Enzimas3 los catalzadores de la vida

http://booksmedicos.blogspot.com
T'r .n el Captulo5 hicimosreferencia a AG', la variacin libre,y vimos su importanciacomo indicador de energa de la espontaneidad termodinmica. Concretamente, el signo de AG' nos dicesi una reaccin esposibleen la diyla magnitud reccinindicada, de A,G'indicala cantidad (o quedebesersuminisquepuedeserliberada de energa trada),mientrasque la reaccin tienelugar en esadirecparalascuales cin,bajolascondiciones secalcul AG'. Al mismo tiempo,pusimoscuidadoen sealar que el parmetro termodinmicoAG' no puede proporcionarnos ningunapista.encuantoa si una reaccin factibletendr y a quvelocidad. lugarrealmente, En otraspalabras, AG' nos dice si una reaccinpuedetener lugar pero no dice nadaen absolutosobresi realmentetendrlugar. Paraesta distincin,necesitamos conocer, no slo la direcciny la energla de la reaccin, sino tambinalgoacerca del mecanismoy la velocidad. Esto nos lleva al tema de la catlisisenzimtica, porqueprcticamente lasreacciones todas o procesos celulares (o, en ciertoscasos, por protenas son mediados ARN) catalizadorasllamadasenzimas. Las nicas reacciones que ocurrena unavelocidad apreciable en una clula sonaquellasparalascuales lasenzimas apropiadas y estnpresentes activas. As,las enzimascasisiempresignificanla diferencia entre<puede tenerlugar>y <tendr lugao en lasreaccionescelulares. Slo cuandoexploramos la naturaleza de y suspropiedades las enzimas catalizadoras, comenzamos por qulasreacciones quesonfactibles energa entender ticamente,tienen lugar realmenteen las clulas y cmo se controlala velocidad de talesreacciones. En estecaptulo,consideraremos primero por qu las reacciones termodinmicamente espontneas no tienen lugar normalmentea velocidades apreciables sin un catalizador,y despus veremos el papel delas enzimascomo catalizadoresbiolgicos especficos. Thmbin veremos cmo Ia velocidad de una reaccin catalizadaenzimticamente se ve afectada por la concentracin del sustrato disponible para la reaccin. Asimismo, se analizarn algunas de las formas de regulacin de la tasade reacciones encaminadas las necesidades a satisfacer de la clula.

Energa de activacin y el estado metaestable

ustedya estfamiliarizado Si se detienea pensarlo, con que son termodinmicamente muchasreacciones factibles,aunqueno ocurranmuy a menudo.Un ejemploevidente,considerado en eI Captulo5, esla oxidacinde la (vaseReaccn (realmente, glucosa 5.9).Estareaccin se(AG'= -686 rie de reacciones) es altamente exergnica no ocurrepor s misma.De hekcal/mol) sin embargo, en forma cristalina o en solucin, cho,la glucosa sepuede y la oxidaexponeral oxgenodel aire indefinidamente, cin ser mnima o inclusoinexistente. La celulosa del papel sobre el cual estnimpresas estaspalabras, es otro ejemplo,como lo es usted mismo, que estformado por un conjuntocomplejode molculas termodinmicamente inestables. pero igualmenteimportantespara la No tan cercanas, qumica celular,son muchasreacciones termodinmicapero que no tienenlugarpor s mismasa mentefactibles, una velocidadapreciable. Como ejemplo,consideremos a adenosina la molculade alta energa trifosfato(AIP),la (-7,3 kcal/mol) cual tiene una AG' altamente favorable para la hidrlisis de su grupo fosfatoterminal, durante la
y el estado Energa deactivacin metaestable

r39

molculas deATPI HzO alcancen el estado de transicin. AG" mide la diferencia en la energa libre entrelos reactivosy los productos(-7,3 kcal/molpara estareaccin AIP + HrO: (6.1) ADP + Pi en particular),mientrasEo indica el mnimo de energa Estareaccin esmuy exergnica bajo condiciones esrequeridapara que los reactivosalcancenel estadode tndare inclusolo esms en las condiciones que prevale- transiciny, por tanto, seancapaces de dar lugar a los cenen lasclulas. Sin embargo, a pesar de quela variacin productos. de energa libre esmuy alta,esta reaccin tienelugarpor s La velocidad real de una reaccin es siemprepropormismaslolentamente, de maneraqueel ATP permanece cional a la fraccin de molculasque tienen una energa establedurante varios das cuando se disuelveen agua igualo mayorqueEo.Cuandoen una solucin a temperapura. Estapropiedadparece ser compartidapor muchas tura ambiente, lasmolculas de ATP y aguasemuevenlimolculas y reacciones biolgicas. bremente, cadauna posee una ciertacantidadde energa en un momentodado.Como semuestra en la Figura6.ib, la distribucin de energa entre las molculas tieneforma La barrera de aetivacin energtica debeser superada de campana; algunas molculas poca tendrn energa, alantesde quese pueda quimica verificar unareaccin gunaspodrn tenermucha,y la mayoraestar cercadel Lasmolculas que deberan reaccionar entres,a menudo promedio.El hechoa destacar es que slo las molculas no lo hacen porquecarecen de energa suficiente. Para toda capaces de reaccionar en un instantedado,son las que tiereaccin,hay una energade activacin especfica(.Eo), nensuficiente parasuperar energa la barrera de energa de definidacomo la cantidadmnima de energa (Figura6.1b,lneadiscontinua). que los reacactivacin tivos debentener antesde que la colisinentre ellostenga xito,dandoorigena los productos. Ms especficamente, Elestado metaestable eseilesultado dela barera los reactivosnecesitan a).canzar un estadocumico interde activacin medio llamado estadode transicir, .tryi energa libre es mayor que la de los reactivos iniciales. La Figura6.la La energade activacin es,para la mayora de las reacciomuestrala energade activacinrequeridapara que las nes biolgicas a temperaturas celularesnormales, lo sufiFigura 6.1 Efectode la catlisisen la y en el nmero ener$a de activacin de molculas capaces de reaccionar. (a) La energade activacin E, esIa cantidad mnima de energacintica que deben poseerlos reactivos(aqu, ATP y HrO) para permitir ias colisiones que conducen a la formacin del producto. Cuando los reactivosrebasanla barrera de energiade activacin y reaccionan, los productos tienen una energalibre reducidaen una cantidadAG". (b) El nmero de molculas N1,que son lo suficientementeenergticas para sobrepasar la barrerade energa de activaciny chocarsatisfactoriamente, sepuede incrementar a N2, elevandola temperatura de T, a Tr. (c) La energade activacin tambin puede disminuirse por un catalizador,(d) incrementndose as el nmero de molculasde \ a Nr', sin que cambie la temperatura.

formacin del correspondiente difosfato (ADP) y fosfato inorgnico(P'):

Estado de transicin
t\ c) _o

(
@

(
c LU

1T:
A flo'

f O 'q)

o) c)

t
I

ADP+l

o E o o o c)
.l

E z
Fnornia intina

(a) Secuencia de reaccin

/v1
N2

de as molculas

(b) Activacin termal

t\

5 o .c) E c) c o c) E .l

c c) -c) q) LL

z
(c) Secuencia de reaccin con catalizador

Fnarne

nintia

A' /1 ,

de las molculas\-.J N; (d) Activacincataltica

-.--\40 Gaptulo 6 Enzimas: los catalzadores delavida

cientemente alta para que la proporcin de molculas que posean mucha energa en un instante dado, sea extremadamente pequea. Por consiguiente, la velocidad de las reacciones no catalizadasen las clulas es my baja, y la mayora de las molculas parecen ser estables,pese a ser reactivos potenciales en reaccionesfavorecidas termodinmicamente. Son, en otras palabras, termodinmicamente inestables,pero no tienen la energa suficiente para sobrepasar la barrera de la energa de activacin. Talesmolculas, aparentemente estables,se dice que eslas clgljtslos- biolgitn en un estado metaestable._P*arp

pueden Si los reactivos que facilitequelas agruparse sobrealgntipo de superficie porcionespotencialmente reactivas de lasmolculas adyala interaccinse centesse yuxtaponganapropiadamente, y la energa verfavorecida enormemente de activacin reducida de maneraeficaz. reactiva Latareadeproveerde tal superficie esla propia que aumentalavelocidad de un catalizador,agente de una reaccin,disminuyendola energade activacin (Figura que una proporcin mayorde molcu6.lc) y asegurando para experimentarla energticas las sean suficientemente Ia enere de acti-vggig3lta el..estado cos celulares, gg -'-y_ -{PGf'?YfFffi(Figura reaccin sin suministro de calor 6.1d).Una caracloi'b6fi cel ulare s, so n c ru c iale s, cler ' - . - . . . . stabT-e rn-etae ftluEt6 .-:+,:,...-_"^,-..:,,' r, i-e _-_primordialde un catalizador esoueno semodifiporque Ia ?ida, pdr sb'plopia naturaleza, es un sistema terstica estacionario lejosdel equilibrio. capermanente_nqeIte.nisg__g9nslrng.nienjrailalga$tqr-r mantenidoen un estado ! na_u amb_i rnle j-d-emetaestable, todaslasreacciones t iene lugatSim plenete,plo poLsr Si no fuerapor el estado cuado paa Q_c-i!!1adq tenderanrpidamente al equilibrio y la vida seraimposi949qi_q, considerar la descomposicin del perxido Podemos La vida,por lo tanto,depende ble tal comola conocemos. como un ejemplode cade hidrgenoen aguay oxgeno, de activacinseanaltas, evitandoque la de quelasenergas mayorade las reacciones celulares ocurran a velocidades tlisis: de un catalizador apropiado. apreciables en ausencia (6.2) 2 H2O + 02 2 H 2 O 2- la banerade la energla Loscatalizadores superan de activacin La energade activacinno es slo importante para el, sino que es taml mantenimiento del estadometaestable, paraquelasreacciobin una barreraquesedebesuperar, adecuadas. Dado nesdeseables tenganIugara velocidades que el contenidoenergtico de una molculadadadebe de reacciosuperarEoantesde que la molculaseacapaz que pueda nar, la nica manerade verificarse una reaccin basadaen reactivos metaestables, a una velocidad proporcin de molculas sufiadecuada, es aumentarla energticas. Estosepuedeconseguir, bien aucientemente medio de energa de todaslasmomentandoel contenido de lculas, o bien reduciendo el requerimiento de energa activacin. del Una manerade incrementarel contenidode energa calor.Como muestraIa Figura sistema es suministrando incrementando la temperatura del sis6.lb, simplernente cinticade las tema desdeT, a T, seaumentarla energia por tanto, que hayaun mayor nmolculas, asegurando, (N, lugarde {). As,lahimerode molculas reactivas "r calentandola soludrlisis de AIP podra ser facilitada cin, esdecir,confiriendo a cadamolculade ATP y agtJa msenerga. EI problemade usaruna temperaturaelevada es que es incornpatiblecon la vida, porque los sistemas consbiolgicosrequierenuna temperaturarelativamente isotrmicos tante. Las clulasson esencialmente sistemas (temperaturaconstante) y requierenmtodosisotrmicos para resolver el problemade la activacin. La alternativaa un incrementode la temperaturaesreducir el requerilqlelQ_dcll-ilqlg1a_d9_aclivaqaa.Dc,ese r-nodo, nos aseguramos de que una proporcin mayor de termodinmicamente favorecida, pese staesuna reaccin a que el perxido de hidrgeno existaen un estadometaestable debido a la alta energade activacinde la reacsi aadimos un nmeropequeo cin.Sinembargo, deiones de hierro (Fe") a una solucin de perxido de hidrgeno, la reaccin de descomposicin tienelugarunas veces ms pida quesin los ionesde hierro.Clara30.000 en estareaccin, mente,el ion Fe'- esel catalizador redu(comosemuestra de activacin en la Ficiendola energa que una proporcin gura 6.1c)y, por tanto, asegurando mayor molculas de de perxido de hisignificativamente (30.000 posean veces ms) Ia energa drgeno adecuada paradescomponerse a la temperatura dada,sin necesidad adicional. de aporteenergtico la solucinpara la descomposicin En las clulas, del perxidode hidrgenono esla adicinde ionesfrricos, una protenaque contienehierro. sino la enzimacatalasa, de Ia catalasa Ia reaccin es 100.000.000 En presencia de de catalizador. La catalaveces msrpidaque en ausencia tomos de hierro retenidos en estructuras qusacontiene porfirinas. As,la ventaja micasllamadas de la catlisis inorgnica seincorporadentro del contextode una molcula proteica.Estacombinacinda lugar a un catalizador mudel perxido de hicho ms eficazparaladescomposicin El incrementode drgenoque los ionesde hierro aislados. 108vecespanla catala velocidadde, aproximadamente, lasa,no es un valor atpico en absoluto;los aumentosde velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente y 1014, en el rangocomprendido entre107 en colpaestn no catalizadas. Estosvaloressuracin con las reacciones brayanla importanciaextraordinariade lasenzimascomo y nos llevan hastael tema principal de este catalizadores captulo.
y el estado Ener$a deactivacin metaestable 1 4 t

Enzimas como catalizadores biolgicos

Independientemente de su naturaleza qumica, todos los catalizadorescomparten tres propiedades bsicas: 1. Un catalizador incrementa la velocidad de una reaccin disminuyendo el requerimiento de la energade activacin y permitiendo que una reaccin termodinmicamente factible, tenga lugar a una velocidad razonable, sin necesidadde activacin trmica. 2. Un catalizador funciona formando complejos transitorios con las molculas de sustrato, ligndolas de manera que se facilite su interaccin.

mamosenzimas fue eldefermentos.Sin embargo, hubo que esperar hasta\926 para obtenerla primera enzimacristali(apartir delasalubias, zada,la ureasa por fames B. Sumner), demostrndose que era una protena. Incluso, entonces, pasun tiempo hastaque los bioqumicosy enzimlogos apreciaranque los <fermentos> que estabanestudiando eran,de hecho,protenas catalticas, y queparasu completa comprensin se requeraentendersu estructura y funcin (Enlosprimeros comoprotenas, aos de 1980, losbilogos descubrieron que,adems delasprotenas, ciertas molculas deARN, llamadas tambinactividadcatar.ubp:wras,tienen ltica.Lasribozimasserndiscutidas en una seccin prxima. Aqu, consideraremos las enzimascomo protenas, las cuales son,realmente, la mayora.)

El sitio activo. Uno de los conceptos ms importantes paraentender lasenzimas comoprotenas, esel de sitio activo. Cadaenzima,indepe cataliceo de su estructuraparticular,contienedentro de partede su estructura alguna terciaria un grupocaractersque tico de aminocidos formanel sitio activo, dondeocurre el eventocatalticodel cual esaenzimaesresponsablg. Estas propiedades son comunes a todoslos catalizado- Normalmente,el sitio activoesun surcoo bolsillo real con qumicas y estructurales quepermitenla acores,seanorgnicos o inorgnicos. Refirindonos a nuestro propiedades modacin adecua9_tyespeclfica. del sustrato. La Figura6.2 ejemplo, estoseaplicaigualmente a los ionesde hierroy a muestra los modelos obtenidos por ordenador de lasenzilasmolculas de catalasa. Sin embargo, los sistemas biolmas lisozima y carboxipeptidasa que A, ilustran bien el gicosraramenteusancatalizadores inorgnicos. En vezde preciso ajuste de la molcula de sustrato en los bolsillos eso,fundamentalmente todaslas catlisis en las clulas se producidos por el plieguecaracterstico de las cadenas de (pr.otelnas orgnicas en la mallevana cabopor molculas polipptidos. La lisozima es una enzimaque rompe las yorla de los ce.s_o!)-llamadgs-ezimas. Debido a que las enen los peptidoglicanos de las paredes zimassonmolculas orgnicas, sonmuchomsespecficas qnionesglicosdicas (ruptura) bacterianas. conduciendo a la lisis y muertede quelos catalizadores inorgnicos, y susactividades sepuelas bacterias. La carboxipeptidasa A es una enzima que den regular con muchomscuidado. modificalos polipptidos eliminando un aminocido cada vezdesde el extremoC-terminal del polipptido. La mayora de las enzimas son protenas El sitio activode una enzimatpica comprendeun nLa capacidad de los extractos celulares para catalizar reac- mero determinado de aminocidos, que normalmente no cionesqumicas seha conocidodesde los estudios soncontiguos, de la fera io largodela secuencia primariadela promentacin de Eduardy HansBuchner juntos,en una conforen 1897. De hecho, tena.En todo caso, se mantienen uno de los primerosnombresaplicados a lo que ahorallamacincorrecta, gracias al plegamiento tridimensional caSustrato unido al centro activo Sustrato unido al centro activo
Figura6,2 Estructurasmoleculares y la caoxipeptidasa de la lisozima A. Modelo tridimensional compacto generadopor ordenador de las enzimas (a) Iisozima y (b) carboxipeptidasaA, con las respectivas molculasde sustrato unidas a sus sitios activos,un segmento corto de un peptidoglicano bacteriano, en el casode la lisozima y un pptido artificial, en el casode la carboxipeptidasaA.

3. Uncutiliffiad a laque se consigue eI equilibrio; no tiene efectosobrela posicindelequilibrio. Esdecir, un catalizador puede incrementar Ia velocidad de las reacciones exergniperono puede, cas, de ningunamanera, servircomo motor energtico de una reaccin endergnica. En otraspalabras, los catalizadores no son geniostermodinmicos.

tr

(a) Lisozima

(b) Carboxipeptidasa A

142

Capitulo 6

Enzimas: loscatalizadores de la vida

moPorejemplo,la polipeptdica. dela cadena racterstico A, que se muestraen la Figura lcula carboxipeptidasa en un nico polipptido de 307 residuos 6.2b, consiste presentes en el siestn delos quesloseis amoinoaclicos, posiciones 69 y las en histidina de los residuos tio activo: 270, el de argiposicionesT2y las en glutamato de 196,los y el de tirosinaen la posicin248. nina en la posicin145, situadosa lo largo de Ia caEstarelacinde aminocidos de la importancia la estructuraterciariatotal dena,subraya Slocuandola molculaalcande la molcula enzmtica. se renenlos tridimensionalestable za su conformacin activo. el sitio para constituir especficos aminocidos difeEn realidadslounospocosde los 20 aminocidos en el sitio estnpresentes rentesque forman las protenas, que han sido estudiaactivode la mayorade las protenas histidicistena, los aminocidos aparecen das.Casisiempre glutamatoy lisina.Ib4gs etlospugden aspartato, na, serina, parficiparen la nin del sustratoal sitio activoduranteel y el glutamato' v Ia histidina,el aspartato. proceso cataltico, de protones. o aceptores sirven tambincomodonantes por una o de estarformadas adems enzimas, Algunas comportar tambin polipeptdicas, mscadenas Pueden stos componente no proteicos. ponentes ! pg!_plgstticg! normalmente son molculasorgnicas comoel hierro dela enzitales olonesmetlicos' f'equeas ncjqn4njolqo-gcqplqres fu Frecue_nteme!8, ma catalasa. s porquenlnguo delosaminocido delectrones, grupos Los buen3qgplal-d-9-el9Ell9nes' esun de Ia.cadena presentes, selocalizan en queestn prostticos, en los casos capara la actividad en el sitio activoy son indispensables un ejemplo A es taltica de la enzima.La carboxipeptidasa tieneun tomode con un grupoprosttico; de una enzirha unido a dos residuosde histidina y a zinc estrechamente en su sitio activo. uno de los glutamatos'

Esta reaccin se puede llevar a cabo en el laboratorio usando un catalizador de platino (Pt) o de nquel (Ni), como se indica. Estos catalizadoresinorgnicos son muy pudiendo catalizarIa hidrogenacin de poco especficos, una amplia variedad de componentes insaturados.De hecho, el nquel o el platino se usan comercialmente para hidrogenar aceitesvegetalespoliinsaturados, en la fabricacin de manteca para guisar o de manteca vegetal. Se pueden hidrogenar eficazmenteen presenciade nquel o platino, con independencia de cul sea la estructura del componente insaturado. Comparmoslo con el ejemplo biolgico de la hidrogenacin que tiene lugar en la conversin de fumarato en de nuevo en el Casuccinato,reaccinque consideraremos ptulo 10:

o
-O-C \,/
C

HO H it l +2H*+2e-:

H-C-C-O ^l
UI

lll

,/\ H C-O_

il | -o-c-c-H I
H Succinato

(6.4)

o
Fumarato

lt ll

por Ia enzima en lasclulas escatalizada Estareaccin (llamada asporquenormalmendeshidrogenasa succinato en la direccin energtico te funcionaen el metabolismo es como muchasenzimas' Estadeshidrogenasa, opuesta). No puedeaadiro quitarhidrgenos especfica. altamente en los que semuestran excepto ningn compuesto, desde que enzimaestan especfica esta 6.4.Dehecho, la Reaccin una isoformadel al maleato, inclusono puedereconocer (Figura 6.3). fumarato recoalgunas sontan especficas; No todaslasenzimas dela estructuenzimtica.Una consecuencia Especificidad y otras resubstratos, de muy concreto nmero nocenun ra del sitio activo es que las enzimasmanifiestanun alto que siempre sustancias' de amplia categora una conocen grado de especificidadpor el sustrato, puesto de maniEstaespecicomunes. estructurales caractersticas fiesto por su habilidad para discriminar entre molculas posean enzimas implicaen frecuente por grupos es ms esuna de las propiedades ficidad La especificidad muy similares. polmeros. El objetivo de y degradacin dasen la sntesis laseny precisamente vivos, delosseres mscaractersticas polipeptlos enlaces A es degradar de la carboxipeptidasa de esmsespectaculares zirnasson unos de los ejemplos dicosdesdeel grupo carboxiloterminal; as,la funcin de pecificidad biolgica. las comparando mostrar estaespecificidad Podemos La mayotiade inorgnicos. enzimascon los catalizadores o o y son muy pocosespecficos inorgnicos los catalizadores o c -o-c H H de componenpor ello puedenactuarsobreuna variedad \^./ \^/ U qumicageneral. tes que compartenalgunacaracterstica tl (incorpotapor ejemplo,la hidrogenacin Considere, a n "\ ,,,"\ ,/ C:C): insaturado cin de hidrgenoa un enlace
! r

U-U

\J-\,

HH R-C:C-R'

HH

tl

+ Hz ---------) R-Q-q-R
PtoNi I I HH

tl

o
(6.3)
(a) Fumarato

(b) Maleato

y (b) maleato' (a) fumarato 6.3 Losestereoismeros Figura biolgicos t43 como catalizadores Enzimas

estaenzimaesaceptaruna gran variedadde polipptidos ya que la utilizacin de enzimasdistintas como sustratos, que tienen que pptidicosdiferentes paratodoslos enlaces polipeptdica, represenserhidrolizadosen la degradacin para la clula. tarla un gastoinnecesario de alta eslas enzimasson generalmente Sin embargo, pecificidadcon relacin al sustrato,tanto que una clula como reacciopuedeposeer casitantasenzimas diferentes, Parauna clulatpica, son necesanestiene qtoecatalizar. para cumplir con todo su rias miles de enzimasdiferentes un gastosuperprogramametablico. En principio, parece tanta almacenar fluo tener que sintetizartantasprotenas, y tener siemprea mano tantasenziinformacin gentica mas en la clula.Peroestoimplica enormesposibilidades ms adelante. como veremos de regulacin,

y nomenclatura, No essorprendente Divetsidad enzimtca dadasu esque hayansido identificadas miles de enzimas, que ocurren pecificidady el amplio nmero de reacciones y de enzimas dentro de una clula.Estaenormediversidad gran variedad ha dado lugar a una funcionesenzimticas para nombrarlas,a medida que eran de combinaciones y descritas. Algunassedenominaronsegnel descubiertas proteasay amilasustrato, comopor ejemploribonucleasa, deshidrogenasayla sa.Otras,cbmo la succinato fosfoglucoisusfunciones. Sinembargo, nombraronsegn someresa,se tienennombresqueno estnen absolutoreotrasenzimas lacionadoscon sussustratoso sus funciones.La tripsina, y lisozimason enzimasde estaltima categoria. catalasa, paralas enzimas La proliferacinde nombrescomunes hizo que la Unin Internacional y la confusinresultante, (EC), designara una ComisinEnzimtica de Bioqumica encargada de idear un sistemaracional para nombiar las EC estrepresentado en la Tabla6.1. enzimas. El sistema principales basedividen dentro de seisclases Lasenzimas paradefigenerales, con subgrupos sadas en susfunciones principales ms precisas. Lasseisclases nir susfunciones liasas, isometransferasas, hidrolasas, son oxidoreduct*sts, y ligasas. rasas La Tabla 6.1 proporciona un ejemplo de que catalizan reacciones setrausandoenzimas cadaclase, tarn mstarde en el texto. conocidas con CE designa todaslasenzimas El sistema en cuatro partes.Por ejemplo,EC un nmero separado A. Losprime3.4.17.I, esel cdigode la carboxipeptidasa y sub-subclase, subclase ros tresnmerosdefinenla clase, y el nmero final esel nmero de serieasignadoala enziA, ma cuandofue aadidaa la lista.As,la carboxipeptidasa de la cuarta sub-subclase esla primera entradaenla 17.u tambinson sensibles al al pH. Las enzimas que Sensibilidad La listade enzimas subclase de la clase 3 (hidrolasas). dentro de un rango de pH de han sido clasificadas de estaforma, crececontinuamente pH. Muchasslo son activas Estadependencia del pH se debe,normal3-4 unidades. y caracterizadas. con las quevan siendodescubiertas cargados de uno o ms aminocidos mente,a la presencia Sensibilidad a la temperatura.Ademsde por su especifici- en el sitio activo o en el propio sustrato.La actividaddegrupos,cargados pendede cmo estnestos o sin carga. tambinpor su lasenzimas secaracterzan dady diverSidad, A, Por ejemplo, en el sitio activo de la carboxipeptidasa dela tempeEstadependencia sensibilidad a la temperatura. r44
loscatalizadores delavida Captulo 6 Enzimas:

paralasenzimas de lasclulas de ratura no esproblemtica porque estosorganismos son homeotermamferoso aves, de regularla temperaturacorporal indepenmos,capaces animales Sinembargo,los dientemente del medioambiente. y lasbacterias, funcionan lasplantas, los protistas inferiores, la cualpuedevariar de su medio ambiente, a la temperatura la dependencia de la activiorganismos, mucho.Paraestos esmuy significativa. de la temperatura dadenzimtica La velocidad de una reaccin cata[zada enzimticamente aumentacon la temperatura,dentro de unos lmicinticade las motes,porque el incrementoen la energa lculasde la enzimay del sustrato,conducea una mayor facilitandola unin correctaal frecuencia en lascolisiones, seIlegaa un punto en el que el auSin embargo. sustrato. porque la mento de la temperaturaes contraproducente, Los molcula enzimtica comienza a desnaturalizarse. hidrpuentes de hidrgenoserompen,las interacciones fobascambian. v la integridadestructuraldel sitio activose la prdidade la actividad. interrumpe,causando por encimadel cual una enEl rangode la temperatura mucho de una enzimaa otra y zima sedesnaturalizavaria la dea otro.En la Figura6.4asecompara deun organismo pendenciade la temperatura de una enzima tpica del cuerpo humano, con una enzimatpica de una bacteria termfiIa.La velocidadde reaccinde una enzimahumana esmximaalrededorde los 37 oC,que esla temperatubruscoen ra corporalnormal.A partir de ah el descenso de las su actividad reflejala progresivadesnaturalizacin La mavorla de las enzimasde los molculasenzimticas. sereshomeotermosse inactivan por la temperatura,por nzimas,la inactivacin de laboratorio. Sin embar@meno sensibles al go, algunasenzimasson extraordinariamente ms e inactivan a temperaturas calor y se desnaturalizan inclusoa temperaturas corporales casos, bajas, en algunos con fiebrealta. en personas enzimasconalgunas En el otro extremodel espectro, altas. excepcionalmente servanla actividada temperaturas la dependencia La curvaverdeen la Figura6.4arepresenta terde la temperaturade una enzimapropia de lasarqueas organis, en el Captulo 4. Estos mfilas,ya mencionadas cidosa temperaturas calientes mos crecen en manantiales cadauna de lasmiles tan altascomo 80 oC!Evidentemente, para la activinecesitan de enzimasque estosorganismos de funcionar a temdad celularnormal, debensercapaces peraturasa las que sedesnaturalizanla mayorlade las enincluido usted. de otros organismos, zimasen las clulas

I .t v-v:* t.Y;i

s*:trr E-u'! I I
+

HX

E
I

.r <v

I
FTT vvH lv I iu J

i1

N ^

T -r

O
lo
H=

^-''. v-\J

l^
r6
t9

{Y s

v-v

lr:t
lH

.':
I

rA =a
0.6

Eo
I .:

+ +

f'1{

d-u
Ffi

BE FH

o:

? \ll zrl
tl
+ '^ /Al Zll

* <A \J
Al

H'

l 6 |^
I

A_t v-v

*\-.,,/u-u , u : u . . \lTr \/
H /r_A

oe, E ts
^

E S r) A vv t
I

si

o
R\. I
o d

RA

?\1
q'l
)l

I r

+lr

1l tl *\
HF

<\

l *,/l
EI ,/d

'
a

'dE

o^)
F I . H l

r
I

I
I

\/A

=
I

,U:U.
\ t>

v
I rl Fri*h

A-

(,
S H ' l

V_Y
a-r'r V_Y

ts
E F

o:()/ r l tl
Yl"

\t::o
A

.U

i):r

I
I

+ L
I
A-
l ^

o i\

.F.Y

E I H ^

.r o
!t

s o
c,

l(,
N 'fr

I
Jr

Yg

rY

\o U
j

r'l

z
-. ll
I

.s .*
:x
E9rE

.5

t I
F

E. =' (,

(E It G'

Ft'l

Ff<

I F

o tt -9

z
I I
6

E o 't
E ! t

CL

a\
h H

s
d 9 -

tz
%,1 E :'i e

.3
!!e

I o ag

E
N

-cldJ

c o o tt o (E

< o.,

EgE ess

est xE
H oO=

*AEHE ^-E

.F-H

o;9

( it .E
Ytr
I ^.=

HgFF u=-dl

Rs=e $r[

:E F'5 -rr!?
^H

.e -j .i! 9c.ib
lsr SH; e9

a x 5\o X
.! ; !!

'g
I

o ;' c

g .E (, o , E .3 () =
e o
.E

o EO
io @l

.o

Gn

l s 5 boo
..ou X?9
:J:d

(d

t
t.o
G H

: E+

.9n
xv Q5a

99

2.;. tr

Hca

* l s E FOE* .EacEIts E+t;ts

5 8_?

tE ;
E

.oE
6\O odO "E ^

x '6

E ET#

E o-e c N +:-i *E.B boE*

'e

tl c

okll =.:
o.a '. 6 -

E E
6 d a

'o
E

b
6 o H ,a (d d I
d G

!(

..1
(0 (E .4

(n
d

9?

,ti

r
.j

r;

como catalizadores biol$cos Enzimas

'o (U c) ! c)

Temperatura para ptima unaenzima humana tpica

(g
p
q)

gra) estpresenteen el estmago, donde el pH normalmentetiene valoresen torno a 2, mientrasque la tripsina (lnearoja) essecretada en el intestinodelgado, el cualtiene un pH en torno a 8. Ambas enzimasson activasen un rangode casi4 unidadesde pH, pero difierenmucho en su pH ptimo, consecuente con las condicionespropias de susrespectivas localizaciones dentro del cuerpo. Sensibilidad a otrosfactores. Otra de lascaractersticas de las enzimas essu sensibilidad a otros factores, adems de a la temperatura y pH, como lassustancias inhibidoraso activadorasde la enzima,un aspecto al cual volveremos ms tarde en el captulo.En el casode enzimascon especificidadpor determinados grupos,la actividad tambinsepuede ver afectada por la presencia de sustratos alternativos. La mayorade las enzimasson sensibles al medio ambiente inico, el cual esprobablemente el que afectaa la conformacin total de la enzima,debido a que los puentesde hidrgenodependen de 1. El medio ambienteinico puede afectartambin a las uniones del sustratoporque las interacciones inicasestna menudo involucradas en las unionesentreel sustratoy el sitio activo. La unindelsustrato,la activacin y la reaccin se producen en elsitio actvo Las enzimasson catalizadores muy eficaces, graciasa que los sustratos encajan de forma precisa con el sitio activode las enzimas. Estaeficaciase puedeobservaren toda su extensin, si comparamos la catlisis enzimtica con la catlisis inorgnica. Como apuntamos anteriormente, las reacciones catalizadas enzimticamente progresana una velocidad de 107 a 10ra veces msrpidoquelasreacciones no catalizadas, mientrasque las que utilizan catalizadores inorgnicos, sonde 103 a l0aveces msrpido. Comousted puedeadivinar,la mayor parte del interspor las enzimas, secentraen el sitio activo,dondeocurrenla unin, activacin y transformacin qulmicadel sustrato. Launin delsustrato. El contactoinicial entreel sitio activo deuna enzimayunamolcula de sustrato potencial, dependede colisiones aleatorias. Srnembargo. una vez e hendidura o bolsillo del sitio activo,las molculasde sustrato seunen temporalmente a la superficie de la enzima. con la orientacinapropiadapara interaccionarentre s y catalticos qspecficos de la enzima,lo cual facicon.grupos lita la reaccin. La unin delffi vsde aminocidos cargados, por medio de puentesde hidrgeno o enlaces inicos(o ambos). Estiion'es son,en general, pero la sumade variasde ellasessuficiendbiles, te para mantenera la molcula en su lugar. La fuerzade unin entre una enzimay una molculade sustrato, suele encontrarse en el rangode 3-I2 kcal/mol, menosde un dcimo dela fuerza de un enlace (taseFigra2.2). covalente Por tanto,la unin al sustratoesfcilmentereversible.

60 ("C) Temperatura
C

'o
(g

a) c) E c

'o
q)

(b)

pH

Figura6.4 Efectode la temperatulay el pH en la velocidadde las reaccionescqtalizadasenzimticamente. (a) Efecto de la temperatura eh la velocidad de una reaccin catalizadapor una -bacteria enzimahumana tpica (en negro) y una enzima de una termfila (en verde). La tasade reaccin esmixima a la temperatura ptima, unos 37 oC en el casohumano (la temperatura de cuerpo) y unos 75 "C en la bacteria (la temperatura de un manantial termal). El incremento inicial de la actividad con la temperatura, es debido al aumento de la energacintica en las molculas de enzima y sustrato.Sin embargo,un aumento excesivo de la temperatura inactiva la reaccin,pues la protena de la enzima se desnaturaliza.(b) Efecto del pH en la velocidad de una reaccin catalizadapor Ia enzima gstricapepsina (en negro) y Ia enzima intestinal tripsina (en rojo). La tasade reaccin es mixima al pH ptimo, aproximadamerLte 2,0 para la pepsinay 8,0 para la tripsina. EI pH ptimo para una enzima se correspondecon la concentracin de protones a la cual los grupos ionizables,tanto de la enzima,como del sustrato, estnen la configuracinms favorablepara reaccionar.Los valoresde pH lejos del ptimo producen, en general,modificaciones en Ios grupos cargadosde la enzima, el sustrato o ambos. El grado ptimo pH de una enzima sueleser el mismo que el del compartimiento celular,o el medio externo, en el que la enzima esactiva.

aparecen los gruposcarboxilosde dos residuos glutamato. Estosgrupos carboxilosdebenestarpresentes en la forma (ionizados),de forma que la enzimaseinactivasi cargada el pH disminuyehastael valor en el cual los gruposcarboxilo del glutamatoen la mayorade las molculasenzimticas, estn protonados por tanto,sin carga. Como sepodraesperar, la dependencia de pH de una enzimanormalmentereflejael medio ambienteen el cual la enzimaest activa. La Figura6.4bmuestra la dependencia de pH de dosenzimas que degradan protenas, encontradasen el tracto digestivo humano.La pepsina(lneanet46 Capitulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

Durante muchos aos,los enzimlogosconsideraronel sitio activo como una estructura rigida. Comparaban el ajuste de un sustrato dentro del sitio activo a una llave dentro de una cerradura,analogasugeridaen 1894por el bioqumico alemn Emil Fischer.Esle modelo de cerraduray llaye, mostrado en la Figura 6.5a, explic la especificidad enzimticapero hizo poco para acrecentarnuestro conocimiento del evento cataltico. Un punto de vista ms til acercade la interaccin enzima-sustrato es el provisto por el modelo de ajuste inducido, propuesto en 1985 por Daniel Koshland.Como ilustra la Figura 6.5b,estemodelo supone que la unin inicial de la(s) molcula(s) de sustratoal sitio activo deforma la enzima y el sustrato,estabilizandoa las molculas de sustrato en su estadode transicin y permitiendo que los enlacescrticos sean ms susceptiblesa ataquescatalticos. La distorsin de ia enzima implica un cambio conformacional en la misma por tanto, en la configuracin del sitio activo. Este cambio posiciona de forma ptima a los grupos reactivosapropiados de la enzima, para la reaccin catalticaen la cual intervienen, aumentando asla probabilidad de que la reaccin se produzca. EI cambio conforlateralesde los macional acecaal sitio activo a las cadenas aminocidos que son crticos para el proceso cataltico, pero {.ue no estnen las proximidades del sitio activo en la conformacin no inducida. En muchos casos'estascade-

q'Yc*e*(.8
y llave (a) Modelode cerradura Enlace(s) desestabilizado(s) Sitio
aCtlVO

nas lateralesson grupos cidos o bsicos,que promueven A, la unin del En el casode la carboxipeptidasa la catlisis. sustrato atrae a tres residuos aminoaclicos crticos al sitio activo (una arginina, un glutamato y una tirosina). Los estudiosde difraccin de rayosx de protenas cristalizadashan confirmado que realmentese producen estos cambios, durante Ia unin del sustrato. La cristalografa con rayos X se usa para determinar la forma de una molcula enzimtica con o sin sustrato unido al sitio activo. La Figura 6.6 ilustra los cambios conformacionalesque tienen lugar tras la unin del sustrato ala lisozima,la enzima ya mostrada en la Figura 6.2a,y parala hexoquinasa,una enzima que podremos encontrar de nuevo ms adelante en estecaptulo. En ambos casosse produce un cambio notorio en la conformacin de la molcula proteica, como respuesta a la unin del sustrato.En el casode la hexoquina,u, po. ejemplo, la unin del sustrato (una molcula de D-glucosa) provoca que dos de los dominios de la enzima se doblen el uno hacia el otro, cerrando el pliegue del sitio de unin alrededor del sustrato (Figura 6.6b). El cambio conformacional al producirse la unin del sustrato, puede resultar en un desplazamientoextensode grupos de aminocidos dentro de la molcula proteica. En el casode la carboxipeptidasaA, por ejemplo, la unin del sustrato hace que el residuo de tirosina de la posicin 248 se mueva a I,2 nm, una distancia aproximadamente igual a una cuarta parte del dimetro de la molcula enzimtica! del sustrato. El papel del sitio activo no es slo Activacin reconocer y unir el sustrato apropiado sino tambin acflvarlo, sumergindoloen el medio qumico necesariopara enzimtiUna determinada reaccin cafalizada la catlisis. camente,puede involucrar a uno o ms recursosde activacin del sustrato. Los tres mecanismosms comunes son Ios siguientes: 1. El cambio en la conformacin enzimtica inducida por Ia unin del inicial sustrato al sitio activo, no slo causauna mejor complementariedady un ajuste ms estrechoenzima-sustrato,sino que tambin debilitando as deforma uno o ms de sus enlaces, hacindolos ms susceptibleal atadichos enlaces, que cataltico. 2. La enzimatambin puede aceptaro donar protones incrementando, por tanto, la reactividad qumica del sustrato.Esto da cuenta de la importancia de los aminocidos cargadosen la qumica del sitio activo, lo cual, a su vez, explica por qu la actividad de la enzimasueleser tan dependientedel pH. 3. Como forma adicional para la activacin del sustrato, las enzimas tambin pueden aceptar o donar formando de esemodo enlacescovalenelectrones, tes temporales entre la enzima y su sustrato.El mecanismo necesitaque el sustrato tenga una regin biolgicos t47 Enzimas como catalizadores

- F)-[,(:)/ .Y*\U// /a\ /

@ ,,\ v

(b) Modelode ajustelnducldo enzima-susttato' Figura6.5 Dosmodelos de interaccin (a) El modelo de cerraduray llave.En estemodelo clsico, la molcula enzimrica(E) era consideradauna estructura rgida, con el sustrato (S), anlogamentea un sitio activo, donde encajaba como 1ohace una llave en una cerradura. La reaccin en el sitio activo, convierte a las molculasde sustrato en molculasde producto (Pr y Pz).(b) El modelo de ajusteinducido. Segneste modelo, la unin de una molcula de sustrato al sitio activo de una enzima,induce un cambio conformacional en sta,que sita en el de manera ptima sitio activo a los grupos reactivosadecuados, para la reaccin catalizada.Adems,el aiuste estrechoentre la del uno o ms de los enlaces nzimay el sustrato desestabiliza a un ataquecataltico. sustrato,haciendo que seanms susceptibles

Sustrato (peptidoglicano)

\r.

Figura6.6 Cambioconformacional en la estluctura de la enzima,inducidopu la unindel sustrato, Aqu semuestran los modelos compactosde las (a) lisozimay (b) hexoquinasa enzimas: y sus sustratos(un peptidoglicano artificial y una molcula de o-glucosa,respectivamente). En ambos casos, la unin del sustrato induce un cambio conformacional en la enzima, detectable por anlisisde difraccin con rayos-X.

(a) Lisozima

(b) Hexoquinasa

que seaelectropositiva (deficiente en electrones; o (ricaen electrones) electronegativa y queel sitio activo de la enzimatengauno o msgruposde polaridad opuesta. El acontecimiento catalitico. La secuencia de acontecimientos que tienen lugar en el sitio activo,seilustra en la Figura6.7,tomandocomo ejemploala enzima sacarasa. La sacarasa hidrolizael disacrido sacarosa en glucosa y fructosa. Hastael momento,hemosvisto que la colisin inicialaleatoria -sacarosa,en de una molcula de sustrato ssfs 6s6- con el sitio activo, tiene como resultado su unin a residuos aminoaclicos que estn posicionados estratgicamente all (Paso1). La unin del sustrato induce un cambioen la conformacin que intensifica enzimtica el ajusteentre la molculasustratoy el sitio activo,facilitando de esemodo la conversin del sustrato en los productos, en estecasoglucosa y fructosa(paso2). Despus, estosproductosse liberan desdeel sitio activo (paso3), permitiendo que la molculaenzimticaregrese a su conformacin original, quedandoel sitio activo ahora disponible para admitir otra molcula (paso4). La de sustrato
148 Captulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

secuencia completade acontecimientos tienelugar en un tiempolo suficientemente cortoparapermitir queen el sitio activo de una solamolcula enzimtica ocurran cientos,o inclusomiles,de talesreacciones por segundo!

Cintica enzimtica
Hasta el momento, nuestra exposicin acercade las enzimas ha sido bsicamentedescriptiva. Hemos hablado del requerimiento de energa de activacin que evita que las reaccionestermodinmicamente factibles ocurran, y de los catalizadores como medio de reducir la energa de activacin y de esemodo facilitar dichasreacciones. Thmbin hemos consideradoa las enzimascomo catalizadores biolgicos y hemos examinado su estructura y funcin .ot -, detalle.Adems,nos hemos dado cuenta de que las nicas reacciones que probablemente ocurren en las clulas a velocidades razonables, son aquellas para las cuales las enzimas especficasestn al alcance de la mano, de manera que la capacidad metablica de una clula, est especificda por las enzimas que estnpresentes.

Complejo enzimasustrato

c o l i s i o nc ao n e l QEI sustrato srtio a c t i v od , o n d ee s m a n t e n i d o p o ' e n l a c ed s e b r i ec so r ^ i o sg , u p o sR de osarir oc r c o so e s i t i oa c t i v o . L a u n i o nd e l s u s t r a t o provoca un cambio contorrao c n a e n l a e n z i m ar ,esponsable de queel sustrato s e au n i d om s (aluste firmemente inducrdot

:t+ HrO acrivo @ Elsitio

o<1 dicn^nrh

para otra moiecula de sustrato.

@ Sustrato
e5 colrverti0L) e pfocjuctos

O L o sp r c c l L r c t o s 5 0 ni o e f a t o s

t
Fructosa

Figuta 6.7 Cfclo cataltico de unaenzima, En este ejemplo, la enzima sacarasa catalizalahidrlisis de sacarosa en glucosa y fructosa.

Inclusocuandofaltanlas enzimas Dodemos servirnos de su ausencia paracalcular, por comaracin, la velocidad real a la cual tiene lugar una reaccincatalizada enzimticamente y culesel efecto por determinados ejercido factores en la velocidad de reaccin. La simplepresencia de la enzimaapropiada en Ia clulano asegura que una determinada reaccin puedaocurrir a una velocidad adecuada,a menosque tambin podamosestarseguros de quelascondiciones celulares sonfavorables parala actividad enzimtica. Yahemosvisto que hay factoresque pueden influir en la actividadenzimtica. talescomo la temperaturao el pH. Ahora estamos preparados paravalorar cmo la actividad enzimticatambin depende de la concentracin de los sustratos, de los produciosy de los inhibidorespresentes en la clula. Adems, veremos cmo,al menos algunos de estos efectos, pueden ser definidos cuantitativamente. Cuando dirigimos nuestra atencin a estosaspectos cuantitativos de la catlisisenzimtica, nos encontraremos en el campbde la cintica enzimtica.I,a palabracintica es de origen griego (Klnetlkos, siqnifica<movimiento>). Aplicadaa lasreacciones qumicas. la cintica concierne a

lasvelocidades de reaccin y la maneraen que esas velocipero especialdadesestninfluidaspor varios factores, mentepor la concentracin delsustrato. delosproductos y de los inhibidores,Aqu nos centraremos, mayoritariamente, en los efectos de la concentracin del sustrato en la cintica de las reaccionescatalizadas enzimticamente. Nuestroestudioestar limitado alasvelocidades iniciales de reaccin, medidas alrededor de un periodode tiempoen el cual la concentracin de sustratotodavano ha disminuido lo suficientepara afectara la velocidad,y la acumulacin de producto es todavapequea para provocaruna reaccinapreciable, en sentido contrario.Aunque esto es una simplificacin de lo queocurrerealmente, nospermitir entender principiosimportantes algunos dela cintica enzimtica. La cinticaenzimtica puedeparecer bastante compleja al principio. Paraardarle a entenderlos conceptos bsicos, en el Anexo6A seplanteaun smil, en el cual,lasepzimas que actan sobre las molculas de sustrato, se comparancon una habitacinllena de monos pelando cacahuetes. Puede resultarle til recurrira la analoga ahora y regresar despus a esta seccin. Cintica enzimtica 149

Anexo MoNos Y CACAHUETES

Si le parecide utilidad el ejemplode los frijoles saltarines para entenderel conceptode energa libre del mejicanos, Capltulo 5, qra aprecie la aproximacina la cintica enzimtica basada en la analoga con una habitacinrepletade y una cantidadvariablede cacahuetes monos (<enzimas>) pelados(<sustratos>). Tiate de entendercadapaso,primero en y luegocomo una trminos de monos pelandocacahuetes, ' autnticareaccin,catalizada enzimticamente. la puertay permitimos que los ansiosos monos pasena la Galerade Cacahuetes.

de cacahuetes Comienza el pelado

Yaestamos listospara nuestroprimer anlisis. Comenzamos por metro inicial de un cacahuete con una concentracin y asumimosque,con estaconcentracin, un mono cuadrado, yI en encontrarun cacahuete tarda como media9 segundos segundo en pelarlo.Estosignificaque cadamono necesita 10 por cacahuete y por tanto puedepelarlosa una segundos por segundo. velocidadde 0,1 cacahuetes Como hay l0 monos para el total en la galera, la velocidadv de peladode cacahuetes por segundo, de los monos esde 1 cacahuete con esta (la cual llamanos[S] para recordar concentracin de cacahuetes que los cacahuetes son el sustratode la accinde pelar).Todo estosepuedetabular como sigue:
de cacahuetes [S] : concentracin (cacahuetes/m2) Tiempo requeridopor cacahuete: Paraencontrarlo(segundo/cacahuete) Parapelarlo (segundo/cacahuete) Total (segundo/cacahuete) Velocidadde pelado: Por mono (cacahuete/segundo) Total (r) 0,10 1,0 9 1 10
I

LaGalera delCacahuete
una tropa de diez monos, Paranuestromodelo,necesitamos todos igualmenteexpertosen encontrary pelar cacahuetes, tambin que los monos son incapaces de come Suponemos que pelan,pero pesea siquiera,uno solo de los cacahuetes compulsivade seguirpelando. todo, sufrenuna necesidad (Parahacerel modelo algo ms riguroso,podemosinsistir que los cacahuetes son una nuevavariedadhbrida, que se puederecomponerfcilmente, y que los monos,lo mismo que estncolocandolos cacahuetes dentro de suscscaras, pelndolos. no nos preocupan Peroestas consideraciones interesados en las condiciones iniciales aqul; slo estamos en las cualestodos los cacahuetes estndentro de sus cscaras.) Necesitaremos tambinla Galerade Cacahuetes, una se habitacinde superficieconociday en la cual los cacahuetes distribuyenhomogneamente en el suelo.EI nmero de pero en todo cacahuetes variara medidaque avancemos, que momento,en Ia habitacinhabrmuchosmscacahuetes monos.Adems, dado que conocemos el nmero de cacahuetes y la superficiedel suelo,podremoscalcular<laconcentracin> (parasermsexactos, Ia densidad)de cacahuetes en la los monos comienzan habitacin.En cadacaso, en una salade espera contigua.Paraempezar el ensayo, simplemente abrimos

Aumenta el nmero de cacahuetes

Paranuestrosegundo ensayo, llevamosa todoslos monos de y barremoslos desperdicios, vueltaa la salade espera, por ahoracon una concentracin de 3 cacahuetes empezamos

la cintica La mayofa de las enzimas sguen de Michaelis-Menten Desdehacemucho tiempo sesabeque la velocidadde una reaccincatahtafi;Mffi'fifonti. aumentacon la concentracinde sustrato,pero de tal forma, que cadaincremento adicional de sustrato,da como resultadoun aumento menor de la velocidadde reaccin. De manerams precisa, que la relasepuedeobservarexperimentalmente cin entre la velocidad inicial de reaccin yy la concentracin de sustrato[S] es una hiprbole, .oo ,. ilustra en la Figura6.8.Una propiedadimportantede estarelacinhiperblica esquea medidaque [S]tiendehaciael infinito, y tiende hacia un valor miximo, que dependedel nmero de molculas enzimticas por tanto, slo puede incrementarse aadiendo msenzima. para aumentarla velocidadde reacLa incapacidad cin ms all de un valor finito mximo a concentracio150 Gapitulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

nes de sustrato cadavez ms altas,se llama saturacin. fundamentalde las reacciones Estaes una caracterstica catalizadas enzimticamente. Las reacciones catalizadas altas de siemprellegan a saturacina concentraciones mientrasqueestono ocurreen lasreacciones no sustrato, catalizadas. Gran parte de nuestracomprensinde la relacinhipionerosde perblicaentre [S] y l sedebea los trabajos Leonor Michaelisy Maud dos enzimlogosalemanes, postularon Menten.En 1913, una teorlageneral de la acque ha resultadoserla basepara el anlicin enzimtica, de la cinticaensiscuantitativode casitodoslos aspectos zimtica.Paraentendersu enfoque,considere una de las posiblesreacciones ms simcatalizadas enzimticamente ples,en la cual un nico sustratoS seconvierteen un nico producto P.
S ---------+ P
Enzlma \El

(6.s)

metro cuadrado. Como la cantidadde cacahuetes seha triplicado,cadamono podr encontrarun cacahuete tresveces msrpidamente que antes, esdecir,que el tiempo que emplean en encontrarel cacahuete, ahoraesde slo 3 segundos. Dado que sesigueempleandoI segundo en pelar cadacacahuete, el tiempo total por cacahuete esahorade 4 segundos y la velocidadde peladoes0,25cacahuetes por segundo y mono, es decr,2,5cacahuetes por segundo para el total de los de monos. Estogenera otra columnade entradas para nuestratabla de datos:
de cacahuetes lSl = concentracin (cacahuetes/m2) Tiempo requeridopor cacahuete: Paraencontrarlo(segundo/cacahuete) Parapelarlo (segundo/cacahuete) Total (segundo/cacahuete) Velocidad de pelado: Por mono (cacahuete/segundo) Total (/) 0,10 1,0 9 1 l0 3 I 4 1

Qu ocuresi v y [S]contnan aumentando?

Paradescubrirqu ocurre finalmentecon la velocidadde peladosi Ia concentracin de cacahuetes en la galera escada vez mayor,lo nico que hay que haceresampliar la tabla de datos, suponiendo un incremento de los valores de [S] V y. Por ejemplo,una calculandola correspondiente (de 3 a 9 concentracin triplicadade cacahuetes cacahuetes/m2) conduce a una reduccin del tiempo-necesario por cacahuete, que ahoraserde 2 segundos ( 1 segundo para y otro segundo encontrarlo parapelarlo),con una velocidad de

peladode 0,5 cacahuetes por segundoy mono, o 5 cacahuetes por segundo en total. Ya seempiezaa ver una tendencia. El primer triplicado de la concentracinde cacahuetes aumentla velocidad 2,5veces, pero el siguiente triplicadoslola dobla.Esdecir, que Ia progresin no eslineal.Puede ver estoclaramente si eligeuna concentracinalgo mayor de cacahuetes y representa v en el eje/ (escala sugerida: 0- 10 cacahuetes/segundo) y [S] en el ejer (escala sugerida: 0-100cacahuetes/m2.. Como ver, los datosgeneran una curvahiperblica muy parecida a la de Ia Figura6.8,y si observa cuidadosamente susdatos, verpor qula curvacontinandoblndose, a medidaque [S] (esdecir,porquela velocidad incrementa incrementa progresivamente menosconforme aumentael nmero de cacahuetes): el tiempo de peladoesfijo y por tanto llegaa ser un componentecadavezms importante del total del tiempo empleado por cacahuete mientrasque el tiempo para encontrarlo, escadavezmenor.Esprecisamente este tiempo fijo de peladoel que establece el lmite superioren la velocidad de procesamiento del cacahuete, porqueinclusosi [S] fuera infinita (o sea, en un mundo repletode cacahuetes), todava se precisara un tiempo finito de I segundo paraprocesar cada cacahuete. Por ltimo, ustedpuededarsecuentade que hay algo especial en la concentracin de cacahuetes a la cual,el tiempo para encontrarlos, esexactamente igual al tiempo de pelado (sta resulta serde 9 cacahuetes/m'). Este esel punto de Ia curva en el cual la velocidadde procesamiento del cacahuete es exactamente la mitad de Ia velocidadmxima.De hecho,esuna referencia tan importante en la escala de concentracin, que ustedpodra estartentadode darleun nombre especial, sobre todo si sellamaraMichaelisy estuviera haciendoel mono con enzimas en vezde con cacahuetes!

Segnla hiptesisde Michaelis-Menten, la enzima E qloecataliza estareaccin primero con el sustrato reacciona S, formando un complejoenzima-sustrato transitorio,ES, que sufreluegola reaccin cataltica real,paraformar la enzima libre y el productoR como semuestraen la secuencia

Er+s *

tt {ie,+r

(6.6)

y esla veloAqu, IS] esla concentracin inicial de sustrato, cidad inicial de reaccina esaconcentracin de sustrato, y V-o y K- sonparmetros cinticos importantesque consideraremos enla prximaseccin. sta esla ecuacin Michaelis-Menten, la principal de la cinticaenzimtica. (El Problema6.11al finaldelcaptulo le darunaoportunidad para deducirpor s mismo la ecuacin de Michaelis-Menten.) es ef significado de V^,y K^? Cul Paravalorarlasconsecuencias de la relacin entrevy [S] y examinarel significadodelos parmetrosV-u*y K-, podemos considerar tres casos especiales de concentracin de sustrato:concentracinde sustratomuy baja, concentracin de sustrato muy altay el caso especial de [S] : K-. Caso1: concentracin de sustrato muybaa([S]< K,). A concentracin de sustratomuy baja, [S] es despreciable
Cintica enzimtica 1 5 1

donde E es la forma libre de lu .rrri-u, S es el sustrato,ES es el complejo enzima-sustrato,P es el produ cto,y k1,k2,k3 y knson las constantesde velocidad para las reaccionesindicadas. Comenzando con este modelo y suponiendo varias simplificaciones, Michaelis y Menten llegaron a la siguiente relacin entre la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamentey la concentracin de sustrato: v: -=------.^: K- + LSl

y^""Is]

(6.7)

s E
.O -c

p
o
O

7\/ 2'max

a)

Concentracin de sustrato LSI

K m

entre la velocidad de leacciny la Figura6.8 Relacin concentlacinde susttato, Parauna eaccin catalizada la que siguela cinticade Michaelis-Menten, enzimticamente, velocidad inicial tiende hacia un lmite superior de velocidad V*u* de sustrato[S] tiende hacia a medida que la concentracin de Michaelis-Menten K- corresponde el infinito. La constante de sustratopara la cual la reaccintiene lugar a a la concentracin mxima. la mitad de la velocidad

Esto nos proporciona una definicin de V-*, uno de los dos parmetros cinticos de la ecuacin de MichaelisMenten. V-u" es la velocidad mxima, o el valor lmite superior, al cual tiende la velocidad de reaccin inicial v cuando la concentracindel sustrato [S] seacercaal infinito. En otras palabras,V-",es la velocidad a concentracin saturante de sustrato.En estascondiciones,toda molcula enzmtica est ocupada, casi todo el tiempo, en el proceso puesto que Ia concentracin de sustrato real de la catlisis, es tan alta que, casi alavez que se libera una molcula de producto, llega otra molcula de sustrato al sitio activo. Por tanto, el lmite superior de V-u, se determina por 1) el tiempo necesariopara la reaccincatalticareal ms la liberacin subsiguientedel producto desdela superficiede cadamolcula de enzima,y2) eInmero de molculaspresentes.Debido a que la velocidad real de la reaccin es limitada, la nica manera de que la V-", pueda aumentar es incrementando la concentracin de la enzima. De hecho, V-u* es linealmente proporcional a la cantidad de enzima presente,como se muestra en la Figura 6.9. Caso3: ([S] = l(r). Hasta el momento, hemos visto Ia razn para Ia cintica de las reaccionesde primer orden a de sustratobajasy para cinticasde orden concentraciones altas.Tambin hemos formulado la cero a concentraciones definicin para V-u*, pero todava tenemos que descubrir el significado del segundo parmetro cintico, K-. Fjese que con independenciade su significado, K- parecetener algo que ver con la determinacin de cunto de baja debe ser la concentracin de sustrato,para asegurarla cintica de primer orden, o bien, cunto de alta debe ser,para asegurar la cintica de orden cero.De estamanera, K- parece ser un punto de referencia en la escalade concentracin que determina cunto de alto es alto y cunto de bajo es bajo. Para explorar su significado de manera ms precisa, considere el caso especial en el que [S] es exactamente

comparada con Ia constante K. del denominador de Ia ecuacin de Michaelis-Menten, por lo que podemos escribir

v."*[S].- v."*[s] ,,_ ' K-+lsl K-

(6.8)

Por tanto, a concentracin de sustratomuy baja, la velocidad inicial de reaccin es ms o menos proporcional a la concentracin de sustrato.staes,por tanto, la reginde primer orden de la grfrcade Michaelis-Menten. Mientras la concentracin del sustrato sea mucho ms baja que el valor de K-, la velocidad de una reaccin catalzada enzimticamente, aumenta casi linealmente con la concentracin de sustrato. Gaso 2: Concentracin de sustrato muy alta ([S] > ,(,). A concentracionesde sustrato muy altas,K- se vuelve insignificante comparada con [S] en el denominador de Ia ecuacin de Michaelis-Menten,y podremos escribir:

, ',-

V.o*[Sl K- + LSI

V.r*[Sl -r, LSI

'max'

(6.e)

Estarelacin significa que, a concentraciones de sustrato muy altas, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente, es esencialmente independiente de Lavariacin de la IS], volvindosecasiconstante.staconstituyela regin de orden cero de la representacin de MichaelisMenten. Mientras la concentracin de sustrato seamucho mayor que el valor de K*, la velocidad no seve afectadapor los cambios en la concentracinde sustrato,permaneciendo casi constante,con valoresprximos a V^u,.

Concentracin de la enzima[E] linealentre V,"" y la concentracin enzimtica. Figura6.9 Relacin EI incremento iineal en la velocidad de reaccin en funcin de la concentracin dela enztma,proporciona la basepara determinar, experimentalmente,las concentracionesde enzima.

r52

Capitulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

iguala K^. Bajoestas condiciones, la ecuacin de Michaelis-Menten sepuedeescribircomo

Y:

y-*[s] : v_u"[s] : v-* K*+tsl ,rsl 2

(6.r0)

Estaecuacinnos proporciona la definicin que hemos estadobuscando: K- es la concentracin de sustrato para la cual la reaccin tiene lugar a la mitad de su velocidad mxima. Esta concentracin es un valor fijo para cada enzima que cataliza una reaccin determinada bajo unas y se denomina constante de Micondiciones especficas chaelis (de ah su abreviaturaK-) en honor al enzimlogo que dilucid su significado.La Figura 6.8 ilustra el significado de V-u,y de K-.

V-* tambin puede usarse para determinar otro parmetro til llamado nmero de recambio (K."J, que expresa la velocidad a la cual las molculas de sustrato se convierten en producto por una nica molcula de enzima, cuando sta est funcionando a su mxima velocidad. La constante (u, se expresa en unidades de tiempo inverso (s-', por ejemplo) y se calcula como el cocienteentre V-* y [E,], la concentracin de la enzima en moles/litro:
r '-cat t' /m u f F I l ! f l

(6.u)

El nmero de recambio vara mucho entre enzimas, como se apreciaen los ejemplos dados enlaTabla 6.2.

Vr.* y Kmpaa los Bilogos Porquson importantes celulares? Ahora que entendemos lo que significaD V-* y K-, debemos preguntarnos por qu estos parmetros cinticos son paralos bilogoscelulares. importantes El valor de K. es til, porquenos permitecalcular en quparteen la representacin de Michaelis-Menten de Ia Figura6.9, estfuncionandouna enzima(suponiendo, por supuesto, que la concentracin de sustrato en la clulaesconocida). Podemos entonces calcular a quefraccinde Ia velocidad mxima esprobableque Ia reaccincatalizada enzimticamente tenga lugaren la clula. Adems, K- sepuedeconsiderar como un clculoaproximado de la <calidad> esuna enzima, en el sentidode que,cuantomsbajo esel valor K-, ms bajo es el rango de concentracin de sustratoen el cual la enzimaeseficaz*.Losvaloresde K- paravariasenzimasaparecen en la Tabla6.2. La V-"* de una reaccinparticularnos proporciona una medidadela tasade reaccin. Realmente sonpocas las que se encuentran, enzimas in vivo, con concentraciones saturantes de sustrato, de maneraque las enzimasraramentevan a funcionarlejosde susvelocidades miximas, en condiciones celulares. Sin embargo, conociendo los valores de V-",, K-, y la concentracin de sustratoen vivo, podremosal menosestimarla velocidadprobablede la reaccin, en dichas condiciones celulares. Tabla 6.2 Valores del(, y k r, para algunas enzimas
Nombre de la enzima
Acetilcolinesterasa Anidrasacarbnica Fumarasa Triosafosfatoisomerasa B-lactamasa

La glicadoble recproca es unaforma til de representar losdatos cinticos

La grfi,ca clsica de Michaelis-Menten de y frentea [S],tal y como semuestra en Ia Figura6.8,esuna representacin fiel de cmo Ia velocidad depende de la concentracin de pero no es una herramientaespecialmente sustrato, til paraladeterminacin cuantitativa de los parmetros cinticosclaves K^y V^u*. Suforma hiperblica hacedifcil extrapolarconprecisin el parmetro crtico V^^*, a conceny si V.u* no es conocidacon tracin infinita de sustrato, precisin, K- no se puededeterminar. Esteproblemase aprecia en la Figura6.9,en la que sera difcil calcularV-u* ya dibujada, y sin V-u*,K- tampocopuede si no estuviera sercalculada fcilmente. Parasolucionar problema este y proporcionar un enfoque grfico ms til, Hans Lineweaver y Dean Burk convirtieronla relacin hiperblica de la ecuacin de Michaelis-Mentenen una funcin linealinvirtiendoamboslados de la Ecuacin 6.7y simplificando la expresin resultante parauna lnearecta: con la forma de una ecuacin 1_ v K.+[S] V-o[S] _ K* Y-*[S] _, [S] Y.".[S]

'l - K^ lf * I v^* \lsl / v_*

(6.r2)

Sustrato
Acetilcolina Cot Fumarato Gliceraldehdo 3-fosfato Bencilpenicilina

,(' (M)
g x 10-s 1 X 10-2 5 X 10- 5 X 10-4 2 X 10-s

k n(s-")
x 10 4 1,49 1 g X106 xl02 Xl03

4,3 x 103 2

* K- se considera a menudo como una medida de la afinidad de una enzima por sus sustratos,es decir, como la constantede disociacin para ES. Sin embargo, es una relacin de las constantesde velocidades:K^ : (k, + k) I h, Para conocer las consecuencias de estarelacin, vaseelPrcblema 6.I I a1final del captulo.

Cintica enzimtica 1 5 3

La Ecuacin6.12 esla ecuacinde Lineweaver-Burk. como Ilv frentea l/[S], como Cuandostaserepresenta en la Figura 6.10,la grfrca doble recprocaresultante es lineal,con una interseccin de IIV^^ con el ejey, otra de -llK^,con el ejex,yunapendienteK^lV^o. (Puede convencerse a s mismo de estosvaloresde interseccin estaprimero 1/[S],igualandollv a ceroen la Ecuableciendo luegoel otro valor.) Por tanto, una cin 6.12y resolviendo vez que seha dibujado la representacin doble recproca, V-* se puede determinar directamentea partir del recproco de la interseccin con el ejey,y K- a partir del rela cproconegativode la interseccin con el ejex. Adems, pendiente sepuedeusar para comprobarambosvalores. De estamanera,la representacin de Lineweaver-Burk estil porqueconfirma mediantesu linealidadquela reacest siguiendo la cintica Michaelis-Mencin en cuestin ten, y permite determinarlos parmetrosV-o y K- sin la complicacin de una curva hiperblica. Thmbin sirve comoun diagnstico til en el anlisis de la inhibicinenla forma de la representacin seve afectazimtica,porque por varias tipos diferentesde da de forma caracterstica, inhibidoresreversibles. la ecuacinde Lineweaver-Burk Sin embargo, tiene algunas limitaciones. El principalproblema esque,a menupara determinar una extrapolacin elevada do, seprecisa puedeserpocofiable. Adems, K-, por lo queel resultado los datosmscruciales en Ia determinacin de la pendiente de la curvasuelen serlos msalejados del eje stos se corresponden conlasconcentraciones msbajas de sustray por tanbajosde la actividad enzimtica, to y los niveles to, con los valores msinciertos. Parasortear estas desventajas, sehan propuesto varias a la ecuacin de Lineweaver-Burk. de alternativas Una ellas Eadie-Hofstee, que es la ecuacin de se representa como una grficade v/[S] frentea v. Como seilustraen la Figupor la interseccin ra 6.1I, V-o sedetermina con el ejexy (Paraexplorarla representaK- a partir de la pendiente.

Interseccin con el eje y = V^ *l K^ vV^uv = ra1 ,K .m K

Lvl

'.m

v/[S]

La relacin Figura 6.11 Representacin de EadieHofstee. v/lSl se comounafuncinde r;.K- puede determinarse representa desde la pendiente y V-o por la interseccin con el ejex.

cin de Eadie-Hofsteey otra alternativams a la representacin Lineweaver-Burk,vea el Problema 6.12. al final de estecaptulo.)

de K^y V^u* Unejemplo de determinacin para determinar V** y Considereun ejemplo especfico que imK-, a partir de la representacin doblerecproca, plique a la enzimahexoquinasa, como seilustra en las Figuras6.12y 6.13.La hexoquinasa esuna enzimaesencial en el metabolismoenergticocelular,porque cataliza\a primerareaccin dela glucolisis, la cualsediscutir en decatalizala fosforilatalle en el Captulo 9. La hexoquinasa cin de la glucosa en el tomo de carbono6, usando ATP de fosfato, como de la energa necesaria comofuente, tanto parala reaccin: f ADP (6.13) Glucosa+ AIP -----------) Glucosa-6-fosfato
Hexoquinasa

,*,(tJ.t'*

Interseccin .j eleJe x= - v COn Km

Interseccin 1 con el eJeY =;v^^* 1/[S]

Figura 6.10 Representacin doble reciprocade Lineweaver-Burk. El recproco de la velocidad inicial Uv, serepresentacomo una funcin del recproco de la concentracin de sustrato, 1/[S]. Kpuede calcularsepor la interseccincon el eje xy V-o, coneleje y.

Para analizar cinticamente esta reaccin, debemos determinar la velocidad inicial en cada una de las diversas concentraciones de sustrato. Cuando una enzima tiene dos sustratos,el enfoque habitual es variar la concentracin de un sustrato en un momento dado. mientras se mantiene la del otro constante, a un nivel suficientemente alto (cercade la saturacin), para asegurarque no llegue a ser un factor limitante de la velocidad. Debemos tambin tener cuidado de asegurarnosde que la determinacin de la velocidad se haga antes de que el producto se acumule hasta los valores que hagan que la reaccin contraria pueda tener lugar. En el enfoque experimental que se muestra en la Figura 6.I2,la glucosa es el sustrato variable, con el AIP presente a una concentracin saturante en cada tubo. De las nueve reaccionesde mezcla programadaspara esteexperimento, una se toma como blanco (B), porque no contiene glucosa.Los otros ocho tubos tienen concentracionesgraduales de glucosaque van desde0,05 a0,40 mM.Unavez

154

Gaptulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

I-'t

Nmerode tubo:

(mM): [S]= lglucosal

v (pmol/min):

pwwwffiwry
lBll 1ll2ll3ll4ll5ll6ll
|--t |-1 t-1 t-1 t-T t-T |-1

rllsl

t-1

Bliiii

f a

OE

-tr
'6*
O

cA ) -o O

,, - /t"" [S] K* + [S]

o : -0

0,10

0,20

0,30

0,40

(mM) de glucosa [S]= Concentracin

Figwa 6.L2 Estudioexpeilmentalde la cintica de la reaccinde la hexoquinasa. Seincub una seriede tubos de ensayocon concentracionescrecientesde glucosay una concentracin saturada de ATR aadiendo una cantidad estndarde hexoquinasa.La velocidad inicial de la aparicin del producto, v, se representcomo una funcin de la concentracin del sustrato [S]. La curva es a V-*, a medida que la concentracin de hiperblica, acercndose sustrato escadavez mayor. Parala representacindoble recproca Figura 6.13. vasela derivadade estosdatos,

que la alejende la cinticade naspropiedades especiales Michaelis-Menten. de Ia Figura6.12ilustrala necesiLa curvahiperblica dad de recurrir a un anlisislineal, porque no se pueden obtener,ni V-*, ni K-, a partir de los valoresde la reprehiperblica,aunquese dispongade los datos sentacin para construir la curva.Sin embargo, la representacin lide la Figura6.13,s lo permite.Para nealdoblerecproca aqu,se calcularon los recobtenerlos datosmostrados procosde cada valorde [S]y v dela Figura6.12.Asi,los vamM, generan recprocos de20-2,5 loresde [S] de0,05-0,40 de v de 2,5-7,3 arrojanremlullt, y los valores .rmol/min, de 0,4-0,14 min/rmol.Dadoquesonvalores reccprocos procos> el dato del tubo I es el ms alejadodel origen, alcanzar un valor ms mientras que cadatubo sucesivo, prximo al origen. Cuandoestosdatossevan uniendo por medio de una con el eje7 coincidgcon el valor lnearecta,la interseccin '. estas 0,1min/mmol, y la del ejex" con -6,7 mluf Desde podemos que V-o : calcular intersecciones con los ejes, y K- : -(ll-6,7) : 0,15mM. Si 1/0,1: 10 prmol/min de Michaelis-Menten ahora volvemosa la representacin podremos ver queambos valores sonrade la Figura6.12, que la reporquepodemos imaginarfcilmente zonables presentacin est creciendohiperblicamente hasta un miximo de l0 nmollmin. Ms an, Ia grfrcaalcanzala de sustrato de 0,15 mitad de su valor a una concentracin

faa una temperatura preparados los tubosy mantenidos oC), (generalmente, me25 se inicia la reaccin, vorable fija de hexoquinasa. diantela adicinde una cantidad de formacindel productosepuededeLa velocidad terminar,bien mediantemonitorizacinespectofotomque de mezcla(suponiendo trica continuade Ia reaccin absorben luz de una deo productos uno de los reactivos terminadalongitud de onda),bien permitiendoque cada progrese duranteun periodode tiempo reaccin de mezcla qumico de la desaparicorto y fijo, seguidode un ensayo del producto.En el cin del sustrato o de la acumulacin seusael ltimo procasode la reaccincon hexoquinasa, porque no hay manerade medir fotomtricacedimiento, ni los reactivos. menteni los productos inicial Como se indica en la Figura6.12,la velocidad paralos tubos 1-8 oscildesde 2,5 a 7,3 .rmol de glucosa por minuto, sin reaccin en el blanco.(Si la consumida los glucosa en el blanco, consumida hubierasidodetectada valoresdel resto de los tubos tendran que normarlizarse no enzimtica.) Cuandolasvecon relacina estareaccin como una funcin de locidades de reaccinserepresentan la de glucosa, los ocho puntos generan la concentracin que semuestraen Ia Figura6.12.Auncurvahiperblica parailusque los datosde la Figura6.12sehan corregido de los datrar mejor el ejemplo,lo cierto esque la mayora tos cinticosobtenidospor estemtodo encajanbien en una curva hiperblica,a menosque la enzimatengaalgu-

de tubo: Nmero Itll ;l I;l Itl |;l

1/v(min/pmol)

rlr.r$ffi| |B uu|8|ffiu
4 0,15 0,18 0,20 0,25

I,I

-o
.c

0 ,2 0, 1 l(ml1l 1 = n v* [ts]l-v*

1/[S]= 1/[glucosa](ml1z|1) Figura6.13 Representacin doble recprocade los datos de la hexoquinasa de la Figura 6.12. Los valoresde l/vy 1/[S] de cada tubo de ensayose calcularon a partir de los datos de la Figura 6.12. serepresent l/v como funcin de 1/ [S]. La interseccin Despus a llV^*, por lo que V-o es con el eje7 en el punto 0,1,corresponde 10 zmollmin. La interseccin con el eje x en elvalor '6,7 , a -llK^,y as, corresponde {, es0,15 mM. (Note que,por falta de en espacio,no semuestran aqu algunos de los tubos representados la Figura 6.12.)

Cintica enzimtica 1 5 5

mM que esel datodel tubo 3. staes,por supuesto, la Kde la hexoquinasapara la glucosa,generalmente escrita
como K-,r1u.oru. Adems, la enzima tiene una K- para el otro sustrato, Km,Arp,que sepodra calcularvariando la concentracinde ATP mientras se mantiene la concentracin de glucosa a un valor alto y fijo. Curiosamente, la hexoquinasa fosforila, no slo a la glucosa,sino tambin a otras hexosas, teniendo un valor distinto para cadauna. La K^para fructosa,por ejemplo, es 1,5mM 1ocual significa que necesita10 vecesms de fructosa que de glucosa, para mantener la reaccin a la mitad de su velocidad mixima. Aunque ligeramente simplificada e idealizada,esta es la manera en que los enzimlogos abordan el estudio de las reacciones catalizadasenzimticamente. Sus anlisis son a menudo ms complicadosy casisiempreprecisande un ordenador para calculary trazar los datos doblesrecprocosy determinar los valores de K- y de,V-o, pero el enfoque bsico es el mismo que el ilustrado en las Figuras6.12y 6.13.

irreversible Losinhibidores enzmticos actan o fevefsiblemente

quelasnicas Hasta aqu,hemosasumido sustancias enlas que afectana las actividades clulas de lasenzimasson sus Sin embarso, las enzimas tambinestninfluisustratos. ' por productos, sustratos alternativos, sustratos anlodas y una clase gos,drogas, toxinas importantede reguladores I^ ^aot 4rrtofgt-olgltrir^. Muchas de estassustancias re-tienen un efectoinhibidor en la actividad enzimtca, duciendo(o incluso anulando)la velocidadde reaccin con el sustrato deseado. inliiliiii:n d la actividadde la enzimaesimporEbta La primeray principal,esque Ia tantepor variasrazones. inhibicinenzimtica desempea un papelvital comomcanismo de controlen lasclulas. Comodiscutiremos en el prximo apartado, muchasenzimas se someten a regulapequeas cin por molculas especficas distintasde sus sustratos. La inhibicin enzimtica tambinesimportante y toxinas, en la accinde drogas Iascuales ejercen frecueninhibiendoenzimas Losintemente susefectos especficas. hibidorestambinson tilespara los enzimlogos como herramientas para el estudiode los mecanismos de reaccin. Son especialmente importantes en esteltimo caso, que se asemejan compuestos al los anlogos de sustratos, realpero que son qumicamente sustrato incapaces de IIevar a cabola reaccin. Losinhibidorespuedensereversibles o irreyersbles.Un inhibidor irreversibleseune a la enzimaconvalentemente, causando una prdidairrevocable de la actividadcataltica. que los inhibidores No sorprende irreversibles seannormalmentetxicosparalasclulas. peLosionesde metalgs sados son,a menudo,inhibidoresirreversibles, al igual que y los gases suelenserlolos agentes alquilantes txicosnerstaes,de hecho, laraznde quemuchosinsecticiviosos.
156 Capitulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

dasy gases nerviososseantan txicos.Estassustancias se a la acetiLcolinesterasa, unen irreversiblemente una enzima queesfundamentalparala transmisindel impuso nervioso (vase Captulo 13).La inhibicin de la actividadacetilllevaa una parlisis rpidadelasfunciones colinesterasa vitales por tanto, a la muerte.Uno de talesgases nerviosos esel di-isopropilo el cualseune covalentemenfluorofosfafo, te al grupo hidroxilo de una serinacrticadel sitio activode la enzima, a la cualinactivapermanentemente. Muchastoxinasnaturales sontambininhibidores enzimticos irreversibles. Por ejemplo, el alcaloidefsostigmi(Nigeria), del habade Calabar na,un componente estxiporqueinhibe irreversiblemente co paralos animales a la acetilcolinesterasa. El antibiticoD enicilinq esun inhibidor irreversible d. tut por tanto,es de la paredcelularbacteriana. La penicilina, porque eficaz en el tratamiento de infecciones bacterianas, impide la formacinde las paredes celulares de bacterias. Por contra,un inhibidor reversibleseune a una enzima de forma disociable, no covalente, de maneraqni lut formas libres y unidas del inhibidor existenen equilibrio las unascon las otras.Podemos replesentar talesuniones E + Ii-EI (6.14)

ae sgegsr" ll sl4ry stlffi{iii por

ai ro.

E la enzima librey activa,Iel inhibidor,y EI el comsiendo plejo inactivo enzima-inhibidor. Evidentemente, la fracdisponible cin de la enzimaqueest en la clula en forma activa, depende de la concentracin del inhibidor y de la estabilidad del complejo enzima-inhibidor. Lasdosformasmscomunes de inhibidores reversibles seclasificancomo inhibidores competitivos inhibidores e no competitivos. vo de la ertzimay por lo tanto compite directamente con por el mismo sitio de la enzima las molculas de sustrato (Figura6.14a), reduciendo su actividad,-hasta el punto de quelossitiosactivos pueden delasmolculas de enzima tener unidas,en culquiermomento,molculas del inhibidor,en lugarde molculas del sustrato. Un inhibidor no competitivo po-r-g1lglgdq,se une a la

embargoinhibe la actividadde la enzimaporque la unin del inhibidor con su sitio especfico, reduceenormemente o incluso suprime la actividad cataliticaen el sitio activo (Figura 6.14b)

"Ti;Aie tali,n6lo?frea fa;inelsusti 6iiin

dlsitio

Regulacin enzimtica
Para entender el papel de las enzimas en la funcin celular, debemos saber que es muy infrecuente, que la mejor opcin para una clula,seapermitir funcionar a stasa velocidades indiscriminadamente altas. En su lugar, las velocidades de las reacciones catalizadas enzimticamente y las

.i.l':3l),H" t

..

Sustrato

Productos

Productos

&\,
I
lb r \ Fr E J

,s,
[/

trb
/^\

{-t
y el sustrato se unen (b) Inhibicinno competitiva.El inhibidor deformala La uninde un inhibidor a sitiosdiferentes. de la unindel la probabilidad disminuyendo enzima,
SUSTTAIO.

1lrra,nn,o,oo,,
Ausenca oe rormaoon deproductos

\=/

(a) lnnibicincompetitiva. Tantoei inhibidor, como el sustrato, La uninde un inhibidor se unenal sitioactivode la enzima, por tanto,la se una,inhibiendo, impldeque el sustrato enzimtica. actlvidad

(a),comolosno competitivos y nocompetitivos. losinhibidores Tanto competitivos delosinhibidores deaccin Fgura 6.14 Modos difieren (E)inhibiendo, Losdostiposdeinhibidores por tanto, su actividad. (b) (enrojo)seunenreversiblemente a la enzima competitivos al queseunen. oor el sitiodeia enzima nectar o desconectara las enzimas o aiustar susvelocidades de reaccin, modulando apropiadamente las actividades de las enzimas. Casi invariablemente,una enzima que se regula por tal mecanismo, catalizael primer paso de una ruta de mltiples etapas. La secuencia completa se controla, incrementando o reduciendo Ia velocidad a la cual funciona la primera etapa. Entre las rutas que se regulan as, se encuentran las de ruptura de molculas grandes (como azcares,grasaso aminocidos) y las que conducen a la sntesis de sustancias necesarias para la clula (como aminocidosy nucletidos).Ahora discutiremosla regulacin alostricayla modificacin covalentede una manera introductoria. con Ia intencin de volver a estosmecanismos a medida que encontremos ejemplos especficosen captulosposteriores.

rutas bioqumicas de las que forman parte, deben ajustarse continuamente, para mantenerlas sintonizadas,de forma de la clula.Un aspectoimporprecisa,con las necesidades tante de ese ajuste reside en la capacidad de la clula de controlar las actividadesde la enzima con especificidady precisin. Ya hemos visto una variedad de mecanismosreguladode sustrato res,incluyendo cambios en las concentraciones (y de producto), alteraciones en el pH, y la presenciade inhibidores. ta cgulacin que depende directamente de las interaccionesentre lg! t@ zima, se llama regla_c_iQn pqr el sustrato..Tal y como se desprendede la ecuacin de Michaelis-Menten, los incrementos en la concentracin de sustrato tienen como resultado un aumento en la velocidad de reaccin (vase Figura 6.8). Por el contrario, los incrementos en la concentracin de producto reducen la velocidad a la cual el susla lrato se convie concentracin de producto es porque vtiene que ser identificado como la velocidad de reaccin inicial en Ia ecuacin de Michaelis-Menten, tal y como viene dado por la Ecuacin 6.7. Si una cantidad significativa de producto esfya presente,o se acumula durante el curso de Ia reaccin, la ecuacinsemelve ms compleja que ia forma simple en que la hemos considerado.) La regulacin por el sustrato es un importante mecanismo de control en las clulas,pero no es suficiente para la regulacin de]a mayora de las reacciones o secuencias de reacciones.En la mayoria de las rutas, Ias enzimas se regulan tambin mediante otros mecanismos. Dos de los ms importantes sonla regulacin alostricav la modirtca' Estosmecanismospermiten a las clulascocin,covalente.

pormolculas se regulan alostricas enzimas Las y losproductos delosreactivos diferentes

es el nico mecanismo importante La regulacinolostrica de control, por el cual Ia tasa de las reaccionescatalizadas celulares. Para enzimticamente,se aiustaa las necesidades entender este-modo ieguiaciOn,considerela va por la cual una clula convierte un precursor A en un producto final R mediante una serie de intermediarios B, C y D, en una secuenciade reaccionescatalizadasrespectivamente, por las enzimasE1,E2,E3y Ea: A --;tl B --;Ft C --;L, D --;-+ P rc

(6.1s)

por ejemplo, un aminocido El productoP podraser, y A poparala sntesis de protenas, quela clulanecesita
Regulacin enzimtica t57

l-

dra ser algn componente celular comn que sirve como punto de partida parala secuenciade reaccin especfica que conduce a P. Rettoinhibicin, Si se permite progresar constantementea la ruta 6-15, con una tasano limitada, se convertirn grandes cantidadesde A en R con los posiblesefectosadversos de la reduccin de A o una excesiva acumulacin de P (o quedan mejor ambos). Estclaro que los intereses celulares satisfechos cuando la ruta no estfuncionando a su mixima velocidad o incluso a una velocidad constante,sino a una velocidad,cuidadosamentedeterminadapor la necesidad de P. De alguna manera, las enzimas de estava deben ser sensibles al nivel celular del producto P,al igual que una calderanecesitaser sensiblea la temperatura de Iashabitacionesque pretendecalentar.En el ltimo caso,un termostato proporciona el vnculo regulador necesario entre la calderay su <producto>,el calor. En nuestro ejemplo de la enzima,la regulacin deseada esposible porque el producto P es un inhibidor especficode E,,la enzima que catalizalaprimera reaccin de la secuencia. Este fenmeno es llamado retroinhibicin (o inhibicin por el producto final) y se representapor la flecha de lneasdiscontinuas que conectael producto P con la enziva: ma E1,en la siguiente

o
^ ^v-v

I
H.+N-C-H

"l

i-o
)Qr .o.E
'c @ ou c lri ;v Y E v
.. 1) -

.-v;;;;:. -'1
I cH.
lntermeoa -l I Enzima2 I

H-C-OH

c E

Intermediario B

t
c)

I
I I

Enzima 3

Intermediarlo C
Enzima 4

fxx oo
-q)

A -;-

V
lntermediarlo D

l-

C -E- D

I'P

(6.16)

Retroinhibicinde El medianteP

v
o c-oI
H?l+ N - C - H

I I

Enzima 5

De manera ms general, una retroinhibicin sucede cadavez que un producto metablico inhibe a una de las enzimasimplicada en la va por la cual eseproducto sesintetiza. La retroinhibicin es uno de los mecanismos ms comnmente usadospor las clulaspara asegurarque las actividades de las secuencias de reaccin se aiustan a las necesidades celulares. La Figura 6. l5 proporciona un ejemplo especfico de tal -la ruta de cinco pasosen la que el aminocido secuencia isoleucinase sintetiza a partir del aminocido treonina-. En estecaso,la primera enzima en la va, la treonina desaminasa,seregulamediante la concentracinde isoleucina en la clula. Si se estconsumiendo isoleucina (por ejemplo, en la sntesisde protenas),su concentracinserbaja. En estascondiciones,la treonina desaminasaest activa y la va funcionapara producir ms isoleucina, de manera que se satisface la necesidadreal de esteaminocido. Si los requerimientos de isoleucina decrecen, sta empezar a acumularse en la clula y el incremento de su concentracin conducir a una reduccin de la actividad de la treoy, por ende,de Ia velocidad de sntesisdel nina desaminasa aminocido. Reglacin alostdca. Cmo puede la primera enzima en una va (por ejemplo, la enzima E, en Ia secuencia de Reac-

Producto final (isoleucina)

H-C-CH"

t" t-

CH, CH^

Figura 6.15 Regulacin alostrica dela actividad enzimtica. La rutadesntesis delaminocido isoleucina a partirdetreonlna, es un buenejemplo de retroinhibicin. Laprimera enzima dela secuencia, la treorrina deaminasa, esinhibida alostricamente por la isoleucina, Ia cualseunea la enzima en un sitio diferente d,elsito actlvo. cin 6.16) ser sensiblea la concentracin de una sustancia P que no es ni su sustrato ni su producto inmediato? O, volviendo a la Figura 6.15, cmo puede la actividad de la treonina desaminasa ser sensiblea la concentracinde isoleucina, cuando su estructura difiere tanto de la de la treonina, que es improbable que seareconocida por el centro activo de la treonina deaminasa? Esta pregunta fue respondida por primera vez en 1963 por |acquesMonod, Jean-PierreChangeux y Frangois Ja-

158

Captulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

cob. Aunque basadainicialmente en datos incompletos, su modelo fue rpidamente tenido en consideraciny se desarroll hastallegar a ser la basede nuestro entendimiento de Ia regulacin alostrica. El trmino alostricoderiva del griego <otra forma (o estado)>,indicando, por lo tanto, que todas las enzimascon capacidadde regulacin alostrica, pueden existir en dos estadosdiferentes. En una de las dos formas, la enzima tiene una afinidad alta por su(s) sustrato(s), mientras que en la otra, tiene poca o ninguna afinidad. Las enzimas con estapropiedad se llaman enzimas alostricas. Las dos fognas dife:e-ntes-deuna en-ima alq,strica qqq fcilmp-q1elntelgalyqrtlblEyst!-descha.qn equilibrio una con otra. Obviamente, la velocidad de reaccin es alta cuando la enzima est en la forma de alta afinidadybaja,o incluso nula, cuando Ia enzima esten su forma de baja afinidad. El que se favorezcala forma activa o inactiva de una enzima alostrica depende de la concentracin celular de la sustanciareguladora apropiada, llamada efector alostrico. de isoleucina,la enzima alostricaes En el casode la sntesis y el efector alostricoes la isoleucila treonina desaminasa es una pena. De manera ms general,un efectoralostrico quea molculaorgnica que regula Ia actividad de una enzini eIproductoinmediato. m6 para Ia cual no esni el sustrato, Un efector alostrico influye n la actividad de la enzima unindose a una de las dos formas interconvertibles de sta, una enzima en eseestado. En otras palabras, estabilizndola

alostrica puede existir en una forma compleja o simple, dependiendo de si tiene una molcula efectora unida a ella o no. El efector se une a la enzima debido a la presencia en la superficie de sta de un sitio alostrico (o regulador), que es distinto del sitio activo en el cual tiene lugar el evento cataltico. As, una caracterstica distintiva de todas las enzimas alostricas(y otras protenas alostricas) es la presenciaen la enzima dew sitio activo al que se une el sustrato y un sitio alostricoal que se une el efector. De hecho, algunas enzimas alostricastienen multiples sitios alostricos, cada uno capaz de reconocer un efector diferente. Un efector puede ser, o bien un inhibidor alostrico o bien un activador alostrico, dependiendo del efecto que ejerza cuando se una al sitio alostrico de la enzima, es decir, dependiendo de si la forma compleja es el estadode baja afinidad o alta afinidad de la enzima (Figura 6,16).La unin de un inhibidor alostricocambia el equilibrio entre las dos formas de la enzima para favorecerel estadode baja afinidad (Figura 6.16a).La unin de una activador alostrico, por otra parte, cambia el equilibrio a favor del estado de alta afinidad (Figura 6.16b). En cada caso,la unin del efector al sitio alostricoestabilizala enzima en una de sus dos formas, incrementando o disminuyendo de esemodo la probabilidad de unin al sustrato. La mayora de las enzimas alostricas son protenas grandes,multimricas y con un sitio activo o un sitio alostrico en cada subunidad. De hecho, los sitios activosy los

Sitio

",":i:?."

\ _ r't1x al*'h (jr.-? \--,\-:/

il.--lnnroroor

activo ffsustrato

,.--.t'oxto'

- L \

Sitlo Sitio activo alostrico Escasa o nula formacin de producto Formade bajaafinidad de laenzima

Formade altaafinidad de la enzima

fflI

arostrico

n lk c-mg:l;;
"\l

lt

Escasa o nula formacin de producto

\-/\-:/

pl^fl"b.-.4
[\1/ V

productos

Formade bajaafinidad de la enzima (a) tnnibicinalostrica.Una enzimasusceptible de inhibicln alostrica es actva en la formalibre,la cual por sus sustratos (S).La uninde tieneuna altaafinidad (en rojo)estabiliza la enzimaen su un inhibidor alostrico resultando formade baja afinidad, en poca o nula actividad.

Formade altaafinidad de la enzima (b) Activacn alostrica. Una enzimasusceptiblede alostrica es inactlva en su formalibre,la cual activacin La uninde un tieneuna afinidad baja por su sustrato. (en verde)estabiliza la enzimaen su activador alostrico formade baja afinidad, activando a la enzima.

estconstituidapor una o ms subunidades de inhibicin o activacin alostticas, Una enzimaalostrica Figura 6.16 Mecanismos La catalticas(C) y una o ms subunidadesreguladoras(R), cada una de las cualescon un sitio activo y un sitio alostrico,respectivamente. enzimaexisteen dos formas, una con alta afinidad por el sustrato ( por tanto, con una probabilidad alta de formacin de producto) y otra con una baja afinidad (y la correspondienteprobabilidad baja de formacin de producto). La forma que adquiere una enzima es para esaenzima. de la concentracin del efector(es) alostrico(s) dependiente

Resulacin enzimtica

L59

sitiosalostricos estnnormalmenteen diferentes subunidades de la protena,a lasque denominamos subunidades catalticas y subunidades reguladoras, respectivamente (fijeseen lassubunidades C y R de lasmolculas de la enzima que semuestran en la Figura6.16). Estosignifica, consecuentemente, quela unin delasmolculas efectoras a los sitiosalostricos, no slo afecta a la forma de lassubunidadesreguladoras, sino tambina lassubunidades catalticas. Lasenzimas alostricas manfestan interacciones cooperativas entresubundades Muchasenzimas alostricas poseen una propiedadconocida'comocooperatividad.Estosignificaque,a medidaque los mltiples sitios catalticos unen molculas de sustrato, la enzimasufrecambiosconformacionales, queafectan a la afinidad de los restantes sitiosde unin del sustrato. Algunasenzimas positiva,en la cual la muestrancooperatfuidad unin de una molculasustratoa una subunidadcataltica incrementa la afinidadde otrassubunidades por catalticas el sustrato. Otrasenzimas muestrancooperativad negativa, en la cual el sustratounido a una subunidadcatalticareduce la afinidad de otros sitios catalticos por el sustrato. El efectocooperativo permite a las clulas producir enzimasque son ms o menossensibles a los cambiosen la concentracin de sustrato, lo que por otra parte,serapredeciblepor la cinticade Michaelis-Menten. La cooperatividad positivahaceque la actividad catalitica de la enzima se incrementems rpido de lo normal a medida que la concentracin del sustratoaumenta,mientrasque la cooperatividadnegativasignificaque la actividad enzimtica aumentamslentamente de lo esperado. por la adicln Lasenzimas tambinse pueden regular o eliminacin de gruposqumcos Muchasenzimas, aderns de la regulacinalostrica, estn sometidasa control mediantemodificaciones covalentes. En estamanerade regulacin, la actividadde una enzima seve afectada por la adicin o eliminacinde gruposqumicosespecficos. Lasmodificaciones comunes incluyenla adicin de gruposfosfato,gruposmetilo, gruposacetilo,o derivados de nucletidos. Algunasde estas modificaciones pueden ser reversibles, mientras que otras no. En cada caso, el efectode la modificacinesla activacino la inactivacin de la enzima,o por lo menosla modulacin,hacia arriba o haciaabajo,de su actividad. Fosfodlacin/defosforilacin. La adicin reversible de grupos fosfatoesuna de las modificaciones ms frecuentes y mejor entendidas. La adicin de gruposfosfato,esdecir,la fosforilacin suele producirse por transferenciade un grupo fosfatodesdeel ATP al grupo hidroxilo de un residuo de serina,treonina o tirosina de la protena enzimtique catalizan ca.Lasenzimas la fosforilacinde otrasenzimas (o de otrasprotenas)sellaman proten-quinasas. El
160 Captulo 6 Enzimas: loscatalizadores de lavida

procesoinverso, la defosforilacin,estcatalizado por enzimas llamadasproten-fosfatasase implica la eliminacin de un grupo fosfatodesde la protenafosforilada. Estaforma de regulacinesla de la glucgeno fosforilasa,rrna enzimaque seencuentraen las clulas musculares (Figura6.I7).La enzimahidrolizael glucgeesquelticas no por eliminaciones sucesivas de unidadesde glucosa, en (Figura6.I7a). La regulacin forma de glucosa-1-fosfato de esta enzimadimrica se consigueen parte por la presencia en lasclulas musculares de dosformasinterconvertiblesde la enzima,una forma activallamadafosforilasa ay otra inactiva b (Figura6.17b).Cuando ,llamadafosforilasa senecesita hidrolizar glucgenoen las clulas musculares, la forma inactiva b de la enzimapasaa la forma activaa, por adicin de un grupo fosfatoen una serinaespecfica, en cadauna de las dos subunidades de la fosforilasa. Esta reaccinsecatalizapor la fosforilasa quinasayel resultado esun cambioconformacional en la fosforilasa. Cuandono senecesita hidrolizar ms glucgeno, los gruposfosfatola fosforilasa a son liminadospor la enzima fosforilasa fosfatasa.(La glucgeno sintasa, la enzima que aadenueyas unidades de glucosa a la cadena de glucgeno, responde de forma opuesta; esinactivaen la forma fosforiladay seactiva por defosforilacin. ) Ademsde la regulacinpor los mecanismos de fosforilacin/defosforilacin dela Figura6.l7,la glucgeno fosforilasa es tambin una enzima alostrica, que se inhibe por glucosa y ATR y seactivapor AMP. Si una sealhormonal provocala fosforilacin por tanto,activacin de la fosforilasa en una clulamuscular, que an posee suficiente de glucosa,sta inhibir alostricamente a la enzima, hastaque searealmente necesaria. Por otra parte,las clulasmusculares quetenganniveles bajosde glucosa, podrn beneficiarse inmediatamente dela conversin dela fosforilasaa la forma activa. La existencia de dosniveles de regulacin parala glucgenofosforilasa, ilustraun aspecto importantede la regulacin enzimtica. Muchasenzimasse controlan por dos o msmecanismos reguladores, y de esemodo,permitena la clularesponder adecuadamente frentea variassituaciones. prcteoltica. Un tipo diferentede activacincovaRuptuta lente de enzimasconsiste en la eliminacinirreversible de un fragmento de la cadenapolipeptdica,mediante una enzima proteoltica (que degrada protenas) adecuada. Estetipo de modificacin,llamado ruptura proteolltica, esel que tiene lugar en las enzimasproteolticasdel pncreas,tripsina, quimiotripsina y carboxipeptidasa. Estas enzimas, sintetizadas en el pncreas, son secretadas al duodeno,en respuesta a una sealhormonal. Estas proteasas, junto con la pepsinadel estmago y otras enzimas proteolticassecretadas por las clulasdel intestino, pueden digerir casi todas las protenasingeridas,rindiendo aminocidos libres,que sepuedenabsorber por lasclulas epitelialesdel intestino.

cH2oH

cH2oH

CH2OH

,.#t"#'"-,{}'"OH Restode glucosa del extremo de la cadenade glucgeno @

OH OH Cadena de glucgeno

loo ,sii"T::::
i

t99

cH,oH

cH,oH o -..
OH

Figura6.17 Regulacin de la glucgeno fosfodlasapu fosforilacin, (a) La glucgeno fosforilasa esuna enzima dimrica en las clulasmusculares,que libera unidades de glucosaa partir del glucgeno,en forma de glucosa-l fosfato, utilizable por Ia clula muscular, como fuente de energa.(b) La glucgeno fosforilasaestregulada,en parte, por un mecanismo de fosforilacin/defosforilacin. La forma inactiva de la enzima, la fosforilasa , puede ser convertida a la forma activa, fosforilasa a,porla transferenciade grupos fosfato desdeel AIP a una serina determinada,en cada una de las dos subunidadesde la enzima, La reaccin de fosforilacin escatalizadapor la enzima fosforilasa quinasa.La eliminacin de los grupos fosfato por la fosforilasa fosfatasa, devuelvea la fosforilasa a la forma b inactiva.

o-eo.+ *
OH Glucosa-1-fosfato

-""rt
OH Cadena de glucgeno con resto de glucosa menos

(a) Reaccincatalizadapor la glucgenofosforilasa

--slN4.''xl 'ry:R '@

OH OH
' qutnasa FOSrOllasa Fosforilasa fosfatasa

w
Glucgeno fosforilasa b (inactiva)

H 2@

,@

Glucgeno fosforilasa a (activa)

(b) Regulacin de la glucgeno fosforilasa

Lasproteasas pancreticas no sonsintetizadas en su forma activa;probablemente problemasen esopodra causar las clulasdel pncreas, la cualesdebenprotegerse de sus propiasenzimas proteolticas. En cambio,cadauna de estas enzimasse sintetizacomo una molculaligeramente ms grandey catalticamente inactivallamadazimgeno. Loszimgenosdebenautodigerirse proteolticamente para producir lasenzimas activas. Variosde estos acontecimientos se muestran en la Figura6.18.Por ejemplo, la tripsinasesintetizainicialmentecomo un zimgenollamadotripsingeno. Cuando el tripsingenoalcanza el duodeno,se activa por la eliminacinde un hexapptido(una cadena de seis aminocidos) desdesu extremoN-terminal, por la accin dela enteroquinasa, una proteasa producida de membrana, por las clulasdel duodeno.La tripsina activaluego a los proteolisis otros zimgenos, mediante especficas.

Ribozimas: molculas de RNA con actividad enzimtica

Antesde los primerosaosde Ladcada de 1980,sepensaba quetodaslasenzimas eranprotenas. De hecho,esaafirmacin seconsidercomo una de lasverdades fundamentales de la biologa celular y se encontrabaen todos los libros de texto.Los bilogoscelulares llegarona estarconvencidosde que todaslas enzimaseran protenas, porque todaslasenzimas aisladas en los 55 aosque siguierona la purificacin de la ureasa por Sumneren 1926,resultaron ser protenas.Pero Ia biologa est llena de sorpresas, y ahora sabemosque la afirmacin necesitaser revisada, para incluir a los catalizadores constituidospor ARN y denominadosribozimas.
Ribozimas: molculas de RNA conactividad enzimtica 1 6 1

Procarboxioeotidasa
/ i ^^o ^+i,,^\ \il uuva,, -->

Carboxioeotidasa
(activa)

para que guanosina- erannecesarias del nucletido Paranuestra tuvieralugar la reaccin. sorpresa, no era quecontena necesario el extracto nuclear lasenzimas. Nosvimosobligados a concluirque,o Ia actividad proyenade unaprotenaunida tan enzimtica estrechamente al RNAqueramos incapaces de separarla de 1, o queel RNAestaba catalizando su propioayuste. Dado lo arraigada queestaba la ideade quetodosloscatalizadores biolgicos eranprotenas, Ia por RNAno erafcil de aceptar. hiptesis de Ia catlisis

Pesea todo, Ios experimentos adicionales apuntaron haciala conclusin inicial:la eliminacin de un intrn de 4 13-nucletidosdel pre-rRNA de Tetrahymena estcatalizadaporla propiamolcula de pre-rRNA, por tansiendo, to, un ejemplode autocatalisis. La Figura6.19muestrael proceso de escisin, el cual Clulas plegamiento pre-RNAr implica el de la molcula de no O epiteliales por un grupo arstadaparaformar un bucle,@ el ataque hidroxilo de una de guanosinaque acta como cofactor, pancreticos por Figura6.18 Activacin de los zimgenos de la molculade rRNA con la liberacin ptoteolisis. Lasproteasas @ cortey ayuste pancreticas son sintetizadas y secretadas en el intestino deigado,como precursoresinactivos del intrn, y @ rotura adicionalautocataltica del intrn llamadoszimgenos. La procarboxipeptidasa, el tripsingenoy el paralaeliminacin de 19nucletidos ms.El intrn comquimiotripsingenoson zimgenos. La activacindel tripsingeno pletamente procesado esuna ribozima,capaz de acortaro a tripsina requiere la eliminacin de un segmentohexapeptdico gar gonucletidos pequeos. alar oli por la enteroquinasa, una enzimaduodenalde membrana.La que la molculade rRNA de la Sepodra argumentar por ruptura proteoltica. tripsina activaluego a otros zimgenos, La procarboxipeptidasa esactivada en una proteolisisnica, mientras Figura6.19 no satisface la definicinde catalizador, que que la activacinde quimiotripsingenoesun procesoalgo ms suponeque el propio cafalizador no sedebealterardurancomplicado, en dos etapas, cuyosdetalles no semuestranaqu. te el proceso de reaccin. Sin embargo, dosaosmstarde por RNA en el lasedescubri otro catalizador constituido de Sydney Altman en Ia que boratorio Universidad deYale, La primera evidencia lleg en 1981,cuandoThomas La supera esta restriccin. enzima, llamada ribonucleasa P, Cechy suscolegas de la Universidad de Coloradodescu(pre-tRNAs) rompe precursores de RNA de transferencia brieron una excepcin aparente a la regla(todaslasenzi(En este para producir molculasde RNA funcionales. mas son protenas)). Estaban estudiando el arster de un caso, se elimina un segmento terminal la de molcula de segmento interno de un precursorde un RNA especfico lugar de un intrn, procesaRNA, en como ocurra en el (pre-rRNA) in Tetrahymena thermophila, un organismo mientodel pre-rRNA.) (Como eucariotaunicelular. veremosen el Captulo21, Sesabadesde hacatiempo que la ribonucleasa P tena muchosde los RNAsde eucariotas que seelimirequieren proteicoy otro de RNA,y sesuponaqueel un componente nen uno o mssegmentos internosllamados intrones, anproteico.Sin embargo, en el componente tesde quelleguena serfuncionales en Ia clula. El proceso sitio activoestaba y Altman sus colaboradores demostraron inequvocamente, de corteimplicala escisin del intrn y la unin de lasdos mediante el aislamiento de los componentes y su estudio partes de la molcula originalen el sitio de escisin.) En el que eI componente por separado, proteicoaislado eracomcursode su trabajo, los investigadores hicieronla observapletamente que inactivo, mientras el componente ribonucin notable de que el procesoiaparentemente avanzaba cleotdico si era capaz de catalizarlaruptura especfica delos sin la presencia de protenas! Describiendo su intento de precursores del IRNR y, adems, no se alteraba durante el estudiar la escisin de intronesin vitro. Ceahescribi: proceso. Adems, la reaccincatalizada medianteRNA seguala cinticade Michaelis-Menten, una evidencia msde pequeas quealgunas Result delasmolculas que erael RNA quien estaba actuando como una autntica -principalmente iones y varias de magnesio formas proteicoaumenta enzima.(El componente Ia actividad pero parala unin del sustrato no esnecesario o su ruptura.) t N. del Z: siguiendo la recomendacin de Bilogos Moleculares hispanohaLa trascendencia de estos hallazgos sereconoci con el blantes,traduciremos como ayusteeI trmino ingls splicing que hace refePremioNobel que Cechy Altman compartieron en 1989 rencia al procesamientode1RNA, consistenteen el corte y empalme de cierpor susdescubrimientos de lasribozimas. A partir de estos tos sectoresdel mismo. Segrin el DRAI, a)'uste es un trmino nutico que refiere a la (costura o unin de dos caboso. iniciales, descubrimientos sehan descrito msejemplos de
Quimiotripsinoeno-P (inactiva t
t

Quimiotripsina (acriva)

r62

Captulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

5' r

UpCpUpApApAp Pre-rRNA

r GPUPAPAP

3'

o
GpupApAp- 3,

s,-

poooooo\ upcpu

,.)fo
S'oGon0A0n01
g'rUpCpUor 3' \6PUPAPAP-3'

de Figura6.19 La autocatlisisy el ayuste del intn del Pre-rRNA Tetrahymena. La molcula precursora del RNA ribosomal (pre-rRNA) contiene un intrn que es capazde catalizarsu propia de Tetrahymena O Formacin escisin.La escisiny el a)'usteocurren en cuatro etapas. pre-rRNA. de la molcula de @ El intrnica regin en la bucle un de bucle del intrn es atacadopor un grupo hidroxilo de un nucletido de guanina libre, pG, que funciona como cofactor.@ La molcula de prerRNA esrota en el extremo 5'terminal del segmentodel intrn, con Ia adicin de G al intrn. La uridina en el extremo 3' de otro fragmento de rRNA atacaluego al extremo 3'del intrn, liberndolo y empalmando @ El intrn las dos piezasde rRNA para formar el rRNA procesado. sufre una subsiguienteruPtura autocataltica,eliminando otros 19 nucletidos en dos etapas,primero libera un segmentode 15 nucletidos y luego otro de 4.

5'PGPAPAPAP-Go" eliminado lntrn

3'

lo t
l\

nucletidos N,u t\ \ o nucletidos I procesado Intrn

esel ejemplode un paso relevancia De especial ribozimas. stos en los ribosomas. protenas de la snlesis en esencial que muy grandes, como enzimas puedenserconsiderados aadiendo peptldicos, los enlaces de la formacin iatalizan (vase aminocidosa una cadenapolipeptdica ctecente ribosomal subunidad especficamente,la 4.8). Ms Figura que grandeesel lugar de Ia actividadpeptidil transferasa, peptdico. del enlace formacin catalizala que el sitio actiDurantemucho tiempo seha supuesto en una de las localizado estaba peptidil transferasa vo de la embargo, grande. Sin la subunidad proteicas de molculas de Sanla Universidad de colaboradores Harry Noller y sus una de las en su atencin centraron ta Cruz en California, a la demostracin, llev les trabajo derRNA. Este molculas de que a pesarde la eliminacinde por publicadaen 1992, de la protenade la subunidadribosomal io -.not el 95o/o de intactael 800/o el rRNA mantena grandede una bacteria, Adems,la la subunidad. de la actividadpeptidil transferasa por el tratamientocon ribonucleasa' actividaddesapareca por proRNA,pero no seafectaba una enzimaque degrada (de hecho, protenas teinasaK, una enzima que degrada protelas para eliminar usados stafue uno de los agentes nas de la subunidad).As pues,qued demostradoque la

de un pasocruresponsable actividadpeptidil transferasa, ribozima. esuna de protenas, cial en la sntesis Aunque muchos bilogos se quedaron inicialmente no de las ribozomas' por el descubrimiento asombrados pueno de RNA hay razn para pensarque las molculas Al igual que de funcionar como enzimas. dan ser capaces las molculasde RNA puedenadoptar una las protenas, que es la condicinprevia terciariacompleja, estructura en amboscasos. paralafuncin catalizadora de las ribozomasha cambiadoconEl descubrimiento la manerade pensarsobreel orilen de la siderablemente vida en la tierra. Durante muchosaos,los cientficoshacatalizaban pensadoque las primeras macromolculas semedorasdebanhabersido polmerosde aminocidos, choca estasuposicin jantesa las protenas. Sin embargo, con la dificultad de que no hay una forma sencillade explicar cmo una protelnaprimitiva puedeportar informapor s misma,que son dos atributosvitacin o replicarse les bsicos.Sin embargo,si el primer catalizadorfuera RNA en vez de molculasproteicas,es conceptualmente de RNA que de molculas ms fcil de asumir un sistema como a la replicacin, actesirviendo,tanto a la catlisis, pudiendo transferir la informacin a otras generaciones.
enzimtica 163 conactividad de RNA molculas Ribozimas:

Cerrando el crculo, volvemos al tema planteadoen la introduccin de estecaptulo -a saber,que la termodinmica nos permite valorarla factibilidadde una reaccin, pero no dice nada sobrela probabilidadde que esareaccin ocurra realmente en Ia clula,a una velocidadapreciable-. Serequiere un catalizador, que siempre es una enzima en los sistemas biolgicos,para asegurar que secumplen los requerimientosde energa de activacny que sealcanza el estadode transicin. Todaslas enzimasproteicasson polmerosde aminocidos con una secuencia programada genticamente,y son sensibles a la temperatura y el pH. Thmbinson exquisitamente especficas, paraun nicosustrato o paraun conjunto de compuestos estrechamente relacionados.El procesocatalticotiene lugar en el sitio activo, un grupo crtico de aminocidos responsables de la unin y la activacin del sustratoy de la autnticareaccinqumica. La unin de un sustrato apropiadoen el sitio de activo,induce un acoplamientoms.eficazentre la enzima y el sustrato,facilitando de esemodo Ia activacindel sustrato. Las reacciones catalizadasenzimtcamente tienenlugar a travsde un intermediario enzima-sustrato.Muchas enzimas siguenIa cinticade MichaelisMenten, caracterizada por una relacin hiperblicaentre la velocidadde reaccin inicial v y la concentracindel

sustratoIS].El lmite superiorde la velocidad se denominaV^*, y Ia concentrapara alcanzar cin de sustratonecesaria la mitad de la velocidadmxima,se expresa como la constantede Michaelis, (. La relacinhiperblicaenrrey y [S] se puede convertir en lineal, mediante una ecuacin doble recproca, en la que V-* I K- sepuedendeterminar grficamente o analizaren un ordenador. La actividad enzimtca estinfluida, no slopor la disponibilidaddel sustrato, sinotambinpor los productos, suStratos alternativos, sustratosanlogos, drogasy toxinas,muchasde las cualestienen un efectoinhibidor. La inhibicin puedeser reversible o irreversible, implicandoestas ltimas la formacin de unionescovalentesdel inhibidor a la superficiede la enzima. Por otra parte, un inhibidor reversible seune a la enzimade forma reversible. ya seaen el sitio activo (inhibicin competitiva) o en otro lugar de la superficie de la enzima(inhibicinno competitiva). Las enzimasse pueden regular para ajustarsusnivelesde actividada lasnecesidades de la clula.La regulacinpor el sustrato sebasaen los efectos que tienen Ias concentraciones del sustrato y de los productos,en la velocidadde reaccin. Los mecanismos de control adicionales incluyenla regulacinalostrica y lasmodificaciones covalentes. La mayorade las enzimas reguladas alostricamente catalizan el primer pasoen una secuencia de

reacciones y son protenasmultimricas con variassubunidades catalticas y varias subunidades reguladoras. Cadauna de Ia subunidades catalticas tieneun sitio activo que reconocea los sustratosy a los productos,mientras que cadasubunidad reguladoratiene uno o ms sitios alostricos,que reconocen a lasmolculas efectoras especficas. Un determinadoefector puedeinhibir o activarla enzima,dependiendode culde lasformasde la enzima estfavorecidapor la unin del efector. Las modificacionescovalentesms comunessonla fosforilaciny la desfosforilacin,como ocurre,por ejemploen la glucgenofosforilasa,y la ruptura proteoltica,como ocurre en la activacinde los zimgenosde las enzimasproteolticassecretadas por el pncreas. Aunque durante mucho tiempo se pensque todaslasenzimas eranprotenas,ahorareconocemos las propiedades catalizadorasde ciertas molculas de RNA llamadasribozimas.stasincluyen algunasmolculasde rRNA, que son capacesde catalizarIa eliminacin de sus propiosintrones, de eliminarlos componentesRNA de enzimasribonucleoproteicas y quizsinclusopartedel nN de ribosomas ya ensamblados. El descubrimiento de las ribozomasha cambiadoel pensamiento sobreel origen de la vida en la tierra porque las molculasde RNA, a diferencia de lasprotenas, son capaces de replicarse a s mismas.

Problemas
problemas Los demayor dificultad estn marcados con un .. 6,1 La necesidad de las enzimas.Nos encontramos ahoraen disposicinde apreciarla diferenciaentrela factibilidad termodinmicade una reaccin y la probabilidadde que realmente vayaa tenerlugar. (a) Muchasreacciones que son posibles termodinmicamente no ocurrena una velocidadapreciable, debido a las necesidades energticas de los reactivos para superarel estado de transicin.Qusignificaestoen trminos moleculares? (b) Una forma de cumplir esterequerimientoesmediante aportacinde calor,que en algunoscasos, slo esprecisoal inicio. D un ejemplo,y expliquelo que significaen trminos moleculares.
(c) Una solucin alternativa es reducir Ia energa de activacin. Qu significa en trminos moleculares decir que un cataLzador disminuye la energa de activacin de una reaccin?

(d) Los qumicos orgnicos usan a menudo en sus reacciones, catalizadores inorgnicos tales como el nquel, el platino, o ciertos cationes,mientras que las clulasusan protenas denominadas enzimas.Cules son las ventalasdel uso de las enzimas?Ylas desventajas? 6,2 Energa de activacin. Como se muestra en la Reaccin 6.2, el perxido de hidrgeno,H2O2, se descomponeen HrO y Or. La energa de activacin, E, para la reaccin no cataljzadaa 20'C es de 18 kcal/mol. La reaccin se puede catalizarpor iones de hierro (E : i3 kcal/mol) o por Ia enzima catalasa (4: 7 kcal/mol).

r64

Captulo 6 Enzrmas: loscatalizadores delavjda

(a) Dibuje un diagramade energa de activacinpara esta y no catalizacin, de catalizacin reaccin bajo condiciones y expliquelo que significaque la energa de activacin baje de 18a 13kcal/mol,cuandoseusanionesde hierroy de 18 de Ia catalasa. a7 kcallmol en presencia (b) Sugiera que hagande ella un dospropiedades de la catalasa catalizador intracelularms apropiadoque los ionesde hierro. (c) Sugiera la tasade la una forma msde acelerar steun del perxido de hidrgeno.Es descomposicin de medio apropiadode incrementarlasvelocidades reaccindentro de lasclulas? Porqu o por qu no? (d) Recuerde presente en las del Captulo4 que Ia catalasa selocalizadentro de los peroxisomas, clulas eucariotas junto con cualquiera generadoras de lasdiversas enzimas de HrOr. Debido a la toxicidaddel perxido de hidrgeno, por qu es enzimtica explique en trminosde cintica generadoras de HrO, y Ia ventajoso tenera lasenzimas juntas dentro de un mismo orgnulo. catalasa La 6.3 Incremento de la velocidadmediantela catsis. en la Reaccin descomposicin de HrO, en HrO y O, mostrada (iones por un catalizador inorgnico 6.2sepuedecatalizar,bien por Esta reaccin tiene lugar bien la enzima catalasa. de hierro), de ionesde hierro, unas30.000 veces msrpidaen presencia veces perohasta100.000.000 quecuandono haycatalizador, de la catalasa, una enzimaquecontiene msrpidaen presencia preguntas, asumiendoque I .rg hierro. Conteste a lassiguientes dadade HrO, en 1 descompone una cantidad de catalasa sellevana caboen minuto a 25 'C y quetodaslasreacciones condiciones estriles. (a) Cunto paradescomponer la misma tiemposenecesitara de una cantidad de ionesde cantidad de HrO, en presencia al contenidoen hierro de I rg de hierro equivalente catalasa? (b) Cunto tardariaen descomponerse la misma cantidadde de un catalizador? HrO, en ausencia (c) Explique la necesidad de los cmo stos ilustranclculos y la superioridad sobre los de lasenzimas catalizadores inorgnicos. catalizadores 6.4 Efectosde la temperaturay el pH. La Figura6.4 muestra de las enzimas en funcin de la temperaturay el las actividades pH. En general, la actividadde una enzimaespecfica esmsalta y el pH que son caractersticos del ambienteen a la temperatura el cual funciona normalmente. (a) Expliquelasformasde lascurvasde la Figura6.4 en basea qumicoso ffsicosmsdeterminantes en la los factores actividadde la enzima. (b) Paracadaenzimade la Figura6.4,sugiera Ia ventaja adaptativa de tenerel perfil de actividadenzimtica mostradoen la figura. (c) Algunasenzimas tienenun perfil de pH plano,esdecir, Ia misma actividadsobreun rango tienen esencialmente podraexplicar estaobservacin? ampliode pH. Cmo 6,5 Cintica de Michaelis-Menten.La Figura6.20representa de una enzimatpica,con una Ia grca de Michaelis-Menten velocidadinicial de reaccinexpresada como una funcin de la En la curva seidentificantres concentracin de sustrato.

E
.o .g c
!

'
a)

(s

Concentracin de sustrato fSl

6.20 Anlisis de la representacin de Michaelis-Menten. Figura 6.5. Vese el Problema mediantelasletrasA, B y C. Paracadauna de las regiones, que siguen,indique con una nica letra cul de las afirmaciones mejor a la afirmacin. 3 regiones de la curvaseajusta (a) El sitio activode una molculade enzimaestocupadopor el sustratoIa mayorparte del tiempo. (b) El sitio activode una molculade enzimaestlibre la mayorpartedel tiempo. (c) El rangode concentracin del sustratoen el cual la mayora funcionan en lasclulas normales. de lasenzimas (K^, (d) Incluya el punto V^u*12). (e) La velocidad principalmente, de la reaccin est limitada, presentes. por el nmerode molculas de enzima (0 La velocidad principalmente, de la reaccin est limitada, por el nmerode molculas de sustrato presentes. cafalizala 6.6 Cintica enzimtica.La enzimaB-galactosidasa lactosa en suscomDonentes hidrlisisdel disacrido monosacridos: # + H2O Lactosa f Galactosa Glucosa (6.L7)
d-salactosidasa

parala lactosa, ParadeterminarV^*y K- de Ia B-galactosidasa de enzima(1 lg por tubo) con una seincubla mismacantidad de lactosa, en condiciones en lasque seriede concentraciones de productoerandespreciables. La lasconcentraciones velocidadde la reaccininicial sedetermin para cada de lactosa, valorandola cantidadde este concentracin que permanece al final del ensayo. disacrido Seobtuvieronlos datos: siguientes
Concentracin de lactosa (mM) I 2
4 I i6 )z

Velocidad del consumo de lactosa (rmollmin)

10,0 16,7 25,0 33,3 40,0 44,4

(a) Por qu es necesario especificar que las concentraciones de producto eran insignificantes durante el curso de la reaccin? (b) Represente v (velocidad del consumo de lactosa) frente a [S] (concentracin de lactosa).Porqu cuando se doblala

Problemas 165

concentracin de lactosa, el incrementode la velocidades siempremenor que el doble? (c) CalculeIlvy ll[S] para cadaentradaen la tabla de datosy tracellv frentel/[S]. (d) DetermineK- y V-* a partir de Ia representacin doble recproca. (e) En la misma grficade la parte b, represente los resultados que esperara si cadatubo contuvieraslo 0,5 .rg de enzima.Expliqueel grfico. 6.7 Ms cinticaenzimtica.La galactosa formada en la Reaccin 6.17sepuedefosforilar mediantela transferencia de un grupo fosfatodesdeel AIfl reaccinque escatalizada por la enzimagalactoquinasa: * AIP ----------------+ Galactosa Galactosa-l-fosfato * ADP (6.1S)
galacquinasa

Estareaccines,como descubriremos en el Captulo 8, bsica en el transportedel dixido de carbonoen los glbulosrojos, desde los tejidosdel cuerpoa los pulmones.La anhidrasa carbnicatiene un pesomolecularde 30.000 y un nmero de (valorft.",) recambio de I X 106 sec-r.Suponga queseIe da 1 mL de una solucinque contiene2,0 pgde anhidrasa pura. carbnica (a) Aqu velocidad(milimoles de CO, consumidos por segundo)tendrlugar estareaccinen condiciones ptimas? (b) Suponiendonormalesla temperatura y la presin,cul es el consumo de CO, en mL por segundo? 6.9 Inhibidores devarias clases. Conteste, razonandoen cada caso, cules de lassiguientes (V) o afirmaciones son verdaderas (F). falsas (a) El di-isopropil fluorofosfatoseune covalentemente al grupo hidroxilo del residuode un aminocidoespecfico de Ia enzimaproblema,siendo,por tanto, casicon toda certeza, un efectoralostrico. (b) La enzimahexoquinasa seinhibe por su propio producto, la glucosa-6-fostato y, por tanto,esun ejemplode retroinhibicin. (c) La glucgeno sintasa, como la glucgeno fosforilasa, es activaen la forma fosforiladae inactivaen la forma defosforilada. (d) Esmuy probableque una enzimaque estsujetaa la activacinalostrica, catalice la primera reaccinde una va biosinttica. (e) Si los investigadores sostienen que una enzimaesactivada alostricamente por el compuesto A e inhibida alostricamente por el compuesto B, una de estas afirmaciones debeestarequivocada. La tioredoxinaesuna proteina reguladoracon dos grupos sulfhidrilo (-SH) que sepuedenoxidar de manera reversible, formando un enlacedisulfuro (-S-S-). Probablemente afectea la actividadde una enzima a la que seuna,reduciendo los puentes disulfurode la enzimaa grupossulfhidrilo,haciendo que la enzima experimenteun cambio conformacionalque conduzcaa su activacin. .6.10 Relevancia biolgica. Expliquela relevancia biolgica de cadauna de lassiguientes observaciones relativaa la regulacinde enzimas. (a) Cuandoustednecesita un aportede energa, lashormonas y glucagnsesecretan adrenalina haciasu torrente y sedirigen a susclulas sanguneo musculares, donde inician una cascada de reacciones que conducena la fosforilacinde la forma inactiva (b) delaglucosa fosforilasa, que pasaa Ia forma activa(a). (b) Incluso en la forma a, la glucosa fosforilasa de lasclulas musculares, seinhibe alostricamente por glucosa o AIP, en concentraciones elevadas. (c) Su pncreas sintetiza y secreta Ia enzimaproteoltica carboxipeptidasa en forma de precursorinactivo,llamado procarboxipeptidasa, que seactivacomo resultadode la proteolisis, mediantetripsina,en el duodeno. (0

que ha aisladola enzimagalactoquinasa Suponga y ha determinadosusparmetros cinticos, variandola concentracin de galactosa en presencia de una concentracin y alta (esdecir,en saturacin). de AIP constante La representacin doble recproca(Lineweaver-Burk) de los datos semuestra en la Figura6.21. (a) Cul esla K. de la galactosidasa, para la galactosa, en estas condiciones de experimentacin? nos dice la KQu acerca de la enzima? (b) Cul esla V-o de la enzimaen estas condiciones de experimentacin? nos dice la V-o acerca de la Qu enzima? (c) Suponga que repite el experimento, pero variandoIa concentracin de ATP y manteniendoa la galactosa en nivelesaltosy constantes. Asumiendoque lasdems condiciones semantienen comoantes, obtener la esperara misma V-o que en el apartadob? Porqu o por qu no? (d) En el experimento descritoen el apartadoc, el valor de K* esmuy diferenteal del apartado b. Puede explicarpor qu? 6.8 El nmero de recambio.La anhidrasa carbnicacatalza Ia hidratacinreversible del dixido de carbonopara formar ion bicarbonato: CO2+ H2O;HCO; + H-

(6.1e)

A o
C -'"

E
r1> o2

10 20 30 40 (mM-1) 1/lgalactosa] Figura 6.21 Representacin doble reciproca de la enzima galactoquinasa. Vese el Problema 6.7.

t66

Capitulo 6 Enzimas: loscatalizadores delavida

.6.11 Consecuencias de la ecuacinde Michaelis-Menten. la enzimaen la cual el sustratoS ParaIa reaccincatalizadapor 6.5),la velocidad seconvierteen un producto P (vaseReaccin o la aparicin del sustrato la puede como desaparicin definir se del producto por unidad de tiempo: y:----:---:-:+--elt rlt

(d) En su debido momento, se dar cuenta de que la V-* y la K- se pueden definir como sigue:

v-*:

kr[E]

*^:

h* ot
k1

(6.2t)

dtst

dlPl

(6.20)

a Ia etapainicial Partiendode estadefiniciny restringindonos cero,derivela cuando [P] esprcticamente de reaccin, (vasela 6.7).Los Ecuacin de Michaelis-Menten ecuacin pueden en su derivacin: ayudarle apartados siguientes (a) Comience Ia ecuacinde la velocidadpara expresando dlS)ldt, dlp)ldt,y dlBS)ldter trminos de concentraciones y velocidades constantes. (b) Suponga en el cual el complejo un estadoestacionario a la misma 6.6desaparece de la Reaccin enzima-sustrato velocidada la que seforma, de forma que Ia tasanetadel cambio,d[ES]ldt, escero. (c) Desecuentade que la cantidadtotal de la enzimapresente, en el libre Emsla queest E, esla sumade la enzima enzima ES:E : Er + ES. complejo

.6.1l La ecuacinde Michaelis-Mentenen forma lineal. (Figura6.10)' de Lineweaver-Burk Ademsde la representacin de la ecuacinde seempleanotrasdos formaslineales a veces esuna de Eadie-Hofstee La representacin Michaelis-Menten. Figura6.I I ), y la representacin grficade v/ [ S] frentea v (vase enfrenta a [S]/vya [S]. de Hanes-Woolf que la ecuacinque se (a) Demuestre, en amboscasos, grficamente sepuedeobtenera partir Ia representa con una simple ecuacinde Michaelis-Menten, manipulacinaritmtica. (b) En amboscasos, indique cmo sepuedendeterminarK- y el grficoresultante. V-o desde sealando los de Hanes-Woolf, (c) Hagauna representacin y la pendientecomo en las puntos de interseccin y de Eadie-Hofstee de Lineweaver-Burk representaciones por qula (vanseFiguras sugerir 6.10y 6.11).Puede desde Hanes-Woolfesla mssatisfactoria, representacin de lastres? el punto de vista estadstico,

Bibliografa recomendada
con' histrica estn marcadas referencias conimportancia Las genelales Referencias NewYork: Meth. Enzymol. S. Colowick, P.y N. O. Kaplan,eds. - present (ongoingseries). I 970 Press, Academic A Practical Introductionto Structures, R. A. Enzymes: Copeland, NewYork Wile 2000. and Data Analysis. Mechanisms, of A. L., D. L. Nelsony M. M. Cox.Principles Lehningeq Worth' 1999. ed.NewYork: Biochemistry,3rd C. K., K. E. van Holdey K G. Ahern.Biochemistry,3rd Mathews, 2000. Benjamin/Cummings, ed.SanFrancisco: The CeII of Enzymology: Fundamentals Price,N. C. y L. Stevens. New York: and MolecularBiologyof Cataftic Profelns. 1999. Oxford UniversityPress, A Reference: Purich,D. L. y R. D. Allison. TheEnzyme Nomenclature, to Enzyme Guidebook Comprehensive 2002. Boston:AcademicPress, and Methods. Reactions, histricas Referencias . Changeux, Sci. J.P.The control of biochemicalreactions. Amer.2l2(abrilde 1965):36. .Cori, C. F.James B. Sumnerand the chemicalnatureof Biochem. Scl.6 (1981):194. Trends enz'rnes. . Friedmann,H., ed.Benchmark Vol.1: Papers in Biochemistry. PA:HutchinsonRoss,1981. Stroudsburg, Enzymes. 'Monod, f., f. P.Changeux, and F.|acob.Allostericproteinsand 306. cellular controlsystems. I. MoL BioI.6 (1963): .Phillips, D. C. The three-dimensional structureof an enzyme de 1966): 78. Sci. Amer.215(noviembre molecule. y estluctura de enzimas Funcin for G. y I. . Iones.Chemicalmodification of enzymes DeSantis, 10 (1999): functionality.Curr. Opin. Biotechnol. enhanced 324. Combining structural H., E. E. Abola y R. C. Stevens. Erlandsen, completingthe picture in genomics and enzymology: and enzymeactivesites.Curr. Opin. metabolicpathways 719. Biol.10 (2000): Struct. A Guideto in ProteinScience: andMechanism A. Structure Fersht, NewYork W.H. Folding. and Protein Catalysis Enzyme Freeman. 1999. of enzymeactivity. Northrop, D. B. Rethinkingfundamentals (1999): 25. 7 3 Adv.Enzymol. Enzyme Chemistry: Suckling,C. I., C. L. Gibsony A. R. Pitt., eds. ed.NewYork Blackie ImpactandApplications,3rd 1998. & Professional, Academic Walsh, C. Enabling the chemistry of lfe. Nature 409 (2001): 226. enzimtica de la catlisis Mecanismos and Methods. Kinetics: Principles H. Enzyme Bisswange, Wiley-VCH, 2001. Weinheim,Germany: Mechanisms. Fre P.A.y D. B. Northrop, eds.Enzymatic 1999. DC: IOS Press, Washington, A ModernApproach. Kinetics: Maragoni,A. G. Enzyme 2003. Hoboken,Nf : Wiley Interscience, for MichaelisMtthews,J.N. y G. C. Allcock. Optimal designs 477 . Med.23 (2004): Stat. Mentenkineticstudies. recomendada t67 Bibliografia