Tcnicas: PCR-Secuenciacin

Agua ultrapura libre de impurezas biolgicamente activas apta para tcnicas PCR
 Las tcnicas PCR se utilizan ampliamente en el sector biotecnolgico para la amplificacin de material gentico, desde la investigacin genmica fundamental hasta aplicaciones forenses y biomdicas avanzadas. La necesidad de reactivos y soluciones libres de nucleasas (DNasa, RNasa) que puedan provocar la fragmentacin de los oligonucletidos est ampliamente reconocida; sin embargo, la influencia de otros contaminantes transmisores de enfermedades a travs del agua raramente se considera. Estos pueden provocar problemas con los resultados de las pruebas, por lo que es vital que el agua a utilizar est libre de contaminantes transmisores de enfermedades.
de la composicin de la mezcla de la reaccin1. La presencia de nucleasas enzimas que rompen los enlaces de fosfodister entre las subunidades de los cidos nucleicos dentro del recipiente de reaccin llevar a la interrupcin severa del proceso de PCR, ya que el material gentico se fragmentar rpidamente bajo las condiciones de reaccin. Por lo tanto, es fundamental garantizar que todos los reactivos y soluciones utilizados en las aplicaciones de PCR estn libres de nucleasas. La necesidad de un agua libre de nucleasas en las aplicaciones de PCR est ampliamente reconocida; sin embargo, hay otros contaminantes que se encuentran comnmente en el agua que pueden impedir

Dr. Paul Whitehead, PhD, CChem, FRSC, ELGA Labwater R&D Facility (England)

Introduccin La llegada de las tcnicas de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) revolucion la genmica a principios de la dcada de 1980, y los mtodos basados en PCR, como la PCR de transcripcin inversa (RTPCR) y la PCR cuantitativa (qPCR), ahora son esenciales en una amplia gama de aplicaciones en la investigacin mdica y biolgica. La amplificacin del ADN por PCR se basa en el uso de enzimas de polimerasa de ADN para sintetizar molculas de ADN de cadena doble a partir de plantillas de cadena nica, usando cortas secuencias de iniciacin de oligonucletidos para identificar el gen de inters. Aunque este
2 MARZO/ABRIL12

proceso emplea generalmente polimerasas de ADN termoestables, tanto la especificidad del gen diana como la eficiencia

de la reaccin catalizada de la enzima son altamente dependientes de las condiciones fsicas (pH, temperatura, etc.) y

Farmespaa INDUSTRIAL

Es fundamental garantizar que los reactivos y soluciones utilizados en PCR estn libres de nucleasas
la amplificacin del ADN por PCR, incluyendo: Bacterias La presencia de ADN de bacterias puede llevar a resultados errneos, especialmente en las tcnicas qPCR, as como en la amplificacin de secuencias no diana. Adems, muchas bacterias liberan nucleasas extracelulares y otras pequeas molculas e iones que interfieren con la polimerizacin del ADN. Iones Las polimerasas de ADN termoestables requieren un cofactor de magnesio (Mg2+) para la unin efectiva al sustrato. La concentracin de Mg2+ por tanto es crucial para la optimizacin de la actividad de la polimerasa3. Las enzimas de polimerasas tambin son muy sensibles a otros cationes divalentes comunes (Cu2+, Fe2+, Ni2+, etc.), que interfieren con la coordinacin del cofactor y entorpecen la unin del sustrato dentro del punto activo. Adems, la presencia incluso de cantidades de trazas de iones de metales pesados (como el cadmio) inhibir la actividad enzimtica. Compuestos orgnicos Las partculas pueden causar daos en la bomba de la HPLC y tambin provocar que las columnas se bloqueen. Este efecto es an ms significativo
Farmespaa INDUSTRIAL

en los usuarios de UHPLC, ya que los tamaos de partculas mucho ms pequeos y con dimetros ms reducidos de estas columnas hacen que sean ms susceptibles al bloqueo prematuro que sus homlogas HPLC. Los coloides pueden ser adsorbidos irreversiblemente en la fase inmvil, resultando en un cambio en la eficiencia de la separacin de la columna. Radiacin ultravioleta (UV) Debido a que las molculas de ADN llevan carga negativa, otras biomolculas cargadas negativamente dentro del entorno de reaccin pueden interferir con la unin del sustrato introducindose en el entorno activo cargado positivamente y causando una interferencia estrica, lo que provoca una menor produccin de sustrato. Purificacin del agua para PCR La optimizacin de los procesos de PCR requiere el uso de agua libre de nucleasas, microorganismos, compuestos orgnicos y trazas de elementos para la elaboracin de todos los reactivos y tampones. Para garantizar que todos estos contaminantes no estn presentes, el agua de grado ultrapuro (Tipo I) con una resistividad de 18,2 M cm, un valor de carbono orgnico total (TOC) inferior a 10 ppb, niveles de bacterias por debajo de 1 CFU/ml y endotoxinas por debajo de 0,01 EU/ml es altamente recomendable para aplicaciones4 PCR. El Ultra Genetic PURELAB de ELGA utiliza un proceso de purificacin multi-etapa para producir agua de grado ultra-puro adecuada para PCR, incluyendo: Radiacin ultravioleta (UV) El paso del agua a travs de un haz de luz ultravioleta descompone de forma efectiva los compuestos orgnicos incluyendo bacterias y molculas bioactivas tales como las nucleasas y endotoxinas. La longitud de onda de 185 nm oxida las macromolculas con contenido de carbono, produciendo fragmentos ionizados para la posterior eliminacin por intercambio de iones, mientras que la radiacin UV de longitud de onda ms larga (254 nm) interrumpe la actividad de las enzimas bacterianas, evitando la reproduccin. Para maximizar la fragmentacin de las molculas orgnicas, el PURELAB Ultra Genetic emplea una lmpara UV de espectro total con un manguito de cuarzo sinttico de pureza ultra alta. Ultrafiltracin Los ultrafiltros (UF) son filtros de membrana con poros tpicamente de 1 a 50 nm, frecuentemente en forma de fibras huecas, que ofrecen altas velocidades de flujo por unidad de volumen. Normalmente estn hechos de fibras asimtricas con la capa activa, con los poros ms finos, en un lado. Los UF se caracterizan por la eficiencia con la que eliminan contaminantes especficos a niveles aceptables. La ultrafiltracin es til junto con los UV para maximizar la eliminacin de macromolculas y bacterias. El PURELAB Ultra Genetic de ELGA utiliza la fotooxidacin UV y cartuchos de purificacin de alta capacidad combinados con un ultrafiltro, para proporcionar de forma fiable agua ultrapura libre de endotoxinas (ver tabla). La resistividad en tiempo real y el control de los valores TOC garantizan la eliminacin comprobable de los contaminantes orgnicos e inorgnicos, y el sistema ofrece trazabilidad validada y calidad garantizada. Conclusin El agua ultrapura con alta resistividad (>18,2 M cm) y libre de nucleasas, compuestos orgnicos y endotoxinas debe ser utilizada para todas las aplicaciones PCR para garantizar la amplificacin optimizada de las secuencias diana. 9 Referencias:
1 Bogetto, P et al. (2000). Helpful tips for PCR. Focus, 22 (1), 12 2 Sambrook, J and Russel, DW (2001). Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed) 3 Yang, L et al. (2004). Critical role of magnesium ions in DNA polymerase betas closing and active site assembly, J Am Chem Soc, 126 (27), 8441-8453 4 ASTM Standard Guide for Bio-applications Grade Water, D 5196-06.

Para saber ms sobre las tecnologas y soluciones para el tratamiento del agua de ELGA LabWater para aplicaciones biotecnolgicas, visite www. elgalabwater.com

MARZO/ABRIL12