TERAPIA CON VIRUS

Los virus son verdaderos expertos a la hora de importar material gentico al interior de un organismo infectado. Esta particularidad es la que se explota en la terapia gnica, en la que los genes se introducen en las clulas de un paciente para tratar enfermedades o defectos genticos.

INTEGRANTES: Cayo Gonzales, Carmen Galloso Snchez, Paola Herrera Egoavil, Pilar Moreno Rodrguez, Diana Pinchi Dvila, Xiomy Rengifo Faifer, Cristina Snchez Vendez, Pamela

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6 de julio de 2013

Seminario N7

TERAPIA CON VIRUS

RESUMEN

Palabras clave:

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INDICE
INTRODUCCIN ..................................................................................................................................... 3 CAPITULO I.............................................................................................................................................. 4 Cmo funcionan las vacunas? ......................................................................................................................... 4 Clasificacin microbiolgica de las vacuna ................................................................................................. 4 Vacunas de microorganismos vivos atenuados ....................................................................... 5 Vacunas de microorganismos muertos o inactivados .......................................................................... 5 Vacunas y ADN recombinante ...................................................................................................................... 7 Perspectivas ............................................................................................................................................................. 8 CAPITULO II ............................................................................................................................................ 9 Tipos de terapia gnica........................................................................................................................................ 9 Terapia gnica somtica.9 Terapia gnica germinal..10 Sistemas de transferencia.11 Vectores virales...11 Grupos virales utilizados en terapia gnica...12 Retrovirus ......................................................................................................................................................... 12 Lentivirus ......................................................................................................................................................... 12 Adenovirus ....................................................................................................................................................... 15 Adenoasociados ................................................................................................................................................... BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................... 18

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INTRODUCCIN Durante la ltima dcada se ha producido una importante revolucin cientfica en el campo de la biologa molecular que, junto con un mejor conocimiento del Genoma Humano, ha permitido una mayor comprensin de la funcin celular a nivel molecular. Se han abierto importantes expectativas en la sociedad y en el mundo cientfico, que han hecho creer que todas las enfermedades son susceptibles de tratarse y de prevenirse mediante la terapia gnica. Los virus son verdaderos expertos a la hora de importar material gentico al interior de un organismo infectado. Esta particularidad es la que se explota en la terapia gnica, en la que los genes se introducen en las clulas de un paciente para tratar enfermedades o defectos genticos. La terapia gnica en los ltimos aos se ha enfocado a la bsqueda de nuevos vectores para el transporte de genes, los cuales tengan una mayor eficacia en la transferencia gnica, mayor persistencia en la expresin del material transferido, as como una alta especificidad al tipo celular que se desea transferir. Una de las caractersticas ms importantes es que deben ser seguros e inocuos, que despierten en el paciente una respuesta inmune casi nula. En la bsqueda de los vectores ms adecuados se han utilizado diferentes especies de virus cada uno con caractersticas especficas. En este momento, gracias a los mencionados desarrollos biotecnolgicos, la terapia gnica es una opcin teraputica viable para varias enfermedades crnico-degenerativas. En este informe vamos a realizar una revisin de la literatura sobre la aplicacin de los virus en la terapia gnica y en la inoculacin de vacunas.

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CAPITULO I VACUNAS

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Desde que Jenner y Pasteur iniciaron en los siglos XVIII-XIX las primeras estrategias de vacunacin, se han sucedido numerosos intentos dirigidos a ampliar el nmero de enfermedades susceptibles de prevencin y a su vez, conseguir para cada una de ellas el tipo de vacuna ideal. De las distintas definiciones que se han hecho de las vacunas, es de destacar la que las considera como "suspensiones de microorganismos atenuados o inactivados (muertos), o sus fracciones, que se pueden administrar a personas sanas susceptibles a determinadas enfermedades, con objeto de inducirles inmunidad activa protectora contra las mismas". 1. Cmo funcionan las vacunas? Las vacunas le ensean al cuerpo cmo defenderse cuando los microorganismos, como virus o bacterias, lo invaden.

Las vacunas lo exponen a uno a una cantidad muy pequea y muy segura de virus o bacterias que han sido debilitados o destruidos. Su sistema inmunitario aprende luego a reconocer y atacar la infeccin si uno est expuesto a ella posteriormente en su vida. Como resultado, uno no resultar infectado o tendr una infeccin ms leve. sta es una forma natural de hacerle frente a las enfermedades infecciosas.

2. Clasificacin microbiolgica de las vacunas Salvo excepciones, las vacunas disponibles en la actualidad, tienen su origen en los propios agentes infecciosos contra los que se vacuna, los cuales son sometidos a diferentes modificaciones para eliminar su poder patgeno pero manteniendo su capacidad inmungena. Las excepciones son la vacuna contra la viruela, cuyo componente es el propio virus de la vacuna (enfermedad de las vacas), que posee inmunidad cruzada con el virus de la viruela e inmuniza a los humanos contra la enfermedad, y la vacuna contra la hepatitis B empleada en la actualidad, que es obtenida por recombinacin gentica.

Ilustracin 1 Virus sometidos a modificaciones

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De ah que bajo este criterio se clasifiquen a las vacunas en vricas y bacterianas (solo nos centraremos de las vricas); y a su vez, cada una de ellas se dividen en dos grupos: a) vacunas de microorganismos vivos atenuados y b) vacunas de microorganismos muertos o inactivados. Estas ltimas a su vez se clasifican en enteras, cuando contienen el virus completo y de subunidades, cuando lo que contienen son antgenos secretados o fracciones vricas de distinta naturaleza.
Tabla 1. Clasificacin microbiolgica de las vacunas Vivas atenuadas Inactivas (muertas) Vricas Varicela Rabia Virus enteros Fiebre amarilla Gripe Polio oral Sarampin Polio parenteral Rubola Hepatitis A Parotiditis Encefalitis japonesa Subunidades Gripe Hepatitis B

1.

Vacunas de microorganismos vivos atenuados.

Las vacunas vivas consisten en preparaciones de microorganismos que pueden replicar in vivo en el husped de forma similar al microorganismo nativo, originando una infeccin inaparente o con sntomas mnimos, provocando con ello una respuesta inmune, celular y humoral, similar aunque algo inferior a la provocada por la infeccin natural. La atenuacin del microorganismo, mediante pases sucesivos en diferentes huspedes animales o medios de cultivo, es lo que garantiza la eliminacin de la capacidad de inducir enfermedad; pero su gran inmunogenicidad provoca generalmente proteccin a largo plazo y con un mnimo de dosis (las dosis de refuerzo se administran en las vacunas vivas para evitar el riesgo de fallo en la primera dosis, no para reactivar la respuesta inmune, como ocurre con las vacunas inactivadas). La excepcin la constituye la vacuna antipoliomieltica oral trivalente tipo Sabin, de la que es necesario administrar varias dosis, para evitar los fenmenos de interferencia que pueden producirse con otros virus existentes en el tracto digestivo y los propios virus vacunales. Como inconveniente tienen el ser vacunas ms inestables, ms difciles de producir, ms reactgenas y el que, en determinadas circunstancias, pueden provocar la enfermedad en el husped o incluso propagarse a otro sujeto.
Tabla 2. Caractersticas de una vacuna viva (atenuada) Se replica en el husped pero con virulencia atenuada Ventajas: Induce respuesta celular y humoral Menor nmero de dosis Proteccin de mayor duracin Inconvenientes: Posibilidad de reversin Puede ser ms reactgena La infeccin puede ser transmisible desde la persona vacunada Dificultad de fabricacin

2.

Vacunas de microorganismos muertos o inactivados

Las vacunas muertas o inactivadas se componen de microorganismos inactivados, trmica o qumicamente, o bien se trata de fracciones o subunidades de los mismos, incapaces de reproducirse, y por ello incapaces de producir la enfermedad en el husped o de transmitirse a otro sujeto. Son vacunas generalmente bien toleradas, menos reactgenas que las vacunas vivas, muy seguras y de ms fcil fabricacin. Desde el punto de vista

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inmunolgico son menos inmungena que las vacunas vivas, precisando adyuvantes, la administracin de varias dosis para la primovacunacin y posteriormente varias dosis de refuerzo para que la proteccin obtenida sea a largo plazo. Por lo general estimulan fundamentalmente la inmunidad humoral y preparan la memoria inmunolgica e incluso en algunos casos, sobre todo cuando se administran con adyuvantes o sistemas de liberacin, pueden estimular la inmunidad mediada por linfocitos T citotxicos.
Tabla 3. Caractersticas de una vacuna inactivada (muerta) Incapaz de replicarse en el husped No produce la enfermedad Ventajas: Menos reactgena No transmisible a otro sujeto no vacunado Fabricacin ms sencilla Inconvenientes: Escaso estmulo de la inmunidad celular Necesidad de varias dosis iniciales y posteriores refuerzos para una proteccin completa y prolongada

Dentro de las vacunas atenuadas e inactivadas se pueden distinguir vacunas de grmenes enteros o de clulas enteras, y vacunas de subunidades como los toxoides o anatoxinas, los antgenos purificados y los polisacridos capsulares. Vacunas de clulas enteras. En ellas los microrganismos obtenidos a partir de cultivos se atenan por pases sucesivos en animales o en medios de cultivo (sarampin, rubola, varicela y otras vricas o bacterianas de este grupo); o bien se inactivan mediante el calor o agentes qumicos diversos como el fenol o el formol (gripe, hepatitis A, antipertusis y otras). Vacunas de subunidades o fracciones. Las vacunas de fracciones o subunidades son preparaciones purificadas o sintetizadas de determinados componentes (protenas, pptidos, carbohidratos, toxinas, etctera) de microorganismos. Tienen las mismas ventajas e inconvenientes generales que las vacunas inactivadas, pero se caracterizan por una menor reactogenicidad (derivada de la ausencia de otros componentes no deseados del patgeno completo inactivado) y, por su simplicidad, mayor facilidad para generar mejoras (modificaciones estructurales, conjugaciones, molculas recombinantes, etctera).

Ilustracin 2 Estrategias actuales de generacin de vacunas vricas atenuadas e inactivas

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Dentro de la clasificacin microbiolgica de las vacunas y segn el mtodo de obtencin del antgeno, se pueden diferenciar las vacunas clsicas o no recombinantes, en las que no se utilizan las tcnicas de recombinacin de ADN para su obtencin, y vacunas en las que se utilizan dichas tcnicas. 3. Vacunas y ADN recombinante.

Dentro de estas vacunas se diferencian dos variedades: las recombinantes y las sintticas. En las vacunas recombinantes la vacuna est compuesta por partculas proteicas producidas en clulas husped, generalmente levaduras, en las que se ha insertado por tcnicas de recombinacin de ADN el material gentico responsable de su codificacin. Es el caso de la vacuna recombinante contra la hepatitis B, en la cual la recombinacin del gen S que codifica el HBsAg en las clulas del husped, permite obtener partculas de HBsAg casi idnticas a las que circulan en el plasma de personas infectadas. Son vacunas por tanto de genes clonados y expresados. Las vacunas sintticas se elaboran a partir de polipptidos que copian la secuencia primaria de aminocidos de los determinantes antignicos del microorganismo. Este tipo de vacunas ha tenido un escaso desarrollo, ya que uno de sus principales obstculos parece ser la escasa inmunogenicidad de estos pptidos sintticos, que precisaran el concurso de protenas transportadoras capaces de aumentar su antigenicidad. Otras vacunas basadas en tcnicas de ADN recombinante, como las vacunas de genes expresados en vectores o las vacunas de ADN desnudo estn en fase experimental, aunque son en general muy prometedoras por su capacidad de proporcionar una proteccin a largo plazo y ser relativamente estables en diversas situaciones. Sin embargo se cuestiona su seguridad en relacin a la induccin de tumores o fenmenos de autoinmunidad. Igualmente estn en fase experimental las llamadas vacunas antiidiotipo, contra molculas peligrosas como endo o exotoxinas, y otras.

Ilustracin 3 Estrategias actuales de vacunacin de fragmentos

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3. Perspectivas. Los nuevos usos de las vacunas incluyen no solo la cura de la infeccin o su prevencin, sino la prevencin de secuelas serias que se presentan como resultado de dicha enfermedad, la vacuna de VHB es un buen ejemplo, ya que su uso est motivado tambin por la prevencin del cncer heptico. Adems se trabaja en la fabricacin de vacunas contra el Helicobacter pylori, agente involucrado en la aparicin de cncer de estmago y del Papillota virus, agente altamente relacionado con el cncer crvico-uterino respectivamente. Se propone que otra aplicacin de estas vacunas ser prevenir enfermedades debidas a problemas de autoinmunidad o bien a inmunidad hiperreactiva como la que propicia el asma y las alergias.

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CAPITULO II TERAPIA GNICA

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La definicin de terapia gnica ha cambiado a lo largo del tiempo, y hoy en da no existe una comnmente aceptada. En este informe vamos a basarnos en la propuesta por un grupo de expertos noruego1. As, la terapia gnica (TG) se puede definir como la transferencia de material gentico, ADN o ARN, a clulas diana con fines teraputicos. 1. Tipos de terapia gnica Terapia gnica somtica (somatic cell gene therapy) Implica la correccin de defectos genticos en cualquiera de las clulas del paciente, excepto las de la lnea germinal, lo que significa que tal correccin del defecto gentico no se transmite a los descendientes, ya que la lnea germinal del paciente tratado no est manipulada. La terapia gnica somtica ha centrado sus actuaciones sobre enfermedades hereditarias bien definidas cuyo defecto gentico reside en un nico gen, las llamadas enfermedades monognicas. Estas podran ser del tipo de las hemofilias, fenilcetonuria, deficiencia de ADA (adenosina desaminasa), fibrosis qustica, distrofia muscular, hipercolesterolemia familiar, etc. Enfermedades hereditarias cuyo defecto gentico es fcilmente confirmable en los portadores, y altera el funcionamiento de un tipo celular concreto y ms o menos accesible a los genes teraputicos externos. Las enfermedades provocadas por la alteracin de ms de un gen, o por la falta de coordinacin de varios genes, las llamadas polignicas, son lgicamente ms complejas de abordar y de momento se desestima la terapia gnica para su posible tratamiento. La terapia gnica somtica se puede dividir en 4 niveles: 10 1. Terapia gnica con integracin, en la que el gen es incorporado en el ADN 2. Terapia gnica sin integracin, en la que el gen no se incorpora en el ADN 3. Empleo de pequeos oligonucletidos sintticos, tambin denominados molculas ribozima/anti-sentido, sin elementos regulatorios que modifiquen la expresin gnica. 4. Vacunas de ADN teraputicas. La terapia gnica somtica se puede dividir en tres categoras: Esta clasificacin de la terapia gnica responde al lugar donde se produce la manipulacin gentica de las clulas. Ex vivo: Consiste en la recuperacin de clulas del organismo, su tratamiento con el vector portador del ADN teraputico y el regreso de las clulas modificadas genticamente al organismo. Esta opcin se ha empleado en clulas sanguneas y de la piel. Este proceso es ms fcil con clulas del sistema hematolgico. La obtencin de mdula sea, purificacin de clulas madre, su manipulacin en el laboratorio, y la introduccin de la clula madre con la versin funcional de un gen de vuelta en el paciente ha servido por ejemplo para el tratamiento de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) por deficiencia de ADA. La introduccin del gen ADA funcional en las clulas progenitoras del sistema inmunolgico han curado ya a nios con SCID, los conocidos como nios burbuja, en unos ensayos clnicos.
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SMELAND E, PRYDZ H, ORSTAVIK KH, FROLAND S, AAMDAL S, MYKLEBOST O ET AL. Gene Therapy: status and potential in clinical medicine. The Norwegian Centre for Health Technology Assessment (SMM) 2000 (SMMReport7/2000)

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In situ: Consiste en la colocacin del vector portador del ADN teraputico dentro del tejido en el que el gen funcionar. Esto se ha probado en las vas areas y en los pulmones en la fibrosis qustica y en algunos tipos de cncer. In vivo: Aqu el vector portador del ADN teraputico puede ser, por ejemplo, inyectado en el torrente sanguneo para ser captado por las clulas diana. Por ejemplo, la modificacin de clulas pulmonares o hepticas con una versin correcta del gen de la alfa-1 antitripsina en pacientes con enfisema pulmonar o cirrosis fruto de esta deficiencia, o en la introduccin del gen de la distrofina en tejidos musculares en pacientes de distrofia muscular.

Ilustracin 4 In vivo ex vivo

Terapia gnica germinal (germ-line gene therapy) Implica la correccin de defectos genticos en las clulas de la lnea germinal (clulas reproductoras). Estos cambios genticos se transmitirn a las futuras generaciones. sta no se ha realizado en humanos porque la legislacin actual lo prohbe. Existe consenso nacional e internacional de prohibir la terapia gnica germinal, mientras no se disponga de conocimientos que permitan realizarlo con seguridad suficiente.

Ilustracin 5 Terapia gnica somtica vs germinal

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2. Sistemas de transferencia

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Para que los genes o fragmentos de genes puedan ser empleados en el tratamiento de enfermedades son necesarios buenos sistemas de transferencia a clulas diana donde el nuevo ADN pueda ser expresado como ARN y/o protena. Hasta ahora, el desarrollar sistemas de transferencia seguros y eficientes es el principal obstculo para explotar el gran potencial de tratamiento que representa la terapia gnica. El gen o el fragmento de gen que interesa es habitualmente insertado en un vector (a menudo un ADN o ARN virus o un plsmido de ADN) que es una parte fundamental del sistema de transferencia (vehculo de transporte). El ADN teraputico se inserta en el vector en una localizacin donde a menudo reemplaza ADN que no es esencial para la transferencia o multiplicacin del virus. Los sistemas de transferencia pueden ser: Vectores virales ARN virus: Retrovirus (los ms utilizados) ADN virus Adenovirus Virus adenoasociados Virus herpes simple Otro mecanismo de transferencia Se han desarrollado diversos sistemas de transferencia. As, se han utilizado plsmidos (ADN desnudo), liposomas catinicos o liposomas con anticuerpos contra la superficie de la clula diana, cromosomas humanos artificiales... 3. Vectores virales Entendemos por vectores a los sistemas que utilizamos como ayuda en el proceso de transferencia de un gen exgeno al interior de la clula. Ellos facilitan la entrada y biodisponibilidad intracelular del material gentico a transducir y, por consiguiente, su funcionamiento correcto. Se ha utilizado una gran variedad de vectores con fines experimentales y de forma genrica los podemos clasificar en: vectores no virales y vectores virales. (Tabla 4)
Tabla 4. Vectores utilizados en terapia gnica Vectores no virales Vectores virales Retrovirus Qumicos
Fosfato clcico Liposomas Receptores

Fsicos
Biobalstica Electroporacin Microinyeccin

Adenovirus Virus asociados a adenovirus Herpes simples

Hasta hace unos aos, cuando pensbamos en los virus nos imaginbamos un agente infeccioso responsable de numerosas enfermedades o unas partculas extremadamente pequeas que slo pueden observarse gracias al microscopio electrnico y que, aunque presentan material gentico propio, son incapaces de replicarse por s mismos. Sin embargo, hoy da este concepto empieza a cambiar y los virus empiezan a ser considerados como herramientas de trabajo, vectores, que sirven para introducir material gentico con fines teraputicos en las clulas diana. Los virus no pueden ser utilizados directamente como se encuentran en la naturaleza, necesitan ser modificados para poder ser utilizados como vectores. Es necesario convertirlos en entes deficientes en replicacin en el interior de la clula diana. Se trata, por tanto, de producir una anulacin parcial del genoma viral.

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Los principales tipos de vectores virales usados hasta ese momento en protocolos de terapia gnica, es decir, vectores retrovirales, adenovirales, adenoasociados y basados en Herpesvirus. 4. Grupos virales utilizados en terapia gnica RETROVIRUS Los retrovirus son un grupo ampliamente desarrollado. Son virus cuyo material gentico est constituido por una molcula de ARN. Esto los obliga a realizar el proceso de retrotranscripcin para su replicacin. Tienen la capacidad de integrarse en el genoma del husped, con lo que ofrecen la ventaja de una expresin persistente del transgn, lo que los hace tiles para su uso en enfermedades hereditarias y/o crnicas. Sin embargo, la integracin en el genoma del husped es aleatoria, presentando el riesgo (aunque extremadamente bajo) de mutagnesis insercional debido a la posibilidad de alterar un gen vital o un gen supresor de tumor y por lo tanto interrumpir su expresin, o bien insertarse en un protooncogn induciendo su activacin a oncogn. La gran desventaja que presenta este tipo de vectores es que slo son capaces de infectar clulas en divisin. Los retrovirus recombinantes ms usados son los derivados del virus de la leucemia murina, los cuales se modifican para hacerlos deficientes de replicacin, con lo que se suprime su capacidad de formar partculas virales2. La falta de especificidad de diana de los retrovirus se ha estudiado con retrovirus quimricos derivados de virus humanos y virus de otras especies animales. Por ejemplo, la especificidad de infeccin reside en las protenas de la cubierta del virus, y stas son sustituibles en el cromosoma del virus. As, se ha conseguido sustituir una protena de la cubierta del virus de la leucemia del ratn (MLV) por la del virus de la estomatitis vesicular humana (HVSV) y cambiar la especificidad del MLV por clulas humanas. En la actualidad se estn probando vectores basados en estas quimeras vricas, sobre la base de que le MLV no produce enfermedades conocidas en el hombre y que los niveles de fabricacin de protena a partir de un gen teraputico insertado en su genoma pueden ser regulables y apropiados para su uso en terapias. LENTIVIRUS Son un tipo de retrovirus con capacidad de integracin estable tanto en clulas en reposo como en divisin. Sin embargo, la mayora de ellos derivan de la familia del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), por lo que los aspectos referentes a la seguridad biolgica para su uso en protocolos clnicos debern ser considerados antes de su aplicacin. Lentivirus y entrada en el ncleo En la citada revisin del 20003 se conclua que la entrada en el ncleo del complejo de preintegracin del VIH vena posibilitada por la existencia de seales de localizacin nuclear en las diferentes protenas que forman, junto con el ADN viral recin transcrito, el complejo de reintegracin. Nuevos estudios completaron esta visin, al observarse que tanto en el VIH como en otros lentivirus existe una estructura de ADN tricatenario hacia la zona central del ADN, que contiene una secuencia rica en purinas (PPT) anloga a la que

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Vassilopoulos G, Stamatoyannopoulos G. The basics of gene therapy vectors. Haema 2000; 3: 214-28. Talavera A, Liras A, Fuentes L, Snchez H. El VIH y otros retrovirus complejos en la terapia gnica de clulas en reposo. Virologa 2000; 7:2-15.

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normalmente est presente en la zona subterminal del ARN viral y que sirve, durante la transcripcin inversa, de cebador de la sntesis de la segunda cadena (cadena +) del ADN4. Esta secuencia, llamada segunda PPT sirve de cebador independiente de un ADN+, y est situada antes de la seal de terminacin (CTS) del ADN+ normal, por lo que se da un solapamiento entre ambos ADN+, que da cuenta de la regin de tres cadenas ( Ilustracin 6). La conformacin impuesta por esta estructura es lo que permite al ADN la entrada al ncleo a travs de los poros nucleares. Como era de esperar, poco tiempo despus de la descripcin de este elemento apareci en la literatura su aplicacin a nuevos vectores basados en lentivirus.

Ilustracin 6 Estructura de la parte central del ADN del VIH La cadena negativa del ADN presenta un tracto de polipurina extra (2 PPT), del que se origina una cadena positiva de ADN (ADN+ secundario). Otra cadena positiva, originada en la PPT normal (fuera de los lmites del esquema), termina su sntesis en la regin CTS, ulterior a la 2 PPT, la zona del ADN comprendida entre ambas regiones de origen y terminacin es, por lo tanto, tricatenaria.

Empaquetamiento transitorio La tecnologa que conduce a la obtencin de retrovirus recombinantes o transductores se basa en la coexistencia en una clula, en un momento determinado, de dos elementos genticos: a) Un provirus artificial que en el que los genes estructurales del retrovirus han sido sustituidos por el transgn que se desea transducir; el ARN transcrito a partir de este provirus ha de conservar, entre otros elementos retrovirales, la capacidad de ser encapsidado. b) Genes que expresen las protenas virales necesarias para la formacin de cpsidas donde el ARN del provirus artificial puedan ser encapsidadas. Sin embargo, los ARNs mensajeros correspondientes a estos genes deben ser incapaces (o haber sido activamente incapacitados) para pasar a formar parte de las cpsidas virales que sus genes contribuyen a formar, ya que ello dara lugar a la aparicin, junto a los deseados retrovirus transductores incapaces de formar nueva progenie, de retrovirus normales, que no slo seguiran propagndose una vez que infectasen las clulas blanco, sino que ayudaran a los virus transductores a propagarse con ellos, situacin no deseada en el contexto de la terapia gnica, cuyo objetivo es transportar el gen curativo a las clulas diana y no a sus vecinas. Normalmente, el primero de los elementos se halla en un plsmido retroviral genmico que contiene los LTR y otras regiones de control propias de un provirus, y en el que se ha insertado el transgn. Este plsmido se introduce en una estirpe celular, llamada
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Talavera A, Martn F, Snchez H. Los virus en la terapia gnica. Publicacin Oficial de la Sociedad Espaola de Virologa 1996; 4:3-15.

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empaquetadora (Ilustracin 7) en la que previamente, y de forma estable, se ha introducido el segundo de los elementos, generalmente en dos plsmidos independientes, uno de ellos portador de los genes estructurales de la cpsida y nucleocpsida retroviral (genes gag y pol) y el otro portando los genes que dan lugar a las protenas de la envuelta viral (gen env). La fraccin de clulas empaquetadoras que han recibido el plsmido con el transgn, y que ahora pueden ya llamarse clulas productoras de retrovirus recombinantes, han de seleccionarse [usando para ello un gen selector que comnmente acompaa al transgn], y ser usadas como poblacin general para la produccin de virus o, de manera ptima, ser clonadas para elegir los clones que producen ms cantidad de partculas virales recombinantes, produccin que depende, entre otros factores, del locus de la clula empaquetadora en el que el vector retroviral ha quedado integrado.

Ilustracin 7 Tcnica clsica de preparacin de retrovirus recombinantes

El vector retroviral genmico se introduce en las clulas empaquetadoras, que expresan estable y constitutivamente los genes estructurales del retrovirus. Las clulas obtenidas producen partculas de virus que empaquetan el ARN que contiene el transgn.

Todo el proceso arriba indicado es tedioso y extenso en el tiempo. La aplicacin de genes selectores de accin rpida, como el gen de la protena verde fluorescente (EGFP) de la medusa Aequorea victoria5, ha posibilitado la preparacin de clulas productoras mediante la tcnica conocida como transfeccin transitoria, que consiste en la introduccin simultnea en una poblacin celular de todos los elementos necesarios para la produccin de virus recombinantes (Ilustracin 8), cuya expresin transitoria es suficiente para la preparacin, durante un tiempo limitado, de virus recombinantes con ttulos tiles para la mayora de los experimentos. La cantidad de la transfeccin puede ser determinada, por medio de citometra, en una fraccin de las clulas transfectadas al cabo de 24 o 48 horas despus de la misma, de manera que si la proporcin de clulas transfectadas (fluorescentes) resultara ser reducida (lo que sera indicativo de una baja produccin de virus) se procedera a una nueva transfeccin sin la larga espera inherente al procedimiento de transfeccin estable. Para la transfeccin transitoria se utiliz en un primer momento la electroporacin. Sin embargo, se ha determinado que para la preparacin de clulas empaquetadoras por transfeccin transitoria es ms conveniente usar el procedimiento clsico de introduccin de material gentico en clulas animales, es decir, la coprecipitacin de ADN con fosfato clcico, ya que produce menos mortalidad celular.

Prasher DC y cols. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 1992;111:2

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Ilustracin 8 Empaquetamiento transitorio de retrovirus recombinantes Una estirpe celular normal se cotransfectan con el vector retroviral genmico y con plsmidos que contienen los genes virales estructurales. Las clulas cotransfectadas expresan transitoriamente los productos de todos los genes introducidos, produciendo partculas virales con el ARN recombinante requerido.

Pseudotipaje La formacin de partculas de retrovirus recombinantes exige la participacin de un gen que codifique las protenas de la envuelta viral. La tecnologa primitiva utilizaba los genes env correspondientes a las estirpes ecotrpica (capaz de infectar exclusivamente ratones y ratas) o anfotrpica (capaz de infectar un rango ms amplio de huspedes, entre los que se cuenta la especie humana) del virus de la leucemia murina de Moloney, dependiendo, en lneas generales, del destino ltimo pensado para los vectores y de la seguridad respecto al experimentador de que se les deseaba dotar. La fragilidad que presentan las envueltas que contienen este tipo de protenas haca imposible la concentracin de virus por mtodos mecnicos, tales como la precipitacin y centrifugacin. Este inconveniente, unido al desarrollo posterior de vectores basados en el VIH, condujo a la produccin de partculas virales que contenan envueltas propias de otros virus, procedimiento al que (tomando la terminologa propia de un fenmeno natural conocido durante largo tiempo, merced al cual el virus de determinado tipo serolgico adquiran, independientemente de su genoma, caractersticas inmunolgicas de un tipo diferente) se le conoce como pseudotipaje. El gen normalmente elegido es el correspondiente a la protena G de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular, que confiere a las partculas virales la resistencia mecnica suficiente para que puedan ser sometidas a concentracin por los mtodos anteriormente apuntados6. ADENOVIRUS Los adenovirus (Ad) son virus de ADN ampliamente desarrollados en terapia gnica; su aislamiento en 1953 a partir de tejidos adenoides de nios dio origen a su nombre. A los adenovirus recombinantes usados como vectores se les han eliminado regiones de su genoma con la finalidad de inhibir su replicacin. Debido a que no se integran en el genoma del husped, estos virus slo expresan el transgn en forma temporal durante su estancia en la clula. Los adenovirus deben su uso exitoso al hecho de su seguridad biolgica, porque en forma natural en el humano slo se les ha relacionado con padecimientos de vas respiratorias. Existen ms de 40 serotipos de adenovirus, de los cuales los tipos 2 y 5 (Ad2 y Ad5) son los ms utilizados como vectores gnicos. Su
Sepiegel M y cols. Pseudotype formation of Moloney murine leukemia virus with Sendal virus glycoprotein. FJ Virol 1998; 72:5296-5302.
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produccin es relativamente sencilla, lo que ha facilitado una administracin eficiente in vivo. Estos virus tienen adems la capacidad de infectar un amplio espectro de clulas eucariotas, tanto en reposo como en replicacin, siendo su principal rgano blanco el hgado (cuando es administrado por va sistmica), en el cual logra transducciones de 8090% en hgados de rata sanos y alrededor de 40% en hgados cirrticos por el modelo de intoxicacin por CCl. El principal inconveniente para su utilizacin en el envo de genes a rganos o tejidos especficos, es la vigorosa respuesta inmunolgica que despiertan, caracterizada por una intensa inflamacin, as como por activacin de linfocitos T citotxicos. En un intento por aminorar la intensidad de la respuesta inmune despertada en el husped por el adenovirus se han escindido extensas porciones en el genoma viral produciendo as los llamados adenovirus gutless que expresan menos protenas virales; despertando por ende una menor respuesta inmunolgica. A lo largo de los ltimos aos se han desarrollado nuevas generaciones de vectores adenovirales: a) Vectores con genes inactivados, tambin denominados vectores de primera generacin, fue el primero en ser desarrollado con esta clase de virus. En la anterior revisin se trat de la base del diseo de vectores adenovirales de esta generacin, consistente, originalmente en la delecin de la regin temprana E1 del genoma. Ms tarde se aadieron deleciones en otras regiones tempranas, principalmente la regin E3, para aumentar la seguridad de estos vectores. b) Vectores vacos. Las deleciones citadas resultaron no ser suficientes para evitar el elevado riesgo de inmunotoxicidad de estos vectores, debido a la expresin remanente de protenas virales. Consecuentemente se desarrollaron los denominados vectores vacos en los que slo se mantienen las secuencias necesarias en cis, incluyendo los dos orgenes de replicacin en los extremos del genoma, as como las secuencias de empaquetamiento. La produccin de estos vectores requiere el uso de adenovirus auxiliares, que pueden ser separados mediante tcnicas biofsicas gracias a su diferente contenido en ADN. Un mecanismo adicional de seguridad que evita la produccin de stos consiste en el flanqueamiento de la regin de empaquetamiento de los virus con la secuencia IoxP, que, en presencia de la recombinasa Cre se escinde, evitando la encapsidacin del genoma del virus auxiliar (Ilustracin 9). En la actualidad, se estn llevando a cabo mejoras en las lneas productoras de estos vectores que permitan su produccin a gran escala en biorreactores. La eficacia de estos vectores est siendo evaluada en tratamientos tan diversos como la disfuncin erctil, mediante la transferencia del gen de la sintetasa de NO neuronal (nNOS) en el pene de ratas envejecidas, o la hemofilia A con un vector que contiene el gen del factor de coagulacin VIII y cuya administracin intravenosa en ratones permite una expresin mantenida durante nueve meses frente a los tres obtenidos con un vector de primera generacin, as como la prdida visual debida a retinopatas de origen diabtico tras la inyeccin intraocular de adenovirus vacos que expresan el gen de la endostatina, un inhibidor de la vascularizacin coroidal. c) Adenovirus oncolticos. El descubrimiento en 1996 de que ciertas estirpes de adenovirus con mutaciones en la zona E1B del genoma (gen que codifica una protena capaz de inactivar el gen supresor de tumor p53), podan replicar y lisar clulas humanas deficientes en p53, condujo al desarrollo de nuevas estrategias antitumorales. Los xitos obtenidos con este nuevo tipo de virus denominado ONYX-015 en ensayos clnicos de fase I y II ha permitido la realizacin de ensayos clnicos en fase III para el tratamiento de carcinoma de clulas escamosas de cuello y cabeza.

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Sin embargo, no todos los protocolos clnicos ensayados han tenido el xito que cabra esperar. Una de las razones de ello estriba en la ausencia de un receptor celular adecuado para estos vectores en las clulas tumorales. Entre los tratamientos que s parecen estar funcionando, cabe destacar los protocolos en fase II aprobados para pacientes de cncer colorrectal, con tumores hepatobiliares, o con carcinomas pancreticos no extirpables.
La estirpe celular 293Cre se transfecta con un plsmido que contiene el transgn flanqueado por los extremos del ADN de adenovirus, incluyendo las ITR y las secuencias de empaquetamiento, adems de secuencias de ADN no expresable cuya misin es que la distancia entre los extremos sea la apropiada para que el tamao del ADN permita su encapsidacin, las clulas transfectadas se infectan con un adenovirus auxiliar cuyo ADN aporta todos los genes virales necesario para la formacin de las cpsidas, pero cuya zona de empaquetamiento est contenida entre dos regiones IoxP. La recombinasa Cre expresada por las clulas promueve la recombinacin entre ambas regiones IoxP, eliminando la regin de empaquetamiento del ADN auxiliar, que no puede entrar a formar parte de la progenie. En cambio, el ADN que contiene el transgn el empaquetado normalmente para dar lugar a partculas de virus recombinante.

Ilustracin 9 Empaquetamiento de seguridad de adenovirus recombinante

En la tabla 5 se resumen las ventajas y desventajas presentadas por los vectores virales utilizados en terapia gnica entre los que destacaremos los retrovirus, adenovirus y el herpes simple.
Tabla5. Caractersticas de los vectores biolgicos utilizados en terapia gnica
Retrovirus

Vector

Adenovirus

Adenoasociados

Integracin estable Fcil manejo No provocan respuesta inmune Transduccin eficiente Clulas en reposo o replicacin Episomales Estables in vivo Ttulos altos Clulas en reposo o replicacin Posible integracin especfica Poco inmunognicos Ttulos altos No son patgenos en humanos Clulas en reposo Episomales Adecuados para el sistema nervioso

Ventajas

Bajo ttulo Posible mutacin insercional Extincin del transgn in vivo Requieren proliferacin celular
Respuesta inmune e inflamatoria Direccionabilidad difcil Difcil manejo

Desventajas

Poca longitud del transgn Difciles de producir en gran cantidad No parecen transducir a todo tipo de clulas in vivo
Posible mutacin insercional

Herpes virus

Patogenicidad Difcil manejo

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BIBLIOGRAFA

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