid succinic anhydride

CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 DMSO CDCl3 dioxane water water CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 DMSO

9 33 25 98 42 78 8 11 84 94 77 2 10 13 101 12 73 79 81 144 88 39 82 133 23 97 26 29 4 90 95 124 3 129 80 27 69 83 93 131 89 70 24 132 99 141 139 41 130 40 100 71 66 143 142 32 91 56 35 7 49

19,3 51,3 55,9 59,5 61,9 62,6 69,3 72,0 72,8 73,7 74,3 79,0 83,0 84,1 88,4 91,1 93,7 93,8 98,5 100,1 100,1 100,8 101,2 101,6 104,3 106,9 107,4 113,0 119,0 119,1 119,2 120,0 120,5 122,0 125,4 127,7 129,7 129,9 130,9 132,4 133,9 138,1 142,2 142,6 148,4 149,0 149,8 150,6 151,3 154,6 157,0 162,3 163,4 176,2 179,7 182,3 190,3 191,4 191,6 198,7 201,5

-1,2 9,2 15,4 15,4 9,8 31,2 9,1 32,1 25,7 15,4 22,8 38,7 12,3 14,5 36,4 27,1 25,8 20,9 36,4 24,2 31,2 10,5 34,4 25,9 45,3 22,5 24,1 18,1 1,3 18,9 11,4 24,2 50,1 21,8 12,1 22,4 10,9 11,1 58,6 22,0 10,0 31,8 10,6 13,9 26,7 10,2 22,6 36,0 9,4 18,7 10,4 9,2 19,8 32,2 54,8 46,8 23,4 19,9 14,9 20,6 28,6

20,5 15,3 28,6 44,1 52,1 31,4 60,2 39,9 47,1 58,3 51,5 40,3 70,7 69,6 52,0 64,0 67,9 30,7 62,1 33,8 68,9 26,3 66,8 27,8 59,0 33,9 37,6 47,3 117,7 30,8 29,4 27,2 70,4 26,8 26,0 49,5 29,0 25,0 72,3 25,7 22,7 44,6 10,8 22,1 50,6 19,3 24,8 54,3 32,0 67,7 26,5 153,1 19,9 40,8 56,6 63,5 40,6 22,0 21,5 178,1 172,9

26,8 11,9

42,2 42,1 64,0 47,9 50,5 45,7 47,6 69,4 33,2 68,6 31,7 34,2 55,8 35,5 33,7 41,6 32,0 61,7 120,8 29,2 71,1 56,4 41,7 60,3 38,8 68,2 54,3 123,7 45,4 68,3 72,0 60,0 27,1 155,2

45,2

41,7 53,1 54,3 60,1 43,1 69,2

32,5 29,3 60,7 71,1 65,8

44,9 33,8

57,8

66,3 122,4

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Rsonance Magntique Nuclaire 69


2,5-dihydrofuran 1-amino-3-methoxypropane tetramethylurea 2-propyne-1-ol 2-butyne-1-ol succinimide ethylene glycol monoethyl ether alpha-methyltetrahydrofuran pyrrole thioacetic acid beta-methyltetrahydrofuran dimethylformamide acetaldehyde ethylcarbamate 3-mercaptopropionic acid acetone tetramethyliuorea 2,5-dibromothiophene 2,3-dibromopropionic acid alanine L-tartaric acid 3-methoxy-1-butanol hexachlorobutadiene thiophene furan 1-bromo-1-propene (cis) 3-pentanone 3-hydroxy-3-methylbutyne-1 1-bromo-1-propene (trans) 1,3,5-tribromobenzene ethyl methylcarbamate 2-bromobutyric acid N,N-dimethyl acetamide cysteine sodium diethyldithiocarbamate 2-pyrrolidone butyraldehyde Trifluoroacetic acid isopropylacetate cyclopentanone methyl ethyl ketone 3-ethoxypropionitrile allyl bromide maleic acid hydrazide betaine hydrochloride 4-butyrolactone 3-chloro-1-propene methyl isopropyl ketone maleic anhydride methylene cyclobutane 2-methyl-2-butene trimethylvinylammonium bromide 3-hydroxy-1-propene propylene carbonate methionine acetoin ethyl trichloroacetate threonine proline hexachlorocyclopentadiene ethyl trifluoroacetate 2-chloroacrylonitrile acrylonitrile beta-xylose trichloroacetylisocyanate crotononitrile (cis) alpha-xylose 2,3-butandione monooxime crotononitrile (trans) methoxyethyl thioglyconate CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane dioxane water CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 water water CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane water water CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 DMSO water CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane water CDCl3 CDCl3 water CDCl3 CDCl3 water water dioxane CDCl3 CDCl3 dioxane water CDCl3 dioxane water CDCl3 dioxane CDCl3 59 96 137 19 58 55 92 123 54 6 125 34 5 37 31 28 138 44 18 36 64 140 43 50 48 20 122 112 20 145 86 65 85 38 120 67 74 1 126 113 75 116 21 47 134 60 22 121 45 110 119 136 30 62 135 76 51 87 117 102 52 15 16 128 14 53 128 68 53 127 201,6 202,5 203,9 206,8 212,6 213,9 215,0 222,9 225,8 227,1 228,9 229,7 230,4 233,2 235,4 236,6 236,9 241,5 242,8 245,2 248,1 248,7 250,0 251,6 252,7 253,6 254,7 254,9 255,5 256,1 260,6 262,7 262,9 263,4 268,2 272,9 277,6 278,0 279,6 279,7 281,1 283,6 285,6 286,5 287,0 296,4 297,8 298,7 300,9 304,1 306,3 311,1 315,8 319,0 319,0 328,6 330,1 334,5 338,8 342,8 351,9 356,9 363,1 370,9 381,2 384,4 384,8 388,8 389,2 390,3 75,3 33,6 38,5 50,0 3,2 30,3 15,0 21,0 107,9 32,6 17,9 31,1 30,7 14,5 19,3 30,6 43,0 111,4 28,8 17,2 72,8 18,9 123,6 124,9 109,7 15,3 7,9 31,3 18,1 123,2 14,7 11,7 21,3 28,2 12,3 20,8 13,8 115,0 20,8 23,5 8,0 14,9 32,6 130,3 54,8 22,2 45,1 18,1 136,6 16,8 13,3 55,3 63,4 19,1 15,0 19,4 13,7 20,0 24,6 81,5 13,8 110,8 108,1 61,8 92,4 17,3 66,0 8,0 18,8 26,3 126,3 39,6 165,4 73,8 50,5 183,6 61,5 26,2 117,9 194,5 34,0 36,2 199,7 60,9 38,2 206,0 193,9 130,1 40,4 51,5 175,3 39,1 126,4 126,7 143,0 108,9 35,4 64,0 104,7 132,9 27,4 28,1 34,5 58,4 49,5 30,3 16,0 163,0 21,8 38,0 29,0 18,9 118,8 156,2 64,6 27,7 118,1 27,3 164,3 32,1 17,1 112,7 114,9 70,8 30,6 24,9 65,4 62,7 29,8 128,5 64,7 114,4 117,5 70,2 130,2 100,9 70,0 25,0 101,2 58,7 58,4 83,0 78,9 66,5 33,5 70,9

80,0 72,0 67,2

75,0

34,7 162,4 157,8 177,9

67,6

74,7

173,6 176,5 55,8 59,6 75,3

129,4 211,4 70,0 132,7 60,7 47,0 37,5 176,8 206,4 42,4 45,9 67,4 218,2 36,5 65,1 134,2 167,6 68,6 134,6 41,5 104,8 25,5 143,1 137,5 73,9 34,6 73,1 89,9 70,4 47,0 132,8 115,3 131,7 137,5 72,3 158,6 116,0 74,8 157,0 117,6 64,4

89,6

157,8 175,9 169,6

179,4 201,9 169,6 207,6 66,5

118,2

177,9 211,8 150,4 118,7

131,7

155,2 56,1 211,2 161,1 181,4 62,1 158,1

182,7

175,3

73,6 150,2 76,6 198,8 151,6 70,2

93,0

97,4

170,7

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Rsonance Magntique Nuclaire 70


o-dichlorobenzene hydroxyproline pyridine thiazole vinyl acetate thiomalic acid N-Glyclyglycine monosodium glutamate methyl methacrylate crotonaldehyde 2-chlorothiophene m-dichlorobenzene 1,2,3-trichlorobenzenze 1-bromo-4-nitrobenzene 2-methylpyrazine acetyl acetone citraconic anhydride 3-chloro-6-methoxypyridazine 2-aminopyridine 2-pyridone furfural CDCl3 water CDCl3 CDCl3 dioxane water water water dioxane dioxane CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane 148 118 106 17 61 63 72 111 114 57 46 149 146 147 108 115 103 105 109 107 104 390,8 398,6 409,1 414,5 426,4 429,4 430,5 475,0 498,7 500,2 506,1 521,6 522,0 534,2 605,9 606,3 621,3 621,3 665,9 668,5 715,2 127,7 38,2 123,6 118,6 20,2 36,9 41,3 27,8 18,3 18,2 123,9 127,0 127,5 124,9 21,6 24,3 11,3 55,0 108,5 106,7 112,9 130,5 53,9 135,7 143,2 96,8 40,2 44,2 34,3 51,5 134,9 125,9 128,9 128,6 129,8 141,8 30,2 129,7 120,1 113,3 120,1 121,6 132,6 60,7 149,8 152,7 141,8 175,3 167,9 55,5 124,7 153,7 126,4 130,6 131,6 132,5 143,8 58,2 149,5 130,8 137,5 134,8 148,7 70,9 174,9

167,6 177,0 177,1 175,4 136,9 193,4 129,9 135,1 134,3 147,0 144,7 100,3 164,3 151,0 147,7 141,6 153,8

182,0 167,3

154,0 191,4 166,5 164,4 158,9 165,3 178,2

201,9

7.4 CONCLUSION
Les indices SOACS, SOACS-ol et a priori SACCS sont des outils de recherches perfomants qui permettent, sur la base de lexprience RMN proton ou carbone, de retrouver aisment une molcule dj compile dans la GlycoBase21. Nous tenterons de convaincre les autres banques de donnes RMN dutiliser cette requte en plus de celles existantes. Enfin cette requte a t publie dans Carbohydrate Research (Maes et al 2008).
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21
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http://glycobase.univ-lille1.fr/base/
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Rsonance Magntique Nuclaire 71

8. CONCLUSION
Comme nous avons pu le voir, la R.M.N. est un outil particulirement intressant dans lanalyse structurale des oligosaccharide-alditols puisque ceux ci sont constitus majoritairement datomes possdant une rsonance. Cette technique est puissante par le fait quelle est suffisante pour une dtermination complte de la composition et de la structure de ces molcules biologiques. Bien que non destructive cette technique a ses limites. En effet les expriences, et notamment les expriences dobservation du carbone 13C, demandent une quantit non ngligeable de matriel qui nest pas toujours disponible. Nanmoins lavnement de la nouvelle gnration des supra-conducteurs et la mise au point de bobines inductrices de champs magntiques de plus en plus puissants (jusqu' 1 GHz) ainsi que de squences dimpulsions de plus en plus complexes permettent daugmenter la sensibilit de cette technique. La R.M.N. est une technique parfaitement complmentaire de la spectromtrie de masse (et vice et versa). Leur combinaison permet trs souvent dobtenir les rsultats souhaits. Enfin ce livret a t labor partir de revues gnrales et de sites internet. Nous conseillons vivement aux lecteurs la consultation de ces ouvrages pour de plus amples informations.
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Rsonance Magntique Nuclaire 72

9. BIBLIOGRAPHIE
Sites Web dintrt : Equipe Biodiversit (Guerardel Y.) : http://glycobase.univ-lille1.fr/ GlycoBase : http://glycobase.univ-lille1.fr/base/ SWEET-DB : http://www.glycosciences.de/sweetdb/ BCSDB : http://www.glyco.ac.ru/bcsdb/start.shtml Sugabase : http://www.boc.chem.uu.nl/sugabase/sugabase.html Queens University : http://web.chem.queensu.ca/FACILITIES/NMR/nmr/index.htm USTL : http://www.univlille1.fr/lcom/RMN2D/index1.htm#resum2D_us/index_us.htm
HU UH HU UH HU UH HU UH HU UH HU UH HU UH

Benn R. and Gnther H. (1983) Modern pulse Methods in High-Resolution NMR Spectroscopy, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 22, 350-380 Bria M. and Watkin P. (1997) La spectroscopie de rsonance magntique nuclaire deux dimensions ou laide la dtermination structurale des molcules organiques, Act. Chim., 2, 24-35 Capon C., Maes E., Michalski J. C., Leffleur H and Kim Y.S. (2001) Sd(a)antigen-like structures carried on core 3 are prominent features of glycans from the mucin of normal human descending colon. Biochem J., 358, 657-664. Capon C., Leroy Y., Wieruszeski J. M., Ricart G., Strecker G., Montreuil J. and Fournet B. (1989) Structures of O-glycosidically linked oligosaccharides isolated from human meconium glycoproteins, Eur. J. Biochem., 186, 583-590 Coppin A., Maes E. and Strecker G. (2002) Species-specificity of amphibia carbohydrate chains: The Bufo viridis case study, Carbohydr. Res., 337, 121-132 Coppin A, Maes E, Flahaut C, Coddeville B, Strecker G (1999). Acquisition of species-specific O-linked carbohydrate chains from oviducal mucins in Rana arvalis. A case study, Eur J Biochem; 266,:370-82.
T T

Delplace F., Maes E., Lemoine J. and Strecker G. (2002) Species specificity of O-linked darbohydrate chains of the oviducal mucins in amphibians : Structural analysis of neutral oligosaccharide-alditols released by reductive elimination from the egg-jelly coats of Rana clamitans, Biochem. J., 363, 457-471 Derome A. E., Modern NMR techniques in high resolution NMR, Pergamon Press, 1987 Florea D., Maes E. and Strecker G. (1997) Primary structure of seven sulfated oligosaccharide-alditols released by reductive -elimination from oviducal mucins of Rana temporaria. Carbohydr. Res., 302, 179-189 Florea D, Maes E, Haddad M, Strecker G. (2002) Structural analysis of the oligosaccharide alditols released from the jelly coat of Rana dalmatina eggs by reductive beta-elimination., Biochimie, 84, 611-624 Fontaine M. D., Wieruszeski J. M., Plancke Y., Delplace F. and Strecker G. (1995) Structure of six 3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nonulosonic acid (Kdn) containing oligosaccharide-alditols released from oviduct secretions of Ambystoma maculatum. Characterization of the sequence fucosyl(1Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 73 2)[fucosyl(1-3)]fucosyl(1-4)3-deoxy-D-glycero-D-galactononulosonic Eur. J. Biochem., 231, 424-433 acid

Guerardel Y., Balanzino L., Maes E., Leroy Y., Coddeville B., Oriol R. and Strecker G. (2001) The nematode Caenorhabditis elegans synthetizes unusual O-linked glycans : identification of glucose-substituted mucin-type O-glycans and short chondroitin-like oligosaccharides. Biochem J., 357, 167-182. Guerardel Y., Kol O., Maes E., Lefebvre T., Boilly B. Davril M. and Strecker G. (2000) O-Glycan variability of egg-jelly mucins from Xenopus laevis characterization of four phenotypes that differ by their terminal glycosylation of their mucins. Biochem. J., 352, 449-463 Gurardel Y, Petit D, Madigou T, Guillet B, Maes E, Maftah A, Boujard D, Strecker G, Kol O. (2003) Identification of the blood group Lewis(a) determinant in the oviducal mucins of Xenopus tropicalis, FEBS Lett., 554,:330-6.
T T

Kamerling J. F.. and Vliegenthart J. F. G. (1992) In : Biological Magnetic Resonance (Berliner, L. J. and Reben J. Eds), Plenum Press, New-York and London, vol 10, pp 1-287 Klein A., Carnoy C., Wieruszeski J. M., Strecker G., Strang A. M., van Halbeek H., Roussel P. and Lamblin G. (1992) The broad diversity of neutral and sialylated oligosaccharides derived from human salivary mucins. Biochemistry, 31, 6152-6165 Koerner T.A.W., Prestegard J.H. and Yu R. K. (1987) Oligosaccharide structure by two-dimensional Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Methods in Enzymology, 138, 38-59 Lamblin G., Rhamoune H., Wieruszeski J. M., Lhermitte M., Strecker G. and Roussel P. (1991) Structure of two sulfated oligosaccharides from respiratory mucins of a patient suffering from cystic fibrosis, Biochem. J., 275, 199-206 McNaught AD (1997) Nomenclature of carbohydrates, Adv Carbohydr Chem Biochem., 52,43-177 Maes E., Florea D., Delplace F. Lemoine J., Plancke Y. and Strecker G. (1997) Structural analysis of the oligosaccharide-alditols released by reductive elimination from oviducal mucins of Rana temporaria. Glycoconjugate J., 14, 127-146 Maes E., Plancke Y., Delplace F. and Strecker G. (1995) Primary structure of acidic oligosaccharide-alditols from the egg jelly coats of Ambystoma tigrinum. Occurrence of the oligosaccharides with fucosyl(1-5)[fucosyl(1-4)] 3-deoxy-Dglycero-D-galactononulosonic acid and fucosyl(1-2)galactosyl(1-3)-Nacetylgalactosamine sequences, Eur. J. Biochem., 230, 146-156 Maes E., Wieruszeski J. M., Plancke Y. and Strecker G. (1995) Structure of three Kdn-containing oligosaccharide-alditols released from oviducal secretions of Ambystoma tigrinum : Characterization of the carbohydrate sequence Fuc(15)[Fuc(1-4)]Kdn(2-3/6), FEBS-Lett., 358, 205-211 Maes E, Bonachera F, Strecker G, Guerardel Y.(2008) SOACS index: an easy NMR-based query for glycan retrieval, Carbohydr Res, doi:10.1016/j.carres.2008.11.001
T T

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 74 Morelle W. and Strecker G. (1997) Structural analysis of hexa to dodecaoligosaccharide-alditols released by reductive -elimination from oviducal mucins of Bufo bufo. Glycobiology, 7, 1129-1151 Morelle W. and Strecker G. (1997) Structural analysis of the oligosaccharide-alditols released from the jelly coat of Rana utricularia eggs, Biochem. J., 321, 879-887 Morelle W. and Strecker G. (1997) Structural analysis of the oligosaccharide-alditols released by reductive -elimination from oviducal mucins of Bufo bufo : Characterization of the carbohydrate sequence Gal(13)GalNAc(1-3)[Fuc(1-2)]Gal., Glycobiology, 7, 777-790 Morelle W, Guytant R, Strecker G.(1998) Structural analysis of oligosaccharide-alditols released by reductive beta-elimination from oviducal mucins of Rana dalmatina., Carbohydr Res, 306:435-43.
T T

Mourad R, Morelle W, Neveu A, Strecker G.(2001) Diversity of O-linked glycosylation patterns between species. Characterization of 25 carbohydrate chains from oviducal mucins of Rana ridibunda., Eur J Biochem, 268,:1990-2003.
T T

Pierce-Cretel A., Decottignies J. P., Wieruszeski J. M., Strecker G., Montreuil J. and Spik G. (1989) Primary structure of twenty-three neutral and monosialylated oligosaccharides O-glycosidically linked to the human secretory immunoglobulin. A hinge region determined by a combination of permethylation analysis and 400 MHz 1H-NMR analysis, Eur. J. Biochem., 182, 457-476
P P

Plancke Y., Wieruszeski J. M., Alonso C., Boilly B. and Strecekr G. (1995) Structure of four acidic oligosaccharides from the jelly coat surrounding the egggs of Xenopus laevis. Eur. J. Biochem., 231, 434-439 Plancke Y., Wieruszeski J. M., Boilly B. and Strecker G. (1994) Primary structure of seven new acidic oligosaccharide-alditols from the egg jelly coats of Axolotl mexicanum and Pleurodeles waltl. Cienca e cultura, 46, 273-279 Sanders J.K.M. and Hunter B.K., Modern NMR spectroscopy. A guide for chemists, Oxford University Press, 1994 Strecker G. (1993) Analyse structurale des chanes glycanniques, Biofutur, Juillet-Aout, 46-52 Strecker G., Wieruszeski J. M., Cuvillier O., Michalski J. C. and Montreuil J. (With the technical assistance of Alonso C.) (1992) 1H- and 13C-NMR assignments for sialylated oligosaccharide-alditols related to mucins. Study of thirteen components from hen ovomucin and swallow nest mucin., Biochimie, 74, 39-42
P P P P

Strecker G., Wieruszeski J. M., Fontaine M. D., and Planke Y. (1994) Structure of the major neutral oligosaccharide-alditols released from the egg jelly coats of Ambystoma maculatum. Charcterization of the carbohydrate sequence GalNAc(1-4)[Fuc(1-3)]GlcNAc(1-3/6), Glycobiology, 4, 605-609 Strecker G., Wieruszeski J. M., Martel C. and Montreuil J., (1987) Structure of sulfated tetra and pentasaccharides obtained by alkaline borohydride degradation of Hen ovomucin. A fast atom bombardment-mass spectrometric and 1H-NMR analysis, Glycoconjugate J., 4, 329-337
P P

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 75 Strecker G., Wieruszeski J. M., Martel C. and Montreuil J., (1989) Complete 1H- and 13C-NMR assignments for two sulfated oligosaccharide alditols of hen ovomucin, carbohydr. Res., 185, 1-13
P P P P

Strecker G., Wieruszeski J. M., Michalski J. C., Alonso C., Boilly B. and Montreuil J. (1992) Charcterization of LeX, LeY and ALeY antigen determinants in Kdn-containing O-linked glycan chains from Pleurodeles waltlii jelly coat eggs, FEBS-Lett., 298, 39-43
P P P P P P

Strecker G., Wieruszeski J. M., Michalski J. C., Alonso C., Leroy Y., Boilly B. and Montreuil J. (1992) Primary structure of the neutral and acidic oligosaccharide-alditols from the jelly coat of the Mexican axololt. Occurrence of oligosaccharides with fucosyl (1-3)fucosyl (1-4)-3-deoxy-D-glycero-D-galactononulosonic acid and galactosyl (1-4) [fucosyl (1-2)]galactosyl (1-4) Nacetyllactosaminic sequences, Eur. J. Biochem., 207, 995-1002 Strecker G., Wieruszeski J. M., Michalski J. C., and Montreuil J. (1992) 2oxo-3-deoxy-D-glycero-D-galactononulosonic acid containing oligosaccharidealditols bearing Lewis Y, Lewis X and A Lewis Y determinants isolated from the jelly coat of Pleurodeles waltl eggs., Biochem. J., 287, 905-909 Strecker G., Wieruszeski J. M., Planke Y. and Boilly B. (1994) Primary structure of 12 neutral oligosaccharide-alditols released from the egg jelly coats of the anouran Xenopus laevis by reductive -elimination, Glycobiology, 5, 137146 van Halbeek H., N.M.R. spectroscopy of Carbohydrates, Analytical Glycobiology 3rd International Symposium, San Diego, CA, 1995.
P P

van Halbeek H., 500-MHz 1H-NMR spectroscopy as a tool in the structural analysis of the carbohydrate chains of glycoproteins, Thesis of Utrecht University,1982. van de Ven FJ.M. The basics of multi-dimensional NMR in liquids, VCH Publisher, 1992 Vliegenthart J. F. G., Dorland L. and van Halbeek H. (1983) Highresolution, 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy as a tool in the structural analysis of carbohydrates related to glycoproteins, Adv. Carbohydr. Biochem.,vol. 41
P P

Vliegenthart J. F. G., van Halbeek H. and Dorland L., Pure Appl. Chem., 1981, 53, 45-77 Vliegenthart J. F. G., and Kamerling J., 1H-NMR Structural-Reporter-Group Concepts, In Comprehensive Glycoscience, 2007, Vol. 2, 133-191
P P

Wieruszeski J. M., Michalski J. C., Montreuil J., Strecker G., PeterKatalinic J., Egge H., van Halbeek H., Mutsaers J. H. G. And Vliegenthart J. F. G. (1987) Structure of the monosialyl oligosaccharides derived from salivary gland mucin glycoproteins of the chinese swiflet (Genus collocalia) J. Biol. Chem., 262, 6650-6657

Maes E. Mise jour 01/09