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REACCIONES DE CARACTERIZACION DE AMINOCIDOS Y PROTEINAS

OBJETIVOS: Efectuar algunas reacciones para comprobar la presencia de protenas. Comprobar la presencia de algunos aminocidos en forma libre o haciendo parte de las protenas con base en las reacciones caractersticas de los grupos funcionales de esos aminocidos.

FUNDAMENTOS: Para escudriar si en una determinada muestra biolgica hay protenas pueden utilizarse numerosas reacciones, unas relacionadas con la presencia en la cadena polipeptdica de determinados aminocidos generalmente triptfano y tirosina o bien basarse en la misma estructura polipeptdica, como es el caso de la reaccin del Biuret, propia de las series de al menos 2 enlaces peptdicos contiguos y que, por tanto, permite valorar casi todos los tripptidos y todos los pptidos del orden superior incluidas las protenas. Reaccin de la ninhidrina: La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con el grupo amino de aminocidos libres y con los grupos amino de la molcula protenica para dar un compuesto azul violeta. Los aminocidos prolina e hidroxiprolina tambin reaccionan con la ninhidrina pero en este caso se obtiene un color amarillo en lugar del violeta. La reaccin es muy sensible por lo cual se utiliza en cromatografa y en la deteccin de aminocidos y protenas en muestras biolgicas.

Reaccin del Biuret: Cuando una disolucin alcalina de sustancias que contienen enlaces peptdicos tales como el Biuret, la oxamida, los polipptidos y las protenas, se aade sulfato cprico, se forman sales complejas de color violeta. El nombre de reaccin del biuret proviene de un derivado de la urea, el biuret, que, en condiciones apropiadas, da esta reaccin. El biuret se forma en el curso del calentamiento de la urea, con desprendimiento de amoniaco: El biuret contiene en su molcula dos enlaces amida sucesivos, de modo anlogo a las protenas, donde se presentan numerosos enlaces peptdicos sucesivos. Este biuret en medio alcalino forma unos complejos de coordinacin con el cobre, de color azul morado caracterstico. La reaccin es cuantitativa y permite valorar la presencia de protenas con bastante exactitud e independientemente del tipo de protena.

H2N -C- NH2 + H2N -C- NH2 O O Urea Urea

H2N-C NH -C- NH2 + NH3 O O biuret amoniaco

Reaccin xantoproteca La reaccin xantoproteca (del griego xanthos, amarillo) permite descubrir en la molcula de protena la presencia de aminocidos aromticos (fenilalanina, tirosina, triptfano). Estos aminocidos, al nitrarse, producen un compuesto de color amarillo, caracterstico de los nitrobencenos. No todas las protenas dan positiva esta reaccin ya que en unas pocas la presencia de tirosina, triptfano y fenilalanina es extremadamente baja o nula. Este es el caso de la gelatina derivada del colgeno.

Reaccin de Millon Esta reaccin se debe a la presencia, en la molcula de protena, de la tirosina, que tiene en su composicin un grupo fenlico. Este, por calentamiento con el reactivo de Millon (una mezcla de nitrato y nitrito mercrico disueltos en cido ntrico concentrado), produce una coloracin roja que se debe a la formacin de nitrotirosina que, por adicin de mercurio en el curso del calentamiento, se transforma en una sal mercrica de color rojo.

Reconocimiento de arginina La arginina, en presencia de -naftol, se oxida con hipobromito, perdiendo un grupo imino. La arginina oxidada, al combinarse con otra molcula de -naftol, forma una sustancia de color rojo que permite reconocerla. Reconocimiento de triptfano. El triptfano en presencia de iones de magnesio y de cido oxlico (reactivo de Hopkins-Cole) y con la presencia de un cido mineral, como el cido sulfrico, produce coloraciones violeta en la interfase que se forma, debido a la formacin de complejos con el grupo indol del triptfano.

Determinacin de la presencia de aminocidos azufrados en las protenas La determinacin de la presencia de aminocidos sulfurados se realiza mediante una hidrlisis (puede ser incompleta) de la protena en un medio fuertemente alcalino, que conlleva a la destruccin de los aminocidos sulfurados liberando el azufre que contienen en forma de sulfuro, ion que se puede poner de manifiesto con la adicin de una sal soluble de plomo, con el que precipita el sulfuro de plomo, de color negro fcilmente reconocible:
NH3
+

NH3
-

HS CH2 CH COO + 2 NaOH Cisteina Na2S + (H3C COO)2Pb

HO CH2 CH COO + Na2S + H2O 2 H3C COONa + PbS negro

MATERIALES Y REACTIVOS: Bao mara Hielo 20 ml casena 0.5% 20 ml gelatina 0.5% 20 ml suero sanguneo 1 clara de huevo diluida en 20 volmenes de agua 20 ml glicina 0.1% 5 ml prolina 0.1% 10 ml metionina 0.1% 5 ml fenilalanina 0.1% 10 ml de cido actico glacial. 10 ml tirosina 0.1% 5 ml triptfano 0.1% 5 ml arginina 0.1% en cido sulfrico 0.1N 5 ml cisteina 0.1% en cido clorhdrico 0.1N 5 ml cistina 0.1% en cido clorhdrico 0.1N 10 ml ninhidrina al 0.1% en acetona 10 ml NaOH 30% 1 ml sulfato cprico 1% 10 ml cido ntrico concentrado

10 ml reactivo de Millon 10 ml de reactivo de Hopkins-Cole. 10 g de Mg en polvo diluirlos en agua, se agrega 250 ml de cido oxlico fresco. Se agita y se filtra. Se acidifica el filtrado con cido actico y diluir hasta 1 litro con agua. 1 ml -naftol 0.05% en etanol-agua (1: 1) 1 ml hipobromito sdico 1N 10 ml acetato de plomo 10% 10 ml de nitrito de sodio. 5% 10 ml de urea 40%

PROCEDIMIENTO: Realice las diferentes pruebas con la solucin de protena obtenida en la practica de aislamiento de protenas con la solucin de protena de los que se encuentran en la mesa de reactivos y con los aminocidos que se mencionan en cada caso. Reaccin de la ninhidrina En diferentes tubos de ensayo tome 1 ml de la solucin de cada una de las protenas (la obtenida por usted y una de las que se encuentran en la mesa de reactivos) y 1 ml de glicina, metionina y prolina, agregue 1 ml de ninhidrina a cada tubo y caliente a ebullicin en bao mara durante 10 minutos. La solucin debe adquirir un color violeta azul o amarillo, en el caso de la prolina. Deteccin de aminocidos azufrados: Se toma 1 ml de la muestra (protena y glicina, metionina, cisteina y cistina) en diferentes tubos y se aade a cada uno 1 ml de hidrxido de sodio al 30%, se calienta en bao mara durante 10 minutos. Se enfran los tubos en un bao de agua fra, se aaden 2,5 ml de acetato de plomo al 5%, se agita bien, se calienta suavemente y se observa el oscurecimiento progresivo de la solucin.

Reaccin del biuret Tome en un tubo 1 ml de la solucin de protena y en otro tubo 1 ml de glicina se les aade 2 ml de hidrxido de sodio al 30%, se mezcla cuidadosamente y se agregan tres gotas de sulfato cprico al 1%. Se mezcla de nuevo. La aparicin de una coloracin rojiza violeta indica la presencia de enlaces peptdicos.

Reaccin xantoproteca Se toma en un tubo 1 ml de la solucin de protena y en otros tubos 1 ml de la solucin de los aminocidos (glicina, fenilalanina, tirosina, triptfano) agregue luego 1 ml de cido ntrico concentrado. En el caso de las protenas se observa la aparicin de un precipitado blanco que corresponde a la protena desnaturalizada. Caliente en bao mara durante 5 minutos. La solucin o el precipitado se tien de amarillo. En caso de duda se deja enfriar el tubo de ensayo y se aaden 2 ml de hidrxido de sodio al 30%. El color amarillo vira a naranja fuerte.

Reaccin de Millon Tome en diferentes tubos de ensayo 1 ml de la solucin de protena y 1 ml de las soluciones de aminocidos (glicina, tirosina y triptfano) adicione 0.5 ml del reactivo de Millon y agite. Posteriormente agregue 0,5 ml de nitrito sdico y agite. En los tubos que contienen protenas se forma un precipitado blanco. Caliente los tubos en bao mara durante 5 minutos. La tirosina y las protenas que la contienen adquieren un color rojo. Reconocimiento de arginina En varios tubos de ensayo tome 1 ml de las protenas y de los aminocidos arginina y glicina aada 0.1 ml de hidrxido de sodio al 30% y 0.3 ml de -naftol al 0.05%. Se agita y se deja 5 minutos en un bao de hielo.

A continuacin se aaden 1 ml de hipobromito sdico 1N. La reaccin es positiva indicando la presencia de arginina u otra guanidina, al aparecer una coloracin roja viva que se desvanece con relativa rapidez. La adicin de 0.3 ml de urea al 40% estabiliza el color.

Reconocimiento de triptfano. Reaccin del cido glioxlico: Se toma en diferentes tubos de ensayo 1 ml de los aminocidos arginina, glicina, metionina y triptfano, y en otro tubo 1 ml de protena. Adicione a cada tubo 1 ml de cido actico glacial; luego deje caer lentamente por las paredes del tubo 1 ml de cido sulfrico concentrado hasta que se formen dos fases. Observe el cambio de color en la interfase. Si en ella se forma un anillo violeta, la reaccin es positiva e indica la presencia del aminocido triptfano.

RESULTADOS: Prueba muestra Protena Muestra problema Glicina Prolina Fenilalanina Tirosina Triptfano Arginina Metionina Cisterna Cistina

ninhidrina

biuret

xantoproteca Millon

arginina

triptfano azufrados