UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRCOLAS

ESCUELA DE INGENIERA AGRONMICA

EVALUACIN DEL ANTAGONISMO DE CEPAS DE Trichoderma spp. CONTRA HONGOS FITOPATOGENOS BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO E INVERNADERO. TUMBACO PICHINCHA.

Autor: Direccin:

Jorge Alfredo Moser Surez. Ing. Agr. Hugo Orellana, M. Sc.

Microbiologa

INTRODUCCIN
La produccin agrcola ve constantemente limitados sus rendimientos y calidad final de la produccin, debido a la incidencia de una diversidad de enfermedades, entre las cuales sobresale por los daos que ocasiona, la lancha, causada por el cromista (Phytophthora infestans).

Microbiologa

INTRODUCCIN
Para combatir estas enfermedades, entre otras medidas, se utilizan generalmente pesticidas con diversos modos y mecanismos de accin, distintos grados de toxicidad y un sinnmero de peligros para la salud de productores y consumidores, y con el consecuente dao al ambiente. En consecuencia, el abuso en la utilizacin de productos agroqumicos para combatir las enfermedades que afectan al cultivo, ha generado la necesidad de encontrar alternativas amigables para el ambiente y efectivas para combatir a los patgenos, manteniendo un equilibrio biolgico entre especies.

Microbiologa

OBJETIVOS
GENERAL
Registrar la accin antagnica del hongo Trichoderma spp, bajo condiciones de laboratorio e invernadero, contra patgenos que afectan al follaje y a las races.

Microbiologa

OBJETIVOS
ESPECFICOS
Registrar en el laboratorio la accin antagnica de las cepas de Trichoderma spp para combatir a P. infestans, R. solani y Fusarium spp.

Evaluar en el invernadero protectante de Trichoderma contra P. infestans en papa. Iniciar un banco Trichoderma spp. de

la accin harzianum

germoplasma

de

Microbiologa

AMBIENTES

Microbiologa

AMBIENTES

Microbiologa

CARACTERSTICAS DEL SITIO E X P E R I M E N TA L

Microbiologa

UBICACIN
La investigacin se condujo en el laboratorio e invernadero de Microbiologa y Fitopatologa General ubicados en el Campo Docente Experimental La Tola CADET, de la Facultad de Ciencias Agrcolas de la Universidad Central del Ecuador.
Provincia: Cantn: Parroquia: Altitud: Latitud: Longitud: Pichincha Quito Tumbaco 2460 m.s.n.m. 0 13 58S. 78 22' 05O.

Laboratorio de Microbiologa y Fitopatologa de la U.C.E., F.C.A. 0o1345 S 78o2218 O

Sitio Experimental (Invernadero) de la U.C.E., F.C.A. 0o1352 S 78o2208 O

Microbiologa

CARACTERSTICAS CLIMTICAS
De acuerdo a los datos de temperatura y humedad registrados en el invernadero de Microbiologa y Fitopatologa General, se trabaj bajo las siguientes condiciones meteorolgicas:

Temperatura mxima: Temperatura mnima: Temperatura promedio: Humedad relativa: Luminosidad:

33C 16C 24C 60% 147.2 horas sol/mes 4.9 horas sol/da.

Microbiologa

M AT E R I A L E S Y REACTIVOS

Microbiologa

M AT E R I A L E S
LABORATORIO
Cajas petri Tubos de ensayo Aislamientos P. infestans, Trichoderma spp, Fusarium spp, R. solani. Cintas de parafilm Rtulos Libreta de campo Material de oficina Marcadores

INVERNADERO
Suelo estril Semilla de papa var. Sper Chola (Solanum tuberosum ssp. Andgena) Aislamientos P. infestans, T. harzianum, Trichoderma spp, Cepa Comercial. Cimoxapac (fungicida quimico) Agua destilada esterilizada Pipetas Nebulizadores.

Microbiologa

REACTIVOS

Medios de Cultivo

Medio ACG Phytophthora infestans

Medio PDA Fusarium spp Rhizoctonia solani Trichoderma spp

Microbiologa

EQUIPO

Microbiologa

EQUIPO

Microbiologa

EQUIPO

Microbiologa

FA C TO R E S E N ESTUDIO

Microbiologa

L A B O R AT O R I O
Hongo antagnico Trichoderma spp.

Microbios fitopatgenos Phytophthora infestans Rhizoctonia solani Fusarium spp.

Microbiologa

INVERNADERO
Hongo antagnico Trichoderma harzianum Dosis 1 = 1 x 106 esporas / mililitro Dosis 2 = 1 x 109 esporas / mililitro Microbio fitopatgeno Phytophthora infestans

Microbiologa

INVERNADERO
pocas de aplicacin T. harzianum
poca 1 = 0 das antes de la inoculacin poca 2 = 1 das antes de la inoculacin poca 3 = 2 das antes de la inoculacin poca 4 = 3 das antes de la inoculacin

poca 5 = 4 das antes de la inoculacin

poca 6 = 5 das antes de la inoculacin poca 7 = 6 das antes de la inoculacin

Microbiologa

INVERNADERO
Adicionales
Testigo qumico 6 das antes de la inoculacin (Cimoxapac) Testigo cepa Trichoderma spp. (Laboratorio) Testigo cepa Trichoderma comercial (T. viride, T. koningii, T. harzianum, T. polysporum). Testigo absoluto (sin aplicacin)

Microbiologa

D I S E O E X P E R I M E N TA L
Para analizar los datos obtenidos se utiliz un Diseo Completamente al Azar, con un arreglo factorial 2 x 7 + 4 con 9 observaciones por tratamiento. rea total del ensayo: rea neta del ensayo: Nmero de macetas: Nmero total de U.E: Nmero total de plantas: rea total de la unidad experimental: rea de la unidad experimental neta: 60 m 50 m 162 162 162 1 maceta 1 maceta

Microbiologa

DISPOSICION DE LOS T R ATA M I E N T O S

Microbiologa

VA R I A B L E S Y MTODOS DE E VA L U A C I N

Microbiologa

IDENTIFICACION DE LA ESPECIE DE Trichoderma spp

Se identific la especie en base a sus caractersticas morfolgicas (apariencia macroscpica, tamao y forma de las fialides con su respectiva distribucin).

Microbiologa

C A PA C I D A D A N TA G O N I C A D E Trichoderma spp.
Se registr en base al crecimiento de cada consorte, para lo cual, se sembr a Trichoderma frente a cada patgeno, Fusarium spp., R. solani y P. infestans, en el medio de cultivo PDA y ACG respectivamente.

Microbiologa

ACCION DE Trichoderma spp. CONTRA Phytophthora infestans

Se evalu la accin protectiva de Trichoderma spp, en base a la severidad de ataque. Para el efecto, se consider como 0% a una planta sana y como 100% a una planta muerta, de acuerdo a la escala de Henfling.

Microbiologa

R E S U LTA D O S Y DISCUSIN

Microbiologa

L A B O R AT O R I O

Cepas efectivas de Trichoderma spp

Cepas Localidad Los Andes 1 I II III Los Andes 2 Cochapamba Jesus del Gran Poder 1 Jesus del Gran Poder 2 El Angel 1 El Angel 2 Provincia Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha Pichincha X X X Presencia de Trichoderma spp.

Microbiologa

Ausencia de Trichoderma spp. X X X X

IV
V

Checa
Tumbaco 1

Pichincha
Pichincha

X
X

VI
VII VIII IX X XI XII

Tumbaco 2
El Arenal 1 El Arenal 2 Cotopaxi 1 Cotopaxi 2 Papallacta 1 Papallacta 2 Holanda

Pichincha
Pichincha Pichincha Cotopaxi Cotopaxi Napo Napo

X
X X X X X X X

Microbiologa

Trichoderma spp. CONTRA Fusarium spp.

La cepa de Trichoderma spp III de El ngel fue la ms agresiva, obtuvo hasta un 90% de colonizacin del espacio ocupado por Fusarium spp, mientras que, las cepas I y VI de las localidades Los Andes y Tumbaco, respectivamente, no presentaron ningn nivel de invasin

Microbiologa
100

90
80

% de colonizacin

70 60 50 40 30 20

10
0 Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 I II III IV V VI VII VIII X XI XII

Cepas de Trichoderma spp

Porcentaje de colonizacin de Trichoderma spp. contra Fusarium spp

Microbiologa

Fusarium spp

Trichoderma spp

Aproximacin de micelios de Fusarium spp y Trichoderma spp

Microbiologa

Fialides

Trichoderma spp invadiendo espacio ocupado por Fusarium spp

Microbiologa

Competencia por espacio

Trichoderma spp compitiendo por espacio ocupado por Fusarium spp

Microbiologa

Trichoderma spp. CONTRA Rhizoctonia solani

La cepa VII de Trichoderma spp, de El Arenal, obtuvo los efectos ms altos de antagonismo, parasitando aproximadamente hasta un 100 % a R. solani; en tanto que, la cepa comercial XII, debido a su lento desarrollo, o al otorgamiento de un ambiente desfavorable, no mostr antagonismo

Microbiologa
120 100

% de Antagonismo

80 60 40 20 0 Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 I II III IV V VI VII VIII X XI XII

Cepas de Trichoderma spp.

Porcentaje de antagonismo de Trichoderma spp. contra Rhizoctonia solani

Microbiologa

Micoparasitismo

Hifas de R. solani envueltas por Trichoderma spp

Microbiologa

Micoparasitismo

Hifas de R. solani parasitadas por Trichoderma spp

Microbiologa

Lisis

Lisis de hifas de R. solani por Trichoderma spp

Microbiologa

Trichoderma spp. CONTRA Phytophthora infestans

En este consorcio, fue la cepa VI de Trichoderma spp proveniente de Tumbaco, la de que mostr mayor grado antagnico, parasitando hasta un 100% a P. infestans, en tanto que, la cepa II proveniente de la localidad Jess del Gran Poder, no present ningn tipo de antagonismo.

Microbiologa
120 100

% de Antagonismo

80 60 40 20 0 Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob Ob 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 I II III IV V VI VII VIII X XI XII

Cepas de Trichoderma spp.

Porcentaje de antagonismo de Trichoderma spp. contra Phytophthora infestans

Microbiologa

Envolvimiento de Esporangio

Hifas de P. infestans envueltas por Trichoderma spp

Microbiologa

Micoparasitismo

Esporangios de P. infestans envueltas por Trichoderma spp

Microbiologa

Lisis de Esporangio

Lisis de esporangio de P. infestans por Trichoderma spp.

Microbiologa

Trichoderma spp CONTRA Phytophthora infestans en foliolos de papa

En foliolos de papa, el mayor efecto antagnico lo mostr la cepa "X" proveniente de Papallacta, al haber permitido el menor porcentaje de infeccin; en tanto que, in vitro, fue la cepa "VI" proveniente de Tumbaco" la que mostr mayor eficiencia.

Microbiologa
80 70 60

% de Infeccion

50
40 30 20 10 0 I II III IV V VI VII VIII X XI XII Testigo

Cepas de Trichoderma spp.

Severidad de ataque en foliolos de hojas de papa de la variedad "Sper Chola" inoculadas bajo condiciones de laboratorio

Reaccin de hipersensibilidad Tumbaco (Ecuador) y Antioquia (Colombia)

Reaccin de Infeccin tpica de P. infestans

Microbiologa

INVERNADERO

Anlisis estadstico
Fuente de Variacin TOTAL 161 GL

Microbiologa

CM

DOSIS (D) POCA (E) DxE Ad vs Facto a0 vs a1,a2,a3 a1 vs a2, a3 a2 vs a3 ERROR EXP

1 6 6 1 1 1 1 144

777.01** 441.58** 210.78** 167.44** 22601.34** 216.75** 110.25** 15.4**

Promedio = 23.61 foliolos infectados CV = 16.62 %

Promedios y Pruebas de Significacin

FACTORES DOSIS (D) d2 1 x 109 esporas/mililitro 1 x 106 esporas/mililitro 10.86 a DESCRIPCION DMS 5 %

Microbiologa

PROMEDIO FOLIOLOS ENFERMOS

d1 EPOCA (E)
e5 e7 e6 e1 e2 e4 e3

23.47

b TUKEY 5 %

4 to dia 6 to dia 5 to dia 0 dia 1 er dia 3 er dia 2 do dia

17.12 a 19.69 a b 20.12 a b 25.19 27.12 29.31 30.75 bc c c c

Promedios y Pruebas de Significacin

FACTORES INTERACCION (DxE) d2e6 d1e5 d2e7 d2e5 d1e7 d2e3 d2e1 d1e1 d2e2 d1e2 d1e6 d1e4 d2e4 d1e3 FACTORIAL vs ADICIONAL Adicional a0, a1, a2, a3 21.59 a 1 x 109 esp/ml x 5to dia 1 x 106 esp/ml x 4to dia 1 x 109 esp/ml x 6to dia 1 x 109 esp/ml x 4to dia 1 x 106 esp/ml x 6to dia 1 x 109 esp/ml x 2do dia 1 x 109 esp/ml x 0 dia 1 x 106 esp/ml x 0 dia 1 x 109 esp/ml x 1er dia 1 x 106 esp/ml x 1er dia 1 x 106 esp/ml x 5to dia 1 x 106 esp/ml x 3er dia 1 x 109 esp/ml x 3er dia 1 x 106 esp/ml x 2do dia 12.37 a 15.62 a b 15.87 a b 18.62 23.50 23.75 24.00 26.37 26.32 27.62 27.87 29.00 29.62 37.75 b c c c cd cd cd cde de de e DMS 5 % DESCRIPCION TUKEY 5 %

Microbiologa

PROMEDIO FOLIOLOS ENFERMOS

Factorial

DxE

24.19

Promedios y Pruebas de Significacin

FACTORES a0 vs a1, a2, a3 a1, a2, a3 a0 a1 vs a2, a3 a1 a2, a3 a2 vs a3 a1 a2 T. spp Comercial T. spp Laboratorio 5.75 a 11.00 b Control Qumico Control Biolgico 2.00 a 8.37 b DMS 5 % Control qumico y biolgico Sin control 6.25 a 67.62 b DMS 5 % DESCRIPCION DMS 5 %

Microbiologa

PROMEDIO FOLIOLOS ENFERMOS

Microbiologa

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Microbiologa

CONCLUSIONES
1. El hongo Trichoderma spp demostr en el laboratorio diversos grados de antagonismo contra los patgenos Fusarium spp, Rhizoctonia solani y Phytophthora infestans; y, en el invernadero contra P. infestans.
2. Trichoderma spp en el laboratorio mostr un efecto dominante en velocidad de crecimiento y colonizacin del medio de cultivo cuando compiti contra Fusarium spp; y, un efecto competitivo y supuestamente micoparastico contra R. solani y P. infestans. 3. En el invernadero, Trichoderma harzianum present diversos grados de antagonismo contra P. infestans, de acuerdo a la dosis y poca de aplicacin.

Microbiologa

CONCLUSIONES
4. Los tratamientos que demostraron mayores grados de antagonismo fueron los que correspondieron a la dosis mayor (1 x 109 esporas/mililitro) y se aplicaron despues del cuarto da de la inoculacin con P. infestans. 5. Existen cepas efectivas de Trichoderma spp en el laboratorio de Microbiologa.

Microbiologa

RECOMENDACIONES
1. Identificar la especie de Trichoderma spp 2. Continuar con los estudios de evaluacin de la accin antagnica de Trichoderma harzianum contra Phytophthora infestans utilizando una variedad susceptible.

3. Evaluar la accin antagnica de Trichoderma spp bajo condiciones de campo.

Microbiologa
25

20

# de Foliolos infectados

15

10

Promedio (21.164)

d1

d2

Dosis de T. harzianum

Promedio de foliolos de papa infectados para Dosis

Microbiologa
35,000 30,000 25,000

% de Infeccion

20,000 15,000 10,000 5,000 0,000

Promedio (21.16)

e1

e2

e3

e4

e5

e6

e7

pocas de aplicacin de P. infestans

Promedios de foliolos de papa infectados para pocas de aplicacin

Microbiologa
40 35 # de Foliolos Infectados

30
25 20 15 10 5 0
d1e1 d1e2 d1e3 d1e4 d1e5 d1e6 d1e7 d2e1 d2e2 d2e3 d2e4 d2e5 d2e6 d2e7

Promedio (21.164)

Factorial Dosis x pocas

Promedios de foliolos de papa infectados para Interaccin D x E

Microbiologa
24,5 24

23,5

# de Foliolos Infectados

23 22,5 22

Promedio (23.611)
21,5 21 20,5 20

Factorial

Adicional

Factorial vs Adicional

Promedios de foliolos de papa infectados para Factorial vs Adicional

Microbiologa
80 70

# de Foliolos Infectados

60 50 40 30 20

Promedio (21.594)

10
0

a0

a1,a2,a3

a0 vs a1, a2, a3

Promedios de foliolos de papa infectados para a0 vs a1, a2, a3

Microbiologa
9 8 # de Foliolos Infectados 7 6 5 4

Promedio (6.25)

3
2 1 0 a2,a3 a1

a1 vs a2, a3

Promedios de foliolos de papa infectados para a1 vs a2, a3

Microbiologa
12,00 10,00 # de Foliolos Infectados 8,00 6,00

Promedio (8.375)
4,00 2,00 0,00 a3 a2

a2 vs a3

Promedios de foliolos de papa infectados para a2 vs a3

Microbiologa

ANTIBITICOS Trichoderma spp

MECANISMO DE ACCIN Inhibe Biosntesis de Protenas Inhibe Formacin ADN transcripcin

ANTIBITICO Atroviridina A-C

Neoatroviridina A-D
Trichosetin

Tetracyclina
Cycloheximida

Inhibe Formacin ARN transferencia Inhibe Formacin ARNt y ARNm