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Protenas y pptidos teraputicos recombinantes Enzimas recombinantes Vacunas recombinantes Otros ejemplos de aplicacin de la ingeniera gentica

1973: primer experimento de clonacin molecular. VIA para producir microorganismos. protenas de genes introducidos en

NUEVA ERA en la domesticacin de seres vivos: ms racional y menos emprica 1976: primer ejemplo de produccin de protenas teraputicas por ingeniera gentica: somatostatina de bacterias, un neurotransmisor de solo 14 aminocidos. Ingeniera gentica: permita producir grandes cantidades de productos con gran valor aadido, difciles o imposibles de producir por otros medios. Intereses sanitarios y farmacuticos: empujaron la aplicacin de la nueva gentica para obtencin de nuevos frmacos. Se crearon cientos de pequeas empresas: absorbidas por grandes compaas. Ha surgido nueva empresa basada en la nueva biologa. Las farmacuticas orientadas hacia la farmacologa de base gentica. Las alimentarias, las agroqumicas, etc, van introduciendo igualmente estas novedades. La nueva gentica, incluyendo la genmica: base de la nueva generacin de productos irn apareciendo en campos diversos:

 farmacologa diagnsticos alimentacin industria qumica tratamiento de residuos.

1. Protenas y pptidos teraputicos recombinantes

Numerosas protenas potencialmente teraputicas , que antes se producan en pequeas cantidades, ahora pueden elaborarse en grandes cantidades. Existen cientos de genes de protenas teraputicas expresados a nivel de laboratorio, y que estn intentando demostrar su adecuacin clnica. Existen ms de 30 protenas aprobadas para su uso clnico .
Sustancia factor antihemoflico DNasa I Eritropoyetina (EPO) Glucocerebrosidasa Hormona del crecimiento Insulina Interfern alfa-2 Interfern alfa-2b Interfern alfa-n3 Interfern gamma-1b Interleucina-2 Somatotropina Activador tisular del plasmingeno (tPA) Empresa Miles, Baxter, Genetics Institute Genentech Amgen, Ortho Biotech Genzyme Genentech Eli Lilly Hoffmann-LaRoche Schering-Plough Interferon Sciences Genentech Chiron Eli Lilly Genentech Enfermedad Hemofilia A Fibrosis qustica Anemia, enf. Renal Enfermedad de Gaucher Enanismo hipofisario Diabetes ciertas leucemias, sarcoma de Kaposi ciertas leucemias, Sarcoma de Kaposi, hepatitis B y C Herpes genital enf. granulomatosa crnica Carcinoma clulas renales Deficiencia hormona crecimiento Infarto agudo de miocardio, embolismo pulmonar masivo

El % de protenas teraputicas fabricadas por mtodos recombinantes Ir creciendo. En el 2000 su valor era de 20.000 millones de dlares.

Comentemos algunos ejemplos citados en la tabla: La insulina es el primer caso de protena por ingeniera gentica:

 1982: uso en humanos (nombre comercial: Humulina, de la compaa Eli-Lilly). Los mamferos producen insulina en clulas beta de los islotes de Langerhans del pncreas: regula niveles de glucosa en sangre. El defecto de su sntesis conduce a la diabetes.

Hasta la ingeniera gentica la insulina para diabticos proceda de pncreas de cerdos o vacas : es biolgicamente activa en humanos, pero no es idntica. Se pueden producir algunas reacciones inmunes adversas.

La hormona de crecimiento: Pptido de 191 aminocidos producido por la hipfisis (glndula pituitaria), que estimula el crecimiento normal. Su deficiencia: enanismo hipofisario. Antes, se trataba con hormona extraida de cerebros de cadveres extraccin larga y costosa, con poco rendimiento, cuyo producto daba infecciones con virus y priones procedentes de los cerebros de los cadveres.

Se ha resuelto con ingeniera gentica. Millones de dosis de hormona

recombinante se administran cada ao a miles de pacientes. DNasa-I : Se aprob el uso de DNasa-I: tratamiento de la fibrosis qustica (enfermedad monognica frecuente en poblaciones caucasianas, los afectados son muy susceptibles a infecciones bacterianas en pulmones, se acumula un grueso moco que dificulta la respiracin). La DNasa-I administrada como aerosol: rompe ADN del moco acumulado disminuyendo su viscosidad y facilitando la respiracin del paciente.

Igualmente se intenta obtener una alginato-liasa: rompe el componente alginato secretado por Pseudomonas aeruginosa responsable de buena parte del moco de los enfermos de fibrosis qustica.

Activador tisular del plasmingeno (tPA) Es la primera protena teraputica recombinante obtenida en clulas de mamfero (tPA) se administra a vctimas de ataques cardacos (infarto agudo de miocardio). cataliza la conversin del plasmingeno en plasmina , que disuelve la fibrina del cogulo sanguneo. El tPA recombinante, desarrollado por Genentech fue aprobada en 1987 (nombre comercial Activasa).

Ademas se ha aprobado su empleo en el: embolismo pulmonar agudo (1990) y en la isquemia aguda (1996).

2. Enzimas recombinantes
Existen muchos mbitos econmicos donde se requiere el uso de enzimas animales, vegetales o microbianas Las enzimas microbianas se emplean: en la obtencin de jarabes de glucosa y fructosa en detergentes y en textiles Suelen ser enzimas que hidrolizan polmeros, como protenas y polisacridos. La produccin industrial de enzimas:

 negocio a comienzos del siglo XXI con 1.600 millones de dlares al ao, el 70% se debe a al gnero Bacillus. Veamos el desglose por grupos de enzimas y actividades comerciales (aos ochenta): Tipo de enzimas Actividad econmica Sacarasas e isomerasas Procesamiento del almidn, endulzantes y jarabes ricos en fructosa Fabricacin de textiles Detergentes Carnes, quesos Procesamiento de pescado Procesamiento de tejidos 150 Millones $ / ao

Proteinasas

400

Renninas (quimosinas) Lipasas

Coagulacin de la leche para produccin de quesos Detergentes Procesamiento de pieles Saborizantes Procesamiento de carne y queso

60 20

Celulasas

Produccin de zumos de frutas Produccin de olivas Modificacin de granos y fibras Envejecimiento de prendas vaqueras

20

Para usar un microorganismo que produzca enzimas de consumo humano, se deben de cumplir requisitos legales: tal microorganismo debe figurar en la lista GRAS (generally aknowledged as secure), es decir, que haya demostrado una larga historia de seguridad. Existen unos 50 microorganismos GRAS aprobados para la industria alimentaria, citamos los siguientes: Bacillus, como p. ej. B. subtilis y B. licheniformis. Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadera). Aspergillus niger y A. oryzae. Lactobacillus y estreptococos lcticos. La produccin de enzimas por microbiologa industrial era ya un negocio floreciente ante de la era del ADN recombinante la INGENIERIA GENETICA. se adapta perfectamente a la mejora de esta biotecnologa comercial, y empez a usarse de modo casi inmediato. En la industria alimentaria: Quimosina recombinante (rennina) para la elaboracin de quesos . Muy empleada en EE.UU y Gran Bretaa (90% de los quesos duros) sustituye a la escasa quimosina de terneros y a la biotecnolgica tradicional obtenida de hongos (Rhizomucor, Endothia parasitica). se obtiene en Kluyveromyces lactis y Aspergillus niger manipulados.

Somatotropina bovina recombinante estimula la produccin de leche de vacas en los EE.UU. (aprobada por la FDA en 1994 para Monsanto (nombre comercial de Prosilac). En la industria de detergentes: La Lipolasa de Novo-Nordisk (ahora Novozymes) primera enzima recombinante aprobada para detergentes. Su gen, aislado de hongo Humicola se transfiri a Aspergillus oryzae. La cutinasa de Fusarium, buena degradadora de cidos grasos se expresa en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Entre las proteasas Se destaca la subtilisina de Bacillus licheniformis y B. amyloquefaciens ayuda a eliminar manchas de sangre, comida, etc. Por ingeniera de protenas ha sido posible mejorarlas buenas cualidades de la subtilisina, creando variantes resistentes a la oxidacin por perxido de hidrgeno derivado de los perboratos, resistentes a pH alcalinos y termorresistentes.

3. Vacunas recombinantes
Las vacunas tradicionales suelen ser de dos tipos: microorganismos inactivados (muertos) o microorganismos vivos pero atenuados : normalmente requieren cultivar el microorganismo responsable de la enfermedad frente a la que se pretende inmunizar.

Pero hay varios inconvenientes con este tipo de enfoque: no todos los microorganismos se pueden cultivar la produccin es cara: caso de vacunas frente a virus se requieren medidas de seguridad en los laboratorios productores que manejan el patgeno se requieren medidas muy estrictas para asegurar la completa inactivacin o la atenuacin adecuada de la cepa. De vez en cuando, la cepa atenuada puede recuperar la virulencia hay enfermedades, como el sida, que no parecen doblegarse al diseo tradicional de vacunas La tecnologa del ADN recombinante permite nuevos enfoques para el diseo y produccin de vacunas:

Vacunas a base de subunidades del agente patgeno . la actual vacuna de hepatitis B usa un determinado antgeno aislado del virus: el HBsAg, producido por ingeniera gentica en levaduras. El antgeno se produce a altos niveles en grandes fermentadores, de modo seguro. Se est avanzando en vacunas subunitarias frente al virus del herpes simple (HSV) Vacunas frente a la glosopeda (fiebre aftosa) del ganado de pezua hendida: se est ensayando una a base de la protena VP1 de la cpsida del virus Ahora que se ha completado la secuencia del genoma del bacilo de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), se abren ms perspectivas de vacunas ms efectivas y seguras que la actual basada en el bacilo de CalmetteGurin (CGB), una cepa de Mycobacterium bovis. Nuevas vacunas atenuadas: Estrategia bsica: manipular un agente patgeno para eliminarle genes de virulencia mientras que retiene su capacidad de estimular el sistema inmunitario. el microbio manipulado se podra emplear como vacuna viva atenuada segura, sin miedo a que revierta al tipo virulento, como pasa hoy. los microorganismos completos suelen ser ms efectivos que las vacunas subunitarias. Se han diseado cepas estables del agente del clera (Vibrio cholerae) desprovistas del gen de su potente enterotoxina actualmente estn en fase de ensayos clnicos. En el caso de Salmonella se ha ensayado quitarle ciertos genes no relacionados con la virulencia, pero que al desaparecer convierten a la cepa en atenuada (disminucin de su virulencia en un milln de veces). Han mostrado su efectividad en ovejas, bovinos, pollo e incluso, ms recientemente, en humanos. Vacunas vectores: uso de microorganismos no patgenos que incorporan genes determinantes de antgenos protectores para ciertas enfermedades. el virus vacunal: es un buen candidato a ser vector de vacunas, ya ha venido siendo usado para la erradicacin de la viruela. Se trata de un poxvirus con genoma de 187 kb, totalmente secuenciado permite acomodar varios genes forneos en su interior. Si colocamos un gen bajo el control de un promotor del virus vacunal, este

gen se expresa en el organismo hospedador. Se han ensayado las expresiones de genes intereresantes como: antgenos de virus de la rabia hepatitis B gripe herpes simple. Se puede intentar vacunar simultneamente para varias enfermedades. Otros ejemplos de virus vectores candidatos: Adenovirus Poliovirus varicela-zoster. Vectores bacterianos: la idea es expresar antgenos de bacterias patgenas en la superficie de bacterias no patgenas.

4. Otros ejemplos de aplicacin de la ingeniera gentica

la I.G. encuentra su aplicacin inmediata en la produccin del producto directo del gen, es decir, la protena no se puede olvidar que tambin puede ayudar a producir sustancias y metabolitos no proteicos, ya que en la biosntesis de stos intervienen protenas catalizadoras (enzimas) a su vez susceptibles de poder mejorarse o incrementarse su produccin mediante las nuevas tcnicas. Trataremos algunos ejemplos: Sntesis de antibiticos. mejoras en procesos tradicionales: p. ej., ampliando los "cuellos de botella" metablicos con ingeniera metablica. sntesis de nuevos antibiticos, fusionando rutas de dos antibiticos diferentes: la mederrodina deriva de transferir genes de actinorrodina a una cepa productora de medermicina manipulando racionalmente rutas de antibiticos: la delecin de un gen para un mdulo enzimtico de una ruta de polictido gener un nuevo antibitico de la familia de la eritromicina. Sntesis de aminocidos: los aminocidos se producen para varios fines: aditivos mejoradores del sabor de alimentos suplementos de dieta en industria qumica, cosmtica, para suministros mdicos, etc. Aunque esta biotecnologa tiene casi un siglo de vida y ya haba llegado a cierta madurez, se han logrado mejoras en la produccin de lisina, glutmico y triptfano por parte de bacterias industriales Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium spp.

 En la mayor parte de los casos, se trata de ampliar cuellos de botella metablicos y eliminar mecanismos de retroinhibicin y de represin por producto final. Sntesis del ndigo: se emplea como colorante para las prendas tejanas (blue-jeans), el proceso era puramente qumico y contaminante. Se ha desarrollado un sistema para producir este colorante de modo limpio en bacterias manipuladas genticamente (no se requieren sustancias qumicas peligrosas como anilinas, formaldehido, cianuro, etc). Produccin de enzimas para detergentes de lavadoras : la subtilisina es una enzima producida por razas de Bacillus subtilis se viene usando, junto con otras enzimas microbianas, como aditivos que mejoran el poder limpiador de los detergentes para ropa. La subtilisina natural tiene el inconveniente de que se inactiva con la leja. Mediante una tcnica gentica llamada "ingeniera de protenas", se logr cambiar un determinado aminocido (Met-222) por otro (Ala-222), la nueva subtilisina resista a la leja. Por mtodos parecidos se han diseado variantes que aguantan altas temperaturas, por lo que se pueden usar en programas de lavado en caliente. Procedimientos industriales "verdes". Se estn haciendo esfuerzos para que la ingeniera gentica los impulse Aqu algunos ejemplos: Produccin de plsticos biodegradables. ciertas bacterias (Ralstonia eutropha) producen grnulos de reserva de polihidroxialcanoatos, sustancias de notables propiedades termoplsticas y elsticas. Se han diseado cepas de bacterias con los genes de biosntesis de estas sustancias. Hay empresas que fabrican estos plsticos biodegradables para usos especiales: dispositivos mdicos (el Biopol de la Monsanto). Se hacen esfuerzos para abaratar costos, principalmente con plantas transgnicas. Es posible los precios sean competitivos e ir sustituyendo los plsticos sintticos, contaminantes y gastadores de combustibles fsiles, por los bioplsticos, biodegradables y dependientes de biomasa y recursos naturales renovables. La bacteria Xanthomonas campestris produce el xantn Exopolisacrido con mltiples emulsificante y espesante. aplicaciones industriales: agente

Para hacer ms rentable el proceso de produccin industrial, se disea

cepas manipuladas de esta bacteria para usar como fuente de carbono desechos de industrias, como lactosuero de las queseras. Las melaninas Uso: bronceadores, protectores solares de plsticos , etc., Se suelen obtener de modo qumico o extraccin de organismos: procedimientos ineficientes Se han localizado y aislado los genes de sntesis de melanina en la bacteria del suelo Streptomyces antibioticus, y se han transferido a otras bacterias ms fciles de manejar, logrndose su expresin. Producir adhesivos biolgicos : Se estn intentando por ingeniera gentica. Por ejemplo, se aisl el gen de una protena adhesiva del mejilln (Mytilus edulis), y se ha logrado expresar en microorganismos. De tener xito, esta protena adhesiva pueda emplearse en adhesivos para dentistas y mdicos. Obtener caucho: A partir de genes de la planta productora ( Hevea brasiliensis): Se han iniciado estudios para ver la viabilidad por ingeniera gentica,

Enrique Iez Pareja . Instituto de Biotecnologa . Universidad de Granada http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/ingenetindustrial.htm